KR101878925B1 - 희소돌기아교세포 분화용 조성물 및 이를 이용한 희소돌기아교세포 분화방법 - Google Patents

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Abstract

본원은 레시틴 또는 이의 분획물을 포함하는 희소돌기아교전구세포 분화용 조성물 및 이를 이용한 분화 방법, 그리고 레시틴 또는 이의 분획물을 포함하는 희소돌기아교전구세포 분화용 배지 및 배지 첨가물에 관한 것이다.

Description

희소돌기아교세포 분화용 조성물 및 이를 이용한 희소돌기아교세포 분화방법{COMPOSITION FOR DIFFERENTIATING INTO OLIGODENDROCYTE AND METHOD USING THE SAME}
본원은 레시틴 또는 이의 분획물을 포함하는 희소돌기아교전구세포 분화용 조성물 및 이를 이용한 분화 방법, 그리고 레시틴 또는 이의 분획물을 포함하는 희소돌기아교전구세포 분화용 배지 및 배지 첨가물에 관한 것이다.
신경조직은 신경세포와 신경아교세포로 이루어져 있다. 중추신경계에 존재하는 중추신경아교세포는 크게 별아교세포, 희소돌기아교세포, 미세아교세포 그리고 뇌실막 세포로 나누어진다. 신경세포는 자극을 받아들이고 정보를 처리하여 신경충동의 형태를 전도하는 역할을 하는데 신경아교세포들은 이러한 신경세포를 구조적으로 보조하거나 지지하여 신경전달 속도를 높이거나 신진대사에 관여하는 역할을 한다. 이 중, 희소돌기아교세포는 수초를 형성하여 신경원의 생존과 유지에 관여하며 신경세포의 신호전달 속도를 높이는 역할을 담당한다.
희소돌기아교세포에 의해서 생성되는 수초 혹은 미엘린(myelin)은 포유류 뇌의 중요한 특징이며, 특정 영역에서 이루어지고 태어나면서부터 시작되어 성인기까지 진행된다고 알려져 있다. 발생과정 동안 희소돌기아교세포는 희소돌기아교 전구세포로부터 형성되며, 뇌실밑구역의 전구세포가 뇌의 특정 부위로 이주해와서 분화 및 성숙과정을 거쳐 미엘린을 형성하는 희소돌기아교세포가 된다. 이렇게 성숙한 희소돌기아교세포에 의해 형성된 수초는 축색돌기를 둘러싸고 있는 동심원적으로 적층된 막 구조를 형성한다. 말초신경계에서는 슈반세포가 미엘린을 만들지만 중추신경계에서는 희소돌기세포가 동일한 역할을 담당한다. 수초화가 일어나는 동안 희소돌기아교세포의 세포막은 신경세포의 축삭을 여러 겹으로 둘러싸며 하나의 희소돌기아교세포는 돌기를 통해 수십 개의 축삭을 수초화 할 수 있는데, 모든 축색돌기가 수초로 덮여있는 것은 아니다. 수초화에 의하여 전기적 전달에 대해 절연체가 형성됨으로써, 빠른 신경전달이 가능해진다. 또한 인접한 두 개의 미엘린 세그먼트 사이에는 갭(gap)이 존재하는데 이를 란비에 결절(Node of Ranvier)이라고 한다. 신경세포에서 신호가 전달될 때 이 결절 사이를 점프하는 방식으로 진행하여 빠른 전달이 유도된다.
탈수초화 질병은 이러한 희소돌기아교세포가 손상되어 생기는 질병으로, 다발성 경화증과 백색질형성장애 등 매우 다양한 질환을 포함한다. 척수 손상 등 외상으로도 탈수초 현상이 일어날 수 있고, 희소돌기아교세포의 손상으로 뇌성마비와 척수 손상, 뇌졸중 등이 나타나며, 또한 희소돌기아교세포의 기능 이상은 양극성 장애와 조현병 등의 병태 생리학과도 연관이 있다. 신경세포의 축삭이 절단될 때에도 말단 부분에서 퇴행성 변화를 보이는데 이를 월러변성(Wallerian degeneration)이라고 부르며 여러 개의 작은 조각으로 분절되는데 이 때, 수초역시 축삭과 함께 파괴가 된다. 그 외의 관련 질병으로는 데빅 증후군, 중심교뇌수초용해증, 척수매독, 백(색)질뇌병, 시신경 척수염, 뇌척수염 등이 있다.
이러한 탈수초화 질병의 발병 메커니즘 및 치료 방법의 연구를 위해서는 체외에서 희소돌기아교세포를 이용한 연구가 수행되어야 하는데, 종래에는 래트의 뇌로부터 희소돌기아교세포를 수득하거나 또는 희소돌기아교세포 전구세포를 수득하여 분화시키는 방법을 사용하였다. 그러나 이러한 종래의 방법에 따르면 래트로부터 세포를 분리한 후 한 달 이상의 장기간 동안의 체외 배양이 필요하고, 또한 래트는 유전자 변형 동물 모델이 개발되지 않아 탈수초화 질병 동물 모델 등에 활용하기 어려운 문제가 있었다. 따라서, 질병 동물 모델 확립이 용이한 마우스를 이용하여, 희소돌기아교 전구세포로부터 희소돌기아교세포로의 신속하고 안정적인 분화를 유도할 수 있는 신규한 방법의 개발이 요구된다.
대한민국 공개특허 10-2016-0119517
Takehiko Yamamoto,Lekh Raj Juneja,Hajime Hatta,Mujo Kim. (1997) Hen Eggs: Basic and Applied Science. CRC Press. LE Palacios and T Wang. (2005) Extraction of egg-yolk lecithin. Journal of the American Oil Chemists' Society. 82(8). 565-569
본원은, 레시틴 및 이의 분획물이 희소돌기아교 전구세포로부터 희소돌기아교세포로 분화하는 과정에 미치는 영향을 연구함으로써, 희소돌기아교세포로의 분화에 도움을 줄 수 있는 희소돌기아교세포 분화용 조성물 및 희소돌기아교세포 분화 방법 등을 제공하고자 한다. 특히, 레시틴을 아세톤과 같은 용매를 이용해 불용물과 가용물로 분리한 후, 불용물과 가용물 각각이 희소돌기아교세포로의 분화에 미치는 영향을 확인하고자 하였다.
그러나, 본원이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본원의 제 1 측면은, 레시틴 또는 이의 분획물을 포함하는, 희소돌기아교전구세포를 희소돌기아교세포로 분화시키기 위한 조성물을 제공할 수 있다.
본원의 제 2 측면은, 레시틴 또는 이의 분획물을 포함하는 배지에서 희소돌기아교 전구세포를 배양하는 것을 포함하는, 희소돌기아교 전구세포를 희소돌기아교세포로 분화시키는 방법을 제공할 수 있다.
본원의 제 3 측면에 따르면, 레시틴 또는 이의 분획물; 그리고 트랜스페린, 프로게스테론, 푸트레신, 아셀렌산나트륨, 글루타민, 인슐린, 티록신 및 글루코스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는, 희소돌기아교전구세포 분화용 배지를 제공할 수 있다.
본원의 제 4 측면에 따르면, 레시틴 또는 이의 분획물을 포함하는, 희소돌기아교전구세포 분화 촉진용 배지 첨가물을 제공할 수 있다.
상술한 과제 해결 수단은 단지 예시적인 것으로서, 본 발명을 제한하려는 의도로 해석되지 않아야 한다. 상술한 예시적인 구현예 외에도, 도면 및 발명의 상세한 설명에 기재된 추가적인 구현예 및 실시예가 존재할 수 있다.
본원에 따르면, 난황으로부터 분리한 레시틴 및 이의 분획물을 이용하여 희소돌기아교 전구세포로부터 희소돌기아교세포로의 분화를 유도 및 촉진하는 것이 가능하다. 따라서, 희소돌기아교세포로의 분화 과정 및 희소돌기아교세포의 수초 형성 메커니즘의 이해, 특정 화합물이 희소돌기아교세포 분화에 미치는 영향 연구, 및 분화된 희소돌기아교세포의 이식에 의한 탈수초화 질병을 앓는 개체의 치료 및 질병 완화 연구에 도움이 될 수 있다. 나아가, 본원의 방법에 의해 분화된 희소돌기아교세포를 탈수초화 질병을 앓는 개체에 투여 내지 이식함으로써 수초화를 유도하고 뇌발달, 및 기억력 또는 학습능력 개선에 도움을 주거나, 또는 상기 희소돌기아교세포를 특정 화합물 또는 희소돌기아교전구세포와 함께 투여 내지 이식함으로써 유사한 효과를 기대할 수 있다.
도 1은 본원의 일 실시예에 따른 난황레시틴 추출 방법의 개략도이다.
도 2는 본원의 일 실시예에 따른 희소돌기아교세포 분화 공정의 개략도이다.
도 3은 본원의 일 실시예에 따라 분화된 희소돌기아교세포의 형광 염색 이미지이다.
도 4는 본원의 일 실시예에 따라 분화된 희소돌기아교세포의 분화율을 비교 분석한 그래프이다.
아래에서는 첨부한 도면을 참조하여 본원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본원을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "~(하는) 단계" 또는 "~의 단계"는 "~ 를 위한 단계"를 의미하지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.
본원 명세서 전체에서, "A 및/또는 B" 의 기재는, "A, B, 또는, A 및 B" 를 의미한다.
이하, 본원의 희소돌기아교전구세포 분화용 조성물 및 이를 이용한 분화 방법, 그리고 희소돌기아교전구세포 분화용 배지 및 배지 첨가물에 대하여 구현예 및 실시예와 도면을 참조하여 구체적으로 설명하도록 한다. 그러나, 본원이 이러한 구현예 및 실시예와 도면에 제한되는 것은 아니다.
본원의 제 1 측면은, 레시틴 또는 이의 분획물을 포함하는, 희소돌기아교전구세포를 희소돌기아교세포로 분화시키기 위한 조성물을 제공할 수 있다.
예를 들어, 상기 희소돌기아교전구세포는 마우스, 래트, 토끼, 기니피그, 원숭이 및 인간으로부터 분리된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 레시틴은 난황 및/또는 대두로부터 추출된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 레시틴은 난황으로부터 분리된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
레시틴은 인지질을 주로 함유하는 지질성분을 포함한다. 계란은 크게 흰자(난백)와 노른자(난황)로 나누어지는데, 일반적으로 계란의 레시틴은 난황으로부터 추출하여 얻는다. 난황은 지용성 성분을 다량 함유 (고형분의 약 61.8%)하며, 중성지질이 약 65%, 콜레스테롤이 약 4%, 인지질이 약 31% 포함되어 있다. 계란으로부터 추출한 레시틴의 경우, 인지질 중 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine, PC)을 가장 많이 함유하고 있다. 레시틴의 순도는 인지질의 함량에 따라 분류할 수 있는데, 보통 60% 이상의 인지질을 함유하고 있으며 80% 이상은 고순도로 분류한다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 레시틴은 인지질을 약 80 중량% 이상 함유하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 레시틴은 인지질을 약 80 중량%, 약 85 중량%, 약 90 중량% 또는 약 95 중량% 함유하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 레시틴 또는 이의 분획물은 포스파티딜콜린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜에탄올아민, 아실포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜글리세롤, 라이소포스파티딜에탄올아민, 중성지질, 콜레스테롤 및 잔토필로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
난황 레시틴에 포함되는 인지질 중 주요성분은 포스파티딜콜린(PC)이다. PC는 세포막을 구성하는 인지질로서, 이름에서 알 수 있듯이 체내에서 중요한 신경전달물질인 콜린이 붙어 있는 형태의 인지질이다. 난황 레시틴으로부터 PC의 함량을 높이기 위한 방법으로는 헥산 또는 아세톤 등으로 추출하는 방법이 있으며, 인체에 크게 해가 없는 아세톤을 활용하는 방법이 주로 사용된다. PC를 포함하는 인지질은 특성상 아세톤에 잘 녹지 않기 때문에 레시틴을 아세톤으로 처리하여 아세톤 가용물과 불용물을 분리함으로써 인지질 또는 PC 또는 인지질의 함량이 높은 레시틴을 얻을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 레시틴 분획물은 레시틴으로부터 물, 아세톤, C1-C4 알코올, 클로로포름, 에틸아세테이트, 헥산 또는 이들의 혼합용매를 이용하여 수득된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있으며, 상기 나열된 용매 외에도 본원이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 용매가 레시틴 분획물의 수득을 위해 사용될 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 분획물은 아세톤 불용물일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 아세톤 불용물은 포스파티딜콜린 및 포스파티딜에탄올아민 등을 주요 성분으로 함유하는 복합인지질을 포함하는 조성물일 수 있고, 더욱 구체적으로는 약 70 중량% 이상의 포스파티딜콜린 및 약 5 중량% 이상의 포스파티딜에탄올아민을 함유하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있으며, 사용되는 추출 방법에 따라 그 함량이 달라질 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 분획물은 아세톤 가용물일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 아세톤 가용물은 중성지질, 콜레스테롤 및 잔토필을 포함하는 것일 수 있고, 더욱 구체적으로는 약 50 중량% 이상의 중성지질, 약 40 중량% 이상의 콜레스테롤 및 약 0.04 중량% 이상의 잔토필을 함유하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있으며, 사용되는 추출 방법에 따라 그 함량이 달라질 수 있다.
희소돌기아교세포의 기능 이상 또는 수초 손상 관련 질병, 예를 들어 다발성 경화증, 백색질형성장애, 뇌성마비, 척수 손상, 뇌졸중, 양극성 장애, 조현병, 데빅 증후군, 중심교뇌수초용해증, 척수매독, 백(색)질뇌병, 시신경 척수염, 뇌척수염, 진행성 다초점 백색질뇌증(progressive multifocal leukoencephalopathy, PML), 뇌척수염(encephalomyelitis, EPL), 뇌교 중심부 수초용해증(central pontine myelolysis, CPM), 부신백질이영양증(adrenoleukodystrophy), 알렉산더병(Alexanders disease), 펠리제우스-메르츠바하병(Pelizaeus Merzbacher disease, PMZ), 왈러 변성(Wallerian Degeneration), 시신경염(optic neuritis), 횡단성 척수염(transverse myelitis), 근위축성 축삭 경화증(amylotrophic lateral sclerosis, ALS), 헌팅톤병, 알츠하이머병, 파킨슨병, 척수 손상(spinal cord injury), 외상성 뇌 손상(traumatic brain injury), 방사선치료후 손상(post radiation injury), 화학요법의 신경학적 합병증(neurologic complications of chemotherapy), 뇌졸중(stroke), 급성 허혈성 시신경병증(acute ischemic optic
neuropathy), 비타민 E 결핍(vitamin E deficiency), 단독형 비타민 E 결핍 증후군(isolated vitamin E deficiency syndrome), AR, 무베타 지질 단백혈증(Bassen-Kornzweig syndrome), 마키아파바-비그나미 (Marchiafava-Bignami) 증후군, 이염성 백질이영양증(metachromatic leukodystrophy), 삼차 신경통(trigeminal neuralgia) 및 벨 마비(Bell's palsy)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 질병의 연구, 치료 및 예방에 본원의 조성물을 이용하여 분화된 희소돌기아교세포를 이용할 수도 있다.
본원의 제 2 측면은, 레시틴 또는 이의 분획물을 포함하는 배지에서 희소돌기아교 전구세포를 배양하는 것을 포함하는, 희소돌기아교 전구세포를 희소돌기아교세포로 분화시키는 방법을 제공할 수 있다.
예를 들어, 상기 희소돌기아교 전구세포는 마우스, 래트, 토끼, 기니피그, 원숭이 및 인간으로부터 분리된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 희소돌기아교 전구세포를 희소돌기아교세포로 분화시키는 방법은 (A) DMEM 및 FBS를 포함하는 배지 조성물에 마우스 피질 전구세포를 접촉하여 약 7 내지 10일 동안 배양하는 단계; (B) 상기 마우스 피질 전구세포가 배양되고 있는 용기를, 예를 들어 약 0.5 내지 2 시간 동안 약 100 내지 300 rpm에서 흔들어준 후 상등액은 버리고 배지 조성물을 첨가하여, 예를 들어 약 12 내지 20 시간 동안 약 200 내지 300 rpm에서 흔들어 준 후 상기 용기 바닥에 붙어있던 세포 전구체는 제외하고 흔들어주는 과정을 통해 용기 바닥으로부터 떨어진 희소돌기아교 전구세포가 함유된 상등액을 분리하는 단계; 및 (C) 희소돌기아교 전구세포를 약 2 일 동안 추가 배양한 후, 상기 전구체에 레시틴 또는 이의 분획물을 포함하는 배지를 접촉하여 약 3 일 동안 배양하여 분화를 유도하는 단계를 포함할 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 레시틴이 상기 배지 내에 약 1 ㎍/㎕ 내지 100 ㎍/㎕ 함유될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 레시틴 분획물은 레시틴으로부터 물, 아세톤, C1-C4 알코올, 클로로포름, 에틸아세테이트, 헥산 또는 이들의 혼합용매를 이용하여 수득될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 레시틴 분획물이 아세톤 불용물인 경우, 상기 배지 내에 1 ㎍/㎕ 내지 100 ㎍/㎕ 함유될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 레시틴 분획물이 아세톤 가용물인 경우, 상기 배지 내에 1 ㎍/㎕ 내지 20 ㎍/㎕ 함유될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 제 3 측면에 따르면, 레시틴 또는 이의 분획물; 그리고 트랜스페린, 프로게스테론, 푸트레신, 아셀렌산나트륨, 글루타민, 인슐린, 티록신 및 글루코스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는, 희소돌기아교전구세포 분화용 배지를 제공할 수 있다. 예를 들어, 상기 희소돌기아교전구세포 분화용 배지는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), 트랜스페린 약 20 내지 80 ㎍/mL, 프로게스테론 약 1 내지 10 ng/mL, 푸트레신 약 10 내지 18 ㎍/mL, 아셀렌산나트륨 약 1 내지 8 ng/mL, 글루타민 약 1 내지 5 mM, 인슐린 약 1 내지 10 ㎍/mL, 티록신 약 0.1 내지 1.5 ㎍/mL 및 글루코스 약 1 내지 10 ㎍/mL를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 제 4 측면에 따르면, 레시틴 또는 이의 분획물을 포함하는, 희소돌기아교전구세포 분화 촉진용 배지 첨가물을 제공할 수 있다. 상기 배지 첨가물은 희소돌기아교세포 분화의 목적, 실험 방법, 세포의 농도, 세포의 수 및 배양 기간 등을 포함하는 분화 조건에 따라 통상의 기술자가 적절한 농도를 용이하게 선택하여 사용될 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본원의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
마우스 피질 전구세포의 배양
출생 1 일 후의 ICR 마우스에서 뇌를 제거하고 HBSS(Hanks' Balanced Salt Solution)를 함유한 페트리 접시에 놓은 다음 뇌에서 중뇌, 수막, 후각 전구체를 제거하고 HBSS를 포함하는 15 mL 원뿔 튜브에 피질을 수집하였다. 상기 HBSS를 제거하고, DMEM 및 10% FBS(Fetal bovine serum)를 첨가하여 10 mL의 피펫으로 1~2회 솔루션을 피펫팅하여 피질을 분쇄하였다. 튜브로 효소 소화 솔루션 (최종: 0.0125% 트립신)을 첨가하고 37 ℃ 휠 인큐베이터에 15 분(150 rpm) 동안 배양한 후 DMEM, 20% FBS, 1% Pen/Strep 및 DNase I (0.003%)가 혼합된 혼합물을 첨가한 다음 부드럽게 튜브를 3 회 흔들고 상온에서 10 분 동안 배양하였다. 상기 배양 후에 1000 rpm의 속도로 10 분 동안 원심분리하고 상등액을 제거 후 DMEM과 10% FBS이 혼합된 용액 10 mL로 재현탁시킨 다음 100 μm 스트레이너를 사용하여 필터하고 다시 원심분리 (1000 rpm, 10 분)한 후 상등액을 제거하고 DMEM과 10% FBS이 혼합된 용액 20 mL로 재현탁시켰다. 상기 재현탁액을 70 μm 스트레이너를 사용하여 필터하고 또 다시 원심분리 (800 rpm, 10 분)한 다음 상등액을 제거하고 DMEM과 10% FBS이 혼합된 용액 20 mL로 재현탁한 다음 40 μm 스트레이너를 사용하여 필터하고 24 시간 후 배지 조성물을 교체한 후 새로운 배지 조성물(DMEM + 10% FBS)을 3 일마다 교체하여 약 7 일 내지 10 일 동안 배양함으로써 마우스 피질 전구세포를 배양하였다.
희소돌기아교 전구세포의 수집
배양된 마우스 피질 전구세포를 플라스크에 넣고 37 ℃에서 1 시간 동안 200 rpm의 속도로 흔들어준 후 상등액을 제거 (소교세포 제거)하고 새로운 DMEM과 10% FBS를 포함하는 10 mL 배지 조성물을 이용하여 37 ℃에서 5시간 동안 배양하였다. 상기 배양 후 37 ℃의 온도로 15 시간 동안 250 rpm의 속도로 흔들어준 후 상등액을 취하여 1 차 원심분리 (1500 rpm, 10 분)한 다음 PBS로 세척하여 2 차 원심분리 (1500 rpm, 10 분)하고 PBS를 제거한 후 트립신-EDTA첨가 (0.25%, 1.5 mL, 10 분)하여 상온에서 교반하였다. 상기 교반 후 트립신-EDTA을 제거하고 DMEM과 20% FBS를 혼합한 20 mL 배지 조성물을 이용하여 10 분간 배양하였다. 상기 배양된 배양물을 3 차 원심분리 (1500 rpm, 10 분)한 후 상등액을 제거하고 DMEM과 10% FBS를 혼합한 용액 20 mL를 첨가하여 1 차 재현탁한 다음 상기 1 차 재현탁액을 도포하여 1 시간 동안 배양한 뒤에도 바닥에 흡착되지 않은 희소돌기아교 전구세포를 수집 (1차, 약간의 성상교세포 전구세포도 함유)한 후 4 차 원심분리 (1500 rpm, 10 분)하여 상등액을 제거하고 DMEM과 10% FBS를 혼합한 용액 20 mL를 첨가하여 2 차 재현탁한 다음 상기 2 차 재현탁액을 다시 도포하였다. 1 시간 동안 배양한 뒤에도 바닥에 흡착되지 않은 희소돌기아교 전구세포를 수집 (2 차)한 후 상기 수집 (2 차)된 희소돌기아교 전구세포 현탁액을 3 차 도포하였다. 상기 3 차 도포 후 1 시간 동안 배양한 후에도 흡착되지 않은 현탁액을 40 μm 세포 스트레이너로 필터한 후 24 시간 후 DMEM과 10% FBS를 혼합한 용액을 교체하면서 순수한 희소돌기아교 전구세포를 추출하였다.
난황 레시틴의 추출
난황 레시틴의 추출을 위해 먼저 달걀로부터 난황을 분리하고, 난황에 4.25 배수의 주정 (95% 에탄올)을 첨가하였다. 이어서 Ar2 가스로 퍼징한 후, 감압 및 교반 (500 rpm)하면서 30 분간 지질을 추출하였다. 추출이 완료된 후, 3500 rpm에서 15 분간 상온에서 원심분리하고, 이어서 종이를 이용해 여과하였다. 이어서 다시 Ar2 가스로 퍼징한 후, 첨가된 에탄올을 40℃에서 증발시켜 농축함으로써 최종적으로 난황 레시틴을 수득하였다.
난황 레시틴의 수득 수율은 약 20%였으며, 약 86.4%의 인지질, 약 12%의 콜레스테롤 및 중성지질, 및 약 3%의 수분을 함유하는 것으로 분석되었다. p-NMR로 분석한 인지질의 조성 (중량%로 표시됨)은 아래 표 1에 나타나 있다.
Phosphatidylcholine (PC, 포스파티딜콜린) 64.0%
Phosphatidylinositol (PI, 포스파티딜이노시톨) 3.0%
Phosphatidylethanolamine (PE, 포스파티딜에탄올아민) 13.6%
N-acylphosphatidylethanolamine (APE, 아실포스파티딜에탄올아민) 1.7%
Phosphatidylglycerol + lysophosphatidylethanolamine
(PG+LPE, 포스파티딜글리세롤+라이소포스파티딜에탄올아민)		 1.9%
그 외 부산물 1.8%
난황 레시틴 분획물의 추출
주정을 이용해 추출한 난황 레시틴 약 2 g을 코니칼 튜브에 넣고, 상온의 아세톤을 소량 첨가하여 레시틴과 혼합하였다. 이후, 냉아세톤 (4℃)을 50 mL가 될 때 까지 채우고 충분히 교반한 후, 15 분 동안 얼음물에 방치하였다. 이어서, 3500 rpm으로 15 분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 원심분리 후 상등액 (아세톤 가용물)을 다른 농축플라스크로 옮기고, 침전물에는 다시 아세톤을 50 mL가 될 때 까지 채우고 상기 교반 내지 원심분리 과정을 반복하였다. 수득된 아세톤 가용물은 진공증발농축기를 이용하여 아세톤을 완전히 제거하여 농축시킨 후 데시케이터에 방치하였다. 아세톤 불용물은 동결건조하여 보관하였다.
수득된 아세톤 불용물 및 가용물의 조성을 분석한 결과를 아래 표 2 및 표 3에 나타내었다.
주요성분
아세톤 불용물
(88.3 중량%)		 * Phosphatidylcholine 83 중량% (포스파티딜콜린,PC)
* Phosphatidylethanolamine 14 중량% (포스파티딜에탄올아민, PE)
* 기타 인지질 3 중량%
아세톤 가용물
(11.7 중량%)		 * Neutral lipids 57 중량% (중성지질)
* Cholesterol 42 중량% (콜레스테롤)
* 잔토필 (0.04 중량%, 루테인 및 제아잔틴)을 포함하는 기타 지용성 성분 1 중량%
가용 용매 가용 농도 주요성분
난황레시틴 95% 에탄올 5 mg/50 ㎕ 아세톤 불용물+아세톤 가용물
아세톤 불용물 95% 에탄올 5 mg/50 ㎕ PC 83%, PE 14%, 기타 인지질 3%
아세톤 가용물 DMSO 1 mg/100 ㎕ 콜레스테롤, 중성지질, 잔토필
*기타인지질: PI (포스파티딜이노시톨), LPE (라이소포스파티딜에탄올아민), SM (스핑고마이엘린) 등
*잔토필: 루테인 및 제아잔틴
희소돌기아교세포로의 분화
분리된 마우스 희소돌기아교 전구세포를 약 2 일간 추가 배양한 후, 레시틴 또는 레시틴 분획물을 배지에 첨가함으로써 희소돌기아교세포로의 분화를 유도하였다. 분화 배지로는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), 트랜스페린 약 20 내지 80 ㎍/mL, 프로게스테론 약 1 내지 10 ng/mL, 푸트레신 약 10 내지 18 ㎍/mL, 아셀렌산나트륨 약 1 내지 8 ng/mL, 글루타민 약 1 내지 5 mM, 인슐린 약 1 내지 10 ㎍/mL, 티록신 약 0.1 내지 1.5 ㎍/mL 및 글루코스 약 1 내지 10 ㎍/mL를 포함하는 배지를 사용하였다. 구체적으로, 마우스 피질 전구세포로부터 분리해 낸 희소돌기아교세포 전구세포들을 분화를 유도하는 배지에서 2 일 동안 배양한 후, 4 개의 그룹으로 나누어 하나는 아무것도 첨가하지 않은 대조군, 하나는 난황 레시틴 66 ㎍/㎕ 첨가군, 하나는 난황 레시틴의 아세톤 불용물 58.1 ㎍/㎕ 첨가군, 그리고 나머지 하나는 난황 레시틴의 아세톤 가용물 7.7 ㎍/㎕ 첨가군으로 분화를 유도하였다. 상기 첨가량은 난황 레시틴에 포함된 불용물 및 가용물의 조성비율을 감안하여 결정되었다. 처음 분화 유도시 분주한 세포의 개수 및 세포를 추출한 마우스의 연령에 따라 세포의 분화 속도가 조금씩 다름을 감안하여, 대조군의 분화가 일정해지는 시점을 기준으로 분화 유도 2 일 내지 5 일 뒤에, 고정 작업 및 염색 실험을 진행하여 관찰하였다.
항체염색법을 이용한 희소돌기아교세포로의 분화 양상 확인
희소돌기아교세포로의 분화 양상 및 분화 정도를 측정하기 위해 항체염색법(immunocytochemistry)을 활용하였다. 1차 항체 (primary antibody)로는 분화된 희소돌기아교세포에서 발현되는 MBP (myelin basic protein) 단백질을 인식하는 항체와, 분화정도와 관계없이 모든 단계의 희소돌기아교세포에 발현되는 olig2 단백질을 인식하는 항체를 사용하였고, 2차 항체로는 형광단백질이 부착된 항체를 사용하였다. 분화의 양상은 MBP의 분포를 기준으로 판단하였다. 도 3은 분화된 희소돌기아교세포의 분화 양상을 촬영(Cell Observer Z1, Zeiss)한 사진이며, 도 4는 본 실시예 및 비교예에 따라 분화된 희소돌기아교세포의 분화 정도를 나타낸 그래프이다.
도 3 및 도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 레시틴 또는 레시틴 분획물을 첨가한 배지에서 분화된 희소돌기아교세포는 희소돌기아교 전구세포로부터 정상적으로 분화되었으며, 분화 효율도 대조군에 비해 높은 것을 확인하였다. 특히, 레시틴 또는 레시틴 분획물을 사용한 경우 희소돌기아교세포만이 분화되었고, 다른 종류의 아교세포 (별아교세포 및 미세아교세포 등)의 분화는 관찰되지 않아 높은 순도의 분화 효능을 보였다.
본 실시예에 따른 결과상으로는 레시틴의 아세톤 불용물에서 가장 분화 효율이 높았고, 다음으로 레시틴의 아세톤 가용물, 그 다음으로 레시틴의 순서로 높은 효과를 보였다. 다만, 아세톤 가용물은 레시틴 (66 ㎍/㎕) 및 아세톤 불용물 (58.1 ㎍/㎕)에 비해 상대적으로 낮은 농도 (7.7 ㎍/㎕)로 사용되었다는 점을 고려할 때, 동일한 처리농도로 사용된 경우 아세톤 가용물, 아세톤 불용물 및 레시틴의 순서로 높은 효과를 가질 것으로 예측되었다.
전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (16)

  1. 난황으로부터 분리된 레시틴 또는 이의 분획물을 포함하는, 희소돌기아교전구세포를 희소돌기아교세포로 분화시키기 위한 조성물.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 레시틴은 인지질을 80% 이상 함유하는 것인, 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 레시틴 또는 이의 분획물은 포스파티딜콜린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜에탄올아민, 아실포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜글리세롤, 라이소포스파티딜에탄올아민, 중성지질, 콜레스테롤 및 잔토필로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것인, 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 레시틴 분획물은 레시틴으로부터 물, 아세톤, C1-C4 알코올, 클로로포름, 에틸아세테이트, 헥산 또는 이들의 혼합용매를 이용하여 수득된 것인, 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 분획물은 아세톤 불용물인, 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 아세톤 불용물은 포스파티딜콜린 및 포스파티딜에탄올아민을 함유하는 것인, 조성물.
  8. 제 5 항에 있어서,
    상기 분획물은 아세톤 가용물인, 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 아세톤 가용물은 중성지질, 콜레스테롤 및 잔토필을 함유하는 것인, 조성물.
  10. 난황으로부터 분리된 레시틴 또는 이의 분획물을 포함하는 배지에서 희소돌기아교전구세포를 배양하는 것을 포함하는, 희소돌기아교전구세포를 희소돌기아교세포로 분화시키는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 레시틴이 상기 배지 내에 20 ㎍/㎕ 내지 100 ㎍/㎕ 함유되는 것인, 방법.
  12. 제 10 항에 있어서,
    상기 레시틴 분획물은 레시틴으로부터 물, 아세톤, C1-C4 알코올, 클로로포름, 에틸아세테이트, 헥산 또는 이들의 혼합용매를 이용하여 수득된 것인, 방법.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 레시틴 분획물이 아세톤 불용물인 경우, 상기 배지 내에 20 ㎍/㎕ 내지 100 ㎍/㎕ 함유되는 것인, 방법.
  14. 제 12 항에 있어서,
    상기 레시틴 분획물이 아세톤 가용물인 경우, 상기 배지 내에 1 ㎍/㎕ 내지 20 ㎍/㎕ 함유되는 것인, 방법.
  15. 난황으로부터 분리된 레시틴 또는 이의 분획물; 및
    트랜스페린, 프로게스테론, 푸트레신, 아셀렌산나트륨, 글루타민, 인슐린, 티록신 및 글루코스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는, 희소돌기아교전구세포 분화용 배지.
  16. 난황으로부터 분리된 레시틴 또는 이의 분획물을 포함하는, 희소돌기아교전구세포 분화 촉진용 배지 첨가물.
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