KR101879110B1 - 플루오로-9-메틸-β-카르볼린 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 플루오로-9-메틸-β-카르볼린, 이의 제조와 마찬가지로 이들의 의약 용도 및 플루오로-9-메틸-β-카르볼린을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

Description

플루오로-9-메틸-Β-카르볼린{FLUOR-9-METHYL-Β-CARBOLINES}
본 발명은 플루오로-9-메틸-β-카르볼린, 이의 제조와 마찬가지로 이들의 의약 용도 및 플루오로-9-메틸-β-카르볼린을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 화합물은 급성 및 만성 귀 질환 및 청각 손상, 특히 현기증 및 균형 교란 특히 난청, 폭발 외상, 폭발 손상, 이명, 소음에의 만성적 노출에 의해 야기되는 미로성 난청, 노화와 관련된 청력 상실, 내이 보철의 이식 동안의 외상(삽입 외상), 내이 영역 내 질환에 의해 야기되는 현기증, 메니에르병의 증후군과 연관되고/되거나 메니에르병의 증후군으로서의 현기증, 메니에르병의 증후군과 연관되고/되거나 메니에르병의 증후군으로서의 균형 교란 및 항생제 및 세포증식억제제로 인한 청각 손상의 치료를 제공한다.
세계보건기구 (WHO)의 연구에 따르면 대략 2억5천만명(250 million people)이 중등 및 중증의 청각 장애로 고통받고 있다. 미국에서는 3천 내지 4천만명이 청각 손상 및 난청을 앓고 있다. 치료 만의 비용은 매년 대략 5조 달러(50 billion USD)이다. 독일 청각장애자 협회 (Deutscher Schwerhorigenbund)는 2007년에 14세 이상의 독일인구의 약 19 %가 청각 장애로 고통받고 있다고 보고하였다.
나이가 듦에 따라 청각 장애의 백분율이 증가한다. 심지어 현재 청각 장애는 65세 이상의 사람에서 골 및 관절의 질환, 고혈압 및 심장 질환에 이어 4번째로 가장 흔한 만성적인 신체 장애이다. 60 내지 69세 사이의 사람의 37% 및 70세 이상의 사람의 54%가 청각 손상을 앓고 있다. 독일연방공화국에서 대략 1200만명 내지 1500만명의 환자가 미로성 난청으로 그리고 대략 290만명의 환자가 이명으로 고통받고 있다.
용어 "이명(Tinnitus aurium)" 또는 간단히 이명(tinnitus)은 앓고 있는 사람이 지속적이거나 반복하는 소음을 감지하는 징후 또는 증후군을 의미하며, 여기에서 2가지 형태의 이명이 구별될 수 있다. 상대적으로 드문 "객관적 이명(objective tinnitus)"에서 환자에 의해 감지되는 소음은 또한 외측으로부터 감지될 수 있거나 적어도 측정될 수 있다. 이는 예를 들면 내이에 근접하게 통과하는 혈관과 같이 대개는 신체 자체의 음원에 기초하고 있다. 유의미하게 보다 빈번한 "주관적 이명(subjective tinnitus)"에서 음향 현상은 다른 사람에 의해 감지될 수 있는 외부 음원에 기초하고 있지 않다. 따라서 "주관적 이명"은 귀에 작용하는 소리에 무관한 음향 감지이며, 환자에 의해 감지된다. 이러한 감지의 원인은 다양할 수 있고 다른 무엇보다도 내이의 청각 기능의 장애에 기여할 수 있다. 이명 환자가 감지하는 분명한 소음의 형태는 매우 다양하다. 용어 이명은 하기의 음향 인상의 결합이다:
- 윙윙거림(humming) 또는 호루라기(whistle) 소리
- 쉿쉿거림(hissing)
- 좌르르함(rushing)
- 딱딱임(snapping) 또는 똑똑임(knocking)
소음은 그의 세기가 일정할 수 있고; 또한 규칙적으로-맥동하는 특성을 가질 수 있다.
귀는 다음과 같이 구축된다. 귓불로부터 이도가 귀의 내측으로 인도된다. 이도는 고막에서 종료한다. 귀의 이 부분은 외이로 표시된다. 외이 뒤에 또한 고실이라고도 불리우는 공간인 중이가 놓여지고, 이는 유스타키오관 및 또한 비인두에 연결된다. 중이는 그의 일측이 고막으로 그리고 반대측이 난원창으로 그리고 원창으로 감싸여진다. 두 창의 뒤에 내이로 표시되는 공간이 후속된다. 내이는 균형계 (전정장치) 및 음향 감지를 위한 소위 달팽이관 (와우각) 같은 여러 기관을 감싼다. 이는 다시 내이 내의 감각세포 (모세포)의 수용체로서 코르티 기관을 포함한다.
원창의 막은 내이 공간에 대한 생물학적 장벽을 형성하고 내이의 손상 및 질환의 국소 치료에 대한 가장 큰 장애를 구성한다. 투여된 활성제는 내이 공간으로 유입되기 위해서는 이 장벽을 극복하여야만 한다. 이 막이 이러한 조작에 의하여 손상될 수 있기 때문에 활성제는 이 막을 통하여 기계적으로 그리고 기기-기반으로 투여될 수 없다. 원창 막에서 국소적으로 작동가능하게 (즉, 고막을 통한 주사) 될 수 있고 계속해서 원창 막을 투과할 수 있다. 따라서, 활성제가 와우각의 상호연결된 격실 즉 고실계와 전정계에 의해 형성된 내이 공간을 채우는 외림프액에 도달한다. 중간계라 불리우는 고실계와 전정계 사이의 막으로 분리된 격실은 내림프액으로 둘러싸여진 청각 기관 (내유모세포 및 외유모세포)의 감각세포를 포함한다. 이들은 주변 지지세포와 함께 코르티 기관으로 표시된다. 모세포는 임의의 원인 (나이, 특정의 항생제 또는 세포증식억제제 등과 같은 약물)의 미로성 난청과 마찬가지로 원발적으로 손상된 이명에 있다. 외림프 공간으로부터 중앙계를 분리하는 막 너머로 활성제는 모세포에 직접적으로 또는 내림프를 통하여 영향을 미칠 수 있다. 와우각의 외림프와 마찬가지로 내림프 격실이 균형계와 연결되어 있기 때문에, 활성제는 또한 와우각으로부터 전정장치의 감각세포 내로 유입될 수 있다.
독일 특허 출원 (DE 10 2007 009264 A1)은 9-알킬-β-카르볼린의 신경보호 효과로 인하여 이것이 운동 장애 및/또는 예를 들어 알쯔하이머병 또는 파킨슨병 등과 같은 신경 질환의 치료 및/또는 예방에 사용될 수 있다는 것을 개시하고 있다.
Von Hamann et al. (J. Hamann et al.; Neurochem Internat. 2008, 52, 688-700)은 중뇌 뉴런의 1차 세포 배양에서의 β-카르볼린 9-메틸-β-카르볼린의 신경보호 효과를 나타낼 수 있었다. 여기에서 나타난 9-메틸-β-카르볼린으로 인한 신경의 증가된 생존율은 그러나 증가된 증식에 기인하는 것이 아니었다. 반대로, 9-메틸-β-카르볼린의 적용이 증식의 억제 및 신경의 증가된 분화를 야기하였다. 이러한 9-메틸-β-카르볼린의 효과는 인간 신경모세포종 세포 (SH-SY5Y)에 대하여 확인되었다. 촉진된 분화와 함께, 소닉 헤지호그(sonic hedgehog), Wnt1 및 Wnt5a 등과 같은 신경영양인자의 증가된 발현이 입증되었다. 게다가, 9-메틸-β-카르볼린은 중뇌 뉴런의 일차 세포 배양에서 나타난 도파민작동성 뉴런의 수의 증가를 유도하였다. 따라서, 파킨슨병의 치료에서의 9-메틸-β-카르볼린의 치료적인 이점은 가망을 지속하는 것이다.
미국 특허 출원 (US 2004/038970 A1)은 이명을 포함하여 다양한 의학적 적응증의 치료에서의 활성제로서의 β-카르볼린의 용도를 개시하고 있으나, 반면에 9-알킬-β-카르볼린 및 그에 따라 또한 β-카르볼린의 구조적으로 크게 벗어나는 기인 6- 및/또는 7-플루오로-9-메틸-카르볼린으로부터의 용도는 언급하지 않았다.
국제 특허 출원 (WO 2011/079841)은 β-카르볼린 특히 9-알킬-β-카르볼린 및 이들의 내이의 질환 또는 손상의 치료를 위한 용도를 개시하고 있다. 9-알킬-β-카르볼린의 적용이 인간 신경모세포종 세포 (SH-SY5Y)의 신경 분화와 마찬가지로 신경보호 특성을 갖는 신경영양인자의 발현을 촉진한다는 것이 밝혀졌다. 이는 랫트의 와우각 제제의 세포 배양에서 확인되었다. 게다가, 기니피그에서 내이의 원창에의 국소 적용 이후 9-메틸-β-카르볼린이 내이의 외림프 공간 내로 확산될 수 있고 이는 코르티 기관의 모감각세포의 전기생리학적 활성의 증가를 야기한다는 것이 밝혀졌다.
본 발명의 1차 목적은 청각 손상, 노화와 관련된 청력 상실 (노인성 난청), 현기증 및 균형 교란의 예방 및 치료에 사용될 수 있는 것과 마찬가지로 학습 및 기억을 개선하고 이미 개발된 것 이상의 이점을 나타낼 수 있는 활성제와 마찬가지로 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 독립 청구항들의 교시에 의해 해결된다. 본 발명의 추가의 이로운 특징, 관점 및 상세들은 본 출원의 종속 청구항들, 상세한 설명, 도면 및 실시예들로부터 명백하다.
플루오로 -9- 메틸 -β - 카르볼린
놀랍게도, 본 발명에 따르면, 일반식 (I)의 플루오로-9-메틸-β-카르볼린이 선행기술의 화합물 (예를 들면, 9-메틸-β-카르볼린)에 비하여 내이 질환의 치료에서 증가된 효능을 나타낸다는 것이 발견되었다. 이는 선행기술에 비하여 유의미한 치료학적 개선을 대표하는 더 낮은 투여량 및 저감된 독성으로 적용될 수 있는 가능성을 제공한다.
게다가, 놀랍게도, 본 발명에 따르면, 6- 및/또는 7-플루오로-9-메틸-β-카르볼린은 특별한 속성에 의하여 치료적인 용도를 지지하는 이미 개발된 것에 비하여 두드러진다는 것을 발견하였다. 따라서 9-메틸-β-카르볼린에 비하여 6- 및/또는 7-플루오로-9-메틸-β-카르볼린에 대하여 인간 신경모세포종 세포에서의 신경 분화를 촉진하는 것에 대한 증가된 효능이 입증되었다. 더욱이, 9-메틸-β-카르볼린에 비하여 6- 및/또는 7-플루오로-9-메틸-β-카르볼린은 증가된 막 투과성과 연관되는 유의미하게 증가된 친유성을 나타낸다. 이는 내이의 질환 또는 손상의 치료 또는 기억을 증강시키고 학습능력을 증가시키기 위한 본 발명에 따른 화합물의 치료적인 용도에 대한 원대한 결과를 갖는다. 이미 기술된 바와 같이, 고막, 원창의 막 및 중앙계의 막 (덮개막 및 라이스너막) 등과 같은 생물학적 막은 활성제에 대하여 그의 내이의 모세포로의 경로에 대한 천연의 장애물을 형성한다. 이는 특히 고막 또는 원창 상에의 활성제의 국소적 적용에 적용된다. 증가된 막 투과성으로 인하여 활성제의 이용가능성이 또한 증가된다. 막 투과성 외에도 체내에서의 활성제의 열화는 특히 전신적으로 투여되는 경우에 그의 효능에 그리고 또한 가능한 부작용에 대하여 중요한 역할을 한다. 9-메틸-β-카르볼린이 6번 위치에서 하이드록실화에 의하여 분해되고 후속하여 공액화 반응이 일어나는 반면, 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린에 대하여는 이는 대사 경로가 플루오라이드기(들)에 의해 차단된다. 이로써, 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린의 반감기가 증가될 뿐만 아니라 잠재적으로 독성인 분해 산물을 형성하는 위험 또한 감소되었다. 6- 및/또는 7-플루오로-9-메틸-β-카르볼린의 증가된 효능으로 인하여, 다른 9-알킬-β-카르볼린에 비하여 치료에서의 저감된 투여량이 가능하게 될 것으로 여겨진다. 이는 신체의 부담 및 거기에 더해 원치않는 부작용을 감소시킬 수 있기 때문에 특히 만성 질환의 장기 치료에서 매우 중요하다. 따라서, 본 출원은 선택 발명이다.
용어 "6- 및/또는 7-플루오로-9-메틸-β-카르볼린"은 "또는"으로 연결되는 경우, 화합물 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 또는 화합물 7-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 중의 어느 하나를 그리고 "및"으로 연결되는 경우, 화합물 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 및 7-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 둘 다를 의미한다.
본 발명은 일반식 (I)의 화합물 또는 일반식 (I)의 플루오로-9-메틸-β-카르볼린과 마찬가지로 상기 언급된 화합물의 약학적으로 수용가능한 염, 용매화물 및 수화물과 마찬가지로 전구약물 및 착화합물에 관한 것이다:
Figure 112016041206701-pct00001
여기에서 R1은 -F이고 R2는 -H 또는 -F이거나,
여기에서 R1은 -H이고 R2는 -F이다.
본 발명은 또한 일반식 (I)의 화합물 또는 일반식 (I)의 플루오로-9-메틸-β-카르볼린과 마찬가지로 상기 언급된 화합물의 약학적으로 수용가능한 염, 용매화물 및 수화물과 마찬가지로 전구약물 및 착화합물에 관한 것이다:
Figure 112016041206701-pct00002
여기에서 R1 및 R2는 서로 독립적으로 -F 또는 -H이고,
여기에서 두 잔기 R1 또는 R2 중의 적어도 하나는 -F이다.
본 발명은 또한 일반식 (I)의 화합물 또는 일반식 (I)의 플루오로-9-메틸-β-카르볼린과 마찬가지로 상기 언급된 화합물의 약학적으로 수용가능한 염, 용매화물 및 수화물과 마찬가지로 전구약물 및 착화합물에 관한 것이다:
Figure 112016041206701-pct00003
여기에서 R1 및 R2는 서로 독립적으로 -F 또는 -H이고,
여기에서 두 잔기 R1 또는 R2 중의 적어도 하나는 -H이다. R1이 -F인 경우 R2는 -H이거나 R1이 -H인 경우 R2는 -F인 것이 바람직하다.
여기에서 사용된 용어 전구약물은 비활성으로 또는 덜 효과적인 형태로 투여되는 약제학적 물질로 정의된다. 투여 후, 이는 그의 활성의, 유효한 형태, 즉, 환자의 체내에서 일반식 (I)의 플루오로-9-메틸-β-카르볼린으로 전환된다.
본 발명의 화합물과 산부가염을 형성할 수 있는 가능한 산은 하기의 것이 될 수 있다: 황산, 술폰산, 인산, 질산, 아질산, 과염소산, 브롬화수소산, 염산, 포름산, 아세트산, 프로피온산, 숙신산, 옥살산, 글루콘산 (글리콘산, 덱스트론산), 젖산, 말산, 타르타르산, 타르트론산 (하이드록시말론산, 하이드록시프로판디온산), 푸마르산, 시트르산, 아스코르브산, 말레산, 말론산, 하이드록시말레산, 피루브산, 페닐아세트산, (o-, m-, p-) 톨루엔산(toluoylic acid), 벤조산, p-아미노벤조산, p-하이드록시벤조산, 살리실산, p-아미노살리실산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, 하이드록시에탄술폰산, 에틸렌술폰산, p-톨루엔술폰산, 나프탈렌술폰산, 나프틸아민술폰산, 술파닐산, 캄퍼술폰산, 차이나산 (퀸산), o-메틸-만델산, 하이드로겐벤젠술폰산, 피크르산 (2,4,6-트리니트로페놀), 아디핀산, d-o-톨릴타르타르산, 메티오닌, 트립토판, 아르기닌 등과 같은 아미노산 및 특히 글루탐산 또는 아스파르트산 같은 산성 아미노산. 더욱이 베타인-형태가 또한 가능하다.
본 발명의 다른 양태는 하기의 단계들:
a) 식 (III)의 글리옥실산 수화물 및 염기의 첨가 하에서 일반식 (II)의 출발물질의 (그리고 각각 플로오로-1-메틸트립타민 염산염의) 일반식 (IV)의 화합물로의 반응
Figure 112016041206701-pct00004
b) 산의 첨가 하에서 그리고 가열 하에서 일반식 (IV)의 화합물의 일반식 (V)의 화합물로의 (그리고 각각 일반식 (V)의 플루오로-9-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-β-카르볼린으로의) 탈카르복실화
Figure 112016041206701-pct00005
c) 촉매의 첨가 하에서 일반식 (V)의 화합물의 (그리고 각각 일반식 (V)의 플루오로-9-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-β-카르볼린의) 일반식 (I)의 화합물로의 (그리고 각각 일반식 (I)의 플루오로-9-메틸-β-카르볼린으로의) 방향족화를 포함하는 일반식 (I)의 본 발명에 따른 화합물 (그리고 각각 일반식 (I)의 플루오로-9-메틸-β-카르볼린)의 제조를 위한 방법에 관한 것이며;
여기에서
R1은 -F이고 R2는 -H 또는 -F이거나,
R1은 -H이고 R2는 -F이다.
본 발명에 따른 화합물의 제조를 위한 특정한 방법에 대하여 상기 기술된 바와 같이 잔기 R1 및 R2의 표시가 대응하는 합성의 출발물질에 대하여 뿐만 아니라 수득된 중간체 생성물과 마찬가지로 합성의 종국적인 최종 산출물에 대하여도 적용된다는 것은 말할 필요도 없다.
따라서 본 발명의 다른 양태는 하기의 단계들:
a) 식 (III)의 글리옥실산 수화물 및 염기의 첨가 하에서 일반식 (II)의 출발물질의 (그리고 각각 플로오로-1-메틸트립타민 염산염의) 일반식 (IV)의 화합물로의 반응
Figure 112016041206701-pct00006
b) 산의 첨가 하에서 그리고 가열 하에서 일반식 (IV)의 화합물의 일반식 (V)의 화합물로의 (그리고 각각 일반식 (V)의 플루오로-9-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-β-카르볼린으로의) 탈카르복실화
Figure 112016041206701-pct00007
c) 촉매의 첨가 하에서 일반식 (V)의 화합물의 (그리고 각각 일반식 (V)의 플루오로-9-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-β-카르볼린의) 일반식 (I)의 화합물로의 (그리고 각각 일반식 (I)의 플루오로-9-메틸-β-카르볼린으로의) 방향족화를 포함하는 일반식 (I)의 본 발명에 따른 화합물 (그리고 각각 일반식 (I)의 플루오로-9-메틸-β-카르볼린)의 제조를 위한 방법에 관한 것이며;
여기에서 R1은 -F이고 R2는 -H 또는 -F이고 이는 일반식 (I), (II), (IV) 및 (V)의 화합물에 대하여 동등하게 사실이거나
또는 여기에서 R1은 -H이고 R2는 -F이고 이는 (I), (II), (IV) 및 (V)의 화합물에 대하여 동등하게 사실이다.
출발물질로서 플루오로-1-메틸트립타민 염산염은 상용적으로 획득가능하다(또한 이하를 참조하시오). 본 발명의 바람직한 구체예에 있어서 단계 a)에서 2 내지 6, 바람직하게는 3 내지 5의 pH-값 특히 4의 pH-값이 염기의 첨가에 의해 달성된다. 보다 바람직한 구체예에 있어서 단계 a)'에서 화합물 IV의 결정화가 빙수(ice water) 중에서의 배양(incubating)에 의하여 촉진된다.
보다 바람직한 구체예에 있어서 단계 b)에서의 반응은 비활성 가스 하에서, 특히 바람직하게는 N2 하에서 일어난다. 더욱이, 차가운, 특히 바람직하게는 0 ℃ 내지 5 ℃에서 수 시간 동안 단계 b)' 배양에 의하여 단계 b)의 반응 생성물의 결정화를 촉진시키는 것이 바람직하다. 보다 바람직한 구체예에 있어서 단계 b)의 반응 생성물의 정제를 위하여, 결정화 이후 메탄올로부터의 재결정이 수행된다. 더욱이, 단계 c)에서 플루오로-9-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-β-카르볼린 (그리고 각각 일반식 (V)의 화합물)이 먼저 물에 용해되고 염기, 예를 들면, 수산화나트륨 또는 탄산나트륨의 첨가에 의하여 염기성 pH-값을 특히 바람직하게는 pH 11 내지 pH 14, 특히 바람직하게는 pH 13으로 조정하는 것이 바람직하다.
바람직한 구체예에 있어서 단계 c)에서의 산화성 방향족화를 위한 촉매는 다른 것들 보다 Pd　/　C, Pt　/　C, PdCl2, Pd　/　세피올라이트, Pd　/　SiO2 및 Pd　/　AlO4가 될 수 있다. 산화성 방향족화를 가능하게 하는 다른 첨가제는 당해 기술분야에서 숙련된 자에게 공지되었다. 그러나, Pd / C (탄소 상의 팔라듐, 활성탄 상의 팔라듐)가 촉매로서 바람직하게 사용된다.
단계 a) 및 c)에서 첨가된 염기는 서로 독립적으로 무기 또는 유기 염기, 예를 들면, NaOH, KOH, NH4OH, 테트라알킬암모늄 하이드록사이드, 라이신 또는 아르기닌이 될 수 있다. 당해 기술분야에서 숙련된 자에게는 어느 염기가 여기에서 반응을 진행시키기에 적절한 것인지 공지되었다. 그러나 KOH 및 NaOH 각각이 바람직하다.
단계 b)에서 첨가되는 산은 무기 또는 유기 산, 예를 들면, 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산, 아세트산, 시트르산, 옥살산, 말산, 살리실산, p-아미노살리실산, 말론산, 푸마르산, 숙신산, 아스코르브산, 말레인산, 술폰산, 포스폰산, 과염소산, 질산, 포름산, 프로피온산, 글루콘산, 젖산, 타르타르산, 하이드록시말레인산, 피루브산, 페닐아세트산, 벤조산, p-아미노벤조산, p-하이드록시벤조산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, 아질산, 하이드록시에탄술폰산, 에틸렌술폰산, p-톨루엔술폰산, 나프틸술폰산, 술파닐산, 캄퍼술폰산, 차이나산, 만델산, o-메틸만델산, 하이드로겐벤젠술폰산, 피크르산, 아디프산, d-o-톨릴타르타르산, 타르트론산, α-톨루산, (o-, m-, p-) 톨루산 또는 나프틸아민술폰산일 수 있다. 당해 기술분야에서 숙련된 자에게는 어느 산이 여기에서 반응을 진행시키기에 적절한 것인지 공지되었다. 그러나, 염산이 바람직하다.
다른 구체예에 따르면, 본 발명은 일반식 (I)의 플루오로-9-메틸-β-카르볼린이 다루어지며
Figure 112016041206701-pct00008
여기에서 R1은 -F이고 R2는 -F이고, 보다 더 바람직하게는 여기에서 R1은 -H이고 R2는 -F이고, 가장 바람직하게는 여기에서 R1은 -F이고 R2는 -H이다.
6- 플루오로 -9- 메틸 -β- 카르볼린 ( 6F9MβC )
특히 바람직한 구체예에 따르면, 본 발명은 β-카르볼린 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 그의 제조와 마찬가지로 그의 의약 용도 및 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 화합물 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린은 여기에서는 부분적으로 또한 "6F9MβC" 또는 "AC102"로 약칭될 수 있다. 반면에 선행기술에서 공지된 9-메틸-β-카르볼린은 부분적으로 "9MβC" 또는 "AC002로 약칭될 수 있다.
본 발명에 따른 화합물 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린은 선행기술에서는 보다 개별화된 즉, 확고한 형태로 개시되지 않았다. 게다가, 놀랍게도 본 발명의 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린은 치료 용도를 지지하는 그의 특별한 특성들로 명확하게 선행기술과는 상이하다는 것이 발견되었다. 따라서 9-메틸-β-카르볼린에 비하여 본 발명의 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린에 대하여 인간 신경모세포종 세포에서의 신경 분화를 촉진하는 증가된 효능이 입증되었다 (실시예 2를 참조하시오). 더욱이, 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린은 9-메틸-β-카르볼린에 비하여 유의미하게 증가한 친유성을 나타내며, 이는 증가된 막 투과성과 연관된다. 이는 각각 내이의 질환 또는 손상의 치료를 위한 본 발명에 따른 화합물의 치료적인 용도에 대한 원대한 결과를 갖는다. 이미 기술된 바와 같이, 고막, 원창의 막 및 중앙계의 막 (덮개막 및 라이스너막) 등과 같은 생물학적 막은 활성제에 대하여 그의 내이의 모세포로의 경로에 대한 천연의 장애물을 형성한다. 이는 특히 고막 또는 원창 상에의 활성제의 국소적 적용에 적용된다. 증가된 막 투과성으로 인하여 활성제의 이용가능성이 또한 증가된다. 막 투과성 외에도 체내에서의 활성제의 열화는 특히 전신적으로 투여되는 경우에 그의 효능에 그리고 또한 가능한 부작용에 대하여 중요한 역할을 한다. 9-메틸-β-카르볼린이 6번 위치에서 하이드록실화에 의하여 분해되고 후속하여 공액화 반응이 일어나는 반면, 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린에 대하여는 이는 대사 경로가 플루오라이드기에 의해 차단된다. 이로써, 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린의 반감기가 증가될 뿐만 아니라 잠재적으로 독성인 분해 산물을 형성하는 위험 또한 감소되었다. 6- 및/또는 7-플루오로-9-메틸-β-카르볼린의 증가된 효능으로 인하여, 다른 9-알킬-β-카르볼린에 비하여 치료에서의 저감된 투여량이 가능하게 될 것으로 여겨진다. 이는 신체의 부담 및 거기에 더해 원치않는 부작용을 감소시킬 수 있기 때문에 특히 만성 질환의 장기 치료에서 매우 중요하다.
본 발명은 식 (Ia)의 화합물 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린과 마찬가지로 상기 언급된 화합물의 약학적으로 수용가능한 염, 용매화물 및 수화물과 마찬가지로 전구약물 및 착화합물에 관한 것이다.
Figure 112016041206701-pct00009
여기에서 사용된 용어 전구약물은 비활성으로 또는 덜 효과적인 형태로 투여되는 약제학적 물질로 정의된다. 투여 후, 이는 그의 활성의, 유효한 형태, 상기의 경우 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린으로 전환된다.
본 발명의 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린과 산부가염을 형성할 수 있는 가능한 산은 하기의 것이 될 수 있다: 황산, 술폰산, 인산, 질산, 아질산, 과염소산, 브롬화수소산, 염산, 포름산, 아세트산, 프로피온산, 숙신산, 옥살산, 글루콘산 (글리콘산, 덱스트론산), 젖산, 말산, 타르타르산, 타르트론산 (하이드록시말론산, 하이드록시프로판디온산), 푸마르산, 시트르산, 아스코르브산, 말레산, 말론산, 하이드록시말레산, 피루브산, 페닐아세트산, (o-, m-, p-) 톨루엔산, 벤조산, p-아미노벤조산, p-하이드록시벤조산, 살리실산, p-아미노살리실산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, 하이드록시에탄술폰산, 에틸렌술폰산, p-톨루엔술폰산, 나프탈렌술폰산, 나프틸아민술폰산, 술파닐산, 캄퍼술폰산, 차이나산 (퀸산), o-메틸-만델산, 하이드로겐벤젠술폰산, 피크르산 (2,4,6-트리니트로페놀), 아디핀산, d-o-톨릴타르타르산, 메티오닌, 트립토판, 아르기닌 등과 같은 아미노산 및 특히 글루탐산 또는 아스파르트산 같은 산성 아미노산. 더욱이 베타인-형태가 또한 가능하다.
본 발명의 다른 양태는 하기의 단계들:
a) 식 (III)의 글리옥실산 수화물 및 염기의 첨가 하에서 식 (IIa)의 출발물질 5-플루오로-1-메틸트립타민 염산염의 식 (IVa)의 화합물로의 반응
Figure 112016041206701-pct00010
b) 산의 첨가 하에서 그리고 가열 하에서 식 (IVa)의 화합물의 식 (Va)의 6-플루오로-9-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-β-카르볼린으로의 탈카르복실화
Figure 112016041206701-pct00011
c) 촉매의 첨가 하에서 6-플루오로-9-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-β-카르볼린 (Va)의 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 (Ia)로의 방향족화를 포함하는 본 발명의 화합물 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린의 제조를 위한 방법에 관한 것이다.
출발물질 5-플루오로-1-메틸트립타민 염산염은 예를 들면 AKos GmbH (Steinen)으로부터 상용적으로 획득가능하다. 본 발명의 바람직한 구체예에 있어서 단계 a)에서 2 내지 6, 바람직하게는 3 내지 5의 pH-값 특히 4의 pH-값이 염기의 첨가에 의해 달성된다. 보다 바람직한 구체예에 있어서 단계 a)'에서 화합물 IVa의 결정화가 빙수 중에서의 배양에 의하여 촉진된다.
보다 바람직한 구체예에 있어서 단계 b)에서의 반응은 비활성 가스 하에서, 특히 바람직하게는 N2 하에서 일어난다. 더욱이, 차가운, 특히 바람직하게는 0 ℃ 내지 5 ℃에서 수 시간 동안 단계 b)' 배양에 의하여 단계 b)의 반응 생성물의 결정화를 촉진시키는 것이 바람직하다. 보다 바람직한 구체예에 있어서 단계 b)의 반응 생성물의 정제를 위하여, 결정화 이후 메탄올로부터의 재결정이 수행된다. 더욱이, 단계 c)에서 6-플루오로-9-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-β-카르볼린이 먼저 물에 용해되고 염기, 예를 들면, 수산화나트륨 또는 탄산나트륨의 첨가에 의하여 염기성 pH-값을 특히 바람직하게는 pH 11 내지 pH 14, 특히 바람직하게는 pH 13으로 조정하는 것이 바람직하다.
바람직한 구체예에 있어서 단계 c)에서의 산화성 방향족화를 위한 촉매는 다른 것들 보다 Pd　/　C, Pt　/　C, PdCl2, Pd　/　세피올라이트, Pd　/　SiO2 및 Pd　/　AlO4가 될 수 있다. 산화성 방향족화를 가능하게 하는 다른 첨가제는 당해 기술분야에서 숙련된 자에게 공지되었다. 그러나, Pd / C (탄소 상의 팔라듐, 활성탄 상의 팔라듐)가 촉매로서 바람직하게 사용된다.
단계 a) 및 c)에서 첨가된 염기는 서로 독립적으로 무기 또는 유기 염기, 예를 들면, NaOH, KOH, NH4OH, 테트라알킬암모늄 하이드록사이드, 라이신 또는 아르기닌이 될 수 있다. 당해 기술분야에서 숙련된 자에게는 어느 염기가 여기에서 반응을 진행시키기에 적절한 것인지 공지되었다. 그러나 KOH 및 NaOH 각각이 바람직하다.
단계 b)에서 첨가되는 산은 무기 또는 유기 산, 예를 들면, 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산, 아세트산, 시트르산, 옥살산, 말산, 살리실산, p-아미노살리실산, 말론산, 푸마르산, 숙신산, 아스코르브산, 말레인산, 술폰산, 포스폰산, 과염소산, 질산, 포름산, 프로피온산, 글루콘산, 젖산, 타르타르산, 하이드록시말레인산, 피루브산, 페닐아세트산, 벤조산, p-아미노벤조산, p-하이드록시벤조산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, 아질산, 하이드록시에탄술폰산, 에틸렌술폰산, p-톨루엔술폰산, 나프틸술폰산, 술파닐산, 캄퍼술폰산, 차이나산, 만델산, o-메틸만델산, 하이드로겐벤젠술폰산, 피크르산, 아디프산, d-o-톨릴타르타르산, 타르트론산, α-톨루산, (o-, m-, p-) 톨루산 또는 나프틸아민술폰산일 수 있다. 당해 기술분야에서 숙련된 자에게는 어느 산이 여기에서 반응을 진행시키기에 적절한 것인지 공지되었다. 그러나, 염산이 바람직하다.
놀랍게도 본 발명의 화합물 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 (Ia)이 이미 공지되고 시험된 9-메틸-β-카르볼린 등과 같은 β-카르볼린에 비하여 내이 질환의 치료에 대한 증가된 효능을 나타낸다는 것이 발견되었다. 이는 외상 후 세포 재생 (특히 내이에서의)에 대하여 유의미한 주요 세포 인자의 활성제 유도 유전자 발현(실시예 4를 참조하시오)에 대한 그리고 청각적 외상 후 청각계의 재생에 대한 조직학적 (실시예 6을 참조하시오)과 마찬가지로 생리학적 검사 (실시예 7을 참조하시오)의 두 검사에 대하여 밝혀졌다. 부가적으로, 여러 실험들에서 본 발명의 화합물 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 (Ia)의 유의미하게 증가된 친유성 (실시예 3을 참조하시오)이 나타나고 있다. 참조 물질 9-메틸-β-카르볼린에 대하여 다른 것들 보다 하기의 이점들이 발생된다:
1. 막 투과성이 증가되었다.
2. 제거가 늦추어졌다 (6F9MβC의 제거 반감기는 9MβC의 대략 1.75-배 더 높다).
3. 다른 β-카르볼린으로부터 이들이 6번 위치에서의 하이드록실화 및 후속하는 공액화 반응에 의한 열화가 6번 위치에서의 플루오라이드기에 의한 이의 대사 과정을 차단하여
- 경구 적용 이후 개선된 생체이용율.
- 독성 대사산물 또는 잠재적으로 알러지를 일으키는 대사산물의 최소화된 위험.
4. 그러나 독성의 디-메틸화된 열화 생성물을 야기하는 β-카르볼린의 다른 공지된 대사 경로는 생체 내에서 순차적인 N-메틸화를 거쳐 진행되고, 여기에서 먼저 2번 위치에서 질소가 그리고 계속해서 9번 위치에서 질소가 메틸화된다. 현재의 실험에서 6F9MβC는 다행스럽게도 독성의 디-메틸화된 생성물을 야기하지 않고 (실시예 8을 참조하시오), 그에 의하여 독성 대사산물의 위험이 추가로 최소화된다.
5. 외상 후 세포 재생 (특히 내이에서의)에 대하여 유의미한 주요 세포 인자의 활성제 유도 유전자 발현(실시예 4를 참조하시오)에 대한 그리고 또한 청각적 외상 후 청각계의 재생에 대한 조직학적 (실시예 6을 참조하시오)과 마찬가지로 생리학적 검사 (실시예 7을 참조하시오)에 대한 증가된 효능.
7- 플루오로 -9- 메틸 -β- 카르볼린 (7F9MβC )
다른 구체예에 따르면, 본 발명은 β-카르볼린 7-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 그의 제조와 마찬가지로 그의 의약 용도 및 7-플루오로-9-메틸-β-카르볼린을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
화합물 7-플루오로-9-메틸-β-카르볼린은 여기에서는 또한 부분적으로 "7F9MβC"로 약칭될 수 있다.
본 발명은 식 (Ib)의 화합물 7-플루오로-9-메틸-β-카르볼린과 마찬가지로 상기 언급된 화합물의 약학적으로 수용가능한 염, 용매화물 및 수화물과 마찬가지로 전구약물 및 착화합물에 관한 것이다.
Figure 112016041206701-pct00012
상기 설명된 바와 같이, 여기에서 사용된 용어 전구약물은 비활성으로 또는 덜 효과적인 형태로 투여되는 약제학적 물질로 정의된다. 투여 후, 이는 그의 활성의, 유효한 형태, 상기의 경우 7-플루오로-9-메틸-β-카르볼린으로 전환된다.
본 발명의 7-플루오로-9-메틸-β-카르볼린과 산부가염을 형성할 수 있는 가능한 산은 하기의 것이 될 수 있다: 황산, 술폰산, 인산, 아질산, 과염소산, 브롬화수소산, 염산, 포름산, 아세트산, 프로피온산, 숙신산, 옥살산, 글루콘산 (글리콘산, 덱스트론산), 젖산, 말산, 타르타르산, 타르트론산 (하이드록시말론산, 하이드록시프로판디온산), 푸마르산, 시트르산, 아스코르브산, 말레산, 하이드록시말레산, 피루브산, 페닐아세트산, (o-, m-, p-) 톨루엔산, 벤조산, p-아미노벤조산, p-하이드록시벤조산, 살리실산, p-아미노살리실산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, 하이드록시에탄술폰산, 에틸렌술폰산, p-톨루엔술폰산, 나프탈렌술폰산, 나프틸아민술폰산, 술파닐산, 캄퍼술폰산, 차이나산 (퀸산), o-메틸-만델산, 하이드로겐벤젠술폰산, 피크르산 (2,4,6-트리니트로페놀), 아디핀산, d-o-톨릴타르타르산, 메티오닌, 트립토판, 아르기닌 등과 같은 아미노산 및 특히 글루탐산 또는 아스파르트산 같은 산성 아미노산. 더욱이 베타인-형태가 또한 가능하다.
본 발명의 다른 양태는 하기의 단계들:
a) 식 (III)의 글리옥실산 수화물 및 염기의 첨가 하에서 식 (IIb)의 출발물질 6-플루오로-1-메틸트립타민 염산염의 식 (IVb)의 화합물로의 반응
Figure 112016041206701-pct00013
b) 산의 첨가 하에서 그리고 가열 하에서 식 (IVb)의 화합물의 식 (Vb)의 7-플루오로-9-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-β-카르볼린으로의 탈카르복실화
Figure 112016041206701-pct00014
c) 촉매의 첨가 하에서 7-플루오로-9-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-β-카르볼린 (Vb)의 7-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 (Ib)로의 방향족화를 포함하는 본 발명의 화합물 7-플루오로-9-메틸-β-카르볼린의 제조 방법에 관한 것이다.
출발물질 6-플루오로-1-메틸트립타민 염산염은 예를 들면 Otavachemicals Ltd. (Vaughan, 캐나다)으로부터 상용적으로 획득가능하다. 본 발명의 바람직한 구체예에 있어서 단계 a)에서 2 내지 6, 바람직하게는 3 내지 5의 pH-값 특히 4의 pH-값이 염기의 첨가에 의해 달성된다. 보다 바람직한 구체예에 있어서 단계 a)'에서 화합물 IVb의 결정화가 빙수 중에서의 배양에 의하여 촉진된다.
보다 바람직한 구체예에 있어서 단계 b)에서의 반응은 비활성 가스 하에서, 특히 바람직하게는 N2 하에서 일어난다. 더욱이, 차가운, 특히 바람직하게는 0 ℃ 내지 5 ℃에서 수 시간 동안 단계 b)' 배양에 의하여 단계 b)의 반응 생성물의 결정화를 촉진시키는 것이 바람직하다. 보다 바람직한 구체예에 있어서 단계 b)의 반응 생성물의 정제를 위하여, 결정화 이후 메탄올로부터의 재결정이 수행된다. 더욱이, 단계 c)에서 7-플루오로-9-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-β-카르볼린이 먼저 물에 용해되고 염기, 예를 들면, 수산화나트륨 또는 탄산나트륨의 첨가에 의하여 염기성 pH-값을 특히 바람직하게는 pH 11 내지 pH 14, 특히 바람직하게는 pH 13으로 조정하는 것이 바람직하다.
바람직한 구체예에 있어서 단계 c)에서의 산화성 방향족화를 위한 촉매는 다른 것들 보다 Pd　/　C, Pt　/　C, PdCl2, Pd　/　세피올라이트, Pd　/　SiO2 및 Pd　/　AlO4가 될 수 있다. 산화성 방향족화를 가능하게 하는 다른 첨가제는 당해 기술분야에서 숙련된 자에게 공지되었다. 그러나, Pd / C (탄소 상의 팔라듐, 활성탄 상의 팔라듐)가 촉매로서 바람직하게 사용된다.
단계 a) 및 c)에서 첨가된 염기는 서로 독립적으로 무기 또는 유기 염기, 예를 들면, NaOH, KOH, NH4OH, 테트라알킬암모늄 하이드록사이드, 라이신 또는 아르기닌이 될 수 있다. 당해 기술분야에서 숙련된 자에게는 어느 염기가 여기에서 반응을 진행시키기에 적절한 것인지 공지되었다. 그러나 KOH 및 NaOH 각각이 바람직하다.
단계 b)에서 첨가되는 산은 무기 또는 유기 산, 예를 들면, 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산, 아세트산, 시트르산, 옥살산, 말산, 살리실산, p-아미노살리실산, 말론산, 푸마르산, 숙신산, 아스코르브산, 말레인산, 술폰산, 포스폰산, 과염소산, 질산, 포름산, 프로피온산, 글루콘산, 젖산, 타르타르산, 하이드록시말레인산, 피루브산, 페닐아세트산, 벤조산, p-아미노벤조산, p-하이드록시벤조산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, 아질산, 하이드록시에탄술폰산, 에틸렌술폰산, p-톨루엔술폰산, 나프틸술폰산, 술파닐산, 캄퍼술폰산, 차이나산, 만델산, o-메틸만델산, 하이드로겐벤젠술폰산, 피크르산, 아디프산, d-o-톨릴타르타르산, 타르트론산, α-톨루산, (o-, m-, p-) 톨루산 또는 나프틸아민술폰산일 수 있다. 당해 기술분야에서 숙련된 자에게는 어느 산이 여기에서 반응을 진행시키기에 적절한 것인지 공지되었다. 그러나, 염산이 바람직하다.
놀랍게도 본 발명의 화합물 7-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 (Ib)이 이미 공지되고 시험된 9-메틸-β-카르볼린 등과 같은 β-카르볼린에 비하여 내이 질환의 치료에 대한 증가된 효능을 나타낸다는 것이 발견되었다. 참조 물질 9-메틸-β-카르볼린에 대한 7-플루오로-9-메틸-β-카르볼린의 효능에 대한 최근의 실험에 기초하여, 다른 것들 보다 하기의 이점들이 발생된다:
1. 막 투과성이 증가되었다.
2. 제거가 늦추어졌다 (7F9MβC의 제거 반감기는 9MβC의 대략 1.5-배 더 높다).
3. 외상 후 세포 재생 (특히 내이에서의)에 대하여 유의미한 주요 세포 인자의 활성제 유도 유전자 발현(실시예 4 및 5를 참조하시오)에 대한 증가된 효능.
약제학적 적용 및 제형
본 발명에 따른 화합물은 특히 내이, 특히 내이의 신경 및 감각 구조의 질환 또는 손상의 치료에 적절하다. 이러한 질환 또는 손상은 여기에서는 바람직하게는 청력 및/또는 전정 기능에 영향을 준다. 수반되는 증후군에는 다른 무엇보다도 청각 손상, 난청, 현기증, 균형 교란, 이명, 방향 감각 상실, 구역 및 구토가 포함된다.
따라서, 본 발명의 하나의 관점은 약물로서 사용하기 위한 일반식 (I)의 화합물 (또는 일반식 (I)의 플루오로-9-메틸-β-카르볼린)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 약물로서 사용하기 위한 화합물 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린에 관한 것이다. 본 발명은 또한 약물로서 사용하기 위한 화합물 7-플루오로-9-메틸-β-카르볼린에 관한 것이다. 본 발명의 화합물, 특히 7-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 및 특히 바람직하게는 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린은 특히 내이의 질환 및/또는 손상, 특히 미로성 난청의 치료에 적절하다. 내이의 질환 및/또는 손상은 바람직하게는 내이의 급성 및 만성 질환일 수 있다. 귀의 청각적 외상, 폭발 손상, 난청 및 외상은 내이 보철의 이식 동안의 내이의 급성 질환으로 고려된다 (삽입 외상). 내이의 만성 질환에는 다른 무엇보다도 청각적 외상(만성적인 소음 노출에 의한 미로성 난청), 노인성 난청(노화와 관련된 청력 상실), 이경화증 및 메니에르병이 포함된다. 용어 미로성 난청 (또한 와우각 또는 감각성 난청으로 정의됨)에는 만성적인 소음 노출로 인한 난청과 마찬가지로 노인성 난청(노화와 관련된 청력 상실)이 포함된다.
본 발명의 또 다른 양태는 따라서 내이의 질환 및/또는 손상의 치료를 위한 일반식 (I)의 화합물, 특히 7-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 및 특히 바람직하게는 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린에 관한 것이며, 여기에서 내이의 질환 및/또는 손상은 귀의 청각적 외상, 폭발 손상, 청력 상실 및 삽입 외상을 포함하는 군으로부터 선택되는 내이의 급성 질환이다.
본 발명의 또 다른 양태는 따라서 내이의 질환 및/또는 손상의 치료를 위한 일반식 (I)의 화합물, 특히 7-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 및 특히 바람직하게는 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린에 관한 것이며, 여기에서 내이의 질환 및/또는 손상은 만성 청각적 외상, 이명 및 노인성 난청을 포함하는 군으로부터 선택되는 내이의 만성 질환이다.
더욱이, 본 발명의 화합물은 청각 손상 또는 귀 질환에 의해 야기되는, 그리고 특히 귀의 균형의 감각의 손상에 의해 야기되는 현기증 및 균형 교란의 치료와 마찬가지로 기억을 증가시키고, 학습 능력을 증가시키고 그리고 유지력, 특히 단기 기억과 마찬가지로 장기 기억의 유지력을 증가시키는 데 적절하다.
내이의 질환 및 손상은 또한 항생제 및/또는 세포증식억제제 등과 같은 이독성 물질에 의해 촉발될 수 있다. 본 발명의 화합물, 특히 7-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 및 특히 바람직하게는 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린은 내이의 손상이 이독성 물질로 야기되는 것을 특징으로 하는 내이의 질환 및/또는 손상을 치료하는 데 적절하다. 이독성 물질은 바람직하게는 항생제 및/또는 세포증식억제제, 특히 바람직하게는 암피실린, 바캄피실린, 카르베니실린, 인다닐, 메즐로실린, 피페라실린, 티카르실린, 아목시실린-클라불란산, 암피실린-술박탐, 벤질페니실린, 클록사실린, 디클로박실린, 메치실린, 옥사실린, 페니실린 지, 페니실린 브이, 피페라실린, 타조박탐, 티카르실린, 클라불란산, 나프실린, 세팔로스포린, 세파드록실, 세파졸린, 세팔렉신, 세팔로친, 세파피린, 세프라딘, 세파클로르, 세파만돌, 세포니시드, 세포테탄, 세폭시틴, 세프프로질, 세프메타졸, 세푸록심, 이오라카르베브, 세프디니르, 세프티부텐, 세포페라존, 세픽심, 세포탁심, 세프포독심, 프록세틸, 세프타지딤, 세프티족심, 세프트리악손, 세페핌, 아지트로마이신, 클라리트로마이신, 클린다마이신, 디리트로마이신, 에리트로마이신, 록시트로마이신, 텔리트로마이신, 세트로마이신, 스피라마이신, 안시마이신, 올레안도마이신, 린코마이신, 트롤레안도마이신, 시녹사신, 시프로플록사신, 에녹사신, 가티플로삭신, 그레파플록사신, 레보플록사신, 이오메플록사신, 목시플록사신, 날리딕스산, 노르플록사신, 오플록사신, 스프라플록사신, 트로바플록사신, 옥소린산, 제미플록사신, 퍼플록사신, 이미페넴-실라스타틴, 메로페넴, 아즈트레오남, 아미카신, 겐타마이신, 가나마이신, 네오마이신, 네틸마이신, 스트렙토마이신, 토브라마이신, 파로모마이신, 테이코플라닌, 반코마이신, 데메클로사이클린, 독시사이클린, 메타사이클린, 미노사이클린, 옥시테트라사이클린, 테트라사이클린, 클로르테트라사이클린, 티거사이클린, 마페니드, 실버설파다이아진, 설파세타미드, 설파다이아진, 설파메톡사졸, 설파살라진, 설피속사졸, 트리메토프림-설파메톡사졸, 설파메티졸, 리파부틴, 리팜핀, 리파펜틴, 리네졸리드, 스트렙토그라민스, 퀴노프리스틴, 달포프리스틴, 박시트라신, 클로람페니콜, 포스포파이신, 이소니아지드, 메테나민, 메트로니다졸, 무피로신, 니트로푸란토인, 니트로푸라존, 노보비오신, 폴리믹신, 스펙티노마이신, 트리메토프림, 콜리스틴, 사이클로세린, 카프레오마이신, 에티오나미드, 피라지나미드, 파라-아미노살리실산, 에리트로마이신-2'-아세테이트, 에리트로마이신-2'-스테아레이트, 에리트로마이신 에스톨레이트, 에리트로마이신 에틸숙시네이트, 에리트로마이신 글루타메이트, 리팜피신, 미코나졸, 케토코나졸, 클로트리마졸, 에코나졸, 비포나졸, 부토코나졸, 펜티코나졸, 이소코나졸, 옥시코나졸, 세르타코나졸, 술코나졸, 티오코나졸, 플루코나졸, 이트로코나졸, 이사부코나졸, 라부코나졸, 포사코나졸, 보리코나졸, 테라코나졸, 앱펀진, 테르비나핀, 아모롤핀, 나프티핀, 부테나핀, 아니둘라펀진, 카스포펀진, 미카펀진, 벤조산, 시클로피록솔아민, 톨나프테이트, 5-플루오로시토신, 그리세오풀핀, 할로프로진, 푸시딘산, 그라미시딘, 프리스티나마이신, 라모플라닌, 티로트리신 나타마이신, 리모시딘, 필리핀, 나이스타틴, 암포테리신 비, 칸디신 및 하마이신을 포함하거나 또는 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이다.
따라서, 본 발명의 다른 양태는 내이의 질환 및/또는 손상의 치료를 위한 일반식 (I)의 화합물, 특히 7-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 및 특히 바람직하게는 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린에 관한 것이며, 여기에서 내이의 손상은 이독성 물질에 의해 야기된 것이다.
본 발명의 다른 양태는 내이의 질환 및/또는 손상의 치료를 위한 약물의 제조를 위한 본 발명의 화합물, 특히 7-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 및 특히 바람직하게는 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 하나의 구체예는 일반식 (I)의 화합물, 특히 7-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 (Ib) 및 특히 바람직하게는 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린(Ia)의 투여에 의한 내이의 질환 및/또는 손상의 치료를 위한 방법에 관한 것이다.
게다가, 본 발명의 다른 흥미로운 양태는 이러한 점을 다룰 것이다: 본 발명자들은 세포 수준에서의 본 발명자들의 검사에서 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 (6F9MβC)이 CREB의 농도를 8배로 증가시키고 BDNF (뇌 유래 신경영양인자)의 농도를 3배까지 증가시킨다는 것을 발견하였다. 이러한 통찰은 본 발명의 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 (6F9MβC)이 내이의 질환 및/또는 손상의 치료에서 유용할 뿐만 아니라 또한 학습 및 기억을 증진시킨다는 것을 암시하고 있다.
학습 및 기억의 내재 메카니즘은 매우 복잡하다. 이들은 분자 및 세포 수준에서, 시스템 생물학의 수준에서 그리고 심리학의 수준에서 고려될 수 있다. 분자 수준에서의 기억 형성에 대한 핵심 과정 중의 하나는 cAMP 반응 요소 결합 단백질 (CREB: cAMP response element binding protein)의 활성화이다. 이는 기억 형성과 결합된 과정인 시냅스의 새로운 형성을 야기한다. 이 과정은 많은 인자들에 의해 조절된다. 양성 증폭(positive amplification)이 뇌 BDNF 및 그의 수용기 TRKB에 의해 유도된다. 생물거동 실험 (실시예 9를 참조하시오)은 동물 모델 렛트에 대한 본 발명의 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 (6F9MβC)의 투여가 미처리 대조군 동물에 비하여 학습 과정을 촉진시키고 기억을 개선한다는 것을 나타내었다.
본 발명의 다른 양태는 따라서 학습 및 기억을 개선하거나 기억을 증가시키거나 학습 능력을 증가시키고 그리고 유지력을 증가시키기 위한 일반식 (I)의 화합물, 특히 7-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 및 특히 바람직하게는 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 양태는 학습 및 기억을 개선시키기 위한 약제학적 제형의 제조를 위한 본 발명의 화합물, 특히 7-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 및 특히 바람직하게는 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 하나의 구체예는 일반식 (I)의 화합물, 특히 7-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 (Ib) 및 특히 바람직하게는 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 (Ia)의 투여에 의하여 학습 및 기억을 개선시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 따라서 학습 과정 및/또는 기억 과정을 개선시키기 위한 일반식 (I)의 화합물, 특히 7-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 및 특히 바람직하게는 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는 학습 과정 및/또는 기억 과정을 개선시키기 위한 약제학적 제형의 제조를 위한 본 발명의 화합물, 특히 7-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 및 특히 바람직하게는 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 하나의 구체예는 일반식 (I)의 화합물, 특히 7-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 (Ib) 및 특히 바람직하게는 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 (Ia)의 투여에 의하여 학습 과정 및/또는 기억 과정을 개선시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는 적어도 하나의 본 발명의 화합물 (또는 적어도 하나의 일반식 (I)의 화합물)을 포함하는 액적, 연고, 스프레이, 리포좀, 겔, 에멀젼 또는 주사용액의 형태의 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는 하나 이상의 본 발명의 화합물 (또는 하나 이상의 일반식 (I)의 화합물)을 포함하는 액적, 연고, 스프레이, 리포좀, 겔, 에멀젼 또는 주사용액의 형태의 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린을 포함하는 액적, 연고, 스프레이, 리포좀, 겔, 에멀젼 또는 주사용액의 형태의 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 7-플루오로-9-메틸-β-카르볼린을 포함하는 액적, 연고, 스프레이, 리포좀, 겔, 에멀젼 또는 주사용액의 형태의 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 및 7-플루오로-9-메틸-β-카르볼린을 포함하는 액적, 연고, 스프레이, 리포좀, 겔, 에멀젼 또는 주사용액의 형태의 약제학적 조성물에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 또한 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 및/또는 7-플루오로-9-메틸-β-카르볼린을 포함하는 액적, 연고, 스프레이, 리포좀, 겔, 에멀젼 또는 주사용액의 형태의 약제학적 조성물에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 또한 적어도 하나의 본 발명의 화합물 (또는 적어도 하나의 일반식 (I)의 화합물) 또는 그의 염을 사용하여 제조되는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 하나 이상의 본 발명의 화합물 (또는 하나 이상의 일반식 (I)의 화합물) 또는 그의 염을 사용하여 제조되는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명의 화합물 7-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 또는 그의 염을 사용하여 제조되는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 본 발명의 화합물 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 또는 그의 염을 사용하여 제조되는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 화합물 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 또는 그의 염을 사용하고 본 발명의 화합물 7-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 또는 그의 염을 사용하여 제조되는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
유사하게, 본 발명은 본 발명의 화합물 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 및/또는 7-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 또는 그의 염을 사용하여 제조되는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
적어도 하나의 본 발명의 화합물 (또는 일반식 (I)의 화합물) 외에, 특히 7-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 외에 그리고 특히 바람직하게는 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 외에, 약제학적 조성물은 바람직하게는 약학적으로 수용가능한 담체, 보조제 및/또는 용매를 포함한다.
본 발명의 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 외에 약제학적 조성물은 바람직하게는 약학적으로 수용가능한 담체, 보조제 및/또는 용매를 포함한다.
본 발명의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물은 경피 적용 시스템 (첩부제, 필름), 액적, 알약, 정제, 필름코팅 정제, 다층정, 드라제, 겔, 하이드로겔, 연고, 시럽, 과립, 좌약 (우불라스), 에멀젼, 분산액, 마이크로캡슐, 캡슐, 마이크로제제, 나노제제, 리포좀, 분말, 스프레이, 에어로졸, 용액, 쥬스, 현탁액, 수액 또는 주사액의 형태로 제조되고 투여될 수 있다. 리포좀, 겔 및 에멀젼의 형태의 약제학적 조성물이 바람직하다. 하이드로겔 제형이 특히 바람직하다.
이러한 조성물은 다른 무엇보다도 흡인 또는 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 점액피부, 경구, 직장, 경피(transdermal), 국소, 구강, 피내(intradermal), 위내, 피내(intracutaneous), 비내, 구강내, 경피(percutaneous), 고실내 또는 설하 투여에 적절하다. 중이 내로의 투여 또는 주사와 마찬가지로 고막 상에로의 국소 투여가 특히 바람직하다.
예를 들면, 락토오스, 전분, 소르비톨, 슈크로스, 셀룰로오스, 마그네슘스테아레이트, 디칼슘포스페이트, 칼슘설페이트, 활석, 만니톨, 에틸알코올 등이 약제학적으로 수용가능한 담체로서 사용될 수 있다. 분말과 마찬가지로 정제는 이러한 담체 5 내지 95 중량%로 이루어질 수 있다.
게다가, 익스플로더, 염료, 방향제 및/또는 결합제가 약제학적 조성물에 첨가될 수 있다.
액체 제형에는 용액, 현탁액, 스프레이 및 에멀젼이 포함된다. 예를 들면 주사용액은 비경구 주사를 위하여 물을 기반으로 하거나 물-프로필렌글리콜을 기반으로 한다.좌약의 제조를 위하여는, 바람직하게는 저-융점 왁스, 지방산에스테르 및 글리세리드가 사용된다.
캡슐은 예를 들면 메틸셀룰로오스, 폴리비닐알코올 또는 변성 젤라틴 또는 전분으로 제조된다. 익스플로더로서는 전분, 소듐카르복시메틸 전분, 예를 들면 캐롭 검, 카라야 검, 구아 검, 트라가칸트 검 및 한천 등과 같은 천연 및 합성 검과 마찬가지로 메틸셀룰로오스, 소듐카르복시메틸셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스 등과 같은 셀룰로오스 유도체와 마찬가지로 알긴산염, 점토 및 벤토나이트가 사용될 수 있다. 이러한 성분은 2 내지 30 중량%의 양으로 사용될 수 있다.
결합제로서 당, 옥수수, 쌀 또는 감자 유래 전분, 아카시아 검 또는 구아 검, 젤라틴 트라가칸트 검, 알긴산, 소듐알기네이트, 암모늄칼슘알기네이트 등과 같은 천연과 마찬가지로 합성 검, 메틸셀룰로오스, 소듐카르복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌글리콜, 왁스와 마찬가지로 마그네슘알루미늄실리케이트 등과 같은 무기 화합물이 첨가될 수 있다. 결합제는 1 내지 30 중량%의 양으로 첨가될 수 있다.
활제로서 마그네슘스테아레이트, 칼슘스테아레이트, 포타슘스테아레이트, 등과 같은 스테아레이트, 스테아린산, 고-융점 왁스와 마찬가지로 염화나트륨, 소듐벤조에이트, 소듐아세테이트, 소듐올레이트, 폴리에틸렌글리콜, 붕산 및 류신 등과 같은 아미노산과 같은 수용성 활제가 사용될 수 있다. 이러한 활제는 0.05 내지 15 중량%의 양으로 사용될 수 있다.
따라서, 활성제를 국부적으로 원창 막 상에 투여하기에 적절한 모든 약제학적 제형이 바람직하다. 게다가, 약제학적 제형이 막투과촉진제를 포함하는 경우, 원창 막을 통하여 일반식 (I)의 본 발명의 화합물, 특히 7-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 및 특히 바람직하게는 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린의 통과를 지지하는 것이 바람직하다. 따라서, 액체 또는 겔-형의 제형이 특히 바람직하다. 물론 활성제를 경구로 투여하는 것 또한 가능하다.
일반식 (I)의 화합물의 임의의 형태의 투여를 위한 약제학적 조성물은 치료적으로 유효한 적정량의 일반식 (I)의 화합물 및 필요한 경우 무기 또는 유기의, 고체 또는 액체의 약제학적으로 수용가능한 담체 물질을 포함한다. 중이 중에의 국소 투여에 적절한 약제학적 조성물은 중이에의 투여 전에 제조될 수 있는, 예를 들면, 동결건조된 제형의 경우, 일반식 (I)의 화합물 만 또는 가능하게는 담체와 함께 포함하는 수성 용액 또는 현탁액을 포함한다.
7-플루오로-9-메틸-β-카르볼린의 임의의 형태의 투여를 위한 약제학적 조성물은 치료적으로 유효한 적정량의 7-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 및 필요한 경우 무기 또는 유기의, 고체 또는 액체의 약제학적으로 수용가능한 담체 물질을 포함한다. 중이 중에의 국소 투여에 적절한 약제학적 조성물은 중이에의 투여 전에 제조될 수 있는, 예를 들면, 동결건조된 제형의 경우, 7-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 만 또는 가능하게는 담체와 함께 포함하는 수성 용액 또는 현탁액을 포함한다.
6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린의 임의의 형태의 투여를 위한 약제학적 조성물은 치료적으로 유효한 적정량의 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 및 필요한 경우 무기 또는 유기의, 고체 또는 액체의 약제학적으로 수용가능한 담체 물질을 포함한다. 중이 중에의 국소 투여에 적절한 약제학적 조성물은 중이에의 투여 전에 제조될 수 있는, 예를 들면, 동결건조된 제형의 경우, 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 만 또는 가능하게는 담체와 함께 포함하는 수성 용액 또는 현탁액을 포함한다.
약제학적 조성물은 추가로 생분해가능하거나 비-생물학적으로 분해가능한, 수성 또는 비-수성 또는 미소구에 기초하는 겔을 포함한다. 이러한 겔의 예들에는 폴록사머, 히알루론산염, 자일로글루칸, 키토산, 폴리에스터, 폴리악티드, 폴리글리콜리드 또는 이들의 공중합체 PLGA, 사카로아세테이트 이소부티레이트 및 글리세린모노올레이트가 포함된다. 경장 또는 비경구 투여에 적절한 약제학적 조성물에는 상기 기술된 바와 같이 정제 또는 젤라틴 캡슐 또는 수성 용액 또는 현탁액이 포함된다.
약제학적 조성물은 멸균될 수 있고/되거나 보조제, 예를 들면, 보존제, 안정화제, 습윤제 및/또는 유화제, 삼투압을 조절하기 위한 염 및/또는 완충제를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물은, 필요한 경우, 추가로 활성제를 포함할 수 있다. 이러한 약제학적 조성물은 당해 기술분야에서 공지된 임의의 종류의 방법에 의해, 예를 들면, 혼합, 과립화, 성형(confectioning), 용해 및 동결건조 등과 같은 통상적인 방법에 의하여 제조될 수 있고 이는 동결건조물로서 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린의 대략 0.01 내지 100 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 50 중량%에서 100중량% 까지 포함할 수 있다. 이러한 약제학적 조성물은 또한 7-플루오로-9-메틸-β-카르볼린의 대략 0.01 내지 100 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 50 중량%에서 100중량% 까지 포함할 수 있다. 이러한 약제학적 조성물은 또한 일반식 (I)의 화합물의 대략 0.01 내지 100 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 50 중량%에서 100중량% 까지 포함할 수 있다.
바람직한 구체예에 있어서 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 국소 적용용으로 제형화된다. 이성 투여(otogenic administration)에 적절한 담체는 약제학적으로 수용가능하고 본 발명에 따른 화합물 및/또는 그의 추가의 활성제와 반응하지 않는 유기 및 무기 물질, 예를 들면, 요리용 식염, 알코올, 식물유, 벤질알코올, 알킬글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 글리세린트리아세테이트, 젤라틴, 락토오스 또는 전분 등과 같은 탄수화물, 마그네슘카보네이트 (마그네시아, 백악), 스테아레이트 (왁스), 활석 및 페트로라툼(바세린)이다. 기술된 조성물은 멸균될 수 있고/되거나 보조제, 예를 들면, 활제, 티오메르살 등과 같은 보존제 (즉, 50 중량%), 안정화제 및/또는 습윤제, 유화제, 삼투압에 영향을 주기 위한 염, 완충물질, 염료 및/또는 방향제를 포함할 수 있다. 이러한 조성물은, 필요한 경우, 또한 하나 이상의 부가의 활성제를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 이성 조성물은 다른 화합물 및/또는 물질, 예를 들면, 항생제, 스테로이드, 코르티손 등과 같은 항염증활성제, 진통제, 안티피린, 벤조카인, 프로카인 등과 같은 다른 생물학적 활성물질을 포함할 수 있다.
국소 투여를 위한 본 발명에 따른 조성물은 다른 약제학적으로 수용가능한 화합물 및/또는 물질을 포함할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에 있어서 국소 부형제는 귀에, 중이 내에 또는 이도 내에 투여되는 경우에 일반식 (I)의 화합물, 특히 7-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 및 특히 바람직하게는 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린의 그리고 가능하게 부가되는 활성제 또는 활성제들의 혈액 순환 시스템에로 또는 중추신경계로의 방출을 증폭시키지 않는 것이 선택된다. 가능한 담체 물질에는 탄화수소산(hydrocarbonic acid), 친수성 페트로라툼 (바세린) 및 무수 라놀린 (즉, Aquaphor®) 등과 같은 무수 흡수제(water-free adsorbent) 및 라놀린 및 콜드 크림 등과 같은 수-유 에멀젼에 기초하는 수단이 포함된다. 필수적으로 배제되지 않고 대개는 수용성과 마찬가지로 수중유 에멀젼 (크림 또는 친수성 연고)에 기초하는 물질 및 폴리에틸렌글리콜에 기반하는 담체 물질 및 메틸셀룰로오스, 하이드록시에틸셀룰로오스 및 하이드록시프로필-메틸-셀룰로오스와 같은 여러 물질로 겔화된 수성 용액 등과 같이 수용성 기반을 갖는 물질인 담체 물질이 보다 바람직하다.
정제 또는 캡슐의 형태로의 경구 투여를 위하여는 본 발명에 따른 화합물은 사전-겔화된 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 등과 같은 결합제; 락토오스, 사카로스, 글루코스, 만니톨, 소르비톨 및 다른 환원 및 비-환원당, 미정질 셀룰로오스, 칼슘설페이트, 칼슘하이드로겐포스페이트 등과 같은 충진제; 마그네슘스테아레이트, 활석 또는 실리카, 스테아린산, 소듐스테아릴푸마레이트, 글리세릴베헤네이트, 칼슘스테아레이트 등과 같은 활제; 감자 전분 또는 소듐글리콜레이트 전분 등과 같은 붕해제; 소듐도데실설페이트 등과 같은 습윤제; 염료; 방향제; 젤라틴; 감미제; 아라비아 검, 트라가칸트 검 또는 알기네이트 등과 같은 천연 및 합성 검; 완충제 염; 카르복시메틸셀룰로오스; 폴리에틸렌글리콜; 왁스 등등을 포함하는 목록으로부터 선택되는 비-독성의 약제학적으로 수용가능한 보조제와 혼합될 수 있다.
정제는 예를 들면 아라비아 검, 젤라틴, 활석, 이산화티탄 등을 포함할 수 있는 농축된 당 용액으로 코팅될 수 있다. 다른 구체예에 있어서 정제는 휘발성 유기 용매 또는 유기 용매의 혼합물에 용해되는 중합체로 코팅될 수 있다. 바람직한 구체예에 있어서 일반식 (I)의 본 발명의 화합물, 특히 7-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 및 특히 바람직하게는 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린은 즉시방출용 정제로서 또는 서방 형태의 정제로서 제형화된다. 즉시방출용의 투여량 형태는 60 분 또는 그 이하의 짧은 시간 내에 일반식 (I)의 화합물의 대부분 또는 총량의 방출을 허용하고 본 발명에 따른 화합물의 신속한 흡수를 가능하게 한다. 서방 형태는 보다 긴 시간에 걸쳐 일반식 (I)의 화합물의 치료학적으로 유효한 혈장 수준에 도달하고/하거나 보다 긴 시간에 걸쳐 이 치료학적으로 유효한 혈장 수준을 유지하고/하거나 일반식 (I)의 화합물, 특히 7-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 및 특히 바람직하게는 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린의 다른 약동학적 특성을 변성하도록 지연된 방출을 허용한다.
본 발명에 따른 화합물은 연질 젤라틴 캡슐을 제형화하기 위하여 예를 들면 식물유 또는 폴리에틸렌글리콜과 혼합될 수 있다. 경질 젤라틴 캡슐은 락토오스, 사카로스, 만니톨, 감자 전분, 옥수수 전분 등과 같은 전분 등과 같은 정제를 위한 상기 언급된 보조제 또는 아밀로펙틴, 셀룰로오스 유도체 또는 젤라틴을 사용하는 과립 형태의 본 발명의 화합물을 포함할 수 있다. 또한 액체 또는 반-액체 형태의 본 발명에 따른 화합물이 경질 젤라틴 캡슐 내에 충진될 수 있다.
일반식 (I)의 본 발명에 따른 화합물, 특히 7-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 및 특히 바람직하게는 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린은 또한 예를 들면 폴리글리콜산/젖산 (PGLA)으로부터 제조된 마이크로비드 또는 마이크로캡슐 내에 내포될 수 있다. 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리락트산과 폴리글리콜산의 공중합체, 폴리-ε-카프로락톤, 폴리하이드록시부티르산, 폴리오르토에스터, 폴리아세탈, 폴리하이드로퓨란, 폴리시아노아크릴레이트 및 하이드로겔의 가교화되거나 양친매성인 블록공중합체를 포함하는 목록으로부터 선택되는 생체적합성 중합체가 본 발명의 약제학적 조성물로부터 본 발명의 화합물의 제어된 방출을 달성하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에 있어서 일반식 (I)의 화합물, 특히 7-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 및 특히 바람직하게는 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린은 경구 투여를 위한 액체 제형으로 제공된다. 경구 투여를 위한 액체 제제는 용액, 시럽, 에멀젼 또는 현탁액의 형태로 제공될 수 있다. 달리, 경구 투여를 위한 액체 제형은 적용 이전에 경구 투여를 위한 건조 제형의 물 또는 다른 적절한 담체 물질로의 재구성에 의해 제조될 수 있다. 경구 투여를 위한 제제는 본 발명에 따른 화합물 및 가능한 부가의 활성제의 제어되고 지연된 방출이 달성될 수 있도록 제형화될 수 있다.
액체 형태의 경구 투여를 위하여 본 발명에 따른 화합물은 에탄올, 글리세린 물 등과 같은 비-독성의 약제학적으로 수용가능한 비활성의 담체 물질; 소르비톨 시럽, 셀룰로오스 유도체 또는 경화된 식용가능한 지방 등과 같은 현탁제; 레시틴 또는 아라비아 검 등과 같은 유화제; 아몬드 오일, 오일성 에스테르, 에탄올 또는 분획된 식물유(fractioned vegetable oil) 등과 같은 비-수성 담체 물질; 메틸 또는 프로필 p-하이드록시벤조에이트 또는 소르빈산 등과 같은 보존제; 등등이 함께 사용될 수 있다. 예를 들면 부틸하이드록시아니솔, 부틸하이드록시톨루엔, 프로필갈레이트, 소듐아스코르베이트, 시트르산 등과 같은 항산화제와 같은 안정화제가 또한 투여량 형태의 안정화를 위하여 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따른 화합물의 용액은 대략 0.2 중량%에서 대략 20 중량%까지 포함할 수 있으며, 여기에서 평탄화 화합물(levelling compound)은 당 및 에탄올, 물, 글리세린 및 프로필렌글리콜의 혼합물일 수 있다. 선택적으로, 이러한 액체 제형은 염료, 방향제, 사카린, 증점제로서 카르복시셀룰로오스 및/또는 다른 보조제를 포함할 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 본 발명에 따른 화합물의 치료학적으로 유효한 투여량은 용액으로 경구적으로 투여되며, 여기에서 용액은 보존제, 감미제, 가용화제 및 용매를 포함할 수 있다. 경구 투여를 위한 용액은 하나 이상의 완충제, 방향제 또는 추가의 부형제를 포함할 수 있다. 다른 구체예에 있어서 페퍼민트 또는 다른 방향제가 경구 투여를 위한 본 발명의 화합물의 용액에 첨가된다.
흡인에 의한 투여를 위하여는, 본 발명에 따른 화합물은 가압된 팩으로의 에어로졸 스프레이 또는 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 등과 같은 적절한 추진제 또는 다른 적절한 가스를 사용하는 스프레이의 투여량 형태로 적절한 경로로 투여될 수 있다. 가압된 에어로졸을 사용하는 경우, 투여량은 계량된 양의 투여를 위한 밸브를 제공하는 것에 의해 결정될 수 있다. 캡슐 및 카트릿지가 본 발명에 따른 화합물 및 가능한 하나 이상의 추가의 활성제의 분말 혼합물과 마찬가지로 락토오스 또는 전분 등과 같은 적절한 분말 기반 물질을 포함하도록 하여 예를 들면 흡인기 또는 취입기에서 사용하기 위한 젤라틴의 캡슐 및 카트릿지가 제형화될 수 있다.
주사에 의한 비경구 투여를 위한 용액은 대략 0.5 중량% 내지 10 중량%의 농도를 갖는 본 발명에 따른 화합물, 특히 7-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 및 특히 바람직하게는 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린의 수용성의 약제학적으로 수용가능한 염의 수성 용액으로부터 제조될 수 있다. 이러한 용액은 또한 안정화제 및/또는 완충제 물질을 포함할 수 있고 서로 다른 투여량 단위를 갖는 앰플로서 제공된 적절한 수단일 수 있다.
따라서, 여기에서 제공된 본 발명의 화합물, 특히 7-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 및 특히 바람직하게는 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린은 내이의 질환 및/또는 손상의 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조에 유용하다. 여기에서 내이의 질환 및/또는 손상은 바람직하게는 급성 및/또는 만성의 내이의 질환이다. 청각적 외상, 귀의 폭발 손상, 청력 상실 및 삽입 외상이 무엇보다도 내이의 급성 질환에 속한다. 만성 청각적 외상, 이명 및 노인성 난청이 내이의 만성 질환에 속한다. 질환 및/또는 손상은 추가로 이들이 이독성 물질에 의해 야기될 수 있다는 사실로 특징지워질 수 있다.
도 1은 일반식 (II)의 플루오로-1-메틸트립타민 (염산염으로서) 및 글리옥실산 수화물 (III)의 일반식 (IV)의 중간체 및 일반식 (V)의 플루오로-9-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-β-카르볼린을 거친 일반식 (I)의 플루오로-9-메틸-β-카르볼린으로의 3-단계 반응의 반응 개요이다. 여기에서는 R1 = -F이고 R2 = -H 또는 -F이고 이는 일반식 (I), (II), (IV) 및 (V)의 화합물에 동등하게 적용되거나 R1 = -H이고 R2 = -F이고 이는 일반식 (I), (II), (IV) 및 (V)의 화합물에 동등하게 적용된다.
도 1a는 5-플루오로-1-메틸트립타민 염산염 (IIa) 및 글리옥실산 수화물 (III)의 중간체 생성물 (IVa) 및 6-플루오로-9-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-β-카르볼린 (Va)을 거친 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 (Ia)으로의 3-단계 반응의 반응 개요이다.
도 1b는 6-플루오로-1-메틸트립타민 염산염 (IIb) 및 글리옥실산 수화물 (III)의 중간체 생성물 (IVb) 및 7-플루오로-9-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-β-카르볼린 (Vb)을 거친 7-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 (Ib)으로의 3-단계 반응의 반응 개요이다.
도 2는 AC102 (6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린)과 함께 15일 배양한 SH-SY5Y 세포주를 나타내는 도면이다.
도 3은 AC002 (9-메틸-β-카르볼린)과 함께 15일 배양한 SH-SY5Y 세포주를 나타내는 도면이다.
도 2 및 도 3은 15일 동안 증가하는 농도의 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 (AC102)에 노출시킨 인간 신경모세포종 세포 (SH-SY5Y)의 배양물을 나타내고 있다 (도 2). 비교를 위하여 동일한 조건 하에서 9-메틸-β-카르볼린 (AC102)의 영향을 도 3에 제공하였다. 상부 열은 70 μmol/ℓ에 대한 현재 실험으로부터 나온 반면, 하부 열은 이전 실험으로부터의 농도 의존성을 나타내고 있다. 본 발명에 따른 화합물 (AC102)은 세포의 증식을 억제하고 슬림 익스텐션(slim extension)의 발아와 마찬가지로 세포의 크기 및 형태에서의 변화를 유도한다. 이는 분화의 유도에 의하여 설명된다. 본 화합물의 이러한 영향은 두 시간에서 농도 0 μM (대조) 및 30 μM을 비교하는 경우에 특히 확연하였다.
도 4는 9-메틸-β-카르볼린 (9MβC, AC002) 및 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 (6F9MβC, AC102)의 HPLC 크로마토그램이다. 체류 시간 (retention time)은 각각 5.3 및 7.3 분 이다. 컬럼: Phenomenex Luna 3uC18 (2) 100A; 용리액: ACN90%/NH4Ac 40mM [45/55]
도 5는 6F9MβC (10　μM, 20　μM 및 30　μM) 또는 9MβC (30　μM, 50　μM 및 70　μM)에 대한 SH-SY5Y 세포의 노출 각각 2 일 (밝은 회색 막대), 7 일 (짙은 회색 막대) 및 14 일 (검은색 막대) 후의 BDNF (뇌-유래 신경영양인자, 도 5a), Lif (백혈병억제인자, 도 5b), NT3 (뉴로트로핀 3, 도 5c), Id2 (분화 억제자 2, 도 5d), BTG2 (B-세포 전이 유전자 2, 도 5e), Cbln (세레벨린 1 전구체 단백질, 도 5f), DRD2S (도파민 수용기 아형 2의 짧은 변형체, 도 5h), DKK1 (딕콥트-연관 단백질 1(Dickkopf-related protein 1), 도 5i)의 상대 유전자 발현과 마찬가지로 몫 Bax/Bcl2 (도 5g)을 나타내는 도면이다. 상대 유전자 발현은 참조 조건에 대한 개별 인자의 유전자 발현을 의미한다.
도 6은 7F9MβC에 대한 SH-SY5Y 세포의 노출 각각 2 일 (밝은 회색 막대), 7일 (짙은 회색 막대) 및 14 일 (검은색 막대)의 BDNF (뇌-유래 신경영양인자, 도 6a), Lif (백혈병억제인자, 도 6b), DRD2S (도파민 수용기 아형 2의 짧은 변형체, 도 6c) 및 DKK1 (딕콥트-연관 단백질 1, 도 6d)의 상대 유전자 발현을 나타내는 도면이다. 상대 유전자 발현은 참조 조건에 대한 개별 인자의 유전자 발현을 의미한다.
도 7은 청각적 외상 후의 기니피그의 팔로이딘으로의 면역조직화학적인 염색 후에 절단한 와우각의 형광 현미경 영상 (Alexa　Fluor®　488로 표지된)이며, 여기에서 하나의 귀는 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 (6F9MβC, 귀 당 총 0.105　㎎) (도 7b)으로 처리되고 두 번째의 미처리된 귀는 개체-내 대조 (또한 "대조"로 칭함, 도 7a)로서 기능한다. 내유모세포 (IHC) 및 3개의 열 (I, II, III) 외유모세포 (OHC)가 인식될 수 있다. 사멸 세포가 백색 화살표로 강조되었고 청각적 외상의 손상 영향을 입증하고 있다. 축적 = 25 ㎛.
도 8은 청각적 외상 후의 기니피그의 팔로이딘으로의 면역조직화학적인 염색 후에 절단한 와우각의 형광 현미경 영상 (Alexa　Fluor®　488로 표지된)이며, 여기에서 하나의 귀는 9-메틸-β-카르볼린 (9MβC, 귀 당 총 0.2　㎎) (도 8의 B)으로 처리되고 두 번째의 미처리된 귀는 개체-내 대조 (또한 "대조"로 칭함, 도 8의 A)로서 기능한다. 내유모세포 (IHC) 및 외유모세포 (OHC)가 인식될 수 있다. 사멸 세포가 백색 화살표로 강조되었고 청각적 외상의 손상 영향을 입증하고 있다. 축적 = 100 ㎛.
도 9는 청각적으로 유도된 소음 외상 후의 기니피그의 청각 문턱값의 영구적인 이동을 나타내는 도면이며, 여기에서 소음 외상 후의 하나의 귀는 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 (6F9MβC, 귀 당 총 0.18　㎎)으로 처리되고 두 번째의 미처리된 귀는 개체-내 대조 (대조)로서 기능한다. 청각 문턱값은 청각적으로 유발된 뇌간 전위를 측정하는 것에 의하여 결정되었으며, 이는 청각적 소음 외상 3 일 전 (D-3), 청각적 소음 외상 30 분 후(D0)와 마찬가지로 청각적 소음 외상 14 일 후(D14)에 측정되었다. 청각 문턱값의 영구적인 이동은 측정된 값들 D14 - D-3으로부터 산출되었다. 나타난 값들은 4개의 독립적인 측정 (n = 4)으로부터의 평균값이다.
도 10은 도 9와 마찬가지이나, 여기에서 청각적으로 유도된 소음 외상 후의 기니피그의 청각 문턱값의 회복을 나타내었다. 이는 측정된 값들 D0 - D14로부터 산출되었다. 나타난 값들은 4개의 독립적인 측정 (n = 4)으로부터의 평균값이다.
도 11은 청각적으로 유도된 소음 외상 후의 기니피그의 청각 문턱값의 회복을 나타내며, 여기에서 소음 외상 후의 하나의 귀는 9-메틸-β-카르볼린 (9MβC, 귀 당 총 0.2　㎎)로 처리되고 두 번째의 미처리된 귀는 개체-내 대조 (대조)로서 기능한다. 청각 문턱값은 청각적으로 유발된 뇌간 전위를 측정하는 것에 의하여 결정되었으며, 이는 청각적 소음 외상 3 일 전 (D-3), 청각적 소음 외상 후(D1)와 마찬가지로 청각적 소음 외상 14 일 후(D14)에 측정되었다. 청각 문턱값의 회복은 측정된 값들 D1 - D14로부터 산출되었다.
도 12는 도 11과 마찬가지이나, 여기에서 귀 당 0.35 ㎎의 9-메틸-β-카르볼린이 투여되었다.
도 13은 미처리된 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 (6F9MβC, 도 13a), 간 파쇄액과 함께 1 시간 동안 배양된 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 (도 13b), 6-플루오로-2,9-디메틸-β-카르볼리늄 이온 (6F29DMβC, 도 13c) 및 2,9-디메틸-β-카르볼리늄 이온 (29DMβC, 도　13d)의 HPLC 크로마토그램이다. 체류 시간은 19.0 분 (6F9MβC 및 간 + 6F9MβC), 10.1 분 (6F29DMβC) 및 9.1 분 (29DMβC)이었다. 컬럼: Phenomenex Luna 3uC18 (2) 100A; 용리액: ACN90%/NH4Ac 40mM [45/55]
실시예
실시예 1a: 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린의 합성
Ho and Walker (Beng T. Ho and K. E. Walker; Org . Synth. 1971, 51, 136 or Org . Synth . 1988, Coll . Vol. 6, 965)의 절차와 유사하게, 3.5　mmol (800　mg)의 5-플루오로-1-메틸트립타민 염산염 (도 1a, 식　IIa, AKos GmbH, Steinen)을 10 ㎖의 물에 용해시키고 810 ㎕ 물 중의 3.9　mmol (356.4　㎎)의 글리콜산 수화물 (도 1a, 식 III)의 용액과 결합시켰다. 계속해서, 교반하면서 3.4　mmol (190.4　㎎) 수산화칼륨의 용액을 피펫팅하였으며, 여기에서 pH는 대략 4로 조정되었다. 반응 혼합물을 3 시간 동안 실온에서 교반시키고 결정화를 완료하기 위하여 추가의 1 시간 동안 빙욕(ice bath) 내에 위치시켰다. 베타인 (도 1a, 식 IVa)의 오렌지 베이지색 침전을 여과하고 약간의 빙수로 세척하였다. 탈카르복실화를 위하여 여전히 습윤한 베타인 (도 1a, 식 IVa)의 여과 케이크를 플라스크 내로 옮기고 희석 염산 (6.48　㎖ 물 및 918 ㎕ 농염산)에 용해시켰다. 반응 혼합물을 10 분 동안 질소 하에서 환류시키고, 다시 945 ㎕ 농염산을 고무마개를 통하여 첨가하고 다시 15 분 동안 환류시켰다. 후속하여, 용액을 실온으로 가져가고 2 시간 동안 0 내지 5 ℃에서 저장하였다. 형성된 6-플루오로-9-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-β-카르볼린 (도 1a, 식 Va)의 결정을 여과하고 메탄올로부터 재결정시켰다. 수율: 230　㎎ (52　%).
방향족화를 위하여, 230　㎎의 6-플루오로-9-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-β-카르볼린 (도 1a, 식 Va)을 15 ㎖ 물에 용해시키고, 수산화나트륨으로 pH 13으로 맞추고 에틸아세테이트 및 톨루엔 (1:1)의 혼합물로 3회 추출하였다. 결합된 유기상을 황산마그네슘 (MgSO4) 상에서 건조시키고 감압 하에서 증발시켰다. 오일상 잔사를 50 ㎖ 톨루엔으로 취하고, 100　㎎ Pd/C (10　%)와 결합시키고 24 시간 동안 환류시켰다. 여전히 따뜻한 용액으로부터 Pd/C를 여과하고 여과 케이크를 20 ㎖의 따뜻한 톨루엔으로 세척하였다. 유기상을 진공 중에서 증발시켰다. 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 (도 1a, 식 Ia)의 오일상 잔사를 방치 동안에 결정화하고 183　㎎ (96　%)의 겨자-황색 결정을 형성한다.
융점: 117 내지 118 ℃; 유리 염기의 GC/MS: m/z = 201 (10　%), 200 (100　%), 199 (71　%), 185 (13　%), 145 (6　%), 131 (6　%), 양성자 핵자기공명 분광분석(1H-NMR): δ (ppm) 메탄올 d4, 400　㎒: 3.80, s, 3H, N-CH3; 7.34, m, 1H; 7.43, m, 1H; 7.73, m, 1H; 7.91, m, 1H; 8.24, m, 1H; 8.73, m, 1H, 탄소 핵자기공명 분광분석(13C-NMR): δ (ppm) 메탄올 d4, 100 ㎒: 28.23; 106.38; 106.64; 110.20 및 110.29, d; 114.67; 116.25; 116.52; 120.59 및 120.66, d; 127.91; 131.30; 136.95; 137.51; 138.35; 156.20 및 158.55, d,
C12H9FN2 x 0.1 H2O x 0.1 톨루엔에 대한 원소 분석: C, H, N,
이론치: C: 72.21; H: 4.77; N: 13.26, 실측치: C: 72.01; H: 4.55; N: 13.45
실시예 1b: 7-플루오로-9-메틸-β-카르볼린의 합성
6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린의 합성과 유사하게, 3.5　mmol (800　㎎)의 6-플루오로-1-메틸트립타민 염산염 (도 1b, 식　IIb , Otavachemicals Ltd., Vaughan, Canada)를 10 ㎖의 물에 용해시키고 810 ㎕의 물 중의 3.9　mmol (356.4　㎎)의 글리콜산 수화물 (도 1b, 식 III)의 용액과 결합시켰다. 계속해서, 교반하면서 3.4　mmol (190.4　㎎) 수산화칼륨의 용액을 피펫팅하였으며, 여기에서 pH는 대략 4로 조정되었다. 반응 혼합물을 3 시간 동안 실온에서 교반시키고 결정화를 완료하기 위하여 추가의 1 시간 동안 빙욕 내에 위치시켰다. 베타인 (도 1b, 식 IVb )의 오렌지-베이지색 침전을 여과하고 약간의 빙수로 세척하였다. 탈카르복실화를 위하여 여전히 습윤한 베타인 (도 1b, 식 IVb )의 여과 케이크를 플라스크 내로 옮기고 희석 염산 (6.48　㎖ 물 및 918 ㎕ 농염산)에 용해시켰다. 반응 혼합물을 10 분 동안 질소 하에서 환류시키고, 다시 945 ㎕ 농염산을 고무마개를 통하여 첨가하고 다시 15 분 동안 환류시켰다. 후속하여, 용액을 실온으로 가져가고 12 시간 동안 0 내지 5 ℃에서 저장하였으며, 여기에서 7-플루오로-9-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-β-카르볼린 (도 1b, 식 Vb )을 염산-염으로서 침전시켰다. 형성된 결정을 여과하고 메탄올로부터 재결정시켰다. 수율: 각각 1 mmol 및 250　㎎ (28　%).
방향족화를 위하여, 250　㎎의 7-플루오로-9-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-β-카르볼린 염산염 (도 1b, 식 Vb )을 15 ㎖ 물에 용해시키고, 수산화나트륨 용액으로 pH 13으로 맞추고 밤새도록 냉장고 내에 저정하였다. 여과된 베이지색 결정 고체로 결정화한 유리 염기를 물로 세척하고 진공 중에서 건조시켰다. 고체를 50 ㎖ 톨루엔 중에 현탁시키고, 100　㎎ Pd/C (10　%)와 결합시키고 8 시간 동안 환류시켰다(전환 제어를 위한 TLC). 여전히 따뜻한 용액으로부터 Pd/C를 여과하고 여과 케이크를 20 ㎖의 따뜻한 톨루엔으로 세척하였다. 유기상을 진공 중에서 증발시켰다. 7-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 (도 1b, 식 Ib )의 오일상 잔사를 방치 동안에 결정화하고 겨자-황색 결정을 형성하고, 이를 컬럼크로마토그래피 (CHCl3/메탄올 9:1)로 정제하였다. 160　㎎ (80　%)이 잔류하였다.
실시예 2: 인간 신경모세포종 세포 ( SH - SY5Y )의 분화
SH-SY5Y 세포주를 German collection of microorganisms and cell cultures - DSMZ, Braunschweig로부터 입수하였다. 10　% FCS (우태혈청, Biochrom AG) 및 페니실린/스트렙토마이신 (Biochrom AG)을 수반하는 MEM (최소필수배지, Life Technologies)에서 세포를 배양시켰다. 형태학적 검사를 위하여 세포를 1 ㎖ 배지를 수반하는 24-웰 플레이트 (Falcon, 세포 배양 처리됨)에 1.5　x　104 세포/㎠의 밀도로 파종하였다. 50% 에탄올 중의 본 발명에 따른 화합물 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린의 10　mmol/ℓ 저장 용액을 준비하고 멸균여과하였다. 세포의 파종 5 시간 후 본 발명에 따른 화합물 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린을 대응하는 양의 배지에 첨가하여 소정의 최종 농도가 되도록 하였다. 배지를 주 1회 교환하였다. 세포를 정기적으로 현미경으로 검사하였다. 현미경 영상을 10　x 렌즈 및 4 x 디지털 줌으로 BZ Keyence 10으로 촬영하였다. 프로그램 BZ Analyzer로 자동 대비 증강을 수행하였다.
30 μM 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린에 비하여 대략 70 μM 9-메틸-β-카르볼린의 농도에서 첨음으로 시험된 세포의 상당한 분화가 관측되었기 때문에, 9-메틸-β-카르볼린에 비하여 본 발명의 화합물 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린의 이점이 발견되었다. 30 μM의 본 발명의 화합물 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린에 비하여 인간 신경모세포종 세포의 분화의 표식으로서 50 μM 9-메틸-β-카르볼린은 너무 낮은 신경돌기 성장의 결과를 가져왔다.
실시예 3: 9 - 메틸 -β- 카르볼린에 비한 6- 플루오로 -9- 메틸 -β- 카르볼린의 친유성
6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린의 친유성이 9-메틸-β-카르볼린의 친유성 보다 더 높은 지의 여부를 검사하기 위하여 하기의 검사를 수행하였다. 실험적으로, 옥탄올과 물 간의 실제 분배 또는 보다 간단하게는, Valko에 의해 기술된 바와 같이, 역-상 컬럼 (RP18)으로의 HPLC 실험 (K.　Valko; Journal of Chromatography A 2004, 1037 (1-2), 299-310)에 의하여 친유성을 결정하였다. 여기에서 조사될 물질의 성분들은 고정상에 대하여 다른 세기로 상호작용한다. 만일 하나의 성분의 고정상에 대한 상호작용이 더 약한 경우, 이는 더 빨리 컬럼을 빠져나온다. 이러한 상호작용의 세기에 따라 물질의 성분들은 분리 컬럼의 말단에서 서로 다른 시간 (체류 시간)에서 출현한다. 이러한 검사를 두 물질들에 대하여 수행하였다. 본 발명의 화합물 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린이 9-메틸-β-카르볼린 보다 더 긴 체류 시간을 갖는 것으로 나타났으며 (도 4), 이는 명확하게 선택된 컬럼과 마찬가지로 고정상과 관련한 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린의 더 높은 친유성을 명확하게 나타내고 있다.
더욱이, 실온에서의 수중에서의 두 화합물들의 일련의 농도를 준비하는 것에 의하여 수중의 두 화합물의 용해도가 결정되었다. 화합물이 간신히 용해되는 농도를 외부 교정으로 결정하였다. 대응하는 농도를 HPLC로 정량화하였다. 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 (염기)이 29.7　㎎/ℓ의 최대 가용 농도를 갖고 9-메틸-β-카르볼린 (염기)이 168.3　㎎/ℓ의 최대 가용 농도를 갖는다는 것이 관측되었다. 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린의 더 낮은 수용해도는 역으로 9-메틸-β-카르볼린에 비하여 증가된 친유성을 지지한다.
화합물의 친유성은 ADME 매개변수 ("흡수(absorptopm)", "분배(distribution)", "대사(metabolism)" 및 "배설(excretion)")에 대하여 강한 영향을 갖는다. 증가된 친유성으로 인하여, 화합물은 특히 친유성 구획(lipophilic compartment)에서 풍부화된다. 막을 통과하기 위해서는, 화학물질은 생물학적 이중막의 소수성 부분을 통과하여야 하며, 따라서 이들은 친유성이어야 한다. 지질 가용성과 막 통과 사이에는 양호한 상관관계가 종종 존재한다. 따라서 친유성은 화합물의 약동학에 대하여 유의미한 영향을 갖는다. 요약하면, 다중 검사에서 9-메틸-β-카르볼린에 비하여 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린의 유의미하게 증가된 친유성이 나타나고 있다.
본 발명에 따른 화합물의 다른 중요한 양태는 제거 반감기의 연장에 관한 것이다. 비록 9-메틸-β-카르볼린이 6번 위치에서 하이드록실화에 의하여 분해되는 반면에, 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린에 대하여는 이 대사 경로는 플루오라이드기에 의해 차단된다. 이것이 9-메틸-β-카르볼린에 비하여 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린의 반감기의 증가에 대한 가능한 이유이다. 9-메틸-β-카르볼린의 구조적 유사체인 하만의 반감기가 인간의 혈장 중에서 대략 68 분이기 때문에 (Rommelspacher et al.; Eu J Pharmacol 2002, 441 (1-2), 115-125), 이 값의 연장은 본 발명의 화합물, 특히 만성 질환의 치료를 위한 적용에서 유의미한 이점을 나타낸다.
동물 기관 보다 정밀하게는 외림프 (알려진 운동의 자리)에서의 9-메틸-β-카르볼린 (9MβC), 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 (6F9MβC) 및 7-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 (7F9MβC)의 반감기의 보다 나은 평가를 위하여, 기니피그에 대한 검사를 수행하였다. 따라서, 40 ㎕의 하이드로겔 (18% 폴록사머 407 및 0.6% 알기네이트)에 포장된 개개 활성제 (귀 당 총 1.4 ㎎ 활성제로서)를 마취된 기니피그의 원창의 막 바로 앞에 1회 투여하였다. 이들 막들은 외림프액-충진된 내이로부터 공기-충진된 중이를 분리한다. 소정의 시간 (20 분, 2　시간, 8　시간 또는 24　시간)의 만료 후, 마취 하에서 와우각의 상단 (첨단)으로부터 매회 5 ㎕ 외림프액을 제거하였다. 후속하여, 동물을 치사시켰다. 적어도 귀들에서 각 시간 (20 분, 2　시간, 8　시간 또는 24　시간) 마다 측정된 값들을 취하고 평균하였다.
외림프액 샘플 중에서의 대응하는 활성제의 농도를 고-성능 액체 크로마토그래피 (HPLC, 부분적으로는 또한 고-압 액체 크로마토그래피라고도 불리움) 및 개개 활성제의 자가 형광의 측정에 의하여 결정하였다. HPLC에 대하여는 용리액은 90% 아세토니트릴 45% 및 암모늄아세테이트 55%로 구성되었다 (40　mM, pH <5). 유속은 0.4 ㎖/분 이고 주입 용량은 10 ㎕이었다. 신호가 너무 강한 경우, 각 샘플을 60% 메탄올로 희석시켰다. 매 운전 이후 주사 바늘을 100% 이소프로판올로 세척하였다. 검출한계는 20 fmol/ℓ이었다.
결정된 활성제 농도로부터 제거 반감기를 산출하였다. 9-메틸-β-카르볼린이 대략 3.4　시간의 제거 반감기를 갖고, 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린이 대략 6.0 시간의 제거 반감기를 갖고 그리고 7-플루오로-9-메틸-β-카르볼린이 대략 5.0 시간의 제거 반감기를 갖는다는 것이 밝혀졌다. 9-메틸-β-카르볼린에 비하여 본 발명의 화합물들의 제거 반감기의 1.5-배 (7F9MβC) 내지 1.75-배 (6F9MβC) 증가로, 선행 기술에 비하여 유의미하게 개선된 생체이용율이 일어난다. 종합적으로, 놀랍게도, 외림프에서 결정된 반감기가 혈액 중에서 예측된 반감기 보다 더 높다 (예를 들면 9MβC와 관련하여).
실시예 4: 정량적 RT- PCR -실험 I
신경모세포종 세포에서 손상된 감각모세포에 대하여 재생 효과를 갖는 것으로 알려진 주요 신경보호 및 신경영양 인자의 발현에 대하여 본 발명에 따른 화합물들 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 및 7-플루오로-9-메틸-β-카르볼린과 마찬가지로 선행 기술로부터의 9-메틸-β-카르볼린이 어느 정도까지 작용하는 지가 검사되어야 한다. 게다가, 이들은 내이로부터 뇌간을 통하여 계속해서 뇌의 청각 센터까지 정보를 매개하는 나선신경절의 신경 세포의 활력을 개선시킨다. 외상의 경우에서 감각모세포의 신경 연장부가 수축되고, 그에 의하여 대응하는 소리의 신호가 더 이상 전진하지 못한다. 신경영양 인자는 신경 연장부와 그에 들어맞는 감각모세포 간의 연결을 야기하여 대응하는 소리가 다시 들릴 수 있도록 한다.
institute of human genetics of university hospital Eppendorf에 의해 제공되고 이는 차례로 Braunschweig resource center로부터 수령한 SH-SY5Y 세포주가 이 목적을 위하여 수행된 RT-PCR 실험 (역 전사효소 폴리머라아제 연쇄 반응)을 위하여 다시 사용되었다.
10　% FCS (우태혈청, Biochrom AG) 및 페니실린/스트렙토마이신 (Biochrom AG)을 수반하는 MEM (최소필수배지, Life Technologies)에서 세포를 배양시켰다. 세포를 5 ㎖ 배지를 수반하는 25 ㎠ 세포배양병 (Falcon, 세포 배양 처리됨) 내에 1　x　105 세포/㎠의 밀도로 파종하였다. 증류수 중의 화합물 9-메틸-β-카르볼린 (AC-002 또는 9MβC) 및 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 (AC-102 또는 6F9MβC) 각각의 10　mmol/ℓ 저장 용액을 준비하고 멸균여과하였다. 세포의 파종 1 일 후 화합물들을 대응하는 양 (5 내지 55㎕)의 배지에 첨가하여 배지 중의 6F9MβC에 대하여는 10 μM, 20 μM 및 30 μM 그리고 9MβC에 대하여는 30 μM, 50 μM 및 70 μM의 최종 농도에 도달되도록 하였다. 대조들은 단지 대응하는 양의 용매 (증류수) 만 수령하였다. 배지를 주 1회 교환하였다.
세포를 정기적으로 현미경으로 검사하고 배양 시간 2 일, 7 일 및 14 일 후에 수확하고, PBS로 세척하고 즉각적으로 -80 ℃에서 동결시켰다.
Roche 사의 HighPure RNA Isolation kit로 RNA-단리를 수행하였다. 이러한 단리에는 DNaseI 소화가 포함된다. RNA의 농도를 nanoDrop 분광분석기로 측정하였고 RNA 무결성을 Bioanalyzer 2100 (Agilent)의 도움으로 결정하였다. 랜덤 헥사머 프라이머(random hexamer primer), 보호기 RNA 억제제 (Roche) 및 transcriptor reverse transcriptase (fermentas)를 사용하는 것에 의하여, 300 ng의 RNA를 각 샘플 마다 cDNA 내로 전사시켰다.
반응 이후, 이 생산량(run)을 1:4로 희석시키고 그 중의 2 ㎕를 각 정량적 RT-PCR 당 사용하였다. 이를 LightCycler 480 중에서 SybrGreen format 중의 표준 조건 하에서 각 프라이머에 대하여 개별적으로 결정된 어닐링 온도로 수행하였다. 가능하다면, 엑손 신장 프라이머(exon spanning primer)가 사용되었다.
사용된 프라이머의 목록은 표 1(정량적 RT-PCR 실험에 대한 프라이머 시퀀스. 추가로 대응하는 시퀀스 동정 번호 (SEQ-ID)를 괄호 내에 나열하였다. 모든 프라이머의 시퀀스는 5'-3'-방향으로 주어졌다.)에서 찾을 수 있다.
Figure 112016041206701-pct00015
융점 곡선 분석 및 후속의 겔 전기영동에 의하여 특이성을 입증하였다. 각 PCR에 대하여 PCR 효율 및 Cq 값을 프로그램 LinRegPCR로 결정하였고 이들을 추가의 계산에서 사용하였다. B2M (β2-마이크로글로불린)을 검사 조건에 적절한 다중 대조 유전자로부터 동정하였다. 모든 결과들은 대응하는 대조 조건과 비교한 결과이며, 여기에서 단지 용매 만이 특정된 기간 동안 (즉 2 일, 7 일 또는 14 일)에 적용되었다. 도 5a 내지 도 5i들에 또한 상대 유전자 발현 (대조 조건들에 대한)이 제공되었다. 여기에서, 2-일 노출이 밝은 회색으로, 7-일 노출이 짙은 회색으로 그리고 14-일 노출이 검은색으로 나타내었다. 도 5a 내지 도 5i로부터 모든 측정된 값은 3개의 독립적인 생물학적 샘플들의 평균값을 나타내고 있다.
도 5a는 신경영양 BDNF (뇌유래 신경영양인자)의 6F9MβC (10　μM, 20　μM 및 30　μM) 또는 9MβC (30　μM, 50　μM 및 70　μM)에 대한 2 일, 7 일 및 14 일 노출 후의 상대 유전자 발현을 나타내고 있다. 30　μM 6F9MβC 또는 9MβC에 대한 노출 후 BDNF 발현과 비교할 때, 이미 이 농도에서 6F9MβC에 의해 유도된 발현이 9MβC에 의해 유도된 발현 보다 대략 2배 더 높은 것으로 나타났다.
도 5b는 세포 분화를 자극하고 증식을 억제하는 Lif (백혈병억제인자)의 6F9MβC (10　μM, 20　μM 및 30　μM) 또는 9MβC (30　μM, 50　μM 및 70　μM)에 대한 2 일, 7 일 및 14 일 노출 후의 상대 유전자 발현을 나타내고 있다. 30　μM 6F9MβC 또는 9MβC에 대한 노출 후 Lif 발현과 비교할 때, 이미 이 농도에서 2-일 노출 후 6F9MβC에 의해 유도된 Lif의 발현이 9MβC에 의해 유도된 발현 보다 대략 3배 더 높은 것으로 나타났다. 또한 6F9MβC에 대한 14-일 노출 후 Lif 발현이 9MβC에 비하여 대략 2배이다. 단지 6F9MβC에 대한 7-일 노출 후 Lif의 발현은 9MβC에 비하여 약간 낮은 것으로 보인다. 6F9MβC의 낮은 농도에서의 높은 발현이 또한 주목할 만하다.
도 5c는 뉴로트로핀 NT3 (뉴로트로핀 3)의 6F9MβC (10　μM, 20　μM 및 30　μM) 또는 9MβC (30　μM, 50　μM 및 70　μM)에 대한 2 일, 7 일 및 14 일 노출 후의 상대 유전자 발현을 나타내고 있다. 30　μM 6F9MβC 또는 9MβC에 대한 노출 후 NT3 발현과 비교할 때, 이미 이 농도에서 14-일 노출 후 6F9MβC에 의해 유도된 NT3의 발현이 9MβC에 의해 유도된 발현 보다 대략 3.5-배 더 높은 것으로 나타났다. 6F9MβC의 낮은 농도, 특히 단지 10 μM 6F9MβC에 대한 7-일 노출 후에서의 높은 발현이 또한 주목할 만하다.
도 5d는 세포 분화를 억제하고 따라서 증식을 촉진하는 Id2 (분화 억제자 2)의 상대 유전자 발현을 나타내고 있다. 유전자가 비활성화된 마우스가 신경퇴행 현상을 나타내고 있다는 것이 또한 기술되었다. 6F9MβC (10　μM, 20　μM 및 30　μM) 또는 9MβC (30　μM, 50　μM 및 70　μM)에 대한 2 일, 7 일 및 14 일 노출 후 Id2의 상대 유전자 발현이 나타났다. 30　μM 6F9MβC 또는 9MβC에 대한 노출 후 Id3 발현과 비교할 때, 이미 이 농도에서 6F9MβC에 의해 유도된 Id2의 발현이 9MβC에 의해 유도된 발현 보다 대략 2-배 내지 3.5-배 더 높은 것으로 나타났다. 6F9MβC의 낮은 농도에서의 Id2의 높은 발현이 또한 주목할 만하다.
도 5e는 뉴로프로텍터(neuroprotector) BTG2 (B-세포 전이 유전자 2)의 6F9MβC (10　μM, 20　μM 및 30　μM) 또는 9MβC (30　μM, 50　μM 및 70　μM)에 대한 2 일, 7 일 및 14 일 노출 후의 상대 유전자 발현을 나타내고 있다. 30　μM 6F9MβC 또는 9MβC에 대한 노출 후 BTG2 발현과 비교할 때, 이미 이 농도에서 6F9MβC에 의해 유도된 BTG2의 발현이 9MβC에 의해 유도된 발현 보다 대략 1.25-배 내지 2.7-배 더 높은 것으로 나타났다. 이미 10 μM 6F9MβC에서 9MβC의 가장 높은 농도에 필적하는 BTG2의 발현이 관측되었다 (2-일 노출 후는 제외).
도 5f는 뉴로프로텍터 Cbln (세레벨린 1 전구체 단백질)의 6F9MβC (10　μM, 20　μM 및 30　μM) 또는 9MβC (30　μM, 50　μM 및 70　μM)에 대한 2 일, 7 일 및 14 일 노출 후의 상대 유전자 발현을 나타내고 있다. 30　μM 6F9MβC 또는 9MβC에 대한 노출 후 Cbln 발현과 비교할 때, 이미 이 농도에서 6F9MβC에 의해 유도된 Cbln의 발현이 9MβC에 의해 유도된 발현 보다 대략 1.5-배 더 높은 것으로 나타났다(2-일 노출 후는 제외). 단지 20 μM 6F9MβC에서 Cbln의 발현이 심지어 더 높은 것으로 보여진다.
도 5g는 세포자멸사 표지자로서 여겨지는 Bac 및 Bcl2의 6F9MβC (10　μM, 20　μM 및 30　μM) 또는 9MβC (30　μM, 50　μM 및 70　μM)에 대한 2 일, 7 일 및 14 일 노출 후의 유전자 발현의 몫을 나타내고 있다. Bax/Bcl2 몫이 더 작을수록 세포자멸사가 더 낮다. 30　μM 6F9MβC 또는 9MβC에 대한 노출 후 Bax/Bcl2 몫과 비교할 때, 9MβC 후에 비하여 6F9MβC 후에서 유의미하게 낮았다(2-일 노출 후는 제외). 6F9MβC의 낮은 농도에서의 낮은 Bax/Bcl2 몫이 또한 주목할 만하다.
도 5h는 DRD2S (도파민 수용기 아형 2의 짧은 변형체)의 6F9MβC (10　μM, 20　μM 및 30　μM) 또는 9MβC (30　μM, 50　μM 및 70　μM)에 대한 2 일, 7 일 및 14 일 노출 후의 유전자 발현의 몫을 나타내고 있다. 30　μM 6F9MβC 또는 9MβC에 대한 노출 후 DRD2S 발현과 비교할 때, 이미 이 농도에서 2-일 및 14-일 노출 후 6F9MβC에 의해 유도된 DRD2S의 발현이 9MβC에 의해 유도된 발현 보다 더 높았고 7-일 노출 후 9MβC에 의해 유도된 발현 보다 더 낮은 것으로 나타났다. 6F9MβC의 낮은 농도에서 7-일 노출 후 DRD2S의 발현은 9MβC에 의해 유도된 발현에 필적하는 것으로 보인다.
도 5i는 신경 세포의 분화에 중요하고 현재의 통찰 이후에 감각세포의 외상에서 중요한 핵심적인 역할을 하는 인자 DKK1 (닥콥트-연관 단백질 1)의 6F9MβC (10　μM, 20　μM 및 30　μM) 또는 9MβC (30　μM, 50　μM 및 70　μM)에 대한 2 일, 7 일 및 14 일 노출 후의 상대 유전자 발현을 나타내고 있다. 30　μM 6F9MβC 또는 9MβC에 대한, 특히 더 짧은 노출 (2 일 및 7 일) 후에서 DKK1 발현과 비교할 때, 6F9MβC에 의해 유도된 DKK1의 발현이 9MβC에 의해 유도된 발현 보다 1.4-배 내지 2.7-배 더 높은 것으로 나타났다. 14-일 노출에 대하여는 이 값들은 서로 필적할 만하다. 그리고 7-일 노출 후 9MβC에 의해 유도된 발현 보다 더 낮다. 이미 10 μM 6F9MβC에서 9MβC의 가장 높은 농도에서의 발현에 비하여 상당하거나 심지어 더 높은 DKK1의 발현이 감지되었다는 것이 또한 주목할 만하다.
종합적으로, 본 발명의 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린이 최근의 기술 수준의 9-메틸-β-카르볼린에 비하여 세포의 분화 및 증식에 대하여 따라서 또한 외상 후의 감각조직의 재생에 대하여 직접적 또는 간접적인 영향을 갖는 거의 모든 시험된 세포 인자들에 대하여 이로운 효과를 갖는다는 것이 밝혀졌다. 내이에서 외상 후 세포 복구 과정에 대하여 가장 중요한 인자에 속하는 인자 BDNF 및 Lif 들이 특히 강조된다. 따라서, 본 발명에 따른 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린이 내이의 질환 및/또는 손상에 성공적으로 적용될 뿐만 아니라 최근의 기술 수준의 메틸-β-카르볼린 보다 더 낮은 농도에서 가능성을 갖는다.
실시예 5: 정량적 RT- PCR 실험 II
실시예 4와 유사하게 본 발명의 활성제 7-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 (7F9MβC)에 대한 RT-PCR 실험에 또한 어느 정도 중요한 세포 인자들에 대하여 수행되었다. 여기에서 실험 절차는 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 및 9-메틸-β-카르볼린에 대한 실험과 동일하였다. 여기에서 동일한 (6F9MβC와 마찬가지로) 배양 배지에 대하여 30　μM, 50　μM 및 70　μM 7F9MβC의 최종 농도가 사용되었다. 검사된 인자들은 BDNF (뇌-유래 신경영양인자), Lif (백혈병억제인자), DRD2S (도파민 수용기 아형 2의 짧은 변형체)와 마찬가지로 DKK1 (딕콥트-연관 단백질 1)이었다. 실시예 4에서의 개개 표적 유전자에 대하여 이미 나열된 동일한 프라이머들 (표 1)이 사용되었다. 이미 언급한 바와 같이, 특히 BDNF 및 Lif가 내이에서 외상 후 세포 복구 과정에 대하여 가장 중요한 인자에 속한다.
도 6a는 뉴로트로핀 BDNF (뇌-유래 신경영양인자)의 7F9MβC (10　μM, 20　μM 및 30　μM)에 대한 2 일, 7 일 및 14 일 노출 후의 상대 유전자 발현을 나타내고 있다. 30　μM 7F9MβC 또는 9MβC에 대한 노출 후에서 BDNF 발현과 비교할 때 (도 5a), 2-일 노출에 대하여 7F9MβC에 의해 유도된 BDNF의 발현이 9MβC에 의해 유도된 발현 보다 대략 3배 더 높은 것으로 나타났다. 더 긴 노출에 대하여 값들은 서로 필적할 만하다.
도 6b는 세포 분화를 자극하고 증식을 억제하는 Lif (백혈병억제인자)의 7F9MβC (10　μM, 20　μM 및 30　μM)에 대한 2 일, 7 일 및 14 일 노출 후의 상대 유전자 발현을 나타내고 있다. 30　μM 7F9MβC에 대한 그리고 30　μM 9MβC에 대한 노출 후에서 Lif 발현과 비교할 때(도 5b), 2-일 노출에서 7F9MβC에 의해 유도된 Lif의 발현이 9MβC에 의해 유도된 발현 보다 대략 3배 더 높은 것으로 나타났다. 7-일 노출에서 7F9MβC에 의한 유도가 더 약하였고 14-일 노출에서 이 값들은 서로 필적할 만하다. 20 μM 7F9MβC에 대한 2-일 노출 후의 Lif의 더 높은 발현이 또한 뚜렷하다.
도 6c는 DRD2S (도파민 수용기 아형 2의 짧은 변형체)의 7F9MβC (10　μM, 20　μM 및 30　μM)에 대한 2 일, 7 일 및 14 일 노출 후의 상대 유전자 발현을 나타내고 있다. 30　μM 7F9MβC에 대한 그리고 30　μM 9MβC에 대한 노출 후에서 DRD2S 발현과 비교할 때(도 5h), 2-일 노출에서 7F9MβC에 의해 유도된 DRD2S의 발현이 9MβC에 의해 유도된 발현 보다 2배 더 높은 것으로 나타났다. 7-일 노출 후 이 값들은 서로 필적할 만하고 14-일 노출 후 7F9MβC에 의한 유도가 9MβC에 의한 유도 보다 약간 더 약하였다.
도 6d는 신경 세포의 분화에 중요하고 현재의 통찰 이후에 감각세포의 외상에서 중요한 핵심적인 역할을 하는 인자 DKK1 (닥콥트-연관 단백질 1)의 7F9MβC (10　μM, 20　μM 및 30　μM)에 대한 2 일, 7 일 및 14 일 노출 후의 상대 유전자 발현을 나타내고 있다. 30　μM 7F9MβC에 대한 그리고 30　μM 9MβC에 대한 노출 후에서 DKK1 발현과 비교할 때(도 5i), 2-일 노출에 대하여 7F9MβC에 의해 유도된 DKK1의 발현이 9MβC에 의해 유도된 발현 보다 1.4-배 더 높은 것으로 나타났다. 7-일 노출 후 이 값들은 서로 필적할 만하고 14-일 노출 후 7F9MβC에 의한 유도가 9MβC에 의한 유도 보다 2.2-배 더 높았다.
종합적으로, 최근의 기술 수준의 9-메틸-β-카르볼린에 비하여 7-플루오로-9-메틸-β-카르볼린이 짧은 노출에서 특히 더 높은 효과를 달성한다는 것이 주목되고 있다. 하나의 가능한 설명은 7-플루오로-9-메틸-β-카르볼린이 9-메틸-β-카르볼린 보다 더 친유성이고 그에 의하여 세포를 더 빨리 투과하고 따라서 더 빨리 세포 중에서 높은 농도에 도달한다는 것이다. 이러한 이점들은 이들이 효율적이고 더 짧은 치료 지속기간을 가능하게 하고 이는 환자의 이점으로 기능하기 때문에 치료학적인 관점에서 바람직하다. 따라서 치료학적인 위치에서, 예를 들어 청각적 외상 및 난청 등과 같은 내이의 급성 손상의 치료에서 7-플루오로-9-메틸-β-카르볼린이 최근의 기술 수준의 9-메틸-β-카르볼린에 비하여 더 우수하다.
실시예 6: 면역조직화학적 실험
이하에서는, 조직학적 기반에서 기니피그에의 9-메틸-β-카르볼린 (9MβC) 또는 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 (6F9MβC)의 투여가 내이 중에서의 외유모세포 (OHC)의 청각적 외상-유발 사멸에 어떻게 영향을 미치는 지의 여부를 조사하였다. 이 점에서 내유모세포 (IHC)는 임의의 외상에 대하여 보다 덜 감수적이다.
청각적 외상을 유도하기 위하여, 기니피그를 60 ㎎/㎏ 케타민 및 8 ㎎/㎏ 자일라진으로 마취시켰다. 계속해서 눈에 베판텐 연고 (Bayer)를 투여하고 동물을 방음실에 투입하였다. 보정된 스피커를 동물의 두부 바로 위에 위치시키고, 여기에서 스피커는 약 8 ㎑를 중심으로 반 옥타브 대역을 110 ㏈의 음량으로 30 분 동안 방출하도록 설정되었다.
하이드로겔 (18% 폴록사머 407 및 0.6% 알기네이트)에 포장된 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 및 9-메틸-β-카르볼린 각각을 매 실험을 위하여 새로이 제조하고 적용시킬 때까지 냉장고에 +4℃에서 저장하였다.
열민감성의, 액체 혼합물을 시각 하에서 해밀턴 시린지(Hamilton syringe)로 중이의 원창 막 직전에 투여하였다(10 ㎕). 첫 번째 투여량 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 (예를 들어 0.07 ㎎)을 청각적 외상 1 시간 후에 0.007 ㎎/㎕의 농도로 그리고 두 번째 투여량 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 (5 ㎕의 용적 중의 0.035 ㎎)을 3 일 차에 투여하였다. 여기에서, 동물 당 단지 하나의 귀만이 처리된 반면, 두 번째의 귀는 개체-내 대조로 제공되었다. 대조는 여기에서는 특히 "대조"로 약칭되었다. 비교 실험에서 단지 활성제 비히클 (하이드로겔) 만의 투여가 완전히 미처리된 귀에 비하여 효과가 없음이 밝혀졌다. 각 활성제 (대조를 포함하여)에 대하여는 4개체의 기니피그가 검사되었다.
청각적 외상 후 14 일차에서 귀의 병소를 와우각이 포함되도록 절개하였다. 준비물(preparation)을 얼음처럼 차가운 4% 파라포름알데히드 (PFA) 내에 24 시간 동안 침지시키고 +4 ℃에서 저장하였다. PFA-고정화 이후 준비물을 인산염-완충 염화나트륨 용액 (PBS)으로 2회 세척하고 그 후 탈회(decalcification)를 위하여 10% 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA) 내에 위치시켰다. 적어도 48 시간 후 준비물을 PBS로 2회 세정하고 그 후 와우각을 절단하였다. 계속해서 감각세포를 포함하는 코르티기관 전체를 와우각에서 절단하고 동등한 길이의 4개의 단편으로 절단하였다. 매 단편은 3/4 와우각 턴(3/4 cochlea turn)의 코르티기관에 대응한다. 이러한 방식으로 소리 유도 손상이 국소화되고 정량화될 수 있다. 1:40의 희석비로 2% 우혈청알부민 (BSA) 및 Alexa　Fluor®　488-표지 팔로이딘 (Invitrogen, catalogue #A12379)을 포함하는 PBS 중에 절단물을 10 분 동안 위치시켰다. 그 후 절단물을 10 분 동안 PBS로 3회 세척하고 슬라이드 상에 편평하게 위치시켰다. 고정 배지 (Invitrogen, cat # P36935)를 포함하는 한 방울의 Pro Long DAPI를 절단물 상에 첨가하고, 계속해서 이를 커버슬립으로 덮었다. 후속하여 준비물을 매니큐어로 밀봉시켰다. 40-배 확대의 절단물의 영상을 형광 현미경 (Keyence)으로 촬영하였다. 도 7 및 도 8은 각 4개체의 기니피그에 대한 검사의 대표적인 결과를 나타내고 있다.
미처리된 대조 (도 7a 및 도 8의 A를 참조하시오)에서 청각적 외상이 외유모세포의 강한 사멸을 야기하였다는 것이 나타났다. 이러한 사멸은 단지 총 0.105　㎎ 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린의 단일의 고실내 투여에 의해 방지될 수 있다 (도 7b를 참조하시오). 또한 9-메틸-β-카르볼린의 투여는 외유모세포의 사멸에 대응할 수 있었으며 (도 8b를 참조하시오), 여기에서 본 발명의 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린에 비하여 유의미하게 증가된 투여량 (0.2　㎎ 9-메틸-β-카르볼린)이 요구되었다. 따라서, 본 발명의 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린은 청력 상실의 치료에 적합할 뿐만 아니라, 또한 최근의 기술 수준의 9-메틸-β-카르볼린에 비하여 효율적이다.
실시예 7: 청각적으로 유발된 전위
이하에서는 청각적 외상에 의해 유도된 청각 문턱값의 변화에 대한 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 (6F9MβC)과 마찬가지로 9-메틸-β-카르볼린 (9MβC)의 효과가 기니피그 모델에 대하여 조사되었다.
청각적 외상을 촉발시키기 위하여, 기니피그를 60 ㎎/㎏ 케타민 및 8 ㎎/㎏ 자일라진으로 마취시켰다. 계속해서 눈에 베판텐 연고 (Bayer)를 투여하고 동물을 방음실에 투입하였다. 보정된 스피커를 동물의 두부 바로 위에 위치시키고, 여기에서 스피커는 약 8 ㎑를 중심으로 반 옥타브 대역을 110 ㏈의 음량으로 30 분 동안 방출하도록 설정되었다.
기니피그의 청각 문턱값의 평가를 위한 측정으로서 청각적으로 유발된 전위가 측정되었다. 따라서, 귀를 8, 11.3, 16, 22.6 및 32 ㎑로 음파처리한 후 내이로부터 자극을 전달하는 뇌간 내 신경세포의 전기생리학적 활성을 유도시켰다. 음파처리는 5 ㏈의 단일 단계로 0 ㏈ 내지 90 ㏈까지 상향식으로 수행하였다.
측정은 청각적 외상 3 일 전 (D-3), 청각적 외상 30 분 후(D0)와 마찬가지로 청각적 외상 14 일 후 (D14)에 수행되었다.
동물 당 하나의 귀는 처리하지 않았고 개체-내 대조 (여기에서는 부분적으로 "대조"로 약칭됨)로 사용하였고 두 번째 귀는 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린으로 처리하였다. 따라서, 청각적 외상 1 시간 후 0.12　㎎의 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 (비히클로서 하이드로겔 내의)의 투여량을 고실내로 투여하였다. 청각적 외상 3 일 후 0.06　㎎의 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린의 추가의 고실내 투여를 수행하였다. 4개체의 기니피그에 대하여 측정을 수행하였다 (n = 4).
비교 실험에서 단지 활성제 비히클 (하이드로겔)의 투여는 완전히 미처리된 귀에 비하여 효과가 없다는 것이 밝혀졌다.
그 후, 청각적 외상 이전 (D-3) 및 14 일 후 (D14) 측정된 값으로부터 잔여의 청력 문턱값의 이동 (또한 청력 문턱값의 영구 이동이라 이름함)이 결정되었다. 청각적 외상 직전 (D0) 및 14 일 후 (D14) 측정된 값으로부터 외상으로부터의 회복(D0 - D14)이 또한 결정되었다.
14 일 후 여전히 청력 손상이 잔류함과 관련하여 (도 9를 참조하시오), 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 (총 0.18 ㎎)의 투여가 미처리된 대조에 비하여 청력 문턱값의 유의미한 감소를 야기하였다는 것이 밝혀졌다. 특히 11.3 및 16 ㎑ 각각의 음향 주파수에서, 대략 20 ㏈ 또는 30 ㏈의 청력 문턱값의 감소가 본 발명의 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린에 의하여 나타났다.
또한 청각적 외상으로부터의 회복과 관련하여 (도 10을 참조하시오) 미처리된 대조에 비한 회복은 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 (총 0.18 ㎎)의 투여에 의하여 유의미하게 개선될 수 있었다. 따라서, 8, 11.3 및 16 ㎑의 음향 주파수에서, 미처리된 귀에 비하여 본 발명의 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린으로 인하여 개별적으로 대략 5　㏈, 25　㏈ 또는 20 ㏈로 개선된 회복이 나타났다.
6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린으로의 상기 수행된 실험과 유사하게, 또한 9-메틸-β-카르볼린으로의 대응하는 실험이 수행되었다. 실험 절차는 거의 동일하였으며, 여기에서 물론 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 대신 9-메틸-β-카르볼린이 사용되었다. 9-메틸-β-카르볼린의 총 투여량은 여기에서는 각각 귀 당 0.2 ㎎ 및 0.35 ㎎이었다.
최근의 기술 수준의 9-메틸-β-카르볼린 또한 명백하게 미처리된 대조에 비하여 회복을 촉진하였다 (도 11 및 도 12를 참조하시오). 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린에 비하여, 투여량이 0.2 ㎎으로 약간 증가된 경우에 단지 대략 5 ㏈ 내지 최대 10 ㏈로 회복의 개선이 나타났다 (도 11을 참조하시오). 또한 0.35 ㎎의 9-메틸-β-카르볼린 (6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린의 2배 높은)의 추가로 증가된 투여량이 단지 약 10 ㏈의 개선을 나타내었다 (도 12를 참조하시오).
실시예 8: 독성의 분해 생성물의 저하
이하에서는, 본 발명의 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 (6F9MβC)이 간에서 공지된 독성의 분해 생성물로 대사되는 지의 여부를 조사하였다.
β-카르볼린에 대하여는, 이것이 N-메틸트랜스퍼라아제 촉매화 반응에 의하여 메틸화된 β-카르볼리늄 양이온으로 변형되었다는 것이 오래전부터 알려졌다. 이들이 다른 무엇보다도 미토콘드리아의 호흡을 억제하고 신경독성 영향을 가질 수 있기 때문에, 이는 1-메틸-4-페닐피리디늄 (MPP+, 또한 파킨슨 신경독소로도 알려진)과 마찬가지로 어느 정도 독물학적 특성들을 갖는다. 특히 독소는 디메틸화된 β-카르보늄 양이온, 즉 2,9-디메틸-β-카르볼리늄 양이온이다. 이는 2 및 9번 위치에서의 순차적인 메틸화에 의해 형성된다. 따라서, 이하에서는, 본 발명의 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 (6F9MβC)이 간에서 대응하는 독소 각각 6-플루오로-2,9-디메틸-β-카르볼리늄 양이온 (6F9MβC로부터 직접적으로 유도됨) 및 2,9-디메틸-β-카르볼리늄 양이온 (9MβC로부터 유도됨)으로 대사되는 지의 여부를 조사하였다.
이러한 물질을 HPLC로 동정하기 위하여, 6-플루오로-2,9-디메틸-β-카르볼리늄 양이온 (6F29DMβC)과 마찬가지로 2,9-디메틸-β-카르볼리늄 양이온 (29DMβC)을 대조 HPLC 측정에 의해 개개 체류 시간이 결정된 현장에서 합성하였다. 또한 순수한 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 (6F9MβC)에 대한 대조 측정이 수행되었다.
간에서의 분해 과정을 모의실험(simulate) 하기 위하여, 서로 다른 농도 (1　μM, 10　μM 및 100　μM)의 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 (6F9MβC)을 균질화된 랫트 간과 함께 1 시간 동안 생리학적 조건 (37℃의 생리학적 인산염-완충 염화나트륨 용액, PBS) 하에서 배양시켰다. 후속하여, 여과된 추출액의 HPLC 측정을 수행하였다.
고-성능 액체 크로마토그래피 (HPLC, 부분적으로는 또한 고-압 액체 크로마토그래피라고도 칭하여짐)에 의해 각 물질의 특정이 이루어졌다. HPLC를 위하여 용리액은 90% 아세토니트릴 45 % 및 암모늄아세테이트 (40　mM, pH <5) 55 %로 이루어졌다. 유속은 0.4 ㎖/분 이었고 주입 용량은 10 ㎕이었다. 신호가 너무 강한 경우, 각 샘플을 60% 메탄올로 희석시켰다. 예를 들어 분석법의 동적 범위 내에 위치되도록 측정 전에 간 균질화물로부터의 샘플은 1:40으로 희석되어야 했다.
미처리된 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 (6F9MβC)에 대하여는 19.0 분의 체류 시간이 측정되었으나 (도 13a를 참조하시오), 반면에 대조 측정은 6-플루오로-2,9-디메틸-β-카르볼리늄 양이온 (6F29DMβC)에 대하여는 10.1 분의 체류 시간 (도 13c를 참조하시오) 및 2,9-디매틸-β-카르볼리늄 양이온 (29DMβC)에 대하여는 9.1 분의 체류 시간 (도 13d를 참조하시오)을 나타내었다. 3가지 대조 샘플 모두는 또한 서로로부터 유의미하게 분리된 체류 시간을 나타내었다. 랫트로부터의 간 균질화물과 함께 배양된 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 (100 μM)은 19.0 분에서 (또한 6F9MβC의) 피크를 나타내었으나, 6-플루오로-2,9-디메틸-β-카르볼리늄 양이온 (6F29DMβC) 또는 2,9-디메틸-β-카르볼리늄 양이온 (29DMβC)의 피크는 나타내지 않았다. 또한, 시험된 낮은 농도의 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 (1 μM 및 10　μm)도 동일한 결과를 나타내었다.
본 발명의 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린은 주어진 조건 하에서 다행스럽게도 공지의 독성 분해 생성물로 대사되지 않는다고 결론지을 수 있다.
이하에서는, 대조 양이온 6-플루오로-2,9-디메틸-β-카르볼리늄 양이온 (6F29DMβC) 및 2,9-디메틸-β-카르볼리늄 양이온 (29DMβC)의 합성이 기술된다.
6F29DMβC의 합성을 위하여는, 3 ㎖ 아세토니트릴 중의 50 ㎎ (즉 0.25 mmol) 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 (유리 염기)의 용액에 200 ㎎ (즉 1.4 mmol) 요오드화메틸을 첨가하였다. 반응 혼합물을 질소 하에서 24 시간 동안 실온에서 교반시켰다. 계속해서 용매를 질소의 기류에 의해 제거하였다. 황색의, 형광 잔사를 소량의 아세토니트릴로부터 재결정시켰다. 수율: 53 ㎎ (즉 15 mmol) 60%.
29DMβC의 합성을 위하여는, 3 ㎖ 아세토니트릴 중의 50 ㎎ (즉 0.27 mmol) 9-메틸-β-카르볼린 (유리 염기)의 용액에 200 ㎎ (즉 1.4 mmol) 요오드화메틸을 첨가하였다. 반응 혼합물을 질소 하에서 24 시간 동안 실온에서 교반시켰다. 계속해서 용매를 질소의 기류에 의해 제거하였다. 황색의, 형광 잔사를 소량의 아세토니트릴로부터 재결정시키고, 여과하고 진공 중에서 건조시켰다. 수율: 43 ㎎ (즉 13 mmol) 48%
실시예 9: 6 -플루오로-9-메틸-β-카르볼린이 학습과 기억을 개선함
학습 및 기억의 내재 메카니즘은 매우 복잡하다. 이들은 분자 및 세포 수준에서, 시스템 생물학의 수준에서 그리고 심리학의 수준에서 고려될 수 있다. 분자 수준에서의 기억 형성에 대한 핵심 과정 중의 하나는 cAMP 반응 요소 결합 단백질 (CREB)의 활성화이다. 이는 기억 형성과 결합된 과정인 시냅스의 새로운 형성을 야기한다. 이 과정은 많은 인자들에 의해 조절된다. 양성 증폭이 뇌 BDNF 및 그의 수용기 TRKB에 의해 유도된다. 따라서, 본 발명의 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 (6F9MβC)가 세포 수준에 대하여 조사되어야 한다.
본 발명자들은 세포 수준에서의 본 발명자들의 검사에서 본 발명의 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 (6F9MβC)이 8 배 만큼의 CREB 농도를 증가시키고 BDNF의 농도를 3 배까지 증가시킨다는 것을 발견하였다. 이들 발견들은 6F9MβC가 학습 및 기억을 촉진한다는 것을 암시한다. 이러한 추정은 이하의 실험에서 입증되었다.
8-가지 미로(eight-armed labyrinth) 중에서 학습 거동에 대한 6F9MβC의 효과를 시험하였다. 5월령의 수컷 랫트를 10 일 동안 매일의 특정 시간에서 실험자에게 익숙하게 하였다. 그 후, 이들을 2 일 동안 다중의 특정 시간에서 미로를 탐험하도록 하고 이들이 또한 그곳에서 먹이 보상을 받도록 학습시켰다. 계속해서 체중이 출발 체중의 10%로 감소될 때까지 먹이를 감소시켰다. 그 후, 미로의 8개의 가지들의 각 단부에 먹이를 위치시키고 카메라를 설치하여 동물의 매 운동을 기록하였다. 첫 번째의 시험일에 랫트를 선행 주사 없이 미로의 중심 내 플랫폼 상에 위치시켰다. 다음 날에 실험자로 하여금 생리학적 식염수 중에 용해시킨 유리 염기로서의 2㎎/㎏의 6-플루오로-9-메틸-β-카르볼린 (6F9MβC)을 랫트에 복강내 투여토록 하였다. 2 시간 후 동물을 미로의 중심 내의 플랫폼 상에 위치시키고 그로부터 동물이 모든 가지들에 접근하도록 하였다. 이러한 절차를 동물이 단지 1회의 실수를 할 때까지 즉 동물이 대응하는 특정 시간에서 전에 이미 진입한 하나의 가지로 들어갈 때까지 매일 반복하였다. 특정 기간의 말기에 모든 8개의 가지들을 방문토록 하였다.
6F9MβC로 처리된 12개체의 랫트 및 단지 생리학적 식염수 만을 수령한 대조군의 12개체의 랫트를 검사하였다. 진체군(verum group) (6F9MβC를 수령한)은 6 일 후에 그리고 대조군은 14 일 후에 경계에 도달하였다. 반복된 측정에 대하여 편차가 ANOVA에 의해 검증되었고 유의미하였다 (p < 0.01). 이러한 결과는 명백하게 6F9MβC가 학습 과정을 촉진시키고 기억을 개선시킨다는 것을 입증하고 있다. 본 발명자들은 또한 우리의 추정을 검증할 수 있었다.
이는 활성제 6F9MβC가 내이의 질환에 대하여 효과적일 뿐만 아니라 또한 학습 및 기억 등과 같은 복잡한 거동에 대하여 이로운 영향을 갖는다는 것을 입증하고 있다.
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Claims (10)

  1. 일반식 (I)의 화합물 또는 상기 화합물의 약학적으로 수용가능한 염, 용매화물 또는 수화물:
    Figure 112018018634577-pct00016

    여기에서 R1은 -F이고 R2는 -H 또는 -F이거나,
    R1은 -H이고 R2는 -F이다.
  2. 제 1 항에 있어서, 여기에서 R1은 -F이고 R2는 -H인 화합물.
  3. 하기의 단계들:
    a) 식 (III)의 글리옥실산 수화물 및 염기의 첨가 하에서 일반식 (II)의 출발물질의 일반식 (IV)의 화합물로의 반응
    Figure 112016041206701-pct00017

    b) 산의 첨가 하에서 그리고 가열 하에서 일반식 (IV)의 화합물의 일반식 (V)의 화합물로의 탈카르복실화
    Figure 112016041206701-pct00018

    c) 촉매의 첨가 하에서 일반식 (V)의 화합물의 일반식 (I)의 화합물로의 방향족화를 포함하는 청구항 제 1 항에 따른 화합물의 제조를 위한 방법:
    여기에서
    R1은 -F이고 R2는 -H 또는 -F이거나,
    R1은 -H이고 R2는 -F이다.
  4. 제 3 항에 있어서, 단계 c)에서 사용된 촉매가 Pd / C 임을 특징으로 하는 방법.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 청구항 제 1 항에 따른 적어도 하나의 화합물을 활성성분으로 포함하는 내이의 질환 또는 손상의 치료를 위한 약제학적 조성물에 있어서,
    내이의 질환 및/또는 손상이 귀의 폭발 외상, 폭발 손상, 청력 상실 및 삽입 외상을 포함하는 군으로부터 선택되는 내이의 급성 질환이거나,
    내이의 질환 및/또는 손상이 만성 청각적 외상, 이명 및 노인성 난청을 포함하는 군으로부터 선택되는 내이의 만성 질환임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제 7 항에 있어서, 액적, 연고, 스프레이, 리포좀, 겔, 에멀젼 또는 주사용액의 형태인 약제학적 조성물.
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