KR101912826B1

KR101912826B1 - 특정분자 친화력을 갖는 하이드로겔 및 이를 이용한 하이드로겔의 부피 조절 방법

Info

Publication number: KR101912826B1
Application number: KR1020160139031A
Authority: KR
Inventors: 배세원
Original assignee: 한국생산기술연구원
Priority date: 2016-10-25
Filing date: 2016-10-25
Publication date: 2018-10-30
Also published as: KR20180045191A

Abstract

본 발명은 친수성 고분자를 포함하는 주사슬, 상기 주사슬을 가교시키는 친수성 고분자를 포함하는 제1 가교사슬, 상기 주사슬을 가교시키는 압타머(aptamer) DNA를 포함하는 제2 가교사슬 및 상기 압타머 DNA에 상보적이고, 미스 매치된 염기서열을 적어도 1개 이상 갖는 cDNA;를 포함하는 하이드로겔 및 이를 이용한 하이드로겔의 부피 조절 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔은 부피수축비를 80% 미만으로 조절하는 것이 가능함으로써 약물전달, 바이오 센서 및 스마트 소재로서의 활용성이 매우 큰 하이드로겔을 제공할 수 있다.

Description

특정분자 친화력을 갖는 하이드로겔 및 이를 이용한 하이드로겔의 부피 조절 방법{HYDROGELS HAVING SPECIFIC MOLECULAR AFFINITY AND METHOD FOR CONTROLING HYDROGELS VOLUME USING THE SAME}

본 발명은 특정분자 친화력을 갖는 하이드로겔 및 이를 이용한 하이드로겔의 부피 조절 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 특정분자 친화력을 갖는 DNA-컨쥬게이티드(DNA-conjugated) 하이드로겔을 제조함으로써 부피수축비를 80% 미만으로 조절하는 것이 가능한 하이드로겔 및 하이드로겔의 부피 조절 방법에 관한 것이다.

하이드로겔은 다량의 수분과 유전자, 단백질 및 세포 등을 쉽게 함유할 수 있는 3차원 입체구조를 지닌 친수성 고분자이다. 생체신화성 및 친수성이 매우 높고 생체조직과 유사한 성질을 띄기 때문에 바이오 센서, 약물전달, 화장품, 조직공학등 다양한 분야 활용가치가 매우 높다. 특히 줄기세포를 이용한 조직공학의 발전과 더불어 생체직접주입이 가능한 하이드로겔이 속속 개발되고 있다. 또한 보편적인 경제적 윤택성에 따라 피부미용과 뷰티산업의 발전이 가속화 되면서 화장품 및 미용등에 하이드로겔의 사용이 급증하고 있다.

또한 온도, pH, 이온세기 등 외부 조절인자에 의해서 하이드로겔의 부피, 가교도, 강도(stiffness)등의 물리적 성질을 조절할 수 있는 동적(dynamic) 하이드로겔은 재료화학 분야에서 상업적 활용성과 응용성이 매우 높은 물질로 그 중요성이 점점 증대되고 있다.

종래기술에 의한 동적 하이드로겔은 유기단분자, 단백질 등을 포함하는 모노머를 혼합 교반한 후, 자외선 조사나 가열에 의해 이를 가교시켜 경화시키는 방법으로 제조한다. 유기단분자를 활용한 대표적인 예로 페닐보론산을 이용하여 포도당에 반응하여 선택적으로 하이드로겔의 부피가 줄어드는 V. Ravaine(Langmuir 2011, 27, 12693-12701)의 연구를 들 수 있다. 단백질의 구조변화에 따른 힌지모션(Hinge Motion)을 활용한 예로 칼모듈린(Calmodulin, CaM)이나 아네닐레이트 키나아제(Adenylate Kinase, Ake)를 이용하여 하이드로겔의 부피를 조절하는 연구가 발표된바 있다(Nature Matter. 2005, 4, 298-302; JACS, 2008, 130, 15760-15761).

그러나, 이러한 방법으로는 부피수축비(V/V₀ x 100, %) 70% 이하의 동적 하이드로겔을 제조하기 힘들다. 또한 단백질의 경우 제조단가가 비싸고 제조과정이 복잡하며 유기단분자의 경우 생체독성등의 문제로 직접적인 응용에 한계를 지닌다.

이러한 문제를 해결하기 위하여, 하이드로겔 내에 유기단분자나 단백질 대신 DNA를 사용하는 방법에 주목하였다. DNA를 첨가한 하이드로겔을 이용 부피의 팽창과 수축을 연구한 예는 M. Maeda(Biomacromolecules 2005, 6, 2927-2929; Macromolecules 2005, 38, 1535-1537)등이 발표한 연구결과를 들 수 있다. 이 방법에서는 ssDNA(single stranded DNA)를 포함하는 폴리아크릴아미드기반 하이드로젤을 이용하여 ssDNA에 상보적인 cDNA(complementary DNA)를 투입하여 팽창비의 변화를 관찰하였다. 하지만 최대 부피수축비가 80% 이하에 미치지 못하는 한계를 나타내었다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은 부피수축비가 80% 미만으로 구현이 가능한 특정분자 친화력을 가지는 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기와 같은 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔을 이용하여 하이드로겔의 부피를 조절하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양상은, 친수성 고분자를 포함하는 주사슬; 상기 주사슬을 가교시키는 친수성 고분자를 포함하는 제1 가교사슬; 상기 주사슬을 가교시키는 압타머(aptamer) DNA를 포함하는 제2 가교사슬; 및 상기 압타머 DNA에 상보적이고 미스 매치된 염기서열을 적어도 1개 이상 갖는 cDNA;를 포함하는 하이드로겔에 관한 것이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따른 하이드로겔에 있어서, 상기 주사슬에 포함된 친수성 고분자가 다중-암(multi-arm) 폴리에틸렌글리콜로 이루어지며, 상기 다중-암 폴리에틸렌글리콜은 말단이 노보닌(norbornene)으로 치환된 것을 특징으로 한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따른 하이드로겔에 있어서, 상기 제1 가교사슬에 포함된 주사슬을 가교시키는 친수성 고분자가 선형 폴리에틸렌글리콜로 이루어지며, 상기 선형 폴리에틸렌글리콜은 말단이 싸이올(thiol)로 치환된 것을 특징으로 한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따른 하이드로겔에 있어서, 상기 압타머 DNA가 5'- A CCT GGG GGA GTA TTG CGG AGG AAG G T - 3' (ATP 압타머), 5'- GAC CAG GGC AAA CGG TAG GTG AGT GGT C - 3' (Arginine 압타머), 5'- GCA GGG GCG TTC GGG GGG TAC CGC TGC - 3' (Green19 압타머), 5'- AAG GTG GGT GGG TGG GGT TGG TTG TTG - 3' (Cellobiose 압타머), 5'- GCC AAG GGT GGG AGG GAG GGG GGC CGG - 3' (Sulforhodamine 압타머), 5'- G AGA CAA GGA TAA ATC CTT CAA TGA AGT GGT CTC - 3' (Cocaine 압타머), 및 5'- CTT CTT TCT TCC CCT TGT TTG TTG - 3' (Hg2+ 압타머) 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따른 하이드로겔에 있어서, 상기 압타머 DNA는 말단이 싸이올로 치환되고, 상기 제2 가교사슬은 신축성 가교사슬인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따른 하이드로겔에 있어서, 제1 가교사슬과 주사슬을 연결하는 공유결합은 제1 가교사슬 말단의 싸이올기와 주사슬 말단의 노보닌기가 싸이올-엔 반응에 의해 이루어지고, 제2 가교사슬과 주사슬을 연결하는 공유결합은 제2 가교사슬 말단의 싸이올기와 주사슬 말단의 노보닌기가 싸이올-엔 반응에 의해 이루어지는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따른 하이드로겔에 있어서, 상기 하이드로겔은 압타머 DNA와 분자친화력이 있는 타겟 물질과 결합하여 부피수축비가 80% 미만으로 수축되며, 상기 타겟 물질은 ATP인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 하이드로겔은 아래 [화학식 1]로 표시될 수 있다.

[화학식 1]

상기 화학식 1에서, l은 각각 독립적으로 15 내지 150의 자연수 중 어느 하나이고, m은 각각 독립적으로 15 내지 100의 자연수 중 어느 하나이고, n은 각각 독립적으로 15 내지 100의 자연수 중 어느 하나이다.

본 발명의 또 하나의 양상은 특정분자 친화력을 갖는 압타머 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔을 제조하는 단계; 및 상기 하이드로겔에 타겟 물질을 결합시키는 단계를 포함하는 하이드로겔의 부피 조절 방법에 관한 것이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따른 하이드로겔의 부피 조절 방법에 있어서, 상기 하이드로겔을 제조하는 단계는 폴리에틸렌글리콜 함유 전구용액을 제조하는 단계; 압타머 DNA에 상보적이고 미스 매치된 염기서열을 적어도 1개 이상 갖는 cDNA와 압타머 DNA를 혼성화시키는 단계; 및 상기 전구용액을 UV 광원에 노출시켜 싸이올-엔 반응을 이용한 라디칼 중합을 유도하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따른 하이드로겔의 부피 조절 방법에 있어서, 상기 전구용액은 말단이 노보닌으로 치환된 다중-암 폴리에틸렌글리콜 모노머, 말단이 싸이올로 치환된 선형 폴리에틸렌글리콜 모노머, 말단이 싸이올로 치환된 압타머 DNA, 상기 압타머 DNA에 상보적이고 미스 매치된 염기서열을 적어도 1개 이상 갖는 cDNA, 광개시제, DNA 혼성화를 안정화시키는 금속이온, 다이설파이드 결합을 환원시키기 위한 환원제 및 완충용액을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따른 하이드로겔의 부피 조절 방법에 있어서, 상기 다중-암 폴리에틸렌글리콜 모노머는 4-암 폴리에틸렌글리콜 모노머 또는 8-암 폴리에틸렌글리콜 모노머일 수 있으며, 분자량은 10K~40K 범위일 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따른 하이드로겔의 부피 조절 방법에 있어서, 상기 선형 폴리에틸렌글리콜 모노머의 분자량은 2K~4K 범위일 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따른 하이드로겔의 부피 조절 방법에 있어서, 상기 광개시제는 DMPA(2,2-dimethoxy-2-phenylacetonephenone), HOMPP(2-hydroxy-2-methylpropipphenone), LAP(Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate), IRGACURE 2959(1-[4-(2-Hydroxyethoxy)-phenyl]-2-hydroxy-2-methyl-1-propane-1-one)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따른 하이드로겔의 부피 조절 방법에 있어서, 상기 압타머 DNA의 농도는 1~5mM 범위이고, 상기 광개시제의 농도는 0.1~2mM 범위일 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따른 하이드로겔의 부피 조절 방법에 있어서, 상기 방법은 압타머 DNA-하이드로겔을 완충용액 상에서 부피팽창시켜 평형상태(V0)에 도달한 후, 상기 하이드로겔을 압타머 DNA와 분자친화력을 지니는 타겟물질이 함유된 용액 상에서 압타머 DNA와 타겟물질을 결합시킨 후 부피(V)를 측정하는 단계를 포함하며, 상기 타겟물질은 ATP인 것을 특징으로 한다.

상기와 같은 구성을 가지는 본 발명에 따르면, 부피수축비 80% 이하의 하이드로겔을 최소의 시료만을 사용하여 경제적으로 쉽게 제조할 수 있는 효과가 있다.

또한, 본 발명에 따른 하이드로겔은 타겟 물질의 첨가에 따라 부피의 축소가 이루어지도록 설계되어 있어 약물전달, 바이오 센서 및 스마트 소재로서의 활용성이 매우 큰 장점이 있다.

도 1은 본 발명의 개념을 설명하기 위한 개략적 모식도이다.
도 2a는 본 발명의 일 구현예에 따른 하이드로겔의 팽창 평형 시간 실험 결과를 도시한 그래프이다.
도 2b는 본 발명의 일 구현예에 따른 하이드로겔의 압타머 농도에 따른 팽창 실험 결과를 도시한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 구현예에 따른 하이드로겔의 등방성 팽창 실험 결과를 도시한 사진이다.
도 4는 본 발명의 일 구현예에 따른 하이드로겔의 압타머 농도에 따른 수축 실험 결과를 도시한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 구현예에 따른 하이드로겔의 등방성 수축 실험 결과를 도시한 사진이다.
도 6은 압타머-ATP의 결합이 하이드로겔의 전체적인 부피 변화를 가져오는 능력을 측정한 실험 결과를 도시한 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 구현예에 따른 하이드로겔의 압타머-ATP 결합의 온도 의존성 실험 결과를 도시한 그래프이다.
도 8은 하이드로겔의 크기에 따른 수축 반응 시간의 실험 결과를 도시한 그래프이다.
도 9는 ATP 농도에 따른 하이드로겔의 수축 반응 실험 실험 결과를 도시한 그래프이다.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 구현예를 가질 수 있는 바, 특정 구현예들을 도면에 예시하고 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다.

본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 구현예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

이하, 실시예 및 첨부 도면 등을 참조하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 본 발명은 친수성 고분자를 포함하는 주사슬; 상기 주사슬을 가교시키는 친수성 고분자를 포함하는 제1 가교사슬; 상기 주사슬을 가교시키는 압타머(aptamer) DNA를 포함하는 제2 가교사슬; 및 상기 압타머 DNA(= 압타머 ATP)에 상보적이고, 미스 매치된 염기서열을 적어도 1개 이상 갖는 cDNA;를 포함하는 하이드로겔에 관한 것이다.

도 1은 본 발명의 개념을 설명하기 위한 개략적 모식도이다. 도 1을 참조하면,본 발명에 따른 하이드로겔은 압타머 DNA에 3 염기 미스 매치된(3 base mismatched) cDNA가 혼성화된 신축성 제2 가교사슬을 포함한다. 여기에서 압타머 DNA에 이와 분자친화력이 있는 타겟 물질을 첨가할 경우, 3염기 미스매치된 cDNA가 압타머 DNA와의 혼성화가 풀리면서 압타머 DNA로부터 떨어져 나가고, 압타머 DNA는 고유한 3차원 구조체를 형성하여 타겟물질과 결합한다. 이에 따라 선형으로 펼쳐져 있던 상기 제2 가교사슬이 수축하여 하이드로겔의 전체적인 부피가 수축하게 된다. 상기 타겟 물질은 ATP일 수 있다. 상기 압타머 DNA와 그에 상응하는 상보적이고, 미스 매치된 염기서열을 적어도 1개 이상 갖는 cDNA는 다음과 같은 구조를 가질 수 있다.

1	압타머 DNA	5'- A CCT GGG GGA GTA TTG CGG AGG AAG G T - 3' (ATP 압타머)
1	cDNA	3'- CGT AAG GCG T - 5' (3BMM)
2	압타머 DNA	5'- GAC CAG GGC AAA CGG TAG GTG AGT GGT C - 3' (Arginine 압타머)
2	cDNA	3'- TGT GCG ATG C - 5' (3BMM)
3	압타머 DNA	5'- GCA GGG GCG TTC GGG GGG TAC CGC TGC - 3' (Green19 압타머)
3	cDNA	3'- AGG CCG CCG A - 5' (3BMM)
4	압타머 DNA	5'- AAG GTG GGT GGG TGG GGT TGG TTG TTG - 3' (Cellobiose 압타머)
4	cDNA	3'- CGC ACG CCG A - 5' (3BMM)
5	압타머 DNA	5'- GCC AAG GGT GGG AGG GAG GGG GGC CGG - 3' (Sulforhodamine 압타머)
5	cDNA	3'- CGC TCG CTG C - 5' (3BMM)
6	압타머 DNA	5'- G AGA CAA GGA TAA ATC CTT CAA TGA AGT GGT CTC - 3' (Cocaine 압타머)
6	cDNA	3'- TGG GAG GTG A - 5' (3BMM)
7	압타머 DNA	5'- CTT CTT TCT TCC CCT TGT TTG TTG - 3' (Hg2+ 압타머)
7	cDNA	3'- GG AGA GGA GC - 5' (3BMM)

본 발명의 바람직한 구현예에 따른 하이드로겔에 있어서, 주사슬은 다중-암 폴리에틸렌글리콜을 포함하여 이루어질 수 있다. 상기 주사슬은 말단이 노보닌으로 치환된 다중-암 폴리에틸렌글리콜 모노머의 광중합에 의해 형성될 수 있다. 폴리에틸렌글리콜에 기반을 둔 하이드로젤은 높은 수분 함량, 친수성, 및 생체적합성 때문에 바이오센서에 대한 생물학 및 의학, 약물 전달 장치, 조직 엔지니어링 및 세포 이식 분야에서 널리 이용될 수 있다.

제1 가교사슬은 선형 폴리에틸렌글리콜을 포함하여 이루어질 수 있다. 상기 제1 가교사슬과 주사슬을 연결하는 공유결합은 제1 가교사슬 말단의 싸이올기와 주사슬 말단의 노보닌기가 싸이올-엔 반응에 의해 이루어질 수 있다.

제2 가교사슬은 말단이 싸이올로 치환된 압타머 DNA를 포함한다. 상기 제2 가교사슬과 주사슬을 연결하는 공유결합은 제2 가교사슬 말단의 싸이올기와 주사슬 말단의 노보닌기가 싸이올-엔 반응에 의해 이루어질 수 있다. 상기 제2 가교사슬은 신축성 가교사슬로 형성된다.

본 발명에 따른 하이드로겔은 아래 [화학식 1]로 표시될 수 있다.[화학식 1]은 완성된 하이드로겔의 한 부분에 예상되는 화학구조를 도식화한 것으로 싸이올기와 노보닌기의 광조사 라디칼 중합 반응에 의해서 젤이 형성되므로 싸이올은 8-암-PEG의 8개의 노보닌중 어느 노보닌과도 반응할 수 있기 때문에 [화학식1]의 구조가 겔 네트워크 상에 반복되는 것은 아니다.

[화학식 1]

상기 전구용액은 광중합에 의해 가교를 형성할 수 있는 말단이 노보닌으로 치환된 다중-암 폴리에틸렌글리콜 모노머, 말단이 노보닌과 광중합이 가능하도록 싸이올로 치환된 선형 폴리에틸렌글리콜 모노머, 말단이 싸이올로 치환된 압타머 DNA, 상기 압타머 DNA에 상보적이고 미스 매치된 염기서열을 적어도 1개 이상 갖는 cDNA, 광개시제, DNA 혼성화를 안정화시키는 금속이온, 다이설파이드 결합을 환원시키기 위한 환원제 및 pH 조절을 위한 완충용액을 포함할 수 있다. 상기 조성물중 압타머 DNA의 농도는 1mM 이상인 것이 바람직하다. 압타머 DNA의 농도가 너무낮으면 하이드로겔 내에 압타머 DNA가 너무 소량 존재하게 되므로 질량 팽창비가 0.8 미만으로 나오기 힘들어 응용성이 저하되기 때문이다.

상기 다중-암 폴리에틸렌글리콜 모너머로는 4-암 PEG-OH(분자량 10K, 20K 등), 8-암 PEG-OH(분자량 10K, 20K, 40K 등)을 이용하여 각 말단을 노보닌으로 치환한후 사용할 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 8-암 PEG-OH(분자량 20K)만을 사용한 예만을 기재하였으나, 이에 한정되지 않으며 본 발명의 실시예를 참조하여 압타머 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔을 제조하는 것은 통상의 기술자에게 용이할 것이다. 상기 모너머들의 치환체들은 모두 노보닌기와 싸이올기가 광중합 반응에 의해 하이드로겔을 형성하므로 본 발명의 하이드겔 제조에 성공적으로 적용할 수 있음은 당연하다.

상기 광개시제는 자외선 조사에 의해 라디칼을 형성할 수 있는 것으로 수용액상에서 활용할 수 있는 DMPA(2,2-dimethoxy-2-phenylacetonephenone), HOMPP(2-hydroxy-2-methylpropipphenone), LAP(Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate), IRGACURE 2959(1-[4-(2-Hydroxyethoxy)-phenyl]-2-hydroxy-2-methyl-1-propane-1-one) 등을 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 광개시제의 농도는 1~2mM가 바람직하다. 광개시제의 농도가 너무 낮으면 광중합반응이 효율적으로 진행되지 않아 하이드로겔이 불완전하게 형성되며, 광개시제의 농도가 너무 높으면 광중합반응이 너무 급격하게 진행되어 하이드로겔의 균일성이 떨어져 그 응용성에 제한이 따른다. 상기 개시제의 농도는 사용하는 모너머의 반응성에 따라서 변할 수 있으며, 모너머의 반응성이 낮으면 더 높은 농도의 광개시제를 사용하는 것이 당연하다.

상기 선형 폴리에틸렌글리콜 모너모로는 HS-PEG-SH(분자량 2K, 3.4K 등)와 같이 양 말단이 싸이올로 치환되어 노보닌과 광중합반응을 일으킬 수 있는 모노머를 사용할 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 분자량이 3.4K인 HS-PEG-SH을 사용한 예만을 기재하였으나, 다른 분자량을 가지는 HS-PEG-SH를 이용하여 본 발명의 실시예를 참조하여 압타머 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔을 제조하데 성공적으로 적용할 수 있음은 당연하다.

상기 조성물을 실시예에 따른 일정 농도로 혼합하여 하이드로겔을 제조할 수 있으며 하이드로겔의 제조에 필요한 양만큼만 사용하게 되므로 불필요한 낭비를 줄일 수 있다. 또한 조성물의 광중합이 매우 짧은 시간(5~10초)안에 완료되기 때문에 고광도의 UV 광원이 필요하지 않으므로 경제적으로 하이드로겔을 제조할 수 있다.

상기 방법에 의해 제조된 압타머 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔은 완충용액 상에서 3시간 정도 보관하면 부피팽창이 평행상태(V₀)에 도달하게 된다. 이 상태의 하이드로겔의 부피를 측정한 후 하이드로겔을 압타머 DNA와 분자친화력을 지니는 물질이 함유된 용액에 옮겨담는다. 이후 3시간 정도의 압타머 DNA와 타겟물질의 결합을 위한 혼성화 시간을 가진 후 하이드로겔의 부피(V)를 측정한다. 이를 통해 부피수축비를 측정할 수 있다.

[ 실시예 ] :

1. 하이드로겔의 제조

먼저 다음과 같이 시료를 준비하였다.

1)완충용액: Hepes(2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-yl]ethansulfonic acid), 10mM, pH 7.4

2) MgCl₂: 1mM in Hepes buffer

3) 압타머 DNA(5'- A CCT GGG GGA GTA TTG CGG AGG AAG G T - 3'): 10mM in DI water

4) 3염기 미스매치 cDNA(3BMM): 10mM in DI water (3'-CGT AAG GCG T-5')

5) PEG2SH: 100mM in Hepes, PEG dithiol MW=3.4K

6) 다이설파이드 결합 환원제(TCEP, tris(2-carboxyethyl)phosphine): 200mM in Hepes,

7) 8PEGNB: 100mM in Hepes, MW= 20K

8) 광개시제(LAP):20mM in DI water

상기 시료들을 가지고 아래와 같이 전구용액을 제조하였다.

	비교예 (0mM DNA Gel)	실시예 1 (1mM DNA gel)	실시예 2 (2mM DNA Gel)
Hepes	4 uL	2.1 uL	0.2 uL
MgCl2	1 uL	1 uL	1 uL
DNA Aptamer	0 uL	1 uL	2 uL
3BMM	0 uL	1 uL	2 uL
DNA 혼성화를 위한 37C, 1hr incubation
PEG2SH	2 uL	1.9 uL	1.8 uL
TCEP	1 uL	1 uL	1 uL
다이설파이드 결합 환원을 위한 Room. Temp., 1hr incubation
8PEGNB	1 uL	1 uL	1 uL
LAP	1 uL	1 uL	1 uL
Total	10 uL	10 uL	10 uL

상기 10 uL 의 전구용액을 1 uL 10개로 나눈 후, 엔펜도르프 피펫을 사용하여 피펫 팁에 1 uL 의 전구용액을 흡인하였다. 이어서 상기 전구용액에 10초간 UV를 조사하여 전구용액을 중합하였다.

상기 과정을 도식적으로 표시하면 다음과 같다.

본 발명에 따른 8-암 폴리에틸렌 글리콜을 사용한 하이드로겔의 중합과정은 다음의 식으로 표시될 수 있다.

상기 반응의 결과물은 아래 화학식 1로 표시될 수 있다.

[화학식 1]

2. 하이드로겔의 팽창 실험

하이드로겔의 최대 팽창능력 및 평형 도달시간을 확인하기 위하여 상기 비교예에 따라 제조된 10개의 하이드로겔 샘플을 37℃, 10 mM, pH 7.4의 HEPES 완충용액에 담가 부피변화를 측정한 후 도 2a에 도시하였다.

실험결과 평형 도달시간은 약 6시간임을 알 수 있었다.

이어서, 비교예, 실시예 1 및 실시예 2 각각의 샘플 3개씩을 37℃, 10 mM, pH 7.4의 HEPES 완충용액에 6시간 담가 부피변화를 측정한 후 도 2b에 도시하였다.

실험 결과 팽창 능력은 압타머의 농도에 비례함을 알 수 있었다. 이는 음전하를 갖는 DNA의 정전기적 반발력에 기인하는 것으로 판단된다.

3. 하이드로겔의 등방성 팽창 실험

하이드로겔의 등방성 팽창 능력을 조사하기 위하여 하이드로겔 샘플을 37℃의 HEPES 완충용액에 담가 직경 및 두께 변화를 현미경으로 측정한 후 도 3에 도시하였다.

실험 결과 직경은 5mm 에서 6.8mm(136%), 두께는 0.8mm에서 1.16mm(145%)로 증가함을 알 수 있었다.

4. 하이드로겔의 수축 실험 1

압타머-ATP의 결합이 하이드로겔의 전체적인 부피 변화를 가져오는 능력을 조사하기 위하여 하이드로겔 샘플을 37℃, 10mM의 HEPES 완충용액에 담가 현미경으로 직경 변화를 측정하여 부피 수축률을 산출한 후 도 4에 도시하였다.

실험 결과 본 발명에 따른 하이드로겔의 수축 효율은 압타머의 농도에 비례함을 알 수 있었다.

또한 높이 변화를 측정하여 부피 수축률을 산출한 후 도 5에 도시하였다.

실험 결과 본 발명에 따른 하이드로겔은 등방성 수축 거동을 나타냄을 알 수 있었다.

5. 하이드로겔의 수축 실험 2

압타머-ATP의 결합이 하이드로겔의 전체적인 부피 변화를 가져오는 능력을 조사하기 위하여 다양한 하이드로겔 샘플을 37℃, 10mM의 HEPES 완충용액에 담가 부피 수축률을 산출한 후 도 6에 도시하였다.

실험 결과 본 발명에 따른 하이드로겔(도 6에서 normal 로 표시) 이외에는 수축 효과가 없거나 미미함을 알 수 있었다.

6. 압타머 -ATP 결합의 온도 의존성 실험.

압타머-ATP 결합의 온도 의존성을 조사하기 위하여 도 7에 도시된 바와 같은 각각의 온도에서 하이드로겔의 부피 변화를 측정하였다.

실험 결과 체온 이상의 온도에서 ATP는 cDNA를 이탈시키고 압타머에 결합함을 알 수 있었다.

7. 하이드로겔의 크기에 따른 수축 반응 시간 실험

하이드로겔의 크기에 따른 수축 반응 시간을 조사하기 위하여 도 8에서와 같은 사이즈의 하이드로겔을 사용하여 수축 반응 시간을 측정하였다.

실험 결과 하이드로겔의 수축 반응 시간은 하이드로겔의 크기와 연관됨을 알 수 있었다.

8. ATP 농도에 따른 하이드로겔의 수축 반응 실험

ATP 농도에 따른 하이드로겔의 수축 반응을 조사하기 위하여 도 9에서와 같은 농도의 ATP를 사용하여 하이드로겔의 부피 변화를 측정하였다.

실험 결과 ATP 농도는 하이드로겔의 부피 변화를 결정함을 알 수 있었다.

이상 설명한 바와 같이 본 발명에 따른 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔은 최대 부피수축비를 80% 미만으로 조절하는 것이 가능함으로써 약물전달, 바이오 센서 및 스마트 소재로서의 활용성이 매우 큰 하이드로겔을 제공할 수 있다.

이상, 본 발명의 바람직한 실시예들에 대하여 설명하였으나, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서, 구성 요소의 부가, 변경, 삭제 또는 추가 등에 의해 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있을 것이며, 이 또한 본 발명의 권리범위 내에 포함된다고 할 것이다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

친수성 고분자를 포함하는 주사슬;
상기 주사슬을 가교시키는 친수성 고분자를 포함하는 제1 가교사슬;
상기 주사슬을 가교시키는 압타머 DNA를 포함하는 제2 가교사슬; 및
상기 압타머 DNA에 상보적이고, 미스 매치된 염기서열을 적어도 1개 이상 갖는 cDNA;를 포함하고,
상기 주사슬에 포함된 친수성 고분자는 말단이 노보닌으로 치환된 다중-암 폴리에틸렌글리콜이고,
제1 가교사슬에 포함되고, 상기 주사슬을 가교시키는 친수성 고분자는 말단이 싸이올로 치환된 선형 폴리에틸렌글리콜이고,
상기 압타머 DNA는 말단이 싸이올로 치환된 것인, 하이드로겔.
삭제
삭제
삭제
삭제
제1항에 있어서,
상기 압타머 DNA가 5'- A CCT GGG GGA GTA TTG CGG AGG AAG G T - 3' (ATP 압타머), 5'- GAC CAG GGC AAA CGG TAG GTG AGT GGT C - 3' (Arginine 압타머), 5'- GCA GGG GCG TTC GGG GGG TAC CGC TGC - 3' (Green19 압타머), 5'- AAG GTG GGT GGG TGG GGT TGG TTG TTG - 3' (Cellobiose 압타머), 5'- GCC AAG GGT GGG AGG GAG GGG GGC CGG - 3' (Sulforhodamine 압타머), 5'- G AGA CAA GGA TAA ATC CTT CAA TGA AGT GGT CTC - 3' (Cocaine 압타머), 및 5'- CTT CTT TCT TCC CCT TGT TTG TTG - 3' (Hg2+ 압타머) 중에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 하이드로겔.
삭제
제1항에 있어서,
상기 제2 가교사슬은 신축성 가교사슬인 것을 특징으로 하는 하이드로겔.
제1항에 있어서,
상기 제1 가교사슬과 상기 주사슬을 연결하는 공유결합은 상기 제1 가교사슬 말단의 싸이올기와 상기 주사슬 말단의 노보닌기가 싸이올-엔 반응에 의해 이루어지고,
상기 제2 가교사슬과 상기 주사슬을 연결하는 공유결합은 상기 제2 가교사슬 말단의 싸이올기와 상기 주사슬 말단의 노보닌기가 싸이올-엔 반응에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는 하이드로겔.
제1항, 제6항, 제8항 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 하이드로겔은 상기 압타머 DNA와 분자친화력이 있는 타겟 물질과 결합하여 부피수축비가 80% 미만으로 수축되는 것을 특징으로 하는 하이드로겔.
제10항에 있어서, 상기 타겟 물질은 ATP인 것을 특징으로 하는 하이드로겔.
제1항에 있어서,
상기 하이드로겔은 아래 [화학식 1]로 표시되는 것을 특징으로 하는 하이드로겔.
[화학식 1]

상기 화학식 1에서
l은 각각 독립적으로 15 내지 150의 자연수 중 어느 하나이고,
m은 각각 독립적으로 15 내지 100의 자연수 중 어느 하나이고,
n은 각각 독립적으로 15 내지 100의 자연수 중 어느 하나이다.
특정분자 친화력을 갖는 압타머 DNA-컨쥬게이티드 하이드로겔을 제조하는 단계; 및
상기 하이드로겔에 타겟 물질을 결합시키는 단계;를 포함하고,
상기 하이드로겔을 제조하는 단계는
폴리에틸렌글리콜 함유 전구용액을 제조하는 단계;
압타머 DNA에 상보적이고 미스 매치된 염기서열을 적어도 1개 이상 갖는 cDNA와 상기 압타머 DNA를 혼성화시키는 단계; 및
상기 전구용액을 UV 광원에 노출시켜 싸이올-엔 반응을 이용한 라디칼 중합을 유도하는 단계;를 포함하는 것인, 하이드로겔의 부피 조절 방법.
삭제
제13항에 있어서,
상기 전구용액은 말단이 노보닌으로 치환된 다중-암 폴리에틸렌글리콜 모노머, 말단이 싸이올로 치환된 선형 폴리에틸렌글리콜 모노머, 말단이 싸이올로 치환된 압타머 DNA, 상기 압타머 DNA에 상보적이고 미스 매치된 염기서열을 적어도 1개 이상 갖는 cDNA, 광개시제, DNA 혼성화를 안정화시키는 금속이온, 다이설파이드 결합을 환원시키기 위한 환원제 및 완충용액을 포함하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔의 부피 조절 방법.
제15항에 있어서,
상기 다중-암 폴리에틸렌글리콜 모노머는 4-암 폴리에틸렌글리콜 모노머 또는 8-암 폴리에틸렌글리콜 모노머인 것을 특징으로 하는 하이드로겔의 부피 조절 방법.
제15항에 있어서,
상기 다중-암 폴리에틸렌글리콜 모노머의 분자량은 10K~40K인 것을 특징으로 하는 하이드로겔의 부피 조절 방법.
제15항에 있어서,
상기 선형 폴리에틸렌글리콜 모노머의 분자량은 2K~4K인 것을 특징으로 하는 하이드로겔의 부피 조절 방법.
제15항에 있어서,
상기 압타머 DNA의 농도는 1~5mM인 것을 특징으로 하는 하이드로겔의 부피 조절 방법.
제15항에 있어서,
상기 광개시제는 DMPA(2,2-dimethoxy-2-phenylacetonephenone), HOMPP(2-hydroxy-2-methylpropipphenone), LAP(Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate), IRGACURE 2959(1-[4-(2-Hydroxyethoxy)-phenyl]-2-hydroxy-2-methyl-1-propane-1-one)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 하이드로겔의 부피 조절 방법.
제15항에 있어서,
상기 광개시제의 농도는 0.1~2mM인 것을 특징으로 하는 하이드로겔의 부피 조절 방법.
제13항에 있어서,
상기 하이드로겔의 부피 조절 방법은 상기 압타머 DNA-하이드로겔을 완충용액 상에서 부피팽창시켜 평형상태(V₀)에 도달한 후, 상기 하이드로겔을 압타머 DNA와 분자친화력을 지니는 타겟물질이 함유된 용액 상에서 압타머 DNA와 타겟물질을 결합시킨 후 부피(V)를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔의 부피 조절 방법.
제22항에 있어서,
상기 타겟물질은 ATP인 것을 특징으로 하는 하이드로겔의 부피 조절 방법.