KR101917932B1

KR101917932B1 - 밀줄무늬 모자이크 바이러스 진단용 lamp 프라이머 세트 및 이를 포함하는 진단 키트

Info

Publication number: KR101917932B1
Application number: KR1020160173795A
Authority: KR
Inventors: 장원철; 노재영; 김진호; 이시원; 이진영; 전승훈; 최영훈
Original assignee: 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단
Priority date: 2016-12-19
Filing date: 2016-12-19
Publication date: 2018-11-12
Also published as: KR20180071054A

Abstract

본 발명은 밀줄무늬 모자이크 바이러스를 진단하기 위한 LAMP 프라이머 세트 및 이를 포함하는 진단 키트에 관한 것으로서, 4개의 프라이머로 이루어진 LAMP 프라이머 세트를 제공한다. 본 발명의 프라이머 세트는 밀줄무늬 모자이크 바이러스로 알려진 모든 계통주와 반응하는 반면, 다른 종의 바이러스와는 반응하지 않으므로 종 특이성이 높으며, 본 발명의 진단 키트는 고가의 전문 장비 없이 유전자 증폭이 가능하므로 신속하고 간단하게 밀줄무늬 모자이크 바이러스를 진단할 수 있다.

Description

밀줄무늬 모자이크 바이러스 진단용 LAMP 프라이머 세트 및 이를 포함하는 진단 키트{LAMP PRIMER SET FOR DIAGNOSING WHEAT STREAK MOSAIC VIRUS AND DIAGNOSTIC KIT INCLUDING THE SAME}

본 발명은 밀줄무늬 모자이크 바이러스 진단용 LAMP 프라이머 세트, 진단 키트 및 이를 이용한 밀줄무늬 모자이크 바이러스 진단방법에 관한 것이다.

숙주세포를 감염시켜 증식하는 바이러스 중에서, 식물을 숙주로 하는 바이러스를 식물 바이러스라고 한다. 식물 바이러스는 많은 식물체에 병을 유발하고 각종 농작물과 화훼류의 생산량 및 품질저하와 품종퇴화 등 농업생산 전반에 걸쳐 심각한 경제적 피해를 주고 있다. 특히 최근에는 식량 및 각종 식물체 등의 국제 교역량이 증가되면서 국내에 존재하지 않던 외국의 병원성 식물 바이러스까지 유입되어 그로 인한 피해가 점차 심해지고 있는 추세이다. 이 때문에 재배식물에 대한 바이러스의 예방, 치료, 검역은 농업에서 중요한 과제이다.

바이러스를 진단할 수 있는 방법으로 종래에는 전자현미경 방법과 혈청학적 방법(ELISA)이 주로 사용되었다. 하지만, 전자현미경 방법으로는 바이러스의 존재 자체는 확인할 수는 있지만 구체적으로 바이러스가 어떠한 종인지를 진단하기는 불가능하였으며, 혈청학적 방법인 ELISA는 PCR 진단법보다 검출감도가 약 1,000배 정도 낮고 항체와 검사시료의 비특이적 반응으로 진단의 신뢰성이 낮다는 문제점이 있었다.

최근에는, 이러한 문제점을 해결하고자 높은 검출감도와 편리성을 가지고 있는 RT-PCR 방법이 식물 바이러스 진단을 위하여 가장 널리 사용되고 있다. 예를 들면, 대한민국(농림축산식품부 농림축산내부본부)의 등록특허 제10-1509651호는 RT-PCR 및 nested PCR의 결합 방법으로 밀줄무늬 모자이크 바이러스를 검출하는 방법을 제시하였다.

그러나, PCR은 반복적으로 온도를 변화시켜야 하므로 중합효소연쇄반응기(Thermocycler)와 같은 전문적인 장비 및 이를 운용할 수 있는 전문 인력이 요구되며, 이러한 일련의 과정들은 수행하는데 있어서 많은 시간이 소요되므로 분석 장비가 갖춰지지 않은 현장에서의 활용력은 현저히 떨어진다.

또한, PCR 방법을 사용하더라도, 특이적 반응의 강도가 낮아서 판별이 곤란하거나, 다른 핵산과의 비특이적 반응이 일어나는 경우를 대비하여, 병원체별 진단용 프라이머 은행을 구축하거나 PCR의 양성 반응과 음성 반응을 검정할 수 있는 시스템을 마련하는 것이 요구된다.

이에 비하여, 등온증폭법(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)은 기존의 PCR 방법과 유사하지만, 유전자를 증폭하는 동안 온도의 변화를 필요로 하지 않기 때문에 전문장비 없이 손쉽게 고정된 온도에서 유전자 증폭이 가능하므로, 항온수조와 같은 간단한 기구만 필요하며 1시간 이내에 검출을 할 수 있다는 장점이 있다. 등온증폭법을 위한 프라이머 세트는 각각 한 쌍의 내부 프라이머 및 외부 프라이머로 구성되며, 반응시 첨가되는 Bst . DNA 중합효소(DNA polymerase) 또한 높은 활성을 가지고 있기 때문에 검출 방법으로 활용도가 높다.

본 발명의 목적은 밀줄무늬 모자이크 바이러스(Wheat streak mosaic virus; WSMV) 종 내에 존재하는 모든 계통주 내지 분리주를 검출할 수 있는 종 특이적 프라이머 세트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 밀줄무늬 모자이크 바이러스 종 특이적 프라이머 세트를 포함하는, 밀줄무늬 모자이크 바이러스 진단 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 밀줄무늬 모자이크 바이러스 종 특이적 프라이머 세트를 이용하여, 밀줄무늬 모자이크 바이러스를 진단하는 방법을 제공하는 것이다.

그러나, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 해당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

일 실시예에 따르면, 서열번호 1 내지 4의 염기서열을 포함하는, 밀줄무늬 모자이크 바이러스(Wheat streak mosaic virus; WSMV) 진단용 프라이머 세트가 제공된다.

일 실시예에 따르면, 상기 프라이머 세트를 포함하는, 등온증폭 반응용 프라이머 조성물이 제공된다.

일 측에 따르면, 상기 등온증폭 반응용 프라이머 조성물은 등온증폭 반응용 DNA 중합효소, 복수의 dNTP 및 반응버퍼를 더 포함할 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 프라이머 세트를 포함하는, 밀줄무늬 모자이크 바이러스 진단용 키트가 제공된다.

일 측에 따르면, 등온증폭 반응용 DNA 중합효소, 복수의 dNTP 및 반응버퍼를 더 포함할 수 있다.

일 측에 따르면, 상기 밀줄무늬 모자이크 바이러스는 진뱅크 접근번호(GenBank accession number) NC_001886.1, AF285169.1, EU914918.1, EU914917.1, AF511643.2, AF511630.2, AF511619.2, AF511618.2, AF511615.2, AF057533.1, AF511614.2, FJ348359.1, FJ348358.1, AF454455.1, AF454454.1 및 AF285170.1로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.

일 실시예에 따르면, 식물시료로부터 RNA를 추출하는 단계; 상기 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계; 상기 cDNA를 주형으로, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 60℃ 내지 65℃에서 등온증폭법(LAMP)으로 표적 서열을 증폭시키는 단계; 및 증폭 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 밀줄무늬 모자이크 바이러스의 진단방법이 제공된다.

일 측에 따르면, 상기 증폭 산물을 검출하는 단계는 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인관 측정을 통해 수행될 수 있다.

본 발명의 밀줄무늬 모자이크 바이러스(WSMV) 진단용 프라이머 세트는 밀줄무늬 모자이크 바이러스로 알려진 모든 계통주 내지 분리주와 반응하는 반면, 다른 종의 바이러스와는 반응하지 않으므로 종 특이성이 높으며, 기존의 항혈청을 이용한 진단법보다 1,000배 이상의 검출한계를 가지고 바이러스를 진단할 수 있다.

또한, 본 발명의 프라이머 세트는 등온증폭법에서 사용되므로, 고가의 전문 장비 없이 유전자 증폭이 가능하며 높은 특이성으로 밀줄무늬 모자이크 바이러스를 검출할 수 있다.

본 발명의 프라이머 세트를 포함하는 진단 키트를 이용하여 빠르고 간단하면서도 정확하게 밀줄무늬 모자이크 바이러스를 진단할 수 있으므로, 밀줄무늬 모자이크 바이러스로 인한 농가의 경제적 손실을 방지할 수 있으며, 외국으로부터 수입되는 식물체 중에서 WSMV에 감염된 식물체와 종자의 유입을 사전에 효과적으로 차단할 수 있다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 밀줄무늬 모자이크 바이러스에 감염된 식물체의 증상을 나타낸 사진이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 이용하여 LAMP를 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 이용한 LAMP 반응 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트의 외부 프라이머 증폭 산물을 나타낸 것이다.
도 5는 종래의 PCR로 증폭된 산물을 나타낸 것이다.

이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 각 도면에 제시된 동일한 참조 부호는 동일한 부재를 나타낸다.

아래 설명하는 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있다. 아래 설명하는 실시예들은 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 이들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

실시예에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 실시예를 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조 부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

밀줄무늬 모자이크 바이러스(Wheat streak mosaic virus; WSMV)는 1937년에 최초로 보고되었으며 캐나다, 체코, 헝가리, 이란, 요르단 등 북아메리카 지역에서 주로 발생하는 바이러스이다. 분류학적으로 WSMV는 Group IV(+) sense ssRNA viruses, Potyviridae과 Tritimovirus속으로 분류된다.

도 1은 밀줄무늬 모자이크 바이러스에 감염된 식물체의 증상을 나타낸 사진이다. WSMV는 식물병원성 바이러스로 주로 혹응애(eriophyid mite, Wheat curl mite; Aceria tosichella) 약충 및 성충에 의해 감염되며, 일부 종자전염(0.1-0.2%)이 보고되어 있다. 봄밀(Spring wheat)보다 겨울밀(Winter wheat)에서 더 많이 감염되는 것으로 알려져 있다. 초봄에 기온이 10℃ 이상일 경우 증상이 나타나며, 감염된 식물체에서는 생장저해, 수량 감소, 모자이크, Rosette 증상이 나타난다(도 1).

WSMV는 밀 이외에도 귀리(Avena sativa), 보리(Hordeum vulgare) 호밀(Secale cerale), 옥수수(Zea mays), 수수(Sorghum vulgare), 기장(Panicum, Setaria, and Echinochloa spp.) 등의 단자엽 식물을 기주(host)로 활동한다.

WSMV는 직경 15㎚, 길이 700㎚의 선형 바이러스로, RNA 유전체(genome)는 350 kDa 크기의 ORF를 암호화한다. P1(41.2 kDa), HC-Pro(44.9 kDa), Nla(49.9 kDa) 유전자가 단백질분해효소(proteinase)를 생성하고, Nlb(58.5%) 유전자가 RNA 중합효소(polymerase)를 생성하는 것으로 알려져 있다.

본 발명은 밀줄무늬 모자이크 바이러스(WSMV)의 전체 유전체(complete genome)를 대상으로 설계된 진단용 프라이머에 관한 것으로, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 서열번호 1 내지 4의 염기서열을 포함하는, 밀줄무늬 모자이크 바이러스(Wheat streak mosaic virus; WSMV) 진단용 프라이머 세트가 제공된다.

밀줄무늬 모자이크 바이러스 종 내에는 염기서열이 미세하게 상이한 계통주(strain) 또는 분리주(isolate)들이 존재한다. 분리주에만 특이적인 프라이머를 사용할 경우는 진단에 실패할 위험이 있으므로, 바이러스 진단용 프라이머는 특정 계통주, 분리주가 아닌 바이러스 종 전체에 특이적으로 작동하는 것이 중요하다.

따라서, 밀줄무늬 모자이크 바이러스(WSMV) 종으로 지금까지 알려진 염기서열을 수집하여, 종의 모든 계통과 분리주가 가지고 있는 공통염기서열을 탐색하고, 이 공통염기서열 중에서 다른 종의 바이러스와 유연관계가 있는 염기서열을 프라이머 설계 대상에서 제외시킴으로써 종 특이적 서열을 선발하였다.

선발된 종 특이적 서열을 전문장비 없이 빠른 시간 내에 효과적으로 검출할 수 있도록, 등온증폭법(loopmediated isothermal amplification, LAMP)에 사용되는 프라이머 세트를 상기 종 특이적 서열에 대하여 디자인하였다(실시예 1 참조).

등온증폭법은 기존의 PCR(polymerase chain reaction)과 달리 유전자를 증폭하기 위한 온도조절을 필요로 하지 않기 때문에 전문장비 없이 유전자를 증폭할 수 있으며 단시간 내에 고농도의 유전자 증폭이 가능하다. 등온증폭법을 이용하기 위해서는 4개의 프라이머(F3, B3, FIP, 및 BIP)가 하나의 세트로 작용하여야 한다. 이 중 F3와 FIP는 유전자의 5' 방향에 결합하는 프라이머이고, B3와 BIP는 3' 방향에서 역방향으로 결합하는 프라이머이다. 또한, FIP와 BIP는 F2(혹은 B2)와 F1c(혹은 B1c)의 염기서열을 포함하도록 하는 프라이머이다.

일 측에 따르면, 상기 등온증폭 반응용 프라이머 조성물은, 등온증폭 반응용DNA 중합효소, 복수의 dNTP 및 반응버퍼를 더 포함할 수 있으며, 상기 등온증폭 반응용 프라이머 세트 또는 이를 포함하는 조성물은 밀줄무늬 모자이크 바이러스 검출을 위한 진단용 키트에 포함될 수 있다.

상기 프라이머 세트는 밀줄무늬 모자이크 바이러스로 알려진 염기서열을 분석한 후, 종 특이적인 서열에 대해 작동하도록 디자인 되었으므로, 상기 진뱅크 접근번호에 개시된 염기서열을 갖는 밀줄무늬 모자이크 바이러스를 검출할 수 있다.

일 실시예에 따르면, 식물시료로부터 RNA를 추출하는 단계; 상기 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계; 상기 cDNA를 주형으로, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 60℃ 내지 65℃에서 등온증폭법(LAMP)으로 표적 서열을 증폭시키는 단계; 및 증폭 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 밀줄무늬 모자이크 바이러스의 진단방법이 제공된다. 일 측에 따르면, 상기 증폭 산물을 검출하는 단계는 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인관 측정을 통해 수행될 수 있다.

본 발명의 LAMP 프라이머는 종 특이적 염기서열로부터 디자인된 프라이머로서, 실제적인 RNA를 주형으로 상보적 DNA(cDNA)를 합성하고 대상 바이러스 이외의 핵산과는 비 특이적 반응이 없고, 대상 바이러스에 대해서는 검출력이 우수하다. 또한, 본 발명의 LAMP 프라이머를 이용한 반응은, 반응의 조건을 모든 바이러스 및 프라이머 조합에서 동일하게 하여 검출의 효율을 높일 수 있도록 설계되었다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적으로 기술된 것으로서, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 종 특이적 서열 탐색 및 프라이머 디자인

LAMP 검사법 개발 대상인 밀줄무늬 모자이크 바이러스(Wheat streak mosaic virus; WSMV)와 참고 바이러스 주(유사염기서열 및 동일 기주 감염 바이러스)의 염기서열을 NCBI(National Center for Biotechnology Information)로부터 확보하였다. 구체적으로 WSMV의 16가지 계통주(strain)와 대조군으로 오이 모자이크 바이러스(Cucumber mosaic virus; CMV)의 3종류 RNA(RNA1, RNA2 및 RNA3)를 포함하는 1종의 염기서열을 확보하였다.

하기 표 1은, 종 특이적 염기서열 탐색을 위해 사용한 바이러스 정보를 나타낸 것이다.

Virus name (strain or isolate)	Acronym	GenBank accession No. (Length, bp)
Wheat streak mosaic virus	WSMV	NC_001886.1 (9,384)
Wheat streak mosaic virus	WSMV	AF285169.1 (9,384)
Wheat streak mosaic virus (saadat-shahr)	WSMV	EU914918.1 (9,381)
Wheat streak mosaic virus (Naghadeh)	WSMV	EU914917.1 (9.384)
Wheat streak mosaic virus (WA99)	WSMV	AF511643.2 (9.384)
Wheat streak mosaic virus (MON96)	WSMV	AF511630.2 (9.384)
Wheat streak mosaic virus (ID99)	WSMV	AF511619.2 (9,384)
Wheat streak mosaic virus (ID96)	WSMV	AF511618.2 (9,384)
Wheat streak mosaic virus (H98)	WSMV	AF511615.2 (9,384)
Wheat streak mosaic virus (Sidney 81)	WSMV	AF057533.1 (9,384)
Wheat streak mosaic virus (H95S)	WSMV	AF511614.2 (9,382)
Wheat streak mosaic virus (Arg2)	WSMV	FJ348359.1 (9,384)
Wheat streak mosaic virus (WA94)	WSMV	FJ348358.1 (9,384)
Wheat streak mosaic virus (Turkey 1)	WSMV	AF454455.1 (9,384)
Wheat streak mosaic virus (Czech)	WSMV	AF454454.1 (9,381)
Wheat streak mosaic virus (El Batan 3)	WSMV	AF285170.1 (9,339)
Cucumber mosaic virus (RNA 1)	CMV	NC_002034.1 (3,357)
Cucumber mosaic virus (RNA 2)	CMV	NC_002035.1 (3,050)
Cucumber mosaic virus (RNA 3)	CMV	NC_001440.1 (2,216)

다운로드한 17종의 염기서열은 'FASTA' format으로 정렬한 뒤, sequence alignment program인 BioEdit 버전 7.1.3을 사용하여 다중 정렬(multiple alignment)을 수행하였다. 정렬된 서열 중에서 프라이머 Tm 값은 49.0℃ 내지 50.2℃(프라이머 별, 최고 1.2℃ 차이)를 조건으로 WSMV 종 특이적인 염기서열을 탐색하였고, 진단용 LAMP 프라이머를 설계하였다.

하기 표 2는 WSMV 종 공통염기서열로부터 설계한 진단용 프라이머 정보를 나타낸 것이다.

Set	No.	Primer	Sequence(5'→3')	Mer	G+C (%)	Tm (℃)
WSMV_ LAMP-1	1	F3	GAGTTGGAGGAAAGGAAA	18	44.4	49.0
	2	B3	TCCGAAAACGGTAGAAAG	18	44.4	49.3
	3	FIP	GGACCAGAATATGTGAGTCGTATCTTTCACACGCAGAGT	39	-	-
	4	BIP	AGGAAGGTTACTCACCTTTGCGGAGTATAACTTGCAAGACG	41	-	-
WSMV_ LAMP-2	1	F3	TACGACTCACATATTCTGGT	20	40.0	50.2
	2	B3	GCCTATGAGTATAACTTGCA	20	40.0	49.4
	3	FIP	TCGGTCCTCGGAGATAGCGGAAGAAAGGTTGGAGAA	36	-	-
	4	BIP	ACAAAGGGAGTTCCTTGAGGATTTTCCGCAAAGGTGAGTAA	41	-	-

*GenBank accession number NC_001886.1을 기준으로 작성

실시예 2: 프라이머 세트 선발

WSMV 감염시료의 잎에서 추출한 총 RNA 2㎕를 주형으로, 반응버퍼(Roche, 스위스) 4㎕, N25-프라이머(50 pmol, NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN N; 서열번호 18(N25-프라이머를 이용한 핵산의 합성 방법; 한국공개특허 제10-2006-0121442호)) 3㎕, 2mM dNTP(Enzynomics, 한국) 2㎕, RNasin(Promega, 미국) 0.7㎕, M-MuLV 역전사효소(Roche, 스위스) 1.6㎕ 및 탈이온 증류수 6.7㎕를 넣음으로써 총 부피를 20㎕로 상보적 DNA(cDNA)를 합성하였다.

그 후, 합성된 cDNA 1.5㎕를 주형으로, LAMP 반응버퍼 2㎕, 10mM dNTP 2㎕, 외부 프라이머(F3 및 B3) 각각 0.6㎕, 내부 프라이머(FIP 및 BIP) 각각 1.4㎕ 및 Bst. 중합효소(polymerase) 1.5㎕를 포함하여 총 부피 11㎕에 맞추어 LAMP 반응을 진행하였다.

LAMP 반응은 95℃에서 10분간 변성시키고, self annealing통해 프라이머가 결합될 수 있도록 4℃에서 1분간 냉각시켰다. 그 후, 각각의 튜브 안에 Bst. 중합효소(polymerase)를 첨가하여 voltexing으로 교반한 후 스핀다운시키고, 62℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이 때, 반응물 조성은 DNA 1.5㎕, 반응버퍼 2㎕, 10mM dNTP 2㎕, 10pM F3 및 10pM B3 0.6㎕, 10pM FIP 및 10pM BIP 1.4㎕ Bst. 중합효소(polymerase) 1.5㎕를 포함하였다.

WSMV에 특이적인 프라이머 세트를 확인하기 위해 대조군인 오이 모자이크 바이러스(cucumber mosaic virus, CMV)를 사용하여 LAMP를 수행하였다.

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 이용하여 LAMP를 수행한 결과를 나타낸 것이다.

도 2를 참고하면, 밀줄무늬 모자이크 바이러스(WSMV)와 오이 모자이크 바이러스(CMV)를 포함하는 총 17가지의 바이러스에 대해, 실시예 1에서 디자인된 2개의 프라이머 세트를 이용한 LAMP를 각각 수행하였으며, 비 특이적 증폭이 일어난 2번 LAMP 프라이머 세트를 제외하고, 1번 프라이머 세트를 선발하였다.

하기 표 3은 선발된 프라이머 세트와 각각의 프라이머 서열번호를 나타낸 것이다.

Set	No.	Primer	Sequence(5'→3')	Mer	G+C (%)	Tm (℃)
WSMV_ LAMP-1	1	F3	GAGTTGGAGGAAAGGAAA	18	44.4	49.0
	2	B3	TCCGAAAACGGTAGAAAG	18	44.4	49.3
	3	FIP	GGACCAGAATATGTGAGTCGTATCTTTCACACGCAGAGT	39	-	-
	4	BIP	AGGAAGGTTACTCACCTTTGCGGAGTATAACTTGCAAGACG	41	-	-

실시예 3: 민감도 테스트

실시예 2에서 선발된 1번 프라이머 세트를 이용하여, 합성된 cDNA를 10^-9까지 9단계 희석한 후 LAMP 반응을 수행하였다.

도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 이용한 LAMP 반응 결과를 나타낸 것이다.

도 3을 분석한 결과, 1번 프라이머 세트에서는 10^-3까지 증폭 산물이 형성된 것을 확인하였다.

실시예 4: 증폭 산물 검정

LAMP로 증폭된 산물을 검정하기 위해, 외부 프라이머만을 이용하여 증폭시킨 산물(350bp)을 BfaI 제한효소로 절단하여 확인하였다.

이 때, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 합성된 cDNA 1㎕를 주형으로 외부 프라이머를 사용한 PCR을 수행하였다. 구체적인 PCR 조건으로는, 95℃에서 10분의 변성 후, 95℃에서 45초, 55℃에서 1분 및 72℃에서 1분의 과정을 35회 반복하고 마지막으로 72℃에서 5분 동안 반응하였다. 모든 산물은 1.5% 아가로스 겔 상에서 Midori Green Nucleic Acid Staning Solution(Nippon genetics, 일본) 0.4㎕를 Loading dye 대신 시료와 섞어 30분간 전기영동 하였으며, UV 하에서 형성된 특이밴드를 확인하였다.

도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트의 외부 프라이머 증폭 산물을 나타낸 것이다.

도 4를 참고하면, 1번 프라이머 세트의 외부 프라이머(F3 및 B3) 증폭산물이 156bp 및 194bp로 절단된 것을 확인하였고, LAMP 증폭 산물을 재차 검정하였다.

실시예 5: 민감도 테스트

종래의 PCR 방법과 본 발명의 LAMP 방법의 민감도를 비교하기 위해, 대한민국 등록특허 제10-1509651호(밀줄무늬 모자이크 바이러스 진단용 프라이머 세트)에 개시된 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하였다. 보다 구체적으로는, 합성된 cDNA를 10^-9까지 9단계 희석하고 상기 등록특허 중에서 조합번호 4번 세트로 1차 PCR 수행 후, 최종 nested PCR 세트 1번으로 2차 PCR을 수행하였다.

도 5는 종래의 PCR로 증폭된 산물을 나타낸 것이다.

도 5를 참고하면, 종래의 PCR 방법으로는 10^-2까지 nested PCR 증폭 산물이 형성된 것을 확인할 수 있었고, 이는 본 발명의 WSMV를 검출하기 위한 LAMP용 프라이머 세트에 비해 민감성이 10배 가량 낮음을 의미한다.

이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기의 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.

그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속한다.

<110> DANKOOK UNIVERSITY <120> LAMP PRIMER SET FOR DIAGNOSING WHEAT STREAK MOSAIC VIRUS AND DIAGNOSTIC KIT INCLUDING THE SAME <130> APC-2016-0418 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 primer <400> 1 gagttggagg aaaggaaa 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 primer <400> 2 tccgaaaacg gtagaaag 18 <210> 3 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP primer <400> 3 ggaccagaat atgtgagtcg tatctttcac acgcagagt 39 <210> 4 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP primer <400> 4 aggaaggtta ctcacctttg cggagtataa cttgcaagac g 41

Claims

서열번호 1 내지 4의 염기서열로 표기되는 각각의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트로서,
상기 프라이머 세트는, 진뱅크 접근번호(GenBank accession number) NC_001886.1, AF285169.1, EU914918.1, EU914917.1, AF511643.2, AF511630.2, AF511619.2, AF511618.2, AF511615.2, AF057533.1, AF511614.2, FJ348359.1, FJ348358.1, AF454455.1, AF454454.1 및 AF285170.1의 밀줄무늬 모자이크 바이러스에 특이적으로 결합하는,
상기 밀줄무늬 모자이크 바이러스(Wheat streak mosaic virus; WSMV)의 진단을 위한 등온증폭 반응용 프라이머 세트.
제1항의 프라이머 세트를 포함하는, 등온증폭 반응용 프라이머 조성물.
제2항에 있어서,
등온증폭 반응용 DNA 중합효소, 복수의 dNTP 및 반응버퍼를 더 포함하는, 등온증폭 반응용 프라이머 조성물.
제1항의 프라이머 세트를 포함하는, 밀줄무늬 모자이크 바이러스 진단용 키트.
제4항에 있어서,
등온증폭 반응용 DNA 중합효소, 복수의 dNTP 및 반응버퍼를 더 포함하는, 밀줄무늬 모자이크 바이러스 진단용 키트.
삭제
식물시료로부터 RNA를 추출하는 단계;
상기 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계;
상기 cDNA를 주형으로, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 60℃ 내지 65℃에서 등온증폭법(LAMP)으로 표적 서열을 증폭시키는 단계; 및
증폭 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 밀줄무늬 모자이크 바이러스의 진단방법.
제7항에 있어서,
상기 증폭 산물을 검출하는 단계는 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인관 측정을 통해 수행되는, 밀줄무늬 모자이크 바이러스의 진단방법.