KR101952648B1 - 양춘사 추출물을 함유하는 지방간 예방 및 치료 개선 조성물 - Google Patents
양춘사 추출물을 함유하는 지방간 예방 및 치료 개선 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 양춘사 추출물 유효성분을 함유하는 지방간 예방 및 치료 개선 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 상기 양춘사 추출물은 물로 추출하는 것을 특징으로 하며, 마우스 경구 투여 기준으로 100 ~ 500mg/kg 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 지방간 예방 및 치료 개선용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 양춘사 추출물의 지방간 생성에 대한 억제 효능 및 그 기전을 in vitro와 in vivo에서 간 내 TG억제, ER stress 관련 유전자 발현 억제, 지방합성 관련 유전자 발현을 억제하는 효능을 통해 양춘사 추출물 유효성분을 함유하는 지방간 예방 및 치료 개선 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기 양춘사 추출물은 물로 추출하는 것을 특징으로 하며, 마우스 경구 투여 기준으로 100 ~ 500mg/kg 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 지방간 예방 및 치료 개선용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 양춘사 추출물의 지방간 생성에 대한 억제 효능 및 그 기전을 in vitro와 in vivo에서 간 내 TG억제, ER stress 관련 유전자 발현 억제, 지방합성 관련 유전자 발현을 억제하는 효능을 통해 양춘사 추출물 유효성분을 함유하는 지방간 예방 및 치료 개선 조성물을 제공하는 것이다.
Description
본 발명은 양춘사 추출물 유효성분을 함유하는 지방간 예방 및 치료 개선 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 상기 양춘사 추출물은 물로 추출하는 것을 특징으로 하며, 양춘사 추출물의 지방간 생성에 대한 억제 효능 및 그 기전을 in vitro와 in vivo에서 간내 TG억제, ER stress 관련 유전자 발현 억제, 지방합성 관련 유전자 발현을 억제 효능을 통해 양춘사 추출물 유효성분을 함유하는 지방간 예방 및 치료 개선 조성물을 제공하는 것이다.
일반적으로 건강한 간의 지방 비율은 5% 이며, 이보다 많은 지방이 축적된 간을 지방간이라고 한다. 최근 영양상태가 좋아지고 성인병이 늘어감에 따라 지방간 환자가 증가하고 있다. 지방의 과도한 섭취로 인한 간 내 지방 축적 및 합성 및 정상적 지방대사가 이루어 지지 못하고 발명하는 질환이다.
지방간은 과음으로 인한 알코올성 지방간과 비만, 당뇨병, 고지혈증, 약물 등으로 인한 비알코올성 지방간으로 나눌 수 있다. 알코올성 지방간은 알코올을 많이 섭취하게 되면 간에서 지방 합성이 촉진되고 정상적인 에너지 대사가 이루어지지 않아 발생하게 된다.
즉, 지방간의 주 원인은 음주와 비만이며, 혈중 지방질의 농도가 높은 고지혈증이나 당뇨병 등의 질병에 동반되어 나타나기도 하고, 부신피질 호르몬제(스테로이드제)나 여성 호르몬제 등의 약제도 원인이 될 수 있다.
지방간은 대부분 증상이 없어서 외관 상으로 건강해 보이며, 피로감과 전신 권태감, 간혹 우상복부 불편감이나 약간의 통증을 느낄 수 있다. 따라서 명확하게 드러나기 보다는 대부분 혈액 검사로 간기능 검사를 하거나 초음파 검사에서 이상 소견이 발견되는 경우가 많다.
이러한 지방간의 치료방법은 알코올, 비알코올지방간에 따라 다르다.
알콜성 지방간의 치료 방법은 먼저 생활습관의 개선으로 과도한 음주로 발병되므로 치료는 술을 끊는 것으로 시작하여, 건강상태를 파악하고, 지속적으로 관리한다. 두번째로 술을 끊거나 줄이는 방법 이외에 항산화제(비타민 E, 비타민 B, C)가 치료제로 사용된다. 간세포 보호제인 우루소데옥시콜린산(urosodeoxycholic acid, UDCA)이나 실리마린(silymarin) 등을 사용하여 간을 보호해 준다.
비알콜성 지방간의 치료방법은 생활습관 개선, 수술적 치료, 약물요법 등이 있다.
지방간질환 환자의 70~80%는 비만이고, 그 외에 상당수 환자는 과체중이다. 따라서 체중감소는 인슐린 감수성을 향상시켜서 지방간이 호전시키며, 최근에는 체중의 약 5% 정도만 감량해도 인슐린저항성이 개선되고 간 기능 수치가 호전된다는 보고가 있다. 이에 생활습관의 개선이 무엇보다 중요하다.
두번째로 과거에는 비만수술요법을 많이 사용하지 않았으나, 최근 고도비만환자가 증가하면서 고도비만(체질량 지수 > 40Kg/m2)이거나 체질량지수 > 35Kg/m2 이상이면서 당뇨나 고혈압 등 위험인자가 동반된 경우에 권장한다. 1) 조기포만감을 유도하여 음식섭취를 줄이는 시술(gastric banding), 2) 소장을 우회시켜 흡수 불량을 유도하는 시술(jejunoileal bypass), 3) 위 두 가지 모두의 효과를 얻기 위한 시술(Roux-en-Y gastric bypass, bilopancreatic diversion)이 있다.
세번째로 약물요법은 당뇨병 치료제 및 인슐린 저항성 개선 약물, 항산화제 및 간세포 보호제, 고지혈증 치료 약물을 사용한다. 당뇨병 치료제 및 인슐린 저항성 개선 약물을 사용하여 포도당 수용체를 증가시켜 근육에서 당의 흡수를 촉진하고, 지방세포의 분화를 촉진하고 하여, 간내 지방 침착을 감소시켜 지방간 및 지방간염의 치료에 효과가 있다. 또한, 지방간 질환의 발생기전의 하나인 산화 스트레스 감소를 위해 항산화제 사용이 연구되고 있으며, 고지혈증 치료제를 사용함으로써 관련 지방관에 효능이 있다고 보고된 바 있다.
그러나 지방간의 약물학적 치료를 위한 유용한 약물은 거의 없는 실정이며, 운동과 식이요법이 권장되고 있다. 또한, 상기 약물을 사용할 경우, 오히려 젖산증, 근육에 미토콘드리아 손상, 염증, 섬유화 등 여러 부작용 또한 보고된 바 있다. 지방간은 상대적으로 초기에는 식이조절로 회복 가능한 가벼운 질환이나 장기간 지속될 경우, 간이 손상되면서 간의 회복이 불가능 해질 수도 있는 무서운 질병이다. 따라서 이러한 지방간의 약제 선택도 단기 및 장기간 복용해도 부작용이 없어야 한다.
이에 본 출원인은 양춘사(Amomum villosum Loureiro) 추출물을 이용하여 부작용이 없으며, 장기 복용하여도 독성이 없고, 지방간 예방, 치료 개선에 효과가 있는 본 발명을 안출하였다.
사인(砂仁)은 생강과(Zingiberaceae)에 딸린 녹각사(綠殼砂 Amomum villosum Loureiro var. xanthioides T.L.Wu et Senjen) 또는 양춘사(陽春砂. Amomum villosum Loureiro)의 잘 익은 열매 또는 씨의 덩어리를 의미하여, 본 발명에서는 양춘사의 열매를 재료로 이용하였다.
양춘사는 Fujian, Guangdong, Guangxi, Yunnan에서 주로 생산되고, 녹각사는 주로 Cambodia, India, Laos, Myanmar, Thailand, Vietnam 등의 인도차이나반도 지역과 중국의 Guangxi, Yunnan의 일부 지역에서 산출된다.(Flora of China, v24:347-356.2000). 생산지가 달라 고대(古代)에는 녹각사를 ‘축사인’이라는 이름으로 별도로 지칭하였다.
한편, 중국은 정품으로 인정하나 국내에서는 위품으로 취급되는 해남사(海南砂 Amomum longiligulare T.L.Wu)의 열매도 대량 유통되고 있는 상황이다. 그러나 Shen 등(SHEN Li WANG Yang JIANG Ku et al. Comparison of HPLC Fingerprints of Amomum villosum Lour. ，Amomurn villosum Lour. var. xanthioides T.L.Wu et Senjen and Amomum longiligulare T.L.Wu. Chinese Pharmaceutical Journal. 2016: 51(12); 1039-1043.)은 ＲP-HPLC 연구결과 3종류의 사인이 성분상 높은 유사도를 보이기는 하나, 해남사와 양춘사는 화학성분이 비슷한 반면 녹각사는 앞의 둘과 분명한 차이가 있으므로 이에 대한 약리와 임상 효능의 비교가 구명되어야 한다고 하였다.
지방간은 비만, 당뇨병 등 대사질환의 전 단계 혹은 징후로 여겨지며, 지방간의 발생은 two-hit working model로 설명된다. 간의 지방증이 first hit에 해당하고, 이 first hit가 염증, 포화지방산 등의 간 손상에 의해 발생하는 second hit에 간을 취약한 상태로 만든다. 최근의 연구에서는 GRP78, CHOP, XBP-1과 같은 ER stress marker를 이용하여 ER stress가 이러한 과정에 second hit으로 중요한 요인임을 증명하였고, 그러므로 지방간의 악화를 막기 위해 ER stress를 줄이는 방법을 연구하는 것이 중요하게 되었다
이에 본 연구는 양춘사 추출물의 지방간 예방 및 개선 효능을 입증하기 위해, in vitro와 in vivo에서 지방간의 화학적 유도인자인 tunicamycin으로 Endoplasmic reticulum(ER) stress를 일으킨 HepG2 cell과 C57BL/6 mouse 모델을 이용하여 양춘사 추출물의 효능을 밝힘으로서 본 발명을 완성하였다.
한편, 선행기술 문헌을 살펴보면, 대한민국 등록특허공보 제10-1431610호에는 오매 및 자초 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만, 이상지방혈증, 지방간 또는 당뇨의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 대해 기재 되어 있고, 대한민국 등록특허공보 제10-1206543호에는 율피 추출물을 포함하는 지방간의 예방 또는 치료용 조성물이 효과 있음이 기재되어 있다.
그러나 상기 선행기술문헌들은 양춘사(Amomum vilosum)와는 다른 천연물을 사용하여 효능을 밝힌 것으로, 본 발명과는 구별된다고 하겠다.
본 발명의 기술적 과제는 양춘사 추출물 유효성분을 함유하는 지방간 예방 및 치료 개선 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 기술적 과제는 양춘사 추출물의 ER stress에 의한 지방간 생성에 대한 억제 효능 및 그 기전을 in vitro와 in vivo에서 ER stress inducer인 tunicamycin을 투여하여 ER stress 관련 GRP78, CHOP 유전자 발현 억제, 지방합성 관련 SREBP-1의 발현이 억제하는 지방간 예방 효능을 확인함으로써 양춘사 추출물 유효성분을 함유하는 지방간 예방 및 치료 개선 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은, 양춘사 추출물을 함유하는 지방간 예방 및 치료 개선 조성물을 제공함으로써, 기술적 과제를 해결하고자 한다.
본 발명에서, 상기 양춘사 추출물은 마우스 경구 투여 기준으로 100 ~ 500mg/kg 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 지방간 예방 및 치료 개선용 조성물을 제공함으로써, 기술적 과제를 해결하고자 한다.
본 발명에서, 상기 양춘사 추출물은 물로 추출하는 것을 특징으로 하는 지방간 예방 및 치료 개선용 조성물을 제공함으로써, 기술적 과제를 해결하고자 한다.
본 발명에서, 상기 양춘사 추출물은 HepG2 세포와 마우스에서 tunicamycin에 의한 지방의 생성을 억제하며, 마우스에서 ER stress 관련 유전자 GRP78, CHOP의 단백질 및 mRNA 발현 억제, 지방간 합성 관련 유전자 ACC(acetyl CoA carboxylase), FAS(fatty acid synthase), SREBP(sterol regulatory element binding protein)-1 의 단백질 및 mRNA 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 지방간 예방 및 치료 개선용 조성물을 제공함으로써, 기술적 과제를 해결하고자 한다.
본 발명에서, 상기 양춘사 추출물은 ER stress에 의한 지방간의 생성에 대하여 지방간 예방 및 치료 개선용 조성물을 제공함으로써, 기술적 과제를 해결하고자 한다.
본 발명은, 양춘사 추출물을 유효성분으로 함유하는 지방간 및 간질환 예방 및 개선 건강기능식품 조성물을 제공함으로써, 기술적 과제를 해결하고자 한다.
본 발명의 실험예에 따라 양춘사 추출물의 지방간 예방 및 치료 개선의 효능을 확인하기 위해 in vitro와 in vivo에서 간 내 지방 축적 억제 효능에 대해 확인하였다.
본 발명의 실험예에 따라 양춘사 추출물 처리한 뒤 ER stress inducer인 tunicamycin 처리하여 확인한 결과, HepG2 세포 및 C57BL/6 mouse에서 tunicamycin에 의한 TG 함량의 증가를 유의하게 억제하였다. 또한, ER stress 관련 GRP78, CHOP 유전자 발현 억제, 지방합성 관련 SREBP-1의 발현이 억제 되었다.
이를 통하여 tunicamycin 유도 ER stress 및 지방합성으로 인한 지방간 생성에 대하여 양춘사 추출물의 효능이 입증되었다. 이에 본 발명자 들은 양춘사 추출물의 지방간 예방 및 치료 개선 효능 조성물을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
도 1은 본 발명의 실험예를 통해 양춘사 추출물의 농도에 따른 세포 내 독성을 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 실험예를 통해 양춘사 추출물의 농도에 따른 세포 내 TG 생성 억제를 나타내는 그래프이다.
도 3는 본 발명의 실험예를 통해 양춘사 추출물의 농도에 따른 동물에서의 TG 생성 억제를 나타내는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 실험예를 통해 양춘사 추출물의 tunicamycin에 의한 ER stress 관련 유전자 발현에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 실험예를 통해 양춘사 추출물의 Tunicamycin에 의한 지방합성 관련 유전자 발현에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 실험예를 통해 양춘사 추출물의 농도에 따른 세포 내 TG 생성 억제를 나타내는 그래프이다.
도 3는 본 발명의 실험예를 통해 양춘사 추출물의 농도에 따른 동물에서의 TG 생성 억제를 나타내는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 실험예를 통해 양춘사 추출물의 tunicamycin에 의한 ER stress 관련 유전자 발현에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 실험예를 통해 양춘사 추출물의 Tunicamycin에 의한 지방합성 관련 유전자 발현에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
본 명세서 및 청구 범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 안되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
따라서 본 명세서에 기재된 실시예, 참조예 및 도면에 기술된 사항은 본 발명의 가장 바람직한 일 예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
실험예 1. 양춘사 추출물의 지방간 생성 억제 효능 평가
1) 시약
약초 양춘사는 CoreSciences(Seoul, Korea)에서 구매하였다. Tunicamycin은 Sigma-Aldrich에서 구매했고(St. Louis, MO, U.S.A.), anti-glucose regulated protein 78 (GRP78), homolog protein (CHOP), anti-X-box-biding protein-1 (XBP-1)는 Santa Cruz Biotechnology에서 구매하였다(Santa Cruz, CA, U.S.A.). cell viability assay reagent인 EZ-cytoxy는 Sigma-Aldrich에서 구매하였다.
2) 양춘사를 추출하는 단계
물로 양춘사을 추출하여 추출물을 얻는 단계이다. 설계조건에 따라, 다른 용매가 사용될 수도 있으며, 추출 용매의 종류에 따라 추출 온도, 추출 시간, 용매의 양 및 잔류 성분 처리 방식 등이 다르게 설계될 수 있다. 추출 용매 또한 다양한 용매가 사용될 수 있는데, 추출 가능한 용매에는 물, 에탄올, 메탄올, 지방유, 글리세린, 마유, 에틸아세테이트, 아세톤, 부탄올 및 이소프로판올 등이 있다. 바람직하게는 본 발명에서 물로 양춘사을 추출하였다.
3) Cell viability test
Human hepatocellular carcinoma cell line HepG2는 간질환 효능을 평가하기 위해 American Type Culture Collection(ATCC)에서 구했다(Manassas, VA, U.S.A.). HepG2 cell은 10% heat-inactivated fetal bovine serum(FBS), 1% antibiotics로 보강된 Dulbecco's minimum Eagle's essential medium(DMEM)에서 배양하였다.
Cell viability assay reagent로 EZ-cytoxy를 이용하였다. Tetrazolium salt를 이용하여 생성되는 formazan을 흡광도를 통해 측정하였다. 양춘사 추출물의 세포독성을 알아보기 위해 HepG2 cell에 Cell viability assay reagent인 EZ-cytoxy를 이용하여 양춘사 추출물 100, 200, 500, 1000 μg/ml 농도별 세포에 대한 독성을 확인하였다.
도 1은 본 발명의 실험예를 통해 양춘사 추출물의 농도에 따른 세포 내 독성을 나타내는 그래프이다.
그 결과 1000 μg/ml 농도에서 50~60 % 의 세포 생존율을 확인하였으며, 100~ 500 μg/ml의 농도에서 유의미한 세포독성이 나타나지 않았다. 이를 통해 고농도 양춘사 추출물은 독성이 있음을 확인하였으며, 이에 본 발명에서는 100 ~ 500 μg/ml의 농도를 사용하였다. 본 발명에서는 1000 ug/ml 이상은 세포독성이 높아 실험에서 배제하였고, 시험군은 각각 양춘사 추출물 100, 200, 500 μg/ml를 투여하는, 3그룹으로 나누었다.
4) 양춘사 추출물의 세포 내 TG 억제 효능 평가
Human hepatocellular carcinoma cell line HepG2는 간세포로서 세포 내 TG 억제 효능을 평가하기 위해 선정하였다. HepG2 cell은 10% heat-inactivated fetal bovine serum(FBS), 1% antibiotics로 보강된 Dulbecco's minimum Eagle's essential medium(DMEM)에서 배양하였다.
ER stress에 의해 증가된 중성지방(TG)에 대한 양춘사의 억제 효과를 조사하기 위해, HepG2 cell을 16시간동안 농도별 양춘사 추출물(100, 200, 500 μg/ml)과 대조군을 배양하였다. 3시간 후 tunicamycin (2 μg/ml)을 처리하고, 24시간동안 배양을 지속했다.
배양 후 TG 함량을 측정하기 위해 HepG2 cell은 chloroform-methanol-H2O solution(8:4:3, v/v/v)에서 균질화되었다. 1시간동안 상온에서 incubate하고 원심분리 했다(3000rpm, 10min). 상층액은 제거한 뒤, 침전물은 24시간 건조하였다. ethanol에서 용해한 후, hepatic TG(triglyceride)는 TG kit(AM 157S-K and AM 202-K, Asan Pharmaceutical, Korea)를 이용하여 검사하였고, protein 농도로 표준화되었다.
도 2는 본 발명의 실험예를 통해 양춘사 추출물의 농도에 따른 세포 내 TG 생성 억제를 나타내는 그래프이다.
그 결과 tunicamycin은 대조군에 비해 중성지방(TG)의 함량이 유의적으로 증가하였다. 그러나 양춘사 추출물을 전 처리한 군에서는 tunicamycin에 의한 TG의 증가를 농도의존적으로 억제시켰다. 즉, in vitro에서의 TG assay 결과, 양춘사 추출물이 HepG2 cell에서 tunicamycin으로 유발된 TG level의 증가를 농도의존적으로 억제한다는 것이 확인되었다. 이러한 결과를 통해 양춘사 추출물은 HepG2 cell에서 intracellular TG level을 감소시키는 효과가 있다는 것을 알 수 있었다.
5) mouse 모델에서 양춘사 추출물의 Hepatic TG level에 대한 효과
In vitro 양춘사 추출물의 ER stress에 의한 중성지방 축적 억제 효과를 in vivo 모델에서 확인하고자 C57BL/6 mouse에 다양한 농도의 양춘사 추출물을 투여한 후 tunicamycin을 투여하고, 간에 축적된 중성지방의 양을 측정하였다.
동물은 24~26 g의 C57BL/6 mouse (8주령) Central Lab. Animal Inc. (Seoul, Korea)에서 구입하였다. 쥐들은 무작위로 5그룹(n=6)으로 나뉘어졌다: 비투여대조군(control), 양성대조군(tunicamycin 단독처리군), tunicamycin과 양춘사추출물 100mg/kg 투여군, tunicamycin과 양춘사추출물 200mg/kg 투여군, tunicamycin과 양춘사추출물 500mg/kg 투여군. 3일간 환경에 적응시키기 위해 동물 사육실에서 일반 배합사료와 물을 충분히 공급하였다.
양춘사 추출물을 경구로 7일동안 투여하였다. 7일째에, tunicamycin(1 mg/kg body weight)을 24시간동안 복강내 주사로 투여하였다. 동물 실험은 Wonkwang University Animal Experiment Ethics Committee에서 승인받았고, 실험실 동물의 사용과 관리는 institutional guideline을 따랐다.
Hepatic lipid는 다음 절차를 따라 간으로부터 추출되었다. liver tissue는 chloroform-methanol solution(2:1, v/v)에서 균질화되었고, 1시간동안 상온에서 incubate하고 원심분리 했다(3000rpm, 10min). 상층액은 제거한 뒤, 침전물은 24시간 건조하였다. ethanol에서 용해한 후, hepatic TG(triglyceride)는 TG kit(AM 157S-K and AM 202-K, Asan Pharmaceutical, Korea)를 이용하여 검사하였고, protein 농도로 표준화되었다.
도 3는 본 발명의 실험예를 통해 양춘사 추출물의 농도에 따른 동물에서의 TG 생성 억제를 나타내는 그래프이다.
그 결과 tunicamycin 군은 간의 TG 함량이 대조군에 비해 2배 이상 증가였으나, 양춘사 추출물을 처리한 군은 tunicamycin에 의한 간에서의 지방 축적을 농도 의존적으로 억제하였다. 즉, in vivo 실험에서는 C57BL/6 mouse에 양춘사을 전처치하고, 24시간동안 tunicamycin을 주사한 후, hepatic TG level을 측정하여 확인하였는데, hepatic TG level은 tunicamycin 주사 이후 두드러지게 증가했다. 하지만 양춘사은 이러한 TG level의 증가를 농도의존적으로 감소시켰다. 이러한 결과를 통해 양춘사 추출물의 중성지방 축적 억제 효과를 in vivo 모델에서도 확인할 수 있었다.
6) 양춘사 추출물의 tunicamycin에 의한 ER stress 관련 유전자 발현에 미치는 영향
본 발명에서는 양춘사 추출물에 의한 지방간 개선이 ER stress의 감소와 관련 있는 지 확인하기 위해 ER stress marker인 관련된 유전자인 GRP78, CHOP 단백질과 mRNA 양을 측정하였다.
양춘사 추출물의 ER stress에 대한 억제 효과를 조사하기 위해 C57BL/6 mouse에 다양한 농도의 양춘사 추출물을 7일간 투여하였다. 이 후, pharmaceutical ER stress inducer로서 tunicamycin을 투여하여 간에서 ER stress 관련된 유전자인 GRP78, CHOP 단백질과 mRNA 양을 측정하였다.
cDNA template, primer, SYBR Green PCR Master MIX를 포함한 반응 혼합물과 7500 Fast RT-PCR System을 이용하여 Real time PCR을 측정하였으며, Total RNA는 TRIzol(Invitrogen, Darmstadt, Germany)을 이용하여 실험 쥐에서 분리 하였다.
또한 protein(40 μg per well)은 8% gel의 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)에 의해 분리되었고, polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane로 transfer시켰다. blocked membrane은 ER stress의 marker인 78-kDa glucose-regulated protein (GRP78;BiP) & C/EBP homologous protein(CHOP)에 대한 primary antibody와 배양하였다. Protein은 enhanced chemiluminescence (ECL) Western blot detection kit(Amersham, Uppsala, Sweden)를 사용하여 검사하였다.
도 4는 본 발명의 실험예를 통해 양춘사 추출물의 tunicamycin에 의한 ER stress 관련 유전자 발현에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
그 결과 tunicamycin 대조군 대비하여 양춘사 추출물 투여 후 tunicamycin 투여한 군 간에서 GRP78, CHOP 단백질과 mRNA의 발현이 대조군에 비해 유의하게 감소하였다. 이는 양춘사 추출물이 간세포에서 pharmaceutical ER stress inducer에 대해 억제효능을 확인할 수 있었다.
7) Tunicamycin에 의한 지방합성 관련 유전자 발현에 양춘사 추출물이 미치는 영향
양춘사 추출물의 간 보호 효과의 기전을 밝히기 위해, 양춘사 추출물의 lipogenesis에 대한 효과를 조사하였다.
즉, 양춘사 추출물의 ER stress 유발 중성지방의 억제 효과 기전을 확인하고자 C57BL/6 mouse에 농도 별 양춘사 추출물을 7일간 투여하였다. 이 후, ER stress inducer인 tunicamycin을 투여하여 간에서 지방합성 관련된 유전자로 알려진 ACC(acetyl CoA carboxylase), FAS(fatty acid synthase), SREBP(sterol regulatory element binding protein)-1 발현량을 측정하였다.
도 5는 본 발명의 실험예를 통해 양춘사 추출물의 Tunicamycin에 의한 지방합성 관련 유전자 발현에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
그 결과 tunicamycin 투여 대조군 대비 양춘사 추출물 투여군에서는 간에서 지방합성을 유도하는 유전자로 알려진 ACC와 FAS mRNA가 유의하게 감소하였다. 또한 ACC와 FAS의 발현에 영향을 주는 전양춘사자(transcription factor)로 알려진 SREBP-1의 발현이 tunicamycin 투여 대조군에 비해 유의하게 감소하였다.
선행 연구에서는 ER stress가 주요한 지방형성 전양춘사자인 SREBP-1을 활성화시켜 ACC와 FAS와 같은 lipogenic gene의 발현을 증가하는 것으로 알려져 있다. 이를 통해 양춘사 추출물이 ER stress로 촉진된 SREBP-1의 발현을 억제하여 FAS, ACC와 같은 lipogenesis를 억제함으로써 지방간을 개선시킨다는 것을 확인할 수 있다.
8) 통계 처리
데이터는 mean(S.E.M.)의 mean±standard error로 표현하였다. 통계적으로 중요한 차이점은 one-way ANOVA에 의해 측정한 후, Duncan's multiple-range test를 시행하였다. 통계분석에서 0.05보다 작거나 같은 p value는 유의하게 본다.
9) 고찰
양춘사 추출물의 지방간 예방 및 치료 개선의 효능을 확인하기 위해 in vitro와 in vivo에서 중성지방 축적 억제 효능에 대해 확인하였다.
먼저 HepG2 세포에서 양춘사 추출물은 500 μg/ml의 농도까지 독성이 나타나지 않았다. 이에 각각 농도의 양춘사 추출물 처리한 뒤 ER stress inducer인 tunicamycin 처리하여 확인한 결과, HepG2 세포 및 C57BL/6 mouse에서 양춘사 추출물은 tunicamycin에 의한 TG 함량의 증가를 유의하게 억제하였다.
또한, ER stress 관련 GRP78, CHOP 유전자 발현 억제, 지방합성 관련 SREBP-1의 발현이 억제 되었다. 이를 통하여 tunicamycin 유도 ER stress 및 지방합성으로 인한 지방간 생성에 대하여 양춘사 추출물의 효능이 입증되었다. 이에 본 발명에서 양춘사 추출물의 지방간 예방 및 치료 개선 효능 조성물을 개발하였다.
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- 양춘사 추출물을 유효성분으로 함유하는 소포체 스트레스(ER stress)에 의해 유발되는 지방간 생성 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물로써,
상기 양춘사 추출물은 물로 추출하고, 마우스 경구 투여 기준으로 100 ~ 500mg/kg 포함되며,
상기 양춘사 추출물은 HepG2 세포와 마우스에서 튜니카마이신(tunicamycin)에 의해 유발되는 트리글리세라이드의 생성을 억제하며, 마우스에서 ER stress 관련 유전자 GRP78, CHOP의 단백질 및 mRNA 발현 억제하고, 지방간 합성 관련 유전자 ACC(acetyl CoA carboxylase), FAS(fatty acid synthase), SREBP(sterol regulatory element binding protein)-1 의 단백질 및 mRNA 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 소포체 스트레스(ER stress)에 의해 유발되는 지방간의 생성 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
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