KR101929914B1 - 유전물질 전달용 지지체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 유전물질 전달용 지지체 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 유전물질 전달용 지지체는 가파른 곡률을 지닌 액적을 제조할 수 있는, 초소수성 층 표면에 패턴화된 친수성 홀을 포함하며, 이러한 구성으로부터 제조된 액적은 비부착 세포의 구상체 형성을 촉진시킴과 동시에 유전물질의 전달 효율을 향상시킬 수 있는 환경을 제공하였는바, 바이러스 벡터와 같은 외부 유전물질의 투여량을 감소시켜 유전자 또는 세포 치료제의 효용성 및 안정성 향상에 기여할 것으로 기대된다.

Description

유전물질 전달용 지지체 및 이의 용도 {Support for delivering genetic materials and use thereof}
본 발명은 유전물질 전달용 지지체 및 이의 용도에 관한 것이다.
유전자 치료 (gene therapy)는 치료 유전자를 체내의 원하는 장기로 전달하여 세포 내에서 새로운 단백질이 발현되도록 하여 질병을 치료하는 것으로, 최근, 유전자 치료에 의한 바이러스성 질환, 암 등 다양한 질병의 유효한 치료 효과가 다수 보고되고 있다. 최초의 유전자 치료제가 유럽에서 시판되어 상용화됨에 따라, 국내에서도 이에 대한 활발한 연구가 진행되고 있으며, 몇몇의 유전자 치료제는 실제로 임상 연구에서 우수한 치료 효과를 보여주면서 국내뿐만 아니라 전 세계적으로 유전자 치료제 개발에 대한 기대가 높은 상황이다. 그러나 이러한 주목을 받고 있음에도 불구하고, 유전자 치료제는, 초기 임상 시험에서 뛰어난 효능을 보여주지 못해 실제로 상업화까지 진행되는 경우는 극히 드문 실정이다. 이의 주요 요인으로 유전자 치료제의 안전성 및 표적 세포로의 낮은 유전자 전달 효율을 꼽고 있다. 따라서, 효과적인 유전자 치료를 위해서는 치료 유전자를 원하는 표적 세포로 안전하게 전달하여 높은 발현 효율의 달성을 가능케 하는 유전자 전달 시스템을 개발하는 것이 필수적이다.
현재, 높은 전달 효율을 가지고 있는 바이러스성 유전자 전달체가 가장 많이 활용되고 있으나, 레트로바이러스 (retrovirus), 아데노바이러스 (adenovirus), 아데노 연관 바이러스 (adeno-associated virus)와 같은 바이러스성 벡터는 제조과정이 복잡할 뿐만 아니라, 면역원성, 감염 가능성, 염증 유발, 비특이적 DNA의 삽입 등의 안전성 문제와 수용할 수 있는 핵산의 크기가 한정되어 있다는 문제로 인해 인체에 적용하기엔 한계가 많다. 이에 현재는 비바이러스성 유전자 전달체가 바이러스성 유전자 전달체의 대용으로 각광을 받고 있다. 비바이러스성 유전자 전달체는 최소한의 면역반응으로 반복 투여할 수 있고, 특정 세포로의 특이적 전달이 가능하며, 안전성 및 저장 안정성이 우수하고, 대량 생산이 용이하다는 장점을 가지고 있으며, 이러한 예로는 양이온성 리포좀 (liposome) 계열로서 N-[1-(2,3-다이올레일옥시)프로필]-N,N,N-트라이메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA), 알킬암모늄 (alkylammonium), 양이온성 콜레스테롤 유도체 (cationic cholesterol derivatives), 그라미시딘 (gramicidin) 등이 있다. 그러나, 이 역시도 혈액 안정성이 낮고, 유전자 전달 효율 및 가격 경쟁력이 낮다는 단점이 있다.
이러한 배경하에서, 바이러스 또는 비바이러스 벡터 등과 같은, 유전자 전달체의 투여량을 감소시키면서 유전물질 전달 효율을 향상시킬 수 있는, 유전물질 전달 시스템의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이나 (한국 공개특허 10-2008-0016532), 아직은 미비한 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 표적 세포에 대한 유전물질의 전달 효율을 증진시키기 위하여 예의 노력한 결과, 초소수성 층 표면에 패턴화된 친수성 홀을 통해 가파른 곡률을 지닌 액적을 제조하였으며, 상기 제조된 액적 내 조건을 이용하여 구상체의 형성을 촉진시킬 뿐만 아니라 유전물질의 전달 효율을 현저하게 향상시킬 수 있음을 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명의 목적은, 초소수성 층 표면에 패턴화된 친수성 홀을 포함하는, 유전물질 전달용 지지체를 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 초소수성 층 표면에 패턴화된 친수성 홀에 세포 및 유전물질을 포함하는 액적을 접착시키고, 이를 현적 배양시키는 단계를 포함하는, 유전물질 전달방법을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 유전자 또는 세포 치료를 위한 상기 지지체의 의약적 용도를 제공하는데 있다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 기판; 및 상기 기판 상에 적층되어 있는 친수성 물질층 및 초소수성 물질층을 포함하며, 상기 초소수성 물질층은 친수성 물질층을 노출시키는 복수 개의 관통홀이 형성되어 있는 것인, 유전물질 전달용 지지체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 지지체 내 초소수성 물질층의 관통홀에 의해 노출되어 있는 친수성 물질 층에, 세포 및 유전물질을 포함하는 액적을 접착시키는 단계; 및 상기 접착된 액적을 현적 배양시키는 단계를 포함하는, 유전물질 전달방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예로서, 상기 친수성 물질층은, 폴리도파민, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리(에틸렌-alt-프로필렌), 폴리부타디엔, 폴리이소프렌, 폴리비닐 메틸 에테르 및 폴리에틸렌 옥사이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 이루어질 수 있다.
본 발명의 다른 실시예로서, 상기 초소수성 물질층은 티타늄 (Ⅳ) 이소프로프옥사이드 (TiO2)로 이루어질 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예로서, 상기 관통홀의 직경은 1000 내지 1500μm로 이루어질 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예로서, 상기 세포는 비부착성 세포 (non-adherent cell)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예로서, 상기 액적의 총 부피는 5 내지 25 ㎕일 수 있고, 액적의 표면 접촉각은 120 내지 150°일 수 있다.
또한, 본 발명은 유전자 또는 세포 치료를 위한 상기 지지체의 의약적 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 유전물질 전달용 지지체는 가파른 곡률을 지닌 액적을 제조할 수 있는, 초소수성 층 표면에 패턴화된 친수성 홀을 포함하며, 이러한 구성으로부터 제조된 액적은 비부착 세포의 구상체 형성을 촉진시킴과 동시에 유전물질의 전달 효율을 향상시킬 수 있는 환경을 제공하였는바, 바이러스 벡터와 같은 외부 유전물질의 투여량을 감소시켜 유전자 또는 세포 치료제의 효용성 및 안정성 향상에 기여할 것으로 기대된다.
도 1은, 본 발명에 따른 iQS 액적 시스템의 유전물질 전달 원리를 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 2는, (A) 웰-플레이트 조건, iNS 액적 시스템, 및 iQS 액적 시스템을 개략적으로 비교한 것이고; 및 (B) 액적의 직경, 표면 접촉각, 및 높이간 상관관계를 나타낸 도이다.
도 3은, (A) iNS 액적 시스템을 위한 지지체의 제조 과정을 개략적으로 나타낸 것이고, (B) iQS 액적 시스템을 위한 지지체의 제조 과정을 개략적으로 타낸 것이고; 및 (C) 지지체 표면의 성질에 따른 액적의 표면 접촉각 변화를 확인한 결과이다.
도 4는, 본 발명에 따른 iQS 액적 시스템 위한 지지체의 외관 및 폴리도파민-홀의 형태를 확인한 결과이다.
도 5는, 폴리도파민 (pDA) 층의 존재 유무에 따른 기판 상에 형성된 초소수성 TiO2 층의 변화; 및 TiO2 층에 의한 티타늄 신호를 확인한 결과이다.
도 6은, 동일한 개수 (36개)의 액적을 포함하는데 필요한 기판의 크기를 inverted droplet system (iNS, iQS)간 비교한 결과이다.
도 7은, 본 발명에 따른 iQS 액적 내 만곡부로 이루어진 중앙 부위로의 세포 이동 촉진을 확인한 결과이다.
도 8은, 각 배양 조건 (웰-플레이트, iNS, 및 iQS)에서 뉴로스피어의 크기를 정량적으로 비교한 결과이다.
도 9는, 각 배양 조건 (웰-플레이트, iNS, 및 iQS)에서 hNSC의 생존-사멸 어세이 결과이다.
도 10은, 각 배양 조건 (웰-플레이트, iNS, 및 iQS)에서 hNSC에 대한 생존, 괴사성, 및 자가사멸성 세포를 비교한 결과이다.
도 11은, 각 배양 조건 (웰-플레이트, iNS, 및 iQS)에서 Jurkat 세포에 대한 생존, 괴사성, 및 자가사멸성 세포를 비교한 결과이다.
도 12는, (A) hNSC 및 (B) Jurkat 세포에 대하여, 각 전달 조건 (웰-플레이트, iNS, 및 iQS)에서 성장한 총 세포수 대비 GFP 양성 세포를 백분율로 정량화하여 평가한 결과이다.
도 13은, 각 전달 조건 (웰-플레이트, iNS, 및 iQS)에서 (A) GFP-방출 뉴로스피어를 관찰한 결과이고; 및 (B) 바이러스 벡터 노출 시간에 따른 성장한 총 세포수 대비 GFP 양성 세포를 백분율로 정량화하여 평가한 결과이다.
도 14는, 각 전달 조건 (웰-플레이트, iNS, 및 iQS)에서 세포막을 가로지르거나 세포막의 바이러스 결합을 AAV 내재화 어세이를 통해 확인한 결과이다.
도 15는, 독립적으로 형질도입 및 성장시킨 hNSC (GFP 또는 DsRed)를 조합하여 단일의 액적 또는 웰에 배양시킨 후, 이들의 분포 변화를 확인한 결과이다.
도 16은, 인터루킨-10 유전자를 포함하는 AAVr3.45 벡터 (AAVr3.45-IL10)를 이용하여 각 전달 조건 (웰-플레이트, iNS, 및 iQS)에서 유전자 전달 효율을 IL-10 분비량을 통해 확인한 결과이다.
도 17은, iQS 액적 시스템에서 hNSC 및 AAV r3.45 바이러스 벡터를 활용한 최적의 유전자 전달 조건을 도출하기 위하여, 바이러스 벡터 투여량 (MOI 1000, 5000, 또는 10000)에 따른 형질도입 효율을 비교한 것이다.
도 18은, iQS 액적 시스템에서 hNSC 및 AAV r3.45 바이러스 벡터를 활용한 최적의 유전자 전달 조건을 도출하기 위하여, 바이러스 벡터의 노출시간 (1, 2, 12, 또는 24시간)에 따른 형질도입 효율을 비교한 것이다.
도 19는, iQS 액적 시스템에서 hNSC 및 AAV r3.45 바이러스 벡터를 활용한 최적의 유전자 전달 조건을 도출하기 위하여, 액적 내 세포의 수 (1×105, 5×104, 2×104, 또는 1×104)에 따른 형질도입 효율을 비교한 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.
본 발명은 기판; 및 상기 기판 상에 적층되어 있는 친수성 물질층 및 초소수성 물질층을 포함하며, 상기 초소수성 물질층은 친수성 물질층을 노출시키는 복수 개의 관통홀이 형성되어 있는 것인, 유전물질 전달용 지지체를 제공한다.
본 발명에 따른 유전자 전달용 지지체는 종래의 현적 배양법 (hanging drop culture)으로부터 착안한 것으로, 세포의 배양 및 증식 과정이 진행되는 액적 (droplet)을, 보다 큰 표면 접촉각을 갖는 준-구형 형태로 변화시킴으로써, 액적 내 세포와 유전물질간 접촉 빈도를 높여 유전물질 전달 효율을 향상시킬 수 있다는 점에 기술적 특징이 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, “지지체”는, 세포의 배양 및 증식, 유전물질 등의 도입이 진행되는 액적이 접착 또는 부착될 수 있는 표면을 제공하는 물질을 일컫는 것으로서, 본 발명에 따른 지지체는 단지 액적의 지지 역할을 수행하는 것에 그치지 않고, 액적의 친수성 성질을 이용하여 유전물질 전달에 유리한 액적의 형태 변화를 유도할 수 있다. 이러한 기능을 구현하기 위하여, 상기 지지체는 친수성 물질층; 및 초소수성 물질층이 순차적으로 적층된 구조로 이루어질 수 있다.
본 발명에 따른 친수성 물질층은, 기판과 초소수성 물질층 사이에 존재하여 초소수성 물질층의 형성 및 안정성을 향상시키고, 초소수성 물질층의 관통홀에 의해 노출되는 친수성 물질층은 액적이 접착되는 영역을 제공한다. 상기 친수성 물질층은 바람직하게 카테콜기, 갈로일기 등를 지닌 다양한 고분자 화합물로 이루어질 수 있고, 바람직하게, 폴리도파민, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리(에틸렌-alt-프로필렌), 폴리부타디엔, 폴리이소프렌, 폴리비닐 메틸 에테르, 또는 폴리에틸렌 옥사이드, 가장 바람직하게는 폴리도파민으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 초소수성 물질층은, 상기 친수성 물질층의 상단에 배치되며, 하단의 친수성 물질층을 외부로 노출시킬 수 있는 복수 개의 관통홀을 포함한다. 상기 초소수성 물질층은, 기판 (구체적으로, 관통홀에 의해 노출된 친수성 물질층)에 접촉되는 액적의 표면 접촉각을 증가시켜 준-구형의 액적을 형성하게 하는 환경을 조성하는 역할을 수행하며, 바람직하게 티타늄 (Ⅳ) 이소프로프옥사이드 (TiO2)로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 초소수성 물질층 내 관통홀은, 기판에 접촉되는 액적의 직경 또는 면적을 조절하고, 이 역시 준-구형 역적의 형성에 기여하게 된다. 구체적으로 상기 관통홀은 바람직하게 1000 내지 1500μm의 범위의 직경으로 마련될 수 있다. 상기 범위를 벗어나 관통홀의 직경이 너무 작으면, 충분한 양의 세포 및 유전물질이 액적 내 포함되지 못하는 문제가 야기될 수 있다. 반대로 관통홀의 직경이 너무 크면, 액적과 기판간 표면 접촉각이 감소되어 준-구형 액적을 형성시킬 수 없는 문제가 야기될 수 있다.
구체적으로, 상기와 같은 구성 일체를 포함하는 지지체는, 도 1에 도시한 바와 같이, 현적 배양 과정 (지지체 상에 세포 등을 포함한 액적을 적가한 뒤, 이를 뒤집어 배양시키는 과정)에서, 약 120 내지 150°의 큰 표면 접촉각을 지닌 액적을 형성 및 유지하며, 이는 전술한 초소수성 물질 층 내 관통홀에 의해 변화될 수 있다. 상기 형성된 준-구형의 액적은 가파른 곡률을 지니므로, 만곡부로 이루어진 중앙 부위 방향으로 세포 및 유전물질의 이동을 촉진시켜 이들간 접촉 빈도를 증가시키고, 이에 따라 유전물질의 전달효율을 향상시킬 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 지지체를 이용하여, 유전물질 외에도 소분자 화합물을 세포에 주입하는 것도 가능하다. 상기 유전물질 및 소분자 화합물은 DNA, RNA, 단백질, 독소(toxin), 염료(dye) 등이 있고, 바람직하게는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 또는 올리고펩타이드(oligopeptide)를 포함한다. 본 발명의 실시예에서는 인간 신경 줄기세포 (hNSCs) 또는 Jurkat 세포에 인터루킨-10 (IL-10), 녹색 형광 단백질 (GFP), 또는 붉은 형광 단백질 (DsRed) cDNA를 포함하는 재조합 AAVr3.45 벡터를 도입하여 우수한 유전자 전달 효율을 확인하였다.
또한, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 기판 상에 적층되어 있는 친수성 물질층 및 초소수성 물질층을 포함하는 지지체에, 세포 및 유전물질을 포함하는 액적을 접착시키는 단계; 및 상기 접착된 액적을 현적 배양 (hanging drop culture)시키는 단계를 포함하며, 상기 접착시키는 단계는, 초소수성 물질층의 관통홀에 의해 노출되어 있는 친수성 물질 층에 액적을 접착시키는 것인, 유전물질 전달방법을 제공한다.
본 발명의 유전물질 전달방법은 전술한 유전물질 전달용 지지체에서 기술한 바 있는 친수성 물질층, 및 초소수성 물질층 등을 이용하기 때문에 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명에 따른 유전물질 전달방법은, 고체 기질상에 유전물질을 고정화시키고, 뒤이어 상기 표면에 세포를 배양시키는 종래의 기질 매개 전달법과 달리, 유전물질을 고체 기질에 고정화하거나 분리하는 과정을 필요로 하지 않으므로, 유기 용매 등과 같은 유해 물질과의 접촉을 최소화시킬 수 있다 (실시예 4) 또한, 본 발명의 방법은 종래의 현적 배양법을 응용한 기술로서, 유전자 전달 효율 향상과 함께 3차원 세포 배양을 통한 구상체 형성 촉진 효과를 동시에 달성할 수 있다 (실시예 5). 따라서, 본 발명은 유전물질과 세포간 접촉 빈도를 향상시켜 유전자 전달 효율을 향상시킬 뿐만 아니라 (실시예 6-1), 전술한 바와 같이 대상 세포의 생존 유지하고 증식을 증진시킬 수다는 점에 기술적 특징이 있다.
또한, 본 발명의 세포-유전물질 또는 세포-세포간 상호작용을 크게 향상시켜, 비교적 균등한 분포를 갖는 구상체 (예를 들어, 뉴로스피어)를 제조할 수 었는바 (실시예 6-2), 유전자 또는 세포 치료제로의 활용 가능성을 극대화시켰다는 점에 또 다른 기술적 특징이 있다.
본 발명에서, 세포는 유전물질이 도입되는 대상이 되는 단일세포를 의미하는 것으로서, 바람직하게 3차원 배양에 의해 구상체를 형성하는 세포, 또는 비부착성 세포 (non-adherent cell)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예에서는 인간 신경 줄기세포 (hNSCs) 또는 Jurkat 세포를 사용하였다.
또한, 하나의 관통홀에 의해 노출된, 친수성 물질층과 접촉하는 액적의 총 부피는 바람직하게 5 내지 25 ㎕, 가장 바람직하게 10 ㎕일 수 있으며, 최적의 유전자 전달 효율을 달성하기 위하여, 1 ㎕ 부피의 액적을 기준으로서, 1000 내지 2000개 범위의 세포를 포함하는 것이 바람직하다. 상기 범위를 벗어나 세포의 수가 너무 많으면, 액적 내 세포 활성이 감소하여 유전자 전달 효율 감소를 야기할 수 있기 때문이다.
또한, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 유전자 또는 세포 치료를 위한 상기 지지체의 의약적 용도를 제공한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
실시예 1. 실험 준비 및 과정
1-1. iQS 액적 (inverted Quasi- sphericla Droplet) 시스템 의 제조
본 발명에 따른 역상의 준구형 액적 (inverted Quasi-sphericla Droplet; iQS droplet) 시스템을 제조하고자, 초소수성 TiO2 기질 상에 폴리도파민 (pDA) 홀을 형성하는 연속적인 제조 공정을 실시하였다. 우선, 5mg/ml의 도파민 하이드로클로라이드 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)와 함께 유리 슬라이드 (75×25 mm; Paul Marienfeld GmbH & Co. KG, Lauda-Konighofen, Germany)를 10mM Tris-HCl (pH 8.5; Amersco, Solon, OH)에 현탁시켰다. 이후, 이를 실온에서 밤새도록 서서히 교반시켜 상기 글라스 상에 도파민을 중합시킴으로써, pDA-코팅된 친수성 표면을 제조하였다. 이후, 상기 pDA-코팅된 글라스의 표면을 티타늄 (Ⅳ) 이소프로프옥사이드 (TiO2; 99.999%, Sigma-Aldrich), 즉 700rpm에서 2-프로판올 (Sigma-Aldrich)로 20% (w/v) 농도 희석시킨 TiO2 용액으로 15초 동안 스핀-코터 (ACE-200, Dong Ah Trade Co., Seoul, Korea)를 사용하여 코팅하였다. 이후, 상기 과정에 따른 결과물인 pDA-TiO2 표면을 perfluorophosphate 계면 활성제 (Sigma-Aldrich)와 함께 에탄올에 용해된 zonyl®FES (Sigma-Aldrich)에 20분 동안 침지시키고, 80℃의 플레이트 상에서 건조시켰다. 끝으로, 초소수성 TiO2 표면을 주사 바늘 (22G, Korea Vaccine Col., Seoul, Korea)로 직접 긁어냄으로써, 약 1300㎛의 직경을 갖는 친수성 pDA-코팅된 홀로 이루어진 패턴을 제조하였다.
한편, 기판과 큰 접촉각을 형성하는, 본 발명에 따른 iQS 액적 시스템의 유전자 전달 능력은 2 가지의 다른 유전자 전달방법과 비교하였다: ⅰ) 기존의 96-웰 조직 배양 플레이트 (TCP)에서의 배양으로서, 100㎕의 배양 배지에 1×105개의 hNSC가 현탁되었다 (세포 밀도: 1×103개의 세포/㎕). (이하, 상기 배양법을 well-plate 또는 conventional TCP (웰-플레이트 또는 종래의 TCP) system으로 명명하였다.) ⅱ) 기존의 역상의 단순 현적법 (invertded simple hanging drop)에서의 배양으로서, 폴리스티렌 TCP 덮개 위에 세포 등을 포함하는 액적을 접착시켰다 (이하, 상기 배양법을 inverted non-spherical (iNS) droplet system으로 명명하였다.).
도 3에 나타낸 바와 같이, 폴리스티렌 TCP 덮개 상에는 작은 표면 접촉각을 지닌 비구형-액적이 형성되었다 (도 3A). 반면, 본 발명에 따른 iQS 액적 시스템에서는, TiO2 초소수성 표면 상에 형성된 마이크로미터-크기의 폴리도파민 홀이 친수성 성질을 지닌 액적을 기판 쪽으로 끌어당기게 되고, 비교적 작은 직경을 갖는 홀에 액적이 접착된 채로 기판이 뒤집어짐으로써, 큰 표면 접촉각을 지닌 준구형-액적이 기판 상에 형성되었다(도 3A). 또한, 비처리된 유리 기판 및 pDA-코팅된 유리 기판의 표면과 액적간 표면 접촉각은 각각 27.70±3.98°, 40.70±0.86°였던 반면, 본 발명에 따른 iQS 액적 시스템에서의 표면 접촉각은 145.09±4.50°로 현저하게 증가됨을 확인할 수 있었다.
1-2. 세포 배양
본 연구에서는 AAV 293, Jurkat, 및 인간 신경 줄기세포 (hNSCs)가 사용되었다. AAV 293 세포 (Stratagene, La Jolla, CA)는 아데노 관련 바이러스 (AAV) 벡터의 효과적인 증폭 및 생산을 가능하게 하는 유전적 변형을 지닌다. 본 발명에 따른 iQS 액적 시스템의 유전자 전달 향상 효과를 구체적으로 평가하기 위한 세포로서, 종뇌 (telencephalon (HFT13)) 유래의 hNSCs가 사용되었다. 마지막으로, 대표적인 부유 세포주인 Jurkat human T lymphocytes (ATCC)를 사용하여 현탁액으로 성장한 세포에 대해서도, 본 시스템이 유전자 전달을 위한 플랫폼으로 사용될 수 있는지 여부를 확인하였다. AAV 293, 세포는, 10 % 우태아 혈청 (FBS; Corning Cellgro) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 (PenStrep, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)을 첨가한 Dulbecco's modified Eagle's 배지 (DMEM; Corning Cellgro, Corning, NY)에서 37℃ 및 5% CO2 조건으로 배양되었다. Jurkat 세포는, 10 % FBS 및 1 % pen/strep을 첨가한 Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640; Thermo Fisher Scientific)에서 37℃ 및 5% CO2 조건으로 배양되었다. hNSC는 N-2 보충제 (Thermo Fisher Scientific), 20ng/mL 섬유아세포 성장 인자 2 (FGF2; R & D Systems, Minneapolis, MN), 8mg/mL의 헤파린 (Sigma-Aldrich), 및 10ng/mL의 백혈병 억제 인자 (LIF; Sigma-Aldrich)를 첨가한 DMEM/F12 (Thermo Fisher Scientific)에서 37℃ 및 6.5 % CO2 조건으로 배양되었다.
한편, 역상의 액적 시스템 (inverted droplet system)을 이용한 세포 배양을 위하여, 다수의 hNSC가 원심분리되었고, 세포 펠렛은 세포 배지에, 2×103개의 세포/㎕의 밀도로 재현탁되었다. 끝으로 2×104개의 세포를 포함하는 액적을 각각 pDA 홀 (iQS) 또는 폴리스티렌 덮개 (iNS) 상에 위치시키고, 액적을 포함하는 기판을 직접 뒤집어 현적 배양을 실시하였다. 세포를 함유하는 액적을 가시화시키기 위하여, 세포를 1ng/mL의 중성 레드 (Sigma-Aldrich)로 염색하였고, 붉게 염색된 세포를 포함하는 각각에 대한 액적의 이미지는 디지털 카메라 (EX2F; Samsung Electronics Co., Suwon, Korea)를 사용하여 획득하였다. 액적의 증발을 막기 위하여, 각각의 inverted 기판 (TCP 덥개 또는 pDA-홀로 패턴화된 TiO2)을 포함하는 디쉬의 바닥은 충분한 양의 멸균수가 채워졌다.
1-3. AAV 벡터의 제조
본 연구에서는 신경 줄기세포에 특이적으로 감염시키기 위하여 특수화된 AAV 벡터, AAVr3.45가 유전자 운반체로 사용되었다. 재조합 AAVr3.45 벡터는 인터루킨-10 (IL-10), 녹색 형광 단백질 (GFP), 및/또는 붉은 형광 단백질 (DsRed)을 암호화하는 cDNA를 포함하며, 상기 벡터는 사이토메갈로 바이러스(CMV) 프로모터의 제어 하에서 칼슘 인산염 형질감염 방법을 통해 연속적으로 패키지화되었다. 요약하면, 말단 반복 염기서열 (inverted terminal repeats; ITR)의 측면에 존재하는 AAV 벡터, 아데노바이러스 보조 플라스미드 (pHelper; Stratagene), r3.45 캡시드 어셈블리 촉진용 플라스미드 (pAAV r3.45), 및 트렌스 유전자를 암호화하는 플라스미드 (i.e, AAV CMV-IL10, AAV CMV-GFP, 또는 AAV CMV-DsRed)를 패키징하기 위한 3개의 코어 플라스미드의 동량 (17mg)과 인산 칼슘 (Amersco, Solon, OH)을 사용하여 복합체를 형성시켰다. 이후, 이를 AAV 293 세포에 형질감염시키고, 상기 세포는 5cm 세포 배양 플레이트 (Falcon, Franklin Lake, NJ)에서 성장시켰다. 감염시킨지 36시간 경과 후, 생성된 AAV 벡터를 수거하고, 1-mL HiTrap 헤파린 컬럼 (GE Healthcare, Pittsburgh, PA)을 사용하여 제조사의 지침에 따라 정제하였다. Amicon 튜브 (Ultra-15; 10,000 MWCO, Millipore, Billerica, MA)를 사용하여, 바이러스 벡터를 포함하는 용출 용액에 대하여 PBS-0.01% (v/v) Tween 20 (Biosesang, Gyeonggi, Korea)으로 완충액-교환을 실시하였다. 마지막으로, 바이러스 게놈 DNA를 Dnase-내성 바이러스로부터 추출하고, SYBR Green 프로브 (Thermo Fisher Scientific)를 사용한 정량적 PCR (qPCR) (Mini Opticon, Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 통해 유전체 농도를 결정하였다.
1-4. AAV 형질도입 어세이
리포터 유전자 (GFP 또는 DsRed)를 포함하는 AAVr3 벡터를 액적에 침지시키고, GFP-발현 세포의 백분율을 정량화하여 iQS 액적 시스템의 유전자 전달 효율 향상 효과를 평가하였다. 대조군 조건 (웰-플레이트 시스템)에서는, AAV 벡터 (1×1010 바이러스 유전체 (vg) 입자)를 DMEM/F12에 희석시킨 뒤, hNSCs (100 ㎕ 내 1×105 세포)를 포함하는 배지의 상단에 직접 떨어뜨린 후, 96-웰 플레이트에서 성장시켰다. inverted droplet system (iQS 또는 iNS)을 위하여, 2×103 cells/㎕의 hNSCs 세포 밀도, 1×103, 5×103, 또는 1×104의 감염 다중도 (MOI)를 갖는 AAV 벡터를 포함하는 마스터 혼합물을 미리 준비하였다. 특정 MOI 및 2×104개의 hNSCs를 포함하는 마스터 혼합물 (10 ㎕)을 pDA 홀 (iQS) 또는 폴리스티렌 덮개 (iNS) 상에 접착시켰다. 연세대학교 의과 대학 의학 연구 센터 (LSR2, BD Biosciences, San Jose, CA)에서, 감염 후 48시간째, GFP-발현 세포의 백분율을 유세포 분석 통해 측정하였다.
1-5. 생존-사멸 세포 어세이
각 배양 조건에서 생존 및 사멸 세포는, 이들의 핵 각각을 fluorescein diacetate (FDA; Sigma-Aldrich)와 propidium iodide (PI; Sigma-Aldrich)로 염색하여 가시화시켰다. 전체 세포의 핵은 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; Sigma-Aldrich)에 의해 추가로 염색되었다. 요약하면, 배양 후 2일째, 세포를 새로운 웰에 옮긴 후, 4% 파라포름알데하이드 (PFA; Sigma-Aldrich)로 고정시켰다. 이후, 상기 고정된 세포를 2㎎/ml의 DAPI, FDA 및 PI를 포함하는 1㎖의 용액과 함께 배양하였다. 마지막으로, 생존-사멸 세포의 형광 이미지는 형광 현미경 (Eclipse Ti-S, Nikon, Tokyo, Japan)을 사용하여 획득하였다. 추가적으로, inverted droplet system에서 성장한 hNSC 집단으로부터 자가사멸 (apoptotic) 및 괴사 (necrotic) 세포의 백분율을 정량화하기 위하여, 세포 운명을 annexin V/7-amino-actinomycin D (7-AAD) 검출 키트 (BD Biosciences, San Jose, CA)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 확인하였고, annexin V 양성 자가사멸 세포 및 7-AAD 양성 괴사 세포를 유세포 분석 (BD Biosciences)으로 정량화하였다.
1-6. 인터루킨-6 (IL-6) 분비 수준의 측정
세포 치료제 제조에서 있어, inverted droplet system의 이로운 효과를 구체적으로 확인하기 위하여, hNSCs로부터 분비된 인터루킨-10(IL-10)의 정량화를 실시하였다. CMV 프로모터의 제어 하에서, 상기 hNSCs는, IL-10을 포함하는 AAV 벡터로 형질도입되었고, 형질도입 후 2일째, 각 배양 셉텁 내 생산된 수용성 IL-10의 양은 세포계측 비드 어레이 (CBA) 키트 (BD Biosciences)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 측정되었다. 요약하면, 10개의 액적 (iQS 또는 iNS), 또는 3개의 웰로부터 유래한 배지를 마이크로원심분리관에 수집하고, 각 상층액을 새로운 마이크로원심분리 관에 옮겨 IL-10을 정량화하였다. 각 샘플은 100배 희석하고, 포획 비드 및 phycoerythrin (PE) 형광 시약을 포함하는 용액과 혼합하였다. 200g에서 5분동안 서서히 원심분리한 뒤, 비드를 50μL의 세척 완충 용액에 재현탁하였다. 각 샘플들의 PE 형광 강도는 유세포 분석 시스템 (LSR2, BD Biosciences)을 사용하여 측정하였다. hNSCs로부터 분비된 IL-10의 농도는 유세포 분석 프로그램 (FlowPy, http://flowpy.wikidot.com/))을 통해 측정하였고, 상기 결과는 각 배양 조건에서 초기의 세포 수로 정규화되었다 (웰 플레이트: 1 × 105 세포, iQS/iNS: 2 × 104 세포). 표준 곡선은 인간 IL-10 단백질 (2500 pg/mL; BE Biosciences)의 연속 희석 (1, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128, 및 1/256)에 의해 도출되었으며, 각 표준 값은 하기 식 1의 4-파리미터 변수 로직 피팅 방정식 (4-parameter logistic fitting equation)으로 계산되었다.
[식 1]
Figure 112017044206974-pat00001
1-7. AAV 내재화 어세이
Alexa Fluor 594 (Thermo Fisher Scientific)로 표지된 AAV 벡터를 설정된 배양 조건에서 1, 2, 12 및 48시간 동안 hNSCs에 노출시켜, 세포막을 가로지르거나 세포막에 바이러스와 결합된, 바이러스 벡터의 시간 의존적인 세포 내재화를 조사하였다. 지정된 시점에서, 상층액을 제거하고 각 웰 또는 액적의 hNSC를 PBS로 세척하여 세포막과 약하게 결합되어 있는 AAV 벡터를 제거하였다. 마지막으로, 막에 단단하게 결합되어 있거나 세포질에 내재화되어 있는 형광 표지된 AAV 벡터를 연세대 연구 시설 센터의 공초점 레이져 스캐닝 현미경(LSM700, Carl Zeiss MicroImaging, Thornwood, NY, USA)으로 관찰하였다. 표면-결합되어 있거나 내재화된 AAV 벡터로부터 방출되는 형광 강도는 비형광 배경에 대한 형광 신호의 비율로 나타내었고, Image J 소프트웨어를 사용하여 시간의 함수로서 정량화되었다.
1-8. 이중 유전자 전달 및 세포간 상호작용의 분석
각기 다른 웰 또는 액적 내 세포들은 GFP 또는 DsRed를 포함하는 AAVr3.45 (MOI 4×104)로 형질도입되었고, 단일 웰 또는 액적을 조합하여 다른 웰 또는 액적에서 두 세포 집단간 상호작용을 조사하였다. 구체적으로, 형질도입 12시간 후, 두 개의 AAV 벡터 (AAVr3.45-GFP 및 AAVr3.45-DsRed)로 각각 형질도입된 세포를 원심분리에 의해 수집하였고, 단일 마이크로원심분리 관으로 옮교 지정된 양을 재현탁시켰다 (웰 플레이트 : 100μL, 역 시스템 : 10μL). 생성된 현탁액을 웰-플레이트 또는 inverted droplet system (i.e., iNS droplets or iQS droplets)으로 다시 옮겨 36시간 동안 추가로 배양시켰다. 마지막으로, 약 24시간 동안의 배양에 의해 형성된 뉴로스피어 내 GFP 또는 DsRed 양성 세포의 분포를 CLSM로 시각화하여 각 배양 조건의 세포간 상호작용의 경향성을 조사하였다.
1-9. 통계학적 분석
모든 실험은 3회 실시하였으며, 실험 데이터는 평균 ± 표준 편차 (SD)로 나타내었다. 통계학적 분석은 post-hoc Dunnet's test 또는 Student's t-test와 일원분산분석 (ANOVA)을 통해 수행되었으며, 모든 수치는 SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) 23 software package (IBM Corporation, Somers, NY, USA)를 사용하여 산출되었다.
실시예 2. 지지체의 제조 용이성 확인
pDA-TiO2 기판 (iQS) 상에 형성된 홀의 총 수는 슬라이드의 직경에 따라 변화될 수 있나, 액적 자체의 부피를 고려하여 홀의 밀도 (주어진 영역 내 홀의 개수)는 제한하였다. 이에, 도 4에 나타낸 바와 같이, 페니-크기의 범위 내 약 20-25개의 홀 (즉, 1300 mm 홀 직경)을 형성하도록 제작하였다.
우선, pDA를 이용한 유리 기판의 전처리는 초소수성 TiO2 층의 형성을 촉진시킬 뿐만 아니라, 홀 패턴을 안정적으로 형성시킬 수 있었다. 도 5에 나타낸 바와 같이, pDA가 코팅된 유리 기판 (+pDA) 상에 형성된 TiO2 층은 조밀하게 배치되고 pDA 층과 TiO2 층이 명확한 경계면을 통해 구분되어 있었으나, pDA가 비코팅된 유리 기판 (-pDA)에서는, TiO2 층이 불규칙하게 쪼개지고 분리되어 있어, 홀 패턴을 형성함에는 다소 무리가 있었다 (도 5A). 또한, 에너지 분산 분광 분석 상에서도 상기 결과와 마찬가지로, pDA가 코팅된 유리 기판 (+pDA)에서 더욱 강력한 티타늄 신호 (붉은색)가 검출되었다 (도 5B). 즉, 도파민 분자의 카테콜 기는 다양한 유기 또는 무기 물질과 밀접하게 결합하게 하고, 유리 기판 상에 TiO2 층을 견고하게 하여 홀 패턴 형성에 유리한 조건을 제공함을 알 수 있었다.
추가적으로, 동일한 개수 (36개 (6×6))의 액적을 포함하는데 필요한 기판의 크기를 inverted droplet system간 비교하였을 때, 도 6에 나타낸 바와 같이, pDA-TiO2 기판, 즉 iQS 시스템의 경우, 동일한 개수의 액적을 로딩 및 현적시키는데 필요한 기판의 면적이 iNS에 비해 약 2/3 정도에 불과함을 확인할 수 있었는바, 보다 집약된 형태의 지지체를 제조할 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 3. 액적 내 중앙 부위로의 세포 이동 촉진 및 이에 따른 구상체 형성 촉진 효과 확인
본 실시예에서는, 세포 치료제 제조를 위한 효율적인 유전자 전달을 평가하기에 앞서서, 신경 퇴행성 치료에 주로 사용되고 있는 hNSC를 대상으로 액적 내 세포의 이동 및 구상체 형성을 확인하였다.
우선, 본 발명에 따른 iQS 액적 시스템은 액적의 가장자리로부터 만곡부로 이루어진 중앙 부위로의 세포 이동을 촉진시켰다. 도 7에 나타낸 바와 같이, iQS 액적 시스템의 경우, 액적의 바닥 부위에 붉게 염색된 세포가 조밀하게 관찰된 반면, iNS 액적 시스템에서는 상대적으로 덜 농축된 hNSC가 관찰되었다. 즉 iQS 액적의 가파른 곡률 (큰 표면 접촉각)은 hNS를 둥근 바닥 쪽으로 빠르게 이동시켰다.
또한, iQS 액적 내의 조밀한 hNS의 집합은 웰-플레이트 시스템 및 iNS 액적 시스템에 비해 보다 큰 뉴로스피어의 형성을 가속화시켰다. 도 8에 나타낸 바와 같이, iQS 액적에서 성장된 뉴로스피어의 평균 직경은 약 112.00±52.03 mm로서, 다른 배양 조건에서 성장된, 뉴로스피어의 직경에 비해 현저하게 크게 관찰되었다 (p <0.05, 웰-플레이드 : 93.33 ± 31.24mm, iNS 액적 시스템: 92.82 ± 35.62 mm).
실시예 4. 비부착 세포에 대한 세포 활성 유지 효과 확인
각 조건에서 생존 또는 사멸 hNSC의 핵을 FDA/PI 염색에 의해 가시화시킨 결과, 다수의 FDA-양성 생존 hNSC가 모든 배양 조건 (웰 플레이트, iQS, iNS)에서 관찰되었다 (도 9). 괴사성 또는 자가사멸성 세포 사멸이 유도된 hNSC 운명을 정량화하기 위하여, 각 조건에서 배양된 hNSC는 annexin V/7-ADD로 염색되었고, 생존, 괴사성, 및 자가사멸성 세포를 유세포 분석을 통해 확인하였다 (도 10A). 그 결과, 도 10B에 나타낸 바와 같이, 배양 후 48시간째, iQS 액적 시스템에서 성장한 생존 hNSC (annexin V 및 7-AD 모두 음성)의 분율 (85.14±1.72%)은 웰 플레이트에서 배양한 생존 세포의 분율 (79.14±7.67%)에 비해 다소 증가하였고, iNS 액적 시스템에 비해서는 현저하게 향상되었음을 확인할 수 있었다. 또한, 도 10C 및 10D에 나타낸 바와 같이, iQS 액적 시스템에서 배양된 hNSC (2.10±0.44%)는, 웰 플레이트에서 배양된 세포 (괴사: 10.42±3.74%)에 비해 괴사성 사멸이 둔화되고, iNS 액적 시스템에서 배양된 세포에 비해서는 괴사성 및 자가사멸이 현격하게 둔화됨을 확인할 수 있었는바, 본 발명은 세포 생존에 유리한 환경을 제공함을 알 수 있었다.
추가적으로, 본 발명에 따른 iQS 액적 시스템의 비부착 세포에 대한 세포 활성 유지 효과를 재차 확인하고자, 대표적인 현탁액 내 배양세포인 인간 T 림프구 (Jurkat 세포)를 iQS 액적에서 성장시키고, 각 조건에서의 웰 또는 액적 내 세포 생존력을 비교하였다. 그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 상기 hNSC에 대한 결과와 마찬가지로, 웰-플레이트 및 iNS 액적 시스템에서 배양된 세포에 비해, iQS 액적 시스템에서 Jurkat 세포의 생존율이 향상됨을 확인하였다.
즉, inverted 액적에 작용하는 표면 장력은 세포 클러스터의 무게에 충분히 저항할 수 있으므로, 세포 생존에 악영향을 미치는 건조 공기 조건에 부분적으로 노출되는 것이 아니라, 배지를 포함하는 액적에 의해 완전히 덮여있을 수 있었다. 또한, 웰 플레이트의 크기에 비해 상대적으로 좁은 액적의 공간에도 불구하고, iQS 액적은 거의 모든 면을 대기에 노출시켜 충분한 양의 산소가 공급될 수 있었고, 따뜻한 주변 환경 (37℃ 인큐베이터)으로부터 inverted 액적을 가로지르는 능동적인 열 전도는 초기 배양 단계에서 주요 인자 (산소, 영양소)를 액적 내 세포에 제공하는 원동력으로 작용할 수 있었다. 따라서, 본 실시예에서는, 이러한 복합적인 작용에 의해 iQS 액적 시스템 내 비부착 세포의 활성이 유지됨을 확인할 수 있었다.
실시예 5. GFP 양성 세포의 정량화를 통한 유전자 전달 효율 평가
전술한 바와 같이, hNSC의 형질도입을 위한 유전자 전달체로 AAV3.45 벡터를 사용하였고, 유전자 전달 효율은 각각의 전달 조건 (웰-플레이트, iQS, iNS)에서 성장한 총 세포수 대비 GFP 양성 세포를 백분율로 정량화하여 평가하였다. 그 결과, 다양한 양의 바이러스 벡터 (MOI 1×103, 5×103, 및 1×104)가 도입되었을 때, 웰-플레이트 전달 조건의 형질도입은 중등도의 유전자 전달 효율을 보인 반면 (10-40%), iQS 액적 시스템의 형질도입 효율은 40% 내지 75%로서, 유전자 전달 효율이 크게 향상되었다 (도 12A). 특히, iQS 액적 시스템에서는, 약 10배 가량 적은 바이러스 양 (MOI 1×103)을 사용하여, 웰-플레이트 조건 (MOI 1×104)과 동등한 수준의 유전자 전달 효율을 얻을 수 있었다. 또한, iNS 액적 시스템의 형질도입과 비교하였을 때에는 많은 양의 바이러스 벡터가 이용된 경우 (1×104)에는, 양자간 큰 차이가 없었으나, 상대적으로 적은 양 (1×103, 5×103)의 바이러스 벡터가 이용된 경우에는 iQS 액적 시스템의 유전자 전달 효율이 약 2배가량 향상됨을 확인할 수 있었다 (도 12A). 바이러스 벡터 투여량의 감소는 세포 독성 또는 비정상적인 유전자 삽입과 같은 유전자 치료에 과정에 발생할 수 있는 부작용들을 경감시킬 수 있는바, 이러한 효과는 유전자 치료제의 효용성 또는 안전성에 기여할 것이다. 추가적으로, hNSC 세포이외 또 다른 현탁액 내 배양세포인 Jurkat 세포에서 유전자 전달 효율을 비교한 결과, 상기 결과와 마찬가지로, 웰-플레이트 전달 조건에 비해 iQS 액적 전달 조건에서 유전자 전달 효율이 향상되었으며, 시간이 경과에 따라 그 차이는 현저하였다 (도 12B).
한편, 상기 실시예 3에서는 본 발명에 따른 iQS 액적 시스템의 구상체 형성 촉진 효과를 확인한 바 있다. 따라서 이러한 효과가 유전자 전달 촉진 효과와 함께 관찰될 수 있는지 여부를 확인하고자 하였다. 형질도입 48시간째, iQS 액적 시스템을 통해 전달된 AAV (MOI 1×104)는 거대한 크기의 GFP-방출 뉴로스피어를 형성하였던 반면, 웰-플레이트 및 iNS 액적 시스템 (MOI 1×104)에서는 비교적 작은 크기의 GFP-방출 뉴로스피어가 관찰되었다 (도 13A). 또한, 웰-플레이트 조건에서의 형질도입은 시간 지점에 따라 GFP-발현 세포의 백분율이 서서히 증가하는 반면, iQS 액적 시스템은 형질도입 후 48시간까지 유전자 전달 효율의 급격한 증가를 가져왔다. 특히, iQS 액적 시스템에 의해 형질도입 후 12시간째 얻은 GFP 발현 세포의 비율 (43.5 ± 3.2%)은 웰-플레이트 조건에 의해 형질도입 후 48 시간째의 비율 (43.5 ± 3.2%)과 비슷하였다 (도 13B). 이러한 결과들은, 본 발명은 구상체 형성 촉진 및 유전자 전달 효율 향상 효과를 한번의 과정을 통해 동시에 얻을 수 있음을 시사한다.
실시예 6. 유전물질과 세포간 상호작용 촉진 효과 확인
6-1. 유전자 전달 효율 향상 기전의 확인
본 발명에 따른 iQS 액적 시스템이 유전자 전달 효율을 어떻게 향상시키는지 확인하기 위하여, 다양한 시점에서 세포막을 가로지르거나 세포막의 바이러스 결합을 형광 표지된 AAV 벡터의 이미지를 통해 모니터링하였다. 그 결과, 배양 시간이 증가함에 따라, 모든 조건에서 형광 신호를 방출하는 세포의 수가 점진적으로 증가하였다. 구체적으로 iQS 액적 시스템에서 hNSC 주변에 근접해 있는 AAV 벡터는, 웰 플레이트 및 iNS 액적 시스템에 비해, hNSC와의 결합을 신속하게 형성하였다. 형질도입 후 2시간 내의 조건에서, iQS 액적 시스템은 다른 조건들에 비해 현저하게 많은 양의 바이러스가 세포와 결합되어 향상된 형광 신호가 일정 기간 지속적으로 관찰되었으나, 24시간 후에는 모든 조건에서 동등한 수준의 형광 신호가 측정되었다 (도 14). 즉, 본 발명에 따른 iQS 액적 시스템은, 액적의 가파른 곡률에 의해 바닥면에 존재하는 AAV 벡터와 hNSC를 근접하게 하여 이들간 상호작용을 촉진시킴으로써, 보다 짧은 시간 내 다량의 유전물질이 전달됨을 알 수 있었다.
6-2. 세포간 상호작용 향상에 의한 유전물질의 균등 분포 확인
hNSC에 각각의 리포터 유전자 (GFP 또는 DsRed)를 포함하는 AAV 벡터를 독립적으로 전달하고, 이들 세포를 개별적으로 배양시켰다. 12시간 경과 후, AAV 벡터 잔기를 포함하는 상청액을 제거하고, 형광 단백질 (GFP 또는 DsRed)을 발현하는 각기 다른 두 개의 hNSC를 분리하였다. 이후, 상기 분리된 세포를 조합하여 단일의 액적 또는 웰에서 24시간 동안 추가 배양시킨 뒤, 이들 세포들의 분포를 확인하였다 (도 15A). 그 결과, 웰-플레이트 조건에서 GFP-발현 또는 DsRed-발현 뉴로스피어는 양자간 뚜렷하게 구분되도록 분포하였으며, iNS 액적 조건에서도 웰-플레이트 조건과 마찬가지로, 대다수의 뉴로스피어가 각각의 리포터 유전자를 개별적으로 발현하였고, 이들간 경계는 명확하게 구분될 수 있었다 (도 15B; 점선). 반면, iQS 액적 조건에서는, 동일한 뉴로스피어내에서 GFP 및 DsRed의 발현이 비교적 균등하게 검출되었다. 즉, 본 발명에 따른 iQS 액적 시스템은, 액적의 가파른 곡률에 의해 바닥면에 존재하는 세포-세포간 접촉 빈도를 높일 수 있으며, 이는 균등한 유전자 분포를 갖는, 구상체 (예를 들어, 뉴로스피어)의 제조로 이어질 수 있어, 세포 치료제의 치료 효과를 향상시킬 수 있을 것이라 판단된다.
실시예 7. IL-10 분비량의 정량화를 통한 유전자 전달 효율 평가
iQS 액적 시스템에서 관찰된 향상된 유전자 전달 효율은 AAV 감염에 의해 자극된 hNS로부터 분비된 최종 유전자 산물의 증가로 이어질 수 있다. 따라서 본 실시예에서는, CMV 프로모터의 하류에 삽입된 인터루킨-10 유전자를 포함하는 AAVr3.45 벡터 (AAVr3.45-IL10; MOI 1x103)를 이용하여, 유전자 전달 효율을 재차 평가하였다. 3개의 웰 또는 10개의 액적으로부터 수거한 IL-10의 총량은 각 조건에서 로딩된 최초 세포의 수 (즉, 웰-플레이트: 1×105 세포, iNS 및 iQS: 2×104 cells)로 정규화시켜, 단일 세포에 당 분비되는 IL-10의 질량을 산출하였다 (도 16A). 그 결과, iQS 액적 내 2×104개의 세포에서 분비된 IL-10의 양은 웰-플레이트 조건의 1×105개의 세포에서 생성된 것보다 높았으며, 웰-플레이트 및 iNS 액적 내 동량의 세포의 분비량에 비해서도 유의적으로 높게 관찰되었다. 이러한 결과를 통해서, 본 발명은 iQS 액적 시스템의 우수한 유전자 전달 효율, 즉 최소한의 출발 물질(세포 및 유전자 벡터)로 충분한 양의 유전자 산물을 생산할 수 있는 시스템임을 입증하였다.
실시예 8. 최적의 유전자 전달 조건 도출
본 실시예에서는, hNSC 및 AAV r3.45 바이러스 벡터를 활용한 최적의 유전자 전달 조건을 도출하고자 하였다. 이에, 바이러스 벡터 투여량 (MOI 1000, 5000, 또는 10000), 바이러스 벡터의 노출시간 (1, 2, 12, 또는 24시간), 및 액적 내 세포의 수 (1×105, 5×104, 2×104, 또는 1×104)에 따른 GFP-발현 세포의 백분율을 정량화하여 웰-플레이트 및 iNS 액적 시스템과 비교하였다. 그 결과, 바이러스 벡터의 투여량에 대해서는, MOI 1000 내지 10000 범위 내에서 모두 유의적인 효과가 관찰되었으며 (도 17), 본 iQS 시스템의 액적은 다른 웰-플레이트 및 iNS 액적 시스템과 달리, 준 구형의 액적을 형성함에 따라, 초기의 열 전달 속도를 증진시키고, 물질 (바이러스, 세포)들을 액적의 바닥 쪽으로 집약시킬 수 있었으며, 세포-바이러스간 상호작용의 증가시킬 수 있었다. 결과적으로, 약 2시간의 바이러스 노출 시간만으로도 유전자의 전달 효율이 크게 향상됨을 확인할 수 있었다 (도 18). 또한, 바이러스 벡터 투여량과 노출시간을 각각 MOI 1000과 48시간을 일정하게 유지한 채, 10㎕의 액적 당 세포 수를 변화시켰을 때, 1×105 또는 5×104의 조건에서는 세포 활성이 감소하여 전체적인 유전자 전달 효율이 크게 감소하였는바, 10㎕의 액적 기준으로 2×104 개 이하의 세포가 유전자 전달에 적합함을 확인할 수 있었다 (도 19).
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (11)

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  5. 기판 상에 적층되어 있는 친수성 물질층 및 초소수성 물질층을 포함하는 지지체에, 세포 및 유전물질을 포함하는 액적을 접착시키는 단계; 및
    상기 접착된 액적을 현적 배양 (hanging drop culture)시키는 단계를 포함하며,
    상기 접착시키는 단계는, 초소수성 물질층의 관통홀에 의해 노출되어 있는 친수성 물질 층에 액적을 접착시키는 것인, 유전물질 전달방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 친수성 물질층은 폴리도파민, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리(에틸렌-alt-프로필렌), 폴리부타디엔, 폴리이소프렌, 폴리비닐 메틸 에테르 및 폴리에틸렌 옥사이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 이루어진 것인, 유전물질 전달방법.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 초소수성 물질층은 티타늄 (Ⅳ) 이소프로프옥사이드 (TiO2)로 이루어진 것인, 유전물질 전달방법.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 관통홀의 직경은 1000 내지 1500μm인 것인, 유전물질 전달방법.
  9. 제5항에 있어서,
    상기 세포는 비부착성 세포 (non-adherent cell)인 것인, 유전물질 전달방법.
  10. 제5항에 있어서,
    상기 액적의 총 부피는 5 내지 25 ㎕인 것인, 유전물질 전달방법.
  11. 제5항에 있어서,
    상기 액적의 표면 접촉각은 120 내지 150°인 것인, 유전물질 전달방법.

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