KR101947138B1

KR101947138B1 - 멀티플렉스 pcr에 유용한 고온 활성 프라이머 및 이를 이용한 핵산 증폭 방법

Info

Publication number: KR101947138B1
Application number: KR1020170091626A
Authority: KR
Inventors: 김성현
Original assignee: 김성현
Priority date: 2017-05-02
Filing date: 2017-07-19
Publication date: 2019-02-12
Also published as: KR20180122264A

Abstract

본 발명은 멀티플렉스 PCR에 유용한 고온 활성 프라이머(High-temperature Activation Primer; H-TAP)와 이를 이용한 핵산 증폭 방법에 관한 발명으로, 보다 상세하게는 멀티플렉스 PCR에 사용되는 프라이머의 5’ 말단에 3’말단의 염기서열과 상보적인 염기서열을 추가하여 낮은 온도(Low-temperature)에서는 닫힌 구조를 형성하도록 유도하고 높은 온도(High-temperature)에서 활성화되는 특이적 올리고 구조와 이에 대한 핵산 증폭 방법에 관한 것이다.
본 발명의 프라이머는 목적하지 않은 비특이적인 반응의 진행을 방지할 수 있을 뿐만 아니라, 핵산 증폭반응 초기부터 말기까지 Tm값의 변화 없이 동일한 증폭 효율을 유지할 수 있다. 따라서, 멀티플렉스 PCR에 적용할 경우 각각의 프라이머가 지닌 민감도와 특이도가 반응 전반에 걸쳐 동일하게 유지될 수 있어 신뢰성 있는 검출결과를 획득할 수 있다는 점에서 매우 유용하다.

Description

멀티플렉스 PCR에 유용한 고온 활성 프라이머 및 이를 이용한 핵산 증폭 방법{High-temperature Activation Primer useful for multiplex PCR and nucleic acid amplification method using the same}

본 발명은 멀티플렉스 PCR에 유용한 고온 활성 프라이머(High-temperature Activation Primer; H-TAP)와 이를 이용한 핵산 증폭 방법에 관한 발명으로, 보다 상세하게는 멀티플렉스 PCR에 사용되는 프라이머의 5’ 말단에 3’말단의 염기서열과 상보적인 염기서열을 추가하여 낮은 온도(Low-temperature)에서는 닫힌 구조를 형성하도록 유도하고 높은 온도(High-temperature)에서 활성화되는 특이적 올리고 구조와 이에 대한 핵산 증폭 방법에 관한 것이다.

핵산 증폭 방법인 PCR(Polymerase Chain Reaction)은 특정 DNA 부위를 특이적으로 반복 합성하여 반응용기 내에서 원하는 DNA 분자를 증폭시키는 방법으로서, 아주 적은 양의 DNA를 이용하여 많은 양의 DNA 합성이 가능한 기술이다. PCR 기법은 1986년 Kary Mullis에 의해 고안된 방법으로, 처음에는 대장균(E. coli)에서 분리한 DNA polymerase Ⅰ을 사용하였으므로 cycle 이 지날 때마다 효소를 첨가해야 하는 불편 때문에 널리 이용되지 못하였다. 그러나, 1987년 Saiki 박사에 의해 thermostable Taq DNA polymerase가 발견된 후 실험방법이 보편화되었다. Kary Mullis는 PCR 기법을 고안한 공적을 인정받아 1993년 노벨 화학상을 수상했다.

PCR 반응에 필수적인 성분은 증폭 대상이 되는 DNA, 증폭할 부분을 결정하며 주형 핵산에 상보적으로 결합하는 짧은 올리고 뉴클레오타이드인 프라이머(primer), 유전자를 합성하는 재료가 되는 뉴클레오타이드인 dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 열에 특별히 강한 DNA 합성효소인 thermostable Taq DNA polymerase로 구성된다. PCR 기법의 과정은 DNA의 변성(denaturation), 프라이머의 결합(annealing), DNA의 합성(polymerization)의 3단계로 구성된다. 이 중 프라이머의 결합 단계는 주형 핵산에 프라이머가 결합하는 과정으로, 통상적으로 50℃ ~ 60℃에서 진행되며, PCR 반응에 사용하는 한쌍의 프라이머의 결합온도(Tm 값)는 비슷하여야 한다. 염기간의 결합은 G와 C는 세 군데에서 수소결합이 일어나고, A와 T는 두 군데에서 결합이 일어나므로 프라이머의 염기구성에 따라 결합온도(Tm 값)가 달라진다. PCR 증폭과정에서 이러한 프라이머의 결합과정이 목적한 DNA 염기서열에만 결합하는 특이성에 의존하기 때문에 프라이머 결합 단계에서의 분자간 상호작용을 최적화하는 것이 중요하다. 프라이머가 완전한 상보적 염기서열을 가진 주형 핵산에 결합하는지 또는 완전하지 않고 하나 이상의 상보적이지 않은 서열을 가진 곳에도 결합하는지 여부는 결합온도, 반응용액 조건 등에 따라 달라질 수 있으며 이러한 조건에 따라 특이적 유전자 부위의 증폭이 가능하거나 또는 비특이 반응으로 인해 목적하는 유전자 부위 이외의 부분을 증폭하거나 부정확한 반응으로 인한 반응 실패 또는 위음성(false negative) 결과를 초래할 수 있다.

한편, 멀티플렉스 PCR은 한 번의 증폭반응에서 여러 주형 유전자에 대한 동시 증폭방법으로 단독 PCR보다 비용적, 시간적 효율성이 뛰어나 대부분의 PCR을 이용한 분자진단 시장에서는 대부분 멀티플렉스 PCR 방법을 사용한다. 그러나 멀티플렉스 PCR은 복수의 프라이머쌍을 이용하여 복수의 표적 서열을 동시에 증폭하는 방법이기 때문에 동일한 염기서열을 갖는 프라이머를 사용한 단독 PCR의 민감도와 특이도를 넘어설 수 없다는 한계를 가진다. 또한 멀티플렉스 PCR 조건에서는 단독 PCR에서와는 달리 각각의 주형에 반응할 수 있는 프라이머가 상보적인 염기서열과 결합하는 과정에서 상호간의 활성을 저해할 수 있는 가능성이 높아지므로 멀티플렉스 PCR용으로 사용되는 프라이머는 특히 비특이 반응에 의한 저해에 더욱 민감할 수 있다.

이러한 비특이 반응이 일어나는 가장 큰 이유는 PCR 반응 중 적합한 결합 온도에 도달하기 전에 PCR 반응액에 함께 존재하는 프라이머와 주형 핵산 사이의 결합이 일부 일어나고 이러한 비특이 부분 결합 중 프라이머의 3' 말단에 DNA 중합효소가 결합함으로써 증폭이 일어나기 때문에 발생한다. PCR 반응이 시작하기 이전 단계에서 상기와 같은 비특이적인 반응이 일어나면, PCR 반응은 초기 증폭물의 반응에 따라 결과가 결정되기 때문에 심각한 문제가 발생할 수 있으며, 주형 핵산과의 올바른 결합을 담보해 주지 못하는 프라이머가 사용되었을 경우에도 비특이 증폭이 심하게 발생된다(도 1).

비특이 증폭을 최소화하고 목적하는 주형 핵산을 특이적으로 증폭시키기 위하여 최적의 염기서열 부분을 이용하여 프라이머를 제작하여 활용하고 있으며 이러한 염기서열은 논문으로 소개되거나 특허로 보호되고 있다. 또한 상온에서의 증폭에 의한 비특이 증폭을 억제하기 위하여 PCR 반응에 필수적인 성분을 빼고 반용용액을 준비한 다음 실제 PCR 반응을 실시할 때 높은 온도에 도달하면 빼두었던 성분을 추가로 첨가하여 정상적인 PCR 반응이 시작하도록 하는 Hot-start PCR 법이 사용되기도 하였으며 최근에는 DNA 중합효소에 면역학적 또는 화학적 결합을 통하여 PCR 반응이 적합 온도에 도달하기 전까지는 반응이 불활성화 되었다가 적합 온도에 도달한 이후 반응이 일어나도록 하여 특이도와 민감도를 높이는 방법이 사용된다.

비록 상기된 방법들과 같은 개선된 방법들이 지속적으로 소개되고 있으나, PCR 증폭 성공을 위한 획기적인 첨가제는 없으며 결합온도와 같은 다양한 조건하에서 특이적인 염기서열을 가진 목적 유전자만 증폭하는 효과적인 프라이머를 제작하고 테스트 하는 일은 지루한 작업이다. 비록, 상기된 접근 방식들이 프라이머의 결합 특이성을 개선하는 데 어느 정도 기여를 하지만, PCR 증폭에 이용되는 프라이머로부터 발생하는 문제점인 비-특이적 생성물과 높은 백그라운드 및 멀티플렉스 PCR 반응상에서 프라이머 간의 간섭반응에 대한 근본적인 해결책은 되지 못한다.

구체적으로, 미국 등록특허 6,365,729호는 프라이머의 5’말단에 3’말단과 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 갖는 헤어핀(Hair-pin) 형태의 프라이머를 제공하고 있다. 상기 헤어핀 형태의 프라이머는 PCR 반응이 시작하기 이전에는 프라이머의 5’말단과 3’말단이 상보적으로 결합하고 있어 주형(template) 서열과의 비특이적인 결합, 프라이머 다이머의 형성과 같은 부반응이 저해된다는 측면에서 매우 획기적이다. 하지만, 상기 헤어핀 형태의 프라이머는 1차 증폭반응, 2차 증폭반응까지는 프라이머의 Tm 값에 아무런 변화가 없지만, 3차 증폭반응부터는 프라이머의 3’말단과 상보적인 서열을 갖는 5’말단까지 뉴클레오타이드가 연장되어 Tm 값이 상승하는 변화가 나타나게 된다. 단독 PCR 반응에서 위와 같은 Tm 값 상승은 큰 문제가 되지 않을 수 있지만, 여러 쌍의 프라이머를 이용하여 복수의 표적 염기서열을 동시에 증폭하는 멀티플렉스 PCR의 경우에는 프라이머마다 Tm값의 변화가 상이할 수밖에 없어 최적의 PCR 반응조건을 설정하기 매우 곤란할 뿐만 아니라, Tm 값의 변화에 따라 어느 한 쌍의 프라이머 활성이 크게 증가하는 경우 다른 프라이머쌍의 활성이 저해되어 객관적인 실험결과를 얻지 못한다는 문제점이 있다.

멀티플렉스 PCR 반응에서 여러 주형에 대한 증폭 효율은 프라이머간 저해 가능성을 극복하여 증폭산물들의 민감도 및 특이도가 일정하게 유지되어야 하며 비특이적 반응을 극복하는 과정에서도 심지어 여러 증폭대상 유전자 중 일부의 효율이 높아지는 개선이 이루어진다고 하더라도 반대급부로 인해 나머지 대상 유전자의 증폭 효율이 낮아지는 결과를 초래할 수 있다. 결국 멀티플렉스 PCR에서의 비특이 반응을 줄이고 민감도 및 특이도의 효율을 높이는 과정에서는 단독 PCR과는 다르게 증폭 과정 중 각각의 프라이머 및 증폭반응에 대한 효율이 변화되는 조건은 멀티플렉스 PCR 상의 모든 주형에 대한 일정한 민감도를 유지할 수 없도록 방해할 수 있다.

한편, 한국 등록특허 10-1525495호는 상기 미국 등록특허 6,365,729호의 헤어핀 형태의 프라이머를 개량하여 프라이머의 5’말단에 3’말단과 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 배치하되, 5’말단과 3’말단 사이에 3~5개의 이노신을 갖는 유니버설 염기를 추가한 덤벨 형태의 프라이머를 제공하고 있다. 상기 한국 등록특허 10-1525495호가 제공하는 프라이머의 경우에는 5’말단과 3’말단 사이에 존재하는 유니버설 염기로 인해 3차 증폭반응 이후에도 3’말단과 상보적인 서열을 갖는 5’말단까지 뉴클레오타이드가 연장되지 않는 것으로 나타나 있지만, 실제로는 이노신 부분에도 상보적인 염기가 결합할 수 있어 핵산 증폭이 진행됨에 따라 Tm값의 변동이 발생할 수 있다. 또한, 상기 유니버설 염기에 포함되는 이노신의 경우 비용이 고가이기 때문에, 프라이머에 3~5개의 이노신이 추가될 경우 통상적인 프라이머와 비교해 3~5배 정도의 제작비용이 요구된다는 단점이 있다.

이에, 본 발명자들은 비특이적인 반응의 가능성이 현저하게 낮고, 멀티플렉스 PCR에 적용 시에도 높은 특이도와 민감도를 유지하면서 상대적으로 적은 비용으로 제작 가능한 프라이머를 개발하기 위해 예의 노력을 거듭하였다.

그 결과, 프라이머의 5’말단에 3’말단과 상보적으로 결합하는 염기서열을 추가함으로써 프라이머가 닫힌 구조를 형성하되, 주형 핵산과 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열과 5’ 말단 사이에 디옥시유리딘(Deoxyuridine)을 추가함으로써, PCR 증폭 이전 오염방지를 위한 UDG(Uracil-DNA Glycosylase) 효소 반응 때 상기 프라이머 내에 삽입된 우라실(Uracil) 염기 부위가 제거되어, PCR 반응이 진행되는 동안 5’ 말단에 추가된 염기서열로 인한 Tm값 및 증폭효율의 변화 없이 일정한 Tm값 및 반응효율을 유지할 수 있다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 다음의 일반식으로 나타내어지는 닫힌 구조 프라이머를 제공하는 것이다:

[일반식] 5’-Ap-Bq-Cr- 3’

상기 식에서, 상기 A는 상기 3’-말단의 연속된 염기서열과 상보적인 염기서열을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 부위를 나타내고, 상기 B는 우라실(Uracil)을 나타내고, 상기 C는 주형 핵산의 특정 연속된 염기서열과 상보적인 염기서열을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 부위를 나타내고, 상기 p, q 및 r은 뉴클레오티드의 수를 나타낸다.

본 발명의 다른 목적은 주형 핵산, 프라이머 및 중합효소를 포함하는 혼합물로부터 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하여 핵산을 증폭시키는 방법에 있어서,

상기 프라이머는 하기 일반식으로 나타내어지는 프라이머이며,

상기 중합효소 연쇄반응을 개시하기 이전에 상기 혼합물에 UDG(Uracil DNA Glycosylase)를 처리하여 상기 프라이머 내 우라실(Uracil) 염기를 제거하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 방법을 제공하는 것이다:

[일반식] 5’-Ap-Bq-Cr- 3’

상기한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 다음의 일반식으로 나타내어지는 닫힌 구조 프라이머를 제공한다:

[일반식] 5’-Ap-Bq-Cr- 3’

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 주형, 프라이머 및 중합효소를 포함하는 혼합물로부터 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하여 핵산을 증폭시키는 방법에 있어서,

상기 중합효소 연쇄반응을 개시하기 이전에 상기 혼합물에 UDG(Uracil DNA Glycosylase)를 처리하여 상기 프라이머 내 우라실(Uracil) 염기를 제거하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 방법을 제공한다:

[일반식] 5’-Ap-Bq-Cr- 3’

이하, 본 발명에 대해 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 다음의 일반식으로 나타내어지는 닫힌 구조 프라이머를 제공한다:

[일반식] 5’-Ap-Bq-Cr- 3’

본 발명에서 사용하는 용어인 “프라이머”란 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(DNA 중합효소 또는 역전사 효소) 및 상이한 4가지 dNTP (deoxynucleoside triphospate)의 존재하에서 DNA합성을 개시할 수 있다.

본 발명에서 상기 A는 3’-말단의 연속된 염기서열과 상보적인 염기서열을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 부위로서, 그 서열은 3’-말단의 염기서열에 따라 결정된다. 상기 p는 A에 포함되는 뉴클레오티드의 개수를 나타내며, 바람직하게는 상기 p는 3~8일 수 있으며, 가장 바람직하게는 3~5일 수 있다.

상기 p, 즉 A에 포함되는 뉴클레오티드의 개수는 목적하는 A의 Tm 값에 따라 3~8에서 결정이 될 수 있으며, 본 발명에서 상기 A의 Tm은 10~30℃, 바람직하게는 10~25℃, 가장 바람직하게는 15~25℃로 설정할 수 있다.

본 발명의 상기 프라이머 내 A의 Tm값은 10~30℃이기 때문에, 중합효소 연쇄반응(PCR)을 진행하기 이전 상온 조건에서 상기 A는 이와 상보적인 염기서열을 갖는 3’-말단의 염기서열과 결합을 하고 있어 닫힌 구조의 프라이머를 형성하게 된다.

따라서, 중합효소 연쇄반응 전 상온 조건에서는 프라이머가 닫힌 구조로 존재하기 때문에 주형 핵산과의 비특이적인 결합이 일어나지 않을 뿐만 아니라, 프라이머의 3’말단을 인식한 중합효소와 결합되는 경우가 줄어들어 원치 않는 반응산물이 생성되는 것을 방지할 수 있다.

이후, 중합효소 연쇄반응이 개시되어 적정 반응 온도에 도달하게 되면, 10~30℃의 비교적 낮은 Tm값을 나타내는 상기 A와 3’-말단 염기서열의 결합은 깨어지고, 프라이머는 펼쳐진 형태로 구조가 변형이 되어 주형 핵산과 상보적인 결합을 할 수 있게 된다.

본 발명에서 상기 B는 우라실(Uracil)을 나타낸다. 또한, 상기 q는 B에 포함이 되는 우라실의 개수를 나타낸다. 본 발명에서 상기 q는 1~5일 수 있고, 바람직하게는 1~3일 수 있으며, 가장 바람직하게는 1일 수 있다.

본 발명의 프라이머에서 상기 B는 프라이머의 구조에 영향을 미치지 않을 뿐만 아니라 주형 핵산과도 상보적인 결합을 하지 않는 부분으로, 중합효소 연쇄반응 개시 전 UDG(Uracil DNA Glycosylase) 처리에 의해 우라실(Uracil)이 제거되어 프라이머 내 염기서열의 단절이 유도되는 부분이다.

본 발명에서 상기 C는 주형 핵산의 특정 연속된 염기서열과 상보적인 염기서열을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 부분을 나타낸다. 또한 상기 r은 C에 포함이 되는 뉴클레오티드의 개수를 나타낸다. 본 발명에서 상기 r은 15~30일 수 있으며, 목적하는 프라이머의 Tm 값에 따라 통상의 기술자가 적절하게 선택할 수 있다. 본 발명에서 상기 C의 Tm 값은 50~70℃일 수 있다.

본 발명에 따른 상기 프라이머의 구조적 특징 및 작동원리를 설명하면 다음과 같다:

(a) 중합효소 연쇄반응 개시 전 상온에서는 5’말단과 3’말단이 상보적으로 결합하고 있어 닫힌 구조를 나타내기 때문에, 주형 핵산과의 비특이적인 결합 및 중합효소와의 결합이 방지된다.

(b) 중합효소 연쇄반응 개시 전, cross-contamination의 방지를 위해 첨가하는 UDG(Uracil DNA Glycosylase)에 의해 상기 B 부분의 우라실(Uracil)이 제거되어 프라이머 내 염기의 단절이 발생한다.

(c) 중합효소 연쇄반응 개시 후 반응 온도가 상승하면 프라이머 내 5’말단과 3’말단의 상보적인 결합이 깨어지고, 프라이머 내 상기 C 부분이 주형 핵산과 상보적인 결합을 형성한다. 이후, 통상적인 프라이머와 동일한 원리에 의해 핵산 증폭이 진행된다.

(d) 프라이머 내 염기의 단절로 인해, PCR 반응개시 후 핵산 증폭 과정에서 5' 말단에 추가된 상기 A 염기서열까지 복제가 일어나지 않아 Tm값의 변화 없이 일정한 반응효율이 유지된다.

본 발명에 따른 상기 프라이머는 상기 구조적 특징 및 작동원리에 따라 멀티플렉스 PCR에 적용이 되는 것이 바람직하다.

멀티플렉스 PCR의 경우 복수의 주형 핵산 및 복수의 프라이머쌍을 혼합하여 동시에 핵산 증폭반응이 진행된다. 따라서, 멀티플렉스 PCR을 통해 바람직한 검출 결과를 획득하기 위한 조건들 중 가장 중요한 것은 모든 프라이머가 유사한 Tm 값을 나타내어야 한다는 것이다.

한편, 종래 보고된 헤어핀 형태의 프라이머 또는 덤벨 형태의 프라이머의 경우 비특이적인 반응을 방지할 수 있다는 점에서 긍정적인 측면도 있으나, 프라이머의 3’말단과 상보적으로 결합할 수 있는 부수적인 염기서열을 5’말단에 추가하였기 때문에 핵산 증폭반응이 진행될수록 Tm값이 상승한다는 문제가 발생할 수 있다. 이 경우, 모든 프라이머쌍에서 동일한 Tm값 상승이 나타나지는 않기 때문에 핵산 증폭반응이 진행됨에 따라서 특정 프라이머쌍의 반응 활성은 증가되는 반면에 다른 프라이머쌍의 활성은 감소되어 객관적인 검출 결과를 획득하지 못할 수 있다.

이에 반해, 본 발명에 따른 상기 프라이머의 경우 중합효소 연쇄반응 개시 전, UDG(Uracil DNA Glycosylase) 처리에 의해 염기의 단절부위가 발생하게 되고, 결과적으로 닫힌 구조를 위해 5’말단에 추가된 염기서열은 증폭을 위한 주형으로 작용하는 것이 불가능하게 되어 반응 초기부터 말기까지 모든 프라이머의 Tm 값은 일정하게 유지가 될 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 상기 프라이머를 멀티플렉스 PCR에 이용하면 초기 반응조건에서 최적화된 각각의 프라이머의 활성이 반응 종료시점까지 동일하게 유지가 될 수 있다.

본 발명의 상기 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속,철, 산화성 금속 등), 및 알킬화제를 함유할 수 있다.

본 발명은 또한 주형 핵산, 프라이머 및 중합효소를 포함하는 혼합물로부터 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하여 핵산을 증폭시키는 방법에 있어서,

[일반식] 5’-Ap-Bq-Cr- 3’

본 발명에서 상기 [일반식]으로 나타낸 프라이머는 전술한 바와 같다.

본 발명에서 상기 중합효소 연쇄반응(PCR)은 바람직하게는 멀티플렉스 PCR일 수 있다.

상기 중합효소 연쇄반응(PCR)이란 당업계에 잘 알려져 있는 것으로 표적 핵산을 주형으로 사용하고, 상기 표적 핵산에 특이적인 프라이머를 사용하여, 변성, 어닐링 및 연장 반응의 과정을 반복함으로써 표적 핵산을 증폭하는 과정을 의미한다.

본 발명에 따른 상기 핵산 증폭방법은 상기 [일반식]의 프라이머를 이용하여 당업계에서 일반적으로 알려진 중합효소 연쇄반응(PCR) 또는 멀티플렉스 PCR과 동일한 방법에 의해 수행될 수 있다.

다만, 본 발명은 중합효소 연쇄반응을 개시하기 이전에 상기 표적 핵산(주형 핵산), 프라이머, 중합효소 등이 포함된 반응 혼합물에 UDG(Uracil DNA glycosylase)를 처리하여 상기 프라이머의 B 영역에 존재하는 우라실(Uracil) 염기를 제거하는 단계를 추가로 수행하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 상기 [일반식]의 프라이머는 B 영역에 1~5개의 우라실(Uracil)을 포함하고 있고, UDG(Uracil DNA Glycosylase) 처리에 의해 프라이머 내 염기의 단절이 발생하게 된다.

이후 통상적인 중합효소 연쇄반응을 개시하여 반응 온도가 상승하면 닫힌 구조의 프라이머가 펼쳐지고 주형 핵산과 상보적인 서열을 갖는 C 영역이 주형 핵산과 결합하여 DNA 중합효소에 의해 염기의 연장반응이 진행된다(1차 증폭반응, 도 2B).

상기 1차 증폭반응이 완료된 이후 2차 증폭반응이 진행될 때에, DNA 중합효소에 의한 염기의 연장반응이 우라실(Uracil)이 제거된 염기의 단절부위에서 중단이 된다. 즉, 닫힌 구조의 프라이머를 형성하기 위해 5’말단에 추가한 염기서열까지 염기의 연장반응이 진행이 될 수 없고, 결과적으로 1차 증폭반응부터 반응의 종료시점까지 동일한 Tm값이 유지가 될 수 있다.

이와 같이, 상기 [일반식]의 프라이머를 이용하는 본 발명의 핵산 증폭방법은, 프라이머의 5’ 말단에 추가된 염기서열(A 영역)과 주형 핵산과 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열(C 영역) 사이에 Deoxyuridine을 추가하여(B 영역), PCR 증폭 이전 오염방지를 위한 UDG(Uracil DNA Glycosylase) 효소 반응 때 우라실(uracil) 염기 부위가 제거됨으로써 중합효소 연쇄반응(PCR)이 진행되는 동안 추가된 염기서열로 인한 증폭효율의 변화 없이 일정한 반응효율을 유지할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 [일반식]의 구조를 가진 프라이머는 현재까지 보고된 바가 없으며, 본 발명을 통해서 최초로 공개하는 바이다.

본 발명의 프라이머는 목적하지 않은 비특이적인 반응의 진행을 방지할 수 있을 뿐만 아니라, 핵산 증폭반응 초기부터 말기까지 Tm값의 변화 없이 동일한 증폭 효율을 유지할 수 있다. 따라서, 멀티플렉스 PCR에 적용할 경우 각각의 프라이머가 지닌 민감도와 특이도가 반응 전반에 걸쳐 동일하게 유지될 수 있어 신뢰성 있는 검출결과를 획득할 수 있다는 점에서 매우 유용하다.

도 1은 일반적인 올리고 프라이머의 반응 전 상온에서 발생할 수 있는 비특이 결합(A) 또는 PCR 반응 이후 비특이 증폭(B)에 대한 가능성을 설명한 도면이다.
도 2는 본 발명의 [일반식]으로 표현되는 프라이머의 반응 전 상온에서 안정적인 닫힌 구조(A)를 나타낸 것이며, PCR 반응 이후 1차 증폭(B) 및 2차 증폭(C)을 진행하는 과정에서 반응의 Tm값이 일정하게 유지될 수 있음을 설명한 도면이다(U: 우라실).
도 3은 일반적인 형태의 프라이머 세트를 이용한 멀티플렉스 PCR(A), 본 발명의 상기 [일반식]에 따른 프라이머 세트를 이용한 멀티플렉스 PCR(B) 및 헤어핀 형태의 프라이머 세트를 이용한 멀티플렉스 PCR(C)의 민감도를 확인한 결과이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

프라이머의 제작

본 발명에서 사용하는 프라이머와 프로브는 미국립보건원 산하 NCBI에서 운영하는 유전자 은행(www.ncbi.nlm.nih.gov)에 등록되어 있는 Genebank 염기서열을 Hitachi 소프트웨어사의 DNAsis프로그램을 이용하여 분석한 다음 그 염기서열을 결정하고, 이를 다시 BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)로 분석하여 스트렙토코커스 뮤탄스 또는 락토바실러스 카제이 및 프레보텔라 인터미디아의 특이적인 염기서열 부분임을 확인하였다.

본 발명의 상기 [일반식]의 형태를 나타내는 프라이머를 “H-TAP 프라이머”라 명명하였다. 상기 H-TAP 프라이머는 5’말단에 3’말단의 염기서열과 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열(즉, A영역)이 추가되어 있고(결합온도(Tm 값)가 18∼20℃가 되도록 제작), 주형 핵산과 상보적인 결합을 형성할 수 있는 염기서열(즉,j C 영역)과 5’말단에 추가된 염기서열(즉, A 영역) 사이에 데옥시유리딘(Deoxyuridine)을 1개 추가(즉, B 영역)하여 제작하였다.

상기 분석한 프라이머는 molecular cloning 3판(sambrook과 rusell, cold spring harborlaboratory press, New York, USA, 2001년)의 10.42에 기술된 올리고뉴클레오타이드 합성과 같은 방법을 이용하여 바이오니아사(bioneer, 한국)에 의뢰하여 합성하였다.

제작된 프라이머의 서열을 하기 표 1에 나타내었다:

상기 표 1에서 서열번호 1 및 2, 서열번호 7 및 8, 서열번호 13 및 14는 각각 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)를 검출할 수 있는 프라이머 쌍이며, 서열번호 3 및 4, 서열번호 9 및 10, 서열번호 15 및 16은 각각 락토바실러스 카세이(Lactobacillus Casei)를 검출할 수 있는 프라이머 쌍이며, 서열번호 5 및 6, 서열번호 11 및 12, 서열번호 17 및 18은 각각 프레보텔라 인터미디아(Prevotella intermedia)를 검출할 수 있는 프라이머 쌍이다.

한편, 상기 서열번호 1 내지 6의 일반구조 프라이머 세트는 통상적으로 이용되는 선형(linear)의 프라이머이며, 상기 서열번호 7 내지 12는 본 발명에 따른 H-TAP 형태의 프라이머 세트이며, 상기 서열번호 13 내지 18의 프라이머 세트는 종래 공지된 헤어핀 구조 또는 덤벨 구조의 프라이머 세트이다.

상기 서열번호 1 내지 18의 프라이머에서 주형 DNA와 상보적으로 결합하는 염기 서열을 검정색 글꼴로 나타내었으며, 검출하고자 하는 대상 미생물에 따라 각각의 프라이머에 동일한 염기서열이 포함되도록 제작하였다.

상기 서열번호 7 내지 12의 H-TAP 구조 프라이머 세트 및 서열번호 13 내지 18의 헤어핀 구조 프라이머 세트는 상기 서열번호 1 내지 6의 일반구조 프라이머의 5’말단에 3’말단과 상보적으로 결합할 수 있는 염기를 추가하였으며, 이를 상기 표 1에서 빨간색 볼드체로 나타내었다.

한편, 상기 서열번호 7 내지 12의 H-TAP 구조 프라이머 세트에는 주형 DNA와 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열과 5’말단에 추가된 염기서열 사이에 1개의 데옥시유리딘(U) 염기를 추가하였으며, 이를 파란색 이탤릭체로 나타내었다.

< 실시예 2>

H-TAP 프라이머의 검출 민감도 평가

상기 제작된 H-TAP 프라이머의 멀티플렉스 PCR 검출 민감도를 확인하기 위해 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) ATCC25175 와 락토바실러스 카세이(Lactobacillus Casei) ATCC334 및 프레보텔라 인터미디아(Prevotella intermedia) ATCC13489를 대상으로 하여, 유전체 DNA를 추출한 후, 10배씩 serial dilution한 시료를 대상으로 PCR 증폭하여 전기영동으로 확인하였다(도 3).

멀티플렉스 PCR의 반응 혼합액에는 스트렙토코커스 뮤탄스와 락토바실러스 카제이 및 프레보텔라 인터미디아의 주형 DNA를 serial dilution한 시료 2 ul(1ng/ul ~ 1fg/ul), 일반적인 멀티플렉스 PCR 조건인 상기 서열번호 1~6의 프라이머 세트, H-TAP 구조 프라이머를 이용한 멀티플렉스 PCR 조건인 상기 서열번호 7~12의 프라이머 세트, 헤어핀 구조 프라이머를 이용한 멀티플렉스 PCR 조건인 상기 서열번호 13~18의 프라이머 세트 각각의 프라이머 0.5 ul(10pmol/ul), 0.4 ul(1 unit)의 Solg^TM h-Taq DNA Polymerase(Solgent co., Korea), 3 ul(15 mM MgCl₂ 용액이 포함된 10X 농도)의 h-Taq reaction buffer(Solgent co., Korea), 0.1 ul(0.1 unit)의 SolGent^TM Uracil-DNA Glycosylase(Solgent co., Korea), 1 ul(dATP, dCTP, dGTP 각각 2mM과 dUTP 6mM)의 dNTP(Solgent co., Korea), 1M betaine(Sigma, USA) 혼합액에 DNase, RNase free water(Sigma-Aldrich co., USA)를 넣어 반응 혼합액의 최종 볼륨이 30 ul가 되도록 하였다.

멀티플렉스 PCR 반응은 PCR Thermal Cycler(Model PCT-100, MJ Research., USA) 기기를 사용하여 하기 방법에 따라 수행하였다:

(1) 50℃에서 5분간 Uracil-DNA Glycosylase를 반응시켜 cross-contamination 방지 및 프라이머 내 우라실을 제거하는 단계;

(2) 94℃에서 10분간 초기 변성(pre-denature) 및 Hot start Taq의 활성 단계; 및

(3) 94℃에서 20초간 변성(denaturation), 58℃ 30초간 결합(annealing) 및 72℃ 30초간 신장(extension)하는 단계.

상기 (1) 내지 (3)의 단계를 1 cycly로 하여 총 40회 반복하였다.

이후, 상기 멀티플렉스 PCR 반응 산물을 전기영동하여 검출결과를 육안으로 확인하였고, 이에 대한 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 일반적인 프라이머를 이용한 멀티플렉스 PCR에서는 스트렙토코커스 뮤탄스 및 락토바실러스 카제이의 희석배율이 각각 10fg/ul 농도까지 종폭 가능한 민감도를 보였으나, 함께 증폭된 프레보텔라 인터미디아의 유전자는 심각한 저해반응을 보여 고농도인 1ng/ul에서만 증폭 반응을 보이고 이후의 낮은 농도에서는 PCR 증폭반응을 확인할 수 없었다(도 3A). 반면, H-TAP 구조의 프라이머를 이용한 멀티플렉스 PCR에서는 스트렙토코커스 뮤탄스 및 락토바실러스 카제이의 희석배율이 각각 1fg/ul 농도까지 종폭 가능한 민감도를 보여 일반적인 구조보다 높은 민감도를 보였으며 일반적인 프라이머를 사용하였을 때 저해되었던 프레보텔라 인터미디아의 유전자의 증폭반응 또한 10fg/ul 농도까지 민감도가 회복됨을 확인할 수 있었다(도 3B). 비교실험으로 동일 유전자 염기서열을 가진 헤어핀 구조의 프라이머를 이용한 멀티플렉스 PCR 조건에서는 프레보텔라 인터미디아의 유전자 증폭반응이 100fg/ul 농도까지 증폭 가능한 민감도를 보여 일반적인 구조의 프라이머 조합보다는 민감도가 많이 회복되었지만 동일한 염기서열의 H-TAP 구조의 프라이머 조합의 증폭반응보다 조금 떨어지는 민감도를 보였으며, 오히려 스트렙토코커스 뮤탄스 유전자의 경우, 증폭반응이 100fg/ul의 민감도를 보여 일반적인 프라이머 조합보다 민감도가 낮아지는 결과를 확인할 수 있었다(도 3C). 이는 헤어핀구조의 프라이머가 증폭과정 중 증가하는 각각의 프라이머 결합온도(Tm)의 변화로 인해 일부 프라이머는 결합력이 높아져서 증폭효율이 증가하는 반면, 동시 증폭되는 다른 최적의 효율 조건을 가지던 프라이머 염기쌍이 결합 조건의 변화로 인해 오히려 민감도의 저해현상이 일어나 발생되는 현상이라고 판단할 수 있었다.

이상으로 본 발명의 바람직한 실시예를 상세하게 설명하였다. 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다.

따라서, 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미, 범위 및 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> KIM, SUNG HYUN <120> High-temperature Activation Primer useful for multiplex PCR and nucleic acid amplification method using the same <130> NP17-04040 <150> KR 2017-0056524 <151> 2017-05-02 <160> 18 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> StrepUF <400> 1 gcatcactag tagatggacc tgcgtt 26 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> StrepUR1 <400> 2 agcacactat ggttgagcca tagc 24 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LacUF <400> 3 ggagggtttc cgcccttc 18 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LacUR1 <400> 4 gcaccacctg tcattttgcc c 21 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PreF <400> 5 caggtagacc cgaacgcaa 19 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PreR <400> 6 cgcaatatgt gcaaatagtt gtac 24 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SmU01F <400> 7 aacgcaugca tcactagtag atggacctgc gtt 33 <210> 8 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SmU01R <400> 8 gctatguagc acactatggt tgagccatag c 31 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LcU01F <400> 9 gaagggugga gggtttccgc ccttc 25 <210> 10 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LcU01R <400> 10 gggcaaugca ccacctgtca ttttgccc 28 <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PreUF <400> 11 ttgcgtucag gtagacccga acgcaa 26 <210> 12 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PreUR <400> 12 gtacaacucg caatatgtgc aaatagttgt ac 32 <210> 13 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sm01F <400> 13 aacgcagcat cactagtaga tggacctgcg tt 32 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sm01R <400> 14 gctatgagca cactatggtt gagccatagc 30 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lc01F <400> 15 gaagggggag ggtttccgcc cttc 24 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lc01R <400> 16 gggcaagcac cacctgtcat tttgccc 27 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pre01F <400> 17 ttgcgtcagg tagacccgaa cgcaa 25 <210> 18 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pre01R <400> 18 gtacaaccgc aatatgtgca aatagttgta c 31

Claims

다음의 일반식으로 나타내어지는 닫힌 구조 프라이머:
[일반식] 5’-Ap-Bq-Cr- 3’
상기 식에서, 상기 A는 상기 3’-말단의 연속된 염기서열과 상보적인 염기서열을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 부위를 나타내고, 상기 B는 우라실(Uracil)을 나타내고, 상기 C는 주형 핵산의 특정 연속된 염기서열과 상보적인 염기서열을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 부위를 나타내고, 상기 p, q 및 r은 뉴클레오티드의 수를 나타내며, 상기 B는 DNA이다.
제1항에 있어서, 상기 p는 3~8개의 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 프라이머.
제1항에 있어서, 상기 q는 1~5개의 우라실(Uracil)을 포함하는 것을 특징으로 하는 프라이머.
제1항에 있어서, 상기 r은 15~30개의 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 프라이머.
제1항에 있어서, 상기 A의 Tm은 10~30℃인 것을 특징으로 하는 프라이머.
제1항에 있어서, 상기 C의 Tm은 50~70℃인 것을 특징으로 하는 프라이머.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프라이머는 멀티플렉스 중합효소 연쇄반응용(Multiplex PCR) 프라이머인 것을 특징으로 하는 프라이머.
주형 핵산, 프라이머 및 중합효소를 포함하는 혼합물로부터 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하여 핵산을 증폭시키는 방법에 있어서,
상기 프라이머는 하기 일반식으로 나타내어지는 프라이머이며,
상기 중합효소 연쇄반응을 개시하기 이전에 상기 혼합물에 UDG(Uracil DNA Glycosylase)를 처리하여 상기 프라이머 내 우라실(Uracil) 염기를 제거하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 방법:
[일반식] 5’-Ap-Bq-Cr- 3’
상기 식에서, 상기 A는 상기 3’-말단의 연속된 염기서열과 상보적인 염기서열을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 부위를 나타내고, 상기 B는 우라실(Uracil)을 나타내고, 상기 C는 주형 핵산의 특정 연속된 염기서열과 상보적인 염기서열을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 부위를 나타내고, 상기 p, q 및 r은 뉴클레오티드의 수를 나타내며, 상기 B는 DNA이다.
제8항에 있어서, 상기 중합효소 연쇄반응(PCR)은 멀티플렉스 PCR인 것을 특징으로 하는 핵산 증폭 방법.