KR101867053B1

KR101867053B1 - 붉은자루동충하초 추출물을 유효성분으로 포함하는 알레르기 예방, 개선 또는 치료용 약학조성물 및 화장료조성물

Info

Publication number: KR101867053B1
Application number: KR1020170147372A
Authority: KR
Inventors: 김성환; 성기호; 이인희
Original assignee: 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단
Priority date: 2017-11-07
Filing date: 2017-11-07
Publication date: 2018-06-14
Also published as: KR20180011037A

Abstract

본 발명은 알레르기 예방, 개선 또는 치료용 약학조성물에 대한 것으로, 보다 구체적으로는 붉은자루동충하초 추출물을 유효성분으로 포함하는 알레르기 예방, 개선 또는 치료용 약학조성물 및 그 응용제품에 관한 것이다.

Description

붉은자루동충하초 추출물을 유효성분으로 포함하는 알레르기 예방, 개선 또는 치료용 약학조성물 및 화장료조성물{A pharmaceutical composition and cosmetic composition for prevention, improvement or treatment of allergic disease comprising Cordyceps pruinosa extracts as an active ingredient}

알레르기(Allergy)란 보통 대부분의 사람에게서는 아무런 문제도 일으키지 않는 물질이 어떤 사람에게만 두드러기, 비염, 천식 등 이상과민반응(Hyper-sensitivity reaction)을 일으키는 것을 말한다. 알레르기도 우리 몸에서 일어나는 면역반응의 한 종류지만 몸에 유해한 반응을 말하며 요즘 들어서는 과민성이란 의미로 사용된다. 알레르기 질환은 봄철에 주로 발생하는 계절형과 1년 내내 증상이 나타나는 만성형 알레르기질환으로 나뉘며 계절형이 해마다 계속되면 만성형으로 전환될 수 있다. 일반적으로 알레르기 질환은 봄철에 유행한다고 생각나 우리나라에서는 집먼지 진드기에 의한 알레르기 질환이 사시사철 발생하는 경우가 많다.

이러한 다양한 항원에 의한 알레르기 반응으로는 유아의 기관지 천식, 아토피성 피부염, 비염, 두드러기, 습진 등의 원인 중의 하나로 추정되는데 알레르기성 접촉성 피부염을 유발하는 항원 물질들은 점차 일상생활에서의 접촉 기회가 늘어나는 추세이다. 알레르기(Allergy) 반응은 무해한 항원, 즉 알러젠(Allergen)에 반응하여 생성된 IgE 항체를 지닌 개인이 계속하여 동일 알러젠에 노출되었을 때 일어난다. 알러젠은 이미 노출된 조직에 있는 IgE 결합 비만세포를 활성화시켜, 알레르기의 특징적인 반응들을 연속적으로 일어나게 한다.

비만세포 및 혈중 호염구는 여러 가지 알레르기 질환 즉, 알레르기성 비염, 알레르기성 아토피 피부염, 천식, 음식 알레르기 및 아나필락틱 쇼크 등을 유발하는 체내 세포로 알려져 있다. 이들 세포는 세포표면에 알레르기를 유발하는 항체인 IgE에 대한 수용체(receptor)를 가지고 있고, 그것은 알레르기를 유발하는 물질(항원 혹은 알러젠으로 불림)에 의해 자극을 받아 자신이 가지고 있는 다양한 알레르기를 유발시키는 물질을 세포 바깥으로 분비한다.

알레르기를 치료하는 다양한 방법들이 존재하나, 대부분의 현대의 알레르기치료는 그 원인을 없애기보다는 증상을 완화하는 방향으로 연구가 진행되고 있다. 대표적으로 알러젠에 의해 비만세포 등에서 분비된 히스타민이나 류코트리엔 등의 수용체에 대한 길항약들이 주를 이루고 이러한 약물들이 거대한 시장을 이루고 있다. 그러나 이러한 약물은 환자에게 투여 후 단기간 내에 내성을 보이기 때문에 일정기간이 지난 후 혹은 반복 투여시 환자들의 증상을 호전시키지 못하는 경우가 많다.

이 외에 다른 치료 방법으로 알레르기 환자가 앓고 있는 알레르기에 대한 알러젠을 규명한 후 이를 소량씩 수년간 투여하여 그 알레르기를 점차 감소시키는 방법이 있다. 하지만 이 방법은 치료기간이 우선 수년이 걸리고, 아나필락틱 쇼크 등을 유발시킬 수 있다는 단점이 있다.

또한, 기타 DNA백신을 사용하는 방법, IgE가 비만세포의 수용체에 결합하는 것을 차단하는 치료법, 알레르기를 유발하는 사이토카인인 IL4에 대한 항체 치료법 등의 치료적 접근법이 있지만, 이러한 접근법들은 비용이 많이 들거나 아직 완전히 그 치료효과가 규명되지 않았다는 문제점이 있다.

한편, 붉은자루동충하초(Cordyceps pruinosa)는 자낭균문, 자낭균강, 육좌균목 Cordycipitaceae과에 속하는 버섯으로, 무성세대는 Mariannaea pruinosa이고 나비목 곤충의 번데기를 숙주로 하여 발생하는데, 주로 이 버섯균은 10월경에 발생하고 쐐기나방류의 번데기를 기주로 1개에서 4개의 곤봉형의 붉은색 자실체를 형성한다. 붉은자루동충하초 균사체는 다당류(polysaccharides), N-6-(2-하이드록시에틸)아데노신, 아데노신과 항 자외선 복사 성분과 같은 2차 대사물질을 함유하고 있으며 보고된 바에 의하면 붉은자루동충하초 자실체 메탄올 추출물은 NF-κB 의존성 염증 유전자 발현을 억제할 수 있고(Kim et al.2003, Liu and Fei 2001), 붉은자루 동충하초의 부탄올 분획물은 암치료에 있어서 항증식 인자의 역할(Kim etal. 2010)을 한다고 알려져 있다.

현재까지 붉은자루동충하초가 항알레르기 효과를 나타내는 유효성분으로 작용한다는 연구내용에 대해서는 보고된 바가 없다.

본 발명자들은 붉은자루동충하초 추출물의 새로운 용도를 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 붉은자루동충하초 추출물을 유효성분으로 포함하여 다양한 알레르기 질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 알레르기 예방, 개선 또는 치료용 약학조성물, 건강기능식품, 화장료조성물 등을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적들은 이상에서 언급한 목적들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 목적들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상술된 본 발명의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 붉은자루동충하초 추출물을 유효성분으로 포함하는 알레르기 예방, 개선 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 붉은자루동충하초 추출물은 비만세포의 알레르기 유발물질 분비를 억제하는 효과를 갖는다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 붉은자루동충하초 추출물은 붉은자루동충하초의 균사 또는 자실체를 물, C1 내지 C2 저급 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 사용하여 추출한 것이다.

또한, 본 발명은 붉은자루동충하초 추출물을 유효성분으로 포함하는 항알레르기 효과를 갖는 건강기능식품을 제공한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 붉은자루 동충하초 추출물은 붉은자루 동충하초의 균사 또는 자실체를 물, 에탄올 또는 이들의 혼합물을 용매로 사용하여 추출한 것이다.

또한, 본 발명은 붉은자루동충하초 추출물을 유효성분으로 포함하는 항알레르기 효과를 갖는 화장료조성물을 제공한다.

본 발명의 붉은자루동충하초 추출물은 비만세포의 알레르기 유발물질 분비작용을 억제함으로써, 다양한 알레르기 증상을 완화하기 위한 항알레르기 특성을 갖는 약학조성물, 기능성 식품소재 및 기능성 화장품소재로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 붉은자루동충하초 추출물(CPEE)이 처리된 비만세포(RBL-2H3 cells)의 MTT assay 상 세포생존성 결과 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 붉은자루동충하초 추출물(CPEE)이 처리된 비만세포(RBL-2H3 cells)에서 β-hexosaminidase 분비 억제효과를 나타낸 결과그래프이다.
도 3a 및 3b는 본 발명의 일 실시예에 따른 붉은자루동충하초 추출물(CPEE)이 처리된 비만세포(RBL-2H3 cells)에서 histamine 분비 억제효과를 나타낸 결과 그래프로서, 도 3a는 기준곡선(Standard curve)이고 도 3b는 측정된 값(Measured value)을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 붉은자루동충하초 추출물(CPEE)이 처리된 비만세포(RBL-2H3 cells)에서 IL-4 mRNA의 발현 억제효과를 나타낸 결과 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 붉은자루동충하초 추출물(CPEE)이 처리된 비만세포(RBL-2H3 cells)에서 IL-13 mRNA의 발현 억제효과를 나타낸 결과 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 붉은자루동충하초 추출물(CPEE)이 처리된 비만세포(RBL-2H3 cells)에서 TNF-αmRNA의 발현 억제효과를 나타낸 결과 그래프이다.
도 7a는 본 발명의 다른 실시예에 따른 붉은자루동충하초를 배양하는 배지의 pH에 따른 붉은자루동충하초 에탄올추출물의 색상을 나타낸 사진이다.(a:붉은자루동충하초 균사를 광조건하에 pH 9.0에서 배양 후 얻은 에탄올추출물, b: 붉은자루동충하초 균사를 광조건하에 pH 7.0에서 배양 후 얻은 에탄올추출물, c: 붉은자루동충하초 균사를 광조건하에 pH 4.0배양 후 얻은 에탄올추출물)
도 7b는 본 발명의 다른 실시예에 따른 붉은자루동충하초를 배양하는 배지의 pH에 따른 붉은자루동충하초 균사의 색상을 나타낸 사진이다. (d: 붉은자루동충하초 균사를 광조건하에 pH 9.0에서 배양, e: 붉은자루동충하초 균사를 광조건하에 균사 pH 7.0에서 배양, f : 붉은자루동충하초 균사를 광조건하에 pH 4.0에서 배양)
도 8은 본 발명의 다른 실시예에 따른 붉은자루동충하초 추출물(CPEE)이 처리된 비만세포(RBL-2H3 cells)의 MTT assay 상 세포생존성 결과 그래프이다.
도 9는 본 발명의 다른 실시예에 따른 붉은자루동충하초 추출물(CPEE)이 처리된 비만세포(RBL-2H3 cells)에서 β-hexosaminidase 분비 억제효과를 나타낸 결과그래프이다.
도 10은 본 발명의 다른 실시예에 따른 붉은자루동충하초 추출물(CPEE)이 처리된 비만세포(RBL-2H3 cells)에서 histamine 분비 억제효과를 나타낸 결과 그래프이다.

본 발명에서 사용되는 용어는 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어를 선택하였으나, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있는데 이 경우에는 단순한 용어의 명칭이 아닌 발명의 상세한 설명 부분에 기재되거나 사용된 의미를 고려하여 그 의미가 파악되어야 할 것이다.

이하, 첨부한 도면 및 바람직한 실시예들을 참조하여 본 발명의 기술적 구성을 상세하게 설명한다.

그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화 될 수도 있다. 명세서 전체에 걸쳐 본 발명을 설명하기 위해 사용되는 동일한 참조번호는 동일한 구성요소를 나타낸다.

본 발명의 기술적 특징은 붉은자루동충하초 추출물이 비만세포(RBL-2H3 cells)에서 알레르기 유발물질의 분비를 억제한다는 점에 착안된 것으로 붉은자루 동충하초 추출물의 새로운 용도인 항알레르기 활성을 이용하여 다양한 알레르기 질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 알레르기 예방, 개선 또는 치료용 약학조성물, 건강기능식품, 화장료조성물을 제공하는 것이다.

여기서, 비만세포(RBL-2H3)는 동물의 결합 조직 가운데 널리 분포하는 세포로서, 결합조직과 점막조직 내에 있는 호염기성 색소로 이염색성(metachromasia)을 나타내는 과립을 가진 방추형의 세포에 작은 둥근 핵을 갖는데, 비만세포의 표면에는 IgE에 대한 수용체가 존재하며, 수용체에 결합한 IgE 분자들끼리 다가의 항원에 의해 서로 연결되면 비만세포 과립탈출 반응이 일어나, 히스타민, 세로토닌, 헤파린 등의 화학전달 물질이 방출되어, 즉시형 알레르기 반응 등의 증상을 일으킨다.

따라서, 본 발명의 알레르기 예방, 개선 또는 치료용 약학조성물, 항알레르기 효과를 갖는 건강기능식품 또는 항알레르기 효과를 갖는 화장료조성물은 붉은자루 동충하초 추출물을 유효성분으로 포함한다. 즉, 붉은자루동충하초 추출물이 비만세포의 알레르기 유발물질 분비를 억제하는 효과를 갖기 때문이다. 그 결과 본 발명의 약학조성물은 인간을 제외한 포유류의 알레르기 치료를 위해 경구 또는 비경구적으로 투여하여 유발된 알레르기를 치료할 수 있다.

본 발명의 약학조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 붉은자루동충하초 추출물의 항알레르기 활성은 후술하는 실험예에서 알 수 있듯이 붉은자루동충하초 추출물의 원료인 붉은자루 동충하초의 재배조건에 영향을 받는다. 즉, 붉은자루동충하초의 재배조건이 빛이 있는 조건에서 균사까지 배양 또는 배지의 pH가 7 내지 9인 조건에서 배양 중 하나 이상의 조건을 충족시켜 얻어진 붉은자루동충하초 추출물의 항알레르기활성이 유효하게 우수하기 때문이다.

본 발명에서 사용되는 붉은자루동충하초 추출물은 붉은자루동충하초의 균사 또는 자실체를 물, C1 내지 C2 저급 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 사용하여 추출한 것일 수 있는데, 특히 건강기능식품에 포함되는 붉은자루동충하초 추출물은 에탄올 또는 이들의 혼합물을 용매로 사용하여 추출한 것일 수 있다.

실시예 1

사용된 균주는 (주) 머쉬텍에서 보관중인 붉은자루 동충하초 strain NO. 11952 이며 배지는 SDAY (Sabourand`s dextrose agar test extract)이다. 평판 한천배지를 제작하고 이후에 균 수확을 용이하게 하기 위하여 배지가 굳은 후 멸균된 반투막 셀로판으로 코팅하였다. 이후 균주의 포자를 5 × 10⁶cfu / ml 농도로 100 ul 를 배지에 접종하여 도말하고 22.5 ℃에서 배양하였다. 실험군은 빛의 유무에서의 배양과 생장단계에서의 약리활성을 비교하기 위하여 빛이 있는 상태에서의 14일 배양 (광조건 균사배양), 빛이 없는 상태에서의 14일 배양 (암조건 균사배양), 빛이 있는 상태에서 14일 배양한 후 추가 접종하고 14일간 배양 (광조건 균사와 포자배양) 등 3개의 군으로 하였다. 여기서 포자 배양은 균사에서 한 단계 더 생장한 단계로 균사 이상의 단계로의 배양에서 추가적인 활성을 보이는지를 확인하기 위한 것을 의미한다. 배양된 각각의 실험군을 수확한 후 -80 ℃에서 7일간 동결건조기 (FD8512, 일신바이오베이스, 한국)로 건조하여 분말화 하였다. 건조분말 50 mg / 20 ml 로 에탄올 추출한 후 감압농축 (NE-2001, EYELA, Japan)하여 50 mg / 2 ml로 농축하였다. 각각의 추출물은 광조건 균사배양 에탄올 추출물을 CPEE(L, H), 암조건 균사배양 에탄올 추출물을 CPEE(D, H), 광조건 균사와 포자배양 에탄올 추출물을 CPEE(L, S)라고 명명하였다.

실험예 1

1. 세포배양

RBL-2H3 세포주는 한국세포주 은행 (KTCC)에서 구입하였으며, 37℃, 5% CO₂ incubator에서 10% FBS (Gibco, USA), 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin (Gibco, USA)이 포함된 DMEM (Gibco, USA)에서 배양하였다.

2. 세포독성능 평가

본 발명에서 알레르기가 유발됨의 정당성을 위하여 MTT assay로 세포독성을 다음과 같이 측정하고 그 결과는 도 1에 나타내었다. RBL-2H3 세포에 (2 × 10⁶cells / ml) 에 CPEE(L, H):C. pruinosa (light, hypha), CPEE(L, S):C. pruinosa (light, spore), CPEE(D, H):C. pruinosa (dark, hypha)를 각각 400, 200, 100, 50 ug / ml 농도로 처리하였고 37℃, 5% CO₂ 조건에서 30분 배양한 후 C4880 (Sigma-aldrich, USA)을 1 mg / ml의 농도로 처리한 후 20분간 동일조건에서 배양하였다. 각 well에 2 mg / ml 농도의 MTT 용액을 10 ul씩 첨가하고 다시 4시간 동안 37 ℃ incubator (MCO-5AL, Panasonic, Japan)에서 배양하였다. 배지를 제거하고 200 ul의 DMSO로 well에 생성된 formazan 결정을 완전히 용해시켜 microplate reader(SUNRISE, TECAN, Switzerland)를 사용하여 640 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포독성은 시료의 흡광도를 대조군의 흡광도에 대한 백분율로 나타내었다. 양성대조군으로 cetrizine (Sigma-aldrich, USA) 10 ul / ml의 농도를 사용하였다.

도 1에 도시된 바와 같이, 세포생존율은 모든 군에서 90 % 이상의 세포생존을 보임을 알 수 있어, 본 실험의 정당성이 확보되었다

실험예 2

β-hexosaminidase 방출량 측정

탈과립 현상의 표지 물질인 β-hexosaminidase의 방출량을 측정함으로써 알레르기 유발의 정도를 확인하였다(Schwartz et al, 1979; Skehan, 1998). RBL-2H3 세포는 2 ×10⁶cell / ml의 농도로 개수하여 tyroid buffer (25 mM PIPES, 158 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.4 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂, 5.6 mM glucose, pH 7.2)로 3회 세척하였고 tyroid buffer에 녹인 CPEE(L, H), CPEE(L, S), CPEE(D, H)를 각각 400, 200, 100, 50 ug / ml 농도로 처리하였다. 기준이 되는 대조군으로는 시판되고 있는 항히스타민제 중 대표적으로 사용되는 cetrizine 10 ug / ml을 사용하였다. 0.1 % triton X로 완전히 용해시킨 세포의 방출량으로 하였다. 30분간 37 ℃, 5 % CO₂ 조건에서 배양한 후 탈과립을 유도하기 위하여 1 mg / ml Compound 48/80을 처리하였고 20분간 다시 배양하였다. 4 ℃에서 10분간 안정화시켰으며 원심분리 후 상층액을 회수하였다. β-hexosaminidase의 기질인 p-nitrophenyl-β-acetyl-glucosaminide을 1 mM의 농도로 처리하고 1시간동안 37 ℃에서 반응시킨 후 2배수의 sodium bicarbonate (pH 10)을 첨가하여 반응을 종결하였다. 415 nm 파장의 microplate reader로 흡광도를 다음과 같이 측정하고 그 결과를 도2에 나타내었다. 도 2에 나타난 값들은 ± SD평균이다. 대조군(C4880 처리된 그룹)과 비교하여 ***p < .0001, **p < 0.001, *p < 0.05. CPEE(D, H)와 비교하여 +p < 0.05. CPEE(L, S)와 비교하여 #p < 0.05.

β-hexosaminidase release index = ( O.D at 415nm of sample / O.D at 415nm of positive control ) x 100

도 2에 도시된 바와 같이 무처리군은 37.46 ± 4.16 %, C4880만 처리한 군은 76.49 ± 3.06 %, C4880과 함께 400, 200, 100, 50 ug / ml의 농도별로 처리한 CPEE(L, H)는 각각 53.41 ± 3.82, 58.11 ± 2.61, 62.98 ± 3.18, 68.49 ± 4.03 % 였으며, C4880과 함께 농도별로 처리한 CPEE(L, S)는 각각, 56.52 ± 4.19, 61.25 ± 2.13, 65.14 ± 5.07, 71.53 ± 6.17 % 이었고, C4880과 함께 농도별로 처리한 CPEE(D, H)는 각각 69.150 ± 3.36, 72.82 ± 3.41, 74.34 ± 1.83, 76.18 ± 2.15 %의 과립이 방출되었다. 대조군인 cetrizine 10 ug / ml 과 C4880을 처리한 군에서는 55.93 ± 3.52 % 의 방출율을 보였다. 모든 실험군들에서 농도의존적인 효능을 보였지만 각 실험군들 간의 효능차이는 확연히 확인이 가능하였다. CPEE(L, H)가 통계적으로 유의하게 가장 효능이 좋았으며 상대적으로 CPEE(D, H)는 효능이 떨어졌다.

실험예 3

Histamine 방출량 측정

Histamine의 방출량을 분석화학적인 방법으로 측정하기 위하여 HPLC 질량분석기 장비를 사용하였다. 항원항체 반응을 이용한 Histamine 방출량 측정에 사용한 동일한 샘플과 동일한 농도의 Histamine 표준품을 사용하였다. 실험에 사용된 HPLC와 질량검출기는 Shimadzu사 (Japan)의 LC-20AD, SIL-20AC, CBM-20A, CTO-20AC, LCMS-2020을 사용하였으며, HPLC 용매인 Acetonitrile, MeOH 은 HPLC용인 J.T.Baker 사의 제품을 사용하였고 그 외의 시료 추출을 위한 용매는 특급시약을 사용하였다. histamine 표준품의 순도는 98.00 % Sigma-Aldrich (USA)에서 구입하여 사용하였다. 질량분석기의 분석을 위하여 전체적인 유속은 0.4 ml / min으로 조정하였다. 이동상A는 100mM ammonium formate, pH 3.0의 H₂O이고, 이동상 B는 acetonitrile (ACN)였다. HPLC의 조건은 구배용매조성법 (Gradient mode)를 사용하였고, HPLC-MS는 아래 표 1에 나타난 조건에서 Electrospray ionization (ESI) 로 112.2 m/z SIM (+) 로 분석하였고 그 결과를 도 3a 및 도 3b에 나타내었다.

Analytes	Condition
LC pump	Binary pump
Column	A hilic (Waters) silica column (100 × 2.1 mm, 3.0 um)
Injection volume (ul)	2
Flow rate (ml / min)	0.4
Gradient mode	linear gradient 90 % B from 0.01 min, 30 % B for 1.00 ~ 2.00 min, 90 % B for 2.21 ~ 4.00 min.
Interface	ESI
Nebulizer gas flow	1.5
DL temp (℃)	400
Heat block temp (℃)	250
Dry gas flow (L / min)	15

β-hexosaminidase 방출량을 측정하면서 얻어진 세포배양 상층액을 아무런 전처리 없이 histamine 표준품 분석 면적값에 대비하여 함량을 분석하였다. 도 3a에 도시된 바와 같이 농도별 히스타민 표준품의 분석을 통한 표준곡선의 R² 값은 1 로 완전한 직선을 형성하였다. 도 3b에 도시된 바와 같이, 이 값에 대입하여 얻은 각각의 히스타민 함량에서 무처리군은 0.41 ± 0.15 ug / ml, C4880만 처리한 군은 0.71 ± 0.21 ug / ml, C4880과 함께 400, 200, 100, 50 ug / ml의 농도별로 처리한 CPEE(L, H)는 각각 0.56 ± 0.16, 0.58 ± 2.61, 0.63 ± 0.11, 0.66 ± 0.12 ug / ml 였으며, C4880과 함께 농도별로 처리한 CPEE(L, S)는 각각 , 0.57 ± 0.09, 0.59 ± 0.13, 0.64 ± 0.08, 0.66 ± 0.09 ug/ml 이었고, C4880과 함께 농도별로 처리한 CPEE(D, H)는 각각 0.67 ± 0.18, 0.69 ± 0.12, 0.70 ± 0.21, 0.71 ± 0.18 ug / ml의 과립이 방출되었다. 대조군인 cetrizine 10 ug / ml 과 C4880을 처리한 군에서는 0.60 ± 0.09 % 의 방출율을 보였다. β-hexosaminidase의 방출량과 모두 비례하였다. CPEE(L, H)는 400, 100, 50 ug / ml 농도구간에서는 CPEE(L, S)와 CPEE(D, H) 보다 유의적으로 높은 활성을 보였다. 하지만 CPEE(L, S)와의 차이가 크지는 않았다.

실험예 4

알레르기성 cytokine 측정

β-hexosaminidase 측정과 동일한 방법으로 처리한 세포에 Trizol (TRI reagent) 1 ml 첨가하여 세포를 용해시킨 후 200 ul의 chloroform을 첨가하였다. voltex 후 15000 rpm으로 15분간 원심분리 한 후 상층액과 동량의 isopropanol을 넣고 15000 rpm으로 11분간 원심분리 하였다. 용액은 모두 버리고 얻어진 pellet은 건조하고 20 ul의 DEPC water로 pellet을 녹인 다음 DEPC water 995 ul 와 sample 5 ul을 섞어 Nano Drop Spectrophotometer를 이용하여 260 nm에서 흡광도를 측정하여 mRNA를 정량하였다. 분리된 RNA로 Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 42℃에서 50분 역전사효소 reverse transcription (C1000 Touch Thermal cycler, Bio-Rad, CA, USA)하여 cDNA를 얻는다. mRNA는 발현을 정량적으로 표현하기 위해 정량 중합 효소 반응을 측정하였다. 합성된 cDNA 1 ul, Real time PCR aster mix 4 ul (Roche), primer 및 probe를 넣고 PCR 조건으로 반응 시켰다. PCR 조건은 92℃에서 30 초, 60℃에서 45 초, 72℃에서 30 초를 40 cycle로 하였다. 정량 중합 효소 반응에 쓰인 forward와 reverse primer 및 TaqMan probe는 Roche (Basel, Switzerland)에서 합성하였다. 사용한 primer는 아래 표 2와 같다. 모든 실험은 3회 이상 반복하였고 실험값은 평균 ± 표준오차로 표시했으며, 통계분석은 SPSS (Statistical Package for the Social Science, Ver. 12.0) program을 이용하여 ANOVA test를 실시한 후, Duncan's multiple range test로 분석하였다.

Name		Sequence ( 5` to 3`)
IL-4	Forward Reverse	ACCTTGCTGTCACCCTGTTC TTGTGAGCGTGGACTCATTC
IL-13	Forward Reverse	GCTCTCGCTTGCCTTGGTGGT CATCCGAGGCCTTTTGGTTAGAG
TNF-α	Forward Reverse	CGGAATTCGGCTCCCTCTCATCAGTTC GCTCTAGACCCTT GAAGAGAACCTGGG

RBL-2H3 세포에 C4880 (1 mg / ml)을 처리 후 각 배양별 추출물들을 각각 400, 200, 100, 50 ug / ml의 농도로 처리하였을 때 IL-4, IL13, TNF-α 들의 mRNA 발현 억제량을 확인하고 그 결과를 각각 도 4 내지 6에 나타내었다. β-actin을 동시에 발현하여 그에 대한 배수로 표현하였다. IL-4에서 CPEE(L, H)와 CPEE(L, S)는 400 ~ 50 ug / ml 까지 전 구간에서 유의적인 효능이 확인되었고, CPEE(D, H)는 400 ~ 100 ug / ml까지 효능이 확인되었다. CPEE(L, H)는 CPEE(L, S)와는 통계적으로 유의한 차이는 없었지만, CPEE(D, H) 보다 유의적으로 많은 IL-4 mRNA 발현을 억제하였다. IL-13에서는 CPEE(L, H)와 CPEE(L, S)는 전구간에서 모두 농도의존적인 효능이 확인되었고, CPEE(D, H)는 400, 200 ug / ml의 농도구간에서만 효능이 확인되었다. CPEE(L, H)와 CPEE(L, S)는 유의적인 효능에 차이가 없었으며 CPEE(D, H)는 유의적으로 효능이 낮았다. TNF-α의 mRNA 발현량도 IL-4, IL-13의 mRNA 발현량과 비례하는 결과를 보였다. CPEE(L, H)와 CPEE(L, S)는 전구간에서 모두 농도의존적인 효능이 확인되었고, CPEE(D, H)는 400, 200 ug / ml의 농도구간에서만 효능이 확인되었다. CPEE(L, H)와 CPEE(L, S)는 유의적인 효능에 차이가 없었으며 CPEE(D, H)는 유의적으로 효능이 낮았다. IL-4, IL13, TNF-α의 mRNA 발현량은 모두 비례적인 결과를 보였다.

실시예 2

붉은자루동충하초 strain NO. 11952을 0.1 N NaOH 및 0.1 N HCl로 pH를 4.0, 7.0, 9.0으로 조정한 SDAY (Sabourand`s dextrose agar yeast extract)에서 배양하였다. 평판 한천배지를 제작하고 이후에 균 수확을 용이하게 하기위하여 배지가 굳은 후 멸균된 반투막 셀로판으로 코팅하였다. 이후 균주 5 × 10⁶ cfu / ml으로 100 ul 를 접종하여 도말하고 22.5 ℃에서 배양하였다. 배지의 pH만 차이가 있고 모든 실험은 CPEE(L, H)와 동일한 방법으로 배양하였다. 배양된 각각의 실험군을 수확한 후 -80 ℃로 7일간 동결건조기(일신바이오베이스)로 건조하여 분말화 하였다. 건조분말을 10 g 씩 100 ml의 에탄올로 추출하고 감압농축(EYELA)한 후 다시 동결건조 하였다. 각각의 에탄올 추출물 분말은 CPEE(L, H) pH 4.0, CPEE(L, H) pH 7.0, CPEE(L, H) pH 9.0으로 명명하였다.

실험예 5

실시예 2와 같이 각 pH 별로 14일간 광조건에서 배양하고 건조하였을 때, 얻어진 붉은자루동충하초의 수율은 CPEE(L, H) pH 9.0 이 3.469 ± 0.131 g, CPEE(L, H) pH 7.0이 2.947 ± 0.081, CPEE(L, H) pH 4.0 이 2.326 ± 0.106 g 이었으며 그에 대한 에탄올 추출물은 CPEE(L, H) pH 9.0 이 0.358 ± 0.0008 g, CPEE(L, H) pH 7.0이 0.300 ± 0.012, CPEE(L, H) pH 4.0 이 0.182 ± 0.009 g이었다. 붉은자루 동충하초의 수율은 표 3에 나타난 바와 같이 각각 10.32 %, 10.20 %, 7.85 %로 CPEE(L, H) pH 4.0은 수율이 감소됨을 확인하였다. 도 7a 및 도 7b에 나타난 바와 같이 각 추출물은 pH가 높을수록 더 붉은색을 띄고 있었으며 CPEE(L, H) pH 4.0은 붉은색이 거의 없었다. 도 7a 에탄올추출물에서 (a): C. pruinosa (Light, Hyphae, pH 9.0), (b): C. pruinosa (Light, Hyphae, pH 7.0), (c): C. pruinosa (Light, Hyphae, pH 4.0). 도 7b 배양배지에서 (d): CPEE(L, H) pH 9.0, (e): CPEE(L, H) pH 9.0, (f): CPEE(L, H) pH 9.0 이다.

	CPEE(L, H) pH 9.0	CPEE(L, H) pH 7.0	CPEE(L, H) pH 4.0
Dry weight of mycelium ( g / 14 days )	3.469 ± 0.131	2.947 ± 0.081	2.326± 0.106
Dry weight of ethanol extract( g )	0.358 ± 0.008	0.300 ± 0.012	0.182 ± 0.009
Yield ( % )	10.32	10.20	7.85

실험예 6

RBL-2H3 세포주를 37 ℃, 5 % CO₂ incubator에서 10 % FBS (GIBCO, USA), 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin(GIBCO, USA)이 포함된 DMEM(GIBCO, USA)에서 배양하였다. 본 실험에서 알레르기가 유발됨의 정당성을 위하여 MTT assay로 세포독성을 측정하고 그 결과를 도 8에 나타내었다. RBL-2H3 세포에 (2 × 10⁶cells / ml)에 CPEE(L, H) pH 4.0, CPEE(L, H) pH 7.0, CPEE(L, H) pH 9.0를 각각 400, 200, 100, 50 ug / ml 농도로 처리하였고 이하 모든 실험방법은 상술된 붉은자루동충하초의 배양별 항알레르기 활성 중 세포독성능 평가와 동일하였다.

도 8에 나타난 바와 같이, 세포생존율은 모든 군에서 90 % 이상의 세포생존을 보여 본 실험의 정당성이 확보되었다

실험예 7

β-hexosaminidase 방출량 측정

탈과립 현상의 정도를 확인하기 위하여 표지 물질인 β-hexosaminidase의 방출량을 측정하고 그 결과를 도 9에 나타내었다. RBL-2H3 세포는 2 × 10⁶cell / ml의 농도로 개수하여 tyroid buffer (25 mM PIPES, 158 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 5.6 mM glucose, pH7.2)로 3회 세척하였고 tyroid buffer 에 녹인 CPEE(L, H) pH 4.0, CPEE(L, H) pH 7.0, CPEE(L, H) pH 9.0를 각각 400, 200, 100, 50 ug / ml 농도로 처리하였다. 기준이 되는 대조군은 0.1 % triton X로 완전히 용해시킨 세포의 방출량으로 하였다. 이하 모든 실험방법은 붉은자루동충하초의 배양별 항알레르기 활성 중 β-hexosaminidase 방출량 측정과 동일하였다.

도 9에 나타난 바와 같이, 무처리군은 04.05 ± 2.18 %, C4880만 처리한 군은 82.69 ± 2.57 %, C4880과 함께 400, 200, 100, 50 ug / ml의 농도별로 처리한 CPEE(L, H) pH 9.0은 각각 54.51 ± 1.82, 56.08 ± 4.11, 61.82 ± 2.52, 68.14 ± 1.97 % 였으며, C4880과 함께 농도별로 처리한 CPEE(L, H) pH 7.0은 각각 61.84 ± 1.71, 68.17 ± 3.89, 70.49 ± 2.10, 70.01 ± 1.31 % 이었고, C4880과 함께 농도별로 처리한 CPEE(L, H) pH 4.0은 각각 67.98 ± 1.82, 71.56 ± 2.28, 78.62 ± 0.99, 79.82 ± 0.87 %의 과립이 방출되었다. 대조군인 cetrizine 10 ug / ml 과 C4880을 처리한 군에서는 52.92 ± 1.57 % 의 방출율을 보였다. 모든 실험군들에서 농도의존적인 효능을 보였지만 각 실험군들 간의 효능차이는 확연히 확인이 가능하였다. CPEE(L, H) pH 9.0이 통계적으로 유의하게 가장 효능이 좋았으며 상대적으로 CPEE(D, H)는 효능이 떨어졌다.

실험예 8

Histamine 방출량 측정

β-hexosaminidase 방출량 측정실험으로 얻어진 각 실험군의 상층액을 각각 1 ml씩 사용하여 HPLC-MS로 배지 중 방출된 histamine을 정량분석하고 그 결과를 도 10에 나타내었다. Electrospray ionization (ESI) 로 112.2 m / z SIM (+) 로 분석하였으며 분석조건은 상기 표 1과 같았다.

β-hexosaminidase 방출량을 측정하면서 얻어진 세포배양 상층액을 아무런 전처리 없이 histamine 표준품 분석 면적값에 대비하여 함량을 분석하였다. 농도별 히스타민 표준품의 분석을 통한 표준곡선의 R² 값은 1 로 완전한 직선을 형성하였다. 도 10에 나타난 바와 같이, 이 값에 대입하여 얻은 각각의 히스타민 함량에서 무처리군은 0.39 ± 0.021 ug / ml, C4880만 처리한 군은 0.71 ± 0.018 ug / ml, C4880과 함께 400, 200, 100, 50 ug / ml의 농도별로 처리한 CPEE(L, H) pH 9.0은 각각 0.48 ± 0.015, 0.53 ± 0.020, 0.61 ± 0.006, 0.65 ± 0.007 ug / ml 이었으며, C4880과 함께 농도별로 처리한 CPEE(L, H) pH 7.0은 각각 , 0.57 ± 0.011, 0.61 ± 0.021, 0.65 ± 0.015, 0.68 ± 0.005 ug / ml 이었고, C4880과 함께 농도별로 처리한 CPEE(L, H) pH 4.0은 각각 0.67 ± 0.011, 0.69 ± 0.0.010, 0.70 ± 0.019, 0.70 ± 0.0.15 ug / ml의 과립이 방출되었다. 대조군인 cetrizine 10 ug / ml 과 C4880을 처리한 군에서는 0.58 ± 0.030 % 의 방출율을 보였다. β-hexosaminidase의 방출량과 모두 비례하였다. CPEE(L, H) pH 9.0과 CPEE(L, H) pH 7.0 은 모든 농도구간에서 농도의존적인 효능을 보였으며 CPEE(L, H) pH 4.0은 400, 200 ug / ml에서만 농도의존적인 효능을 보였다. CPEE(L, H) pH 9.0은 400, 200, 100, 50 ug / ml 모든 농도구간에서 CPEE(L, H) pH 7.0과 CPEE(L, H) pH 4.0 보다 유의적으로 높은 활성을 보였고 CPEE(L, H) pH 7.0은 모든 농도구간에서 CPEE(L, H) pH 4.0보다 유의적으로 높은 활성을 보였다.

상술된 모든 실험은 3회 이상 반복하였고 실험값은 평균 ± 표준오차로 표시했으며, 통계분석은 SPSS (Statistical Package for the Social Science, Ver. 12.0) program을 이용하여 ANOVA test를 실시한 후, Duncan's multiple range test로 분석하였다.

이상의 실험결과들은 본 발명의 붉은자루동충하초 추출물이 알레르기 예방 및 증상 개선을 위한 새로운 기능성 식품 소재 또는 화장료 소재로 사용될 수 있음을 확인하였고, 또한 붉은자루동충하초 추출물은 빛이 있는 조건에서 균사까지 배양하여 얻어진 붉은자루동충하초 및/또는 배지의 pH가 7 내지 9인 조건에서 배양하여 얻어진 붉은자루동충하초로부터 추출될 때 그 효과가 더욱 좋아짐을 확인하였다.

본 발명은 이상에서 살펴본 바와 같이 바람직한 실시 예를 들어 도시하고 설명하였으나, 상기한 실시 예에 한정되지 아니하며 본 발명의 정신을 벗어나지 않는 범위 내에서 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변경과 수정이 가능할 것이다.

Claims

붉은자루동충하초 추출물을 유효성분으로 포함하는데, 상기 붉은자루동충하초 추출물은 비만세포의 알레르기 유발물질 분비를 억제하는 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 알레르기 예방, 개선 또는 치료용 약학조성물.
삭제
제 1 항에 있어서,
상기 붉은자루동충하초 추출물은 붉은자루동충하초의 균사 또는 자실체를 물, C1 내지 C2 저급 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 사용하여 추출한 것을 특징으로 하는 알레르기 예방, 개선 또는 치료용 약학조성물.
붉은자루동충하초 추출물을 유효성분으로 포함하는데, 상기 붉은자루동충하초 추출물은 붉은자루동충하초의 균사 또는 자실체를 물, 에탄올 또는 이들의 혼합물을 용매로 사용하여 추출한 것으로 비만세포의 알레르기 유발물질 분비를 억제하는 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 항알레르기 효과를 갖는 건강기능식품.
삭제
삭제
붉은자루동충하초 추출물을 유효성분으로 포함하는데, 상기 붉은자루동충하초 추출물은 비만세포의 알레르기 유발물질 분비를 억제하는 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 항알레르기 효과를 갖는 화장료조성물.