KR101917368B1 - 보트리티스 시네리아의 선택배지 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea)를 선택적으로 분리할 수 있는 선택배지, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 잿빛곰팡이병을 일으키는 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea)을 선택적으로 분리, 생육할 수 있는 선택배지 및 이를 이용하여 살균제 저항성을 판별하는 방법에 관한 것이다.

Description

보트리티스 시네리아의 선택배지 및 이의 용도{Selective medium for isolation of Botyrtis cinerea and Use Thereof}
본 발명은 보트리티스 시네리아의 선택배지, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
고려인삼은 우리나라 고유의 중요한 천연자원으로서, 수 천년 전부터 영약 또는 선약으로 동양의학적으로는 물론 인류의 보건을 위해 오늘날까지 널리 사용되고 있는 한국의 대표적인 생약이다. 합성의약품의 부작용과 난치성 질병의 극복에 서양의학이 한계를 보임에 따라, 인삼을 비롯한 생약재 및 천연물에 대한 가치가 새롭게 부각되고 있다. 인삼은 암을 예방하고, 노화를 억제하며, 간장을 보호하고, 피로회복과 뇌기능을 강화하며, 최근에는 환경호르몬의 피해를 막아준다는 보고도 있다. 모든 생약재 중에서 으뜸인 인삼은 극히 제한된 환경에서 자라는 식물로서 다른 작물에 비하여 생육기간이 길고 재배방법 또한 특수하고 까다로워 지금까지 세계의 몇몇 나라에서만 생산되고 있다.
한국은 기후풍토가 인삼의 자생과 재배지로 알맞아 약효가 탁월한 고려인삼을 생산하는 인삼 종주국이다. 그러나 인삼이 건강식품 또는 보건의약품으로서 갖추고 있는 이상적인 조건에 대하여 많은 국가들의 관심이 높아지고, 기존의 인삼생산국 ?만 아니라 비생산국도 경쟁적으로 인삼의 연구와 생산을 장려하는 정책을 적극 펼쳐 나가고 있는 추세이다. 인삼을 재배하는 나라는 한국을 비롯한 중국, 일본, 미국, 유럽 일부 지역이며, 인삼을 소비하는 나라는 과거에는 그 대부분이 유교 문화권으로 한국, 중국, 일본, 대만 및 동남아 등이었으나 세계 각국에 인삼소비층이 확대되고 있다. 하지만, 고려인삼은 가격면에서 국제경쟁력이 약화되고 있는 실정이며, 국제경쟁력을 강화하기 위해서는 원료삼인 수삼품질 향상을 위한 재배기술 개발 연구가 필요하다. 특히 최근 인삼재배시 가장 시급한 문제점은 적정예정지의 절대부족, 산지토양 조건 악화로 인한 높은 발병율, 이에 따른 농약 사용량의 증가로 인한 잔류 농약으로 인해 수출하지 못하는 예가 많으므로 무농약 원료삼의 안전한 다수확 생산방법에 관한 집중연구가 시급히 요구되고 있다. 한편, 인삼재배에 있어서 잿빛곰팡이병의 방제는 저년근에서부터 고년근까지 중요한 문제가 되고 있다. 묘삼에서는 뇌두부위를 썩이거나 고년근에는 지제부에 발생하며, 이로 인해 결주율이 증가하게 되어 수량감소에 큰 영향을 끼친다(인삼병해충 방제기술 개발, 조대휘, 조혜선, 인삼연구보고서 p 8, KT&G 중앙연구원 생물자원연구소, 2005). 인삼재배에서 많이 발생하는 잿빛곰팡이에 의한 증상은 모든 생육 시기에 발생하고 뇌두부위 또는 줄기 지제부에 급속하게 진전하여 뿌리를 부패시키고, 잎에 수침상의 병반을 형성하며 열매의 경우 탈색을 시켜 종자 품질을 저해시킨다. 이 병원균은 분생포자나 균핵의 형태로 병든 식물체나 토양에서 월동하며, 주로 비, 바람에 의해 비산하여 전파된다. 병징 부위는 갈색의 반점으로 시작되어 점차 진전되면서 겹무늬, 회갈색의 대형병반으로 확대되며 회색의 분생포자가 밀집되어 있다. 뇌두부위나 줄기를 통해 침입하여 뿌리를 감염 시킬 경우 인삼 생산에 큰 피해를 끼쳐 인삼의 주요 병해 중 하나이다 (인삼재배, 표준영농교본 p 105, 농촌진흥청, 2000). 실제로 잿빛곰팡이병의 원인으로는 인삼 뿌리썩음 증상의 원인균인 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea)이며 이에 의해 피해를 받은 인삼포장에서는 탄저병과 점무늬병의 발생이 용이하므로 더욱 문제가 되고 있다. 3월 이후 지제부에 발생하여 뇌두 썩음을 발생시키는 것으로 시작되어 10월 이후까지 인삼의 줄기와 잎에 피해를 끼치는 것으로 보고되었으며, 수확 후 수삼 저장 중 부패를 일으키는 원인균으로 알려져 있다. 최근 기후변화로 인해 지제부 잿빛곰팡이병 발생에 의한 뿌리썩음 피해가 증가하고 있으며, 포장관리가 미흡한 경우 인삼 저장 중 부패병의 90%까지 발생이 보고되고 있다. 이러한 병해의 방제법으로 병든 인삼과 잎을 땅에 묻거나 소독하고 포장을 깨끗하게 하는 물리적 방제와 폴리옥신수화제, 피리메타닐액상수화제, 이미녹타딘트리스알베실레이트+ 폴리옥신비 수화제 등의 농약을 이용한 화학적 방제가 실시되고 있다. 그러나 이상의 방제법으로는 뚜렷한 효과를 거두기 어렵고, 약제 저항성 균주가 많이 발생하면서 방제할 수 있는 농약도 많이 줄어들고 있음을 알 수 있다. 게다가 기주범위가 넓은 다범성 병원균이기 때문에 단일계통의 약제를 사용하여 방제할 경우 농약 잔류 및 약제저항성 발생이 보고되어, 효과적인 방제법 개발이 필요한 실정이다(식물병연구 논문집, 이선옥 등, p 170-176, 2007, 한국식물병리학회). 따라서 효과적인 잿빛곰팡이병 방제를 위해서는 비산을 통하여 전파가 되는 포자를 포자비산량으로 주기적으로 조사하여 병 발생량을 확인하고 최적농약을 선발하는 것이라고 생각되며 포자비산량을 조사하기 위해서 선택배지를 이용하는 것이 유용할 것으로 판단된다. 현재까지 잿빛곰팡이병을 방제하기 위해 선택배지를 이용하는 것은 연구시설에서도 많이 수행되고 있지 않아 이에 대한 이해 부족으로 인해 농민들이 직접 사용하기에 어려움을 가지고 있다. 특히 농민들이 다양한 시약들이 들어가는 선택배지 조제의 어려움과 다양한 시약과 기구를 소지하고 있는 것 또한 쉬운 일은 아니기 때문에 실용화시키기에 많은 문제를 가지고 있는 실정이다. 그러므로 배지조제의 편리성을 중심으로 선택 배지를 만들어 농가에 보급할 경우 잿빛곰팡이병원균의 예찰 및 방제에 효율적으로 이용될 수 있을 것이다.
그러나 이상의 방제법으로는 뚜렷한 효과를 거두기 어렵고 인삼뿌리썩음병 등과 같은 토양전염성 병원균들은 토양중에 후막포자를 형성하면서 병을 일으키므로 방제가 거의 불가능하다. 토양훈증제의 사용은 토양 생태계의 파괴로 5년간에 병원균이 우점할 위험성도 있다. 특히 인삼의 주요 토양병들은 다양한 온도범위에서 감염이 성립되므로 한번 감염되면 비록 병의 진전은 느리지만 연중 피해를 받게 된다. 따라서 효과적인 토양병 방제를 위해서는 인삼재배 특성상 병방제 효과가 지속적이고 환경에 안정적인 인삼병의 방제 대책으로 생물학적 방제가 가장 적합하리라 생각되며 이에 관해 국내에서 인삼뿌리썩음병균(Cylindrocarpon destructans)에 길항력을 나타내는 스트렙토마이세스 종들(Streptomyces species)의 동정과 길항작용에 관해 보고된 바 있다
현재까지 인삼뿌리썩음병을 방제하기 위한 방안으로 길항미생물을 이용한 생물학적 방제법과 특히 연작지의 경우 사이론, 밧사미드 등 토양훈증제를 이용한 화학적 방제법 및 답전 윤환의 논삼재배법등 경종적 방법이 사용되고 있으나, 현재까지 그 방법이 체계화되어 있지 않은 실정이다. 특히, 인삼 토양병에 대한 지금까지의 생물학적 방제연구는 길항미생물 선발과 포장처리 효과검정등에 대해 주로 수행되어 왔지만 다양한 근권토양 환경에 대한 이해부족, 대상병원균에 대한 선발균주의 항균력이 높지 않거나 균제제 방법 또는 처리방법의 미비로 토양이나 종묘에서의 균 정착능력이 떨어지는 등 인삼뿌리썩음병에 대한 방제 효과가 뛰어난 길항 미생물이 발견되지 않고 있다.
이에, 본 발명자들은 인삼잿빛곰팡이병, 뿌리썩음병, 뇌두썩음병을 유발하는 병원균에 대한 높은 선택성을 갖는 배지를 개발하고자 예의 노력한 결과, 잿빛곰팡이병원균에 대한 높은 선택성을 가지는 선택배지를 개발하였으며, 다양한 식물병을 유발하는 병원균 알터나리아 알터나타(Alternaria alternata), 실린드로카폰 디스트럭턴스(Cylindrocarpon destructans)뿐만 아니라, 푸자리움 옥시스포럼 (Fusarium oxysporum), 푸사리움 소라니(Fusarium solani), 피시움 울티멈(Pythium ultimum), 라이족토니아 소라니(Rhizoctonia solani), 스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum) 등과 같은 다양한 병원균에 대한 높은 항균활성을 가지는 있으며 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea) 균사 및 포자발아만을 선택적으로 잘 자라게 하는 효과를 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 (a) 증류수 1L에 시약을 넣은 용액을 멸균과정 없이 가열한 후 식히는 단계; 및 (b) 상기 용액에 아족시스트로빈(Azoxystrobin)을 더 첨가하는 단계를 포함하는 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea) 선택배지의 제조방법 등을 제공하고자 한다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 (a) 증류수 1L에 시약을 넣은 용액을 멸균과정 없이 가열한 후 식히는 단계; 및 (b) 상기 용액에 아족시스트로빈(Azoxystrobin)을 더 첨가하는 단계를 포함하는
보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea) 선택배지의 제조방법을 제공한다.
상기 (a)에서 시약은 덱스트로즈(Detrose) 0.1 내지 20g, 감자전분(Potato starch) 0.01 내지 4g, 클로람페니콜(chloramphenicol) 0.005 내지 2g, 펜타클로로니트로벤젠(pentachloronitrobenzene, PCNB) 0.001 내지 0.2g, 로즈 밴갈(rose bangal) 0.0025 내지 0.5g, 탄닌산(tannic acid) 0.25 내지 50g, 아가(Agar) 10 내지 200g인 것일 수 있다.
상기 (b)에서 아족시스트로빈(Azoxystrobin)의 농도는 0.01 ppm 내지 10000ppm인 것일 수 있다.
상기 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea)는 잿빛곰팡이병을 일으키는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 방법에 따라 제조된 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea)의 선택배지를 제공한다.
상기 선택배지는 증류수 1L에 덱스트로즈(Detrose) 0.1 내지 20g, 감자전분(Potato starch) 0.01 내지 4g, 클로람페니콜(chloramphenicol) 0.005 내지 2g, 펜타클로로니트로벤젠(pentachloronitrobenzene, PCNB) 0.001 내지 0.2g, 로즈 밴갈(rose bangal) 0.0025 내지 0.5g, 탄닌산(tannic acid) 0.25 내지 50g, 아가(Agar) 10 내지 200g을 포함하고,
아족시스트로빈(Azoxystrobin)을 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 아족시스트로빈(Azoxystrobin)의 농도는 0.01 ppm 내지 10000ppm인 것일 수 있다.
상기 선택배지는 pH 4 내지 pH 8인 것일 수 잇다.
상기 선택배지에서 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea)를 분리하기 위한 배양은 15℃ 내지 30℃의 온도에서 수행되는 것일 수 있다.
상기 선택배지는 알터나리아 알터나타(Alternaria alternata), 실린드로카폰 디스트럭턴스(Cylindrocarpon destructans), 푸자리움 옥시스포럼 (Fusarium oxysporum), 푸사리움 소라니(Fusarium solani), 피시움 울티멈(Pythium ultimum), 라이족토니아 소라니(Rhizoctonia solani) 및 스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum)으로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하는 병원균에 대하여 항균활성을 가지는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 일 구현예로, (a) 본 발명의 선택배지를 멸균과정 없이 가열한 후 식히는 단계; (b) 상기 가열 후 식힌 선택배지에 살균제를 첨가하여 약제배지를 제조하는 단계; (c) 인삼 포장의 중앙에 상기 약제배지를 올려 놓은 후 포자를 채집하는 단계; 및 (d) 상기 약제배지의 색깔이 갈색을 나타내는 경우 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea)가 발아한 것으로 판단하는 단계를 포함하는
잿빛곰팡이병원균의 살균제저항성 판별방법을 제공한다.
상기 (b)에서 살균제는 피리메타닐(pyrimethanil), 이미녹타딘트리스알베실레이트(iminoctadine tris(albesilate), 폴리옥신비수화제(polyoxin B), 플루퀸코나졸(fluquinconazole), 플루디옥소닐(fludioxonil) 및 보스칼리드(boscalid), 플로클로라즈망가니즈(prochloraz manganese complex)로 이루어진 군 중 1종 이상 포함하는 것일 수 있다.
상기 살균제는 선택배지 1L에 0.01g 내지 10g의 농도로 포함되는 것일 수 있다.
본 발명의 잿빛곰팡이병원균 선택배지는 잿빛곰팡이병을 일으키는 병원균인 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea) 균사생육 및 포자발아만을 선택적으로 가능하게 하며, 다른 식물병원균에 대한 균사 생육 억제 및 포자발아 억제와 같은 항균활성을 가지고 있으며, 기존에 보고된 BSM 배지보다 우수한 항균활성을 가지고 있다. 상기 선택배지를 이용하여 인삼을 포함한 광범위한 작물 포장에서 잿빛곰팡이병원균 분리, 포자비산량 조사 및 살균제 저항성을 평가하여 농민 및 다양한 수용자에게 적절한 살균제 선정과 잿빛곰팡이병 방제방법을 제공하는 효과가 있다.
도 1은 본 발명에서 개발한 잿빛곰팡이병원균 분리 선택배지의 특성을 나타낸 결과이다.
도 2는 개발된 선택배지와 기존에 보고된 BSM배지, 곰팡이 배양배지인 PDA 배지에서 식물병원균의 균사생육정도를 나타낸 결과이다.
도 3은 본 발명에서 개발한 선택배지에서 식물병원균의 균사 생육 특성을 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명에서 개발한 선택배지에서 Azoxystrobin 농도에 따른 잿빛곰팡이병원균의 균사 생육특성을 확인한 결과이다.
도 5는 본 발명에서 개발한 선택배지에서 식물병원균을 접종한 3일 후에 Azoxystrobin 농도별에 따른 식물병원균의 균사 생육 억제효과를 나타내는 결과이다.
도 6은 본 발명에서 개발한 선택배지에서 식물병원균을 접종한 7일 후에 Azoxystrobin 농도별에 따른 식물병원균의 균사 생육 억제효과를 확인한 결과이다.
도 7은 본 발명에서 개발한 선택배지를 이용하여 인삼포장에서 비산되는 잿빛곰팡이병원균의 채집된 포자를 나타내는 것이다.
도 8은 본 발명에서 개발한 선택배지를 인삼 포장에서 잿빛곰팡이병원균을 채집하기 위하여 배치를 설치하는 모습을 나타내는 것이다.
도 9은 본 발명에서 개발한 선택배지를 이용하여 인삼잿빛곰팡이병원균의 살균제저항성평가의 결과를 나타내는 것이다.
상술한 바와 같이, 잿빛곰팡이병을 일으키는 병원균인 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea)를 분리할 수 있는 선택배지는 개발된 바가 없다. 또한, 병원균의 포자비산 및 약제저항성을 판별하는 기술이 사용되고 있으나, 식물체로부터 병원균을 분리하여 약제 저항성을 평가하는 데에는 2개월 이상의 시간이 소용되는 문제점을 가지고 있다. 기존에 보고된 선택배지는 잿빛곰팡이병원균 이외에도 다른 병원균의 생육을 가능하게 하여 선택배지의 활성이 떨어지는 문제점이 확인되었다.
이에, 본 발명자들은 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea)를 선택적으로 분리할 수 있는 선택배지를 제공함으로써 상술한 문제의 해결을 모색하였다. 또한 본 발명의 선택배지는 멸균과정 없이 가열을 통해 쉽게 제조될 수 있다.
본 명세서 내 "보트리티스 시네리아(Botrytis cenerea)"는 인삼의 잿빛곰팡이병, 뿌리썩음병, 뇌두썩음병을 일으키는 병원균으로서, 본 발명의 선택배지를 통해 상기 병원균을 선택적으로 분리 및 생육시킴으로써 다른 식물병원균의 생육은 억제하고 잿빛곰팡이병원균의 균사생육 및 포자발아의 촉진이 가능하다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 (a) 증류수 1L에 시약을 넣은 용액을 멸균과정 없이 가열한 후 식히는 단계; 및 (b) 상기 용액에 아족시스트로빈(Azoxystrobin)을 더 첨가하는 단계를 포함하는 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea) 선택배지의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 종래 선택배지에서 다른 균주와 선택적 분리의 효율성이 떨어지는 문제점을 극복하기 위해, 증류수에 시약을 넣은 용액을 멸균과정 없이 가열하는 것을 특징으로 한다.
상기 (a) 단계에서 상기 용액은 멸균과정을 생략함에 따라 선택배지를 쉽게 제조할 수 있고, 이를 통해 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea 의 우수한 균사생장과 포자발아 효과를 가지고 다른 병원균의 균사생육과 포자발아를 효과적으로 억제함으로써 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea)를 선택적으로 분리할 수 있다.
상기 가열 온도는 80℃ 내지 120℃인 것이 바람직하고, 100℃ 내지 110℃인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이 때, 가열 온도가 상기 범위 미만인 경우, 한천(agar)이 녹지않는 문제점이 있고, 가열 온도가 상기 범위를 초과하는 경우, 배지가 끓어 넘쳐 흐르는 문제점이 있다.
또한 상기 용액을 가열 후 40℃ 내지 60℃의 온도에서 식히는 것이 바람직하고, 50℃ 내지 55℃의 온도에서 식히는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이 때, 냉각 온도가 상기 범위 미만인 경우, 배지가 굳는 문제점이 있고, 냉각 온도가 상기 범위를 초과하는 경우 살균제의 활성을 저하시키는 문제점이 있다.
상기 (b)에서 아족시스트로빈(Azoxystrobin)의 농도는 0.01 ppm 내지 10000ppm인 것일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서, 본 발명의 선택배지에 첨가한 아족시스트로빈의 농도에 따른 활성 정도를 확인하기 위하여 상기 아족시스트로빈의 농도를 각각 200, 500 및 1000ppm으로 조절하여 8종의 식물병원균을 대상으로 균사생육정도를 조사하였다. 그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 접종 3일 후에 BSM 배지에서는 다른 병원균들과 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea)와의 생육 차이를 확인할 수 없었으나, 아족시스트로빈을 200, 500 및 1000ppm 으로 첨가한 선택배지에서 다른 균의 생육보다 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea)의 생육이 유의적으로 우수한 것을 확인할 수 있었다.
또한, 도 6에 나타난 바와 같이, 접종 7일 후에도 아족시스트로빈을 200, 500 및 1000ppm 첨가한 배지에서 아족시스트로빈의 농도와 관계없이 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea)의 생육이 우수하였으며, 다른 배지와 비교하여 볼 때 다른 병원균의 균사 생육을 유의적으로 억제하는 것을 확인할 수 있었다.
즉, 본 발명의 선택배지는 상기 선택배지에 포함되는 아족시스트로빈의 농도에 관계없이 잿빛곰팡이병을 일으키는 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea)의 생육이 우수함으로, 본 발명의 선택배지를 이용하여 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea)의 포자채집 및 선택적 분리가 가능하다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 따라 제조된 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea)의 선택배지를 제공한다.
상기 방법에 따라 제조된 선택배지의 경우, 잿빛곰팡이병을 일으키는 병원균인 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea)를 선택적으로 분리 및 생육할 수 있다.
상기 선택배지는 pH 4 내지 pH 8인 것이 바람직하고, pH 4.5 내지 pH 7.5인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이 때, pH가 상기 범위 미만인 경우, 배지가 굳지 않는 문제점이 있고, pH가 상기 범위를 초과하는 경우 선택배지에서 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea)가 자라면서 주변에 만드는 갈색이 옅어지는 문제점이 있다.
상기 선택배지에서 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea)를 분리하기 위한 배양은 10℃ 내지 30℃의 온도에서 수행되는 것이 바람직하고, 15℃ 내지 25℃의 온도에서 수행되는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이 때, 배양온도가 상기 범위 미만인 경우, 상기 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea)의 생육이 늦어지는 문제점이 있고, 배양온도가 상기 범위를 초과하는 경우 상기 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea)의 생육이 제한되는 문제점이 있다.
상기 선택배지는 알터나리아 알터나타(Alternaria alternata), 실린드로카폰 디스트럭턴스(Cylindrocarpon destructans), 푸자리움 옥시스포럼 (Fusarium oxysporum), 푸사리움 소라니(Fusarium solani), 피시움 울티멈(Pythium ultimum), 라이족토니아 소라니(Rhizoctonia solani) 및 스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum)으로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하는 병원균에 대하여 항균활성을 가지는 것일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 일실시예에서, 본 발명의 선택배지와 BSM배지, PDA 배지의 항균활성 평가를 위하여 잿빛곰팡이병원균인 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea)와 식물병원균 7종 알터나리아 알터나타(Alternaria alternata), 실린드로카폰 디스트럭턴스(Cylindrocarpon destructans), 푸자리움 옥시스포럼 (Fusarium oxysporum), 푸사리움 소라니(Fusarium solani), 피시움 울티멈(Pythium ultimum), 라이족토니아 소라니(Rhizoctonia solani) 및 스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum)의 균사생육억제 정도를 조사하였다. 그 결과, 본 발명의 선택배지는 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea)의 균사생육을 가능하게 하고, 다른 병원균의 생육을 억제함을 확인할 수 있었다.
본 발명의 다른 일실시예에서, 본 발명의 선택배지를 이용하여 잿빛곰팡이병원균인 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea)와 상기 식물병원균 7종의 균사생육억제 효과를 확인한 결과, 도 2 및 도 3에 나타난 바와 같이, 접종 후 일주일이 지난 선택배지에서는 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea)를 제외한 다른 균들의 생육이 매우 저조하였으며, 상기 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea)의 균사가 생장하면서 균사 주변이 갈색으로 변화하고, 생기 선택배지에 있는 탄닌산을 분해하여 배지의 색깔이 옅은 분홍색에서 옅은 노란색으로 변화함으로써 육안으로도 다른 병원균들과 쉽게 구분할 수 있었다.
또한, 본 발명은 (a) 본 발명의 선택배지를 멸균과정 없이 가열한 후 식히는 단계; (b) 상기 가열 후 식힌 선택배지에 살균제를 첨가하여 약제배지를 제조하는 단계; (c) 인삼 포장의 중앙에 상기 약제배지를 올려 놓은 후 포자를 채집하는 단계; 및 (d) 상기 약제배지의 색깔이 갈색을 나타내는 경우 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea)가 발아한 것으로 판단하는 단계를 포함하는 인삼 잿빛곰팡이병원균의 살균제저항성 판별방법을 제공한다.
상기 (a)에서 가열 온도는 80℃ 내지 120℃인 것이 바람직하고, 100℃ 내지 110℃인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이 때, 가열 온도가 상기 범위 미만인 경우, 한전(agar)이 녹지 않는 문제점이 있고, 가열 온도가 상기 범위를 초과하는 경우, 배지가 끓어 넘쳐 흐르는 문제점이 있다.
또한 상기 용액을 가열 후 40℃ 내지 60℃의 온도에서 식히는 것이 바람직하고, 50℃ 내지 55℃의 온도에서 식히는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이 때, 냉각 온도가 상기 범위 미만인 경우, 배지가 굳는 문제점이 있고, 냉각 온도가 상기 범위를 초과하는 경우 살균제의 활성을 저하시키는 문제점이 있다.
상기 (b)에서 살균제는 피리메타닐(pyrimethanil), 이미녹타딘트리스알베실레이트(iminoctadine tris(albesilate), 폴리옥신비수화제(polyoxin B), 플루퀸코나졸(fluquinconazole), 플루디옥소닐(fludioxonil) 및 보스칼리드(boscalid), 플로클로라즈망가니즈(prochloraz manganese complex)로 이루어진 군 중 1종 이상 포함하는 것일 수 있다.
상기 살균제는 농약안전사용 기준에 따라 선택배지 1L에 0.05g 내지 2g 의 농도로 포함되는 것이 바람직하고, 0.5g 내지 1g의 농도로 포함되는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이 때, 선택배지 1L에 포함되는 살균제의 농도가 상기 범위 미만인 경우, 살균제 저항성이 평가되지 않는 문제점이 있고, 살균제의 농도가 상기 범위를 초과하는 경우, 살균제 저항성 평가가 제대로 되지 않는다는 문제점이 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
실시예 1. 잿빛곰팡이병원균 선택배지 조성 및 제조법
잿빛곰팡이병원균인 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea)를 선택적으로 분리할 수 있는 배지를 조제하였고, 선택배지의 조성을 하기 표 1에 나타냈다.
Dextrose 2g, potato starch 0.4g, chlorampenicol 0.2g, pentachloronitrobenzene(PCNB) 0.02g, rose bangal 0.05, tannic acid 5g, agar 20g을 증류수 1L에 넣고 골고루 혼합하면서 끓인 다음 50℃로 식히고 azoxystorbin 200mg을 첨가하고 90mm 페트리디쉬에 25~30ml씩 분주한 다음 무균상 작업대에서 30분간 굳혀 배지를 조제하였다. 조제된 선택배지를 엷은 분홍색을 띄는 특징을 가지고 있었다(도 1).
성분 용량(1 L)
Dextrose 2g
Potato starch 0.4g
Potassium cloride 0.1g
Chlorampenicol 0.2g
Pentachloronitrobenzene 0.02g
Rose bangal 0.05g
Tannic acid 5g
azoxystrobin 0.2g
Agar 20g
실시예 2. 잿빛곰팡이 선택배지의 활성 평가
상기 실시예 1에서 개발한 선택배지의 활성을 평가하기 위하여 잿빛곰팡이병원균 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea)와 식물병원균 7종 알터나리아 알터나타(Alternaria alternata), 실린드로카폰 디스트럭턴스(Cylindrocarpon destructans), 푸자리움 옥시스포럼 (Fusarium oxysporum), 푸사리움 소라니(Fusarium solani), 피시움 울티멈(Pythium ultimum), 라이족토니아 소라니(Rhizoctonia solani), 스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum)을 공시하여 선택배지에서의 생육 정도를 조사하였다. 기존에 Edwards와 Sedden(2001)이 보고한 BSM배지, 곰팡이 기본생육배지인 PDA배지와 비교하여 병원균의 균사생육 정도를 비교하였다. 각각의 병원균은 PDA배지에서 1주일 동안 배양하고, 멸균된 6mm 코르크보러를 이용하여 구멍을 뚫고 균사 조각을 만들었다. 각각 병원균의 균사 조각을 선택배지 중앙에 올려 놓고, 20℃에서 1주일간 배양하면서 선택배지의 활성 정도를 평가하였다.
기존에 보고된 BSM배지(Edwards and Sedden, 2001)에서 잿빛곰팡이병원균의 균사 생육이 좋았으나, 실린드로카폰 디스트럭턴스, 푸사리움 소라니, 푸자리움 옥시스포럼의 균사 생육도 비교적 좋아 선택성이 떨어지는 것으로 확인되었다. 개발된 선택배지의 활성을 평가한 결과, 접종 1주일 후에 선택배지에서는 잿빛곰팡이병원균을 제외한 다른 균들의 생육이 매우 저조하였으며, 잿빛곰팡이병원균의 균사 생육만 우수하였다(도 2). 또한, 잿빛곰팡이병원균의 균사가 생장하면서 균사 주변이 갈색으로 변화 하였으며 배지에 있는 tannic 산을 분해하여 배지 색깔이 옅은 분홍색에서 옅은 노란색으로 변화하여, 쉽게 육안으로 다른 병원균들과 구분할 수 있었다. 개발된 선택배지는 공시한 병원균 이외에 잿빛곰팡이병원균의 균사만을 선택적으로 잘 자라게 하는 것을 확인하였다 (도 3).
이에, 본 발명에서는 개발한 선택배지를 잿빛곰팡이병원균 선택배지로 명명하였다.
실시예 3. Azoxystrobin 농도에 다른 선택배지의 활성평가
선택배지에서 인삼 잿빛곰팡이병원균인 Botrytis cinerea와 7종의 인삼 병원균 알터나리아 알터나타(Alternaria alternata), 실린드로카폰 디스트럭턴스(Cylindrocarpon destructans)뿐만 아니라, 푸자리움 옥시스포럼 (Fusarium oxysporum), 푸사리움 소라니(Fusarium solani), 피시움 울티멈(Pythium ultimum), 라이족토니아 소라니(Rhizoctonia solani), 스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum)의 생육정도를 조사하였다. 각각의 병원균은 PDA배지에서 1주일 동안 배양하고, 멸균된 6mm 코르코보러를 이용하여 구멍을 뚫고 균사 조각을 만들었다. 각각의 균사 조각은 azoxystrobin 농도를 200, 500, 1000ppm을 조절한 선택배지 중앙에 올려 놓고, 20℃에서 1주일간 배양하면서 활성 정도를 평가하였다. 개발된 선택배지와 기존에 Edwards와 Sedden 이 (2001)보고한 BSM 배지와 PDA배지를 대상으로 8종의 식물병원균을 대상으로 균사생육정도를 조사하였다.
조사결과, 선택배지에 접종 3일 후에 기존에 보고된 BSM 배지에서는 다른 병원균들과 잿빛곰팡이병원균과 구분을 할 수 없었으나, azoxystrobin을 200, 500, 1000ppm을 첨가한 배지에서 다른균의 생육보다 유의적으로 잿빛곰팡이병원균의 생육이 빠른 것을 확인하였다(도 5).
또한, 접종 7일 후 조사결과에서도, azoxystrobin을 200, 500, 1000ppm을 첨가한 배지에서 azoxystrobin의 농도와 상관없이 잿빛곰팡이병원균의 생육이 우수하였으며(도 4), 다른 배지와 비교하여 볼 때 다른병원균의 균사 생육을 유의적으로 억제하였다(도 6). 개발된 선택배지에서 잿빛곰팡병원균은 짙은 갈색을 띠며 생장하여 다른 식물병원균과 쉽게 구분할 수 있었으며, 기존에 보고된 BSM배지 (Edwards and Sedden, 2001) 보다도 잿빛곰팡이병원균의 생육을 육안으로 쉽게 확인 가능하였다.
실시예 4. 선택배지를 이용한 인삼잿빛곰팡이병원균 포자 비산량 조사
실시예 1에서 개발한 선택배지를 이용하여 잿빛곰팡이병원균의 포장비산량을 조사하기 위해 국립원예특작과학원 인삼특작부 관내에 위치한 인삼 2년, 5년생 포장에서 잿빛곰팡이병원균 포자를 채집하였다. 오후 2시에서 6시까지 인삼 포장의 1/3, 1/2, 3/3 지점의 고랑에 플라스틱을 놓고, 그 위에 선택배지를 4개씩 올려놓고 뚜껑을 4시간 동안 열어 놓았다. 4시간 후에 선택배지를 수거하여 20℃ 배양기에서 3~7일 간 배양한 후 채집된 잿빛곰팡이병원균의 포자를 조사하였다.
Edwards와 Sedden 이 (2001)보고한 BSM 배지에서는 잿빛곰팡이병원균 이외에 Alternaira, Fusarium , Penicillum속 등의 부생균들이 배지에서 쉽게 발아하는 것을 확인하였으나, 개발된 선택배지에서는 잿빛곰팡이병원균이 발아하여 주변에 갈색을 띄며 뚜렷한 생장을 하여 다른 병원균의 포자발아와 쉽게 구별 가능하였다(도 7).
선택배지를 이용하여 인삼잿빛곰팡이병원균의 분생포자량(포자수/90mm plate)을 조사한 결과 BSM 배지와 개발한 선택배지와 비교하였을 때, 채집된 분생포자에는 유의적인 차이가 없는 것으로 확인되었으며, 2년생 포장에서 보다 5년생의 포장에서 잿빛곰팡이병원균의 포자가 많이 채집되는 것을 확인하였고 그 결과를 하기 표 2에 나타냈다.
포장 년생 BSM 선택배지
A 2 4 3
B 2 3 2
C 2 5 4
D 5 31 31
E 5 41 48
실시예 5. 선택배지를 활용한 인삼잿빛곰팡이병원균 살균제저항성 판별
선택배지를 멸균과정 없이 끓인 다음 50℃ 로 식힌 후 농가에서 사용하는 살균제 9종을 선발하여 하기 표 3과 같이 농약안전 사용기준에 따른 사용농도로 맞추어 각각의 살균제를 첨가한 후 90mm의 페트리디쉬에 20ml씩 분주하여 약제배지를 조절하였다.
충북 지역 인삼주산지인 충주, 음성, 괴산, 증평 지역의 4~5년생 인삼 포장 3곳을 선정하였다. 인삼 포장의 중앙에 위치한 고랑에 플라스틱 박스를 올려놓고 그 위에 각각의 약제배지를 2개씩 올려 놓은 다음 4시간 동안 뚜껑을 열어 포자를 채집하였다(도 8). 20℃ 배양기에서 1주일 동안 배양하면서 약지배지별로 포자발아 정도를 확인하였다.
품목명 상표명 희석량/20L
(희석배수)		 유효성분 성분명 첨가량/1L(선택배지)
피리메타닐액상수화제 미토스 20g(1,000배) 37% pyrimethanil 1g
이미녹타딘트리스알베실레이트수화제 벨쿠트 20g(1,000배) 40% iminoctadine tris 1g
이미녹타딘트리스알베실레이트·폴리옥신비수화제 적토마 20g(1,000배) 20%
10%		 iminoctadine trispolyoxin B 1g
플루퀸코나졸·피리메타닐액상수화제 금모리 20ml(1,000배) 5%
30%		 fluquinconazolepyrimethanil 1㎖
펜헥사미드액상수화제 텔도 20ml(1,000배) 42% fenhexamid 1㎖
플루디옥소닐액상수화제 사파이어 10ml(2,000배) 20% fludioxonil 0.5㎖
보스칼리드입상수화제 칸투스 13.3g 49.3% boscalid 0.67g
폴리옥신비수화제 동부폴리옥신 20g(1,000배) 10% polyoxin B 1g
프로클로라즈망가니즈수화제 스포로곤 10g(2,000배) 50% prochloraz manganese complex 0.5g
선택배지를 이용하여, 충북지역 인삼 주산지에서 잿빛곰팡이병 방제를 위하여 사용되는 살균제의 저항성을 조사한 결과, 포자 채집 후 5일 후에 살균제 배지에서 잿빛곰팡이병원균의 포자가 발아하는 지점에는 회색의 균사 주변으로 갈색의 색깔을 띠는 것으로 확인되었다(도 9). 다른 병원균의 포자는 대부분 억제되었으며 일부 포자가 발아하는 지점에는 갈색의 띠를 가지고 있지 않았다.
살균제 저항성 균주의 평가는 살균제가 첨가되지 않은 선택배지에서 발아한 잿빛곰팡이병원균의 포자 수를 비교하여 확인하였다. 지역별로 약제저항성을 평가한 결과 표 4와 같이 증평, 괴산, 충주지역에서 폴리옥신수화제에 대한 저항성 균주가 확인되었으며, 괴산과 충주지역에서 펜헥사미드액상수화제에 대한 저항성균주가 발생하기 시작하였다. 또한, 플루디옥소닐액상수화제와 보스카리드입상수화제에 대한 저항성균주가 괴산, 충주, 증평의 일부지역에서 확인되었다. 조사한 모든지역에서 피리메타닐액상수화제, 이미녹타딘트리스알베실레이트수화제, 이미녹타딘트리스알베실레이트+폴리옥신비수화제, 플루퀸코나졸+피리메타닐액상수화제, 프로클로라즈망가니즈수화제에 대한 저항성 균주가 확인되지 않았다. 병원균을 직접 채집하여 살균제를 분석할 경우에는 병원균의 순수 분리부터 약제저항성을 평가하는 과정에 2달 내외의 시간이 소용되는데 반해 선택배지를 이용하여 잿빛곰팡이병원균에 대한 살균제저항성을 평가하는 기술은 일주일 내외로 잿빛곰팡이병원균의 살균제 저항성 판별이 가능할 것으로 판단된다. 이러한 기술이 농가현장에 활용할 경우 잿빛곰팡이병에 대한 최적약제를 사용하여 병을 효과적으로 방제할 수 있을 것으로 기대된다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (13)

  1. 인삼에서 잿빛곰팡이병원균을 검출하기 위한 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea) 선택배지의 제조방법으로,
    (a) 증류수 1L에 시약을 넣은 용액을 멸균과정 없이 가열한 후 식히는 단계;
    및
    (b) 상기 용액에 덱스트로즈(Detrose) 0.1 내지 20g, 감자전분(Potato starch) 0.01 내지 4g, 클로람페니콜(chloramphenicol) 0.005 내지 2g, 펜타클로로니트로벤젠(pentachloronitrobenzene, PCNB) 0.001 내지 0.2g, 로즈 밴갈(rose bangal) 0.0025 내지 0.5g, 탄닌산(tannic acid) 0.25 내지 50g, 아가(Agar) 10 내지 200g 및 아족시스트로빈 200 내지 1000 ppm을 첨가하는 단계를 포함하고,
    상기 선택배지는 알터나리아 알터나타(Alternaria alternata), 실린드로카폰 디스트럭턴스(Cylindrocarpon destructans), 푸자리움 옥시스포럼 (Fusarium oxysporum), 푸사리움 소라니(Fusarium solani), 피시움 울티멈(Pythium ultimum), 라이족토니아 소라니(Rhizoctonia solani) 및 스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum)으로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하는 병원균에 대하여 항균활성을 가지는, 제조방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 인삼에서 잿빛곰팡이병원균을 검출하기 위한 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea)의 선택배지로,
    상기 선택배지는 증류수 1L에 덱스트로즈(Detrose) 0.1 내지 20g, 감자전분(Potato starch) 0.01 내지 4g, 클로람페니콜(chloramphenicol) 0.005 내지 2g, 펜타클로로니트로벤젠(pentachloronitrobenzene, PCNB) 0.001 내지 0.2g, 로즈 밴갈(rose bangal) 0.0025 내지 0.5g, 탄닌산(tannic acid) 0.25 내지 50g, 아가(Agar) 10 내지 200g 및 아족시스트로빈 200 내지 1000 ppm을 포함하고,
    알터나리아 알터나타(Alternaria alternata), 실린드로카폰 디스트럭턴스(Cylindrocarpon destructans), 푸자리움 옥시스포럼 (Fusarium oxysporum), 푸사리움 소라니(Fusarium solani), 피시움 울티멈(Pythium ultimum), 라이족토니아 소라니(Rhizoctonia solani) 및 스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum)으로 이루어진 군 중 1종 이상을 포함하는 병원균에 대하여 항균활성을 가지는, 선택배지.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제5항에 있어서,
    상기 선택배지는 pH 4 내지 pH 8인 것을 특징으로 하는, 선택배지.
  9. 제5항에 있어서,
    상기 선택배지에서 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea)를 분리하기 위한 배양은 10℃ 내지 30℃의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 선택배지.
  10. 삭제
  11. 인삼에서 잿빛곰팡이병원균의 살균제저항성 판별방법으로,
    (a) 제5항의 선택배지를 멸균과정 없이 가열한 후 식히는 단계;
    (b) 상기 가열 후 식힌 선택배지에 살균제를 첨가하여 약제배지를 제조하는 단계;
    (c) 인삼 포장의 중앙에 상기 약제배지를 올려 놓은 후 포자를 채집하는 단계; 및
    (d) 상기 약제배지의 색깔이 갈색을 나타내는 경우 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea)가 발아한 것으로 판단하는 단계를 포함하는, 인삼에서 잿빛곰팡이병원균의 살균제저항성 판별방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 (b)에서 살균제는 피리메타닐(pyrimethanil), 이미녹타딘트리스알베실레이트(iminoctadine tris(albesilate), 폴리옥신비수화제(polyoxin B), 플루퀸코나졸(fluquinconazole), 플루디옥소닐(fludioxonil) 및 보스칼리드(boscalid), 플로클로라즈망가니즈(prochloraz manganese complex)로 이루어진 군 중 1종 이상 포함하는 것을 특징으로 하는, 판별방법.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 살균제는 선택배지 1L에 0.01g 내지 10g의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는, 판별방법.
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