KR101960009B1 - Biomarker for identifying exposure to air pollutants and method for identifying exposure to air pollutants using the same - Google Patents

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Abstract

본 발명은 공기오염물질 노출 여부 확인용 바이오마커에 대한 것으로, 구체적으로, 공기오염물질인 오존에 노출이 되었는지를 판단하기 위한 바이오마커인 클라우딘 3은 오존 노출 시 발현이 증가하며, 클라우딘 14는 오존 노출 시 발현이 감소하므로, 오존 노출 여부 확인용 바이오마커로서 유용하게 사용될 수 있다. The present invention relates to a biomarker for confirming exposure to air pollutants. Specifically, the biomarker for determining whether the air pollutant is exposed to ozone is Claudin 3, the expression of which is increased upon exposure to ozone, Since the expression is decreased upon exposure, it can be usefully used as a biomarker for confirming whether ozone is exposed.

Description

공기오염물질 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 공기오염물질 노출 확인 방법 {BIOMARKER FOR IDENTIFYING EXPOSURE TO AIR POLLUTANTS AND METHOD FOR IDENTIFYING EXPOSURE TO AIR POLLUTANTS USING THE SAME}FIELD OF THE INVENTION [0001] The present invention relates to a biomarker for detecting exposure to air pollutants and a method for confirming exposure to air pollutants using the same.

본 발명은 공기오염물질 노출 여부 확인용 바이오마커에 대한 것으로, 구체적으로, 인체가 공기오염물질인 오존에 노출이 되었는지를 판단하기 위한 바이오마커에 관한 것이다.The present invention relates to a biomarker for confirming exposure to air pollutants, and more particularly, to a biomarker for determining whether a human body is exposed to ozone as an air pollutant.

오존(O3)은 산소분자(O2) 하나에 산소원자(O) 하나가 결합된 무색의 기체이다. 오존은 산소의 불안정한 동소체로 산소보다 높은 에너지를 갖는다. 햇빛 등 주위의 전자파를 흡수하여 쉽게 분해되고 이때 생긴 여분의 산소원자는 주위의 물질들과 쉽게 반응하는 강한 산화력을 가진 활성 기체이다.Ozone (O 3 ) is a colorless gas in which one oxygen atom (O 2 ) is bonded to one oxygen atom (O). Ozone is an unstable isomer of oxygen and has higher energy than oxygen. The extra oxygen atoms that are easily decomposed by absorbing the surrounding electromagnetic waves such as sunlight are active gases with strong oxidizing power which easily react with surrounding substances.

오존이 갖고 있는 강력한 산화력은 하수의 살균, 악취제거 등에 유용하게 이용되기도 하고, 지구 대기 중에 오존층을 형성하여 보호막의 역할도 한다. 하지만 지표면에 생성되는 오존은 인간의 건강에 해로운 대기오염물질이 된다. The strong oxidizing power possessed by ozone is useful for disinfection of sewage, removal of bad smell, etc., and also serves as a protective film by forming an ozone layer in the earth's atmosphere. However, the ozone generated on the surface of the earth is an air pollutant harmful to human health.

인위적으로 배출된 대기오염물질은 통상 지상으로부터 1 내지 2 ㎞ 이내에 존재한다. 대기오염물질 중 질소산화물과 휘발성 유기화합물은 햇빛에 의한 화학반응에 의해 오존을 생성하여 대기 중 오존농도가 증가하게 된다. 그리고 이 오존의 일부는 대기 중 또 다른 오염물질과의 2차 반응에 의해 미세입자를 만들어 광화학스모그 현상을 일으킨다. 이에 따라 가시거리가 짧아지고, 호흡기나 눈을 자극하는 등 건강에 장애를 준다. 구체적으로, 오존을 동물이나 사람이 흡입하게 되면 기도염증 및 기도의 상피세포 손상으로 인해 폐기능이 저하된다고 보고된바 있다(Uysal N et al., Curr Opin Pulm Med, 144-50, 2003).Artificially released air pollutants are usually within 1 to 2 km from the ground. Among air pollutants, nitrogen oxides and volatile organic compounds generate ozone by chemical reaction caused by sunlight, which increases the concentration of ozone in the atmosphere. And a part of this ozone creates fine particles by secondary reaction with another pollutant in the atmosphere and causes photochemical smog phenomenon. As a result, the visual range is shortened, and it causes health problems such as respiratory or eye irritation. Specifically, ozone has been reported to be inhaled by animals or humans, leading to impaired lung function due to airway inflammation and airway epithelial cell damage (Uysal N et al ., Curr Opin Pulm Med , 144-50, 2003).

한편, 클라우딘(claudin, CLDN)은 세포 간 밀착연접(tight junction)의 주요 필수 막단백질로서 포유류의 경우 24개의 패밀리가 있으며, 사람의 경우 클라우딘 13을 제외한 클라우딘 패밀리를 가지고 있다. 클라우딘 1, 3, 4, 5, 7, 8 및 18은 인간의 기관지 및 세기관지에서 발현된다. 클라우딘 패밀리는 세포벽을 투과하여 박혀있는 형태와 유사한 구조를 가지며, 대부분 두 개의 세포 외 루프(extracellular loop)를 가지고 있는 구조를 가지고 있다.On the other hand, claudin (CLDN) is the main essential membrane protein of tight junctions. It has 24 families in mammals and a cladin family in humans except claudin 13. Claudins 1, 3, 4, 5, 7, 8 and 18 are expressed in human bronchi and bronchioles. The cladin family has a structure similar to that embedded in the cell wall, most of which has a structure with two extracellular loops.

한편, 난소암에서 클라우딘 패밀리 중 클라우딘 3와 클라우딘 4가 과발현된다는 연구(P.J. Morin, Cancer Res, 9603-6, 2005)가 보고된바 있지만, 공기오염물질인 오존 노출 시 클라우딘 3 및 클라우딘 14에 대한 연구가 보고된 것은 없었다. However, it has been reported that overexpression of claudin 3 and cladin 4 in the cladin family of ovarian cancer (PJ Morin, Cancer Res , 9603-6, 2005) No studies have been reported.

Uysal N et al., Curr Opin Pulm Med, 144-50, 2003 Uysal N et al., Curr Opin Pulm Med, 144-50, 2003 P.J. Morin, Cancer Res, 9603-6, 2005 P.J. Morin, Cancer Res, 9603-6, 2005

이에, 본 발명자들은 공기오염물질인 오존의 노출 여부를 판단하기 위한 바이오마커를 개발하기 위해 오존의 노출이 단백질의 발현에 어떠한 영향을 미치는지 연구하였다. 그 결과, 오존에 노출된 마우스의 폐에서 특정 단백질들의 발현이 변화됨을 확인하였고, 상기 단백질들이 오존 노출 여부 확인에 효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. The present inventors have studied how ozone exposure affects protein expression in order to develop a biomarker for judging whether or not ozone as an air pollutant is exposed. As a result, it was confirmed that the expression of specific proteins was changed in the lungs of mice exposed to ozone, and the present inventors completed the present invention by confirming that the proteins are effective in confirming exposure to ozone.

본 발명은 클라우딘 3 및 클라우딘 14로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 단백질을 포함하는 오존 노출 여부 확인용 바이오마커를 제공한다. The present invention provides a biomarker for confirming exposure to ozone containing one protein selected from the group consisting of claudin 3 and claudin 14.

또한, 본 발명은 클라우딘 3 및 클라우딘 14로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 검출하는 제제를 포함하는 오존 노출 여부 확인용 키트를 제공한다. Also, the present invention provides a kit for detecting ozone exposure, comprising a preparation for detecting one protein selected from the group consisting of claudin 3 and claudin 14 or a gene encoding the same.

나아가, 본 발명은 i) 오존 노출이 의심되는 개체로부터 분리된 시료에서 클라우딘 3의 유전자 발현량을 측정하는 단계; ii) 상기 유전자 발현량과 정상 대조군 시료의 발현량을 비교하는 단계; 및 iii) 상기 유전자 발현량이 대조군에 비해 높은 경우, 개체가 오존에 노출되었다고 판정하는 단계를 포함하는 오존 노출에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. Further, the present invention provides a method for detecting ozone in a sample, comprising the steps of: i) measuring a gene expression amount of claudin 3 in a sample separated from a subject suspected of ozone exposure; ii) comparing the amount of gene expression with the expression level of a normal control sample; And iii) determining that the subject is exposed to ozone if the amount of gene expression is higher than that of the control.

또한, 본 발명은 i) 오존 노출이 의심되는 개체로부터 분리된 시료에서 클라우딘 14의 유전자 발현량을 측정하는 단계; ii) 상기 유전자 발현량과 정상 대조군 시료의 발현량을 비교하는 단계; 및 iii) 상기 유전자 발현량이 대조군에 비해 낮은 경우, 개체가 오존에 노출되었다고 판정하는 단계를 포함하는 오존 노출에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for detecting ozone in a sample, comprising the steps of: i) measuring the expression level of claudin 14 in a sample separated from a subject suspected of ozone exposure; ii) comparing the amount of gene expression with the expression level of a normal control sample; And iii) determining that the subject has been exposed to ozone if the amount of gene expression is lower than that of the control, provides a method for providing information on ozone exposure.

나아가, 본 발명은 클라우딘 3 또는 클라우딘 14의 유전자 또는 그와 상보적인 핵산이 집적된 오존 노출 여부 확인용 DNA 마이크로어레이칩을 제공한다. Further, the present invention provides a DNA microarray chip for confirming exposure to ozone in which genes of Claudin 3 or Claudin 14 or a complementary nucleic acid thereof are integrated.

본 발명에 따른 바이오마커인 클라우딘 3은 오존 노출 시 발현이 증가하며, 클라우딘 14는 오존 노출 시 발현이 감소하므로, 오존 노출 여부 확인용 바이오마커로서 유용하게 사용될 수 있다. The biomarker of the present invention, cladin-3, increases its expression upon exposure to ozone, and cladin-14 decreases its expression upon exposure to ozone, thus being useful as a biomarker for confirming exposure to ozone.

도 1은 오존에 노출시킨 인간 기관지상피세포에서 추출한 단백질 중 클라우딘 3 및 클라우딘 14의 발현 변화를 웨스턴 블랏을 통해 확인한 도면이다.
도 2는 마우스를 오존에 노출시켜 클라우딘의 발현 변화를 확인하기 위한 시험과정을 도식화한 도면이다.
도 3은 오존에 노출시킨 마우스를 메타콜린으로 자극한 후 기도과민 반응성을 측정한 도면이다.
도 4는 오존에 노출시킨 마우스의 폐에서 추출한 단백질 중 클라우딘 3 및 클라우딘 14의 발현 변화를 웨스턴 블랏 통해 확인한 도면이다.
도 5는 오존에 노출시킨 마우스의 폐 조직에서 클라우딘 3의 발현 변화를 면역조직화학적염색 통해 확인한 도면이다.
도 6은 오존에 노출시킨 마우스 폐 조직에서 클라우딘 3의 발현 변화를 면역형광염색을 통해 확인한 도면이다.FIG. 1 is a graph showing Western blot analysis of changes in expression of clathin 3 and clathin 14 in proteins extracted from human bronchial epithelial cells exposed to ozone.
FIG. 2 is a diagram illustrating a test procedure for examining changes in expression of claudin by exposing a mouse to ozone. FIG.
FIG. 3 is a graph showing the results of measurement of airway hyperresponsiveness after stimulation with methacholine in a mouse exposed to ozone.
FIG. 4 is a graph showing changes in expression of clathin 3 and clathin 14 in western blot of proteins extracted from lungs of mice exposed to ozone.
FIG. 5 is a view showing immunohistochemical staining of changes in expression of claudin 3 in the lung tissue of mice exposed to ozone.
FIG. 6 is a graph showing changes in expression of claudin 3 in mouse lung tissue exposed to ozone through immunofluorescence staining. FIG.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 클라우딘 3 및 클라우딘 14로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 단백질을 포함하는 오존 노출 여부 확인용 바이오마커를 제공한다. The present invention provides a biomarker for confirming exposure to ozone containing one protein selected from the group consisting of claudin 3 and claudin 14.

본 발명에서 사용하는 용어 '클라우딘 3'이란, CLDN 3 유전자에 의해 암호화되는 단백질로, 세포간 분자들의 흐름을 제어하는 역할을 하는 막단백질을 의미한다. 상기 클라우딘 3의 유전자 및 단백질 정보는 NCBI 유전자 은행과 같은 공지의 데이터베이스를 통하여 용이하게 확인할 수 있으며, 그 예로 NCBI 유전자 은행의 Gene ID: 1365인 클라우딘 3일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 클라우딘 3는 서열번호 1의 염기서열일 수 있으며, 서열번호 2의 아미노산 서열일 수 있다.The term " claudin 3 " used in the present invention means a protein encoded by the CLDN3 gene, which serves to control the flow of intercellular molecules. The gene and protein information of the Claudin 3 can be easily confirmed through a known database such as the NCBI gene bank, for example, but not limited to, Claudin 3 having the Gene ID: 1365 of the NCBI gene bank. The claudin 3 may be the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and may be the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.

상기 클라우딘 3는 본 발명의 구체적인 실시예에서 상술한 바와 같이, 마우스 및 사람 기관지상피세포에서 오존 노출 시 발현이 증가됨을 확인하여 오존 노출 여부 확인용 바이오마커로서 사용 가능함을 확인하였다. As described above with respect to the specific examples of the present invention, the Claudin 3 showed increased expression upon exposure to ozone in mouse and human bronchial epithelial cells, and thus it could be used as a biomarker for confirming exposure to ozone.

본 발명에서 사용하는 용어 '클라우딘 14'란, CLDN 14 유전자에 의해 암호화되는 단백질로, 세포간 분자들의 흐름을 제어하는 역할을 하는 막단백질을 의미한다. 상기 클라우딘 14의 유전자 및 단백질 정보는 NCBI 유전자 은행과 같은 공지의 데이터베이스를 통하여 용이하게 확인할 수 있으며, 그 예로 NCBI 유전자 은행의 Gene ID: 23562인 클라우딘 14일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 클라우딘 14는 서열번호 3의 염기서열일 수 있으며, 서열번호 4의 아미노산 서열일 수 있다.The term " claudin 14 " used in the present invention is a protein encoded by the CLDN 14 gene, and refers to a membrane protein that functions to control the flow of intercellular molecules. The gene and protein information of the Claudin 14 can be easily confirmed through a known database such as NCBI gene bank, for example, but not limited to, Claudin 14, which is Gene ID: 23562 of the NCBI gene bank. The claudin 14 may be the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.

상기 클라우딘 14은 본 발명의 실시예에서 상술한 바와 같이, 마우스 및 사람 기관지상피세포에서 오존 노출 시 발현이 감소됨을 확인하여 오존 노출 여부 확인용 바이오마커로서 사용 가능함을 확인하였다. As described above in the examples of the present invention, the Claudine 14 was confirmed to be reduced in expression upon exposure to ozone in mouse and human bronchial epithelial cells, and thus it could be used as a biomarker for confirming exposure to ozone.

또한, 본 발명은 클라우딘 3 및 클라우딘 14로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 검출하는 제제를 포함하는 오존 노출 여부 확인용 키트를 제공한다. Also, the present invention provides a kit for detecting ozone exposure, comprising a preparation for detecting one protein selected from the group consisting of claudin 3 and claudin 14 or a gene encoding the same.

상기 검출 제제는 상기 단백질을 코딩하는 유전자에 상보적으로 결합할 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있다. 상기 프라이머 또는 프로브는 클라우딘 3 또는 클라우딘 14의 염기서열과 상보적인 결합을 하는 10개 내지 25개의 연속적인 염기서열을 갖는 뉴클레오티드일 수 있다. The detection agent may be a primer or a probe capable of complementarily binding to a gene encoding the protein. The primer or probe may be a nucleotide having 10 to 25 consecutive nucleotide sequences that make a complementary binding to the nucleotide sequence of claudin 3 or claudin 14.

또한, 클라우딘 3 또는 클라우딘 14 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블럿팅(northernblotting), 유전자 칩 분석법 등의 방법에 사용될 수 있다.In addition, primers or probes that bind specifically to the Claudin 3 or Claudin 14 gene can be detected by RT-PCR, competitive RT-PCR, real-time RT-PCR, RPA (RNase protection assay), northern blotting, and gene chip analysis.

본 발명에서 사용되는 용어 "프라이머"란, 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로서, 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충 용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 이때, 중합반응을 위한 시약은 DNA 중합효소 또는 역전사효소일 수 있다. As used herein, the term " primer " refers to a nucleic acid sequence having a free 3 'hydroxyl group, which can form a base pair with a complementary template, Refers to a short nucleic acid sequence that functions as a starting point. The primer can initiate DNA synthesis in the presence of a reagent for polymerization and a different four nucleoside triphosphate at a suitable buffer solution and temperature. At this time, the reagent for the polymerization reaction may be a DNA polymerase or a reverse transcriptase.

본 발명에서 사용되는 용어 "프로브"란, 유전자 또는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수십 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미한다. 이러한 프로브는 올리고뉴클레오타이드 (oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고, 보다 용이하게 검출하기 위하여 라벨링될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.The term " probe " used in the present invention means a nucleic acid fragment such as RNA or DNA corresponding to a few nucleotides or a few tens of nucleotides which can be specifically bound to a gene or mRNA. Such a probe can be produced in the form of an oligonucleotide probe, a single stranded DNA probe, a double stranded DNA probe, an RNA probe, or the like, and can be labeled for easier detection But is not limited thereto.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형일 수 있다. The primers or probes of the present invention can be chemically synthesized using the phosphoramidite solid support method, or other well-known methods. Such nucleic acids can also be modified using many means known in the art. Examples of such modifications may be methylation, capping, substitution of one or more natural nucleotides into homologues, and modification between nucleotides.

또한, 본 발명의 핵산 서열을 검출 가능한 시그날을 직접적으로 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 표지는 방사성 동위원소 표지, 형광성 분자 표지, 바이오틴 표지일 수 있다.In addition, the nucleic acid sequences of the present invention can be modified using a label that can directly or indirectly provide a detectable signal. The label may be a radioisotope label, a fluorescent molecular label, or a biotin label.

또한, 상기 클라우딘 3 및 클라우딘 14를 검출할 수 있는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다. In addition, the agent capable of detecting the claudin 3 and claudin 14 may be an antibody that specifically binds to the protein.

상기 항체는 클라우딘 3 또는 클라우딘 14의 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체일 수 있으며, 다클론 항체, 단클론 항체 또는 재조합 항체를 포함할 수 있다. The antibody may be an antibody that specifically binds to the protein of claudin 3 or claudin 14, and may include a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, or a recombinant antibody.

상기 단백질은 오존 노출에 따라 발현 여부가 달라지므로, 이는 오존 노출 여부 확인용 바이오마커로서 사용할 수 있음이 규명되었다, 상기 단백질에 결합하는 항체는 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.It has been found that the protein can be used as a biomarker for confirming whether or not ozone is exposed since its expression varies depending on ozone exposure. The antibody binding to the protein can be easily prepared using techniques well known in the art .

단일클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler et al., European Jounral of Immunology, 6:511-519, 1976), 또는 파지 항체 라이브러리 (Clackson et al., Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al., J. Mol . Biol , 222:581-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제할 수 있다.Monoclonal antibodies can be prepared using the hybridoma method (Kohler et al ., European Jounal of Immunology, 6: 511-519, 1976), or a phage antibody library (Clackson et al. , Nature, 352: 624-628, 1991; Marks et al. , J. Mol . Biol , 222: 581-597, 1991) . The antibody prepared by the above method can be separated and purified by gel electrophoresis, dialysis, salt precipitation, ion exchange chromatography, affinity chromatography, and the like.

상기 항체를 이용하여 이와 결합한 표적 단백질의 양을 확인하기 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.Methods for determining the amount of the target protein bound to the antibody using the antibody include Western blotting, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion Immunoprecipitation Assay, Complement Fixation Assay, Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS), Protein Immunoprecipitation Assay, Immunoprecipitation Assay, Immunoprecipitation Assay, Immunoprecipitation Assay, Fluorescence Activated Cell Sorter Chip, and the like, but are not limited thereto.

상기 키트는 오존 노출 여부를 확인하기 위해 개체의 시료로부터 클라우딘 3 또는 클라우딘 14의 mRNA 또는 단백질 발현량을 측정함으로써 오존 노출 여부를 확인하는에 사용될 수 있다. 또한 상기 클라우딘 3 또는 클라우딘 14의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하기 위한 프라이머 또는 프로브 및 항체 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다. The kit can be used to determine whether ozone is exposed by measuring mRNA or protein expression levels of claudin 3 or claudin 14 from a sample of an individual to confirm whether or not ozone is exposed. Also, primers or probes and antibodies for measuring mRNA or protein levels of the claudin 3 or claudin 14, as well as one or more other component compositions, solutions or devices suitable for the assay method may be included.

구체적으로, 본 발명의 오존 노출 여부 확인용 바이오마커 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. 상기 RT-PCR 키트는, 클라우딘 3 또는 클라우딘 14 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. Specifically, the biomarker kit for confirming exposure to ozone according to the present invention may include essential elements necessary for performing RT-PCR. The RT-PCR kit can also be used in combination with an enzyme such as a test tube or other appropriate container, reaction buffer, deoxynucleotides (dNTPs), Taq polymerase and reverse transcriptase in addition to the respective primer pairs specific for Claudin 3 or Claudin 14 gene , DNase, RNAse inhibitor, sterile water, and the like. It may also contain a primer pair specific for the gene used as a quantitative control.

나아가, 본 발명은 오존 노출에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 상기 방법은 i) 오존 노출이 의심되는 개체로부터 분리된 시료에서 클라우딘 3의 발현량을 측정하는 단계; ii) 상기 발현량과 정상 대조군 시료의 발현량을 비교하는 단계; 및 iii) 상기 발현량이 대조군에 비해 높은 경우, 개체가 오존에 노출되었다고 판정하는 단계를 포함 할 수 있다. Further, the present invention provides a method of providing information on ozone exposure. Specifically, the method comprises: i) measuring the expression level of claudin 3 in a sample isolated from an individual suspected of ozone exposure; ii) comparing the expression level of the digested amount with a normal control sample; And iii) if the amount of expression is higher than that of the control, determining that the subject is exposed to ozone.

개체로부터 시료를 분리하는 과정은 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있으며, 본 발명에서 사용되는 용어 "시료"란 오존 노출 여부를 확인하기 위해 채취하는 조직, 세포, 혈액, 혈장 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 시료에서 바이오마커인 클라우딘 3 또는 클라우딘 14의 mRNA 또는 단백질 발현량이 오존 노출 여부에 따라 차이가 날 수 있다. The term " sample " used in the present invention includes a sample such as tissue, cell, blood, plasma and the like to be sampled to determine whether or not ozone is exposed. But is not limited thereto. The amount of mRNA or protein expressed by the biomarker, cladin 3 or clad 14 in the sample may vary depending on whether the ozone is exposed or not.

이때, 클라우딘 3의 발현량을 측정하는 단계가 클라우딘 3의 mRNA 또는 단백질을 측정하는 것일 수 있다. 상기 클라우딘 3의 mRNA를 측정하는 단계는 다양한 방법으로 측정할 수 있으며, 구체적으로 상기 클라우딘 3 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 이용할 수 있다. In this case, the step of measuring the expression level of claudin 3 may be to measure the mRNA or protein of claudin 3. The step of measuring mRNA of claudin 3 can be measured by various methods. Specifically, a primer or a probe that specifically binds to the Claudin 3 gene can be used.

또한, 구체적으로 상기 mRNA를 측정하는 단계는 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응 (competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(real time quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RNase protection method), 노던 블랏팅(northern blotting) 또는 유전자 칩을 이용해 측정할 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. Specifically, the step of measuring the mRNA may include a reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), a competitive RT-PCR, a real-time quantitative RT-PCR, But are not limited to, RNase protection method, northern blotting, or gene chip.

상기 클라우딘 3의 단백질을 측정하는 단계는 다양한 방법으로 측정할 수 있으며, 구체적으로 상기 클라우딘 3 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용할 수 있다. The step of measuring the protein of claudin 3 can be measured by various methods, and specifically, an antibody that specifically binds to the claudin 3 protein is used .

또한, 상기 클라우딘 3의 단백질을 측정하는 단계는 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사면역확산법, 오우크테로니 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전분석법, 보체고정분석법, FACS, 단백질 칩에 의하여 측정하는 것일 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.In addition, the step of measuring the protein of claudin 3 can be performed by Western blotting, ELISA, radioimmunoassay, radial immunodiffusion, Oucheronin immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, tissue immuno staining, immunoprecipitation assay, , But not limited to, those measured by protein chips.

상기 분석 방법들을 통하여, 정상 대조군에서 항원-항체 복합체의 형성량과 오존 노출 대상에서 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, 오존 노출 여부 확인용 바이오마커 유전자에서 단백질로의 유의한 발현량 증감여부를 판단하여, 오존 노출 여부를 판단할 수 있다. Through these analysis methods, it is possible to compare the formation amount of the antigen-antibody complex in the normal control group with the formation amount of the antigen-antibody complex in the ozone exposure subject, and the expression amount of the biomarker gene for ozone exposure It is possible to judge whether or not ozone is exposed.

본 발명에서 용어 "항원-항체 복합체"란 오존 노출 여부 확인용 바이오마커 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다.The term " antigen-antibody complex " in the present invention refers to a combination of a biomarker protein for detecting ozone exposure and an antibody specific thereto, and the amount of the antigen-antibody complex formed is determined by the size of a signal of a detection label Can be measured quantitatively.

이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로서 효소가 사용되는 경우 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 등이 있다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. Such detection labels may be selected from the group consisting of enzymes, chromophores, ligands, emitters, microparticles, redox molecules, and radioisotopes, but are not necessarily limited thereto. When enzymes are used as detection labels, available enzymes include? -Glucuronidase,? -D-glucosidase,? -D-galactosidase, urease, peroxidase or alkaline phosphatase, etc. . Ligands include, but are not limited to, biotin derivatives.

상기 클라우딘 3의 단백질 발현량 측정은, ELISA법을 이용할 수 있다. 구체적으로, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출할 수 있다. 오존 노출 여부 확인용 바이오마커 단백질과 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여, 오존 노출 여부를 판단할 수 있다.The protein expression amount of the claudin 3 can be measured by an ELISA method. Specifically, an antibody is attached to a solid support, a sample is reacted, followed by labeling with a labeled antibody recognizing the antigen of the antigen-antibody complex, or by labeling the antibody labeled with an antibody recognizing the antigen of the antigen- It can be detected by a sandwich ELISA method in which a secondary antibody is attached and developed enzymatically. It is possible to determine whether ozone is exposed by confirming the degree of complex formation of the biomarker protein and antibody for confirming exposure to ozone.

또한, 상기 오존 노출 여부 확인용 바이오마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블랏을 이용할 수 있다. 구체적으로, 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동하여, 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀루로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 유전자의 발현에 의해 생성된 단백질의 양을 확인하여, 오존 노출 여부를 확인할 수 있다. 상기 검출 방법은 대조군에서의 마커 유전자의 발현량과 개체로부터 분리한 세포에서의 마커 유전자의 발현량을 조사하는 방법으로 이루어진다. mRNA 또는 단백질 발현량은 단백질의 절대적(예: ㎍/㎖) 또는 상대적(예: 시그널의 상대 강도) 차이로 나타낼 수 있다. Further, western blotting using one or more antibodies against the biomarker for confirming whether the ozone is exposed may be used. Specifically, the whole protein is separated from the sample, electrophoresed, the protein is separated according to its size, and then transferred to the nitrocellulose membrane to react with the antibody. The amount of the protein produced by the expression of the gene can be confirmed by confirming the amount of the generated antigen-antibody complex using the labeled antibody, thereby confirming whether or not the ozone is exposed. The detection method comprises a method of examining the amount of expression of a marker gene in a control group and the expression amount of a marker gene in a cell isolated from an individual. The amount of mRNA or protein expression can be expressed as the absolute (eg, μg / ml) or relative (eg, the relative intensity of the signal) difference of the protein.

또한, 상기 오존 노출 여부 확인용 바이오마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 면역조직 염색을 실시할 수 있다. 구체적으로, 오존 노출 대상으로부터 분리한 시료를 채취 및 고정한 후, 당업계에서 널리 공지된 방법으로 파라핀 포매 블록을 제조한다. 이들을 수 ㎛ 두께의 절편으로 만들어 유리 슬라이드에 붙인 후, 이와 상기의 항체 중 선택된 1개와 공지의 방법에 의하여 반응시킨다. 이후, 반응하지 못한 항체는 세척하고, 상기에 언급한 검출라벨 중의 하나로 표지하여 현미경 상에서 항체의 표지 여부를 판독한다.In addition, immunohistochemical staining using one or more antibodies against the biomarker for confirming exposure to ozone can be performed. Specifically, a sample separated from the object to be exposed to ozone is collected and fixed, and a paraffin-embedded block is produced by a method well known in the art. These are cut into pieces of several μm thick and attached to a glass slide, and then reacted with a selected one of the above antibodies by a known method. Thereafter, the unreacted antibody is washed and labeled with one of the above-mentioned detection labels, and the labeling of the antibody is read on a microscope.

또한, 구체적으로는, 상기 오존 노출 여부 확인용 바이오마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용할 수 있다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여, 오존 노출 여부를 판단할 수 있다.More specifically, a protein chip in which one or more antibodies against the biomarker for confirming whether or not to expose the ozone is arranged at a predetermined position on the substrate and immobilized at a high density can be used. A method of analyzing a sample using a protein chip is a method of separating a protein from a sample, hybridizing the separated protein with a protein chip to form an antigen-antibody complex, reading the protein, It is possible to judge whether or not the ozone is exposed.

또한, 본 발명은 오존 노출에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 상기 방법은 i) 오존 노출이 의심되는 개체로부터 분리된 시료에서 클라우딘 14의 발현량을 측정하는 단계; ii) 상기 발현량과 정상 대조군 시료의 발현량을 비교하는 단계; 및 iii) 상기 발현량이 대조군에 비해 낮은 경우, 개체가 오존에 노출되었다고 판정하는 단계를 포함할 수 있다.The present invention also provides a method of providing information on ozone exposure. Specifically, the method comprises: i) measuring the expression level of claudin 14 in a sample isolated from a subject suspected of ozone exposure; ii) comparing the expression level of the digested amount with a normal control sample; And iii) determining that the subject is exposed to ozone if the expression level is lower than the control.

상기 클라우딘 14의 발현량을 측정하는 단계가 클라우딘 14의 mRNA 또는 단백질을 측정하는 것일 수 있다.The step of measuring the expression level of claudin 14 may be to measure the mRNA or protein of claudin 14.

상기 클라우딘 14의 mRNA를 측정하는 단계는 다양한 방법으로 측정할 수 있으며, 구체적으로 상기 클라우딘 14 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 이용할 수 있다. 상기 클라우딘 14의 mRNA를 측정하는 단계는 상기 클라우딘 3의 발현량을 측정하여 오존 노출에 대한 정보를 제공하는 방법에서 상술한 바와 같다. The step of measuring the mRNA of claudin 14 can be measured by various methods. Specifically, a primer or a probe that specifically binds to the Claudin 14 gene can be used. The step of measuring mRNA of claudin 14 is as described above in the method of measuring the expression amount of claudin 3 and providing information on ozone exposure.

상기 클라우딘 14의 단백질을 측정하는 단계는 다양한 방법으로 측정할 수 있으며, 구체적으로 상기 클라우딘 14 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용할 수 있다. 상기 클라우딘 14의 단백질을 측정하는 단계는 클라우딘 3의 발현량을 측정하여 오존 노출에 대한 정보를 제공하는 방법에서 상술한 바와 같다. The step of measuring the protein of claudin 14 can be measured by various methods. Specifically, an antibody that specifically binds to the Claudin 14 protein can be used . The step of measuring the protein of claudin 14 is as described above in the method of measuring the expression amount of claudin 3 and providing information on ozone exposure.

개체로부터 시료를 분리하는 과정은 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있으며, 본 발명에서 사용되는 용어 "시료"란 클라우딘 3의 발현량을 측정하여 오존 노출에 대한 정보를 제공하는 방법에서 상술한 바와 같다. The term " sample " used in the present invention refers to a method of measuring the expression level of claudin 3 and providing information on ozone exposure, as described above same.

또한, 본 발명은 클라우딘 3 또는 클라우딘 14의 유전자 또는 그와 상보적인 핵산이 집적된 오존 노출 여부 확인용 DNA 마이크로어레이칩을 제공한다. In addition, the present invention provides a DNA microarray chip for confirming whether or not ozone exposure has accumulated genes of Claudin 3 or Claudin 14 or complementary nucleic acids thereof.

본 발명의 상기 DNA 마이크로어레이 칩은, 본 발명의 클라우딘 3 또는 클라우딘 14의 유전자 또는 그와 상보적인 핵산을 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로 어레이로 이루어진다. 상기 DNA 마이크로 어레이 칩은 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 프로브로 부착될 수 있다. The DNA microarray chip of the present invention comprises a conventional microarray except that it contains the gene of Claudin 3 or Claudin 14 of the present invention or a nucleic acid complementary thereto. The DNA microarray chip may be attached as a probe corresponding to a gene or a fragment thereof.

상기 마이크로어레이칩을 제작하는 방법은 하기와 같다. 상기 탐색된 바이오마커를 탐침 DNA 분자로 이용하여 DNA 마이크로어레이 칩의 기판 상에 고정화시키기 위해 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅 (micropipetting)법 또는 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용한다. DNA 마이크로어레이 칩 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde) 등의 활성기가 코팅될 수 있다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막, 또는 니트로셀룰로스 막 일 수 있다. 또한, 키트는 혼성화에 사용되는 완충용액, RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사효소, cNTPs 및 rNTP(사전 혼합형 또는 분리 공급형), 형광 염색제의 화학적 유도제와 같은 표식시약, 세척 완충용액 등으로 구성될 수 있다.A method of fabricating the microarray chip is as follows. In order to immobilize the biomarker on a substrate of a DNA microarray chip using the biomarker as a probe DNA molecule, a micropipetting method using a piezoelectric method or a pin-type spotter ) Is used. The DNA microarray chip substrate may be coated with an activator such as amino-silane, poly-L-lysine and aldehyde. Further, the substrate may be a slide glass, a plastic, a metal, a silicon, a nylon film, or a nitrocellulose film. The kit also comprises a buffer solution used for hybridization, a reverse transcriptase for synthesis of cDNA from RNA, a labeled reagent such as cNTPs and rNTP (pre-mixed or separate feed type), a chemical inducer of fluorescent dye, .

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예로 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples. However, the following examples are for illustrative purposes only and are not intended to limit the scope of the invention.

I. 오존 노출에 따른 인간 I. Human exposure to ozone exposure 기관지상피세포의Bronchial epithelial cells CLDN3CLDN3 및  And CLDN14CLDN14 발현 변화 확인 Identification of expression changes

실시예Example 1. 세포 준비  1. Cell preparation

인간 기관지상피세포(cat#. CC-2540; Lonza, Basel, Switzerland) (3000cells/cm2)를 T-플라스크 BEGM™BulletKit™(Lonza, Basel, Switzerland)에 37℃, 5% CO2 조건으로 배양하였다. 배지는 세포 포화도가 90%에 도달하거나 48시간마다 교체하였다. 실험에 사용될 세포는 6-well-plate에 계대배양을 하였다. 실험 24시간 전, 배지를 0.1%(v/v) FBS가 첨가된 BEBM으로 교체하여 30분 동안 배양한 후, 2ppm 농도의 오존에 2시간 동안 노출시켰다. 그 후, 세포를 37℃, 5% CO2 조건에서 20시간 30분동안 다시 배양하였다. Were cultured; (Lonza, Basel, Switzerland cat # CC-2540.) (3000cells / cm2) to T- flasks BEGM ™ BulletKit ™ (Lonza, Basel , Switzerland) 37 ℃, 5% CO 2 conditions in human bronchial epithelial cells . The medium reached 90% cell saturation or was replaced every 48 hours. Cells to be used for the experiment were subcultured on a 6-well plate. 24 hours before the experiment, the medium was replaced with BEBM supplemented with 0.1% (v / v) FBS, incubated for 30 minutes, and exposed to 2 ppm ozone for 2 hours. Then, the cells were re-cultured at 37 ° C and 5% CO 2 for 20 hours and 30 minutes.

실험예Experimental Example 1.  One. 웨스턴Western 블랏을Blat 통한 오존 노출에 따른 인간  Human exposure to ozone exposure 기관지상피세포의Bronchial epithelial cells 클라우딘의Claudin 발현 변화 확인 Identification of expression changes

50 mM Tris-HCL(pH 7.4), 50 mM NaCl, 0.1%(v/v) SDS, 1%(v/v) TritonX-100, 0.5 mM EDTA, 및 100 mM PMSF를 증류수에 첨가하여 단백질 용해 용액을 제조하였다. 오존에 노출시킨 인간 기관지상피세포에 상기 단백질 용해 용액을 처리하여 균질화하였다. 그 후, 균질화된 폐 조직을 4℃에서 30분 동안 14,000 rpm로 원심분리하였다. 원심분리한 용액에서 상층액을 수집하였다. 상층액 내 단백질들을 SDS-PAGE를 이용해 분리하였고, PVDF 막으로 이동시켰다. 블로킹(blocking) 과정을 진행하기 위해 막에 0.1%(v/v) Tween 20 및 5%(v/v) BSA를 첨가한 TBS 버퍼를 처리하여 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 그 후, 막을 0.1%(v/v) Tween 20을 첨가한 TBS 버퍼로 3번 세척하였다.After adding 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 50 mM NaCl, 0.1% (v / v) SDS, 1% (v / v) TritonX-100, 0.5 mM EDTA and 100 mM PMSF to distilled water, . Human bronchial epithelial cells exposed to ozone were homogenized by treating the protein lysis solution. The homogenized lung tissue was then centrifuged at 14,000 rpm for 30 minutes at 4 < 0 > C. The supernatant was collected from the centrifuged solution. Proteins in supernatant were separated by SDS-PAGE and transferred to PVDF membrane. To proceed with blocking, the membrane was treated with TBS buffer supplemented with 0.1% (v / v) Tween 20 and 5% (v / v) BSA and reacted at room temperature for 2 hours. The membrane was then washed three times with TBS buffer supplemented with 0.1% (v / v) Tween 20.

세척된 막에 토끼 항-CLDN3 항체(1:1000, Abcam, Cambridge, MA, USA), 토끼 항-CLDN4 항체(1:200, Abcam), 토끼 항-CLDN5 항체(1:200, Abcam) 및 염소 항-CLDN14 항체(1:200, Abcam)를 처리하여 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 다음날, 막을 0.1%(v/v) Tween 20을 첨가한 TBS 버퍼로 3번 세척하였다. (1: 1000, Abcam, Cambridge, MA, USA), rabbit anti-CLDN4 antibody (1: 200, Abcam), rabbit anti-CLDN5 antibody Anti-CLDN14 antibody (1: 200, Abcam) was treated and reacted overnight at 4 ° C. The next day, the membrane was washed 3 times with TBS buffer supplemented with 0.1% (v / v) Tween 20.

세척된 막에 겨자무과산화효소(HRP)가 표지된 염소 항-토끼 항체(Santa Cruz)를 처리하고 1시간 동안 반응시켰다. 그 후, 막을 0.1%(v/v) Tween 20을 첨가한 TBS 버퍼로 3번 세척하였다. 세척된 막에 마우스 항-염소(Santa Cruz) 항체를 처리하고 1시간 동안 반응시켰다. 측정은 WEST-ZOL 플러스 웨스턴 블롯 탐지 시스템(iNtRon, SungNam, 한국)을 이용하였다. 단백질의 상대량은 β-actin (Sigma-aldrich, St Louis, USA)을 통해 비교하였다.The washed membrane was treated with a goat anti-rabbit antibody (Santa Cruz) labeled with mustard radish peroxidase (HRP) and reacted for 1 hour. The membrane was then washed three times with TBS buffer supplemented with 0.1% (v / v) Tween 20. The washed membrane was treated with mouse anti-goat (Santa Cruz) antibody and allowed to react for 1 hour. The measurement was performed using a WEST-ZOL plus western blot detection system (iNtRon, SungNam, Korea). The relative amounts of proteins were compared using β-actin (Sigma-aldrich, St Louis, USA).

그 결과, 오존에 노출된 경우 클라우딘 3(CLDN 3)의 발현이 증가하였다. 반면에, 오존에 노출된 경우 클라우딘 14(CLDN 14)의 발현은 감소하였다(도 1). As a result, expression of claudin 3 (CLDN 3) was increased when exposed to ozone. On the other hand, expression of claudin 14 (CLDN 14) decreased when exposed to ozone (FIG. 1).

II. 오존 노출에 따른 마우스의 II. Ozone exposure CLDN3CLDN3 및  And CLDN14CLDN14 발현 변화 확인 Identification of expression changes

실시예Example 2. 오존에  2. Ozone 노출시킨Exposed 마우스 제작 Mouse production

실시예Example 2.1. 마우스 준비  2.1. Mouse preparation

6주령 BALB/c 암컷 마우스를 하루에 6시간씩 3일 동안 오존에 노출시켰다. 대조군 마우스는 주위의 공기에 하루에 6시간씩 3일 동안 노출시켰다. 4일째에, 기도 과민반응성(AHR)이 측정되고, 기관지폐포세척액(BALF)을 수집하였다. 5일째에 폐 조직을 단백질 발현량 측정 및 염색을 통한 이미지를 얻기 위해 가공하였다(도 2). 6-week-old BALB / c female mice were exposed to ozone for 6 hours a day for 3 days. Control mice were exposed to ambient air for 6 hours a day for 3 days. On day 4, airway hyperresponsiveness (AHR) was measured and bronchoalveolar lavage fluid (BALF) was collected. On day 5, lung tissue was processed to determine protein expression and to obtain images through staining (Figure 2).

실시예Example 2.2. 오존 노출  2.2. Ozone exposure

마우스의 몸 전체가 들어갈 수 있는 챔버에 마우스를 넣었다. 챔버에 넣은 마우스에게 0.1 ppm, 1 ppm 또는 2 ppm 농도의 오존을 챔버에 주입하여, 하루에 6시간씩 3일 동안 노출시켰다. 상기 오존은 Sander Model 50 ozonizer(Sander, Eltze, Germany)를 사용하여 챔버에 주입해주었다. 마우스가 숨쉬는 챔버 안의 공기를 채집하여 ambient-air ozone motors (Model 49C; Thermo Environmental Instruments Inc., Franklin, MA, U.S.A.)를 이용해 챔버 안의 오존 농도를 모니터링하였다. 챔버 안의 온도 및 습도는 일정하게 유지시켰다. 2 ppm 농도의 오존을 주입하였을 경우, 챔버 안의 평균 오존농도는 1.98±0.08 ppm이였다. I put my mouse into the chamber where the whole body of the mouse can enter. Ozone concentrations of 0.1 ppm, 1 ppm, or 2 ppm were injected into the chamber and exposed to the chamber for 6 hours a day for 3 days. The ozone was injected into the chamber using a Sander Model 50 ozonizer (Sander, Eltze, Germany). The air in the chamber where the mouse is breathing was collected and the concentration of ozone in the chamber was monitored using ambient-air ozone motors (Model 49C; Thermo Environmental Instruments Inc., Franklin, MA, U.S.A.). The temperature and humidity in the chamber were kept constant. When 2 ppm ozone was injected, the average ozone concentration in the chamber was 1.98 ± 0.08 ppm.

실시예Example 2.3.  2.3. 기관지폐포세척액Bronchoalveolar lavage fluid 및 폐 조직 준비 And lung tissue preparation

기도과민 반응성 측정 후 다음날, 마우스로부터 기관지폐포세척액을 얻어 -20℃ 온도에 저장하였다. 폐 조직은 4%(v/v) 완충 파라포름알데히드(4% buffered paraformaldehyde)를 처리하고 파라핀에서 박아 고정하였다. 폐 조직은 4 ㎛ 두께의 슬라이스로 잘랐다. After the measurement of airway hyperresponsiveness, bronchoalveolar lavage fluid was obtained from mice the next day and stored at -20 ° C. The lung tissue was treated with 4% (v / v) buffered paraformaldehyde (4% buffered paraformaldehyde) and fixed in paraffin. Lung tissue was cut into slices 4 μm thick.

실험예Experimental Example 3.  3. 기도과민Prayer sensitivity 반응성 측정 Reactivity measurement

실시예 2.2.에서 오존에 노출시킨 마우스의 기도과민 반응성은 기도 저항을 측정하여 판단하였다. 기도 저항의 정도는 Penh(enhanced pause)를 측정하여 평가하였다. Penh의 측정은 마우스를 챔버에 넣고 정상 호흡 상태에서 기저 값을 측정한 후 PBS를 네뷸라이저를 이용하여 5분간 흡입시킨 후 3분간 측정하였다. 이후 메타콜린을 0 mg/ml, 5 mg/ml, 20 mg/ml 또는 100 mg/ml 농도로 점차 증가시키면서 흡입시킨 후 Pehn을 측정하였다. 기도 저항의 지표로 이용된 Pehn은 한 주기의 호흡에 대하여 최대호기유량(peak expiratory flow, PEF)/최대흡기유량(peak inspiratory flow, PIF)의 비와 전반기 호기량(former expiratory volume)에 비례하는 무차원의 수로 표시되며 기도저항과 상관관계가 좋아 기도 수축의 지표로 알려져 있다. The airway hyperresponsiveness of mice exposed to ozone in Example 2.2. Was determined by measuring airway resistance. The degree of airway resistance was assessed by measuring Penh (enhanced pause). Penh measurements were made by placing the mouse in a chamber and measuring the basal value under normal breathing conditions. After the PBS was inhaled for 5 minutes using a nebulizer, it was measured for 3 minutes. Pehn was measured after inhaling methacholine with increasing concentrations of 0 mg / ml, 5 mg / ml, 20 mg / ml or 100 mg / ml. Pehn, used as an index of airway resistance, is proportional to the ratio of peak expiratory flow (PEF) / peak inspiratory flow (PIF) to the former expiratory volume (former expiratory volume) It is indicated by the number of dimensions and correlates with airway resistance, so it is known as an index of airway constriction.

Penh= (Te/RT-1)(PEF/PIF)Penh = (Te / RT-1) (PEF / PIF)

Te= expiratory time,Te = expiratory time,

RT= relaxation time,RT = relaxation time,

PEF= peak expiratory flow,PEF = peak expiratory flow,

PIF= peak inspiratory flow PIF = peak inspiratory flow

그 결과, 높은 농도의 오존에 노출된 마우스일수록 메타콜린에 대해 높은 기도과민 반응성을 보였다(도 3).As a result, mice exposed to high concentrations of ozone showed a high airway hyperresponsiveness to methacholine (FIG. 3).

실험예Experimental Example 4.  4. 웨스턴Western 블랏을Blat 통한 오존 노출에 따른 마우스 폐 조직에서의  Of ozone exposure in mouse lung tissue 클라우딘의Claudin 발현 변화 확인 Identification of expression changes

50 mM Tris-HCL (pH 7.4), 50mM NACL, 0.1%(v/v) SDS, 1%(v/v) TritonX-100, 0.5 mM EDTA, 및 100mM PMSF를 증류수에 첨가하여 단백질 용해 용액을 제조하였다. 파라핀화된 폐 조직에 상기 단백질 용해 용액을 처리하여 균질화하였다. 그 후, 균질화된 폐 조직을 4℃에서 30분 동안 14,000 rpm로 원심분리하였다. 원심분리한 용액에서 상층액을 수집하였다. The protein solution was prepared by adding 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 50 mM NACL, 0.1% (v / v) SDS, 1% (v / v) TritonX-100, 0.5 mM EDTA and 100 mM PMSF to distilled water. Respectively. Paraffinized lung tissue was treated with the protein lysis solution and homogenized. The homogenized lung tissue was then centrifuged at 14,000 rpm for 30 minutes at 4 < 0 > C. The supernatant was collected from the centrifuged solution.

상층액 내 단백질들을 SDS-PAGE를 이용해 분리하였고, PVDF 막으로 이동시켰다. 블로킹(blocking) 과정을 진행하기 위해 막을 0.1%(v/v) Tween 20 및 5%(v/v) BSA를 첨가한 TBS 버퍼를 처리하여 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 그 후, 막을 0.1%(v/v) Tween 20을 첨가한 TBS 버퍼로 3번 세척하였다. Proteins in supernatant were separated by SDS-PAGE and transferred to PVDF membrane. For blocking, the membrane was treated with TBS buffer supplemented with 0.1% (v / v) Tween 20 and 5% (v / v) BSA and reacted at room temperature for 2 hours. The membrane was then washed three times with TBS buffer supplemented with 0.1% (v / v) Tween 20.

세척된 막에 토끼 항-CLDN3 항체(1:1000, Abcam, Cambridge, MA, USA), 토끼 항-CLDN4 항체(1:200, Abcam), 토끼 항-CLDN5 항체(1:200, Abcam) 및 염소 항-CLDN14 항체(1:200, Abcam)를 처리하여 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 다음날, 막을 0.1%(v/v) Tween 20을 첨가한 TBS 버퍼로 3번 세척하였다. (1: 1000, Abcam, Cambridge, MA, USA), rabbit anti-CLDN4 antibody (1: 200, Abcam), rabbit anti-CLDN5 antibody Anti-CLDN14 antibody (1: 200, Abcam) was treated and reacted overnight at 4 ° C. The next day, the membrane was washed 3 times with TBS buffer supplemented with 0.1% (v / v) Tween 20.

세척된 막에 겨자무과산화효소(HRP)가 표지된 염소 항-토끼 항체(Santa Cruz)를 처리하고 1시간 동안 반응시켰다. 그 후, 막을 0.1%(v/v) Tween 20을 첨가한 TBS 버퍼로 3번 세척하였다. 세척된 막에 마우스 항-염소(Santa Cruz) 항체를 처리하고 1시간 동안 반응시켰다. 측정은 WEST-ZOL 플러스 웨스턴 블롯 탐지 시스템(iNtRon, SungNam, 한국)을 이용하였다. 단백질의 상대량은 β-actin (Sigma-aldrich, St Louis, USA)을 통해 비교하였다. The washed membrane was treated with a goat anti-rabbit antibody (Santa Cruz) labeled with mustard radish peroxidase (HRP) and reacted for 1 hour. The membrane was then washed three times with TBS buffer supplemented with 0.1% (v / v) Tween 20. The washed membrane was treated with mouse anti-goat (Santa Cruz) antibody and allowed to react for 1 hour. The measurement was performed using a WEST-ZOL plus western blot detection system (iNtRon, SungNam, Korea). The relative amounts of proteins were compared using β-actin (Sigma-aldrich, St Louis, USA).

그 결과, 높은 농도의 오존에 노출된 마우스일수록 클라우딘 3의 발현이 증가하였다. 반면에, 높은 농도의 오존에 노출된 마우스일수록 클라우딘 14의 발현은 감소하였다(도 4). As a result, expression of cladin-3 was increased in mice exposed to high concentrations of ozone. On the other hand, expression of claudin 14 decreased in mice exposed to high concentrations of ozone (Fig. 4).

실험예Experimental Example 5. 면역조직화학적 염색을 통한 오존 노출에 따른 마우스 폐 조직에서의  5. Ozone exposure by immunohistochemical staining in mouse lung tissue 클라우딘의Claudin 발현 변화 확인 Identification of expression changes

파라핀화 시킨 마우스의 폐 조직 슬라이스를 60℃ 오븐에서 1시간 동안 탈파라핀화시켰다. 100% 자일렌(Xylene 100%), 90%(v/v) 알코올(alcohol 90%), 80%(v/v) 알코올(alcohol-80%) 순서로 점진적으로 수화(hydration)를 시켰다. 폐 조직 내 퍼록시다아제 활성을 막기 위해 1.4%(v/v) 과산화수소가 첨가된 메탄올을 처리하고 30분간 반응시켰다. 블로킹 과정을 진행하기 위해 1.5%(v/v) 말혈청(horse serum) 처리하고 30분 동안 반응시켰다. 그 후, PBS버퍼로 3번 세척하였다.The lung tissue slices of the paraffinized mice were deparaffinized in an oven at < RTI ID = 0.0 > 60 C < / RTI > for 1 hour. And gradually hydrated in the order of 100% xylene (100%), 90% (v / v) alcohol (90%) and 80% (v / v) alcohol. To prevent peroxidase activity in lung tissue, methanol treated with 1.4% (v / v) hydrogen peroxide was added and reacted for 30 minutes. To proceed with the blocking procedure, 1.5% (v / v) horse serum was added and reacted for 30 minutes. Then, it was washed three times with PBS buffer.

블로킹 과정을 거친 마우스의 폐 조직 슬라이스에 토끼 항-CLDN3 항체(1:1000, Abcam) 또는 토끼 항-CLDN4 항체(1:200, Abcam)를 처리하고 상온에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 다음날, PBS버퍼로 3번 세척하였다.The mice were treated with rabbit anti-C-LDN3 antibody (1: 1000, Abcam) or rabbit anti-C-LDN4 antibody (1: 200, Abcam) to the lung tissue slice after the blocking process and reacted overnight at room temperature. The next day, they were washed 3 times with PBS buffer.

세척된 마우스의 폐 조직 슬라이스에 ABC kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)를 이용하여 2차 항체 반응을 진행하였다. 액체 DAB+ 기질 키트(Golden Bridge International Inc, Mukilteo, USA)를 이용하여 발색 반응은 진행하였다. 그 후, 헤마톡실린(Hematoxylin)으로 1분 동안 대조 염색을 시키고, ImageJ software (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)를 이용하여 확인하였다.Secondary antibody reaction was performed on the lung tissue slice of the washed mouse using ABC kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). The color reaction was carried out using a liquid DAB + substrate kit (Golden Bridge International Inc, Mukilteo, USA). Thereafter, control staining was performed with hematoxylin for 1 minute and confirmed using ImageJ software (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).

그 결과, 높은 농도의 오존에 노출된 마우스일수록 클라우딘 3에 대한 염색이 짙게 나타내므로, 높은 농도의 오존에 노출된 마우스일수록 클라우딘 3의 발현이 증가하였다(도 5).As a result, expression of cladin-3 was increased in mice exposed to high concentrations of ozone, since mice exposed to high concentrations of ozone exhibited high levels of staining for cladin-3 (FIG. 5).

실험예 6. 면역형광염색을 통한 오존 노출에 따른 마우스 폐 조직에서의 클라우딘의 발현 변화 확인 Experimental Example 6 . Changes in expression of clathrin in mouse lung tissue following exposure to ozone by immunofluorescence staining

파라핀화 시킨 마우스의 폐 조직 슬라이스를 60℃ 오븐에서 1시간 동안 탈파라핀화시켰다. 100% 자일렌(Xylene 100%), 90%(v/v) 알코올(alcohol 90%), 80%(v/v) 알코올(alcohol-80%) 순서로 점진적으로 수화(hydration)를 시켰다. 폐 조직 내 퍼록시다아제 활성을 막기 위해 1.4%(v/v) 과산화수소가 첨가된 메탄올을 처리하고 30분간 반응시켰다. 블로킹 과정을 진행하기 위해 1.5%(v/v) 말혈청(horse serum) 처리하고 30분 동안 반응시켰다. 그 후, PBS버퍼로 3번 세척하였다. 세척된 마우스의 폐 조직 슬라이스에 토끼 항-CLDN3 항체(1:1000, Abcam) 또는 토끼 항-CLDN4 항체(1:200, Abcam)를 처리하고 상온에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 다음날, PBS 버퍼로 3번 세척하였다. The lung tissue slices of the paraffinized mice were deparaffinized in an oven at < RTI ID = 0.0 > 60 C < / RTI > for 1 hour. And gradually hydrated in the order of 100% xylene (100%), 90% (v / v) alcohol (90%) and 80% (v / v) alcohol. To prevent peroxidase activity in lung tissue, methanol treated with 1.4% (v / v) hydrogen peroxide was added and reacted for 30 minutes. To proceed with the blocking procedure, 1.5% (v / v) horse serum was added and reacted for 30 minutes. Then, it was washed three times with PBS buffer. The lung tissue slices of the washed mice were treated with rabbit anti-CLDN3 antibody (1: 1000, Abcam) or rabbit anti-CLDN4 antibody (1: 200, Abcam) and reacted overnight at room temperature. The next day, they were washed 3 times with PBS buffer.

세척된 마우스의 폐 조직 슬라이스에 FITC가 표지된 염소 항-토끼 항체(1:1000, Abcam)와 PE가 표지된 염소 항-쥐 항체(1:1000, Abcam)를 처리하고 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 핵은 DAPI(1:1000 Invitrogen, Grand Island, NY, USA)로 대조 염색하였다. 형광 현미경(Carl Zeiss Microsystems, Thornwood, USA)을 이용하여 6400nm 파장에서 800x 배율로, LSM 510 META 카메라를 이용하여 측정하였다. 이미지는 Zeiss LSM 이미지 브라우저를 이용하여 생성하였다.A lung tissue slice of the washed mouse was treated with goat anti-rabbit antibody (1: 1000, Abcam) labeled with FITC and goat anti-mouse antibody (1: 1000, Abcam) labeled with PE and reacted at room temperature for 2 hours . Nuclei were stained with DAPI (1: 1000 Invitrogen, Grand Island, NY, USA). Were measured using a LSM 510 META camera at 800x magnification at 6400 nm using a fluorescence microscope (Carl Zeiss Microsystems, Thornwood, USA). Images were created using the Zeiss LSM image browser.

그 결과, 높은 농도의 오존에 노출된 마우스일수록 클라우딘 3에 대한 염색이 짙게 나타내므로, 높은 농도의 오존에 노출된 마우스일수록 클라우딘 3의 발현이 증가하였다(도 6).As a result, mice exposed to high concentrations of ozone exhibited a stronger staining for claudin 3, so that mice exposed to high concentrations of ozone increased expression of claudin 3 (FIG. 6).

<110> Soonchunhyang University Industry Academy Cooperation Foundation <120> BIOMARKER FOR IDENTIFYING EXPOSURE TO AIR POLLUTANTS AND METHOD FOR IDENTIFYING EXPOSURE TO AIR POLLUTANTS USING THE SAME <130> FPD/201702-0050 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 663 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgtccatgg gcctggagat cacgggcacc gcgctggccg tgctgggctg gctgggcacc 60 atcgtgtgct gcgcgttgcc catgtggcgc gtgtcggcct tcatcggcag caacatcatc 120 acgtcgcaga acatctggga gggcctgtgg atgaactgcg tggtgcagag caccggccag 180 atgcagtgca aggtgtacga ctcgctgctg gcactgccac aggaccttca ggcggcccgc 240 gccctcatcg tggtggccat cctgctggcc gccttcgggc tgctagtggc gctggtgggc 300 gcccagtgca ccaactgcgt gcaggacgac acggccaagg ccaagatcac catcgtggca 360 ggcgtgctgt tccttctcgc cgccctgctc accctcgtgc cggtgtcctg gtcggccaac 420 accattatcc gggacttcta caaccccgtg gtgcccgagg cgcagaagcg cgagatgggc 480 gcgggcctgt acgtgggctg ggcggccgcg gcgctgcagc tgctgggggg cgcgctgctc 540 tgctgctcgt gtcccccacg cgagaagaag tacacggcca ccaaggtcgt ctactccgcg 600 ccgcgctcca ccggcccggg agccagcctg ggcacaggct acgaccgcaa ggactacgtc 660 taa 663 <210> 2 <211> 220 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ser Met Gly Leu Glu Ile Thr Gly Thr Ala Leu Ala Val Leu Gly 1 5 10 15 Trp Leu Gly Thr Ile Val Cys Cys Ala Leu Pro Met Trp Arg Val Ser 20 25 30 Ala Phe Ile Gly Ser Asn Ile Ile Thr Ser Gln Asn Ile Trp Glu Gly 35 40 45 Leu Trp Met Asn Cys Val Val Gln Ser Thr Gly Gln Met Gln Cys Lys 50 55 60 Val Tyr Asp Ser Leu Leu Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Ala Ala Arg 65 70 75 80 Ala Leu Ile Val Val Ala Ile Leu Leu Ala Ala Phe Gly Leu Leu Val 85 90 95 Ala Leu Val Gly Ala Gln Cys Thr Asn Cys Val Gln Asp Asp Thr Ala 100 105 110 Lys Ala Lys Ile Thr Ile Val Ala Gly Val Leu Phe Leu Leu Ala Ala 115 120 125 Leu Leu Thr Leu Val Pro Val Ser Trp Ser Ala Asn Thr Ile Ile Arg 130 135 140 Asp Phe Tyr Asn Pro Val Val Pro Glu Ala Gln Lys Arg Glu Met Gly 145 150 155 160 Ala Gly Leu Tyr Val Gly Trp Ala Ala Ala Ala Leu Gln Leu Leu Gly 165 170 175 Gly Ala Leu Leu Cys Cys Ser Cys Pro Pro Arg Glu Lys Lys Tyr Thr 180 185 190 Ala Thr Lys Val Val Tyr Ser Ala Pro Arg Ser Thr Gly Pro Gly Ala 195 200 205 Ser Leu Gly Thr Gly Tyr Asp Arg Lys Asp Tyr Val 210 215 220 <210> 3 <211> 720 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atggccagca cggccgtgca gcttctgggc ttcctgctca gcttcctggg catggtgggc 60 acgttgatca ccaccatcct gccgcactgg cggaggacag cgcacgtggg caccaacatc 120 ctcacggccg tgtcctacct gaaagggctc tggatggagt gtgtgtggca cagcacaggc 180 atctaccagt gccagatcta ccgatccctg ctggcgctgc cccaagacct ccaggctgcc 240 cgcgccctca tggtcatctc ctgcctgctc tcgggcatag cctgcgcctg cgccgtcatc 300 gggatgaagt gcacgcgctg cgccaagggc acacccgcca agaccacctt tgccatcctc 360 ggcggcaccc tcttcatcct ggccggcctc ctgtgcatgg tggccgtctc ctggaccacc 420 aacgacgtgg tgcagaactt ctacaacccg ctgctgccca gcggcatgaa gtttgagatt 480 ggccaggccc tgtacctggg cttcatctcc tcgtccctct cgctcattgg tggcaccctg 540 ctttgcctgt cctgccagga cgaggcaccc tacaggccct accaggcccc gcccagggcc 600 accacgacca ctgcaaacac cgcacctgcc taccagccac cagctgccta caaagacaat 660 cgggccccct cagtgacctc ggccacgcac agcgggtaca ggctgaacga ctacgtgtga 720 720 <210> 4 <211> 239 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Ala Ser Thr Ala Val Gln Leu Leu Gly Phe Leu Leu Ser Phe Leu 1 5 10 15 Gly Met Val Gly Thr Leu Ile Thr Thr Ile Leu Pro His Trp Arg Arg 20 25 30 Thr Ala His Val Gly Thr Asn Ile Leu Thr Ala Val Ser Tyr Leu Lys 35 40 45 Gly Leu Trp Met Glu Cys Val Trp His Ser Thr Gly Ile Tyr Gln Cys 50 55 60 Gln Ile Tyr Arg Ser Leu Leu Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Ala Ala 65 70 75 80 Arg Ala Leu Met Val Ile Ser Cys Leu Leu Ser Gly Ile Ala Cys Ala 85 90 95 Cys Ala Val Ile Gly Met Lys Cys Thr Arg Cys Ala Lys Gly Thr Pro 100 105 110 Ala Lys Thr Thr Phe Ala Ile Leu Gly Gly Thr Leu Phe Ile Leu Ala 115 120 125 Gly Leu Leu Cys Met Val Ala Val Ser Trp Thr Thr Asn Asp Val Val 130 135 140 Gln Asn Phe Tyr Asn Pro Leu Leu Pro Ser Gly Met Lys Phe Glu Ile 145 150 155 160 Gly Gln Ala Leu Tyr Leu Gly Phe Ile Ser Ser Ser Leu Ser Leu Ile 165 170 175 Gly Gly Thr Leu Leu Cys Leu Ser Cys Gln Asp Glu Ala Pro Tyr Arg 180 185 190 Pro Tyr Gln Ala Pro Pro Arg Ala Thr Thr Thr Thr Ala Asn Thr Ala 195 200 205 Pro Ala Tyr Gln Pro Pro Ala Ala Tyr Lys Asp Asn Arg Ala Pro Ser 210 215 220 Val Thr Ser Ala Thr His Ser Gly Tyr Arg Leu Asn Asp Tyr Val 225 230 235 <110> Soonchunhyang University Industry Academy Cooperation Foundation <120> BIOMARKER FOR IDENTIFYING EXPOSURE TO AIR POLLUTANTS AND METHOD          FOR IDENTIFYING EXPOSURE TO AIR POLLUTANTS USING THE SAME <130> FPD / 201702-0050 <160> 4 <170> KoPatentin 3.0 <210> 1 <211> 663 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgtccatgg gcctggagat cacgggcacc gcgctggccg tgctgggctg gctgggcacc 60 atcgtgtgct gcgcgttgcc catgtggcgc gtgtcggcct tcatcggcag caacatcatc 120 acgtcgcaga acatctggga gggcctgtgg atgaactgcg tggtgcagag caccggccag 180 atgcagtgca aggtgtacga ctcgctgctg gcactgccac aggaccttca ggcggcccgc 240 gccctcatcg tggtggccat cctgctggcc gccttcgggc tgctagtggc gctggtgggc 300 gcccagtgca ccaactgcgt gcaggacgac acggccaagg ccaagatcac catcgtggca 360 gt; accattatcc gggacttcta caaccccgtg gtgcccgagg cgcagaagcg cgagatgggc 480 gcgggcctgt acgtgggctg ggcggccgcg gcgctgcagc tgctgggggg cgcgctgctc 540 tgctgctcgt gtcccccacg cgagaagaag tacacggcca ccaaggtcgt ctactccgcg 600 ccgcgctcca ccggcccggg agccagcctg ggcacaggct acgaccgcaa ggactacgtc 660 taa 663 <210> 2 <211> 220 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ser Met Gly Leu Glu Ile Thr Gly Thr Ala Leu Ala Val Leu Gly   1 5 10 15 Trp Leu Gly Thr Ile Val Cys Cys Ala Leu Pro Met Trp Arg Val Ser              20 25 30 Ala Phe Ile Gly Ser Asn Ile Ile Thr Ser Gln Asn Ile Trp Glu Gly          35 40 45 Leu Trp Met Asn Cys Val Val Gln Ser Thr Gly Gln Met Gln Cys Lys      50 55 60 Val Tyr Asp Ser Leu Leu Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Ala Ala Arg  65 70 75 80 Ala Leu Ile Val Ala Ile Leu Leu Ala Ala Phe Gly Leu Leu Val                  85 90 95 Ala Leu Val Gly Ala Gln Cys Thr Asn Cys Val Gln Asp Asp Thr Ala             100 105 110 Lys Ala Lys Ile Thr Ile Val Ala Gly Val Leu Phe Leu         115 120 125 Leu Leu Thr Leu Val Ser Val Ser Serp Ser Ala Asn Thr Ile Ile Arg     130 135 140 Asp Phe Tyr Asn Pro Val Val Pro Glu Ala Gln Lys Arg Glu Met Gly 145 150 155 160 Ala Gly Leu Tyr Val Gly Trp Ala Ala Ala Leu Gln Leu Leu Gly                 165 170 175 Gly Ala Leu Leu Cys Cys Ser Cys Pro Pro Arg Glu Lys Lys Tyr Thr             180 185 190 Ala Thr Lys Val Val Tyr Ser Ala Pro Arg Ser Thr Gly Pro Gly Ala         195 200 205 Ser Leu Gly Thr Gly Tyr Asp Arg Lys Asp Tyr Val     210 215 220 <210> 3 <211> 720 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atggccagca cggccgtgca gcttctgggc ttcctgctca gcttcctggg catggtgggc 60 acgttgatca ccaccatcct gccgcactgg cggaggacag cgcacgtggg caccaacatc 120 ctcacggccg tgtcctacct gaaagggctc tggatggagt gtgtgtggca cagcacaggc 180 atctaccagt gccagatcta ccgatccctg ctggcgctgc cccaagacct ccaggctgcc 240 cgcgccctca tggtcatctc ctgcctgctc tcgggcatag cctgcgcctg cgccgtcatc 300 gggatgaagt gcacgcgctg cgccaagggc acacccgcca agaccacctt tgccatcctc 360 ggcggcaccc tcttcatcct ggccggcctc ctgtgcatgg tggccgtctc ctggaccacc 420 aacgacgtgg tgcagaactt ctacaacccg ctgctgccca gcggcatgaa gtttgagatt 480 ggccaggccc tgtacctggg cttcatctcc tcgtccctct cgctcattgg tggcaccctg 540 ctttgcctgt cctgccagga cgaggcaccc tacaggccct accaggcccc gcccagggcc 600 accacgacca ctgcaaacac cgcacctgcc taccagccac cagctgccta caaagacaat 660 cgggccccct cagtgacctc ggccacgcac agcgggtaca ggctgaacga ctacgtgtga 720                                                                          720 <210> 4 <211> 239 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Ala Ser Thr Ala Val Gln Leu Leu Gly Phe Leu Leu Ser Phe Leu   1 5 10 15 Gly Met Val Gly Thr Leu Ile Thr Thr Ile Leu Pro His Trp Arg Arg              20 25 30 Thr Ala His Val Gly Thr Asn Ile Leu Thr Ala Val Ser Tyr Leu Lys          35 40 45 Gly Leu Trp Met Glu Cys Val Trp His Ser Thr Gly Ile Tyr Gln Cys      50 55 60 Gln Ile Tyr Arg Ser Leu Leu Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Ala Ala  65 70 75 80 Arg Ala Leu Met Val Ile Ser Cys Leu Leu Ser Gly Ile Ala Cys Ala                  85 90 95 Cys Ala Val Ile Gly Met Lys Cys Thr Arg Cys Ala Lys Gly Thr Pro             100 105 110 Ala Lys Thr Thr Phe Ale Ile Leu Gly Gly Thr Leu Phe Ile Leu Ala         115 120 125 Gly Leu Leu Cys Met Val Ala Val Ser Trp Thr Asn Asp Val Val     130 135 140 Gln Asn Phe Tyr Asn Pro Leu Leu Pro Ser Gly Met Lys Phe Glu Ile 145 150 155 160 Gly Gln Ala Leu Tyr Leu Gly Phe Ile Ser Ser Ser Leu Ser Leu Ile                 165 170 175 Gly Gly Thr Leu Leu Cys Leu Ser Cys Gln Asp Glu Ala Pro Tyr Arg             180 185 190 Pro Tyr Gln Ala Pro Pro Arg Ala Thr Thr Thr Thr Ala Asn Thr Ala         195 200 205 Pro Ala Tyr Gln Pro Pro Ala Ala Tyr Lys Asp Asn Arg Ala Pro Ser     210 215 220 Val Thr Ser Ala Thr His Ser Gly Tyr Arg Leu Asn Asp Tyr Val 225 230 235

Claims (13)

삭제delete 클라우딘 3 및 클라우딘 14로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 검출하는 제제를 포함하는, 오존 노출 여부 확인용 키트. Clone 3, and claudin 14, or an agent that detects a gene encoding the same. 제 2항에 있어서,
상기 검출 제제가 상기 단백질을 코딩하는 유전자에 상보적으로 결합할 수 있는 프라이머 또는 프로브인, 오존 노출 여부 확인용 키트. 3. The method of claim 2,
Wherein the detection agent is a primer or a probe capable of complementarily binding to a gene encoding the protein. 제 2항에 있어서,
상기 검출 제제가 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체인, 오존 노출 여부 확인용 키트. 3. The method of claim 2,
Wherein the detection agent is an antibody that specifically binds to the protein. i) 오존 노출이 의심되는 개체로부터 분리된 시료에서 클라우딘 3의 발현량을 측정하는 단계;
ii) 상기 발현량과 정상 대조군 시료의 발현량을 비교하는 단계; 및
iii) 상기 발현량이 대조군에 비해 높은 경우, 개체가 오존에 노출되었다고 판정하는 단계를 포함하는, 오존 노출에 대한 정보 제공방법.i) measuring the expression level of claudin 3 in a sample separated from the subject suspected of ozone exposure;
ii) comparing the expression level of the digested amount with a normal control sample; And
iii) determining that the subject has been exposed to ozone when the amount of expression is higher than that of the control. 제 5항에 있어서,
상기 클라우딘 3의 발현량을 측정하는 단계가 클라우딘 3의 mRNA 또는 단백질을 측정하는 것인, 오존 노출에 대한 정보 제공방법.6. The method of claim 5,
Wherein the step of measuring the expression level of claudin 3 measures the mRNA or protein of claudin 3. 제 6항에 있어서,
상기 클라우딘 3의 mRNA을 측정하는 단계에서 상기 클라우딘 3 유전자에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 프라이머를 이용하는, 오존 노출에 대한 정보 제공방법.The method according to claim 6,
Wherein a probe or a primer that specifically binds to the claudin 3 gene is used in measuring the mRNA of claudin 3. 제 6항에 있어서,
상기 클라우딘 3의 단백질을 측정하는 단계에서 상기 클라우딘 3 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하는, 오존 노출에 대한 정보 제공방법.The method according to claim 6,
Wherein an antibody that specifically binds to the claudin 3 protein is used in the step of measuring the protein of claudin 3. i) 오존 노출이 의심되는 개체로부터 분리된 시료에서 클라우딘 14의 발현량을 측정하는 단계;
ii) 상기 발현량과 정상 대조군 시료의 발현량을 비교하는 단계; 및
iii) 상기 발현량이 대조군에 비해 낮은 경우, 개체가 오존에 노출되었다고 판정하는 단계를 포함하는, 오존 노출에 대한 정보 제공방법.i) measuring the expression level of claudin 14 in a sample separated from the subject suspected of ozone exposure;
ii) comparing the expression level of the digested amount with a normal control sample; And
iii) determining that the subject is exposed to ozone when the amount of expression is lower than that of the control. 제 9항에 있어서,
상기 클라우딘 14의 발현량을 측정하는 단계가 클라우딘 14의 mRNA 또는 단백질을 측정하는 것인, 오존 노출에 대한 정보 제공방법.10. The method of claim 9,
Wherein the step of measuring the expression level of claudin 14 measures the mRNA or protein of claudin 14. 제 10항에 있어서,
상기 클라우딘 14의 mRNA을 측정하는 단계에서 상기 클라우딘 14 유전자에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 프라이머를 이용하는, 오존 노출에 대한 정보 제공방법.11. The method of claim 10,
Wherein a probe or a primer that specifically binds to the Claudin 14 gene is used in measuring the mRNA of Claudine 14. 제 10항에 있어서,
상기 클라우딘 14의 단백질을 측정하는 단계에서 상기 클라우딘 14 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하는, 오존 노출에 대한 정보 제공방법.11. The method of claim 10,
Wherein an antibody that specifically binds to the claudin 14 protein is used in measuring the protein of claudin 14. 클라우딘 3 또는 클라우딘 14의 유전자 또는 그와 상보적인 핵산이 집적된 오존 노출 여부 확인용 DNA 마이크로어레이칩.A DNA microarray chip for confirming whether or not ozone is accumulated on the gene of Claudin 3 or Claudin 14 or its complementary nucleic acid.
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