KR102403707B1 - 다기능 중기공 생활성 유리 나노입자 및 이의 제조방법 - Google Patents

다기능 중기공 생활성 유리 나노입자 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 다기능 중기공 생활성 유리 나노입자 및 이의 제조방법에 대한 것으로, 메조포러스 바이오글라스 나노입자 제조방법, 이에 의해 제조된 나노입자 및 이의 이용에 관한 것이며, 구체적으로 a) 브롬화 세틸트리메틸암모늄, 2-메톡시에탄올, 에탄올 및 암모니아수를 물에 용해시켜 혼합물을 준비하는 단계; b) 상기 혼합물에 질산칼슘, 테트라에틸 오르소실리케이트 및 3-아미노프로필 트리에톡시실란을 첨가하고 교반하는 단계; c) 상기 첨가 및 교반으로 생성되는 입자를 수득하는 단계; 및 d) 상기 입자를 350 내지 450℃로 열처리하는 단계;를 포함하는 메조포러스 바이오글라스 나노입자 제조방법, 이 제조방법으로 제조된 메조포러스 바이오글라스 나노입자 및 이 나노입자를 이용한 조성물에 관한 것이다.

Description

다기능 중기공 생활성 유리 나노입자 및 이의 제조방법{Multi-functional mesoporous bioactive glass nanoparticle and manufacturing method thereof}
본 발명은 다기능 중기공 생활성 유리 나노입자 및 이의 제조방법에 대한 것으로, 메조포러스 바이오글라스 나노입자 제조방법, 이에 의해 제조된 나노입자 및 이의 이용에 관한 것이다.
다중모드 이미징을 사용한 광요법은 암 세포 상에서 유의적인 영향을 미친다. 암 부위의 실시간 관찰 및 암세포의 광유도적인 파괴의 이점으로 인해 종양 치료에 폭넓게 적용되기 때문에 의학 분야에서 유망한 전략으로 평가된다. 광열적(PTT) 및 광역학적(PDT) 기술 모두 같은 표적의 다른 기술들과 비교하여 더 나은 치료적 효능을 갖는다. 이 PTT 및 PDT 요법은 빛 에너지의 광학 흡수 및 열 에너지로의 전환 또는 암세포를 파괴하기 위한 활성산소종(ROS)과 같은 고도의 독성 활성 성분의 생산을 기반으로 한다. 이러한 PTT 및 PDT 효과를 동반하는 광 반응성 나노테라노스틱 생물재료의 개발에 초점을 맞추어 활발한 연구가 이루어졌다. 최근에는 탄소 및 금속-기반 나노재료와 같은 특정 나노테라노스틱 생물재료에 대해 보고된 바 있다.
한편, 형광-기반 나노테라노스틱 생물재료들은 암 부위의 진단에서 실시간 이미징 및 관찰에 유용할 수 있다. 이러한 실시간 이미징 및 광치료를 위해 세미퀀텀닷, Au-기반, CD(carbon dot)-기반, 마그네틱-기반 등과 같은 다수의 나노재료들이 개발되었다. 하지만, 독성 및 높은 합성 비용과 같은 단점으로 인해 이러한 나노재료들을 사용하는 것은 제한적이다. 그러나 CD는 낮은 독성, 특이적인 조정가능한 표면 구조, 기능화의 용이성, 빛에 대한 우수한 안정성, 조정가능한 흡수-방출 스펙트럼 등과 같은 특성을 갖기 때문에 형광 이미징(FI), 이-광자 이미징(TP), 및 라만 이미징(RI)을 위한 다중모드 이미징 물질의 좋은 옵션이 될 수 있다. 이와 관련하여, 화학적인 방법, 마이크로웨이브법, 열수작용법, 초음파법, 산소 플라즈마법, 및 전기화학법과 같이 CD-기반 나노재료를 개발하기 위한 기술들이 알려져 있다. 하지만, 본 발명자는 표면개질제로 3-아미노프로필 트리에톡시실란(3-aminopropyl triethoxysilane: APTES)을 사용하고 열처리하는 단순 졸-겔 법을 사용하였다. 최근에 세포 이미징 및 암 치료를 포함하는 생물의학적 적용을 위해 NIR 파장을 사용한 TP 분광법과 같은 이미징 기술들이 사용되었다. NIR 레이저광은 심층 조직 침투를 촉진하는 높은 세기와 낮은 흡수로 인해 투과율이 가시광에 비교하여 더 높았다. TP 이미징 및 테라노스틱스를 위한 탄소 나노테라노스틱 생물재료의 다른 응용에 관한 연구는 아직 진행중이다. 광자의 흡수 및 방출을 기반으로 하는 이들 분광학적 기술 외에, 다른 기술로 라만 분광법이 사용될 수 있으며 이는 광자의 비탄성 산란을 기반으로 한다. 라만 스펙트럼은 그 안정성으로 인해 FI에 비해 장기적인 분석에 더 적합하다. CNT, GO, 및 CD와 같은 탄소-기반 나노재료들은 라만 스펙트럼에서 특징적인 피크를 보이며 장기적 세포 이미징을 위한 비파괴 이미징 물질로 사용될 수 있다.
화학요법은 암세포를 파괴하는 주요 방법이지만, 상당수의 항암제는 소수성이므로 낮은 수용성을 나타내며, 이러한 특성으로 인해 정맥 투여로 제한될 수 있다. CD는 작은 크기 및 비다공성 특징으로 인해 항암제 또는 치료 목적의 다른 생물분자를 적재하는 운반체로 비효율적이다. 여러 연구를 통해 메조포러스 나노운반체를 사용할 때 이의 우수한 약물 파지 능력으로 인해 정맥투여용 소수성 약물이 용이하게 적재될 수 있는 것으로 나타났다. 이러한 접근법은 화학요법의 효능을 개선할 수 있고 부작용을 줄일 수 있다. 다양한 실리카-기반 나노재료 중, 메조포러스 바이오글라스는 이의 높은 표면적, 조정가능한 공극 크기, 및 우수한 생물적합성으로 인해 표적 전달을 위한 좋은 옵션이 될 수 있다. 바이오글라스는 칼슘(Ca) 및 실리카(Si)를 기반으로 하며 뼈와 조직 재생에도 사용된다. 메조포러스 바이오글라스는 높은 표면적과 이에 따른 높은 약물-적재 능력을 가지며 빛, pH, 온도 등의 변화를 통해 방출이 일어나도록 할 수 있다.
본 발명자는 실시간 모니터링, 표적 전달, 및 광요법을 위한 물질을 개발하고자 하였으며, APTES를 사용한 졸-겔법 및 특정 온도로 열처리하는 방법을 통해 CD-기반 바이오글라스 나노테라노스틱 운반체를 개발하는데 성공하였다.
Cheng, L.; Wang, C.; Feng, L.; Yang, K.; Liu, Z. Functional Nanomaterials for Phototherapies of Cancer. Chem. Rev. 2014, 114, 10869-10939.
본 발명의 주된 목적은 실시간 모니터링, 표적 전달 및 광요법에 유용하게 사용될 수 있으며 안정성 또한 우수한 탄소점-기반 메조포러스 바이오글라스를 낮은 비용으로 쉽게 제조할 수 있는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기와 같은 방법으로 제조되어, 실시간 모니터링, 표적 전달 및 광요법에 적용가능하며 안정성이 우수한 탄소점-기반 메조포러스 바이오글라스를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 탄소점-기반 메조포러스 바이오글라스를 이용한 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 a) 브롬화 세틸트리메틸암모늄, 2-메톡시에탄올, 에탄올 및 암모니아수를 물에 용해시켜 혼합물을 준비하는 단계; b) 상기 혼합물에 질산칼슘, 테트라에틸 오르소실리케이트 및 3-아미노프로필 트리에톡시실란을 첨가하고 교반하는 단계; c) 상기 첨가 및 교반으로 생성되는 입자를 수득하는 단계; 및 d) 상기 입자를 350 내지 450℃로 열처리하는 단계;를 포함하는 메조포러스 바이오글라스 나노입자 제조방법을 제공한다.
본 발명의 제조방법에 있어서, Ca : Si의 몰비를 5 : 95 내지 25 : 75로 하는 것이 바람직하다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 테트라에틸 오르소실리케이트 : 3-아미노프로필 트리에톡시실란의 부피비를 1 : 2 내지 2 : 1로 하는 것이 바람직하다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 b)단계의 교반을 3 내지 5시간 실시하는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 메조포러스 바이오글라스 나노입자를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 나노입자를 포함하는 약물 또는 생체분자 전달용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 나노입자를 포함하는 생체 이미징용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 나노입자를 유효성분으로 포함하는 광역학 치료용 광감작제 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 나노입자를 유효성분으로 포함하는 광열 치료용 광열제 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 나노입자를 유효성분으로 포함하는 테라노스틱스용 조성물을 제공한다.
본 발명의 제조방법에 따르면 강한 다색 형광 특성을 나타내어 생체 내에서 특히 암세포를 효과적으로 이미징할 수 있으며, 이-광자 분광 이미징(two-photon spectroscopy imaging) 및 라만 분과 이미징(Raman spectroscopy imaging)에도 사용할 수 있고, 광열적(photothermal: PTT) 및 광역학적(photodynamic: PDT) 특성을 가지며, 생물분자의 효율적인 적재, 표적으로의 운반 및 제어된 방출이 가능하고, 생물적합성이 우수한 탄소점-기반 메조포러스 바이오글라스 나노입자를 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 나노입자는 상기와 같은 특성으로 인해 약물 또는 생체분자의 전달, 생체 이미징, 광역학 치료 또는 광열 치료에 이용할 수 있으며, 특히 생체 이미징과 광치료가 가능하므로 진단과 치료를 동시에 실시하는 테라노스틱스(theranostics)에 이용할 수 있다.
도 1은 (a) 본 발명의 나노입자(fBGn); (b) 높은 독소루비신 적재 및 제어된 방출 메커니즘; 및 (c) 약물 전달, 광학 삼중-모드 이미징, 및 광-유도 암 요법을 나타낸 개략도이다.
도 2는 (a) 본 발명 나노입자(fBGn)의 제조과정, 및 (b) BGn(열처리전의 나노입자) 및 fBGn 샘플의 저- 및 고-배율 TEM 이미지를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명 나노입자(fBGn)의 특성을 나타낸 것이다. (a) UV-vis 스펙트라, (b) 라만 스펙트라, (c) FT-IR 스펙트라, (d) 와이드-스캔 XPS 스펙트라, (e) 내로우(C 1s) 스캔, 및 (f) 내로우(N 1s) 스캔.
도 4는 (a) 플루오린화수소산(HF) 용액으로 처리한 본 발명 나노입자(fBGn) 시료 및 TEM 이미지, (b) 고-해상도 TEM 이미지, (c) PL 방출 스펙트라, (d) EPR 스펙트라, (e) 형광 매커니즘을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명 나노입자(fBGn)의 라벨-프리 형광 특성을 나타낸 것이다. (a) BGn의 열처리로 본 발명 나노입자(fBGn)가 생성되는 것을 나타내는 개략도, (b) 360㎚의 여기 파장에서 서로 다른 온도로 처리하여 제조된 fBGn의 방출 스펙트라, (c) 서로 다른 온도에서 측정한 3가지 피크(P1, P2, 및 P3)의 방출 파장, (d) 서로 다른 온도에서 측정한 3가지 피크(P1, P2, 및 P3)의 방출 강도, (e) 서로 다른 여기 파장에서의 fBGn의 2-D 여기-방출 컨투어 맵, (f) 500㎚에서 방출을 모니터링하여 측정한 수명 감쇠 프로파일, (g) 명시야 하에서 살아있는 HeLa 세포 내 두 가지의 다른 농도의 fBGn의 공초점 형광 이미지.
도 6은 800㎚ 레이저광으로 여기한 본 발명 나노입자(fBGn)의 TP 스펙트라를 나타낸 것이다. (a) 800㎚ 여기 파장에서 서로 다른 온도에 따른 방출 스펙트라, (b) 서로 다른 여기 파장에 따른 방출 스펙트라, (c) 800㎚ 파장의 레이저광 여기 하의 fBGn의 이미지.
도 7은 514㎚ 파장의 레이저광 하에서 실리카 웨이퍼 상 HeLa 세포와 본 발명 나노입자(fBGn)의 라만 이미지(RI)를 나타낸 것이다. (a) 레이저 스팟, (b) 배경이 있는 PL 이미지, (c) 배경이 없는 PL 이미지, (d) 광학 이미지, (e) 낮은 강도를 갖는 G의 상대적 강도의 라만 이미지, (f) 높은 강도를 갖는 G의 상대적 강도의 라만 이미지.
도 8은 본 발명 나노입자(fBGn)의 PDT/PTT 효과를 나타낸 것이다. (a) ~ (d) 다양한 농도의 fBGn에 PTT광(808㎚)을 처리한 결과, (a) PTT 열 곡선, (b) 온도 변화, (c) 온도 NIR 이미지, 및 (d) HeLa 세포에 대한 상대적 세포독성, (e) ~ (h) fBGn에 PDT광(80mW, 660㎚)을 처리한 결과, (e) 암조건 및 LED광 조건에서 ESR 스펙트라로 조사한 fBGn의 1O2-유도 신호, (f) DPBF의 광분해, (g) PBS, fBGn, fBGn+광조사로 처리한 HeLa 세포에서 측정한 ROS 수준, (h) HeLa 세포에 대한 세포독성, (i) 및 (j) PDT/PTT 결합 효과, (i) 다양한 조건으로 fBGn을 처리하여 배양한 HeLa 세포의 공초점 이미지 및 칼세인 AM/PI-염색 형광 이미지, (j) 다양한 농도에서 HeLa 세포에 대한 세포독성.
도 9는 본 발명 나노입자(fBGn)와 MSN(대조군)을 사용한 항암제인 독소루비신(DOX) 적재 및 방출을 실험한 결과를 나타낸 것이다. (a) 항암제 적재, (b) 적재 및 방출 매커니즘, (c) 37℃에서 pH(5.0 및 7.4)에 따른 DOX 방출, (d) HeLa 세포의 세포 생존력.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시 예를 가질 수 있는 바, 특정 실시 예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에서 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다.
본 발명의 메조포러스 바이오글라스 나노입자 제조방법은 a) 브롬화 세틸트리메틸암모늄, 2-메톡시에탄올, 에탄올 및 암모니아수를 물에 용해시켜 혼합물을 준비하는 단계; b) 상기 혼합물에 질산칼슘, 테트라에틸 오르소실리케이트 및 3-아미노프로필 트리에톡시실란을 첨가하고 교반하는 단계; c) 상기 첨가 및 교반으로 생성되는 입자를 수득하는 단계; 및 d) 상기 입자를 350 내지 450℃로 열처리하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 제조방법에서, 바람직하게는 Ca : Si의 몰비를 5 : 95 내지 25 : 75로 하며, 보다 바람직하게는 10 : 90 내지 20 : 80으로 한다.
본 발명의 제조방법에서, 바람직하게는 상기 테트라에틸 오르소실리케이트 : 3-아미노프로필 트리에톡시실란의 부피비를 1 : 2 내지 2 : 1로 하며, 보다 바람직하게는 1 : 1.5 내지 1.5 : 1, 보다 바람직하게는 1 : 1.2 내지 1.2 : 1로 한다.
본 발명의 제조방법에서, 바람직하게는 상기 b)단계의 교반을 1 내지 10시간 실시하며, 보다 바람직하게는 2 내지 8시간, 보다 바람직하게는 3 내지 5시간 실시한다.
상기 a)단계에서, 바람직하게는 물 150㎖을 기준으로 브롬화 세틸트리메틸암모늄 0.1 내지 3g, 2-메톡시에탄올 5 내지 50㎖, 에탄올 2.5 내지 25㎖, 암모니아수 0.5 내지 5㎖을 사용하며, 보다 바람직하게는 물 150㎖을 기준으로 브롬화 세틸트리메틸암모늄 0.5 내지 2g, 2-메톡시에탄올 10 내지 30㎖, 에탄올 5 내지 15㎖, 암모니아수 1 내지 3㎖을 사용한다.
상기 c)단계는 b)단계 이후 혼합물의 교반을 멈추고 원심분리하여 생성되는 백색침전물을 수득하는 방식으로 수행할 수 있다.
본 발명의 제조방법에서, 바람직하게는 상기 c)단계와 d)단계의 사이에 상기 입자를 세척하는 단계를 추가한다. c)단계에서 입자를 수득하는 과정에 브롬화 세틸트리메틸암모늄 등의 불필요한 물질들이 입자와 함께 수득될 수 있으므로, 이를 깨끗이 제거하기 위해 상기와 같은 세척하는 단계를 추가하는 것이 바람직하며, 바람직하게는 물과 에탄올의 혼합 용액을 사용하여 세척한다.
상기 d)단계는 c)단계에서 생성된 메조포러스 바이오글라스 나노입자의 실리카 매트릭스 내에 탄소점(CD)을 생성하기 위한 단계로, 350 내지 450℃로 열처리하는 것을 특징으로 한다. 상기 탄소점은 본 발명 나노입자의 형광 특성과 관련되며, 이러한 특성은 d)단계의 열처리 온도와 관련된다. 이에 바람직하게는 상기 열처리 온도를 360 내지 440℃, 보다 바람직하게는 370 내지 430℃, 보다 바람직하게는 380 내지 420℃, 보다 바람직하게는 390 내지 410℃로 한다.
상기와 같은 제조방법에 따르면 바이오글라스 실리카 매트릭스 내에 탄소점이 생성되어 있으며, 높은 표면적 및 메조포러스 특성을 갖는 나노입자를 제조할 수 있다. 이때의 높은 표면적과 메조포러스 특성은 약물이나 생물분자의 효율적인 적재를 가능하게 한다.
상기 제조방법으로 제조된 본 발명의 나노입자는 바람직하게는 구형이며, 바람직하게는 50 내지 200㎚의 크기를 가진다. 또한, 바람직하게는 600 내지 700m2/g의 BET 표면적을 가지며, 바람직하게는 0.1 내지 1cm3/g의 공극 부피를 가지고, 바람직하게는 2 내지 5㎚의 공극 크기를 갖는다. 또한 바람직하게는 1 내지 5㎚ 크기의 탄소점을 갖는다.
본 발명의 나노입자는 강한 형광 특성 및 다색 형광 특성을 나타낼 수 있는데, 이러한 형광 특성은 상기 탄소점에 의해 발휘될 수 있다.
본 발명의 나노입자는 여기 파장이 405㎚(블루), 454㎚(그린) 및 546㎚(레드)일 때, 각각 서로 다른 색을 방출할 수 있다. 이에 따라 본 발명의 나노입자는 생체 이미징의 용도, 특히 생물의학 분야에서 다중컬러 바이오이미징에 이미징제로 사용될 수 있으며, 생체 이미징용 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다.
본 발명의 나노입자는 근적외선(NIR)의 여기 파장에 대해서도 빛을 발광할 수 있다. 예를 들어, 여기 파장이 800㎚일 때 450 내지 550㎚ 파장의 빛을 발광할 수 있다. 이러한 근적외선은 가시광에 비해 조직 깊숙이 쉽게 침투할 수 있다. 따라서 본 발명의 나노입자는 근적외선을 사용한 보다 효과적인 생체 이미징을 가능하게 할 수 있다. 이에 본 발명은 본 발명의 나노입자를 사용하며 근적외선을 여기 파장으로 사용하는 생체 이미징 방법 또한 제공한다. 이때 근적외선은 바람직하게는 750 내지 850㎚ 파장의 근적외선이며, 보다 바람직하게는 760 내지 840㎚ 파장, 보다 바람직하게는 770 내지 830㎚ 파장, 보다 바람직하게는 780 내지 820㎚ 파장, 보다 바람직하게는 790 내지 810㎚ 파장의 근적외선이다.
본 발명의 나노입자는 이-광자 형광 특성이 있어, 이-광자 분광 이미징에 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 나노입자는 라만 효과(Raman effect)를 나타낼 수 있어, 라만 분광 이미징에도 사용될 수 있다.
본 발명을 통해 본 발명 나노입자의 광열적(photothermal: PTT) 특성이 확인되었다. 예를 들어 808㎚의 레이저광을 조사하였을 때 열 에너지를 생산할 수 있으며, 종양 또는 암세포를 죽이기 위해 충분한 열 에너지를 생산할 수 있다. 따라서 본 발명의 나노입자는 광열 치료의 광열제로 사용될 수 있으며, 광열 치료용 광열제 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명을 통해 본 발명 나노입자의 광역학적(photodynamic: PDT) 특성 또한 확인되었다. 예를 들어 660㎚의 LED광을 조사하였을 때 1O2 ROS(활성산소종)를 생산할 수 있으며, 이를 통해 종양 또는 암세포를 죽일 수 있다. 따라서 본 발명의 나노입자는 광역학 치료의 광감작제로 사용될 수 있으며, 광역학 치료용 광감작제 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다.
상기와 같이 본 발명의 나노입자는 광열 및 광역학적 특성을 모두 발휘할 수 있다. 따라서 본 발명의 나노입자는 광역학 및 광열 병용-치료의 광감작-광열제로 사용될 수 있으며, 광역학 및 광열 병용-치료용 광감작-광열제 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다. 특히, 본 발명에 따르면 광열 치료를 위한 광열제 또는 광역학 치료를 위한 광감작제로 별도로 사용한 경우에 비해 광역학 및 광열 병용-치료의 광감작-광열제로 사용한 경우에 종양 또는 암세포를 보다 효과적으로 사멸시킬 수 있다.
또한, 본 발명을 통해 본 발명 나노입자의 약물 또는 생체분자의 적재 및 제어된 전달이 가능함이 확인되었다. 예를 들어 본 발명의 나노입자는 항암제인 독소루비신(doxorubicin: DOX)을 효율적으로 적재할 수 있으며, pH-의존적인 방출이 가능하다. pH-의존적인 방출 특성은 종양 또는 암세포의 환경이 약산성인 점을 고려할 때 약물 또는 생체분자의 제어된 방출이 가능함을 보여준다. 따라서 본 발명의 나노입자는 약물 또는 생체분자의 전달체로 사용될 수 있으며, 약물 또는 생체분자 전달용 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다.
상기와 같이 본 발명의 나노입자는 약물 또는 생체분자 전달, 생체 이미징, 광역학 치료 및 광열 치료를 모두 가능하게 한다. 따라서 본 발명의 나노입자는 진단과 치료를 병행하는 테라노스틱스(theranostics)를 위한 물질로 사용될 수 있으며, 테라노스틱스용 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다.
본 발명의 나노입자 또는 조성물을 인체에 투여하는 경우의 투여량은 투여대상의 상태, 투여 경로 및 투여 형태에 따라 조절될 수 있으며, 본 발명의 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명을 통해 제시된 효능 실험결과 및 세포독성 실험결과, 또는 임의의 추가 실험을 바탕으로 그 투여량을 판단할 수 있을 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
[실시예]
1. 재료 및 방법
1.1. fBGn 나노입자 합성
스퇴버법을 사용하여 메조포러스 바이오글라스 나노입자(BGn)를 제조하였다. 브롬화 세틸트리메틸암모늄(CTAB) 1g, 2-메톡시에탄올(2-methoxyethanol) 20㎖, 에탄올 10㎖, 및 암모니아수 2㎖을 물 150㎖에 용해시켰다. 30분 동안 교반한 후, Ca(NO3)2·4H2O, 테트라에틸 오르소실리케이트(TEOS), 및 실란 기능화제로 APTES를 혼합물에 첨가하고 4시간 동안 추가로 교반하였다. Ca/Si의 몰비는 약 15:85로 하였고, TEOS 대 APTES의 부피비는 1:1로 하였다. 침전된 백색분말로부터 CTAB을 제거하기 위해 물과 에탄올을 사용하였고, BGn 나노입자를 얻기 위해 최종적으로 70℃에서 밤새 건조하였다. 이후 생성된 BGn 나노입자를 공기의 존재 내에서 250, 300, 350, 400, 450, 500, 및 600℃의 각기 다른 온도로 2시간 동안 열처리하였으며, 이렇게 열처리한 나노입자가 fBGn 합성의 최종 산물이다.
1.2. 샘플 특성화
나노입자의 모양과 크기를 JEOL-7100 TEM(transmission electron microscopy)으로 확인하였다. BET(Brunauer-Emmett-Teller) 표면적, 공극-부피, 및 메조공극 크기 분포를 표면적 분석기(2SI-MP-9 Quantachome Instruments)로 측정하였다. 표면 결합 화학특성 및 구성 비율을 XPS(X-ray photoelectron spectroscopy)를 사용하여 분석하였다. 나노재료 내 결정 격자 결함의 존재를 분석하기 위해 JES-FA200 EPR(electron paramagnetic resonance) 분광광도계를 사용하였다. 라만 스펙트럼은 550㎚ 적광 레이저로 운용되는 라만 분광기(LabRAM HR UV/vis/NIR)를 사용하여 얻었다. 이후 화학적 결합 구조를 FT-IR(Fourier transform infrared spectroscopic technique)(Varian 640-IR)을 사용하여 분석하였다. 광학 흡수에 관련된 스펙트럼은 Cary100 UV-vis-NIR(Ultraviolet-visible-NIR) 분광기를 사용하여 얻었다. 수용액 내 fBGn의 일-광자 여기 형광 또는 형광 특성 및 2D 윤곽 여기/방출 맵을 Jasco FP-6500 장치를 사용하여 다양한 파장에서 UV-vis 필터를 사용하여 검출하였다. 감쇠수명은 iHR320 분광광도계를 사용하여 측정하였다. 수용액 내 fBGn의 TP 여기 형광 분광은 섬유 분광기를 사용하여 관찰하였다. 광 여기 근원으로 튜닝 범위 550 내지 900㎚의 증폭 Ti:사파이어 레이저 시스템(SpectraPhysics, 50 fs, 1kHz)을 사용하였다.
1.3. 공초점 FI
HeLa 암세포를 글라스 챔버 슬라이드에 접종(1x104 cells)하고 37℃로 12시간 동안 유지시켰다. 이후 세포 배지를 50 또는 100㎍/㎖의 fBGn 나노입자가 함유된 신선한 세포 배지로 교체하고, 37℃에서 약 4시간 동안 배양하였다. PBS(Phosphate-buffered saline)로 세포를 세척하고 세 가지의 다른 여기 파장을 갖는 공초점 현미경을 사용하여 이미지화하였다.
1.4. 라만 이미징
24-웰 플레이트를 사용하여 적절한 배양 및 부착 조건 하에서 24시간 동안 α-MEM 배지에서 세포를 배양하였다(1x104 cells/well). 이후 약 6시간 동안 fBGn으로 세포를 처리하였다. 6시간 배양 후, PBS로 부착된 세포를 세척하고 트립신-EDTA를 처리하여 플레이트에서 세포를 떼어내고 PBS에 재현탁하였다. RI를 위해 사용하는 동안 fBGn이 세포막 또는 실리콘 웨이퍼에 흡수되는 것을 피하기 위해 세포 현탁액 방울을 실리콘 웨이퍼에 첨가하였다.
1.5. fBGn의 PTT 효과의 진화
808㎚ 레이저 조사(1W/cm2)로 유도되는 PTT 효능을 조사하기 위해 fBGn을 각기 다른 농도(0, 25, 50, 100, 200, 및 400㎍/㎖)로 사용하였다. 열 NIR 이미징 카메라를 사용하여 6분 동안 fBGn 용액의 온도 변화를 기록하였다. 6분 후 레이저광을 끄고, PTT 효능을 결정하기 위해 온도 감소를 기록하였다.
HeLa 세포와 표준 CCK-8 방법을 사용하여 시험관 내 세포독성을 조사하였다. 96-웰 플레이트에 세포를 접종(1x104 cells/well)하고 α-MEM 배지를 사용하여 세포가 부착되도록 24시간 동안 배양하였다. 이 세포에 약 4시간 동안 다양한 농도(0 내지 800㎍/㎖)로 fBGn을 다시 처리하였다. 레이저 조사는 808㎚로 5분간 실시하였고 이후 추가로 24시간 동안 배양하였다. 마지막으로, 표준 CCK-8 방법을 사용하여 세포의 상대적인 세포독성을 결정하였다.
1.6. fBGn의 PDT 효과의 진화
생물학적 시스템에서 일중항 산소종(1O2)을 결정하기 위해 표준 반응제로 고 반응성 포획제인 DPBF(1,3-Diphenylisobenzofuran)를 사용하였다. 본 실험에서, DPBF(100㎍/㎖) 용액 약 1㎖에 fBGn 나노입자를 첨가하고 빛이 없는 상태에서 10분 동안 소니케이션하였다. 이후 이 혼합물에 660㎚(80mW) LED 광을 조사하였다. UV 분광광도계를 사용하여 서로 다른 조사 시간에서 DPBF의 광학 흡수(408㎚)를 측정하였다.
조사된 빛의 영향으로 생성된 1O2 ROS를 검출하기 위해 ESR 스펙트럼 조사방법을 사용하였다. 1O2 및 O2-●(또는 OH●)의 포획제로 각각 TEMP(2,2,6,6-Tetramethylpiperidine) 및 DMPO(5,5-dimethyl-1-pyrroline N-oxide)를 사용하였다. 여기서, TEMP 또는 DMPO 용액에 fBGn 용액을 첨가하고, 빛이 없는 상태에서 10분 동안 소니케이션하였다. fBGn 샘플의 ESR 스펙트럼은 상온에서 LED 광의 조사 전 및 후에 측정하였다.
시험관 내 ROS의 존재를 확인하기 위해 ROS 분석 키트를 사용하였다. 암세포를 커버글라스 챔버에 접종하고 α-MEM 배지에서 약 24시간 동안 배양하였다. 이후 세포를 fBGn으로 4시간 동안 처리하고 DCFH-DA(2,7-dichloro-dihydro-fluorescein diacetate)로 추가 20분 동안 처리하였다. 행크스 완충 식염수로 세포를 세척하고 최종적으로 660㎚의 빛을 20분 동안 조사하였다. 이후 공초점 현미경을 사용하여 형광 이미지를 얻었다.
HeLa 세포를 사용한 표준 CCK-8 방법을 사용하여 시험관 내 fBGn의 세포독성을 조사하였다. 멸균 조건 하에서, 세포를 96-웰 플레이트에 접종(1x104 cells/well)하고 α-MEM 배지에서 세포가 부착되도록 24시간 동안 배양하였다. 이후 세포를 다양한 농도(0 내지 800㎍/㎖)의 fBGn으로 4시간 동안 처리하였다. 이후 세포에 660㎚ LED를 20분 동안 조사하고 추가로 24시간 동안 배양하였다. 최종적으로, 표준 CCK-8 방법을 사용하여 상대적인 세포독성을 결정하였다.
1.7. 시험관 내 PTT 및 PDT 결합 효과
fBGn의 PDT/PTT 효능의 조합을 조사하기 위해, 세포를 배양 플레이트에 접종하고 적합한 조건으로 α-MEM 배지에서 세포가 부착되도록 24시간 동안 배양하였다. 세포를 fBGn으로 4시간 동안 처리하고 각각 660㎚의 빛을 20분 동안, 808㎚의 레이저를 5분 동안 처리하였다. 처리 후, 세포를 Live/Dead 키트로 20분 동안 공동-염색하고 공초점 현미경으로 형광 이미지를 얻었다.
PDT 및 PTT 결합의 항종양 효과를 조사하기 위해, 빛이 존재하는 상태와 존재하지 않는 상태에서 HeLa 세포를 사용하여 fBGn의 세포독성을 조사하였다. 세포를 fBGn으로 4시간 동안 처리한 다음 각각 660㎚의 빛을 20분 동안, 808㎚의 레이저를 5분 동안 조사하였다. 배양 후, 표준 CCK-8 방법을 사용하여 상대적인 세포독성을 결정하였다.
1.8. 항암 약물의 적재 및 방출 시험
독소루비신(doxorubicin: DOX)은 일반적으로 사용되는 항암제이다. 이 DOX를 MSN 또는 fBGn 나노입자에 적재하기 위해, 24시간 동안 빛이 없는 상태에서 나노입자 1㎎을 각각 다른 농도(80, 100, 및 120㎍/㎖)의 DOX 1㎖에 첨가하였다. 이후, 용액을 원심분리하고 UV 분광광도계를 사용하여 484㎚에서 흡광도를 측정하였다. 이후 표준 스펙트럼 곡선을 사용하여 DOX 적재의 효능을 정량화하였다. DOX가 적재된 나노입자(MSN 및 fBGn)에서 DOX의 방출 곡선을 조사하기 위해, 37℃에서 다양한 시간 간격으로 두 가지의 다른 pH값(5.0 및 7.4)을 선택하였다. 혼합물을 원심분리하고 각 시간 간격에 대해 484㎚에서 상등액의 흡광도를 측정하고, 매 시점에 입자를 신선한 인산 버퍼에 재현탁하고, 최종적으로 표준 곡선을 사용하여 나노입자의 DOX 방출 효율을 정량화하였다.
1.9. 생체 내 바이오이미징 및 생물적합성
모든 동물실험은 대한민국과 단국대학교 동물 보호 연구위원회의 지침에 따라 수행하였다. 첫 번째 실험에서는, 국소투여를 실시하였고, fBGn 나노입자(100㎕, 2㎎/㎖ 식염수 내)를 암컷 누드 마우스의 몸체 우측 지역에 주사하였다. 이후 마에스트로 다중스펙트라 이미징 시스템을 사용하여 FI를 기록하였다. 두 번째 실험에서는 생체 내 생물적합성을 조사하기 위해 건강한 누드 마우스를 사용하였다. 마우스(n=3)의 꼬리 정맥을 통해 fBGn 용액을 서로 다른 투여량(5, 10, 및 20㎎/㎏)으로 정맥주사하였다. 추가로, 식염수를 대조군으로 사용하였다. 2주후 희생시켜 생물적합성 효과를 조사하고, 조직 샘플을 수집하였다. 수집한 심장, 폐, 간, 비장, 및 신장과 같은 내부 기관은 4% 포름알데히드에서 고정시켰고 파라핀에 포매하고 얇게 잘랐다. 이후 H&E로 염색하고 광학 현미경으로 조사하였다.
2. 결과
2.1. CD-관련 fBGn의 합성 및 이의 특성화
도 2a는 다중컬러 형광 fBGn의 제작을 나타내는 체계도이다. 열처리 후, 매트릭스 내 CD의 생성으로 인해 BGn은 형광 BGn(fBGn)으로 바뀌었다. 구형의 메조포러스 실리카 바이오글라스(BGn)를 형성하는 APTES의 존재 내에서 졸-겔 방법으로 fBGn을 제조하였다. 열처리 후, APTES는 다중컬러 형광 fBGn을 나타내는 실리카 바이오글라스 실리카 매트릭스 내에 CD를 생성하였다. APTES 함유 BGn 및 fBGn 샘플의 저- 및 고-배율 TEM 이미지를 도 2b에 나타내었다. 여기서 구형의 BGn 및 fBGn 모두 100±10㎚의 크기를 갖는다. fBGn 샘플에는 실리카 매트릭스 내부의 CD를 나타내는 구조 전체에 분포된 수많은 검은색 점이 있다. N2 흡착/탈착 히스테리시스 루프로 fBGn이 650m2/g의 BET 표면적, 0.637cm3/g의 공극 부피, 및 3.07㎚의 공극 크기를 갖는 것으로 나타났다. 이러한 높은 표면적 및 메조포러스 크기는 생물분자를 적재하기에 유용하다.
다음으로, fBGn 내 CD의 특성을 조사하였다. 첫 번째로, 도 3a와 같이 fBGn 샘플의 UV-vis 스펙트럼을 분석하였다. fBGn은 약 230 및 약 340㎚에서 2개의 피크를 나타냈고, 이는 π-π* 전자 전이의 sp2 도메인(C=C 본드) 및 n-π* 전자 전이의 비결합 산소 상태(C-O 본드)를 나타내는 것이다. 또한, 탄소-기반 나노재료들은 라만 스펙트럼에서 지문 영역 내에 특징적인 피크를 가지고 있다. 도 3b와 같이 fBGn가 갖는 두 개의 대표적인 라만 피크인 약 1400cm-1에서의 D 밴드 및 약 1600cm-1에서의 G 밴드는 각각 라만 진동 모드 sp3 및 sp2의 특징이다. 탄소 구조의 D 및 G 밴드는 각각 무정형 및 결정 특성을 갖는 무질서 또는 탄소-관련 결함을 나타낸다. 탄소 구조의 성질은 강도 비율 I D/I G에 의존한다. 다음으로, 도 3c와 같이 FT-IR 스펙트럼을 사용하여 화학적 구조를 분석하였다. fBGn은 Si-O 결합(465cm-1), Si-O-Si 대칭적 스트레칭(1095cm-1), C=C 스트레칭 진동(1414cm-1), N-H 진동(1560cm-1), C=O/C=N 스트레칭 진동, 및 C-O 스트레칭(880cm-1)을 나타내는 Si- 및 C-관련 밴드를 나타냈다. 추가로 화학적 구성, 구조, 및 결합 에너지를 와이드 스캔을 적용한 XPS를 사용하여 분석하였다. 도 3d와 같이 Si, Ca, C, N, 및 O의 결합 에너지를 보였다. 도 3e는 C 1s 스펙트라를 보이며 이는 메인 피크를 C-C, C-N, C=O, 및 O-C의 4개의 서브피크로 나누는 가우시안 방법을 사용하여 피팅한 것으로, sp2 본드의 그래파이트 구조를 나타낸다. 고-해상도 스캔, N 1s 스펙트라를 N-H, (C)3-N, 및 C-N의 3개의 피크로 분리하였고, 이는 질소가 대부분 탄소에 결합되어 있고 서로 다른 방출 센터가 서로 다른 로컬 에너지 상태를 생성함을 나타낸다(도 3f).
도 4a는 실리카-기반 글라스를 용해하고 TEM을 통해 CD를 관찰할 수 있도록 하기 위해 fBGn 샘플을 37% 플루오린화수소산(HF)으로 처리한 것을 나타낸다. TEM 이미지는 바이오글라스의 배경 분해와 함께 검은색 CD 나노입자를 보여준다(도 4a). 삽입도에서 CD의 크기는 약 1.6±0.4㎚였다. 고-배율 TEM 이미지는 각각 빨간색 및 노란색 써클로 표시한 것과 같이 CD가 결정 및 무정형 상 모두를 갖는다는 것을 보여준다(도 4b). 또한, HF 용액으로 처리하기 전 및 후의 fBGn의 형광 특성을 조사하였다(도 4c). 형광 강도는 HF 처리 전 및 후가 거의 같은 것으로 나타났다. 이는 강한 형광 특성이 실리카 매트릭스가 아닌 CD로 인한 것임을 나타낸다. 형광 발산에 대한 다른 가능성은 실리카 매트릭스 내에 존재하는 결정 결함으로 인한 것이다. 따라서 형광 매커니즘을 확인하기 위해 EPR 분광법을 사용하여 재료 내에 존재하는 결정 결함을 조사하였다. EPR 분광법은 재료 내 결정 격자 결함을 확인하기 위해 사용되는 매우 민감한 기술이다. 도 4d는 두 샘플이 모두 EPR 신호를 나타내지 않는다는 것을 보여주며 이는 재료가 실리카-실리카, 실리카-산소, 및 실리카-탄소 결함을 갖지 않는다는 것을 나타낸다. 이는 또한 형광의 기원이 CD로 인한 것임을 증명한다. 이러한 결과들을 바탕으로, 도 4e의 형광 매커니즘의 기원을 제안한다. CD는 여기 파장-의존적 방출의 가시적 다중형광의 전체 범위를 보여준다. 다색 형광은 표면 산화 엣지 상태, 무정형 영역, 표면 상태의 질소 패시베이션, 및 결정형 영역에 의존한다. 표면 산화 상태는 π 또는 n-도메인 결합 전자 전이 밴드 갭으로 변화하는 탄소 및 산소 밴드와 관련된다. 다중형광 특성은 주로 C-O, C=O, 및 O=C-OH 방출 모드에 의존하는 표면 상태 에너지에 의존적이다. 질소-함유 CD의 표면 에너지 상태는 패시베이팅 물질로 작용한다. 효과적인 이 그룹은 패시베이트된 상태를 달성하고 다중형광을 가능하게 하는데 사용된다.
2.2. 시험관 내 바이오이미징 및 CD 관련 fBGn의 다색 형광
도 5a는 다색 형광 fBGn을 위해 실리카 매트릭스 내에 CD를 형성하기 위한 250 내지 600℃ 범위의 서로 다른 온도로 열-처리된 BGn을 보여준다. λ ex 360㎚에서 PL(photo-luminescence) 측정을 사용하여 fBGn의 형광 특성을 조사하였다(도 5b). 제작한 샘플은 형광 특성을 갖지 않지만, 모든 열-처리한 샘플은 형광 특성을 나타내는 PL 곡선을 보였다. PL 곡선은 각각 428 내지 453, 469 내지 481, 및 511 내지 513㎚ 범위의 방출 파장을 갖는 P1, P2, 및 P3의 3개의 방출 피크를 보였다(도 5b 내지 c). 방출 파장의 변화는 fBGn을 열처리한 온도에 의존한다. 실리카 네트워크 내 CD의 최대 생성으로 인해 최대 피크 강도는 400℃(도 5d)로 관찰되었다. 보다 높은 온도의 열처리 후, CD는 실리카 매트릭스에서 완전히 연소되었다. 추가 실험을 위해 400℃의 샘플을 선택했다. 곡선의 다중피크를 가우시안 피크 분포를 사용하여 피팅하고, 특정 파수를 사용하여 3개의 피크의 면적을 계산하였다. P1, P2, 및 P3 방출 피크는 각각 10.04, 28.25, 및 61.71%의 면적을 갖는다. P3 방출 피크의 면적은 꽤 높았고 512㎚ 방출 파장에서 최대 형광을 나타냈다. 다음으로, fBGn을 다양한 파장으로 자극하고 도 5e와 같이 방출 피크의 강도를 2D 등고선도에 나타내었다. 방출의 최대 강도는 470 내지 550㎚ 범위로 관찰되었다. 2지수 데이터 및 계산된 6.8ns의 감쇠시간을 사용하여 500㎚에서 방출을 모니터링하여 수명 감쇠 프로파일을 측정하였다(도 5f). 먼저 fBGn 나노입자를 완충액에 분산시키고 PL 분광기를 사용하여 서로 다른 파장으로 자극하였다. 또한 제논광을 조사하여 해당 여기 파장으로 육안으로 fBGn의 전체-색 범위를 관찰하였다. 이 fBGn은 생물의학 분야에서 다중컬러 이미징에 사용될 수 있다. 효과적인 다색 이미징 물질로서 이러한 fBGn을 적용하는 것이 암세포를 사용하여 성공적으로 입증되었다. 먼저, HeLa 암세포를 배양 플레이트에 접종하고 fBGn을 두 가지의 다른 농도(50 및 100㎍/㎖)로 약 24시간 동안 세포에 처리하였다. 이후, 살아있는 암세포를 CLSM을 사용하여 각각 블루(405㎚), 그린(454㎚), 및 레드(546㎚)의 3가지의 서로 다른 여기 파장 하에서 관찰하였다. fBGn이 서로 다른 색을 방출하면서 세포질 내에 존재하는 것을 관찰하였다. fBGn의 농도가 증가하면 더 많은 fBGn 입자의 존재로 인해 형광 강도 또한 증가하였다. 따라서 이러한 fBGn 재료는 생물의학 분야에서 다중컬러 바이오이미징에 사용될 수 있다.
2.3. 바이오이미징을 위한 TP 분광법에 CD 관련 fBGn의 적용
TP 형광 분광법을 사용하여 800㎚의 NIR 파장 하에서 fBGn의 다른 독특한 특성을 조사하였다. NIR 파장을 사용한 TP 분광법은 세포 이미징 및 암 치료와 같은 생물의학에 적용하기 위해 폭넓게 사용된다. NIR 레이저광은 부드러운 조직에서 흡수 특성이 낮기 때문에 가시광에 비해 조직 깊숙이 쉽게 침투할 수 있다. 일-광자 및 TP 분광법과 같은 두 가지의 분광기술을 사용하여 fBGn을 두 가지의 파장(450 및 800㎚)으로 자극하였다. 두 여기 파장에서 유사한 방출 경향을 관찰하였다. 800㎚의 여기 파장을 사용하여 서로 다른 온도 범위에서 fBGn의 TP 방출 스펙트럼을 조사하였다. 도 6a의 TP 방출 강도는 강한 방출 피크가 약 500㎚에서 관찰되었음을 보여주지만, 형광 강도는 fBGn이 제조된 온도에 의존적이다. 실리카 네트워크 내 CD의 최대 생성으로 인해 PL 분광법에서와 유사하게 fBGn 샘플의 높은 TP 방출 강도가 400℃에서 관찰되었다. 고온 열처리 후, CD는 실리카 매트릭스로부터 완전히 연소되었다. 레이저광의 여기 파장을 800에서 600㎚로 변화시켰을 때, 400℃ fBGn의 방출 강도는 레이저광의 여기 파장이 감소됨에 따라 동일한 위치에서 방출 피크와 함께 감소하는 것으로 나타났다(도 6b). 또한 글라스 슬라이드 상에서 녹색으로 나타나는 fBGn의 TP 스펙트라 이미지를 분석하였다(도 6c). 이렇게 이 fBGn 시스템은 TP 분광법에 의한 세포 이미징, 심조직 이미징, 및 암 테라노스틱스에서의 미래의 생물학적 적용을 보여준다.
2.4. 라만 분광 이미징을 위한 CD-관련 fBGn
탄소-기반 나노재료는 질환의 검출 및 진단을 돕는 암 테라노스틱스 및 세포 이미징을 위해 가장 폭넓게 사용된다. 최근 연구는 뛰어난 공간 해상도를 보이는 형광, TP, 및 RI와 같은 기술이 세포 이미징에 효과적으로 사용될 수 있음을 보여준다. RI는 FI에 비해 장-기간 모니터링에 안정적이다. CNT, GO, 및 CD와 같은 탄소-기반 나노재료들은 라만 스펙트라에서 특징적인 지문 영역을 갖는다. 본 연구에서, 세포를 약 6시간 동안 fBGn에 노출시키고 수집하였다. 세포 현탁액의 한 방울을 실리콘 웨이퍼 위에 놓았다. 도 7a는 레이저빔과 세포의 단일 방울의 구형 모양을 선명하게 나타낸다. 514㎚ 레이저빔을 사용하고, fBGn 나노입자를 이후 특징적인 방출로 인해 배경에서 빨간색으로 보이는 이 파장으로 자극하였다. 도 7b는 이러한 결과가 PL 측정 및 공초점 이미지 연구와 거의 일치한다. 배경을 제거한 후, fBGn는 도 7c와 같이 빨간색으로 보인다. 또한 세포의 광학 이미지를 얻었다(도 7d). 두 개의 전형적인 라만 피크를 갖는 BGn은 도 7e의 삽입부분에 나와 있고, 여기서 D(1330cm-1) 및 G(1595cm-1) 밴드는 탄소 구조에서 라만 진동 모드의 특징이다. 세포 스캔 탐침으로 G 진동 밴드를 사용하였고 최종 이미지는 도 7e의 세포 라만 이미지이다. 레이저 조사 파워를 증가시킴에 따라 G 밴드의 피크 강도 증가로 인해, 라만 신호가 현저하게 향상되는 것으로 나타났다(도 7f). 따라서 라만 이미지 신호는 레이저 빔의 강도와 fBGn의 농도에 크게 의존하는 것으로 생각된다. 이는 fBGn이 세포의 FI 대신 RI를 위해 사용되었음을 나타낸다.
2.5. 상승적 암 요법에서 CD-관련 fBGn의 PTT 및 PDT 효과
PTT 효과는 탄소-기반 나노재료가 보이는 가장 일반적인 특성 중 하나이다. fBGn의 수용액은 레이저광(808㎚)을 최대 600초까지 조사하였을 때 다른 fBGn 농도에서 다른 온도를 보였다(도 8a). 수용액의 온도는 25 내지 400㎍/㎖ 범위의 fBGn 농도에서 7.6에서 38.6℃로 증가하였고, 이는 ΔT 약 2.4℃를 보이는 나노입자가 없는 물에 조사한 경우에 비해 유의적인 것으로 간주된다(도 8b). 다음으로, 시간-의존적 온도 곡선을 fBGn 수용액이 안정 단계의 온도에 도달할 때까지 기록하고 상온까지 식혔다. 가열-냉각 데이터를 기반으로, PTT 효능을 계산하기 위해 PTT 전환식을 사용하였다. 얻은 PTT 효능은 가열-냉각 데이터를 기초로 약 32.4%였고, 이는 이전의 보고와 유사하였다. 이에 덧붙여, 808㎚ 파장의 레이저광을 사용하여 600초 동안 조사한 후 서로 다른 fBGn의 농도에서 fBGn 수용액의 NIR 이미지를 기록하였다(도 8c). 또한 fBGn의 PTT 효능을 정량적으로 조사하고 독성 연구를 실시하였다. 도 8d와 같이, HeLa 세포의 세포독성은 레이저광 조사 하에서 농도가 증가함에 따라 감소한 반면, fBGn의 정량적인 PTT 효능은 바이오글라스에 CD가 존재함에 따른 암세포 파괴 능력이다. CD는 레이저광 조사 하에서 암세포를 효과적으로 죽이기 위해 충분한 열 에너지를 생산하였다.
LED광(660㎚) 조사 상에서 1O2 ROS 방출에 따른 fBGn의 PDT 능력을 시험관 내에서 조사하기 위해 ESR 분광법을 사용하였다. 생산된 1O2 또는 OH●는 각각 알맞은 스핀 트래핑 물질인 TEMPO 및 BMPO를 사용하여 검출하였다(도 8e). ESR 스펙트럼과 같이, TEMPO는 LED광 조사 하에서 fBGn 내 1O2 신호를 유도하였고 어두운 곳에서는 1O2 신호가 생성되지 않았다. 따라서 BMPO는 fBGn으로 다른 ROS 신호를 생성했기 때문에 어떠한 신호도 검출하지 못했다. 이러한 결과는 레이저광의 존재 하에서 1O2를 생산하는 fBGn의 능력을 보여주며 다른 ROS는 검출되지 않았다. 또한, fBGn에 의한 1O2 신호 생성을 형광 분자인 DPBF를 1O2 신호의 흡수를 위한 트래핑 물질로 사용하는 화학적 트래핑 방법으로 확인하였다. 도 8f와 같이, 광 조사 하에서 1O2와 반응한 DPBF의 분해로 인해 408㎚에서 fBGn의 DPBF 흡수 강도가 LED 광 노출 기간이 증가함에 따라 점차 감소하였다. 이러한 결과는 LED광의 존재 하에서 1O2를 생성하는 fBGn의 능력을 나타낸다. 1O2 생성 비율 또는 양자 수율을 DBPF 흡수 및 조사 시간의 선형 피팅으로 계산하였다. 1O2 양자 수율은 0.86으로 이전 보고와 유사하였다. 또한, ROS 분석 키트를 사용하여 HeLa 암세포에서 fBGn의 1O2 ROS 수준 검출을 분석하였다. 도 8g와 같이, fBGn으로 처리한 HeLa 세포는 LED광 하에서 강화된 녹색 형광을 보였다. 반대로, fBGn이 없는 경우에는 녹색 신호가 검출되지 않았다. fBGn 나노입자가 형광을 나타내기 때문에 fBGn의 존재 하에서 녹색 형광을 관찰하였지만, 이 형광은 LED광 조사에 따른 형광과 비교하여 세포질 내에서 동일하게 관찰되지 않았다. 1O2 ROS는 광 조사 하에서 HeLa 암세포 내에 생산된다. 따라서 모든 시험관 내 PDT 결과들은 광 조사 하에서 fBGn에 의해 1O2 ROS가 방출됨을 나타낸다. 또한, fBGn의 PDT 효능을 정량적으로 분석하고 세포독성 시험을 실시하였다. 도 8h와 같이, 레이저광 조사 상에서, fBGn의 농도가 증가함에 따라 HeLa 세포의 생존력이 감소하는 것으로 나타난 반면, fBGn의 유의적인 PDT 효능은 바이오글라스 내 CD의 존재로 인해 암세포를 효과적으로 죽일 수 있다. CD는 808㎚의 광 조사 하에서 암세포를 효과적으로 죽이기에 충분한 1O2 ROS를 생산하였다.
LIVE/DEAD 분석법을 사용하여 시험관 내에서 fBGn에 따른 HeLa 암세포 상의 PDT/PTT 결합 치료 효과를 조사하였다(도 8i). 이 HeLa 세포를 칼세인-AM(그린) 및 PI(레드)로 공동-염색하는 방법은 살아있는 세포와 죽은 세포를 구별하기 위해 사용할 수 있다. 3개의 군에서(세포, fBGn, 및 광 조사), 모든 세포가 생존하여 녹색 형광을 나타냈기 때문에 세포의 사멸은 관찰되지 않았다(적색 형광 없음). 하지만, fBGn을 처리한 세포는 조사가 없는 상태에서 세포 내 fBGn의 자발-형광을 보였다. 이러한 결과는 세포 배지 또는 물이 광 조사 하에서 세포 사멸을 유도하는 1O2 ROS를 생성하는 능력을 갖지 않는다는 것을 나타낸다. 660㎚ LED광(PDT) 또는 808㎚ 레이저(PTT) 조사가 암세포를 효과적으로 죽이는데 충분한 1O2 ROS 또는 열 에너지의 생성을 초래하기 때문에 HeLa 세포는 660㎚ LED광(PDT) 또는 808㎚ 레이저(PTT) 조사 및 fBGn의 존재 하에서 파괴되었다. PDT 및 PTT를 별도로 적용한 경우와 비교하였을 때 PDT/PTT 요법의 결합에 의해 세포 사멸율이 급격히 증가하였다. 적색 형광의 강도가 유의적으로 증가하였으며, 이는 완전한 세포 사멸을 나타낸다. fBGn의 PDT/PTT의 결합은 광 조사 하에서 암세포를 효과적으로 죽일 수 있다. 추가로 LIVE/DEAD 분석법으로부터 fBGn의 PDT/PTT 효능을 정량적으로 조사하였다. 도 8j와 같이, HeLa 세포가 있고 fBGn이 없는 경우의 시험관 내 PDT/PTT는 광 조사 하에서 세포 생존력 감소를 보이지 않았다. 하지만, 파장 660㎚ 광(PDT) 또는 808㎚ 레이저(PTT)에 노출되었을 때 HeLa 세포의 생존력 감소가 관찰되었다. PDT/PTT의 결합은 다른 처리 군과 비교하여 유의적인 세포 생존력 감소를 보였다. fBGn의 PDT/PTT 결합으로 강화된 효능은 광 조사 하에서 암세포를 효과적으로 파괴하였다. 관찰된 최대 세포 사멸은 결합 요법에서 fBGn의 높은 치료 능력을 나타낸다.
2.6. 화학요법을 위한 항암제 적재 및 제어된 전달
암세포를 파괴하기 위한 다른 중요한 방법은 화학요법에서 항암제의 효율적이고 표적화된 전달이다. 약물의 작은 손실없이 표적 부위로 약물을 운반하는 능력 및 나노입자의 구조는 특이 부위 물질 전달을 위한 효과적인 메조포러스 나노입자를 개발하는데 중요하다. 이를 달성하기 위해, 메조포러스 구조를 갖는 fBGn을 항암제 적재 및 제어된 전달을 위해 사용하였다. 도 9a는 MSN 및 fBGn의 약물 적재 효능을 보여준다. 실리카 격자 내에 Ca2+ 이온이 없는 MSN을 대조군으로 사용하여 fBGn의 적재 효능을 비교하였다. MSN 및 fBGn의 메조포러스 특성은 이들의 제조 방법이 유사하기 때문에 거의 같았다. 이것을 양전하를 띄고 fBGn의 음전하와 정전기적으로 상호작용할 수 있는 항암제인 DOX의 적재를 위해 사용하였다. DOX를 fBGn의 메조공극 내에 캡슐화하였다. 80, 100, 및 120㎍/㎖의 3가지의 서로 다른 농도를 선택하였다. fBGn(1㎎)을 각 농도로 약 24시간 동안 첨가하였다. 농도가 증가함에 따라 적재량이 증가하는 것으로 나타났다. fBGn 및 MSN의 적재 효능은 각각 약 92 및 67%였으며, 이는 fBGn이 MSN에 비해 더 높은 효능을 갖는다는 것을 나타낸다. 적재 효능은 Ca2+ 이온으로 인해 유의적으로 개선되었다(도 9b). 도면은 Ca2+ 이온으로 인한 더 높은 약물 적재 및 제어된 방출을 명확하게 보여준다. DOX 분자는 Ca2+ 이온 및 Si-OH 그룹과 두 가지 유형의 정전기적 상호작용을 나타낸다. 이것이 fBGn이 Ca2+ 이온이 없는 MSN과 비교하여 더 높은 약물 적재능을 갖는 주요 이유이다. 추가로, pH(7.4 및 5.0) 조건에서 fBGn으로부의 약물 방출을 조사하였다. 종양세포의 환경은 pH 범위 4.0 내지 5.8의 다소 산성이며 이는 pH-의존적 방출이 치료적 전달을 위한 주요 요인임을 나타낸다. 나노입자들은 pH 4.0 내지 5.8의 약산성인 암세포 내 엔도솜 및 리소솜 내에 받아들여졌다. 도 9c는 두 가지의 서로 다른 pH 하에서 48시간 동안 fBGn과 MSN으로부터의 약물 방출을 보여준다. Ca2+ 이온과 약물 분자 사이의 강한 결합으로 인해 MSN이 산성 조건 하에서 fBGn에 비해 더 많은 약물 방출을 보였다. 약물 분자는 일반 조건에 비해 산성 조건 하에서 빠르게 방출되었다. 이는 fBGn이 Ca2+ 이온의 효과로 인해 암 화학요법에 사용될 수 있는 더 높은 적재 효능 및 제어된 약물 방출 특성을 갖는다는 것을 나타낸다. 추가로 CCK-8 분석법을 사용한 세포독성 시험으로 HeLa 세포로의 약물 분자 전달을 조사하였다. HeLa 세포를 서로 다른 농도의 fBGn, DOX, 및 fBGn-DOX로 24시간 동안 처리하였다. 도 9d와 같이, fBGn의 농도 320㎍/㎖까지 HeLa 세포 상의 유의적인 세포 독성 효과는 나타나지 않았다. 5 내지 40㎍/㎖의 농도 범위에서 프리 DOX는 fBGn-DOX에 비해 약간 더 낮은 세포 독성을 나타냈다. 처음 24시간 내, fBGn-DOX의 약물 방출은 임의의 특정 농도에서 세포를 파괴하기에 충분하지 않았다. 반대로, fBGn-DOX의 농도(80 내지 640㎍/㎖)는 프리 DOX에 비해 더 높은 세포 생존력을 보였으며 이는 fBGn-DOX 약물 방출이 암세포를 파괴하기에 충분하였다는 것을 나타낸다. 이러한 fBGn 기반 제어된 방출은 가까운 미래에 암 화학요법을 위해 사용될 수 잇다.
2.7. 생체 내 이미징 및 생물적합성
FI는 암의 위치를 진단하는 과정에서 관찰 및 실시간 이미징을 위해 가장 중요하게 요구되는 것 중 하나이다. fBGn을 식염수에 현탁하고 누드 마우스 모델에서 생체 내 이미징을 위해 사용하였다. 첫 번째로, 상응하는 여기 파장 하에서 fBGn의 방출 이미지를 관찰하였다. 이 결과는 fBGn이 다색 형광을 갖는다는 것을 나타낸다. fBGn의 국소 주사로 누드 마우스에서 형광 이미지를 검출하였다. 이 결과는 fBGn이 실시간 이미징 및 광치료를 위한 뛰어난 특성을 가지며 효과적인 암 치료를 위해 사용될 수 있음을 나타낸다.
fBGn 나노입자의 임상적 가능성을 결정하기 위해 생체 내 적합성을 사용하였다. 다양한 투여량(0, 5, 10, 및 20㎎/㎏)을 사용한 fBGn의 생체 내 생물적합성을 누드 마우스에 IV 주사로 평가하였다. 2주 후, 마우스를 희생시키고 주요 기관의 조직을 수집하였다. 이후 H&E 염색법을 사용하여 생물 적합성을 분석하였다. 다양한 투여량의 fBGn은 대조군인 식염수에 비교하여 유의적인 차이를 보이지 않았다. fBGn 나노입자는 거의 모든 기관에서 높은 조직적합성을 보였다.
도 1c는 fBGn이 FI, RI, TP FI에서 실시간 테라노스틱 적용, 제어된 약물 전달, 결합된 PTT 및 PDT 시너지 암 요법과 같은 다양한 생물의학적 적용에 사용될 수 있음을 보여준다. 다중모드 이미징을 사용한 광요법은 의료 분야에서 유망한 전략이며 이는 암 위치의 실시간 관찰 및 암세포의 광-유도 파괴와 같은 이점에 따른 종양 요법의 질을 유의적으로 개선할 수 있다.
상기에서는 본 발명을 특정의 바람직한 실시예에 관련하여 도시하고 설명하였지만, 이하의 특허청구범위에 의해 마련되는 본 발명의 기술적 특징이나 분야를 이탈하지 않는 한도 내에서 본 발명이 다양하게 개조 및 변화될 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백한 것이다.

Claims (10)

  1. a) 브롬화 세틸트리메틸암모늄, 2-메톡시에탄올, 에탄올 및 암모니아수를 물에 용해시켜 혼합물을 준비하는 단계;
    b) 상기 혼합물에 질산칼슘, 테트라에틸 오르소실리케이트 및 3-아미노프로필 트리에톡시실란을 첨가하고 교반하는 단계;
    c) 상기 첨가 및 교반으로 생성되는 입자를 수득하는 단계; 및
    d) 상기 입자를 350 내지 450℃로 열처리하는 단계;를 포함하고,
    상기 a)단계에서, 상기 물 150㎖을 기준으로 상기 브롬화 세틸트리메틸암모늄 0.5 내지 2g, 상기 2-메톡시에탄올 10 내지 30㎖, 상기 에탄올 5 내지 15㎖, 상기 암모니아수 1 내지 3㎖을 용해시키는 것을 특징으로 하는 메조포러스 바이오글라스 나노입자 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 2-메톡시에탄올은 20㎖, 상기 에탄올은 10㎖을 용해시키는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항 또는 제2항의 제조방법으로 제조된 메조포러스 바이오글라스 나노입자.
  6. 제5항의 나노입자를 포함하는 약물 또는 생체분자 전달용 조성물.
  7. 제5항의 나노입자를 포함하는 생체 이미징용 조성물.
  8. 제5항의 나노입자를 유효성분으로 포함하는 광역학 치료용 광감작제 조성물.
  9. 제5항의 나노입자를 유효성분으로 포함하는 광열 치료용 광열제 조성물.
  10. 제5항의 나노입자를 유효성분으로 포함하는 테라노스틱스용 조성물.
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