KR101875462B1 - FosB 유전자 프로모터를 이용한 종양 환자의 항암제 내성 진단용 바이오마커 및 이를 이용한 항암제 내성 진단용 킷트 - Google Patents

Abstract

해결하려는 과제: 항암제 내성 예측용 바이오마커 및 예측방법을 제공하려는 것.
과제해결수단: FosB 프로모터의 특정 부위의 발현 정도를 측정하여 발현이 증가하는 경우 항암제 내성 가능성을 판단할 수 있다.

Description

FosB 유전자 프로모터를 이용한 종양 환자의 항암제 내성 진단용 바이오마커 및 이를 이용한 항암제 내성 진단용 킷트 {Biomarkers to diagnose anti-cancer medicine resistance of cancer patient using FosB gene promoter and diagnostic kit thereof}

본 발명은 FosB 유전자 프로모터를 이용한 종양 환자의 항암제 내성 진단용 바이오마커 및 이를 이용한 항암제 내성 진단용 킷트에 관한 것이다.

암세포의 발병은 정상세포의 일부분이 체세포 점 돌연변이가 되면서 종양 형성이 진행되어 다양한 종류의 암으로 진행되는 것을 뜻한다 (Kubo.M, 2012). 점 돌연변이를 일으키는 유전자는 발암 유전자 (oncogene)라 하며, 이러한 발암 유전자들은 암세포에서 돌연변이가 되어있거나 과발현하고 있으며 세포의 성장과 분화를 조절한다 (Kozma et al., 2002). 발암 유전자로는 RAS, MYC, WNT, ERK, TRK 등의 유전자가 있으며, RAS 단백질은 GTPase를 조절하여 세포 증식에 관여하는 신호전달에 연관되어 있으며 RAS의 돌연변이에 의해서 췌장암, 대장암, 갑상선암, 골수성 백혈병 등이 발병하게 된다 (Hilgenfeld, 1995; Bos, 1989). MYC 유전자는 전사인자로 세포증식을 조절하며 유방암, 망막아세포종, 소세포폐암 등을 일으킨다 (Felsher, 1999). 종양 형성과정은 점 돌연변이가 진행된 일반세포 부분이 악성화된 암 (tumor)이 되어가는 과정이다 (Fearon, 1990). 이 과정에서 발암 유전자가 관여하며 세포증식과 분화를 조절하여 암으로 진행하며 (Croce, 2008), 종양억제 유전자의 기능이 암에 의한 유전적인 변화에 의해서 사라진다 (Knudson, 2001). 프로모터 부분의 CpG 아일랜드 부분을 통해 메틸화가 관여하고 있으며 (Daniel, 2011) 이로 인해 후생유전학적인 히스톤의 변형이 조절되고 이런 현상은 암에 영향을 준다 (Hitchler, 2008). 이와 같은 후생유전학적인 현상을 조절하는 것으로 잘 알려진 HMGA2 유전자가 있다 (Baldassarre, 2003). 또한, miRNA도 암세포를 진행시키는데 miR-137은 대장암에서 후생유전학적인 전사억제를 일으킨다는 보고가 있다 (Balaguer, 2010). 종양 형성이 진행되는 동안 세포증식에 관여하는 신호가 증가하며 이를 막는 신호는 감소하며 세포사멸 유전자가 감소하고 세포의 노화를 막아 무한히 복제가 일어나게 하며 침윤과 전이가 일어나게 된다 (Hanahan et al., 2000).

암을 치료하는 방법으로 널리 사용되고 있는 화학적 치료법은 세포에 독성을 가진 약물을 처리하여 암세포를 죽이는 방법으로서, 항 대사 물질, 알킬화제, DNA 조절제 등 다양한 약물을 처리하며, 이를 통틀어서 보통 항암제라고 부른다 (Lind, MJ et al., 2008). 항암제는 DNA 합성을 저해하여 다양한 메커니즘에 의해 나타나는 세포분열을 방지하거나 세포사멸을 일으켜 암세포를 죽이는데 효과적이다 (Makin et al., 2001). 하지만 화학 치료법은 면역력 악화, 구토, 설사 등 위장에서의 고통 (Gibson et al., 2006), 탈모 등의 부작용이 생긴다. 또한, 화학적 치료를 받은 후 재발병률이 13배 이상 증가한다는 연구 결과가 있다 (Hijiya et al., 2007). 화학적 치료법에서 주로 문제가 되는 것은 세포가 항암제에 대한 저항성을 가지게 되기 때문이다. 암세포는 화학적 요법으로부터 자신을 보호하기 위해 P-글라이코프로테인을 생성한다는 보고가 있으며 (Teraishi et al., 2005), 다른 방법으로는 유전자 증폭에 의해서 항암제에 의해 세포사멸로 가는 경로가 억제가 되며, 또 다른 방법으로는 세포 내 DNA 수리 기작으로 손상된 DNA를 다시 복구하여 원래의 상태인 세포증식 경로로 바뀌면서 항암제 저항성이 생기게 된다 (Luqmani, 2005). 항암제 저항성을 없애는 방법으로는 표적 유전자 치료법 (Housman et al., 2014)이 사용되는데, 항암제 처리시 Apaf-1이 P53을 억제하여 저항성을 일으킨다는 보고가 있으며 (Soenqas et al., 1999), MAPK 신호전달 경로를 억제하여 항암제 저항성을 줄인다는 보고, (Towsend et al., 2003) UGT1A1의 발현은 항암제 저항성을 일으킨다는 보고가 있다 (Gagnon et al., 2006). 또한, 세포사멸을 조절하는 Bcl-2 패밀리에 의해 항암제 저항성이 조절되며 (Frew et al., 2008), TGF-β에 의해서 EMT (epithelial mesenchymal transition) 현상이 일어나 전이 가능한 세포가 증가함에 따라 항암제 저항성에 영향을 주며 (Richard C et al., 2005), 히스톤의 메틸화 또는 아세틸화에 의해서 MDR1 프로모터가 영향을 받아 크로마틴 구조가 변화하여 항암제 저항성이 생긴다는 보고가 있다 (Baker et al., 2003).

FosB (FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog B) 는 FOS 유전자 패밀리이며, 류신 지퍼를 코딩하는 단백질이고, JUN 패밀리와 이합체 (dimer)를 형성하여 전사인자인 AP-1을 생성한다 (Ramachandran et al., 2011). AP-1은 여러 가지 단백질들과 결합하는데, TATA 결합 단백질, NF-κB, CREB 도메인, 그리고 히스톤의 아세틸화를 일으키는 P300/CBP 등과 결합하여 작용한다 (Foletta et al., 1998). AP-1은 전사인자로서 사이토카인이나 성장인자를 조절하여 (Hess et al., 2004) 세포증식, 분화, 사멸 등을 일으킨다 (Ameyar et al., 2003). AP-1은 세포의 성장과 증식에 많은 역할을 하는데 c-FOS와 c-JUN이 주로 역할을 하며 c-JUN은 섬유아세포 증식을 도와준다는 보고가 있으며 (Karin et al., 1997), DNA 합성을 증가시켜 세포의 분화를 조절한다는 보고가 있다 (Angel et al., 1991).

FosB는 사람의 호중구 (neutrophils)에서 산화질소 생성시 PI3K-AKT/단백질 카이네이즈 B 경로를 통해 작동된다는 보고가 있다 (Ratajczak et al., 2014). 또한, AP-1은 독성이 있는 물질이 들어오게 되면 MAPK 신호 전달 경로를 통해 작용한다는 연구 결과가 있으며, 이는 다양한 독성물질에 의한 결과를 초래하게 된다 (Reddy et al., 2002).

FosB는 다양한 스플라이싱 변이체로 존재하는데 (Hong et al., 2011) 이 중 ΔFosB의 경우 병리학적 작용, 약물 중독을 유지시키는데 주로 관여한다는 보고가 있으며 (Ruffle, 2014), 지방세포나 조골세포의 간엽세포를 조절한다는 보고가 있다 (Sabatakos et al., 2000). 화학적 치료요법에 관한 연구도 많은데 항암제 치료시 아세틸폴리아민 옥시데이즈 (acetylpolyamine oxidase)의 하향 조절이 AP-1의 요소인 c-Jun과 FosB의 발현을 증가시킨다는 보고가 있으며, 이러한 FosB/JUN AP-1 패밀리가 ΔNP73에 의해서 화학치료제의 저항성을 일으킨다는 연구 결과가 보고된 바 있다 (Bunjobpol et al., 2014). 항암제 투여시 폐암세포에서 FosB의 발현이 증가한다는 보고도 있다 (Na et al., 2016).

따라서, 본 발명은 종양 환자에 항암제를 처리하여 그 발현이 증가하는 핵산 부위를 동정함으로써, 항암제 내성을 나타내는지 여부를 항암화학치료에 앞서 미리 진단할 수 있는 바이오마커를 제공하는 것을 목표로 한다.

또한, 본 발명은 상기 바이오마커를 이용한 진단 킷트를 제공하는 것을 목표로 한다.

또한, 본 발명은 상기 바이오마커를 이용한 항암제 내성 예측을 위한 정보를 제공하려는 것을 목표로 한다.

본 발명은 종양 환자에 대해 선별적인 항암화학요법을 시행하기 위한 항암제 내성 진단용 바이오마커 및 이를 이용한 항암제 내성 진단용 킷트에 관한 것으로서, 다양한 유전자 발현 변화를 조사하기 위해 항암제 처리에 의해 발현이 증가한 유전자를 분석하였다.

본 발명은 항암제가 처리된 암 환자로부터 분리된 암세포의 FosB 프로모터의 -267 ~ -115 부위 중 연속되는 20 염기 이상 152 염기 이하를 포함하는 부분의 발현량을 측정하고, 항암제 처리 전의 암 환자로부터 분리된 암세포로부터 측정된 상기 FosB 프로모터의 -267 ~ -115 부위 중 연속되는 20 염기 이상 152 염기 이하를 포함하는 동일 부분의 발현량과 비교하여 항암제 처리 후 발현량이 증가하는 경우, 항암제에 대한 내성 가능성이 있는 것으로 판단하는, 항암제 내성 예측을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 20 염기 미만 또는 152 염기를 초과하는 경우 탐지가 상대적으로 용이하지 않으므로 연속되는 20 염기 이상 152 염기 이하의 범위에서 발현량을 측정하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 방법이

a) 암 환자에서 분리한 암세포 조직으로부터 시료를 준비하고, 상기 시료에서 FosB 프로모터의 -267 ~ -115 부위 중 연속되는 20 염기 이상 152 염기 이하를 포함하는 부분의 발현량을 측정하는 단계;

b) 항암제를 투여한 암 환자에서 분리한 암세포 조직으로부터 시료를 준비하고, 상기 시료에서 FosB 프로모터의 -267 ~ -115 부위 중 연속되는 20 염기 이상 152 염기 이하를 포함하는 동일 부분의 발현량을 측정하는 단계;

c) 상기 a) 단계의 결과와 상기 b) 단계의 결과를 비교하는 단계;

d) 상기 비교에서 상기 a) 단계의 발현량보다 상기 b) 단계의 발현량이 증가한 경우 항암제 내성 가능성이 높은 것으로 판단하는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 항암제는 특별한 제한은 없으나, 바람직하게는 독소루비신 (doxorubicin) 또는 탁솔 (taxol)인 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 암세포는 폐암세포인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 FosB 프로모터의 -267 ~ -115 부위 중 연속되는 20 염기 이상 152 염기 이하를 포함하는 부분의 발현량 측정은 mRNA의 양을 측정하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 mRNA 양 측정을 RT-PCR (reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 노던 블롯팅 또는 핵산 마이크로어레이 방법으로 수행함을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 FosB 프로모터의 -267 ~ -115 부위 중 연속되는 20 염기 이상 152 염기 이하를 포함하는 항암제 내성 예측용 바이오마커에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 FosB 프로모터의 -267 ~ -115 부위가 서열번호 7로 표시되는 염기서열을 갖는 핵산임을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 FosB 프로모터의 -267 ~ -115 부위 중 연속되는 20 염기 이상 152 염기 이하를 포함하는 부분의 발현량을 측정할 수 있는 수단을 포함하는 항암제 내성 예측용 킷트에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 발현량 측정 수단이 프라이머, 프로브 및 마이크로어레이로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것임을 특징으로 한다.

상기 수단은 공지된 분자생물학적 수단 또는 면역화학적 수단일 수 있다.

바람직한 구체예로서, 상기 수단은 프라이머, 프로브, 핵산 마이크로어레이로 이루어진 군으로부터 선택된 측정 수단일 수 있다.

상기 "프라이머"는 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건 즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 서열은 주형과 혼성화되어 프라이머로서 작용할 수 있는 정도의 상보성을 가지면 된다.

상기 "프로브"는 자연적으로 존재하거나 인위적으로 합성된 모노머 또는 연쇄의 선형 올리고머를 의미한다. 본 발명의 프로브는 단일쇄이거나 바람직하게는 올리고디옥시리보뉴클레오타이드일 수 있다. 본 발명의 프로브는 dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP, 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체, 리보뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.

상기 "마이크로어레이"는 예컨대 FosB 프로모터 부분을 검출하기 위한 핵산 마이크로어레이일 수 있다. 본 발명의 핵산 마이크로어레이는 FosB 프로모터의 발현 수준을 측정할 수 있는 프라이머 또는 프로브가 혼성화 어레이 요소로 이용되며, 기질 상에 고정된다. 기질로는 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 비드, 젤, 플레이트, 고분자 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

프라이머 또는 프로브와 같은 혼성화 어레이 요소가 기질 상에 배열되고, 화학적 결합 또는 UV를 이용한 결합 등의 다양한 방법으로 기질에 고정할 수 있다.

본 발명의 항암제 내성 예측을 위한 정보를 제공하는 방법, 그리고 바이오마커 및 항암제 내성 예측용 킷트를 이용하면 항암제 치료를 받은 환자의 항암제에 대한 내성 발생 여부를 빠르게 예측할 수 있기 때문에 이후 효과적인 치료를 모색하는데 유용하다.

도 1은 FosB 프로모터 핵산서열이다. (A) Ensembl (www.ensembl.org) 프로그램을 이용하여 사람 FosB 유전체 DNA 서열을 분석하였다. FosB 유전자 엑손 1의 첫 번째 염기서열은 G이며, 그 앞부분인 -1555 부위부터 +73 부위를 증폭하고자 하였다. 센스: 5'-gagcagtaagaaggagattgta(-1555), 안티센스 1: cttggaaac(+61)ttgattgttgtgg-3'(+73)에 대한 프라이머를 제작한 후 사용하였다.
도 2는 유전체 DNA로부터 pGL3-Luc로의 클로닝을 나타낸 모식도와 발현을 나타내는 사진이다. IMR90, 293 세포에서 추출한 유전체 DNA로부터 얻어낸 FosB 프로모터의 1626bp PCR 밴드를 확인하였다. PCR 밴드를 Kpn1, Nhe1 제한효소부위를 이용하여 TA 벡터로 1차, 2차 클로닝을 수행하였다. Kpn1, Nhe1로 절단한 후 FosB 프로모터 삽입부를 pGL3-Luc 벡터로 클로닝하였으며, 예상 크기를 확인하였다.
도 3은 트랜스펙션 후 pGL3FosBp-Luc 활성을 분석한 결과이다. pGL3-FosBp-Luc 벡터를 A549세포에 트랜스펙션한 후 항암제 독소루비신 2 uM과 탁솔 500 nM을 각각 12시간 처리하고, pGL3FosB-Luc 벡터의 루시페린 (Luciferin) 활성을 분석하였다.
도 4는 SETDB1-FosB 발현조절에 관여하는 신호전달체계 분석 결과이다. A549 세포에 pGL3-basic-luc, pGL3-FosB-luc를 트랜스펙션한 다음 저해제를 처리하고 독소루비신을 처리하여 FosB 프로모터 활성 측정 결과 독소루비신에 의해 증가한 FosB 프로모터 활성이 ERK 저해제에 의해 감소함을 확인하였다. A549 세포에 독소루비신과 PD98059 저해제를 처리한 후 웨스턴 블롯 실험을 수행한 결과, 항암제에 의해 증가한 FosB와 p-ERK가 저해제에 의해 감소하고, SETDB1은 항암제에 의해 감소하고 저해제에 의해 다시 발현이 증가함을 확인하였다.
도 5는 Facs 실험을 통한 FosB의 세포주기 조절 기능을 보여준다. A549 세포에 ΔFosB, FosB, siFosB를 각각 트랜스펙션하여 시료 준비 후 facs 실험을 수행하여 세포주기 관찰 결과, ΔFosB, FosB에 의해서 DNA 합성기인 S기가 증가한 것을 확인하였다.
도 6은 ChIP을 통한 FosB 프로모터 지역의 SETDB1 결합부위 분석 결과이다. (A) 생물정보학을 이용하여 FosB 프로모터 부위 염기서열을 확인하고 p1, p2, p3에 해당하는 프라이머를 제작하였다. (B) A549 세포에 독소루비신을 처리하여 시료를 준비하고 IgG, SETDB1, H3K9me3 항체를 사용하여 ChIP 실험한 결과, p2에서 결합하고 있는 SETDB1, H3K9me3가 항암제에 의해서 떨어진 것 확인하였다. (C) A549 세포에 독소루비신과 탁솔을 각각 처리하고 siSETDB1을 트랜스펙션하여 시료를 준비한 후 IgG, SETDB1, H3K9me3 항체를 사용하여 대조군에서는 SETDB1, H3K9me3가 결합하고 있지만 항암제 및 SETDB1 녹다운에 의해 결합이 떨어짐을 확인하였다.

아래에서는 구체적인 실시예를 들어 본 발명의 구성을 좀 더 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 실시예의 기재에만 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.

<실험 방법>

FosB 유전자 프로모터 분석

NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) 또는 Ensembl (www.ensembl.org) 프로그램을 이용하여 FosB 유전자 유전체 DNA 내의 cDNA, 엑손-인트론 서열을 분석하였다. CpG 서열분석은 EMBL-EBI CpG plot (http://www.ebi.ac.uk/Tools/seqstats/)을 이용하였다.

유전체 DNA 추출

유전체 DNA 추출을 위해 배양 중인 IMR90 세포들을 모아 DNA 용출 완충액 (20 mM EDTA pH 8.0, 50 mM Tris HCl pH 8.0, 1% sodium dodecyl sulfate, 0.1 M NaCl, 0.5 mg/mL proteinase K)을 가하고 55℃에서 30분간 반응시켰다. 동량의 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올 (25:24:1, v/v/v)을 첨가하여 원심분리하고 상층액을 취한 후, 두 배 부피의 100% 알코올을 넣고 -20℃에서 침전시켰다. 다음날 침전물을 모으고 증류수를 넣어 녹인 후 보관하였다.

TA 벡터 클로닝을 위한 1차 PCR 및 2차 PCR

PCR 증폭을 위해 OligoTM V6.5 소프트웨어를 이용하여 FosB 프로모터를 증폭하기 위한 PCR 프라이머를 제작하였다. 유전체 DNA로부터 FosB 프로모터를 증폭하기 위해 1차 PCR에 이용할 1stFosBp-S1: 5'-GAGCAGTAAGAAGGAGATTGTA-3', 1stFosBp-AS1: 5'-CTTGGAAACTTGATTGTTGTGG-3'를 합성하여 사용하였다. 유전체 DNA 주형은 1~10 ng을 사용하였으며, 프라이머 쌍들을 넣은 후, 1 mM dNTPs, 1 μg BSA와 함께 1 U Taq DNA 폴리머레이즈 (Biosolution, Korea) 등을 넣어 25 μL 반응 조건에서 수행하였다. 제작된 TA-1stFosBp 벡터로부터 2차 PCR을 위해 제한효소 부위가 첨가된 2ndFosBp-Kpn1 S1: 5'-AGGTACCGAGCAGTAAGAAGGAGATTGTA-3', 2ndFosBp-Nhe1 AS1: 5'-AGCTAGCCACAACAATCAAGTTTCCAAG-3'을 사용하여 증폭하였다. PCR 산물은 EtBr (Ethidium Bromide)이 포함된 아가로즈젤에 전기영동하여 증폭여부를 확인한 후 깨끗한 염기서열 결과를 얻기 위해 젤을 잘라내어 Rapid Gel Extraction Kit (TAKARA, Japan)를 이용하여 정제하였다. pGL3-luc 벡터로의 재조합은 클로닝된 TA-2ndFosBp 플라스미드로부터 제한효소를 이용하여 FosBp를 절단하여 수행하였다.

E. coli 형질전환

각 단계에서 증폭된 PCR 산물과 클로닝 플라스미드를 혼합하여 16℃에서 16시간 동안 반응시켜 DNA 재조합을 수행하였다. 재조합된 DNA 용액을 42℃에서 반응시킴으로써 E. coli XL-1 Blue에 형질 전환하였고, 50 μg/mL의 앰피실린 항생제가 포함된 LB 고체배지에 도말하여 형질 전환체를 선별하였다.

플라스미드 추출

LB 배지에서 배양된 E. coli 형질전환체를 모아 알칼리 추출방법을 이용하여 플라스미드 DNA를 추출하였다. Sol I 100 μL, Sol Ⅱ 200 μL, Sol Ⅲ 150 μL를 차례로 넣은 후 원심분리를 거쳐 페놀 정제를 수행하고 에탄올로 침전시켰다. 침전물을 물에 녹인 후 1% 아가로즈 젤을 사용하여 전기영동을 수행하였으며, 플라스미드 크기 및 제한 효소 절단 등을 이용하여 클로닝된 플라스미드 DNA를 선별하였다.

일시적 트랜스펙션 및 루시퍼레이즈 분석

배양 중인 A549 세포를 일정시간 굶긴 후, 10 μL의 lipofectamine 2000 (Invitrogen)과 5 μg의 pGL3-FosBp-luc 플라스미드를 혼합하여 넣어주었다. 약 6시간 후 FBS와 항생제가 들어있는 DMEM 배양액으로 갈아주었고, 12시간 더 배양한 다음, 독소루비신 또는 탁솔을 가하여 12시간 더 처리하고 루시퍼레이즈 분석을 수행하였다. 루시퍼레이즈 분석은 0.4 mL의 리포터 용균 완충액 (Promega, USA)을 이용하여 시료를 용해한 후, 이중 20 μL의 세포 용균액과 20 μL의 루시퍼레이즈 분석 시약을 기질로 사용하여 luminometer로 측정하였다. 평균 활성도는 세 번의 실험결과로부터 얻은 평균과 표준편차로 분석하였으며, β-갈락토시데이즈를 이용하여 루시퍼레이즈 활성 수치를 보정하였다.

FACS (flow cytometery ) 분석

A549 세포에 과발현 벡터 또는 siRNA를 트랜스펙션하여 세포 펠렛을 얻은 후, 70% 에탄올을 넣어 고정하였다. 이후 PBS로 두 번 워싱한 다음, 고정된 펠렛에 PBS, P.I (10 μg) 그리고 RNase (20 μg)를 넣고 상온에 30분간 유지하여 세포를 염색하였다. 유속세포분리기를 사용하여 세포주기를 확인하였다.

콜로니 형성 분석

A549 세포를 60mm 접시에서 세포가 60-70% 증식하였을 때 siRNA (200 pM), 과발현 벡터 (1 μg)를 각각 트랜스펙션하였다. 24시간 후 콜로니 형성을 분석하였다. 0.8% Low melting agarose (invitrogen Cat.no. 16520-100)와 RPMI-1640 배지를 섞어서 전자레인지에 넣고 아가로즈를 전부 다 녹여준다. 이후 40℃ 욕조에 넣어 굳지 않게 유지하다가 나머지 배지와 10% FBS를 넣어준다. 트랜스펙션한 세포들은 계수하여 1 플레이트당 2000개의 세포가 들어가도록 0.8% low melting agarose에 넣어준다. 이후 각 플레이트에 맞게 3 ml씩 분주하고, 아가로즈가 굳어지면 젤 위에 10% FBS 1Xps RPMI-1640 2 ml를 넣고 CO₂ 배양기에서 배양을 진행하고, 2일마다 배지를 바꿔준다. 15일에서 20일 정도 되었을 때 젤을 제거하고, 0.5% 크리스탈 바이올렛으로 1시간 동안 처리하여 염색한다. 그 다음 증류수로 염색약을 씻어내고 콜로니를 확인한다.

ChIP (Chromatin immunoprecipitation ) 분석

FosB 프로모터의 p1 (-827~-607), p2 (-267~-115), p3 (-139~+37) 부분을 표적하는 프라이머를 제작하였다. A549 세포에 독소루비신 (2 μM), 탁솔 (0.5 μM) 또는 siSETDB1을 처리하거나 트랜스펙션하여 준비한다. 27% 포름알데하이드 (SIGMA F8775) 370 μl를 넣고 세포를 고정한 다음 펠렛을 모아준다. 펠렛을 SDS 용균 완충액 (1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris (PH 8.0), 1X Protease inhibitor (Roche 11697498001))로 초음파처리하여 잘게 부순다. 이후 12500 RPM에서 30분 동안 원심분리하여 상층액을 얻는다. 상층액 중 일부는 input으로 사용하고 나머지는 ssDNA (salmon sperm DNA)와 비드를 같이 넣고 4℃ 조건에서 회전자 (Rotor)로 2시간 동안 프리클리어링 (pre-clearing)을 진행한다. 스핀 다운하여 얻은 상층액에 항체와 비드를 같이 넣어주어 4℃ 조건에서 회전자 (Rotor)로 o/n 동안 면역침전을 진행한다. TSE1 (0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (PH 8.0), 150 mM Nacl), TSE2 (0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (PH 8.0), 500 mM Nacl), TSE3 (0.25 M Licl, 1% NP-40, 1 mM EDTA, 10 mM Tris (PH 8.0)), TE 완충액 (10 mM Tris (PH 8.0), 1 mM EDTA)으로 차례로 워싱한 후, 용출 완충액 (1% SDS, 0.1 M NaHCO₃)을 넣고 비드에 결합한 항체 및 단백질을 분리한다. 여기에 5 M NaCl을 넣고 65℃에서 네 시간 동안 역교차 (reverse crosslinking)를 진행한다. 이후 동일한 양의 3:1 Phe/Chl을 넣어서 단백질을 제거하고, 남은 DNA를 주형가닥으로 하고, FosB 프로모터를 표적으로 하는 프라이머를 가지고 PCR을 진행하여 결합 여부를 확인하였다.

결과 1: FosB 유전체 DNA 분석

FosB 유전자의 프로모터를 동정하고자 Ensembl 프로그램들을 이용하여 FosB 유전체 DNA 서열을 확인하였다. FosB 유전자는 사람의 19번 염색체에 위치하며, 세포에 따라 다양한 변이체들이 발현된다고 보고되어 있다. 이중 FosB 전사 변이체 1은 네 개의 엑손으로부터 338개의 아미노산으로 구성된 단백질을 생산할 수 있다. 그러나 선택적 스플라이싱으로 약 100여 개의 아미노산이 제거된 ΔFosB 단백질도 존재한다고 알려져 있다. 전사 개시점의 염기서열 (TSS; transcription start site, +1)은 사이토신 (C)이며, 엑손 1의 중간부위에 단백질 개시코돈인 ATG 서열이 존재하며, 엑손 4에 단백질 종결코돈 (TGA)을 포함하고 있는 것으로 확인되었다. TSS 상류 방향의 약 2 Kb 부위에는 부위 중 약 300 bp 근처에 CpG 빈도가 높은 부분이 있음을 알 수 있었고, 따라서 FosB 유전자 발현과정에서 DNA 메틸화에 대한 조절 기작도 있을 것임을 추정할 수 있다. 그러므로, 우리는 이 부위를 포함하여 FosB 유전체 DNA의 상류 -1555 부위부터 엑손 1의 +73까지 약 1.6 kb의 FosB 프로모터 부위를 동정하였다 (도 1).

결과 2: FosB 프로모터 클로닝

FosB 프로모터 부위를 pGL3-Luc 벡터로 클로닝하기 위하여 우선적으로 TA 벡터로 삽입하고자 하였다. 정상세포인 IMR90 세포로부터 유전체 DNA를 추출한 후, 이를 주형으로 이용하여 FosB 프로모터 부위에 대한 PCR 반응을 수행하였다. PCR 반응물은 TA 벡터에 삽입하여 TA-1^stFosBp 플라스미드를 얻을 수 있었다. 다시 TA-1^stFosBp 플라스미드를 주형으로 하여 2차 PCR을 수행하였다. 이때 2차 PCR을 수행하기 위한 프라이머들은 pGL3-Luc 벡터로 원활하게 클로닝할 수 있도록 Kpn1과 Nhe1 제한효소 절단부위를 프라이머에 삽입한 후 제작하였다. 따라서, 2차 PCR을 수행하여 얻어진 PCR 산물은 다시 TA벡터로 클로닝되었으며, 이를 TA-2^ndFosBp라고 명명하였다. 이후 Kpn1 과 Nhe1 제한효소 절단을 통하여 FosBp를 획득하였으며, 같은 제한 효소로 절단된 pGL3-luc 벡터에 삽입하였다. 매 단계마다 플라스미드를 추출하고 제한 효소로 절단하여 FosB 프로모터가 삽입된 형질전환체를 확인할 수 있었다.

결과 3: 항암제 처리에 따른 FosBp 활성도 분석

제작된 pGL3-FosBp-Luc를 이용하여 항암제에 대한 활성도를 분석하고자 A549 사람 폐암 세포주에 pGL3-FosBp-luc 벡터를 트랜스펙션한 다음 루시퍼레이즈 (luciferase) 활성도 분석을 수행하였다. 대조군으로는 pGL3-basic-luc 플라스미드를 트랜스펙션하였다. 각각 플라스미드를 트랜스펙션한 후 독소루비신 (doxorubicin) 또는 탁솔 (taxol)을 처리하였을 때 대조군의 루시퍼레이즈 활성도 변화는 거의 없었다. 그러나 pGL3-FosBp-luc 플라스미드를 트랜스펙션한 세포는 대조군에 비해 약 15배 활성도가 증가하였고, 독소루비신 처리군에서는 활성도는 약 240배 증가하였음을 알 수 있었다. 또한, 탁솔 처리 그룹에서는 활성도가 약 25배 증가하였다. 이러한 루시퍼레이즈 활성도 증가는 독소루비신, 탁솔 등을 처리한 후 단백질 발현 양상과 비교하였을 때도 일치하는 결과였다.

결과 4: ERK2 / MAPK 신호전달에 의한 SETDB1 - FosB 발현 조절

A549 세포에 pGL3-basic-luc 벡터 (1 μg), pGL3-SETDB1p-luc 벡터 (1 μg), pGL3-FosBp-luc 벡터 (1 μg)를 트랜스펙션한 뒤 12시간 이후 신호전달 저해제 SP600125 (JNK 저해제), PD98059 (ERK/MAPK 저해제), SB203580 (p38/MAPK 저해제), LY294002 (PI3K 저해제)를 1시간 전처리하였다. 이후 독소루비신을 12시간 처리한 후 1XCCLR 용균 완충액을 이용해 세포 용균액을 얻고 이를 루시페린 (luciferin)과 섞어서 발광하는 정도를 루미네이터 (luminator)로 측정하였다. 그 결과, SETDB1 프로모터의 경우 독소루비신 처리로 감소하던 프로모터 수준이 PD98059에 의해서 다시 원래의 상태로 프로모터 수준이 증가함을 확인할 수 있었다. 그 외 다른 저해제들은 프로모터 수준이 감소한 상태로 변하지 않음을 확인하였다. 이와 반대로 FosB 프로모터의 경우 독소루비신에 의해 증가한 프로모터 수준이 PD98059와 SB203580에 의해서 감소하고 있음을 확인하였고 다른 저해제에서는 변함이 없음을 확인하였다. Fos 패밀리 유전자들은 MAPK 신호를 통해서 세포증식을 조절한다고 알려져 있다 (Bamberger et al., 1999). 이러한 결과를 통해 SETDB1-FosB 경로는 ERK/MAPK 신호전달을 통해 조절되고 있음을 확인하였다. 항암제에 의한 FosB의 증가가 저해제에 의해 감소하는데 저해제의 농도에 따라 FosB의 발현 변화는 없는 것으로 확인하였다. A549 세포에 저해제인 PD98059, SP600125를 한 시간 전처리한 다음 독소루비신을 12, 24시간 처리하여 시료를 준비하였다. 인산화 MAPK 분석 킷트를 이용하여 작용되는 신호전달 경로를 확인하였다. 킷트를 사용하여 확실하게 ERK2 경로에 의해 조절되고 있음을 확인하였다. 다른 MAPK 신호인 ERK1, P38은 크게 영향을 받지 않고 있음을 확인하였고 항암제를 처리할 때 증가하는 P53의 경우 저해제의 영향을 받지 않음을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 보면, 항암제에 의해서 ERK2/MAPK 신호가 증가하고 있으며 이러한 경로가 SETDB1-FosB 경로를 조절하는데 관여하고 있음을 확인할 수 있었고 세포증식을 증가시키는 경로가 작동하는 것으로 보아 항암제 저항성을 가지고 있음을 추측할 수 있다.

결과 5: FosB 프로모터 지역의 항암제 조절 SETDB1 결합부위 분석

항암제 처리시 FosB의 프로모터가 영향을 받고 이때 SETDB1에 의해서 조절되는 것을 루시퍼레이즈 분석법으로 확인하였다. 이번에는 SETDB1 단백질이 FosB 프로모터에 어떻게 작용하여 FosB 프로모터의 활성을 변화시키는지 알아보기 위해 ChIP (Chromatin immunoprecipitation) 분석실험을 진행하였다. 도 6을 보면 FosB 프로모터 부위를 확인하기 위하여 프라이머로서 각각 p1 (-827 ~ -607), p2 (-267 ~ -115), p3(-139 ~ +37)를 제작하였고 A549 세포에 독소루비신 (2 μM)을 처리하고 12시간 이후 포름알데하이드로 세포를 고정하였다. 고정시킨 세포의 펠렛을 얻어 SDS 용균완충액과 초음파 분쇄를 이용하여 세포를 용균한 다음 상층액을 얻어 항체와 비드를 가하여 면역침전을 수행하고 세척과 용출, 그리고 역교차 (reverse crosslinking) 과정을 거치면서 비드에 결합된 항체와 결합한 DNA를 얻어내어 PCR 시료를 준비한다. 이 DNA를 주형으로 하여 위에 제작한 프라이머로 PCR을 진행하였다. 그 결과, 대조군에서 FosB 프로모터에 결합하고 있는 SETDB1과 H3K9me3가 독소루비신을 처리하였을 때 p2에서 결합이 떨어짐을 확인하였다. 이 결과로 SETDB1 단백질이 FosB 프로모터 p2에서 결합하고 있음을 확인하였다. 마찬가지로 A549 세포에 독소루비신 (2 μM), 탁솔 (0.5 μM)을 처리하고 siSETDB1 (500 pM)을 트랜스펙션하여 시료를 얻었다. 그리하여, 독소루비신, 탁솔 처리와 siSETDB1 트랜스펙션시 SETDB1 항체를 사용하였을 때 대조군에서 FosB 프로모터와 SETDB1 단백질이 결합하고 있음을 확인할 수 있었다. 그러나, 독소루비신 또는 탁솔을 처리하거나 siSETDB1을 트랜스펙션하였을 때는 밴드가 나타나지 않은 것으로 보아 SETDB1 단백질과 결합하지 않는다는 것을 볼 수 있다. 또한, SETDB1은 히스톤 메틸 트랜스퍼레이즈 (histone methyl transferase)로 H3K9me3를 조절한다. 따라서, H3K9me3 항체를 사용한 결과, SETDB1과 마찬가지로 대조군에서는 FosB 프로모터와 결합하고 있던 H3K9me3 단백질이 독소루비신 또는 탁솔을 처리하였을 때 siSETDB1을 트랜스펙션하면 결합하지 않는 것을 확인하였다. 이러한 결과, SETDB1은 FosB 프로모터의 p2 부위 (-267 ~ -115)에 결합하여 FosB가 발현되는 것을 억제하고 있으며, 항암제나 SETDB1의 녹다운으로 SETDB1이 없어지면서 FosB가 발현한다고 제안할 수 있다. 즉, FosB의 발현은 SETDB1에 의해서 조절되는 것으로 보인다.

결과 6: FosB의 세포주기 조절 기능

이전 실험에서 FosB 유전자가 세포증식을 조절하는 유전자라는 것을 확인하였다. FosB가 세포주기에 어떠한 영향을 주어 세포증식을 조절하는지 알아보기 위해 마찬가지로 FACS 실험을 진행하였다. A549 세포에 FosB-GFPc2 (1 μg), ΔFosB-GFPc2 (1 μg), siFosB (200 pM)를 트랜스펙션하여 시료를 준비하고 이 시료에 70% 에탄올을 넣어 세포를 고정시킨다. 이후 PI (50 μg/ml), RNase (20 μg/ml)를 1X PBS와 섞어서 세포를 염색시킨다. 이후 플로우 사이토메트리 장치에서 세포주기를 측정하였다. FosB, ΔFosB 과발현 시료에서는 대조군에 비해 G1기가 감소하고 S기가 증가함을 보였으며 FosB 녹다운 시에는 G1기가 증가하고 S기가 감소한 것을 확인할 수 있었다.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation, Kangwon National University <120> Biomarkers to diagnose anti-cancer medicine resistance of cancer patient using FosB gene promoter and diagnostic kit thereof <130> KCKim-KangwonU-FosBpromoter <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1stFosBp-S1 primer <400> 1 gagcagtaag aaggagattg ta 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1stFosBp-AS1 primer <400> 2 cttggaaact tgattgttgt gg 22 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2ndFosBp-Kpn1 S1 primer <400> 3 aggtaccgag cagtaagaag gagattgta 29 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2ndFosBp-Nhe1 AS1 primer <400> 4 agctagccac aacaatcaag tttccaag 28 <210> 5 <211> 2400 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 gagcagcctg accaatatgg agaaactctg tctctactaa aaatacaaaa aaactagcca 60 ggcatggtgg cacatgcctg taatcccagc tactcgggag gctgaggcag gagaagcact 120 tcaacccggg aggcggaggt tgcggtgagc cgagatcgtg ccattgcact ccagcctggg 180 caacaagagc aaaactctgt ctcaaaaaac aaaacagaac aaaacaaaaa ttagccaggt 240 gtggtggcgc acacctgtaa tcccagctac tcgggaggct gaggcaggag aatcacttga 300 acccaggaga tgtaggctgc agtgagccga gattgtggca ctgcactcca gcctgggcaa 360 cagagtgaga ctctgtcaaa aaaaaaaaaa aaaaacgtca gattcatgaa ccccatttgc 420 taagaagatt tgctcaggta gtcacctgta cccctgtgag ccaagattgc aacagtacat 480 gctaagagca gtaagaagga gattgtaaag cttagaaaga cctgacaggc caggcgctgt 540 ggctcacgcc tgtaatctcg acacttcggg aggccgaggc aggcggatca ccaggtcagg 600 agttcaagac catcctgacc aatatggtga aaccccgtct gtactaaaca tataaaaatt 660 agcttgacgt ggtggcccgc gcctgtagtc cagcaactcg agaggctaag gtgaggcgga 720 ggttgcagtg agccgagatc gccactgcac tccagcctgg cggcagagca agactccgtc 780 tcaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa agacctgaca agtgaaagct actaatattg 840 ccattatcat ttaaaaaaac cccagacaca ggtttttcag ggagtttcat ccaaccaggc 900 aggtctcaga aatcagaaaa gaaatggaaa gggtaggaaa tctggagttt gacaattctg 960 agtttgaatt tcttgtgatg ggatcttggg caagtcattt aacctccctg agtatcattt 1020 ttttctttta taaaatgaag atttttctct cttaaccttc cagagctgtt ttaaggatta 1080 caaatcttct actgaaaggc gtagcacagg agctgtgctt ggcaagtgcc aaatacaagg 1140 cattaattat tattattaga attaataata atatcccctc cctcttacac attctttgtc 1200 tccgggtgga ttaaaaggtg gaaggagagg ctaccaacac catcagaaga gaggcttctc 1260 tctaagtttc atttcccatc tcctccaaat ccgcatccct cccaaacgcc ggacctgtaa 1320 ggccagcagg gtccaagaca cacatccttt gcccagcggg gaagattaaa gctaaagctc 1380 agagagggaa aacatttcct aagctcgcac agcgaatcag gacagaaacc aggacgagcc 1440 tcggaatccc tccattacct ccactttcac ctgagcatca cagcccgctc gggactcagt 1500 ttccccacct acgtgaccac accacactaa tcagggtctc cttttggaga tctgctcttc 1560 ttctcgaatg ggggcgctgc accatcggta gaacagggta ggtgggggcg ccagaggtga 1620 aggggacctg caggctgggg tcttccccgc ccgggtcagc ggggtccctg cggggctagt 1680 ctaagcgcct attattacca gcccccgggg cggcgttgca ctgcgcaggc gcgggcgggg 1740 cgcgggcgcg cgcgcgagcg agcgagggat tccctctgac gtcattgcta ggataccaaa 1800 caaacactcc gccgcgccgg ccgagctcct tatatggcta attgcgtcac aggaactccg 1860 ggaaggcggg gccgggatcc cctcccgccg agtggcccgg aacgcaaccc ccgagacccc 1920 cagggccccg agggtcatgc aagtgaccag atcgagtcta gaacagacct cttgctggac 1980 agtgcgggac tcgatttggc ggggccggag atttggggaa gtttgtccag caaggggcgg 2040 gtgacgtaag caggggggcg ggtcccgggc atataaatac aggctggcgg gtctgtgctt 2100 cattcataag actcagagct acggccacgg cagggacacg cggaaccaag acttggaaac 2160 ttgattgttg tggttcttct tgggggttat gaaatttcat taatcttttt ttttccgggg 2220 agaaagtttt tggaaagatt cttccagata tttcttcatt ttcttttgga ggaccgactt 2280 actttttttg gtcttcttta ttactcccct ccccccgtgg gacccgccgg acgcgtggag 2340 gagaccgtag ctgaagctga ttctgtacag cgggacagcg ctttctgccc ctgggggagc 2400 2400 <210> 6 <211> 200 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 catccctccc aaacgccgga cctgtaaggc cagcagggtc caagacacac atcctttgcc 60 cagcggggaa gattaaagct aaagctcaga gagggaaaac atttcctaag ctcgcacagc 120 gaatcaggac agaaaccagg acgagcctcg gaatccctcc attacctcca ctttcacctg 180 agcatcacag cccgctcggg 200 <210> 7 <211> 152 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 atggctaatt gcgtcacagg aactccggga aggcggggcc gggatcccct cccgccgagt 60 ggcccggaac gcaacccccg agacccccag ggccccgagg gtcatgcaag tgaccagatc 120 gagtctagaa cagacctctt gctggacagt gc 152 <210> 8 <211> 176 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 aacagacctc ttgctggaca gtgcgggact cgatttggcg gggccggaga tttggggaag 60 tttgtccagc aaggggcggg tgacgtaagc aggggggcgg gtcccgggca tataaataca 120 ggctggcggg tctgtgcttc attcataaga ctcagagcta cggccacggc agggac 176

Claims (10)

1. 독소루비신 (doxorubicin) 또는 탁솔 (taxol) 중 1종 이상의 항암제를 처리한 폐암 환자로부터 분리된 암세포의 FosB 프로모터 중 서열번호 7로 표시되는 -267 ~ -115 부위에서 선택되는 20 염기 이상 152 염기 이하의 연속된 염기서열로 구성되는 영역의 발현량을 측정하고, 항암제 처리 전의 폐암 환자로부터 분리된 암세포로부터 측정된 상기 FosB 프로모터 중 서열번호 7로 표시되는 -267 ~ -115 부위에서 선택되는 20 염기 이상 152 염기 이하의 연속된 염기서열로 구성되는 영역과 동일한 영역의 발현량과 비교하여 항암제 처리 후 발현량이 증가하는 경우, 독소루비신 또는 탁솔 항암제에 대한 내성 가능성이 있는 것으로 판단하는, 항암제 내성 예측을 위한 정보를 제공하는 방법.
   
2. 청구항 1에 있어서,
   상기 방법은
   a) 항암제 처리 전의 폐암 환자에서 분리한 암세포 조직으로부터 시료를 준비하고, 상기 시료에서 FosB 프로모터 중 서열번호 7로 표시되는 -267 ~ -115 부위에서 선택되는 20 염기 이상 152 염기 이하의 연속된 염기서열로 구성되는 부분의 발현량을 측정하는 단계;
   b) 독소루비신 (doxorubicin) 또는 탁솔 (taxol) 중 1종 이상의 항암제를 투여한 폐암 환자에서 분리한 암세포 조직으로부터 시료를 준비하고, 상기 시료에서 FosB 프로모터 중 서열번호 7로 표시되는 -267 ~ -115 부위에서 선택되는 20 염기 이상 152 염기 이하의 연속된 염기서열로 구성되는 영역과 동일한 영역의 발현량을 측정하는 단계;
   c) 상기 a) 단계의 결과와 상기 b) 단계의 결과를 비교하는 단계;
   d) 상기 비교에서 상기 a) 단계의 발현량보다 상기 b) 단계의 발현량이 증가한 경우 독소루비신 또는 탁솔 항암제 내성 가능성이 높은 것으로 판단하는 방법.
   
3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
   상기 FosB 프로모터 중 서열번호 7로 표시되는 -267 ~ -115 부위에서 선택되는 20 염기 이상 152 염기 이하의 연속된 염기서열로 구성되는 영역의 발현량 측정은 mRNA의 양을 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
4. 청구항 3에 있어서,
   상기 mRNA 양 측정은 RT-PCR (reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 노던 블롯팅 또는 핵산 마이크로어레이 방법으로 수행함을 특징으로 하는 방법.
   
5. FosB 프로모터 중 서열번호 7로 표시되는 -267 ~ -115 부위에서 선택되는 20 염기 이상 152 염기 이하의 연속된 염기서열로 구성되는 폐암 환자의 독소루비신 또는 탁솔 항암제 내성 예측용 바이오마커.
   
6. FosB 프로모터 중 서열번호 7로 표시되는 -267 ~ -115 부위에서 선택되는 20 염기 이상 152 염기 이하의 연속된 염기서열로 구성되는 영역의 발현량을 측정할 수 있는 수단을 포함하는 폐암 환자의 독소루비신 또는 탁솔 항암제 내성 예측용 킷트.
   
7. 청구항 6에 있어서,
   상기 수단은 프라이머, 프로브 및 마이크로어레이로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 킷트.
   
   
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