KR101969619B1 - 약물 전달용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 알부민이 결합된 감광제와 엽산과 알부민 결합체가 결합된 감광제로 이루어진 나노입자를 포함하는 감광제 전달용 조성물에 관한 것이다.

Description

약물 전달용 조성물 {Composition for delivery a photosensitizer}
본 발명은 알부민-약물 결합체와 엽산-알부민-약물 결합체를 4:1 내지 1:1의 중량비로 혼합하는 단계를 포함하는, 약물 전달용 조성물의 제조방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된, 약물 전달용 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 약물 전달용 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
국내 사망원인 1위인 암은, 2013년 보건복지부의 조사에 따르면 81세까지 생존할 경우, 암 발생률이 36.3%로 3명 중 1명이 암에 걸리 정도로 암의 발생률이 높다. 또한, 2000년 대비 2011년 암 발생자수는 114.2%나 증가하는 등 매년 그 수가 증가하여 암의 심각성이 날로 증가하고 있다.
대표적인 암 치료방법으로는 항암화학요법이 있으나, 이는 암세포뿐만 아니라 정상세포 중 빠르게 분열증식하는 세포에도 손상을 가할 수 있어 암세포에 대한 표적성이 낮고, 항암화학요법 후 빈혈, 백혈구 및 혈소판 수의 감소, 구토, 오심, 및 설사 등의 부작용이 발생할 수 있다.
한편, 지난 몇 년 간 항암화학요법의 부작용을 극복하기 위한 치료제로서 감광제, 빛, 및 산소분자의 조합으로 이루어진 광 역학 치료(photodynamic therapy, PDT)에 대한 관심이 증가하고 있다. 광 역학 치료는 기존의 치료 방법과 달리 빛을 조사하는 경우에만 세포를 사멸시키는 효과를 갖는 특징이 있다(CA Cancer J Clin. 2011, 61, 250-281).
감광제의 경우, 낮은 수용성, 목표 지점에 대한 낮은 선택성, 및 피부 광독성의 단점이 존재하나, 미셀, 밀봉 리포좀, 및 바이오폴리머 등의 다양한 담체 시스템과 결합하여 이를 극복하는 연구가 진행되고 있다. 이 중, 알부민은 혈액의 성분으로서 혈류에 안정한 성질을 갖고, 분자 내에 서로 다른 약물 결합 부위를 갖고 있어 약물 전달체로의 활용 가능성이 존재하였다(Drug Development Research. 2003, 58, 219-247). 그 결과, 인체에 무해하며 분해가능한 단백질 입자인 알부민과 감광제를 결합하여 암세포에 대한 감광제의 전달 효율성을 높이는 기술이 개발되었다(Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 2009, 96, 66-74).
다만, 암세포에 대한 표적성은 여전히 연구가 될 필요성이 있으며, 약물 전달체와 결합된 감광제가 암세포 내에서 효과적으로 분리되어 암세포를 효과적으로 사멸시키기 위한 연구 역시 여전히 필요한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 암세포에 대한 표적성이 뛰어나면서 암세포 내로 약물을 효율적으로 전달할 수 있는 조성물을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 알부민-감광제 결합체와 엽산-알부민-감광제 결합체를 특정 비율로 혼합하는 단계를 거쳐 제조된 조성물이 암세포에 대한 표적성이 뛰어나고, 암세포로 감광제가 효율적으로 전달될 수 있음을 확인하고, 이에 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 주된 목적은 알부민-약물 결합체와 엽산-알부민-약물 결합체를 4:1 내지 1:1의 중량비로 혼합하는 단계를 포함하는, 약물 전달용 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 제조방법으로 제조된, 약물 전달용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 제조방법으로 제조된 약물 전달용 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 알부민-약물 결합체와 엽산-알부민-약물 결합체를 4:1 내지 1:1의 중량비로 혼합하는 단계를 포함하며, 상기 알부민-약물 결합체는 알부민과 약물을 결합하여 제조된 것이고, 상기 엽산-알부민-약물 결합체는 엽산과 알부민이 결합된 결합체에 약물을 결합하거나 알부민과 약물이 결합된 결합체에 엽산을 결합하여 제조된 것인, 약물 전달용 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 암을 치료하는 과정에서 나타나는 암세포에 대한 표적성 결여, 및 암세포 내에서의 낮은 약물 전달 효율성 등과 같은 단점을 극복할 수 있는 약물 전달용 조성물의 제조방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 약물 전달용 조성물을 제조함에 있어서, 알부민-약물 결합체와 엽산-알부민-약물 결합체의 중량비를 조절하여 혼합함으로서, 암세포에 대한 표적성을 향상시킬 뿐만 아니라 암세포의 세포 내 환경에서 약물이 효과적으로 전달될 수 있는 약물 전달용 조성물을 제조할 수 있음을 최초로 발견한 것에 기초한다.
먼저, 상기 알부민과 약물을 결합하여 제조된 알부민-약물 결합체에 대하여 이하 설명한다.
제조방법에 대한 비제한적인 일 예로, 에틸렌디아민이 결합된 약물을 메탄올과 디클로로메테인 혼합용액에 용해시키고, 아르곤 가스의 존재 하에 cis-아코니틱 무수물을 혼합용액에 천천히 첨가한다. 이후, N-하이드록시숙신이미드 및 에틸렌-카르보디이미드와 반응시킨다. BSA를 인산완충용액에 용해시키고, 이를 상기 반응물에 천천히 첨가하여 알부민-약물 결합체를 제조할 수 있다. 그러나 당업계에서 널리 알려진 방법으로 제조하거나, 시판되는 알부민-약물 결합체를 사용할 수 있다.
본 발명의 "알부민"은 세포의 기본 물질을 구성하는 단백질의 하나로, 자연상태에서 존재하는 단순 단백질 중 가장 분자량이 작은 단백질이다. 수가용성(water-soluble)으로 혈장에서 흔히 발견되는 주된 단백질이다. 상기 알부민은 난백(egg white, 오브알부민; ovalbumin), 소혈청, 인간혈청 또는 곡물로부터도 추출할 수 있으며, 자연적으로 존재하는 알부민과 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 발현하도록 제조된 형질전환체로부터 수득한 재조합 알부민을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 알부민은 물, 칼슘, 나트륨, 칼륨 등의 양이온, 지방산, 호르몬, 빌리루빈(bilirubin), 약물 등 다양한 리간드와 결합하여 혈액의 콜로이드 삼투압을 조절하는 역할을 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 알부민은 혈액 내에서 보존 효과가 뛰어나고, 강화된 침투성을 갖는 특징이 있어 약물과 결합체를 형성하여 표적 세포 내로 약물을 운반하는 운반체로서의 역할을 수행할 수 있는데, 상기 알부민에 의하여 운반된 약물은 표적 세포에 작용하여 특정 질환을 치료하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 "약물"은 항암제 또는 감광제일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 약물 전달용 조성물을 특이적으로 수용할 수 있는 세포에 대한 예방 또는 치료 효과가 있는 약물이라면 제한없이 사용 가능하다.
본 발명의 "항암"이란 암의 예방 및 치료 효과를 모두 포함한다.
상기 암은 세포의 정상적인 분열, 분화 및 사멸의 조절 기능에 문제가 발생하여 비정상적으로 과다 증식하여 주위 조직 및 장기에 침윤하여 덩어리를 형성하고 기존의 구조를 파괴하거나 변형시키는 상태를 의미한다. 상기 암은 발생한 부위에 존재하는 원발암과 상기 발생 부위로부터 신체의 다른 부위로 퍼져나간 전이암으로 구분된다.
상기 암은 예를 들어 대장암, 췌장암, 위암, 간암, 유방암, 자궁경부암, 갑상선암, 부갑상선암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 난소암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌종양, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS central nervoussystem) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 항암제는 DNA 알킬화제(DNA alkylating agents), 항암 항생제(anti-cancer antibiotics) 및 식물 알칼로이드(plant alkaloids)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
예를 들어 상기 항암제는 메클로에타민(mechloethamine), 클로람부칠(chlorambucil), 페닐알라닌(phenylalanine), 무스타드(mustard), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 카르무스틴(carmustine: BCNU), 로무스틴(lomustine: CCNU), 스트렙토조토신(streptozotocin), 부설판(busulfan), 티오테파(thiotepa), 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 닥티노마이신(dactinomycin: actinomycin D), 독소루비신(doxorubicin: adriamycin), 다우노루비신(daunorubicin), 이다루비신(idarubicin), 미토크산트론(mitoxantrone), 플리카마이신(plicamycin), 마이토마이신 C(mitomycin C), 브레오마이신(Bleomycin); 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 에토포사이드(etoposide), 테니포사이드(teniposide), 토포테칸(topotecan) 및 이리도테칸(iridotecan)으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 감광제는 광을 흡수하여 여기상태(excited state)가 된 계에 에너지를 이동하여 반응을 촉진시키는 것을 의미한다.
상기 감광제가 포함된 세포에 광을 조사할 경우, 감광제가 광을 흡수하여 에너지가 높은 여기상태가 된 후, 다시 에너지가 낮은 바닥상태로 이동하면서 빛을 방출한다. 상기 빛의 방출과정에서 주위의 산소는 세포에 독성을 나타내는 활성산소로 활성화되어 세포의 사멸을 이끈다. 따라서, 암 세포가 상기 감광제를 선택적으로 흡수하게 될 경우, 암 세포에 대해서만 특이적으로 세포의 사멸을 유도할 수 있다.
한편, 상기 감광제는 소랄렌(psoralen), 포르피린(porphyrin), 클로린(chlorin), 박테리오클로린(bacteriochlorin), 페오포르비드(pheophorbide), 박테리오페오포르비드(bacteriopheophorbide), 프탈로시아닌(phthalocyanine), 및 프로토포르피린(protoporphyrin) Ⅸ에 대한 전구체로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 광을 조사하여 활성 산소를 형성하는 것이라면 제한없이 사용된다. 일 예로 상기 감광제는 페오포르비드-a일 수 있다.
본 발명의 "알부민-약물 결합체"에서 상기 약물은 시스-아코니틸(cis-aconityl) 결합으로 알부민과 결합된 것일 수 있다.
본 발명의 "시스-아코니틸(cis-aconityl) 결합"은 화학식 C6H6O6의 시스 아코니트산(cis-aconitic acid)를 매개로 하는 결합으로서, 약산성 조건에서 절단되는 특징이 갖는다.
상기 약산성 조건은 pH 3.0 내지 6.0일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 구체적으로 pH 4.0 내지 5.0 일 수 있다.
본 발명에서 시스-아코니틸 결합은 알부민과 약물 사이를 연결하여 약산성 조건에서 약물이 알부민으로부터 절단되도록 하는 역할을 하는 것이다. 상기 약산성 조건은 세포 내의 환경과 유사하므로, 결국 본 발명의 약물 전달용 조성물은 시스-아코니틸 결합이 약산성 조건에서 절단되는 특징을 이용하여 세포 내에서 약물이 특이적으로 축적되는 특징을 갖는다.
상기 엽산과 알부민이 결합된 결합체에 약물을 결합하거나 알부민과 약물이 결합된 결합체에 엽산을 결합하여 제조된 엽산-알부민-약물 결합체에 대하여 이하 설명한다.
제조방법에 대한 비제한적인 일 예로, 엽산을 N-하이드록시숙신이미드와 디사이클로헥실 카보이미드에 첨가한다. PEG2000-amine을 첨가하여 FA-PEG-OH를 제조한 뒤, 상기에서 미리 제조된 알부민-약물 결합체에 천천히 첨가하여 엽산-알부민-약물 결합체를 제조한다. 그러나 당업계에서 널리 알려진 방법으로 제조하거나, 시판되는 알부민-약물 결합체를 사용할 수 있다.
상기 FA-PEG-OH의 히드록시 그룹을 활성화시키기 위해, N,N-디숙신이미딜 탄산염과 4-(dimethylamino) pyridine의 존재 하에 아르곤 조건에서 상기 FA-PEG-OH를 반응시킬 수 있다.
본 발명의 "엽산"은 비타민 B9 또는 비타민 M 이라고도 불린다. 엽산은 엽산 수용체와 특이적 결합을 이루며, 엽산 수용체는 종양세포에서 주로 발현되고 정상 림프절 구성 세포에는 적게 발현이 되는 것을 특징으로 한다.
상기 "엽산 수용체"는 종양과 관련된 글리코실포스파티딜이노시톨 앵커 단백질로서, 엽산 또는 엽산이 결합된 물질이 수용체-매게 엔도사이토시스를 통하여 섭취되도록 한다.
상기에서 설명된 여러 암의 종류 중, 세포의 표면에 엽산 수용체가 과발현되는 암에는 상피성 난소암, 자궁암, 유방암, 폐암, 신장암, 대장암, 및 뇌종양 등이 있고, 그렇지 않은 암에는 육종, 림프종, 췌장암, 고환암, 방광암, 전립선암, 및 간암 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 "엽산-알부민-약물 결합체"에서 상기 알부민은 폴리에틸렌글리콜(poly ethylene glycol, PEG) 결합으로 엽산과 결합된 것일 수 있다.
본 발명의 "폴리에틸렌글리콜(poly ethylene glycol, PEG)"은 (C2H6O2)n의 분자식을 갖는 세포융합을 일으키는데 사용하는 중합체를 의미하며, 본 발명에서는 엽산과 알부민 사이의 결합을 하는데 사용될 수 있다.
상기 제조방법은 알부민-약물 결합체와 엽산-알부민-약물 결합체를 4:1 내지 1:1의 중량비로 혼합하여 약물 전달용 조성물을 제조하는 단계를 포함할 수 있으며, 구체적으로 상기 중량비는 2:1일 수 있다.
구체적으로, 상기한 알부민-약물 결합체와 상기한 엽산-알부민-약물 결합체를 PBS 등의 버퍼에 용해시킨 후, 초음파를 가하여 상기 약물 전달용 조성물을 제조할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 제조방법에 따라 제조된 약물 전달용 조성물은 100nm 내지 200nm의 직경을 가지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 구체적으로 120nm 내지 180nm의 직경을 가질 수 있다. 뿐만 아니 상기 약물 전달용 조성물은 균일한 입도분포를 나타낸다.
일 실시예에서는 상기 알부민-약물 결합체와 상기 엽산-알부민-약물 결합체를 2:1의 중량비로 혼합하여 약물 전달용 조성물을 제조하였다. 상기 제조된 조성물의 크기는 121nm로서 최적의 세포 투과력을 갖는 크기로 이루어져 있는 것을 확인하여 상기 조성물은 종양 세포에 발현된 엽산 수용체에 결합한 후, 쉽게 세포 내로 투과하여 잔류할 수 있음을 확인하였다(도 5c, 및 표 1).
다른 양태로서, 상기 제조방법으로 제조된 약물 전달용 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 조성물은 알부민-약물 결합체와 엽산-알부민-약물 결합체가 4:1 내지 1:1 중량비로 이루어진 것일 수 있으나 이에 제한되지 않고, 구체적으로 2:1로 이루어진 것일 수 있다.
일 실시예에서는, 상기 알부민-약물 결합체와 엽산-알부민-약물 결합체가 상기 중량비로 이루어진 약물 전달용 조성물과, 오직 알부민-약물 결합체만으로 이루어진 약물 전달용 조성물의 암세포에 대한 표적성을 확인하는 실험을 실시하였다. 그 결과, 본 발명의 약물 전달용 조성물만이 암세포에 대한 표적성을 갖는 것을 확인하였다.
한편, 상기 약물 전달용 조성물을 흡수한 세포에 빛을 조사한 결과 세포의 생존율이 감소하였으나, 빛을 조사하지 않은 경우 세포의 생존율에는 유의미한 변화가 없음을 확인하였다(도 8a 내지 8d). 결국, 본 발명의 약물 전달용 조성물은 그 자체로는 세포에 독성을 나타내지 않아 안정성이 확보됨과 동시에 빛을 조사할 경우에만 세포의 사멸을 이끄는 효과를 갖는다.
본 발명에서, 상기 알부민-약물 결합체와 엽산-알부민-감광제 결합체가 자가 결합(self-assemble)되어 있는 것일 수 있다.
본 발명의 "자가 결합(self-assemble)"은 특정 효소나 인자의 도움 없이 기본이 되는 분자로부터의 복합 구조의 자발적인 형성을 의미한다. 일 실시예에서는 도 4와 같이 상기 알부민-감광제 결합체와 상기 엽산-알부민-감광제 결합체를 PBS에 용해시켜 자가 결합이 형성할 수 있도록 혼합하였다.
본 발명에서, 상기 약물은 pH 3 내지 6 사이의 조건에서 암세포에 특이적으로 축적되는 것일 수 있다.
일 실시예에서는, 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 상기 약물 전달용 조성물을 pH의 조건을 달리하여(pH 5.0 조건과 7.4 조건) 배지 내에 방출된 감광제를 분석한 결과, 상기 pH 조건에서 감광제가 효과적으로 방출됨을 확인하였다(도 6a 내지 6d). 특히, pH 5.0 조건은 세포 내부의 환경과 유사한 환경으로서, 상기 약물 전달용 조성물이 세포 내에 유입될 경우, 시스-아코니틸 결합이 절단되어 약물이 특이적으로 축적될 수 있음을 확인하였다.
다른 양태로서, 상기 제조방법으로 제조된 약물 전달용 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 "개체"는 암이 발병되었거나 발병할 가능성이 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미할 수 있다. 상기 동물은 인간뿐만 아니라 이와 유사한 증상의 치료를 필요로 하는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 고양이 등의 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약물 전달용 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 상기 조성물이 암의 예방 또는 치료에 효과가 있는 특성상, 상기 조성물의 투여 경로는 경구를 통하여 투여될 수 있다.
본 발명의 "예방"은 본 발명에 따른 조성물을 개체에 투여하여 암의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.
본 발명의 "치료"란 본 발명에 따른 조성물을 암의 발병이 의심되는 개체에 투여하여 상기 질환의 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미할 수 있다.
본 발명의 제조방법에 따라 제조된 약물 전달용 조성물은 암세포에 표적성을 갖고, 세포 내로 유입이 용이하며, 세포 내 환경에서 약물을 효과적으로 전달하여 암을 효과적으로 치료할 수 있다.
도 1은, FA-BSA-c-PheoA 나노입자를 제조하는 과정을 나타낸 개략도이다.
도 2a는, PheoA-EDA 결합의 핵자기 공명(NMR) 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 2b는, cis-aconityl-PheoA 결합의 핵자기 공명(NMR) 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 3a는, BSA-c-PheoA 결합의 UV vis 교정 곡선을 나타낸 그래프이다.
도 3b는, 분석 시료의 종류별 FT-IR 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
A: BSA;
B: PheoA;
C: BSA-c-PheoA;
D: FA-BSA-c-PheoA.
도 3c는, 분석 시료의 종류별 흡수 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.
도 4는, BSA-c-PheoA와 FA-BSA-c-PheoA를 혼합하여 FA-BSA-c-PheoA를 제조하는 과정을 나타낸 그림이다.
도 5a는, FA-BSA-c-PheoA 나노입자의 TEM 이미지를 나타낸 사진이다.
도 5b는, 수용액 상태에서 FA-BSA-c-PheoA 나노입자와 자유 PheoA를 비교한 사진이다.
도 5c는, FA-BSA-c-PheoA 나노입자의 크기를 나타낸 그래프이다.
도 5d는, PheoA, BSA-c-PheoA, 및 FA-BSA-c-PheoA의 흡광도, 및 형광밀도를 나타낸 그래프이다.
도 6a는, pH 5.0 조건에서 FA-BSA-c-PheoA 나노입자의 배양 시간에 따른 형광밀도를 나타낸 그래프이다.
도 6b는, pH 7.4 조건에서 FA-BSA-c-PheoA 나노입자의 배양 시간에 따른 형광밀도를 나타낸 그래프이다.
도 6c는, pH 5.0 조건과 pH 7.4 조건에서 FA-BSA-c-PheoA 나노입자의 배양시간에 따른 PheoA의 방출 정도를 나타낸 그래프이다.
도 6d는, pH 5.0 조건과 pH 7.4 조건에서 FA-BSA-c-PheoA 나노입자를 1시간 동안 배양한 후의 입자 크기를 나타낸 그래프이다.
도 7a는, B16F10세포에 종류별 분석 시료를 처리한 후, 형광도를 측정한 사진이다.
A: 무처리군;
B: PheoA 처리군;
C: FA-BSA-c-PheoA 나노입자 처리군;
D: FA 전처리 후, FA-BSA-c-PheoA 나노입자 처리군;
각 이미지의 첫번째 열은 차등간섭 대조 하에서 촬영한 사진, 두번째 열은 Alexa 488 필터 하에서 촬영한 사진, 세번째 열은 Qdot655 필터 하에서 촬영한 사진 및 네번째 열은 상기 사진들의 오버레이를 나타낸 사진이다.
도 7b는, MCF7 세포에 종류별 분석 시료를 처리한 후, 형광도를 측정한 사진이다.
A: 무처리군;
B: PheoA 처리군;
C: FA-BSA-c-PheoA 나노입자 처리군;
D: FA 전처리 후, FA-BSA-c-PheoA 나노입자 처리군;
각 이미지의 첫번째 열은 차등간섭 대조 하에서 촬영한 사진, 두번째 열은 Alexa 488 필터 하에서 촬영한 사진, 세번째 열은 Qdot655 필터 하에서 촬영한 사진 및 네번째 열은 상기 사진들의 오버레이를 나타낸 사진이다.
도 8a는, B16F10 세포에 종류별 분석 시료를 처리한 다음, 광선을 조사한 경우의 처리된 시료의 농도별 세포 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 8b는, MCF-7 세포에 종류별 분석 시료를 처리한 다음, 광선을 조사한 경우의 처리된 시료의 농도별 세포 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 8c는, B16F10 세포에 종류별 분석 시료를 처리한 다음, 광선을 조사하지 않은 경우의 처리된 시료의 농도별 세포 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 8d는, MCF-7 세포에 종류별 분석 시료를 처리한 다음, 광선을 조사하지 않은 경우의 처리된 시료의 농도별 세포 생존율을 나타낸 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<재료의 준비>
소혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA), 엽산(folic acid, FA), 및 cis-아코니틱 무수물(aconitic anhydride)은 시그마-알드리치(St. Louis, Missouri)로부터 구입하였다. 페오포르비드-a(pheophorbide-a, PheoA)는 Frontier Scientific, Ltd. (Logan, UT)으로부터 구입하였다. 모든 다른 시약들은 달리 언급되지 않는 한, 시그마-알드리치 및 도쿄화학공업(Tokyo, Japan)으로부터 구입하였다.
실시예 1: FA-BSA-c- PheoA 나노입자의 제조방법
실시예 1-1: cis - aconityl - PheoA 결합체 (conjugate)의 형성
FA-BSA-c-PheoA 나노입자의 제조방법은 도 1에서 표현된 것과 같다. 상기 나노입자의 제조를 위한 출발 물질로서, PheoA-에틸렌디아민(PheoA-EDA)을 기존에 알려진 방법에 따라 제조하였다(Battogtokh et al, 2012). 제조된 PheoA-EDA (100 mg, 0.16 mmol)을 5 mL의 메탄올과 디클로로메테인(dichloromethane, DCM) 혼합용액에 용해시켰다. 아르곤 가스의 존재 하에 0 ℃, 어두운 조건에서 1,4-디옥산(dioxane) (1 mL)에 존재하는 cis-아코니틱 무수물(cis-aconitic anhydride) (122.9 mg, 0.787 mmol)을 상기 용액에 천천히 첨가한 후, 2시간 동안 상온에서 혼합하였다. 반응 과정은 98:2로 혼합한 DCM/메탄올 용리액(eluent)을 이용하여 박막 크로마토그래피(thin-layer chromatography, TLC)로 관찰하였다. 반응이 완결된 후, 상기 용리액 및 디에틸에테르(diethyl ether)로부터 잔여물을 결정화하였고, 에테르를 사용하여 2회 반복하여 세척하였다. 결정화된 고체를 진공 하에서 건조시켰다. 결정화된 고체의 분석은 양성자 핵자기 공명 (1H NMR) 분석기 (600 MHz, Bruker Billerica, MA), Fourier transform infrared (FT-IR) 분석기, 및 UV-vis 분석기 (Cary 60, Agilent Technology, Santa Clara, CA)를 사용하여 실시하였다.
핵자기 공명 분석 결과 9.8-8.9 ppm, 8.18 ppm, 6.4 ppm, 4.5-1.1 ppm, 7.7 ppm 및 6.18-6.20 ppm에서 신호값이 나타났다(도 2a, 및 도 2b). 상기 신호들의 해석 결과, PheoA의 주요한 신호로서 9.8-8.9 ppm은 메틸기, 8.18 ppm은 NH기, 6.4 ppm은 CH=CH기의 신호값임을 확인하였고, 포피린 백본(porphyrin backbone)에서 4.5-1.1 ppm은 CH3, CH, 및 CH2기의 신호값임을 확인하였다. 또한 cis-aconityl의 주요한 신호로서 7.7 ppm은 NH기, 및 6.18-6.20 ppm은 CH=CH의 신호값임을 확인하였다. 따라서, 상기 합성 방법에 의해 cis-aconityl-PheoA 결합체가 정상적으로 형성됨을 확인하였다.
실시예 1-2: BSA-c- PheoA 결합체의 합성
5 mL의 클로로포름에 존재하는, 상기 실시예 1-1에 따라 형성된 cis-aconityl PheoA (c-PheoA; 30 mg, 0.047 mmol)를 5 방울의 트리에틸아민(triethylamine)의 존재 하에, N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide, NHS, 5.4 mg, 0.047 mmol), 및 에틸렌-카르보디이미드(ethylene-carbodiimide, 14.6 mg, 0.094 mmol)와 6시간 동안 상온에서 반응시켰다. 반응 과정은 5:1로 혼합한 DCM/메탄올 용리액을 이용하여 실리카 겔(silica gel) 플레이트 위에서 TLC로 관찰하였다. 상기 반응물을 실리카 겔 컬럼에서 정제한 후에, 부분표본을 진공 하에서 건조하여 강한 향기가 나는 c-PheoA-EDA의 가루를 수득하였다.
BSA (126 mg, 0.0019 mmol)를 2 mL의 인산완충용액(phosphate buffered saline, PBS; 0.1 M 탄산수소나트륨을 첨가하여 pH를 8.5 유지)에 용해시킨 후, 0.2 mL의 DMSO에 존재하는 상기 succinated c-PheoA-EDA를 천천히 첨가한 다음 1시간 동안 상온에서 혼합하였다. Sephadex G25 column (DP-10; GE Healthcare, Little Chalfont, UK)을 사용하여 반응 생성물 내 불순물을 제거한 뒤, 동결건조기(lyophilizer) 내에서 48시간 동안 동결건조하였다. 형성된 결합은 UV-vis과 FT-IR 분석기를 사용하여 확인하였으며, PheoA 내용물은 UV-Vis 분석기를 사용하여 결정하였다.
분석 결과, 675 nm에서 PheoA에 대한 UV-Vis 교정 곡선으로부터 BSA의 분자당 5개의 PheoA 분자가 부착되었음을 확인하였다(도 3a). 또한 FT-IR 분석 결과, BSA와 c-PheoA 결합에서 알부민에서의 일차 아민과 아마이드 (NH2, C=O, 및 N-H)의 3293.2, 1650.2, 및 1538.8 cm-1의 특정값, 및 각각의 피롤링(pyrrole ring)에서 N-H (신장된), 링에서 -CH- (신장된), cis-aconityl PheoA의 피롤의 C=O (신장된), 및 C=C (신장된)에서 3495.7, 2959.4, 1735.8, 1376.4, 및 1075.9 cm- 1 의 특정값이 나타남을 확인하였다(도 3b). 이를 통해, BSA와 PheoA간 결합체가 정상적으로 형성되었음을 확인하였다.
실시예 1-3: FA-PEG-BSA-c- PheoA 결합체의 형성
폴리에틸렌 글리콜화된 (PEGylated) FA를 아래와 같이 제조하였다. 구체적으로, 100 mg (0.225 mmol)의 FA를 1 mL의 건조 DMSO (dimethyl sulfoxide)에 용해시킨 후, 상기 용액을 3방울의 트리에틸아민의 존재 하에 25.9 mg (0.225 mmol)의 NHS와 92.5 mg (0.45 mmol)의 디사이클로헥실 카보이미드(dicyclohexyl carbodiimide, DCC)에 첨가하였다. 상온에서 3시간 동안 혼합한 후, 281 mg (0.14 mmol)의 PEG2000-amine (1:1.6 몰비의 NH2-PEG/FA)을 상기 활성화된 FA에 첨가한 다음, 질소 하에서 상온에서 2시간 동안 혼합하였다. 회전 증발기를 사용하여 유기 용매를 제거하였고, 6 mL 증류수를 사용하여 잔여물을 다시 수화하였으며, 용해되지 않은 부산물을 제거하기 위해 10분간 4000 rpm에서 원심분리하였다. 그 뒤, 상층액을 48시간 동안 감압 하에 동결건조하였다. 이를 통해 얻어진 생산물(FA-PEG-OH)의 분석은 1H NMR과 FT-IR 분석기를 사용하여 실시하였다.
나아가, 2 mL의 무수 테트라히드로퓨란(tetrahydrofuran, THF) 내에 존재하는 FA-PEG-OH (12.5 mg, 0.0052 mmol)의 히드록시 그룹을 활성화시키기 위해, 2 mL THF 내의 6.56 mg (0.025 mmol) N,N-디숙시이미딜 탄산염(disuccinimidyl carbonate)과 2 mL THF 내의 2 mg (0.016 mmol) 4-(dimethylamino) pyridine의 존재 하에 상온, 아르곤 조건에서 3시간 동안 반응시켰다. 반응 과정은 98:2로 혼합한 DCM/메탄올 용리액을 이용하여 박막 크로마토그래피(thin-layer chromatography, TLC)로 관찰하였다. 반응이 완료된 후에, 혼합물을 진공 하에서 증발시켰다. 결과로서 얻어진 0.4 mL의 DMSO 내의 succinated FA-PEG을 0.1 M의 탄산수소나트륨 (pH 8.3) 5 mL에 상기 실시예 1-2에서 제조된 60 mg (0.00086 mmol)의 BSA-c-PheoA에 5분당 200 μL의 속도로 첨가한 다음, 아르곤의 존재 하에서 1시간 30분 동안 혼합하였다. Sephadex G25 column (DP-10; GE Healthcare, Little Chalfont, UK)을 사용하여 반응 생성물 내 불순물을 제거한 뒤, 동결건조기(lyophilizer) 내에서 48시간 동안 동결건조하였다. 결합의 형성은 UV-vis과 FT-IR 분석기를 사용하여 확인하였다.
분석 결과, 250 nm의 파장에서 BSA-c-PheoA 분자당 2.5개의 FA가 부착되었음을 확인하였다. 또한 FT-IR 분석 결과, FA-BSA-c-PheoA에서 에테르 (C-O-C)와 FA-PEG의 방향족 C-H 구부러짐에 대응하는 1153.9, 1075.9, 및 858.3 cm-1의 값의 세기가 BSA-c-PheoA의 스펙트럼의 대응되는 값에 비해 높게 나타남을 확인하였다. 나아가, FA-BSA-c-PheoA에서 949.2 cm-1의 새로운 값은 FA의 벤질의 값임을 확인하였다(도 3b). 이를 통해, FA-BSA-c-PheoA가 정상적으로 형성되었음을 확인하였다.
한편, 상기 실시예 1-2 내지 1-3에 따라 형성된 BSA-c-PheoA, 및 FA-BSA-c-PheoA와 BSA, FA, 및 PheoA 각각의 흡광도를 측정한 결과 255, 및 285 nm에서 FA, 275 nm에서 BSA, 380 nm에서 소레트 흡수대(soret band), 및 680 nm에서 PheoA의 Q 밴드를 확인하였다. 한편, PheoA와 달리 BSA-c-PheoA와 FA-BSA-c-PheoA의 Q 밴드는 675 nm로 약간의 변화가 있음을 확인하였다(도 3c).
실시예 1-4: FA-BSA-c- PheoA 나노입자의 제조
초음파를 처리하여 FA-BSA-c-PheoA 나노입자를 제조하는 과정은 도 4와 같다. 구체적으로, 상기 실시예 1-2에 따라 형성된 BSA-c-PheoA (10 mg)와 상기 실시예 1-3에 따라 형성된 FA-BSA-c-PheoA (5 mg)를 4 mL의 PBS에 용해시킨 후, 상온에서 15분 동안 자가 결합(self-assemble)이 형성할 수 있도록 혼합하였다. 욕조 형태의 초음파발생장치 (sonicator) (Branson, Danbury, Connecticut)를 사용하여 30분 동안 4 ℃에서 상기 혼합물에 초음파를 가하였고, 응축물을 제거하기 위해 2000 rpm에서 3분 동안 원심분리하였다.
제타 전위와 입자 크기 분석기 (ELSZ-1000, Otsuka Electronics Co, Osaka, Japan)를 사용하여 빛의 산란을 통해 나노입자의 유체역학적 지름과 제타 전위를 측정하였다. 산란된 빛은 23 ℃에서 90° 각도로 측정하고, 데이터의 분석을 위해 0.933 mPa의 점도와 1.333의 굴절률을 사용하였다.
또한, 투과 전자현미경(transmission electron microscopy, TEM)을 사용하여 나노구조의 형태를 관찰하였다. 구체적으로, 나노구조화 된 조성물을 2% 우라닐 아세테이트 (uranyl acetate)로 염색하였고, 2차 증류수를 이용하여 탈색하였다. 그 후, 상기 조성물을 필름과 함께 구리 격자에서 10분간 건조시킨 다음 TEM (JEM 1010, JEOL, Tokyo, Japan)을 이용하여 관찰하였다.
형광 발산 스펙트럼은 Cary Eclipse 형광분광광도계 (fluorescence spectrophotometer) (Agilent Technology, Santa Clara, CA)를 사용하여 측정하였다. 자외선-가시광선 흡수 스펙트럼은 Cary 60 UV-vis 분광광도계 (Agilent Technology, Santa Clara, CA)를 사용하여 측정하였다. 모든 광학 측정은 상온에서 수행하였다.
관찰 결과, TEM 이미지를 통해 FA-BSA-c-PheoA 나노입자는 구의 형태로 이루어져 있음을 확인하였다(도 5a). 또한, 자유 PheoA는 수용액에서 뭉쳐진 형태로 존재하나, FA-BSA-c-PheoA 나노입자는 그렇지 않음을 확인하였다(clean) (도 5b). 나아가, 상기 나노입자는 121.47 ± 11.60 nm의 크기를 갖고, 0.39 ± 0.01 다분산성 지수(PDI)를 나타내며, -31.6 ± 2.91 mV의 제타 전위값을 나타냄을 확인하였다(도 5c, 및 표 1).
물질 지름 (nm) 제타 전위값(mV) 다분산성 지수(PDI)
BSA-c-PheoA 나노입자 104.10 ± 9.35 -14.79 ± 1.63 0.49 ± 0.04
FA-BSA-c-PheoA 나노입자 121.47 ± 11.60 -31.60 ± 2.91 0.39 ± 0.01
이는, 상기 나노입자가 최적의 세포 투과력을 갖는 크기(200nm 이내)로 이루어져 있어, 세포내로의 투과력과 잔류 효과가 증가하여, FA에 의해 종양세포에 특이적으로 결합하고, 종양세포에 쉽게 축적될 수 있음을 나타낸다. 한편, FA-BSA-c-PheoA 나노입자가 BSA-c-PheoA 만으로 이루어진 나노입자에 비해 약 17 nm만큼의 크기가 큰 것은, 나노입자의 표면에 엽산이 정상적으로 결합되어 있음을 의미한다.
한편, PBS/DMSO에서의 자유 PheoA, PBS에서의 BSA-c-PheoA 나노입자, 및 FA-BSA-c-PheoA 나노입자의 흡수 스펙트럼과 형광 스펙트럼을 비교한 결과, FA-BSA-c-PheoA 나노입자의 흡수 스펙트럼은 PBS/DMSO에서의 자유 PheoA의 것과 유사한 값을 나타냈으나, 형광 스펙트럼은 자유 PheoA의 값보다 훨씬 낮은 값을 나타냈다(도 5d). 이는, 자유 PheoA와 달리 나노입자의 내부에 PheoA가 존재하고 있음을 의미한다.
실시예 2: In vitro 상에서 pH의 조건 변화에 따른 PheoA의 방출 실험
PheoA의 방출실험을 실시하였다. 구체적으로, 상기 실시예 1-4 따라 제조된 FA-BSA-c-PheoA 나노입자 용액 (200 μL, 50 μg/mL의 PheoA)을 12 kDa의 분자량 제한이 있는 Mini-Pur-A-Lyzer 튜브(씨그마-알드리치)에 첨가하였다. 상기 튜브를 0.5% (w/v) Tween 80을 포함한 3 mL의 PBS 배지(pH 7.4 또는 pH 5.0)에 담근 후, 50 rpm의 회전 하에서 37 ℃ 조건에서 배양하였다. 상기 배지 전체 양의 3 mL을 특정 시간(1, 2, 3, 4, 6, 9, 24, 그리고 48 h) 에서 회수하였고, 37 ℃ 에서 3 mL의 신선한 배지로 교환하였다. Epoch 마이크로 플레이트 분광광도계 (BioTek Instruments, Winooski, VTC)를 사용하여 675 nm에서 흡광도를 측정하여 배지 내의 방출된 PheoA를 분석하였다.
분석 결과, pH 5.0의 조건에서는 배양시간이 길어질수록 형광의 세기가 증가하는 것을 확인하였다(도 6a). 반면, pH 7.4의 조건에서는 배양의 시간과 관계없이 형광의 세기가 일정하게 유지되는 것을 확인하였다(도 6b). 이를 통해, cis-aconityl 결합은 pH 5.0의 조건에서 절단되어 PheoA가 방출됨을 확인하였다.
나아가, 배양시간에 따른 PheoA의 방출 정도의 측정 결과 24시간 배양 시, pH7.4 조건에 비해 pH 5.0 조건에서 PheoA의 방출이 4.5배 더 많음을 확인하였다(도 6c). 또한, 배양 후 1시간이 경과한 시점에서 나노입자의 크기를 측정한 결과, pH 5.0 조건에서는 나노입자의 크기가 1000 nm이상으로 원래 상태를 유지하였으나, pH 7.4 조건에서는 200 nm이하의 크기를 나타내 나노입자가 붕괴되었음을 확인하였다(도 6d). pH 5.0은 세포 내부의 환경과 유사한 조건으로서, 상기 나노입자는 세포 내에서 cis-aconityl 결합이 절단되어 PheoA가 효과적으로 방출될 수 있음을 의미한다.
실시예 3: FA-BSA-c- PheoA 나노입자의 세포 흡수와 표적화
FA-BSA-c-PheoA 나노입자가 세포 내부로 효과적으로 흡수되는지 확인하기 위해, 자유 PheoA와 비교실험을 실시하였다.
구체적으로, 쥐과의 흑색종 (melanoma) 세포 주 B16F10과 인간의 유방 선암 (adenocarcinoma) 세포 주인 MCF-7을 실험 수행 24시간 전에 10% FBS가 첨가된 2 mL의 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)이 존재하는 커버글라스를 포함하는 6-웰 플레이트에 6 × 105 세포/웰의 농도로 각각 접종하였다. 자유 PheoA, 실시예 1-2에 따라 제조된 BSA-c-PheoA, 실시예 1-3에 따라 제조된 FA-BSA-c-PheoA, 및 실시예 1-4에 따라 제조된 FA-BSA-c-PheoA 나노입자 (10 μg/mL의 Pheo-A)를 각각의 웰에 첨가하였고, 세포와 함께 37 ℃에서 1.5, 3, 및 24시간 동안 배양하였다. PheoA의 세포 내부로의 이동을 시각화 하기 위해서, 세포들에 15 μL의 0.5 μM Lysotracker Green DND-26 (Life Technology, Eugene, Oregon)를 30분 동안 처리한 뒤, 차가운 PBS로 2회 세척하였고, 5분 동안 4% 파라포름알데히드 (paraformaldehyde) (2 mL)에서 고정시켰다. 다시 이를 차가운 PBS에서 2회 세척하였다.
한편, 엽산 수용체의 방해(blocking) 실험을 위해, FA-BSA-c-PheoA 나노입자의 처리 전에, 자유 FA (1 mL)를 첨가하였고, 세포들을 30분간 배양하였다. 그 뒤에, 상기 커버글라스를 PBS로 씻은 다음, Fluoromount (Sigma, St. Louis, Missouri)를 사용하여 상기 커버글라스를 봉입(mounting)하고, ECLIPSE Ti 공초점 현미경 (Nikon Instruments Inc., Melville, NY)을 사용하여 관찰하였다. 관찰된 이미지들은 Lysotracker filter (초록색 여기 488/22 nm; 배출 460/50 nm) 와 QDot 655 filter (붉은색 여기 410/40 nm; 배출 675/50 nm)하에서 수집하였다.
관찰 결과, B16F10 세포와 MCF-7 세포에서는 1.5시간 동안 배양시 (C)FA-BSA-c-PheoA 나노입자와 (B)자유 PheoA에서 유사한 형광값이 나타났고, 이들 값은 BSA-c-PheoA에서 관찰된 형광의 세기에 비해서 높게 나타났다(data not shown). 또한, 3시간의 배양시 (C)FA-BSA-c-PheoA 나노입자의 붉은색 형광의 세기가 증가하였음을 확인하였다(도 7a, 및 도 7b). 이는 상기 나노입자가 세포내 섭취에 의해서 세포 내 엔도좀과 리소좀 내부로 들어갔음을 의미하며, 시간이 지남에 따라 pH에 민감한 cis-aconityl 결합이 더 많이 절단되었음을 의미한다. 한편, (D)엽산을 사전 처리한 세포의 경우, 형광값이 매우 낮게 나타났는데 이는 세포의 엽산 수용체가 엽산에 의해 이미 점유가 되어, FA-BSA-c-PheoA 나노입자와 결합하지 않아 엽산 수용체 매개 세포 내부로의 이동(endocytosis)이 제대로 이루어지지 않은 것을 의미한다.
한편, (C)FA-BSA-c-PheoA 나노입자 뿐만 아니라 (B)자유 PheoA를 처리한 실험에서도 상당한 양의 PheoA이 축적됨을 확인하였는데, 이는 자유 PheoA의 지질친화적 성질에 의한 것으로 보인다. 즉, 높은 친유성을 가진 작은 분자는 확산을 통해 세포내부로 이동함이 알려져 있는데, in vivo에서는 PheoA의 경우 목적지에 도달하기 전에 뭉쳐져 PheoA의 축적이 제대로 이루어지지 않을 것이다.
또한, MCF-7 세포에서 실시한 엽산 수용체의 방해(blocking) 실험에서, 엽산 수용체의 FA 저해는 크게 영향을 받지 않는 것을 확인하였는데, 이는 MCF-7세포에서 엽산 수용체의 발현이 낮기 때문이다.
실시예 4: FA-BSA-c- PheoA 나노입자의 광독성
나노입자의 광독성은 빛처리 후에 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 에세이를 이용하여 측정하였다. 구체적으로, B16F10 세포 또는 MCF7 세포를 96-웰 조직 배양 플레이트에 접종하였다 (1.0 × 104 세포/웰). 다양한 농도의 자유 PheoA, 실시예 1-2에 따라 제조된 BSA-c-PheoA, 실시예 1-3에 따라 제조된 FA-BSA-c-PheoA, 및 실시예 1-4에 따라 제조된 FA-BSA-c-PheoA 나노입자 (0.375, 0.75, 1.5, 및 3 μg/mL의 PheoA)를 첨가하여 6시간 동안 배양한 후에, 671 ± 1 nm 레이저 광원 (Shanghai Dream Lasers Technology Co., Ltd, China)에서 나온 레이저 1.5 J/cm2 를 세포에 조사하였다.
또한 빛의 처리가 없는 상황에서 나노입자와 자유 PheoA의 세포독성을 조사하였다. 추가적으로 세포들을 24시간 동안 배양하였고, 세포들의 생존률을 MTT 에세이를 이용하여 측정하였다. 구체적으로, 10 μL의 5 mg/mL MTT 용액을 각각의 세포 배양 웰에 첨가한 다음, 4시간 동안 배양하였다. 100 μL의 DMSO를 배양액에 첨가하여 혼합하였다. 흡광도는 570 nm에서 Epoch 마이크로 플레이트 분광광도계를 사용하여 측정하였다. 각각의 그룹은 3개의 웰로 구성하였고, 그들의 평균값을 측정값으로 사용하였다.
측정 결과, 0.375, 및 0.75 μg/mL 의 FA-BSA-c-PheoA 나노입자를 첨가한 후, 빛을 조사한 세포는 BSA-c-PheoA를 첨가한 세포에 비해 높은 광독성을 나타냈다(도 8a, 및 8b). 다만, 레이저를 조사하지 않은 경우, BSA-c-PheoA를 처리한 세포뿐만 아니라 자유 PheoA 및 FA-BSA-c-PheoA 나노입자를 처리한 세포에서도 세포 독성이 나타나지 않았다(도 8c, 및 8d). 이를 통해, 암세포에 특이적으로 흡수된 FA-BSA-c-PheoA 나노입자는 빛의 조사를 통해 FA가 결합되지 않은 나노입자에 비하여 효과적으로 암세포를 제거할 수 있음을 확인하였다. 나아가, 상기 나노입자 자체는 세포에 대한 독성을 나타내지 않음을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (11)

  1. 알부민-약물 결합체와 엽산-알부민-약물 결합체를 4:1 내지 1:1의 중량비로 혼합하는 단계를 포함하며, 상기 알부민-약물 결합체는 알부민과 약물을 결합하여 제조된 것이고, 상기 엽산-알부민-약물 결합체는 엽산과 알부민이 결합된 결합체에 약물을 결합하거나 알부민과 약물이 결합된 결합체에 엽산을 결합하여 제조된 것인, 약물 전달용 조성물의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 알부민-약물 결합체와 엽산-알부민-약물 결합체의 중량비는 2:1인 것인, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 약물은 항암제, 또는 감광제인 것인, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 약물은 시스-아코니틸(cis-aconityl) 결합으로 알부민과 결합된 것인, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 알부민은 폴리에틸렌글리콜(poly ethylene glycol, PEG) 결합으로 엽산과 결합된 것인, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 제조된, 약물 전달용 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 조성물은 알부민-약물 결합체와 엽산-알부민-약물 결합체를 4:1 내지 1:1 중량비로 포함하는 것인, 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 알부민-약물 결합체와 엽산-알부민-약물 결합체의 중량비는 2:1인 것인, 조성물.
  9. 제6항에 있어서, 상기 조성물은 알부민-감광제 결합체와 엽산-알부민-감광제 결합체가 자가 결합(self-assemble)되어 있는 것인, 조성물.
  10. 제6항에 있어서, 상기 약물은 pH 3 내지 pH 6에서 암세포에 특이적으로 축적되는 것을 특징으로 하는 것인, 조성물.
  11. 제6항에 따른 약물 전달용 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료 방법.
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