KR101919651B1 - 탄소점 함유 형광 메조다공성 나노입자, 이의 제조방법 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 탄소점 함유 형광 메조다공성 나노입자, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 아미노실란 화합물 함유 메조다공성 생활성 유리 나노입자를 350 내지 550℃에서 소성하여 내부에 탄소점(C-dot)을 생성시킴으로써 형광 발광 특성을 나타내는 동시에, 나노입자 내부에 메조기공 채널을 가져 상기 메조기공 채널 내에 약물, 유전자, 또는 단백질을 담지하는 능력을 갖는 형광 메조다공성 나노입자, 이의 제조방법 및 이의 용도를 제공할 수 있다.

Description

탄소점 함유 형광 메조다공성 나노입자, 이의 제조방법 및 이의 용도{Fluorescent mesoporous nanoparticles containing carbon dots, preparation method thereof, and use thereof}

본 발명은 탄소점 함유 형광 메조다공성 나노입자, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다.

형광성 탄소-계 생체 재료는 최근 높은 광 흡수능, 화학적 안정성, 생체 적합성 및 낮은 독성과 같은 뛰어난 장점으로 인해 관심이 증가하고 있다. 형광성 탄소-계 생체 재료의 이러한 우수한 특성으로 인해 이들은 기존의 형광성 재료와 구별되고, 바이오이미징, 의학적 진단, 촉매 및 광발전 소자와 같은 다양한 흥미로운 응용 분야를 위한 잠재적인 후보 물질로서 주목받고 있다.

악성 골 종양은 골 손실/결손을 이끄는 주요한 비-외상 관련 질환 중 하나이다. 이러한 골 질환의 치료는 전형적으로 골 암 세포를 사멸시키고 골 치유를 촉진하는 것을 포함한다. 약물 전달은 표적화 종양 치료를 위한 중요한 접근법으로서 간주되며 사용되는 재료의 생활성이 골 치유를 촉진하는데 있어서 매우 중요하다. 이러한 이유로, 생활성 재료가 골 치유를 자극하기 위하여 이들의 고유한 생활성과 분해능력을 이용할 수 있고 이와 동시에 골 암세포를 사멸시키기 위하여 제어가능한 방식으로 항암제 약물을 전달할 수 있어, 골 종양을 위한 치료법에서 중요한 역할을 할 수 있을 것으로 기대된다. 메조다공성 생활성 유리(BG)는 최근 골 재건 및 재생을 위한 재료로서 상당한 관심을 받아오고 있다. 비-메조다공성 생활성 유리와 비교되는 BG의 독특한 특징은 BG가 현저하게 향상된 비표면적, 생활성 및 약물-전달 능력을 갖는다는 것이다. 그러나, 주로 이미징 능력을 포함하는 다중 기능적 특성을 갖는 BG의 제조는 상당히 도전이 되는 과제로 남아 있다.

실리카계 나노입자는 비침습 방식으로 민감한 데이터를 제공하여, 초기 암 진단, 줄기 세포 트래킹, 약물 전달, 병원균 검출, 및 유전자 전달에 있어 타개책을 제시해 줄 수 있을 것으로 기대되어 바이오이미징 및 바이오센싱 분야에서 굉장한 관심을 받고 있다. 실리카계 나노입자는 일반적으로 실리카 골격 내에 유기 형광체, QD 또는 Ln^{3 +}와 같은 다양한 방출 센터를 삽입함으로써 제공된다. 광탈색이 지속적인 장기 사용을 방해하는 염료계 나노입자의 주요 제한점이기 때문에, 실리카 내부로의 QD 및 Ln^{3 +} 이온의 결합은 일반적으로 값비싼 및/또는 환경적으로 독성인 발광단의 사용을 필요로 하는 다수의 가공 단계를 수반한다. 따라서, 금속 활성화제 이온을 사용하는 도핑을 필요로 하지 않는 발광 실리카계 나노입자 및/또는 오가노겔이 특히 환경적인 적합성 및 낮은 제조단가의 관점에서 기존의 도핑된 물질에 대한 대안으로서 관심을 받고 있다.

본 발명의 목적은 형광 발광 특성을 나타내는 동시에, 약물, 유전자, 또는 단백질을 담지하는 능력을 갖는 형광 메조다공성 나노입자, 이의 제조방법 및 이의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 제1양태는 산화칼슘(CaO), 실리카(SiO₂), 및 아미노실란 화합물을 포함하는 소성 처리된 메조다공성 생활성 유리 나노입자로서, 입자 매트릭스 내부에 형성된 탄소점(carbon dot)을 함유하여 형광성을 나타내는 형광 메조다공성 나노입자를 제공한다.

본 발명의 제2양태는 1) 산화칼슘 전구체, 및 기공형성 주형으로 계면활성제를 함유하는 염기성 용액을 준비하는 단계(단계 1); 2) 상기 염기성 용액에 실리카 전구체 및 아미노실란 화합물을 첨가하고 교반하여 아미노실란 화합물 함유 생활성 유리 나노입자를 얻는 단계(단계 2); 및 3) 상기 아미노실란 화합물 함유 생활성 유리 나노입자를 350 내지 550℃에서 소성하는 단계(단계 3)를 포함하는 형광 메조다공성 나노입자의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 제3양태는 상기 제1양태에 따른 형광 메조다공성 나노입자를 포함하는 약물, 유전자, 또는 단백질 전달용 조성물을 제공한다.

본 발명의 제4양태는 상기 제1양태에 따른 형광 메조다공성 나노입자를 포함하는 조영제 조성물을 제공한다.

본 발명의 제5양태는 상기 제1양태에 따른 형광 메조다공성 나노입자를 포함하는 생체 이미징용 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 자세히 설명한다.

본 발명에서는 아미노실란 화합물 함유 메조다공성 생활성 유리 나노입자를 소성하는 경우, 나노입자 내부에 탄소점(C-dot)이 생성되어 이로부터 형광 발광 특성이 나타남을 발견하였다. 바람직한 양태로서, 본 발명은 산화칼슘(CaO), 실리카(SiO₂), 및 아미노실란 화합물을 포함하는 소성 처리된 메조다공성 생활성 유리 나노입자로서, 상기 소성 처리에 의해 입자 매트릭스 내부에 탄소점(carbon dot)이 형성되고 이로 인해 형광성을 나타내는 형광 메조다공성 나노입자를 제공할 수 있음을 확인하였다. 본 발명은 이에 기초한다.

구체적으로, 본 발명에서는 아미노실란 화합물, 예컨대 APTES를 사용하지 않고 제조한 나노입자는 상온에서 형광을 나타내지 않는 반면, APTES를 사용하여 제조한 나노입자는 APTES의 사용량에 관계없이 강한 형광 특성을 나타냄을 확인하였다(도 4). 또한, 이러한 나노입자의 형광 특성이 아미노실란 화합물의 존재 하의 소성에 의해 발생하는 작은 탄소 점(C-dot)으로부터 기인한 것임을 확인하였다(도 5).

또한, 본 발명에 따른 나노입자는 상기한 바와 같이 형광 발광 특성을 나타내는 동시에, 나노입자 내부에 메조기공 채널을 가져 상기 메조기공 채널 내에 약물, 유전자, 또는 단백질을 담지하는 능력을 가짐을 확인하였다. 더 나아가, 본 발명에 따른 형광 메조다공성 나노입자는 우수한 약물 전달 및 이미징 능력과 함께, 생활성 유리의 주요 부류로서 생활성과 분해 능력을 동시에 가진다는 장점이 있다. 즉, 본 발명에 따른 형광 메조다공성 나노입자는 실리카와 산화칼슘을 주성분으로 함유하는 생활성 유리에 속하기 때문에 생체 내에서 분해능과 생활성을 가지는 생활성 나노물질로서 우수한 세포 및 조직 적합성을 나타내고 생체 내에서 시간에 따라 분해되면서 이온 종을 방출할 수 있다. 따라서, 본 발명은 치료제의 전달과 동시에 세포의 형광 라벨링을 가능하게 하는 생활성 및 분해성 무기 나노플랫폼(nanoplatform)으로서 새로운 부류의 나노캐리어라 할 수 있는 형광 메조다공성 나노입자를 제공하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 사용되는 용어, "생활성 유리"란, 생체 조직 내에서 특정 생물학적 작용을 유도할 수 있는 유리 성분을 의미하는 것으로, 일반적으로 무기물로 구성되는 유리를 의미할 수 있다. 특히, 본 발명에서는 나노입자 형태의 메조다공성을 갖는 생활성 유리, 즉 메조다공성 생활성 유리 나노입자를 의미할 수 있다. 상기 생활성 유리는 본 발명에서 특별히 한정하지 않으며, 이 분야에서 공지된 것이면 어느 것이든 가능하며, 대표적으로, SiO₂-CaO의 기본적 유리구조로 이루어진 것이 사용 가능하다.

본 발명에서 사용되는 용어, "탄소 점(carbon-dot, C-dot)"은 탄소로 이루어진 양자점으로서, 탄소 양자점(carbon quantum dot)이라 불리기도 한다. 탄소 점은 수 nm 크기의 비정질(amorphous) 탄소형 나노구조로, 다이아몬드형 나노구조인 나노 다이아몬드와 흑연(graphite)형 나노구조인 그래핀, 나노튜브, 풀러렌과 구별되는 완전히 새로운 종류의 물질이다. 기존의 대부분의 양자점이 유독한 중금속 재료를 이용할 뿐만 아니라 공기 중의 산소와 수분에 취약하여 이용에 많은 제약이 따른다. 이에 반해 탄소 점은 생체적합성과 안정성을 가지고 있어 기존 양자점의 단점을 보완할 수 있다.

바람직하기로, 본 발명에 따른 형광 메조다공성 나노입자는 다색 발광 특성을 나타내는 것일 수 있다. 본 발명에 따른 형광 메조다공성 나노입자는 제조시 아미노실란 화합물의 사용량에 따라 조정가능한 색 범위를 가질 수 있다. 구체적으로, 아미노실란 화합물을 실리카 전구체 몰 대비 5 내지 25 몰%의 양으로 사용한 경우 녹색 및 적색 영역에서 광발광(PL) 피크가 나타났으며 가시적으로 청색의 형광 특성을 나타내었고, 50 내지 200 몰%의 양으로 사용한 경우 청색, 녹색 및 적색 영역에서 PL 피크가 나타났으며, 50 내지 75 몰%의 경우 가시적으로 녹색, 100 몰%의 경우 가시적으로 주황색, 150 몰%의 경우 가시적으로 노란색, 그리고 200 몰%의 경우 가시적으로 보라색의 형광 특성을 나타내었다(도 4).

바람직하기로, 상기 소성 처리 온도는 350 내지 550℃일 수 있다.

본 발명에 따른 형광 메조다공성 나노입자는 내부에 약물, 유전자, 또는 단백질이 추가로 담지된 것일 수 있으며, 이러한 추가 담지 물질을 생체 내에서 전달하는데 있어 유용하게 사용될 수 있다.

바람직하기로, 상기 약물은 상기 형광 메조다공성 나노입자 내 Ca^{2 +} 이온과 킬레이트 결합을 형성할 수 있는 것일 수 있다. 상기 킬레이트 결합을 통해 약물이 나노입자 내부에 보다 강하게 결합되어 있을 수 있다.

본 발명에 따른 형광 메조다공성 나노입자 내 Ca:Si의 몰비는 바람직하기로 5~40:60~95, 더욱 바람직하기로 10~30:70~90, 가장 바람직하기로 15:85일 수 있다. 상기 Ca:Si의 몰비 범위 내에서 구형의 입자를 용이하게 형성할 수 있다.

본 발명에 따른 형광 메조다공성 나노입자는 1 내지 5 nm의 평균 기공 크기를 갖는 것일 수 있다. 상기 기공 크기 범위 내에서 약물, 유전자, 또는 단백질의 담지 능력이 우수할 수 있다.

본 발명에 따른 형광 메조다공성 나노입자는 50 내지 200 nm의 평균 입자 크기를 갖는 것일 수 있다.

바람직하기로, 본 발명에 따른 형광 메조다공성 나노입자는 하기 단계를 포함하는 제조방법을 통해 제조될 수 있다.

1) 산화칼슘 전구체, 및 기공형성 주형으로 계면활성제를 함유하는 염기성 용액을 준비하는 단계(단계 1);

2) 상기 염기성 용액에 실리카 전구체 및 아미노실란 화합물을 첨가하고 교반하여 아미노실란 화합물 함유 생활성 유리 나노입자를 얻는 단계(단계 2); 및

3) 상기 아미노실란 화합물 함유 생활성 유리 나노입자를 350 내지 550℃에서 소성하는 단계(단계 3).

바람직하기로, 본 발명에 따른 형광 메조다공성 나노입자의 제조방법은 상기 단계 3 이후에 상기 형광 메조다공성 나노입자에 약물, 유전자, 또는 단백질을 담지하는 단계(단계 4)를 추가로 포함할 수 있다.

상기 단계 1은, 메조기공을 갖는 나노입자를 제조하기 위하여 기공형성 주형으로 계면활성제를 함유하고, 생활성 유리의 산화칼슘 성분을 제공하기 위한 산화칼슘 전구체를 함유하는 염기성 용액을 준비하는 단계이다.

본 발명에서 사용하는 용어, "산화칼슘 전구체(precursor of calcium oxide)"는 생활성 유리의 산화칼슘 성분을 생성시킬 수 있는 물질을 의미할 수 있다. 상기 산화칼슘 전구체는 질산칼슘(calcium nitrate tetrahydrate), 염화칼슘(calcium chloride), 아세트산칼슘(calcium acetate), 및 칼슘 메톡시에톡사이드(calcium methoxyethoxide)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 화합물일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, 상기 기공형성 주형으로서의 역할을 수행하는 계면활성제는 생활성 유리 나노입자 내에 정렬된 기공을 형성시킬 수 있다. 상기 계면활성제는 헥사데실트리메틸 암모늄 브로마이드(CTAB) 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG)일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 염기성 용액은 pH가 9 내지 13일 수 있으며, NH₄OH, NaOH, KOH 또는 Tris로 조절하는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 단계 1)의 염기성 용액은 용매로서 물, C_{1 -4} 알코올 또는 이의 혼합용매를 사용할 수 있으며, 바람직하기로 공용매로서 2-에톡시에탄올을 사용할 수 있다.

본 발명에서 공용매로서 2-에톡시에탄올을, 기공형성 주형으로서의 계면활성제와 함께 사용하는 경우, 제조되는 생활성 유리 나노입자의 모폴로지 및 기공 구조(예를 들어 기공의 배열 등)를 결정함에 있어 상승작용적인 효과를 발휘할 수 있다.

상기 단계 2는, 상기 단계 1)의 염기성 용액에 실리카 전구체 및 아미노실란 화합물을 첨가하고 교반하여 아미노실란 화합물 함유 생활성 유리 나노입자 형성을 유도하는 단계이다.

본 발명에서 사용하는 용어, "실리카 전구체(precursor of silica)"는 생활성 유리의 실리카 성분을 생성시킬 수 있는 물질을 의미할 수 있다. 상기 실리카 전구체는 TEOS(tetraethyl orthosilicate), TMOS(trimethoxy orthosilicate), GPTMS((3-glycidoxypropyl)methyldiethoxysilane), MPS(3-mercaptopropyl trimethoxysilane), GOTMS(γ-glycidyloxypropyl trimethoxysilane) 및 APTMOS(aminophenyl trimethoxysilane)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 화합물일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 실리카 전구체는 무수 메탄올, 에탄올, 프로판올 또는 이소프로판올의 알코올 용액에 용해시킨 용액 형태로 염기성 용액 중에 첨가될 수 있다. 또한, 상기 단계 2)의 교반은 초음파 처리 하에 수행될 수 있으며, 상기 초음파 처리는 출력 전력 200 W 내지 240 W, 10 s on/ 10 s off 사이클로 15분 내지 25분 동안 수행할 수 있다.

본 발명에서 사용하는 용어, "아미노실란(aminosilane) 화합물"은 유기작용기로서 아민기를 함유하는 유기작용기성 알콕시실란계 화합물을 의미할 수 있다. 상기 아미노실란 화합물은 생활성 유리 나노입자의 실리카-칼슘 매트릭스 내에 결함(defect)을 유도하고, 소성 후 형광 특성을 발생시키는 탄소 점(C-dot) 생성을 유도하는 역할을 할 수 있다. 상기 아미노실란 화합물은 APTES(3-aminopropyl triethoxysilane) 및 AEAPMDMS(N(beta-aminoethyl)gamma-aminopropylmethyldimethoxysilane)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 화합물일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 제조방법에서, 상기 산화칼슘 전구체, 실리카 전구체 및 아미노실란 화합물의 첨가량은 Ca:Si의 몰비가 바람직하기로 5~40:60~95, 더욱 바람직하기로 10~30:70~90, 가장 바람직하기로 15:85가 되도록 조절될 수 있다. 상기 Ca:Si의 몰비 범위 내에서 구형의 입자를 용이하게 형성할 수 있다.

상기 단계 2)에서, 아미노실란 화합물 함유 생활성 유리 나노입자를 분리하고 계면활성제 등을 제거하기 위하여, 염기성 용액에 실리카 전구체 및 아미노실란 화합물을 첨가하고 교반하여 얻은 교반액을 원심분리한 후 세척할 수 있으며, 추가로 건조시킬 수 있다. 건조는 65℃ 내지 75℃ 온도범위에서 10시간 내지 14시간 동안 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 단계 3은, 형광 특성을 발휘하는 탄소 점을 생성시키기 위하여 아미노실란 화합물 함유 생활성 유리 나노입자를 350 내지 550℃에서 소성하는 단계이다.

상기 소성 온도가 600℃ 이상인 경우, 나노입자 내 탄소 점이 분해되어 형광 특성이 나타나지 않을 수 있다.

상기 소성 시간은 바람직하기로 1 시간 내지 7 시간, 더욱 바람지하기로 2 시간 내지 3 시간, 가장 바람직하기로 2 시간일 수 있다.

상기 단계 4는, 생체 내에 전달하고자 하는 물질로서 약물, 유전자, 또는 단백질을 상기 형광 메조다공성 나노입자 내에 담지시키는 단계이다.

상기 약물, 유전자, 또는 단백질이 분산된 매질 내에 본 발명에 따른 형광 메조다공성 나노입자를 침지시켜 형광 메조다공성 나노입자 내 메조기공 채널 내에 약물, 유전자, 또는 단백질을 담지시킬 수 있다. 상기 매질은 물일 수 있다.

바람직하기로, 본 발명에 따른 형광 메조다공성 나노입자 내에 담지될 수 있는 약물은 나노입자 내 칼슘 이온 종(Ca^{2 +})과 킬레이트 결합을 형성할 수 있는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 담지가능한 약물로는 독소루비신(DOX), 파클리탁솔, 도세탁솔, 클로로람부실, 덱사메타손, 알렌드로네이트, 젠타마이신 등을 예로 들 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서는 특히 독소루비신을 담지할 경우 pH 의존적으로 지속적인 방출이 가능함을 확인하였다(도 6).

한편, 본 발명에 따른 형광 메조다공성 나노입자는 적절한 담체에 담지되어 윤활제, 습윤제, 유화제, 보존제 등과 함께 조성물을 이루어 사용되는 것이 바람직하다. 여기서, 상기 담체는 약학적으로 허용되는 담체인 것이 바람직하며, 구체적으로, 물, 이온 교환 수지, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질, 각종 완충물질, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌 글리콜 등을 들 수 있다. 그리고, 상기 조성물은 진단이나 검출방법에 따라 체내에 투여되거나 체외 시료에 투여될 수 있는데, 체내에 투여할 경우에는 의약 분야에서 통상적으로 수행되는 방법에 따라 특별한 제약 없이 투여될 수 있으나, 경구 투여보다는 정맥 내, 복강 내, 근육 내, 피하 또는 국부 경로를 통하여 주사용 제제 등으로 수행하는 비경구 투여가 바람직하다.

바람직한 양태로서, 본 발명은 본 발명에 따른 형광 메조다공성 나노입자를 포함하는 약물, 유전자, 또는 단백질 전달용 조성물을 제공할 수 있다.

다른 바람직한 양태로서, 본 발명은 본 발명에 따른 형광 메조다공성 나노입자를 포함하는 조영제 조성물을 제공할 수 있다.

또 다른 바람직한 양태로서, 본 발명은 본 발명에 따른 형광 메조다공성 나노입자를 포함하는 생체 이미징용 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에 따른 형광 메조다공성 나노입자는 형광 발광 특성을 나타내는 동시에, 나노입자 내부에 메조기공 채널을 가져 상기 메조기공 채널 내에 약물, 유전자, 또는 단백질을 담지하는 능력을 갖는다. 더 나아가, 본 발명에 따른 형광 메조다공성 나노입자는 생활성 유리의 주요 부류로서 생활성과 분해 능력을 동시에 가진다는 장점이 있다. 또한, 본 발명에 따른 형광 메조다공성 나노입자는 광퇴색 및 환경 변화에 안정한 다색 형광성을 보유하여 장기간 사용할 수 있는 이점이 있다. 따라서, 본 발명에 따른 형광 메조다공성 나노입자는 약물, 유전자, 또는 단백질 전달용도 및/또는 생체 이미징 용도로서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명에서 사용된 형광 메조다공성 나노입자의 합성 과정을 개략적으로 도시한 것이다.
도 2는 400℃에서 2시간 동안 소성 후의 fBGn0 및 fBGn100 샘플의 TEM 이미지이다.
도 3a는 fBGn의 소각(small-angle) XRD 패턴, 도 3b는 fBGn의 질소 가스 흡착/탈착 등온선, 도 3c는 BJH법으로 분석된 나노스피어의 메조기공 분포 분석 결과이다.
도 4a는 UV 광선 조사 하에 관찰된 다양한 fBGn의 발광 특성, 도 4b는 fBGn 샘플 용액의 광발광(PL) 스펙트럼, 도 4c는 다양한 APTES 농도로 제조된 샘플의 PL 세기를 특정 파장에서 기록한 결과이다.
도 5a는 fBGn의 라만 스펙트럼, 도 5b는 나노입자 내 C, Si, Ca, O, 및 N 원자의 결합 에너지 상태를 와이드(wide) 및 내로우(narrow) 스캔으로 XPS를 통해 분석한 결과, 도 5c는 HF-처리된 fBGn100 용액에 대한 TEM 분석 결과, 도 5d는 단일 C-점의 고해상도 TEM 이미지, 도 5e는 C-점의 크기 분포 분석 결과이다.
도 6a는 순수한 메조다공성 실리카 나노입자(MSN)와 fBGn100에 대해 동일한 담지 조건 하에서 DOX 담지능력을 평가한 결과이고, 도 6b는 DOX 분자와 fBGn의 메조기공 간에 형성가능한 2가지 타입의 결합을 도식적으로 나타낸 것이고, 도 6c는 fBGn100 및 MSN에서 DOX의 방출 동력학에 대한 pH 및 DOX 농도의 영향을 조사한 결과이다.

이하，본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 더욱 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐，실시예에 의하여 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 재료 및 방법

형광 메조다공성 나노입자의 제조

물, 에탄올, 및 공용매로서 2-에톡시에탄올과 계면활성제로서 CTAB를 사용하여 상온에서 염기성 용액 중에서 fBGn을 제조하였다. 1 g의 CTAB를 150 mL의 H₂O, 2 mL의 암모니아수, 10 mL의 2-에톡시에탄올, 20 mL의 에탄올, 및 질산칼슘 4수화물 (Ca(NO₃)₂·4H₂O)로 구성된 에멀젼계 중에 용해시켰다. 상기 혼합물을 상온에서 0.5 시간 동안 격렬하게 교반한 후, 테트라에틸 오르토실리케이트(TEOS) 및 3-(트리메톡시실릴)프로필]에틸렌디아민(APTES)을 상기 혼합물에 빨리 떨어뜨렸다. Ca:Si의 몰비는 15 : 85이었다. TEOS 대 APTES의 비는 실리카 전구체의 순 부피를 유지하면서 변화시켰다. 즉, 각각 mol % APTES = 0, 5, 25, 50, 75, 100, 150, 및 200%인 fBGn0, fBGn5,　fBGn25,　fBGn50,　fBGn75, fBGn100, fBGn150, 및 fBGn200의 일련의 8개의 샘플을 상기와 같은 일반적인 과정을 따라 합성하였다. 생성된 혼합물을 4 시간 동안 상온에서 격렬하게 교반하였다. 흰색의 침전물을 수득하고, 여과한 후 순수한 물로 세척하고, 24시간 동안 60℃에서 대기 하에 건조시켰다. 그 다음, 상기 혼합물을 40 mL 탈이온수 중의 20 mg의 질산암모늄 용액으로 60℃에서 하룻밤 동안 처리하여 임의의 잔여 CTAB를 제거하였다. 나노입자 용액을 원심분리하고 에탄올 및 탈이온수로 세척한 다음, 진공 하에서 하룻밤 동안 건조하여 MBG를 얻었다. 상기 분말을 먼저 저온(< 200℃)에서 처리한 다음, 개방 대기 하에서 2 시간 동안 400℃에서 머플 퍼니스(muffle furnace) 내에서 소성하였다.

나노입자의 물리화학적 특성 분석

제조된 MBG 나노입자의 결정 구조를 분석하기 위하여, 40 kV 및 40 mA에서 작동되는 CuKα 선 (λ= 1.5418Å)을 사용하여 X-선 회절분석 (XRD; Rigaku)을 수행하였다. 2θ= 10-60°의 회절 각도, 2 °/min의 스캔 속도 및 0.02°의 단계 폭(step size)으로 스캔을 수행하였다. 푸리에 변환 적외선 분광법 (FT-IR; Varian 640-IR)을 사용하여 샘플의 작용기와 화학 결합을 분석하였다. 각각의 스펙트럼을 위하여, 400-2000 cm^-1 파장수 범위의 20회 스캔을 KBr 펠렛 법을 사용하여 투과(transmission) 모드로 기록하였다. 나노입자 크기 및 모폴로지는 투과 전자 현미경 (TEM; JEOL-7100)을 사용하여 측정하였다. TEM을 위한 샘플은 에탄올 중에 MBG 나노입자를 분산시키고 탄소-코팅된 구리 그리드(grid) 상에 상기 현탁액 방울을 놓아 준비하였다. 샘플의 원자 조성은 에너지 분산 분광법(EDS; Bruker)으로 분석하였다. 비표면적, 기공 부피 및 기공 크기는 Quadrasorb SI 자동 표면적 및 기공 크기 분석장치(2SI-MP-9 Quantachrome)를 사용하여 77 K에서 질소 가스 흡착/탈착 등온선으로 측정하였다. 샘플은 분석 전에 24시간의 탈기 시간 동안 30℃의 탈기 온도에서 진공 하에서 탈기시켰다. 120　W에서 작동되는 단색 Al Kα X-선 방사선 (hν = 1486.6　eV)을 사용하는 고해상도 X-선 광전자 분광법(HR-XPS) (MultiLab ESCA2000)을 사용하여 샘플의 표면 특성을 조사하였다. 상대적인 표면 하전(charging)의 결과로서 결합 에너지의 이동(shift)을 내부 표준물질로서 284.6　eV에서의 C1s 레벨을 사용하여 보정하였다. C1s 스펙트럼의 곡선 피팅은 Gaussian-Lorentzian 피크 형태를 통해 얻었다.

또한, 샘플의 형광 이미지는 표준 용액으로서 탈이온수를 사용하고 UV 투과조명기(UV transilluminator, Vilber Lourmat)를 사용하여 얻었다. 라만 현미경 시스템 (LabRAM HR UV/Vis/NIR)을 사용하여 실리카 웨이퍼 상의 fBGn을 분석하였다. 나노입자 샘플의 형광 특성을 분광형광계(PL; Jasco FP-6500)로 관찰하였다. fBGn의 시간-분해 형광 세기 소멸을 iHR320 분광형광계 (Horiba Jobin Yvon) 시간-보정된 단일 광자 계수 시스템을 사용하여 기록하였다. 나노입자의 전자 상자성 공명 (EPR) 특성은 100 kHz 자기장 변조로 X-밴드 주파수 (ν) 9.4 GHz에서 작동되는 JEOL 분광계 (model JES-FA200)를 사용하여 분석하였다.

Dox 담지 및 방출

DOX를 pH 7.4에서 PBS 중에 용해시켜 120 ㎍/mL 농도의 스톡 용액을 제조하였다. 표준 곡선은 484 nm의 최대 흡수 세기에서 UV-vis 분광광도계를 사용하여 일련의 스톡 용액의 희석액 (20, 30, 40, 60, 80, 100, 120 ㎍/mL)의 광학적 세기를 측정하여 얻었다. DOX 담지 테스트를 위하여, 1 mg의 나노입자 샘플 (fBGn100 또는 MSN)을 각각의 DOX 용액 중에 5분 동안 초음파 분산시킨 다음 37℃ 수조 내에서 4시간 동안 유지시켰다. 약물 담지량을 정량화하기 위하여, 10000 rpm에서 5분 동안 원심분리한 후 상등액 중의 DOX의 흡광 값을 측정하였다. 나노입자를 PBS로 1회 세척하고 표준 곡선으로부터 측정된 상응하는 담지량으로 전환하였다.

나노캐리어 샘플로부터의 DOX의 방출 프로파일을 조사하기 위하여, 120 ㎍/mL의 초기 DOX 농도에서 제조된, DOX-담지된 나노캐리어 (fBGn100 또는 MSN)를 사용하였다. DOX 방출 동역학을 평가하기 위하여, 2 mg의 각 샘플을 다양한 pH 값 (5.4 및 7.4)으로 제조한 2 mL의 PBS 중에 분산시킨 다음, 37℃에서 인큐베이션시켰다. 매질로 방출된 약물의 양을 다양한 시점(최대 200 시간까지)에 측정하고, 매질을 각 테스트마다 재충전하였다.

생체내 주입

20-22 g 체중의 암컷 누드 마우스를 대한 바이오링크사(Daehan Biolink Co. Ltd, Korea)로부터 구입하였다. 형광 스캔은 Maestro Ex 시험관내(in vitro) 및 생체내(in vivo) 이미징 시스템을 사용하여 다양한 여기 파장 (455 nm, 523 nm, 및 350nm) 및 시점에서 수행하였다. fBGn100 나노입자 (100 ㎕, PBS 중 2 mg/mL)를 누드 마우스에 피하 주사하고, 즉시 여기 (455 nm 및 523 nm) 이미징 시스템으로 이미징하였다.

실시예 2: APTES 를 사용하고 소성하여 제조된 메조다공성 BGn 의 물리화학적 특성 분석

사용된 합성 과정을 도 1에 개략적으로 도시하였다. BGn은 BGn 내에 약하게 정렬된(weakly ordered) 기공을 형성시키는, 조절물질(modifier)(계면활성제 및 포로겐)로서 CTAB, 및 공용매로서 2-에톡시에탄올을 사용하여 합성하였다. 분명히, 본 발명의 결과는 BGn의 모폴로지 및 기공 구조를 결정함에 있어 CTAB (계면활성제) 및 2-에톡시에탄올 (공용매)의 상승작용적인 역할을 나타내었다. 본 발명에서는 다양한 APTES 농도 (0, 5, 25, 50, 75, 100, 150, 및 200 mol % APTES, 각각 fBGn0, fBGn5 fBGn25, fBGn50, fBGn75, fBGn100, fBGn150, 및 fBGn200으로 기재됨)로 광범위의 다중색 형광 BGn을 합성하였다. 400℃에서 2시간 동안 소성 후의 fBGn0 및 fBGn100 샘플의 TEM 이미지(도 2)는 메조다공성 구조를 갖는 거의 단분산의 구를 보여주었다. fBGn100의 더욱 높은 배율 이미지는 구조 내에 다수의 검은색 점을 보여주었다. 또한, 다른 샘플들도 우수한 메조다공성을 갖는 나노스피어의 유사한 TEM 이미지를 보여주었다. APTES 함량이 0%로부터 200%로 증가함에 따라 나노스피어 크기가 60 nm로부터 180 nm로 강한 선형 관계(R ² = 0.99)로 점차 증가하였다. 이는 APTES가 나노입자의 메조다공성과 결과적으로 이의 입자 부피를 증가시키기 때문인 것으로 보였다.

fBGn의 메조다공성 성질은 소각(small-angle) XRD 패턴(도 3a)에서 드러났으며, 구체적으로 2θ= 2.44° 및 4.41°에서의 2개의 명백한 특징적인 피크가 정렬된 기공 구조를 입증하였다. N₂ 흡착/탈착 법을 사용하여, 약물 분자를 담지하는 능력을 결정하는 중요한 파라미터인, 표면적, 기공 부피 및 기공 크기 면에서 fBGn의 메조다공 특징을 광범위하게 분석하였다. 2개의 대표적인 테스트된 fBGn 샘플은 좁은 이력 곡선 영역을 보여주는, 곡선 내에 전형적인 타입 IV 등온선을 보여주었다(도 3b). 상기 등온선에 기초하여, 비표면적 및 기공 부피를 측정하였으며, 그 결과 하기 표 1과 같이 둘 모두의 나노스피어 샘플에 대해 유사한 범위를 나타내었다.

BJH법으로 분석된 나노스피어의 메조기공 분포는 fBGn0 및 fBGn100 각각에 대하여 2.93 nm 및 2.67 nm의 평균 크기를 갖는 것으로 날카로운 피크를 나타내었다(도 3c).

실시예 3: fBGn 의 형광 특성 분석

중요하게는, 400℃에서 2시간 동안 소성하여 제조된 모든 fBGn 샘플이 강한 발광을 보였다. 발광은 UV 광선 조사 하에 APTES의 농도가 증가함에 따라 청색에서 황색까지 나타내는 것으로 관찰되었다(도 4a). 모든 fBGn 샘플 용액(3ml DW 중 1mg)의 광발광(PL) 스펙트럼은 APTES 농도에 의존적으로 다양한 방출 스펙트럼을 나타내었다(도 4b). APTES를 사용하지 않고 제조한 fBGn0은 상온에서 형광을 나타내지 않는 반면, 5% 내지 200% APTES를 사용하여 제조한 fBGn 샘플들은 λ_ex　= 360 nm에서 강한 방출을 나타내었다. 또한, APTES 농도가 증가함에 따라 방출 최대값이 청색으로부터 적색으로 이동하였으며, 방출 스펙트럼 너비(PL 방출 영역)가 증가하였다. 사실상, 300 nm 내지 500 nm의 다양한 여기 파장에서 측정된 나노스피어의 PL 스펙트럼(대표적인 샘플로서 fBGn100이 테스트됨)은 360 nm에서 가장 높은 세기를 보였다. 또한, 다양한 APTES 농도로 제조된 샘플의 PL 세기를 특정 파장에서 기록하였다(도 4c). fBGn5 및 fBGn25의 경우, 470-485 nm (녹색) 및 520-530 nm (적색)에서 2개의 PL 피크가 존재하였고, 이들 2개의 피크 세기는 APTES 농도가 증가함에 따라 증가하였다. 다른 샘플(fBGn50 내지 fBGn200)에서는, 435-455 nm (청색), 470-485 nm (녹색), 및 520-530 nm (적색) 범위의 3개의 PL 피크가 존재하였다. 또한, fBGn100 샘플은 모든 조건에서 가장 높은 세기를 나타내었다. PL 결과는 다양한 APTES 농도에서 조정가능한 색 범위를 갖는 나노스피어의 다색 발광 특성을 나타내었다.

이러한 여기-의존적 방출 현상은 소성 이후 에너지 갭 이내의 불연속 에너지 상태의 존재로 설명될 수 있다. 이러한 상태 간의 전이는 여기 에너지에 의존적이다. 더욱 높은 방출 세기는 일반적으로 100% (fBGn100)까지 제조에 사용된 APTES의 더욱 많은 양과 상관관계가 있는 것으로 관찰되었다. 그러나, 방출 세기는 APTES의 추가적인 첨가에 따라 감소하였다. 따라서, fBGn100가 다양한 파장 (300-500 nm)의 빛에 의해 여기될 때, 가장 높은 세기로 청색으로부터 적색까지의 범위로 다양한 방출 색을 나타낸다는 점에서 최적화된 군인 것으로 여겨졌다.

실시예 4: fBGn 내 탄소 점의 분석

fBGn의 형광 성질은 APTES의 존재로 인한 실리카-칼슘 매트릭스 내 결함(defect)보다는, 소성에 의해 발생하는 작은 탄소 점(C-dot)으로부터 기인하였다. fBGn의 라만 스펙트럼을 먼저 분석하였다 (도 5a). APTES를 사용하지 않고 제조된 fBGn0에서는 라만 시그널이 관찰되지 않은 반면, fBGn100의 라만 스펙트럼은 대략 1402 및 1602 cm^-1에서 2개의 넓은 피크를 나타내었으며, 이는 각각 D-밴드 (sp³) 및 G-밴드 (sp²)로 인한 것으로 여겨진다. D 밴드는 비정렬된 그라파이트 또는 유리질 탄소의 말단 면의 미결합(dangling bond)을 갖는 탄소 원자의 진동과 관련이 있으며, G 밴드는 그라파이트의 E_2g 모드에 해당하며 2차원 (2D) 육각형 격자(lattice) 내 sp²-결합된 탄소 원자의 진동과 관련된다. D 밴드 및 G 밴드 세기는 APTES 함량이 증가(최대 fBGn100)함에 따라 증가한 다음, 감소하였다. 이는 발광 센터의 퀀칭 효과로 인한 것일 수 있다. 또한, fBGn100의 XRD 패턴을 분석한 결과, 2θ= 24.7°의 강한 피크와 2θ= 43.3°의 약한 피크가 존재하는 것으로 나타났다. 이들은 각각 탄소의 (002) 및 (101) 회절 패턴에 해당하였다. 앞선 피크는 ~ 2.85 Å의 중간층 간격에 해당하며, 이는 벌크 그라파이트 내 (002) 면들 사이의 간격보다 약간 더 작으며(3.44 Å), 더욱 작은 중간층 간격(벌크 그라파이트 대비)은 많은 작용기의 존재 때문이다. 더 나아가, 나노입자의 FTIR 스펙트럼은 fBGn100 내 탄소-관련 밴드 (1440 및 1640 cm^-1의 C=O 스트레칭 진동, 1505 cm^-1의 C-N 진동 및 변형, 및 880 cm^-1의 C-O 스트레칭 진동), 및 이외에 fBGn0 내 실리카 관련 다른 밴드 (1220 및 1095 cm^-1의 Si-O-Si 대칭 스트레칭, 801 cm^-1의 Si-O-Si 비대칭 스트레칭, 954 cm^-1의 Si-OH 대칭 스트레칭, 및 465 cm^-1의 Si-O 벤딩)를 나타내었다. 또한, 나노입자 내 C, Si, Ca, O, 및 N 원자의 결합 에너지 상태를 와이드(wide) 및 내로우(narrow) 스캔으로 XPS를 통해 분석하였다 (도 5b). Si, Ca, 및 O 원자는 fBGn0 및 fBGn100 모두에 존재하였으나, C 및 N 원자는 fBGn100에서만 관찰되었다. 내로우 스캔 상에서, 284.6 eV의 C1S 피크는 284.5 (C-C), 285.6 (C-N), 287.6 (C=O), 및 289.6 eV (O-C)에 집중된 4개의 피크로 이루어졌다. 주목할만하게, 284.6 eV의 에너지 피크는 그라파이트성 구조 내 C 원자 때문이었고, 이는 명백히 제조된 그대로의 fBGn100이 주로 sp² 탄소로 이루어진 C-점을 갖는 것을 나타낸다. 나노입자의 EDS 맵핑은 명백히 fBGn100에서 C 원자 피크, 및 이외에 8.68%의 원자 비율로 다른 Si, Ca 및 O 피크의 존재를 나타내었고, 이와 반대로 fBGn0은 C 피크가 관찰되지 않았다.

C-점의 직접적인 관찰은 fBGn100 나노입자를 37% HF 용액 중에서 인큐베이션시켜 유리질 매트릭스를 분해시킨 다음 DW로 세척함으로써 수행하였다. HF-처리된 fBGn100 용액에 대한 TEM 분석은 백그라운드 내 나노스피어 매트릭스의 완전한 파괴를 보여준 반면, 구형 검은색 입자(C-점)는 나타내었다 (도 5c). 본 발명에서는 잔류 용액 중에 구형 형태를 갖는 다수의 대략 1.5 nm 크기의 C-점을 확인하였으며, 이것이 실제적인 발광원인 것으로 여겨졌다. 단일 C-점의 고해상도 TEM 이미지를, 각각 점선의 적색 및 황색 원으로 표시된 바와 같이, sp² 클러스터와 비정질 탄소 매트릭스를 구별하는데 참조하였다 (도 5d). 샘플(도 5e)에 해당하는 C-점의 크기 분포는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 1백 개 이상의 입자에 대해 통계 분석하여 측정된 바, 1.5 ± 0.2 nm의 평균 직경을 가졌다 (도 5e). 놀랍게도, 결과적인 용액은 거의 세기가 변화되지 않고 형광성을 유지하였으며, 이는 이전의 가설이 맞다는 것을 나타낸다. 사실상, 나노스피어의 이러한 넓은 PL 방출 영역(400-700 nm)은 작은 입자 크기 분포로 인한 것으로, 이는 C-점의 표면 상에 유사한 양자 효과 및 방출 트랩으로 이어진다. 또한, 이러한 현상은 형광성 탄소 나노물질에서 나타나는 현상으로서 받아들여져 왔으며, 이때 광학 선택은 C-점의 페르미 준위 부근의 다양한 표면 결함 상태(surface defect state)에 의해 결정된다.

비록 fBGn이 C-점으로부터 발생하는 우수한 발광 특성을 나타내었지만, 발광 안정성도 분석하였다. 먼저, pH 영향과 관련하여, fBGn100의 최대 PL 세기가 pH 4-10에서 나타났으며, 상기 세기는 산성 또는 염기성 용액 중 어느 하나로 변화됨에 따라 약한 청색 이동과 함께 유의적으로 감소하였다(25-78% 감소). 그러나, 이러한 변화는 pH 값을 원래의 값으로 되돌리기 위하여 조정되었을 때 없어졌다. 다양한 pH 마이크로환경에 따라, 형광 세기를 방출하기 위한 C-점들의 광안정성은 변화될 수 있다. 이는 너무 많은 H⁺ 또는 OH^- 이온이 작용기의 유의적인 변화를 유도하여 일부 결함의 전자 전이(electronic transition)를 방해하거나 심지어 중단시킬 수 있기 때문일 수 있다. 그러나, 이러한 분석에서 PL 세기는 pH 범위 4-10 내에서 유의적으로 변화되지 않았으며, 이는 광범위한 pH 범위 내에서 C-점의 잠재적인 생물-의학적인 응용 가능성을 나타낸다. 또한, 장기간에 걸친 형광 안정성을 240 시간 동안 수성 조건에서 조사하여 형광 라벨로서의 안정한 응용 가능성을 확인하였다. C-점 나노스피어는 시간에 따라 우수한 광안정성을 가졌으며, 이는 240 시간 동안 Xe 램프로 지속적인 여기 하에서 단지 6% PL 세기만이 감소하는 것으로 나타났다. 용액 조건에서 광탈색에 대한 이러한 안정성은 fBGn 나노스피어가 단백질 또는 핵산-라벨링 및 바이오이미징 분석에서 사용하기 위한 우수한 잠재능을 가짐을 나타낸다. 또한, NaCl 용액의 농도를 0 M로부터 2.0 M로 증가시키면서 다양한 이온 강도에서의 형광 특성을 모니터링하였다. 그 결과, PL 세기나 피크 특성이 변화하지 않았다. 이로써 가혹한 염 조건에서도 본 발명의 나노스피어를 사용할 수 있는 이점이 있음을 알 수 있었다.

형광 안정성과 관련하여, 형광 수명은 특징적인 파라미터이다. 이는 C-점 나노스피어가 그라운드 상태로 되돌아가기 전에 여기 상태에 머무는 시간으로 결정하였다. 전형적으로 나노초(nanosecond)로 측정되며, C-점의 형광 수명은 형광 부위 및 환경의 성질에 의존한다. fBGn 나노스피어의 형광 수명은 시간-분해 PL 측정을 사용하여 평가하였다 (표 2).

감쇠 트레이스(decay trace)는 하기 수학식 1을 사용하는 비선형 최소 제곱 분석에 기초하여 이중지수 함수(bi-exponential function)로 피팅하였다.

[수학식 1]

Y(t) = A₁exp(-t/τ₁) + A₂exp(-t/τ₂)

상기 식에서, A₁ 및 A₂는 τ₁ 및 τ₂의 시간-분해 감쇠 수명의 기여율(fractional contribution)을 나타낸다.

수명의 이중지수적인 거동은 2개의 상이한 방출 부위가 존재한다는 점을 나타낸다. 이는 형광 상태가 그라파이트 센터 (또는 컨쥬게이트된 구조) 및 표면 트랩에 의해 기인하였음을 의미한다. 더 나아가, 본 발명에서는 형광성 나노스피어의 평균 수명 (τ_average)을 계산하였으며, 그 결과 C-점의 값에 대응함을 확인하였다.

일련의 실험에 기초하여, C-점은 명백히 균일한 크기로 Ca-Si 유리 매트릭스 내에 생성되며 결과적으로 나노스피어 내에서 다색 형광원으로서 작용함을 알 수 있었다. 형광 안정성은 다양한 조건의 환경에서 잘 보존되었으며 이를 통해 본 발명의 나노스피어가 생물의학적인 응용 분야에 잠재능이 있음을 알 수 있었다.

실시예 5: fBGn 의 형광 메커니즘 조사

이 시점에서, C-점으로부터 발생하는 APTES-처리된 Ca-Si 유리 나노스피어 내 형광 메커니즘을 더욱 철저하게 분석할 필요가 있다. 아민기와 같은 빛을 발생시키는 나노클러스터 내 전자-공여 능력을 갖는 화학적 기능기의 존재는 효과적인 광발광 입자를 만드는데 있어서 유리한 인자가 될 것이다. 이러한 점에 근거하여, C- 및/또는 OH-계 종이 BGn 내로 의도적으로 도입되었을 때 PL 방출이 나노입자로부터 얻어질 수 있는 것을 알 수 있다. 또한, 오가노실란 "불순물"로 도핑된 실리카 나노입자가 다양한 온도로 열처리 되었을 때, 분자 구조 및 주변 환경의 변화가 다른 전자 전이를 유도할 수 있고, 결과적으로 다른 광학 특성을 나노입자가 보이도록 야기할 수 있다. 본 발명에서는 나노입자가 600℃로 열처리 되었을 때 나노입자에서 발광이 일어나지 않았으며, 이는 실리카 매트릭스 내로 도입된 유기 (탄소 센터) 불순물의 분해로 인한 것일 수 있고, 이로 인해 PL 성분의 훨씬 더욱 약한 형광을 유도할 수 있음을 확인하였다. 본 발명에서는 Ca-함유 생활성의 분해가능한 실리카 나노입자(BGn)가 소성에 의해 유도된 형광성을 나타낼 수 있을 뿐만 아니라 이러한 형광성 나노입자가 바이오이미징에 잠재적으로 응용 가능함을 제시하였다.

소성-유도 분해가, 형광성 종으로 여겨지는, Si에 대한 C 치환 결함을 야기한다. 산-축합 실리카 졸-겔 내 발광은 일반적으로 실리카 내 결함 센터, 탄소/산소 불순물, 질소 센터 효과, 및/또는 전하-전달 메커니즘으로 인해 야기될 수 있다. 실리카 내에서의 규소 및 산소 원자 간의 전하-전달 메커니즘은 숙성된 TEOS 및 졸-겔 내에서 관찰되는 청색 방출을 제시하여 왔다.

발광 메커니즘을 확인하기 위하여, 전자 상자성 공명 (EPR) 분광법을 fBGn 샘플에 대해 수행하였다. EPR은 결정 격자의 틈새 내 결함을 분석하기 위한 매우 민감한 기술이다. 최근, EPR 시그널이 Si, Ca, P 또는 O (이들 이온 내에는 단전자(single electron)가 없음)에 의해서는 발생할 수 없으며, 이에 따라 페록실 라디칼 또는 이산화탄소 라디칼 음이온과 같은 몇몇 라디칼 관련 결함에서 발생한다는 점이 보고된바 있다(Lee, H. U. et al.,Sci . Rep. 2014, 4, 4665 (1-7); Kim H. W. et al., Acta Biomaterials 2014, 10, 1431-1442). EPR 결과는 시그널 및 유효 상자성 결함이 없음을 보여주었으며, 이는 실리카-탄소 불순물 및 실리카-산소-관련 결함이 관련이 없음을 나타낸다. 본 발명에서는 C-점 제조를 위한 대안적인 온화한 합성 접근법을 제안하였다. 직접적인 공급원이 아니지만, 실리카-칼슘 골격 내 결함은 C-점 생성에 있어 중요한 역할을 한다고 할 수 있다. 이는 소성 과정이 일반적으로 순수한 BG 물질 내에서 발광을 야기하지 않기 때문이다. 본 발명에서 적용된 특정 조건은 BGn 구조 내에 C-점을 생성시키기 위해 필요한 것이다. 즉, C-점의 과도한 성장을 방지하면서 C-점 형성을 위한 작은 나노 반응기(nano-reactor)를 제공해야 한다.

실시예 6: DOX 의 담지 및 방출 능력 조사

본 발명에 따른 fBGn은 다색 발광 나노입자로서 잠재적인 유용성을 가지는 동시에, 약물 분자를 담지하고 전달하는 능력을 가져 질환의 치료 및 조직 수복에 있어 상승작용적인 능력을 갖는다. 치료 분자의 높은 담지력 및 제어 전달에 대한 fBGn의 효능을 조사하기 위해 항암제 약물 DOX를 사용하였다. DOX는 8.3의 pKa를 가지며, 이에 따라 pH 7.4에서 양으로 하전된다. 이는 추가적인 표면 작용기화 없이도 음으로 하전된 fBGn 나노캐리어에 대한 인력(attraction)을 용이하게 부여할 수 있다. 더 나아가, DOX는 소분자이며 이에 따라 메조다공 채널(본 실시예에서 2-3 nm) 내에 결합될 수 있다. 또한, 순수한 메조다공성 실리카 나노입자(MSN)를 fBGn100과 함께 대조군으로서 제조하였으며, 동일한 담지 조건 하에서 DOX 전달 비히클로서 사용하였다. DOX 담지능력은 DOX 농도를 20㎍으로부터 120 ㎍까지 변화시키면서 주어진 나노캐리어 함량 (1 mg)에서 기록하였다 (도 6a). MSN 샘플의 경우, DOX 담지 능력이 DOX의 농도가 증가함에 따라 점진적으로 증가하였으며, 120 ㎍/ml의 샘플에서 67.2%의 최대 담지 능력을 기록하였다 (도 6a). fBGn100의 경우에도, DOX 담지 능력이 DOX 함량이 증가함에 따라 120 ㎍/ml까지 선형으로 증가하였으나, 이의 최대 담지 능력은 92.1% 수준으로 높았다. 따라서, 두 나노캐리어의 담지 능력이 유의적으로 다름을 알 수 있다. MSN의 메조다공 구조적 특징(기공 크기, 기공 부피, 표면적)이 fBGn100보다 더욱 우수했음에도, 놀랍게도 fBGn100에서 유의적으로 향상된 DOX 담지능력이 나타났다. 이를 통해, MSN과의 상호작용과는 다른, DOX와 fBGn 간에 특이적인 화학적 상호작용이 있을 수 있음을 알 수 있다. 이는 fBGn 매트릭스 내 Ca^{2 +} 이온의 존재로 인한 것으로 여겨졌다. DOX 분자는 Ca^{2 +} 이온과 킬레이트 결합을 할 수 있어 비교적 강한 화학적 상호작용을 형성할 수 있다. 본 발명에서는 도 6b에 도식적으로 도시된 바와 같이 DOX 분자와 fBGn의 메조기공 간에 2가지 타입의 결합이 있는 것으로 여겨졌다. 먼저, DOX는 히드록실화된 실리카에 결합할 수 있으며(타입 I), 또한 DOX는 Ca^{2 +} 종과 킬레이트 결합을 할 수 있다(타입 II). fBGn과 MSN 간의 상이한 약물-재료 간 상호작용으로 인해 상이한 약물 담지 능력을 나타낼 수 있고, 또한 이후 방출 거동에도 영향을 미칠 수 있다.

그 다음으로, 본 발명에서는 형광 나노스피어로부터 DOX의 방출 프로파일을 조사하였다. pH 변화가 신체 내에서 국부적 또는 병리상 부위, 예컨대 위, 장, 엔도좀, 라이소좀, 혈관, 여성 생식기 관, 및 다양한 종양성 세포외 부위에서 발생한다는 점을 감안할 때, pH는 약물 전달 시스템에서 가장 중요한 환경 파라미터 중의 하나이다. 따라서 잠재적인 pH-감응성 약물 전달 시스템이 상당히 관심을 받아왔다. fBGn100 및 MSN에서 DOX의 방출 동력학에 대한 pH 및 DOX 농도의 영향을 도 6c에 나타내었다. pH 5.5에서 fBGn100로부터 DOX의 방출 동력학은 pH 7.4보다 유의적으로 더욱 높은 것으로 확인되었다. 이러한 경향은 더욱 낮은 pH에서 DOX 상에 양성자화된 -NH₂ 기가 증가함으로써 DOX의 친수성이 증가하고 더욱 높은 용해도를 가지기 때문인 것으로 여겨졌다. 이들 데이터는 약물 분자가 정상 조직 또는 생물학적인 유체의 생리학적으로 중성인 pH보다 종양 부위의 온화한 산성 환경에서 더욱 빠르게 방출될 수 있음을 나타낸다. 또 다른 주목할 점은 fBGn100으로부터의 DOX 방출이 MSN으로부터의 방출보다 훨씬 더 지속가능하다는 점이었다. 이는 DOX 분자와 fBGn100 내 Ca의 강한 결합으로 인한 것이었으며, 이는 다시 한번 실리카 매트릭스 내 Ca 이온의 효과적인 역할을 입증해주었다. 또한, 그래프는 Ritger-Peppas 경험식 (M _t /M _∞ = kt ⁿ )에 따라 피팅되었으며, 이때 M _t 및 M _∞는 각각 시간 t 및 무한대 시간 (∞)에서 방출된 약물의 절대량이고, k는 약물 전달 디바이스의 구조 및 기하학적 특징을 포함하는, 각각의 식을 위한 방출 속도 상수를 나타내며, n은 방출 지수(released exponent)이다. 생성된 곡선은 원래의 곡선과 상당히 잘 맞는 것으로 나타났다. 이는 DOX 방출이 메조기공 채널을 통한 확산 메커니즘에 크게 의존적이었음을 의미한다. 따라서, 이들 결과를 통해 본 발명에 따른 Ca-Si 유리 매트릭스의 형광성 생활성 나노스피어는 높은 담지량 (캐리어 중량의 92.1%)으로 항암제 DOX 약물을 담지하고, pH-의존적으로 (중성 환경에 비해 산성에서 더욱 높은) 그리고 지속적으로 (적어도 2주 이상) 약물을 전달하는 능력을 가지는 것을 확인할 수 있으며, 이로써 본 발명의 나노스피어가 항암 치료에 있어 잠재적인 이점을 가짐을 알 수 있다.

마지막으로, fBGn0 및 fBGn100 샘플의 형광 현미경 이미지를 통해 청색, 녹색 또는 적색 방출이 다양한 빛 조사 조건 하에서 유도될 수 있음을 확인하였다. 이들의 우수한 광학적 특성으로 인해, 본 발명의 형광 나노스피어를 선험적 테스트를 위해 생체 내 광학적 이미징을 위해 사용할 수 있다. 더 나아가, fBGn100 나노캐리어를 누드 마우스에 피하 주사 (100 ㎕, 2 mg/mL)하고, PL 이미징을 수행하였다. 예측된 바와 같이, 마우스의 해당 주사 부위에 명백하게 PL 시그널이 나타났다. 생체 내 결과를 통해, fBGn100이 치료제 전달을 생체 내에서 트래킹(tracking) 함에 있어서 가장 큰 능력을 가질 수 있음을 알 수 있었다.

Claims (19)

1. 산화칼슘(CaO) 전구체, 실리카(SiO₂) 전구체, 및 아미노실란 화합물을 포함하는 염기성 용액이 350 내지 550℃에서 소성 처리된 메조다공성 생활성 유리 나노입자로서, 상기 소성 처리에 의해 입자 매트릭스 내부에 형성된 탄소점(carbon dot)을 함유하여 형광성을 나타내는 형광 메조다공성 나노입자.
   
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 다색 발광 특성을 나타내는 것을 특징으로 하는 나노입자.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 형광 메조다공성 나노입자 내 약물, 유전자, 또는 단백질이 추가로 담지된 것을 특징으로 하는 나노입자.
   
5. 제4항에 있어서, 상기 약물은 상기 형광 메조다공성 나노입자 내 Ca^{2 +} 이온과 킬레이트 결합을 형성할 수 있는 것인, 나노입자.
   
6. 제1항에 있어서, Ca:Si의 몰비는 5~40:60~95인, 나노입자.
   
7. 제1항에 있어서, 1 내지 5 nm의 평균 기공 크기를 갖는 것인, 나노입자.
   
8. 제1항에 있어서, 50 내지 200 nm의 평균 입자 크기를 갖는 것인, 나노입자.
   
9. 하기 단계를 포함하는 형광 메조다공성 나노입자의 제조방법:
   1) 산화칼슘 전구체, 및 기공형성 주형으로 계면활성제를 함유하는 염기성 용액을 준비하는 단계(단계 1);
   2) 상기 염기성 용액에 실리카 전구체 및 아미노실란 화합물을 첨가하고 교반하여 아미노실란 화합물 함유 생활성 유리 나노입자를 얻는 단계(단계 2); 및
   3) 상기 아미노실란 화합물 함유 생활성 유리 나노입자를 350 내지 550℃에서 소성하는 단계(단계 3).
   
10. 제9항에 있어서, 상기 단계 3 이후에 상기 형광 메조다공성 나노입자에 약물, 유전자, 또는 단백질을 담지하는 단계(단계 4)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
    
11. 제9항에 있어서, 상기 산화칼슘 전구체는 질산칼슘(calcium nitrate tetrahydrate), 염화칼슘(calcium chloride), 아세트산칼슘(calcium acetate), 및 칼슘 메톡시에톡사이드(calcium methoxyethoxide)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 화합물인, 방법.
    
12. 제9항에 있어서, 상기 계면활성제는 헥사데실트리메틸 암모늄 브로마이드(CTAB) 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG)인, 방법.
    
13. 제9항에 있어서, 상기 염기성 용액은 pH가 9 내지 13인 것인, 방법.
    
14. 제9항에 있어서, 상기 실리카 전구체는 TEOS(tetraethyl orthosilicate), TMOS(trimethoxy orthosilicate), GPTMS((3-glycidoxypropyl)methyldiethoxysilane), MPS(3-mercaptopropyl trimethoxysilane), GOTMS(γ-glycidyloxypropyl trimethoxysilane) 및 APTMOS(aminophenyl trimethoxysilane)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 화합물인, 방법.
    
15. 제9항에 있어서, 상기 아미노실란 화합물은 APTES(3-aminopropyl triethoxysilane) 및 AEAPMDMS(N(beta-aminoethyl)gamma-aminopropylmethyldimethoxysilane)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 화합물인, 방법.
    
16. 제9항에 있어서, 상기 산화칼슘 전구체, 실리카 전구체 및 아미노실란 화합물의 첨가량은 Ca:Si의 몰비가 5~40:60~95가 되도록 조절되는 것을 특징으로 하는 방법.
    
17. 제1항 및 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항의 형광 메조다공성 나노입자를 포함하는 약물, 유전자, 또는 단백질의 전달을 위한 조성물.
    
18. 제1항 및 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항의 형광 메조다공성 나노입자를 포함하는 조영제 조성물.
    
19. 제1항 및 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항의 형광 메조다공성 나노입자를 포함하는 생체 이미징용 조성물.

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