KR101925791B1 - 락토페린이 결합된 나노입자 복합체 및 이의 용도 - Google Patents

락토페린이 결합된 나노입자 복합체 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR101925791B1
KR101925791B1 KR1020170039228A KR20170039228A KR101925791B1 KR 101925791 B1 KR101925791 B1 KR 101925791B1 KR 1020170039228 A KR1020170039228 A KR 1020170039228A KR 20170039228 A KR20170039228 A KR 20170039228A KR 101925791 B1 KR101925791 B1 KR 101925791B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
lactoferrin
nanoparticle complex
gold
gold nanoparticle
nanoparticles
Prior art date
Application number
KR1020170039228A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20170114256A (ko
Inventor
이동윤
이승재
김형식
Original Assignee
한양대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한양대학교 산학협력단 filed Critical 한양대학교 산학협력단
Publication of KR20170114256A publication Critical patent/KR20170114256A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101925791B1 publication Critical patent/KR101925791B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/06—Tripeptides
    • A61K38/063—Glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/02—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link
    • C07K5/0215—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link containing natural amino acids, forming a peptide bond via their side chain functional group, e.g. epsilon-Lys, gamma-Glu
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B18/00—Surgical instruments, devices or methods for transferring non-mechanical forms of energy to or from the body
    • A61B18/04—Surgical instruments, devices or methods for transferring non-mechanical forms of energy to or from the body by heating
    • A61B18/08—Surgical instruments, devices or methods for transferring non-mechanical forms of energy to or from the body by heating by means of electrically-heated probes
    • A61B18/082—Probes or electrodes therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/40—Transferrins, e.g. lactoferrins, ovotransferrins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0057—Photodynamic therapy with a photosensitizer, i.e. agent able to produce reactive oxygen species upon exposure to light or radiation, e.g. UV or visible light; photocleavage of nucleic acids with an agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/644—Transferrin, e.g. a lactoferrin or ovotransferrin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6923—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being an inorganic particle, e.g. ceramic particles, silica particles, ferrite or synsorb
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
    • A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0053—Mouth and digestive tract, i.e. intraoral and peroral administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61N—ELECTROTHERAPY; MAGNETOTHERAPY; RADIATION THERAPY; ULTRASOUND THERAPY
    • A61N5/00—Radiation therapy
    • A61N5/06—Radiation therapy using light
    • A61N5/0613—Apparatus adapted for a specific treatment
    • A61N5/062—Photodynamic therapy, i.e. excitation of an agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01G—COMPOUNDS CONTAINING METALS NOT COVERED BY SUBCLASSES C01D OR C01F
    • C01G7/00—Compounds of gold
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/79—Transferrins, e.g. lactoferrins, ovotransferrins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01P—INDEXING SCHEME RELATING TO STRUCTURAL AND PHYSICAL ASPECTS OF SOLID INORGANIC COMPOUNDS
    • C01P2004/00—Particle morphology
    • C01P2004/60—Particles characterised by their size
    • C01P2004/64—Nanometer sized, i.e. from 1-100 nanometer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Surgery (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • Ceramic Engineering (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)

Abstract

본 발명은 락토페린이 결합된 나노입자 복합체 및 이의 신규한 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 나노입자 복합체는 금속 나노입자에 락토페린 또는 폴리에틸렌 글리콜-락토페린이 결합되어 있으며, 이러한 구성에 따라 금속 나노입자를 뇌종양 조직에 효율적으로 표적화시킬 뿐만 아니라, 생체 내 조건 속에서도 금속 나노입자의 안정성이 유지될 수 있음을 확인할 수 있었는바, 뇌종양의 치료에 있어서, 보다 근본적으로 접근하여 타겟 치료할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

락토페린이 결합된 나노입자 복합체 및 이의 용도 {Lactoferrin-conjugated nanoparticle complex and use thereof}
본 발명은 락토페린이 결합된 나노입자 복합체 및 이의 용도에 관한 것이다.
우리나라는 전 세계에서 고령화 속도가 가장 빠르게 진행되고 있으며, 이와 관련된 퇴행성 뇌질환 및 노인성 질환 치료제의 수요가 급증하고 있다. 특히, 65세이상 인구의 사망 원인 중 1위는 암으로서, 인구 10만 명당 865.4명의 사망 원인이 되고 있으며, 뇌혈관 질환 (410.7명), 심장 질환 (332.6명), 당뇨병 (146.6명)이 그 뒤를 따르고 있다. 특히, 두개골 내에 생기는 모든 종양을 일컫는 뇌종양은, 2013년에 발표된 중앙 암 등록본부 자료에 따르면, 남녀를 합쳐서 연 1,679건으로, 연령대 별로는 50대가 17.6%로 가장 많고, 60대 16.5%, 70대 14.9%의 순으로 고연령 층에서 높은 발병율을 나타내었다. 고연령의 환자를 대상으로 반감기가 낮은 정맥주사를 자주 투여해주는 것은 환자에게 스트레스를 유발할 우려가 있을 뿐만 아니라, 유효한 치료 효과를 기대할 수 없게 될 우려가 있다. 이에, 반감기가 긴 경구투여를 통해 환자에게 편리함을 제공해 줄 수 있고, 약물 투여에 의한 스트레스 유발을 막을 수 있는, 경구 흡수용 뇌종양 치료제에 대한 개발이 절실하다.
한편, 뇌종양의 치료법은 크게 세 가지를 들 수 있는데, 첫째로 외과적 수술, 둘째 방사선 치료, 셋째 항암 화학요법 등이 있다. 현재, 임상에서는 항암제인 아바스틴, 테모졸로마이드, 독소루비신 등의 약물이 뇌종양의 치료에 널리 사용되고 있으나, 이들은 메스꺼움과 구토, 구내염, 설사, 복통, 탈모, 및 감염 (폐렴, 요로 감염)과 같은 부작용이 심한 것으로 알려져 있다. 그 밖의 치료법으로서, 유전자 치료, 면역 요법, 광열 또는 광역학 치료법 등이 연구되고 있으며, 최근에는, 악성 뇌종양 치료를 위해 나노입자에 뇌종양 세포 내/외의 특정한 물질에 대한 타깃형 항체를 합성시킨 후, 뇌종양의 표적치료를 통해 항암제의 부작용을 줄여주는 방향으로 연구가 계속 되고 있다. 여러 나노입자 중 근적외선 (near-infrared wavelength)에서 표면 플라스몬 공명 (surface plasmon resonance)을 통해 열을 발생시킬 수 있는 금 나노입자가 주로 사용되고 있으며, 암세포를 사멸시킬 수 있는 충분한 양의 열을 발생하기 위하여 여러 가지 광 증감제 (photosensitizer)를 함께 이용하고 있다. 그러나, 금 나노입자를 이용한 치료법에 있어서도, 위장관에서의 낮은 pH에 의해 경구 흡수율이 매우 낮다는 단점을 지니고 있는바, 치료제로 활용함에 있어 제약이 되고 있다.
이러한 배경 하에서, 뇌종양의 표적 치료의 일환으로서, 생체 내 안정성 및 뇌 조직 표적화 효과가 향상된 나노입자에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으나 (한국 특허공개 번호 10-2010-0037494), 아직은 미비한 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은, 글루타티온이 결합 또는 코팅된 금속 나노입자에 락토페린 또는 폴리에틸렌 글리콜-락토페린을 결합시킴으로써, 금 나노입자를 뇌종양 조직에 효율적으로 표적화시킬 뿐만 아니라, 강 산성과 같은 조건 속에서도 금속 나노입자의 안정성이 유지될 수 있음을 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.
이에, 본 발명의 목적은, 뇌종양의 표적화 및 생체 이용률이 향상된 나노입자 복합체를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은, 상기 나노입자 복합체의 뇌종양 치료를 위한 신규 용도를 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 금속 나노입자, 글루타티온 (Glutathione), 및 락토페린 (Lactoferrin)을 포함하는, 나노입자 복합체를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 금속 나노입자는 금 나노입자, 산화철 나노입자, 및 은 나노입자로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 나노입자 복합체는 락토페린 및 글루타티온으로 표면이 개질된 금속 나노입자를 포함할 수 있고, 상기 락토페린은 생체적합성 고분자로 표면이 개질되어 있을 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 생체 적합성 고분자는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리카프로락톤, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리락테이트-co-글리콜산, 폴리(3-하이드록시부티레이트-co-3-하이드록시발러레이트) (PHBV), 폴리(L-락타이드-co-카프로락톤), 및 폴리(L-락타이드-co-D-락타이드)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 상기 생체 적합성 고분자는 일 말단에 티올 (-SH)기를 갖도록 변형될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 락토페린 및 글루타티온은 금속 나노입자와 이황화 결합에 의해 결합되어 있을 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 나노입자 복합체는 4 내지 20 nm의 평균 직경을 갖는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 나노입자 복합체를 포함하는, 뇌종양의 치료용 약학적 조성물을 제공하며, 상기 나노입자 복합체를 포함하는 광열 또는 광역학 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 조성물은 경구 투여용일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 조성물은 뇌 조직에 표적화되어 있을 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 나노입자 복합체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 뇌종양의 치료방법과 광열 또는 광역학 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 나노입자 복합체의 뇌종양의 치료용도를 제공한다.
본 발명에 따른 나노입자 복합체는 금속 나노입자에 락토페린 또는 폴리에틸렌 글리콜-락토페린이 결합되어 있으며, 이러한 구성에 따라 금속 나노입자를 뇌종양 조직에 효율적으로 표적화시킬 뿐만 아니라, 생체 내 조건 속에서도 금속 나노입자의 안정성이 유지될 수 있음을 확인할 수 있었는바, 뇌종양 등의 치료에 있어서, 보다 근본적으로 접근하여 타겟 치료할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은, 금 나노입자 복합체의 제조 과정을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 2a는, 글루타티온이 코팅된 금 나노입자를 H-NMR을 통하여 확인한 결과이다.
도 2b는, 폴리에틸렌 글리콜이 결합된 락토페린 (Lf-PEG)을 SDS-PAGE를 통하여 확인한 결과이다.
도 2c는, 락토페린과 폴리에틸렌 글리콜간 결합 비율 및 폴리에틸렌 글리콜이 결합된 락토페린 (Lf-PEG)과 글루타티온이 코팅된 금 나노입자간 결합 비율을 BCA protein assay kit를 통하여 확인한 결과이다.
도 3은, 일반 금 나노입자 (좌측)와 금 나노입자 복합체 (우측)를 투과 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 4는, 일반 금 나노입자 (좌측)와 금 나노입자 복합체 (우측)에 근적외선 파장대의 빛을 조사한 후, 흡광도를 측정한 결과이다.
도 5a는, 금 나노입자 복합체 (Lf-AuNP; 하측)에 532nm 파장의 빛을 조사한 후, 이에 따른 온도 변화를 일반 금 나노입자를 처리한 군 (AuNP; 상측)과 비교한 결과이다.
도 5b는, 532nm 파장의 빛을 조사한 후, 시간의 경과에 따른 금 나노입자 복합체 (Lf-AuNP)와 일반 금 나노입자 (AuNP)의 온도 변화를 정량적으로 나타낸 결과이다.
도 6a는, 경구 투여시 약물이 노출되는, 위와 장의 pH 2 또는 5의 조건 하에서, 시간의 경과에 따른 일반 금 나노입자 (AuNP)와 금 나노입자 복합체 (Lf-AuNP)의 파장 별 흡광도를 측정한 결과이다.
도 6b는, 경구 투여시 약물이 노출되는 pH 7.4, 또는 pH 2 에서 pH 5로 변화하는 조건 하에서, 시간의 경과에 따른 금 나노입자 복합체 (Lf-AuNP)의 파장 별 흡광도를 측정한 결과이다.
도 7a는, 단백질 분해 효소인, 펩신 (Pepsin)에 대한 금 나노입자 복합체(Lf-AuNP)의 안정성을 입증하기 위하여 Pesin Hydrolysis assay를 실시한 결과이다.
도 7b는, 락토페린 (Lf)과 금 나노입자 복합체 (Lf-AuNP)의 Pepsin Hydrolysis assay 결과를 정량적으로 나타낸 결과이다.
도 8a는, 소장 내피세포에 금 나노입자 복합체 (Lf-AuNP)를 처리한 후, 세포의 변화를 전자 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 8b는, 소장 내피세포에 금 나노입자 복합체 (Lf-AuNP)를 처리한 후, cell cytotoxicity assay를 통해 세포 생존율을 정량적으로 분석한 결과이다.
도 9a는, 혈관 내피세포에 금 나노입자 복합체 (Lf-AuNP)를 처리한 후, 세포의 변화를 전자 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 9b는, 혈관 내피세포에 금 나노입자 복합체 (Lf-AuNP)를 처리한 후, cell cytotoxicity assay를 통해 세포 생존율을 정량적으로 분석한 결과이다.
도 10은, 금 나노입자 복합체의 경구 흡수율을 평가하기 위한 Caco-2 cell permeability assay의 구성 및 과정을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 11은, TEER 값을 통해 Tight junction의 형성이 예상되는 경우, 소장 내피세포간 결합 형성여부를 전자현미경으로 관찰한 결과이다.
도 12는, Caco-2 cell permeability assay를 통한 금 나노입자 복합체 (Lf-AuNP)의 TEER 값을 일반 금 나노입자를 처리한 군 (AuNP), 락토페린만을 처리한 군 (Lactoferrin), 락토페린과 락토페린 수용체를 바인딩시킨 후, 금 나노입자 복합체를 처리한 군 (Lf+Lf-AuNP)과 비교한 결과이다.
도 13은, 락토페린 수용체 매개 이동 및 세포간 밀착연접 (tight junction)을 투과하는 수동 수송을 통한 소장내피세포 (Caco-2 cell)의 금 나노입자 복합체 (Lf-AuNP) 섭취를 Bio-TEM (투과전자현미경)으로 확인한 결과이다.
도 14는, 소장내피세포 (Caco-2 cell)의 금 나노입자 (AuNP) 섭취를 Bio-TEM (투과전자현미경)으로 확인한 결과이다.
도 15는, 락토페린 수용체 매개 이동 및 세포간 밀착연접 (tight junction)을 투과하는 수동 수송을 통한 뇌종양 세포 (U87MG)의 금 나노입자 복합체 (Lf-AuNP) 섭취를 Bio-TEM (투과전자현미경)으로 확인한 결과이다.
도 16은, 뇌종양 세포 (U87MG)의 금 나노입자 (AuNP) 섭취를 Bio-TEM (투과전자현미경)으로 확인한 결과이다.
도 17은, 락토페린만을 처리한 군 (Lactoferrin), 금 나노입자만을 처리한 군 (AuNP), 금 나노입자 복합체를 처리한 군 (Lf-AuNP)의 뇌종양 세포 (U87MG)에 532nm 파장의 빛을 0, 3, 5분 간 조사한 후, 각각의 세포의 형태를 광학현미경으로 확인한 결과이다.
도 18은, 락토페린만을 처리한 군 (Lactoferrin), 금 나노입자만을 처리한 군 (AuNP), 금 나노입자 복합체를 처리한 군 (Lf-AuNP)의 뇌종양 세포 (U87MG)에 532nm 파장의 빛을 0, 3, 5분 간 조사한 후, cell cytotoxicity assay를 통해 세포 생존율을 정량적으로 분석한 결과이다.
도 19는, 동물모델에 금 나노입자 복합체 (Lf-AuNP)를 경구 투여한 후, 회장 공장 십이지장에서의 흡수를 Bio-TEM (투과 전자 현미경)으로 확인한 결과이다.
도 20은, 뇌종양 동물모델에 금 나노입자 (AuNP)와 금 나노입자 복합체 (Lf-AuNP)를 경구 투여와 정맥 투여한 후, 뇌 조직에 존재하는 금 나노입자의 양을 비교한 결과이다.
도 21a는, 락토페린 (Lactoferrin), 또는 금 나노입자 (AuNP)를 경구 투여 또는 정맥 투여한 후, 면역조직화학 (Immunohistochemistry) 염색 및 형광 현미경으로 뇌종양 조직 내 분포를 확인한 결과이다.
도 21b는, 금 나노입자 복합체 (Lf-AuNP)를 경구 투여 또는 정맥 투여한 후, 면역조직화학 기법 (Immunohistochemistry) 염색 및 형광 현미경으로 뇌종양 조직 내 분포를 확인한 결과이다.
도 21c는, 락토페린 (Lactoferrin), 금 나노입자 (AuNP), 또는 금 나노입자 복합체 (Lf-AuNP)를 경구 투여 또는 정맥 투여한 후, 뇌종양 조직 내 분포를 정량화하여 확인한 결과이다.
도 22는, 뇌종양 동물모델에 흡수된 금 나노입자 복합체 (Lf-AuNP)의 뇌종양 표적화를 Bio-TEM (투과전자현미경)으로 확인한 결과이다.
도 23은, 금 나노입자 복합체 (Lf-AuNP)와 금 나노입자 (AuNP)를 경구 투여한 후, 1, 6, 24시간 간격을 두고 혈액 내 존재하는 금 나노입자의 양을 비교한 결과이다.
도 24는, 금 나노입자 복합체 (Lf-AuNP)와 금 나노입자 (AuNP)를 경구 투여한지 24시간 경과 후, 신장, 소장, 비장, 또는 간 조직에 존재하는 금 나노입자의 양을 비교한 결과이다.
도 25a는, 락토페린을 함유하는 인산완충생리식염수 (Phosphate Buffered Saline) 용액을 경구 투여한 후, 면역조직화학 (Immunohistochemistry) 염색 및 형광 현미경으로 신장, 간, 또는 비장 조직 내 분포를 확인한 결과이다.
도 25b는, 금 나노입자 복합체 (Lf-AuNP)를 경구 투여한 후, 면역조직화학 (Immunohistochemistry) 염색 및 형광 현미경으로 신장, 간, 비장 조직 내 분포를 확인한 결과이다.
도 26은, 동물 모델에서의 신장, 간, 폐, 비장 조직에 대한 금 나노입자 복합체의 독성을 H&E (Hematoxylin-eosin stain) 염색 및 광학 현미경을 통해 확인한 결과이다.
도 27은, 뇌종양 동물모델에 인산염완충식염수 (PBS), 금 나노입자 (AuNP), 금 나노입자 복합체 (Lf-AuNP)를 경구 투여한지 24시간 경과 때, 뇌종양 조직에 532nm 레이져를 3분간 조사한 후, 이에 따른 온도 변화를 확인한 결과이다.
도 28은, 뇌종양 동물모델에 인산염완충식염수 (PBS), 금 나노입자 (AuNP), 금 나노입자 복합체 (Lf-AuNP)를 경구 투여한지 24시간 경과 때, 뇌종양 조직이 아닌, 몸통 부위에 532nm 레이져를 3분간 조사한 후, 이에 따른 온도 변화를 확인한 결과이다.
도 29는, 뇌종양 동물모델을 금 나노입자 복합체 (Lf-AuNP)로 광열 치료한 후, 적출한 뇌종양 조직을 Tunel assay와 H&E 염색으로 확인한 결과이다.
도 30은, 뇌 뇌종양 동물모델을 금 나노입자 복합체 (Lf-AuNP)로 광열 치료한 후, 적출한 뇌종양 조직을 Nissl 염색으로 확인한 결과이다.
도 31은, 뇌 뇌종양 동물모델을 금 나노입자 복합체 (Lf-AuNP)로 광열 치료한 후, 적출한 뇌종양 조직을 Nissl 염색한 결과를 정량적으로 나타낸 결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.
본 발명은, 금속 나노입자, 글루타티온 (Glutathione), 및 락토페린 (Lactoferrin)을 포함하는, 나노입자 복합체를 제공한다.
본 발명에서, 상기 금속 나노입자는 전자기파 조사시 표면 플라스몬 공명 (surface plasmon resonance)에 의해 열을 발생시키는 구성으로서, 나노입자 복합체의 중심부를 형성하는 역할을 한다. 상기 금속 나노입자는 바람직하게 금 나노입자, 산화철 나노입자, 또는 은 나노입자, 가장 바람직하게 금 나노입자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 필요에 따라 실리카 나노입자와 같이 비금속 나노입자로 대체하여 적용될 수도 있다.
종래의 금속 나노입자는 위장관에서의 낮은 pH에 의해 경구 흡수율이 매우 낮아 치료제로 활용함에 어려움이 있었는바, 상기 금속 입자의 생체 적합성을 향상시키고, 낮은 pH에도 안정성이 유지될 수 있도록 글루타티온 (Glutathione)이 결합 또는 코팅되어 있을 수 있으며, 구체적으로, 상기 글루타티온은 금속 나노입자 표면과 이황화 결합 (disulfide bond)을 형성한다. 또한, 상기 나노입자의 금속 성분은 전자기파의 조사에 의해 열을 발생시킬 수 있는 금속이라면 특별히 제한되지 않고, 일 구현예로서, 근적외선 영역에서 흡광도를 갖는 금 (Au) 성분일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 락토페린 (Lactoferrin)은, 인체 내 철분과 결합하여 강력한 항산화 물질로 바뀌며, 체내에서 세균 증식 억제 등의 활성을 나타내는 물질로서, 유즙에 함량이 많으며, 그 중에서도 초유(colostrums)에 가장 많이 함유되어 있는 것으로 알려져 있다.
특히, 락토페린은 세포막 단백질 중 하나인 LRP (Low-density lipoprotein receptor related protein)와 결합이 가능한 리간드이며, 락토페린 수용체는 소장 상피에 다수 발현되어 있는 것으로 알려져 있다. 이에, 본 발명에서는 뇌종양의 표적화와 금속 나노입자의 생체 이용률, 특히 경구 흡수율을 향상시키기 위한 구성으로 락토페린을 이용하였다. 상기 락토페린은 상기 금속 나노입자 표면에 결합 또는 코팅되어 있을 수 있으며, 구체적으로 상기 락토페린은 금속 나노입자 표면과 이황화 결합을 형성한다.
본 발명의 나노입자 복합체는 락토페린의 변형을 최소화하기 위하여, 생체적합성 고분자를 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 락토페린 표면을 생체적합성 고분자로 개질함으로써, 위장관 및 혈액 순환 과정에서의 락토페린의 변형을 최소화시킬 수 있다, 이러한 구성을 통해 나노입자 복합체의 경구 흡수율을 향상시키고, 궁극적으로 뇌 조직으로의 표적성을 증진시킨다. 이 뿐만 아니라, 락토페린과 결합된 생체적합성 고분자간 척력에 의해, 나노입자 복합체간 일정 거리를 유지하게 하여 나노 입자간 응집 현상을 막고 궁극적으로 광열 또는 광역학 치료 효과를 증진시킴에 기여한다.
상기 생체적합성 고분자는 바람직하게 생체 친화적인 특징이 있는 다당류의 단량체 또는 고분자일 수 있으며, 바람직하게, 고분자는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리카프로락톤, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리락테이트-co-글리콜산, 폴리(3-하이드록시부티레이트-co-3-하이드록시발러레이트) (PHBV), 폴리(L-락타이드-co-카프로락톤), 및 폴리(L-락타이드-co-D-락타이드)일 수 있고, 가장 바람직하게, 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene glycol)일 수 있으며, 필요한 경우, 상기 생체 적합성 고분자는 일 말단에 티올 (-SH)기를 갖도록 변형될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 나노입자 복합체는 바람직하게 4 내지 20nm의 평균 직경을 갖을 수 있다. 상기 범위를 벗어나 나노입자의 직경이 너무 작으면 치료 효과가 미미할 우려가 있으며, 나노입자의 직경이 너무 크면 blood brain barrier (BBB)의 통과율이 감소하는 문제가 야기될 수 있다.
본 발명의 나노입자 복합체에서, 락토페린과 폴리에틸렌 글리콜의 결합 비율은 1:100 내지 1:25일 수 있고, 가장 바람직하게 1:50일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 폴리에틸렌 글리콜이 결합된 락토페린과 글루타티온이 결합된 금 나노입자의 결합 비율은 10:1 내지 3:1일 수 있고, 가장 바람직하게 4.5:1일 수 있으나, 이 역시 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 본 발명의 목적상, 상기 나노입자 복합체는 용도면에 있어서, 뇌종양 치료용, 광열(Photothermal) 치료용, 광역학(Photodynamics) 치료용으로 사용될 수 있으며, 투여 방법면에 있어서는, 위장관에서 높은 안정성을 나타내므로 경구 투여용으로 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 글루타티온이 결합되어 있는 금 나노입자에 폴리에틸렌 글리콜이 결합된 락토페린을 반응시켜 본 발명의 금 나노입자 복합체를 제조하였으며, 상기 금 나노입자 복합체는 금 나노입자 본연의 물리적 특징, 즉, 근 적외선 파장대에 대한 유의적인 흡광 peak 및 발열 효과가 유지됨을 확인할 수 있었다. 또한, 본 발명의 다른 실시예에서는, 강산성 조건 하에서도 안정성이 유지되었고, 소장 내피세포 및 혈관 내피세포에 대한 세포 독성이 낮았으며, 우수한 경구 흡수율 증진 효과를 확인할 수 있었다. 이 뿐만 아니라, 뇌종양 동물모델에서, 우수한 뇌 조직 표적화 효과를 확인할 수 있었는바, 뇌종양의 치료에 활용될 수 있음을 알 수 있었다.
이에, 본 발명은 상기 나노입자 복합체를 유효성분으로 포함하는, 뇌종양의 치료용 약학적 조성물; 뇌종양 치료를 위한 상기 나노입자 복합체의 용도; 및 치료학적 유효량의 상기 나노입자 복합체를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 뇌종양의 치료방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "치료"는 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 뇌종양에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서, "개체"는 뇌종양의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하며, 보다 구체적으로 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명의 치료 대상 질병인 "종양"은 정상적인 세포사멸 균형이 깨지는 경우 세포가 과다 증식하고, 주변 조직으로 침윤할 수 있는 특징을 갖는 질병군을 말하며, 상기 나노입자 복합체의 뇌조직 표적화 효과을 감안해 볼때, 바람직하게 상기 종양은 뇌암 (뇌종양)일 수 있으며, 보다 구체적으로는 Glioblastoma multiforme　(GBM)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 유효성분 이외에 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 이때, 약학적으로 허용되는 담체는 제제시 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아, 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성 셀룰로스, 폴리비닐 피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여 (예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 가장 바람직하게는 경구 투여할 수 있다. 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래 의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 나노입자 복합체를 유효성분으로 함유하는, 광열/광역학 치료용 조성물; 광열/광역학 치료를 위한 상기 나노입자 복합체의 용도; 및 치료학적 유효량의 상기 나노입자 복합체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 광열/광역학 치료방법을 제공한다.
본 발명의 조성물은, 전자기파 조사에 의해 열을 발생시키는 금속 나노입자의 성질을 이용하여, 광열 치료용 조성물로 사용될 수 있다. 상기 광열 치료는 파장의 광선 (빛)을 쏘여주었을 때 빛 에너지가 열 에너지로 전환이 되고 빛으로부터 나온 열 에너지가 암세포를 태워 치료하는 방식을 의미한다. 레이저 조사시 표면 플라즈몬 공명 (SPR ; Surface Plasmon Resonance) 현상에 의해 열을 발생시키고 이를 주변으로 발산시켜 외부 영역 (ex. 종양 세포)에 영향을 준다. 일례로서 암세포를 사멸시킬 수 있다.
또한 본 발명의 조성물은 광감각제 (Photosestizer) 및 광선을 사용하여, 광역학 치료용 조성물로 사용될 수 있다. 상기 광역학 치료는 병적 상태에 있는 대상에 광감각제를 처리하고, 이 광감각제를 활성화시켜 치료 효과를 얻기 위해 광선을 조사하는 과정을 포함하는 치료 방식을 의미한다. 상기 "광감작제(photosensitizer)"는 적합한 파장의 광원에 노출되었을 때 빛에너지를 흡수한 후, 광 화학반응에 의해 목표 세포를 손상시키거나 파괴할 수 있는 생물학적 매개물질(예를 들어, 라디칼 또는 세포독성물질)을 방출할 수 있는 화합물을 포괄적으로 의미한다. 상기 광감작제는 생체에 투여되는 경우 특정의 타겟 세포(예컨대, 암세포)에 특이적으로 결합한 후 광원에 의해 활성화되어 암세포를 사멸시킬 수 있는 독성물질을 생성함으로써 암세포에 대한 선택적 독성을 나타낸다. 이러한 광감작제로 사용될 수 있는 화합물들은 일례로서, 클로린계 화합물, 박테리오클로린계 화합물, 프탈로시아닌계 화합물, 포르피린계 화합물, 푸푸린계화합물, 메로시아닌계 화합물, 프소라렌계 화합물, 벤조포르피린 유도체 화합물, 및 포르파이머 소디엄 및 프로토포르피린 IX와 같은 광민감제를 생성할 수 있는 델타-아미노레불린산, ICG, 메틸렌 블루, 톨루이딘 블루, 텍사피린계 화합물 등이 있다.
본 발명에서 열에너지를 발생시키거나 광감작제를 활성화시키기 위한 광선의 에너지량은 사용 환경 및 목적에 따라 적합하게 선택하여 사용한다. 예를 들어, 적합한 파장, 전력(power), 전력밀도(power density), 에너지 밀도 및 광감작제를 처리한 시간에 비례한 적용기간 등을 적절하게 선택, 조절한다. 광선의 파장은 금속 나노입자 또는 광감작제에 의해 흡수될 수 있는 어떠한 파장도 사용가능하고, 표적 세포에 원하는 생물학적 반응을 일으킬 수는 파장이라면, 제한없이 포함될 수 있다.
본 발명에서 광선을 생성하는 광원은 필요한 빛 에너지를 공급하여 열에너지를 발생시키거나 광감작제를 활성화시킬 수 있는 파장을 생성하는 어떠한 광원도 사용가능하다. 광원의 구체적인 예로서 레이저(laser), 램프(lamp), 광전자기 장치(optoelectric magnetic device), 다이오드(diode), 또는 다이오드-레이저(diode-laser) 등을 들 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[ 제조예 ]
제조예 1. 락토페린이 결합된 금 나노입자 복합체의 제조
55.6% (v/v)의 메탄올 수용액 (메탄올 (115ml) 및 증류수 (303ml))에 HAuCl4 (1mM), glutathione (37.8mM), 및 NaOH (178mM)를 용해시킨 후, NaBH4를 첨가하여 금 이온 (Au3 +)을 환원시키고, 이를 100℃에서 48시간 동안 교반시켰다. 상기 혼합용액에 NaCl (68mM)을 첨가한 뒤, 3200 RCF에서 centrifugation시켜 글루타티온이 코팅된 금 나노입자(GSH-AuNP)를 침전시켰다. 이후, room temperature에 24시간 동안 메탄올을 기화시켜 락토페린이 결합된 금 나노입자 복합체를 제조하였다.
제조예 2. 폴리에틸렌 글리콜-락토페린이 결합된 금 나노입자 복합체의 제조
2-1. 폴리에틸렌 글리콜이 결합된 락토페린의 제조
폴리에틸렌 글리콜 (SH-PEG-COOH, 3.5μg)을 PBS buffer (2ml)에 용해시킨 후, 여기에 EDC (47.75mg) 및 NHS (57.55mg)를 다시 용해시키고, 이를 15분간 교반시켰다. 15분 경과 후, 락토페린 (10mg)을 용해시키고, 다시 4℃에서 24시간 동안 교반시켰다. 이후, 10kDa의 membrane을 이용하여 4℃에서 24시간 동안 투석한 후, 얻어진 결과물을 동결건조하여 폴리에틸렌 글리콜이 결합된 락토페린 (SH-PEG-Lactoferrin)을 제조하였다.
2- 2.폴리에틸렌 글리콜-락토페린이 결합된 금 나노입자 복합체의 제조
상기 제조예 2-1에서 제조된 폴리에틸렌 글리콜이 결합된 락토페린 (SH-PEG-Lactoferrin)과 폴리에틸렌 글리콜 (SH-PEG-COOH)이 1:4의 비율로 섞여있는 락토페린-PEG 혼합물을 1mM의 농도로 PBS (2ml)에 용해시켰으며, 이를 다시 글루타티온이 코팅된 금 나노입자 (GSH-AuNP)가 20μM의 농도로 PBS에 용해되어 있는, 금 나노입자 용액과 혼합하여 4ml의 혼합 용액을 제조한 후, 4℃에서 24시간 동안 교반시켰다. 이후, 100kda pore membrane을 이용하여 4℃에서 24시간 동안 투석한 후, 얻어진 결과물을 동결건조하여 폴리에틸렌 글리콜-락토페린이 결합된 금 나노입자 복합체를 제조하였다. 상기 폴리에틸렌 글리콜-락토페린이 결합된 금 나노입자 복합체의 제조과정은 도 1에 개략적으로 나타내었으며, 이하의 실시예에서는, 이를 '금 나노입자 복합체'로 명명하였다.
[ 실시예 ]
실시예 1. 금 나노입자 복합체의 제조과정 및 물리적 특성 확인
본 실시예에서는, 상기 제조예 1 및 2에 따른 금 나노입자 복합체 제조과정에서, 각 단계별 생성물을 구체적으로 확인하고, 금 나노입자 복합체의 구체적인 물리적 특징을 확인하고자 하였다.
1-1. 제조 과정에서의 생성물 확인
제조예 1에 따른 글루타티온이 코팅된 금 나노입자, 및 제조예 2-1에 따른 폴리에틸렌 글리콜이 결합된 락토페린을 H-NMR 및 SDS-PAGE 및 BCA assay를 통하여 확인하였으며, 제조예 2-2에 따른 금 나노입자 복합체를 BCA assay 및 HR-TEM (high resolution-transmission electron microscopy)을 이용하여 관찰하였다.
그 결과, 도 2a 및 2b에 나타낸 바와 같이, H-NMR에서 3.369ppm, 2.485ppm, 2,056ppm의 피크가 관찰되었는바, 이를 통하여 금 나노입자의 표면에 글루타티온이 결합되어 있음을 확인할 수 있었으며, 락토페린 (Lf) 자체는 약 80kda에서 Band가 검출된 반면, 폴리에틸렌 글리콜이 결합된 락토페린 (Lf-PEG)은 상기 Lf Band의 위쪽에 band가 형성되었는바, Lf-PEG가 합성된 것을 확인할 수 있었다.
한편, 도 2c에 나타낸 바와 같이, 폴리에틸렌 글리콜이 결합된 락토페린 (SH-PEG-Lactoferrin)의 몰 농도(M) 비율을 단백질 정량 기법인 BCA assay으로 확인한 결과, 락토페린 (Lf)과 폴리에틸렌 글리콜의 결합 비율이 1 : 50임을 알 수 있었다 (도 2c 참조). 또한, 상기 금 나노입자와 Lf-PEG간 결합으로 형성된, 금 나노입자 복합체에 대하여, 동일하게 BCA assay를 실행한 결과, 폴리에틸렌 글리콜이 결합된 락토페린 (Lf-PEG)과 글루타티온이 결합된 금 나노입자의 결합 비율이 4.5 : 1임을 알 수 있었다 (도 2c 참조).
끝으로, 투과 현미경으로 관찰한 결과, 일반 금 나노입자 (AuNP)의 크기는 평균 4.56nm이고, 본 발명의 금 나노입자 복합체 (Lf-AuNP)의 크기는 평균 5.02nm이었으며, AuNP의 경우 상기 금 나노입자들간 서로 응집된 반면, Lf-AuNP는 PEG에 의해 응집되었던 금 나노입자가 풀려있는 것을 확인할 수 있다 (도 3 참조).
1-2. 금 나노입자 복합체의 물리적 특성 확인
금 나노입자 복합체의 형성에도 불구하고 금 나노입자 본연의 성질을 유지하는지를 확인하기 위하여, UV-vis spectrophotometer를 이용하여 각각의 파장에서의 흡광도 값을 측정하였으며, 근적외선 (NIR) 파장대의 빛에 의한 발열효과를 확인하였다 (도 4 참조). 구체적으로, 일반 금 나노입자 및 금 나노입자 복합체를 8mg/ml씩 준비하였으며, 여기에 LRS-0532 DPSS Laser System Laser glow Part Number: R5310B1FL를 이용하여 532nm 파장의 레이저를 4w/cm2의 조건으로 240초간 조사하였다. 이후, 0, 3, 10, 30, 60, 120, 180, 240, 300, 330, 및 400초 마다 FLIR C2 열화상 카메라를 이용하여 각각 시간대의 온도를 측정하여 발열효과를 비교하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 일반 금 나노입자 (AuNP)와 마찬가지로, 본 발명의 금 나노입자 복합체의 경우, 532nm 파장의 빛에 대한 우수한 발열 효과를 확인하였는바, Lf-PEG가 결합이 되어도 금 나노입자의 성질을 유지하고 있음을 확인할 수 있었다, 이 뿐만 아니라, Lf-PEG 결합에 의한 척력의 작용으로, 금 나노입자간 약 5nm 정도의 거리를 유지하여, 응집 현상이 빈번한 일반 금 나노입자에 비하여 더욱 우수한 발열 효과를 관찰할 수 있었다. 실제로, 도 5b에 나타낸 바와 같이, 일반 금 나노입자의 경우, 최대 47.9℃까지 열이 발생하였던 반면, 본 발명의 금 나노입자 복합체에서는 최대 57.3℃까지 열이 발생하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 2. 강산성 조건에서 금 나노입자 복합체의 안정성 확인
본 실시예에서는, 금 나노입자 복합체가 강산성 조건의 위장관에서 안정성을 유지할 수 있는지를 확인하기 위하여, 장 및 위에서의 산도인 pH 5 및 pH 2에서 상기 실시예 1-2에서 확인한 바 있는 532nm 파장에서의 흡광도 값을 측정하였다. 구체적으로, pH 2 조건에 0, 1, 2, 6, 12시간, pH 5 조건에 0, 1, 2, 6, 12시간 동안 금 나노입자 복합체를 노출시켰으며, 위를 지나 장으로의 진입하는 환경을 모사하기 위한 조건으로서, pH 2 조건에 2시간 노출 후, pH 5로 옮겨 0, 1, 4, 7 시간 동안 금 나노입자 복합체를 노출시켰다. 이후, 각각의 금 나노입자 복합체에 대한 532nm대 파장에서의 흡광도 값을 spectrophotometer를 이용하여 측정하였다.
강한 산성 (pH 2 또는 pH 5) 조건에서 흡광도 값을 측정한 결과, 도 6a에 나타낸 바와 같이, 금 나노입자 복합체 (Lf-AuNP)는 금 나노입자 (AuNP)와 마찬가지로, 532nm 파장에서의 흡광도 증가를 확인할 수 있었다, 또한, pH 2 조건에서 pH 5 조건으로 변화시킨 경우, 도 6b에 나타난 바와 같이, 금 나노입자 복합체의 흡광도 증가는 중성 (pH 7.4)과 비슷한 양상을 보였는바, 생체 내 조건, 특히 위장관에서 금 나노입자 복합체의 안정성이 유지될 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 3. 단백질 분해 효소에 대한 금 나노입자 복합체의 안정성 확인
본 실시예에서는, 위에서 분비되는 단백질 분해 효소인, 펩신 (Pepsin)에 대한 금 나노입자 복합체의 안정성 (락토페린의 분해 억제 효과)을 입증하기 위하여 Pesin Hydrolysis assay를 실시하였다. 락토페린 (Lf)과 금 나노입자 복합체 (Lf-AuNP)를 펩신 (Pepsin)에 0, 10, 20, 30, 60, 120, 및 240분 동안 각각 노출시킨 뒤 전기영동을 실행하였으며, 상기 락토페린(Lf)은 금 나노입자 복합체에 결합되어 있는 락토페린과 동일한 양이 되도록 설정하였다. 구체적으로, 락토페린과 금 나노입자 복합체를 10mM의 HCl에 1mg/ml에 용해시키면서, 여기에 40ng/ml의 펩신 (Pepsin)을 1:1 비율로 첨가하였다. 이후, 0, 10, 20, 30, 60, 120, 및 240분 동안 반응시킨 뒤, 이를 SDS sample solution에 1:1 비율로 반응시켜 전기영동을 실행하였다.
그 결과, 도 7a 및 7b에 나타난 바와 같이, 금 나노입자 복합체과 결합되어 있는 락토페린은, 펩신 (Pepsin)에 대한 안정성이 비결합된 락토페린 (Lf)에 비해 우세함을 확인할 수 있었다.
실시예 4. 세포 독성 평가
금 나노입자 복합체는 소장에 존재하는 Lactoferrin receptor의 표적이 되어 소장 내피세포를 통하여 혈액 내로 들어가게 되며, 이후, 혈액 중에 존재하는 금 나노입자 복합체는 뇌종양 조직으로 표적화되어 뇌 조직 또는 혈관에 축적되게 된다. 이에, 본 실시예에서는, 소장 내피세포 및 혈관 내피세포를 대상으로 세포 독성 실험을 실시하였다.
4-1. 소장 내피세포에 대한 독성 평가
소장 내피세포에서 금 나노입자 복합체의 세포 독성 여부를 확인하기 위하여, 전자 현미경으로 세포의 변화를 관찰하였으며, cell cytotoxicity assay를 통하여 생존 세포의 수를 정량적으로 분석하였다. 구체적으로, 96-well plate에 Caco-2 세포를 5x103/well의 농도로 24시간 동안 incubator에 배양하였으며, 상기 배양된 세포에 금 나노입자 복합체를 800μg/100μl의 농도로 처리한 후, incubator에서 24시간 반응시켰다. 이후, 금 나노입자 복합체를 세척하였으며, media (100μl) 및 cell cytotoxicity assay kit인 EZ-Cytox (10μl)를 처리하고, 약 4시간 동안 incubator에서 반응시켰다. 세포 독성 평가를 위하여 450nm에서의 흡광도를 Plate reader를 이용하여 측정하였으며, 대조군으로 별도의 처리를 하지 않은 군 (Con), 비교군으로는 일반 금 나노입자를 처리한 군 (AuNP)을 이용하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 금 나노입자 복합체를 처리한 세포의 상태를 대조군 및 비교군과 비교하였을 때, 전혀 차이를 보이지 않았으며 (도 8a 참고), 생존 세포수를 정량적으로 분석한 결과, 상기 결과와 마찬가지로 소장 내피세포의 viability가 전혀 감소되지 않음을 확인하였는바 (도 8b 참조), 본 발명의 금 나노입자 복합체는 소장 내피세포에 대하여 세포 독성을 나타내지 않음을 확인할 수 있었다.
4-2. 혈관 내피 세포에 대한 독성 평가
혈관 내피세포에서 금 나노입자 복합체의 세포 독성 여부를 확인하기 위하여, 전자 현미경으로 세포의 변화를 관찰하였을 뿐만 아니라, cell cytotoxicity assay를 통하여 생존 세포의 수를 정량적으로 분석하였다. 구체적으로, 96-well plate에 Human Umbilical Vein Endothelial 세포 (HUVEC)를 5x103/well의 농도로 24시간 동안 incubator에 배양하였으며, 상기 배양된 세포에 금 나노입자 복합체를 800μg/100μl의 농도로 처리한 후, incubator에서 24시간 반응시켰다. 이후, 금 나노입자 복합체를 세척하였으며, media (100μl) 및 cell cytotoxicity assay kit인 EZ-Cytox (10μl)를 처리하고, 약 4시간 동안 incubator에서 반응시켰다. 세포 독성 평가를 위하여 450nm에서의 흡광도를 Plate reader를 이용하여 측정하였으며, 대조군으로 별도의 처리를 하지 않은 군 (Con), 비교군으로는 일반 금 나노입자를 처리한 군 (AuNP)을 이용하였다.
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 금 나노입자 복합체를 처리한 세포의 상태를 대조군 및 비교군과 비교하였을 때, 전혀 차이를 보이지 않았으며 (도 9a 참고), 생존 세포 수를 정량적으로 분석한 결과, 상기 결과와 마찬가지로 혈관 내피세포의 viability가 전혀 감소되지 않음을 확인하였는바 (도 9b 참조), 본 발명의 금 나노입자 복합체는 혈관 내피세포에 대하여 세포 독성을 나타내지 않음을 확인할 수 있었다.
실시예 5. 금 나노입자 복합체의 경구 흡수율 증진 효과 확인
5-1. Trans Epithelial Electronical Resistance ( TEER )를 통한 소장내피세포에 대한 금 나노입자 복합체의 투과율 측정
본 실시예에서는, 소장 내피세포에서 금 나노입자 복합체의 경구 흡수율을 in vitro 상에서 확인하기 위하여, Caco-2 cell permeability assay를 실시하였다 0.4μm pore size의 insert에 2x103의 농도로 Caco-2 세포를 배양시켰으며, EVOM2 (Epithelial Voltohmmeter)을 이용하여 tight junction이 형성될 때까지 Trans Epithelial Electronical Resistance (TEER) 값을 측정하였다. 이후, 금 나노입자 복합체를 800μg/100μl의 농도로 insert에 처리한 후, EVOM2을 이용하여 20분마다 TEER 값을 측정하였다. 구체적으로, 도 9에 도시한 바와 같이, 금 나노입자 복합체가 apical side (A)에서 basolateral side (B)로 이동하게 되면, Caco-2 세포간 tight junction이 벌려지면서 TEER 값이 떨어지게 된다. 따라서, TEER 값의 변화를 통해 in vitro 상에서 경구 흡수율을 평가하였다.
우선, tight junction이 형성된 TEER 값을 나타낼 때의 Caco -2 세포를 전자현미경으로 관찰한 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 세포간 띠 모양 구조를 통해 복잡한 네트워크가 형성되어 있었으며, 이는 Caco-2 세포가 tight junction으로 결합되어 있음을 의미한다.
또한, 도 12에 나타낸 바와 같이, 상기와 같이 tight junction이 형성된 Caco-2 세포에 일반 금 나노입자 (AuNP)를 처리한 경우, TEER 값이 약 73%, 금 나노입자 복합체 (Lf-AuNP)의 경우, TEER 값이 약 62%까지 감소하였다. 특히, 락토페린만 (Lactoferrrin) 처리한 경우, 일반 금 나노입자와 금 나노입자 복합체의 TEER 값 차이와 근사한 10% 가량이 감소하였는바, 락토페린의 효과에 의해 경구 흡수율이 증가한 것임을 알 수 있었다. 이 뿐만 아니라, 상기 경구 흡수율 증진 효과가 락토페린에 의한 것임을 재차 확인하기 위하여, 락토페린만을 Caco-2 세포에 3시간 처리하여 락토페린 수용체에 충분히 바인딩 시킨 후, 상기와 동일한 조건에서 금 나노입자 복합체 (Lf+Lf-AuNP)를 처리하였으며, 그 결과, 일반 금 나노입자를 처리한 그룹과 TEER 값 차이가 없음을 확인함으로써, 상기 경구 흡수율 증진 효과는 락토페린 수용체와 락토페린에 기인한 것임을 확인할 수 있었다.
5-2. 소장 내피세포에 대한 금 나노입자 복합체의 흡수 확인
본 실시예에서는, 소장 내피세포에 대한 금 나노입자 복합체의 흡수를 in vitro 상에서 확인하였다. 100π culture dish에 Caco-2 cell의 수가 8.8 x 106 에 이르도록 배양하여 tight junction이 형성시켰다. 이후, 800μg/100μl 농도의 금 나노입자 복합체를 처리한 후, 18시간 동안 배양 후 3회 세척하고, Trypsin/EDTA를 통해 세포를 분리하였다. 그 후, 4% formaldehyde로 고정하였고, 이를 다시 resin fixation한 뒤, ultramicrotome (EM UC7, 독일)으로 제작한 조직 절편을 80kV Transmission Electron Microscope (JEM1010, 일본)으로 관찰하였다.
도 13에 나타난 바와 같이, 리소좀 탈출 현상과 세포막주변 금 나노입자 복합체의 소수포(vesicle) 함입을 통하여, 락토페린 수용체를 매개한 소장 내피세포의 금 나노입자 복합체 섭취(uptake)를 관찰할 수 있었다. 또한, 소기관 외 세포질에서 다량의 금 나노입자를 확인함으로써, 세포간 밀착연접 (tight junction)을 투과하는 수동 수송을 통한 세포 내 섭취를 확인할 수 있었다.
반면, 금 나노입자의 경우, 도 14에 나타낸 바와 같이, 소장 내피세포의 락토페린 수용체를 매개로한 금 나노입자(AuNP)의 세포 내 섭취를 확인할 수 없었다.
실시예 6. 금 나노입자 복합체의 경구 투여를 통한 뇌종양 표적성 증진 효과 확인
본 실시예에서는, 뇌종양 세포(U87MG)에 대한 금 나노입자 복합체의 흡수를 in vitro 상에서 확인하였다. 100π culture dish에 U87MG cell의 수가 8.8 x 106 에 이르도록 배양하여 tight junction이 형성시켰다. 이후, 800μg/100μl 농도의 금 나노입자 복합체를 처리한 후, 18시간 동안 배양 후 3회 세척하고, Trypsin/EDTA를 통해 세포를 분리하였다. 그 후, 4% formaldehyde로 고정하였고, 이를 다시 resin fixation한 뒤, ultramicrotome (EM UC7, 독일)으로 제작한 조직 절편을 80kV Transmission Electron Microscope (JEM1010, 일본)으로 관찰하였다.
그 결과, 도 15에 나타난 바와 같이, 리소좀 탈출 현상과 세포막주변 금 나노입자 복합체의 소수포(vesicle) 함입을 통하여, 락토페린 수용체를 매개한 뇌종양 세포의 금 나노입자 복합체 섭취(uptake)를 관찰할 수 있었다. 또한, 소기관 외 세포질에서 다량의 금 나노입자를 확인함으로써, 세포간 밀착연접 (tight junction)을 투과하는 수동 수송을 통한 세포 내 섭취를 확인할 수 있었다. 상기 결과를 통해, 경구 투여를 통해 소장내피 세포에 섭취된 금 나노입자 복합체는, 락토페린 수용체를 매개로 하여, 뇌종양 조직으로 전달될 수 있음을 알 수 있었고, 상기 금 나노입자 복합체는 약 5nm 크기의 작은 크기를 갖으므로, 세포질뿐 아니라 세포의 핵까지 전달될 수 있을 것으로 판단된다.
실시예 7. In vitro 상에서 뇌종양 세포에 대한 금 나노입자 복합체의 광열 치료 효과 확인
금 나노입자 복합체 및 근적외선 파장대 (532nm) 레이져를 이용한 광열 치료효과로서, 뇌종양 세포의 세포 사멸 여부를 cell cytotoxicity assay를 통해 확인하였다. 구체적으로, 96-well plate에 뇌종양 세포 (U87MG)를 5x103/well의 농도로 24시간 동안 incubator에 배양하였으며, 상기 배양된 세포에 금 나노입자 복합체를 500μg/ml의 농도로 처리한 후, incubator에서 18시간 반응시켰다. 이후, 금 나노입자 복합체를 2번 세척하고, 0, 3, 5분간 레이져를 조사한 후, 다시 한번 세척 하였다. 이후, media (100μl) 및 cell cytotoxicity assay kit인 EZ-Cytox (10μl)를 처리하고, 약 1시간 동안 incubator에서 반응시켰다. 생존 세포의 수를 정량적으로 분석하기 위하여 450nm에서의 흡광도를 Plate reader를 이용하여 측정하였으며, 대조군으로 별도의 처리를 하지 않은 군 (Con), 비교군으로는 금 나노입자 복합체의 결합 비율을 고려하여, 8.1μg/ml의 락토페린을 처리한 군 (Lactoferrin), 90μg/ml의 금 나노입자를 처리한 군 (AuNP)을 이용하였다. (도 18 참고)
그 결과, 도 17에 나타낸 바와 같이, 금 나노 복합체를 처리한 군은 다른 비교군에 비해 3분의 짧은 레이져 조사 시간에도 뇌종양 세포의 생존율을 20%까지 감소시켰으며, 일반 금 나노입자를 처리한 군은 5분의 레이져 조사를 통해 상기와 동일한 정도의 세포 사멸이 관찰되었다.
상기의 실험 결과와 종합해 보면, 뇌종양 세포에 대한 락토페린 수용체-매개 금 나노입자 복합체의 섭취 증가는 뇌종양 세포에 대한 광열 치료효과, 즉 세포 사멸 효과의 증진으로 이어짐을 알 수 있다.
실시예 8. 동물모델을 이용한 금 나노 복합체의 경구 흡수 확인
본 실시예에서는, 동물모델을 이용하여, 금 나노입자 복합체의 경구 투여 후, 소장에서의 흡수를 확인하고자 하였다. 구체적으로, Balb/c 쥐를 6시간 공복 상태를 유지하게 한 후, 60mg/kg의 농도로 금 나노입자 복합체를 경구 투여하였다. 2시간 반 경과 후, 쥐를 희생시키고 방혈시켰으며, 소장을 적출한 뒤, 십이지장, 공장, 회장을 구분하여 4% formaldehyde로 고정하였고, 이를 다시 resin fixation한 뒤, ultramicrotome (EM UC7, 독일)으로 제작한 조직 절편을 80kV Transmission Electron Microscope (JEM1010, 일본)으로 관찰하였다.
그 결과, 도 19에 나타난 바와 같이, 소장의 십이지장, 회장, 공장에서 금 나노 복합체가 다량 검출되었으며, 이를 통해, 금 나노 복합체의 선택적 흡수를 확인할 수 있었다. 이러한 결과는, 경구 투여된 금 나노입자 복합체는 소장의 모세혈관을 거쳐 혈액 내로 들어가고, 이에 따른 체순환을 거치면서 뇌종양 조직으로 전달될 수 있음을 시사하는 것이다.
실시예 9. 동물모델을 이용한 뇌종양 조직의 표적화 효과 확인
본 실시예에서는, 뇌종양 동물모델을 이용하여, 금 나노입자 복합체의 뇌종양 표적화 효과를 확인하고자 하였다. 구체적으로, 10% FBS 및 1% antibiotics가 첨가된 DMEM 배지에서 배양한 U87MG 세포를 antibiotics가 함유되지 않은 PBS에 모았다. 이후, 5 내지 7주령의 누드 마우스를 아이소프란으로 마취시키고, stereotaxic instrument 안의 ear bar를 이용하여 고정시켰다. 수술 부위의 두피를 절개한 후, 브레그마 (bregma)의 우측 2mm, 아래방향 2mm에 sterile drill을 이용하여 구멍을 만들었다. 이후, 상기 구멍을 통해 1x106의 U87MG 세포를 26G Hamilton syringe로 주입하였으며 (1μl/min), 주입 후 구멍을 bone wax로 막고 봉합하여 두피를 닫아 뇌종양 동물 모델을 확립하였다.
9-1. ICP-MS를 통한 뇌종양 표적화 효과 확인
상기 뇌종양 동물모델에 60mg/kg 농도의 금 나노입자 복합체 (200μl)를 oral gavage을 통하여 경구 흡수시켰다. 24시간 경과 후, 뇌종양 동물모델을 방혈시키고, 뇌를 적출하였으며, 상기 수득한 혈액과 뇌에 존재하는 금 나노입자의 양을 ICP-MS를 통하여 측정하였다. 비교군으로 금 나노입자 복합체에 금 나노입자의 결합 비율을 고려하여 11mg/kg 농도의 일반 금 나노입자를 경구 투여한 군 (AuNP)을 이용하였다. 한편, 약물 투여 방식의 차이에 의한 금 나노입자의 뇌종양 표적화 효과를 확인하기 위해, 1mg/kg 농도의 금 나노 입자 복합체를 10회 정맥 투여하였다. 비교군으로는 0.18mg/kg 농도의 일반 금 나노입자를 정맥 투여한 군 (AuNP)을 이용하였다.
그 결과, 도 20에 나타낸 바와 같이, 정맥 또는 경구 투여를 통해 일반 금 나노입자를 처리한 대조군에서, 뇌종양 형성에 따른 blood brain barrier (BBB)의 파괴 및 enhanced permeability and retention effect (EPR)에 의해 소량의 금 나노입자가 뇌에 존재함을 알 수 있었으나, 정맥 또는 경구 투여를 통해 금 나노입자 복합체를 처리한 경우, 이러한 대조군에 비해 5-6배 이상의 많은 금 나노입자가 축적되어 있음을 알 수 있었다. 이는 Lactoferrin receptor mediated trancytosis, 및 PEG에 의해 증가된 반감기 효과를 통해, 뇌 조직으로 다량의 금 나노입자를 전달되었음을 나타내는 것이다. 또한 약물 투여 방식에 따른 뇌종양 표적성의 차이를 확인할 수 있다. 구체적으로, 일반 금 나노입자를 처리한 군에서는 정맥 투여가 경구 투여에 의한 경우보다 높은 축적량 보였다. 반면, 본 발명의 금 나노입자 복합체의 경우, 경구 투여가 더 높은 효율을 보였다. 이와 같은 결과는, 전술한 일체의 구성을 통해 금 나노입자를 포함하는 복합체 전체의 반감기를 증진시키고 생체 이용율을 향상시킴에 기인하는 결과이다. 즉, 경구 투여된 금 나노입자 복합체의 뇌종양 조직에 대한 표적화 증진 효과는 뇌종양에 대한 광열 또는 광역동 치료 효과를 향상시킬 수 있을 것으로 기대된다.
9-2. 면역조직화학 염색 (IHC staining)을 통한 뇌종양 표적화 효과 확인
상기 뇌종양 동물모델에 60mg/kg 농도의 금 나노입자 복합체 (200μl)를 oral gavage을 통하여 경구 투여하였다. 24시간 경과 후, 뇌종양 동물모델을 방혈시키고, 뇌를 적출하였으며, 상기 수득한 뇌 조직을 4% paraformaldehyde로 2일간 고정시켰다. 이후, 상기 조직을 Leica TP1020 Semi-enclosed Benchtop Tissue Processor에 넣어 조직내 수세, 탈수, 투명, 파라핀 침투 과정을 완료한 후, 파라핀 침투가 완료된 조직을 박편 제작이 용이하도록 base mold에 넣고 파라핀을 분주하여 굳혔다. 그 후 파라핀 회전형 박절기 Leica RM2145 Microtome을 이용한 삭절 과정을 통해 4μm 두께로 조직이 포함된 절편을 제작하였다. 상기 절편에 대한 탈파라핀, 함수, 수세, 과정을 진행하였다. 혈청 차단을 위해 80% Phospohate Buffered Saline Tween-20 (PBST) 과 20% Goat serum을 섞은 혼합물을 1 slide 당 50μl씩 처리하고, 파라핀 필름으로 밀착시켰다. 이로부터 30분 경과 후, 1차 항체와 락토페린을 1:100 비율로. PBST와 Goat serum 혼합물에 희석시켜 1 slide 당 50μl씩 처리하고, 파라핀 필름 밀착한 상태로 12시간 동안 4℃에서 반응시켰다. 다음날 형광 물질을 포함하는 2차 항체, goat anti-rabbit을 PBS에 1:200 비율로 희석하여 1 slide 당 50μl씩 처리하고, 한 시간 반응 시켰다. 이후, 봉입(mounting) 과정을 거친 뒤, 형광현미경을 통해 관찰하였다.
비교군으로 금 나노입자 복합체에 금 나노입자의 결합 비율을 고려하여 11mg/kg 농도의 일반 금 나노입자를 경구 투여한 군 (AuNP), 1.7mg/kg 농도의 락토페린을 경구 투여한 군 (Lf)을 이용하였다. 한편, 약물 투여 방식의 차이에 의한 금 나노입자의 뇌종양 표적화 효과를 확인하기 위해, 1mg/kg 농도의 금 나노 입자 복합체를 10회 정맥 투여하였다. 비교군으로는 나노입자 복합체에 금 나노입자의 결합 비율을 고려하여 0.18mg/kg 농도의 일반 금 나노입자를 정맥 투여한 군 (AuNP), 0.017mg/kg 농도의 락토페린을 정맥 투여한 군 (Lf)을 이용하였다.
그 결과, 도 21에 나타난 바와 같이 금 나노입자 복합체를 처리한 군에서 가장 많은 형광이 관찰되었다. 이는 금 나노입자 복합체에 포함된 타겟 항원인 락토페린과 뇌종양 조직에 다량 발현되어 있는 락토페린 수용체간의 반응이 비교군에 비해 우세함에 기인한 결과이다. 이로부터, 본 발명에 따른 뇌종양 조직의 표적화 효과를 확인할 수 있었다.
9-3. Bio- TEM을 통한 뇌종양 표적화 효과 확인
상기 뇌종양 동물모델에 60mg/kg 농도의 금 나노입자 복합체 (200μl)를 oral gavage을 통하여 경구 투여하였다.. 24시간 경과 후, 뇌종양 동물모델을 방혈시키고, 뇌를 적출하였으며 4% formaldehyde로 고정하였고, 이를 다시 resin fixation한 뒤, ultramicrotome (EM UC7, 독일)으로 제작한 조직 절편을 80kV Transmission Electron Microscope (JEM1010, 일본)으로 관찰하였다.
도 22에서 나타낸 바와 같이, 뇌종양이 유발 된 부위에서 다량의 금 나노입자 복합체가 확인할 수 있었는바, 본 발명에 따른 뇌종양 조직 표적화 효과를 재차 확인할 수 있었다.
실시예 10. 동물모델을 이용한 생체 내 분포 확인
10-1. ICP-MS를 통한 금 나노입자의 생체 내 분포 확인
본 실시예에서는, 동물 모델을 이용하여, 경구 흡수시킨 금 나노입자 복합체의 생체 내 분포를 확인하고자 하였다. 구체적으로, 60mg/kg 농도의 금 나노입자 복합체 (200μl)를 oral gavage을 통하여 경구 흡수시켰으며, 이후, 혈액 샘플은 흡수시킨 지 1, 6, 24시간이 경과한 때, Retro-Orbital plexus bleeding techniques을 통하여 채취하였다. 이들 중 24시간이 경과한 때, 혈액의 채취와 함께 소장, 간, 비장, 신장을 적출하였으며, 상기 수득한 혈액과 장기에 존재하는 금 나노입자의 양을 ICP-MS를 통하여 측정하였다. 한편, 대조군으로 일반 금 나노입자를 처리한 군 (AuNP)을 이용하였다.
그 결과, 도 23에 나타낸 바와 같이, 혈액의 경우 1, 6, 24시간 때 모두, 대조군에 비해 금 나노입자 복합체를 처리한 군에서 금 나노입자의 양이 현저하게 많았으며, 1 시간이 경과한 때에는 6배 이상의 양이 측정이 되었는바, 이를 통하여 금 나노입자 복합체는 일반 금 나노입자에 비해 높은 경구 흡수율을 가지고 있음을 알 수 있었다.
또한, 장기 별 분포를 살펴보면 도 24에 나타낸 바와 같이, 소장의 경우, 금 나노입자 복합체를 경구 투여한 군은 금 나노입자를 경구 투여한 군에 비해 금 나노입자의 양이 크게 증가하였던 반면, 간, 비장, 신장에서는 금 나노입자를 경구 투여한 군과 큰 차이를 보이지 않았다.
10-2. 락토페린 항체를 이용한 면역조직화학 염색 (IHC staining)을 통한 금 나노입자의 생체내 분포 확인
본 실시예에서는, 동물 모델을 이용하여, 경구 흡수시킨 금 나노입자 복합체의 생체 내 분포를 확인하고자 하였다. 구체적으로, 60mg/kg 농도의 금 나노입자 복합체 (200μl)를 oral gavage을 통하여 경구 투여하였으며, 24시간 경과한 때, 콩팥, 간, 폐, 비장을 적출하였다. 상기 수득한 장기를 대상으로, 락토페린 항체를 이용한 면역조직화학 염색을 실시하여, 장기 내 존재하는 금 나노입자 복합체를 형광 현미경으로의 관찰하였다. 한편, 대조군으로 별도의 처리를 하지 않은 군 (con)을 이용하였다.
그 결과, 도 25에 나타낸 바와 같이, 금 나노입자 복합체의 장기 별 분포는, 도 24의 결과와 일치하게 관찰되었는바, 금 나노입자 복합체의 우수한 경구 흡수를 재차 확인할 수 있었다.
실시예 11. 동물 모델을 이용한 독성 평가
본 실시예에서는, 경구 흡수시킨 금 나노입자 복합체의 생체 내 조직 독성을 동물 모델을 대상으로 확인하였다. 구체적으로, 60mg/kg 농도의 금 나노입자 복합체 (200μl)를 2일 간격을 두고 10회 oral gavage을 통하여 경구 투여하였다. 이로부터 20일이 경과한 때, 콩팥, 간, 폐, 비장을 적출하고, 이를 파라핀 블록 제작 후, 제조된 조직 절편을 H&E 염색으로 염색하여 관찰하였다. 대조군으로 별도의 처리를 하지 않은 군 (con)을 이용하였다.
그 결과, 도 26에 나타낸 바와 같이, 금 나노입자 복합체를 처리한 군과 대조군은 콩팥, 간, 폐, 비장 등에서 조직학적 차이를 보이지 않았으며, 이를 통해 본 발명에 따른 금 나노입자 복합체는 생체에서 특별한 독성을 나타내지 않음을 알 수 있었다.
실시예 12. 동물모델을 이용한 뇌종양에 대한 광열 효과 확인
본 실시예에서는, 뇌종양 동물모델을 이용하여, 경구 투여된 금 나노입자 복합체의 광열 효과를 확인하고자 하였다. 구체적으로, 동물모델을 6시간 동안 공복 상태를 유지하게 한 후, 60mg/kg 농도의 금 나노입자 복합체 (200μl)를 경구 투여하였다. 투여 24시간 경과 후, 뇌종양 병변 부위 및 몸통 왼쪽 부위에 LRS-0532 DPSS Laser System Laser glow Part Number: R5310B1FL를 이용하여 532nm 파장의 레이저를 4w/cm2의 조건으로 180초간 조사하고 실시간으로 FLIR C2 열화상 카메라를 이용하여 온도의 변화를 측정하였다. 비교군으로 PBS (200μl), 11mg/kg 농도의 금 나노입자 (200μl)를 oral gavage을 통하여 경구 투여하였다.
그 결과, 도 27에 나타난 바와 같이, 금 나노입자 복합체의 높은 뇌종양 표적화와 Lf-PEG의 척력 효과에 의한 금 나노입자 복합체간 거리 유지 효과 (약 5nm)에 의하여 532nm 파장대의 빛에 의한 우수한 광열 효과를 관찰할 수 있었다. 또한, 도 28에 나타난 바와 같이, 금 나노입자 복합체의 높은 뇌종양 표적화로 인해, 다른 몸통 부위에서의 금 나노입자 복합체는 금 나노입자에 비해 광열 효과가 4.5℃ 정도의 감소함을 확인할 수 있었다.
실시예 13. 동물모델을 이용한 경구투여 금 나노복합체의 뇌종양 광열치료 효과 확인
본 실시예에서는, 뇌종양 동물모델을 이용하여, 경구투여 금 나노입자 복합체의 뇌종양 표적화로 인한 광열효과를 확인하고자 하였다. 구체적으로, 동물모델을 6시간 동안 공복 상태를 유지하게 한 후, 60mg/kg 농도의 금 나노입자 복합체 (200μl)를 경구 투여하였다. 투여 24시간 경과 후, 뇌종양 병변 부위에 LRS-0532 DPSS Laser System Laser glow Part Number: R5310B1FL를 이용하여 532nm 파장의 레이저를 4w/cm2의 조건으로 180초간 조사하는 과정을 3일 간격을 두고 5회, 즉 15일간 치료를 시행하였다. 비교군으로 PBS (200μl), 11mg/kg 농도의 금 나노입자 (200μl)를 oral gavage을 통하여 경구 투여하였다.
이후, 마우스를 희생시킨 뒤, 뇌를 적출하였다. 상기 수득한 뇌 조직을 4% paraformaldehyde에 2일간 고정을 시킨 후, Leica TP1020 Semi-enclosed Benchtop Tissue Processor에 넣어 조직내 수세, 탈수, 투명, 파라핀 침투과정을 완료 후, 파라핀 침투가 완료된 조직을 박절이 용이하도록 base mold에 넣고 파라핀을 분주하여 굳혔다. 그 후 파라핀 회전형 박절기 Leica RM2145 Microtome을 이용해 20μm 두께의 조직 절편을 제작하였다. 얻어진 절편에 대하여 추가로 탈파라핀, 함수, 및 수세 과정을 진행하였다.
13-1. Tunel assay를 통한 뇌종양 세포의 사멸 효과 확인
DeadEnd Fluorometric TUNEL System ( Promega, USA ) kit를 이용하여 상기 수득한 조직 절편을 관찰하였다. Tunnel assay는 TdT (Terminal deoxynucleotidyl transferase) 효소 및 UTP (uridine triphsophate) DNA 조각을 이용한 실험으로서, DNA의 단편화 (fragmentation) 여부를 통해 뇌종양 조직 내 세포괴사 또는 사멸을 확인하였다. 그 결과, 도 29에 나타낸 바와 같이, 금 나노입자 복합체를 이용하여 광열 치료한 군 (Lf-AuNP)은 금 나노입자를 이용한 군 (AuNP)에 비해, 단편화된 DNA 절편이 다량 검출되었으며, 이를 통해 우수한 뇌종양 세포 사멸 효과를 확인할 수 있었다.
13-2. 니슬 염색을 통한 뇌종양 조직의 부피 감소 효과 확인
0.2g cresyl violet-acetate를 150ml 증류수에 용해시킨 cresyl violet stock solution, 및 0.1M 아세트산와 0.1M 소듐 아세테이트를 혼합한 Buffer solution을 혼합한 용액으로 상기 수득한 조직 절편을 염색하여 관찰하였다. 한편 본 실시예에서는, 대조군으로 생리 식염수를 이용한 군 (Saline)을 이용하였고, 비교군으로는 락토페린을 경구 투여한 군 (Laferrin), 금 나노입자를 경구 투여한 군 (AuNP), 금 나노입자 복합체를 경구 투여한 군 (레이져 비처리; Lf-AuNP), 금 나노입자 경구 투여 및 레이져 처리군 (AuNP)을 이용하였다.
그 결과, 도 30 및 도 31에 나타난 바와 같이, 금 나노입자 복합체를 이용하여 광열 치료한 군 (Lf-AuNP with laser)은, 다른 비교군들에 비해, 특히 금 나노입자를 이용하여 광열 치료한 군 (AuNP with laser)에 비해 뇌종양 조직의 부피가 현저하게 감소되었음을 확인할 수 있었다.
이러한 결과들을 종합해 볼 때, 본 발명에 따른 금 나노입자 복합체는, 상기 복합체 표면에 결합된 락토페린을 통해 경구 흡수율 및 뇌 표적화를 향상시켰고, 또 다른 표면에 결합된 글루타티온을 통해 생체 적합성 및 안정성을 증진시켰다. 또한, 락토페린에 결합되어 있는 PEG는 상기 락토페린의 위장관, 및 체순환 과정에서의 안정성을 향상시키고, PEG간 척력을 통해 나노입자들간 응집성을 둔화시켜 뇌종양에 대한 우수한 광열 치료효과를 나타내었다. 이러한 사실에 기초해 볼 때, 본 발명에 따른 금 나노입자 복합체는 뇌종양을 타겟으로 하는 경구 투여용 광열 또는 광역학 치료용 조성물로 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (13)

  1. 금 나노입자에 글루타티온(Glutathione)과, 생체 적합성 고분자로 표면이 개질되어 있는 락토페린(Lactoferrin)이 결합되어 있고, 4 내지 20 ㎚의 평균 직경을 갖는, 경구 투여용 나노입자 복합체.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 생체 적합성 고분자는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리카프로락톤, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리락테이트-co-글리콜산, 폴리(3-하이드록시부티레이트-co-3-하이드록시발러레이트) (PHBV), 폴리(L-락타이드-co-카프로락톤), 및 폴리(L-락타이드-co-D-락타이드)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 경구 투여용 나노입자 복합체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 생체 적합성 고분자는 일 말단에 티올 (-SH)기를 갖는 것인, 경구 투여용 나노입자 복합체.
  6. 제1항에 있어서, 상기 락토페린 및 글루타티온은 금속 나노입자와 이황화 결합에 의해 결합되어 있는 것인, 경구 투여용 나노입자 복합체.
  7. 삭제
  8. 제1항의 경구 투여용 나노입자 복합체를 포함하는, 뇌종양 치료를 위한 경구 투여용 약학적 조성물.
  9. 삭제
  10. 제8항에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함하는 것인, 경구 투여용 약학적 조성물.
  11. 제1항의 경구 투여용 나노입자 복합체를 포함하는, 광열 또는 광역학 치료를 위한 경구 투여용 약학적 조성물.
  12. 삭제
  13. 제11항에 있어서, 상기 조성물은 뇌 조직에 표적화되어 있는 것인, 경구 투여용 약학적 조성물.

KR1020170039228A 2016-03-29 2017-03-28 락토페린이 결합된 나노입자 복합체 및 이의 용도 KR101925791B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020160037860 2016-03-29
KR20160037860 2016-03-29

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20170114256A KR20170114256A (ko) 2017-10-13
KR101925791B1 true KR101925791B1 (ko) 2018-12-07

Family

ID=59959078

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020170039228A KR101925791B1 (ko) 2016-03-29 2017-03-28 락토페린이 결합된 나노입자 복합체 및 이의 용도

Country Status (2)

Country Link
US (2) US10828083B2 (ko)
KR (1) KR101925791B1 (ko)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107936505B (zh) * 2017-11-22 2020-02-07 厦门理工学院 一种聚乳酸抗菌薄膜及其制备方法
KR102465434B1 (ko) * 2019-08-14 2022-11-11 아주대학교산학협력단 나노입자 및 환경 유래 미세입자의 독성 저해 조성물
CN113230400A (zh) * 2021-03-11 2021-08-10 上海交通大学 一种基于表观遗传调控的金纳米团簇放疗增敏组装体及其制备和应用
CN113616804B (zh) * 2021-09-01 2024-02-27 深圳大学 靶向乳铁蛋白受体的多功能纳米药物载体及其制备方法与载药组合物
CN115073772B (zh) * 2022-07-29 2024-02-13 西安交通大学医学院第一附属医院 一种乳铁蛋白阳离子淀粉球及其制备方法
WO2024079331A1 (en) * 2022-10-13 2024-04-18 Stichting Radboud Universitair Medisch Centrum A complex comprising a cargo and a targeting moiety binding intelectin-1

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012532860A (ja) 2009-07-07 2012-12-20 サバンジュ・ウニベルシテシ 架橋されたタンパク質ナノ結晶、架橋されたタンパク質ナノ凝集体およびそれらの調製方法
US20130323314A1 (en) 2011-12-30 2013-12-05 University Of Hyderabad Novel Nanoparticles of Lactoferrin Useful for Preparing a Pharmaceutical Composition Facilitating Easy Delivery of the Drug and a Process for Preparing the Same

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8323694B2 (en) * 2007-05-09 2012-12-04 Nanoprobes, Inc. Gold nanoparticles for selective IR heating
KR101074026B1 (ko) 2008-10-01 2011-10-17 한국과학기술연구원 근적외선 형광체가 결합된 양친성 히알루론산 복합체 나노입자를 포함하는 암 진단용 조영제
US20110111002A1 (en) * 2009-11-12 2011-05-12 Calin Viorel Pop Transport and delivery of glutathione into human cells using gold nanoparticles
US20120052513A1 (en) * 2010-08-24 2012-03-01 Pradeep Thalappil Gold sub-nanoclusters and uses thereof

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012532860A (ja) 2009-07-07 2012-12-20 サバンジュ・ウニベルシテシ 架橋されたタンパク質ナノ結晶、架橋されたタンパク質ナノ凝集体およびそれらの調製方法
US20130323314A1 (en) 2011-12-30 2013-12-05 University Of Hyderabad Novel Nanoparticles of Lactoferrin Useful for Preparing a Pharmaceutical Composition Facilitating Easy Delivery of the Drug and a Process for Preparing the Same

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIOMATERIALS VOL.32 (2011) P. 495_502*
CHEM. COMMUN., 2011, VOL. 47, P. 3550_3552
INTERNATIONAL JOURNAL OF PHARMACEUTICS, VOL. 415 (2011) P. 273_283
PHARM DEV TECHNOL, EARLY ONLINE 1_10 [DOI: 10.3109/10837450.2014.892130]*

Also Published As

Publication number Publication date
US20170281797A1 (en) 2017-10-05
US20210015538A1 (en) 2021-01-21
US11369425B2 (en) 2022-06-28
KR20170114256A (ko) 2017-10-13
US10828083B2 (en) 2020-11-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101925791B1 (ko) 락토페린이 결합된 나노입자 복합체 및 이의 용도
Luo et al. Tumor-targeted hybrid protein oxygen carrier to simultaneously enhance hypoxia-dampened chemotherapy and photodynamic therapy at a single dose
Sabri et al. Dual activity of rose bengal functionalized to albumin-coated lanthanide-doped upconverting nanoparticles: targeting and photodynamic therapy
Nguyen et al. Highly retina-permeating and long-acting resveratrol/metformin nanotherapeutics for enhanced treatment of macular degeneration
Meyers et al. Peptide‐targeted gold nanoparticles for photodynamic therapy of brain cancer
Fernandes et al. Photoimmunoconjugates: novel synthetic strategies to target and treat cancer by photodynamic therapy
Ma et al. Precisely striking tumors without adjacent normal tissue damage via mitochondria-templated accumulation
An et al. Rationally assembled albumin/indocyanine green nanocomplex for enhanced tumor imaging to guide photothermal therapy
KR102081666B1 (ko) 암 치료용 약학 조성물
Burley et al. Near‐infrared photoimmunotherapy targeting EGFR—Shedding new light on glioblastoma treatment
Deng et al. Development of biocompatible and VEGF-targeted paclitaxel nanodrugs on albumin and graphene oxide dual-carrier for photothermal-triggered drug delivery in vitro and in vivo
Guo et al. Graphene oxide (GO)-based nanosheets with combined chemo/photothermal/photodynamic therapy to overcome gastric cancer (GC) paclitaxel resistance by reducing mitochondria-derived adenosine-triphosphate (ATP)
Siwawannapong et al. Ultra-small pyropheophorbide-a nanodots for near-infrared fluorescence/photoacoustic imaging-guided photodynamic therapy
US20150343060A1 (en) Treatment of circulating tumor cells using an extracorporeal device
KR101735933B1 (ko) 청색광 엘이디를 이용한 암세포 성장억제 및 고사장치
Guo et al. Biodegradable hollow mesoporous organosilica nanotheranostics (HMON) for multi-mode imaging and mild photo-therapeutic-induced mitochondrial damage on gastric cancer
Yan et al. Ultrasmall hybrid protein–copper sulfide nanoparticles for targeted photoacoustic imaging of orthotopic hepatocellular carcinoma with a high signal-to-noise ratio
Xin et al. AlPcS4-PDT for gastric cancer therapy using gold nanorod, cationic liposome, and Pluronic® F127 nanomicellar drug carriers
Kim et al. A novel therapeutic strategy of multimodal nanoconjugates for state-of-the-art brain tumor phototherapy
KR101188979B1 (ko) 광역학 진단 또는 치료를 위한 생체 적합성 고분자와 광감작제의 결합체 및 이의 제조방법
Juengpanich et al. Pre-activated nanoparticles with persistent luminescence for deep tumor photodynamic therapy in gallbladder cancer
Peng et al. Targeted photodynamic therapy of human head and neck squamous cell carcinoma with anti‐epidermal growth factor receptor antibody cetuximab and photosensitizer ir700dx in the mouse skin‐fold window chamber model
Xin et al. In situ-activated photothermal nanoplatform for on-demand NO gas delivery and enhanced colorectal cancer treatment
Shen et al. Multifunctional human serum albumin fusion protein as a docetaxel nanocarrier for chemo-photothermal synergetic therapy of ovarian cancer
KR20130127232A (ko) 광역학치료용 광민감제로서 플러렌과 글리콜키토산의 접합체, 이의 제조방법, 및 이를 이용한 광역학치료방법

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right