KR101852260B1 - 퓨린리보뉴클레오사이드 또는 그 유도체의 베타 락타메이즈 저해제로서의 용도 - Google Patents

Abstract

본원은 퓨린리보뉴클레오사이드모노포스페이트 또는 그 유도체 또는 그 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 C형 베타-락타메이즈 저해용 조성물을 개시한다. 본원에 따른 조성물은 베타-락탐 계열의 항생제와 함께 사용되어, 특히 C형 락타메이즈를 생산하는 박테리아의 항생제 내성 문제를 해결할 수 있어, 상기 박테리아로 인한 감염증 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

퓨린리보뉴클레오사이드 또는 그 유도체의 베타 락타메이즈 저해제로서의 용도 {Use of purine ribonucleoside and its derivative as beta-lactamase inhibitor}

본 발명은 베타-락타메이즈의 저해제로서 작용하는 뉴클레오사이드, 특히 아데노신모노포스페이트 및 그 유도체의 신규한 용도에 관한 것이다.

세균감염 치료에 일반적으로 사용되는 것이 항생제이다. 아미노글리코사이드, 글리코펩타이드, 마크로라이드, 퀴놀린 등 다양한 형태의 항생제들이 개발되어 있으나 이 중 그람 음성균 감염에 대한 일차 처방약으로서 여러 항생제 중에서도 효과는 뛰어나면서 독성이 적은 페니실린, 세팔로스포린, 카바페넴과 같은 베타-락탐 계열의 항생제가 널리 사용되고 있다. 2000년부터 2013년까지 FDA 승인을 얻은 항생제 신약 22종 중 베타-락탐 구조의 항생제는 6종으로, 9종이 승인을 얻은 퀴놀린계 항생제에 이어 두 번째로 많은 종류를 차지하고 있다.

하지만 세균은 이러한 베타-락탐 계열의 항생제를 무력화시키는 효소인 베타-락타메이즈를 만들어 항생제에 대한 내성을 가지게 된다. 즉 기존의 항생제로 치료가 어려운 다제 내성균 즉 수퍼박테리아의 출현과 함께, 세균감염에 대한 치료가 많은 제약을 받고 있다.

β-락타메이즈는 항생 활성을 지니는 β-락탐 항생제의 모핵인 4원환-헤테로고리인 β-락탐 고리를 오픈시킴으로써 β-락탐 항생제를 불활성화시킨다. β-락타메이즈-매개 불활성화를 피하기 위하여, 베타-락탐 항생제가 베타-락타메이즈 저해제와 조합 제제(베타-락탐/베타-락타메이즈 저해제 복합 제제)로 개발되어 동시에 투약하는 방법이 사용되고 있으며, 이 경우 베타-락타메이즈에 의한 항생제의 분해가 억제되어 치료 효과가 높아진다.

따라서 베타-락타메이즈의 활성을 억제하는 저해제 개발은 항생제 내성 문제 해결에 매우 중요한 역할을 할 것으로 기대된다.

하지만 모든 종류의 β-락탐 항생제를 가수분해할 수 있는 새로운 β-락타메이즈를 발현하는 병원균의 출연으로 인해 이에 대한 문제 해결이 시급한 실정이다. 베타-락타메이즈는 서열 유사도에 따라 A, B, C, D형으로 구분되며, 이 중에서 임상에서 항생제 내성에 가장 큰 문제를 야기하는 것은 A형과 C형이다. A, C 및 D군에 속하는 효소는 활성부위에 세린이 있으며, 그 빈도가 낮은 B군은 활성이 아연 의존적이다. 1970년대 10종류 미만이던 세린 기재 락타메이즈는 현재 300종류 이상 존재하는 것으로 보고되었다 (Jacoby & Bush, "Amino Acid Sequences for TME, SHV and OXA Extended-Spectrum and inhinitor Resistant beta lactamase on the Lahey Clinic website"). 이에 맞추어 세린 기재 베타-락타메이즈 변이체의 공격을 회피하는 새로운 종류의 항생제로 세팔로스포린과 카바페넴이 개발되었지만, 이를 무력화하는 새로운 종류의 세린 기재 락타메이즈가 추가로 발견됨으로써 락탐계열 항생제의 효용성이 낮아져 의학적으로 심각한 문제를 일으키고 있다.

현재 임상에서 사용되고 있는 베타-락타메이즈 저해제들은 주로 A형 베타-락타메이즈에만 효과를 나타낸다. 예를 들면 아목시실린 또는 티카르실린과 함께 사용되는 클러벌란산(clavulaninc acid), 암피실린 또는 설퍼라존과 함께 상용되는 설박탐(Sulbactam), 그리고 페니실린과 함께 사용되는 타조박탐(Tazobactam), 아비박탐(Avibactam) 등을 들 수 있으나, 이들은 베타-락타메이즈의 기질과 유사한 락탐 구조를 포함하고 있어 다제 내성 병원균의 베타-락타메이즈에 의해 분해되어 효과가 사라지는 문제점이 있다.

한편 C형 베타-락타메이즈에 대한 저해제 개발 연구도 진행되고 있다. C형 β-락타메이즈는 그램-음성 병원균 사이에 널리 분포되어 있는데 이들로 인해 광범위한 β-락탐 항생제에 대해 박테리아 내성이 생긴다. 이들은 세파마이신(세폭시팀 및 세포테탄)과 같은 옥시이미노-β-락탐을 포함한 모든 세대의 세파로스포린 및 벤질페니실린을 가수분해할 수 있다. 나아가 이미페넴-가수분해활성을 지닌 광범위 C형 효소도 알려졌다. 그러나 임상에서 효과를 보이는 저해제는 개발되어 있지 않다 (Three decades of beta-lactamase inhibitors. Drawz SM1, Bonomo RA., Clin Microbiol Rev., 2010 23(1):160-201). 따라서 새로운 락타메이즈 저해제의 출현과 함께, 새로운 세대의 락타메이즈 저해제, 비락탐구조를 포함하는 저해제의 개발이 요구된다.

본원은 전술한 종래의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로 비락탐구조 기반의 베타-락타메이즈 저해제를 제공하고자 한다.

한 양태에서 본원은 하기에 기재된 화합물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 화합물 또는 그 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 C형 베타-락타메이즈 저해용 조성물을 제공한다.

i) 하기 화학식 1의 화합물;

[화학식 1]

(상기에서, R은 수소, 아세틸, 바이오티닐, 리포일, 몰리브도프테린, L-2-아미노아데페이트(aminoadipate), 팔미트산 안하이드레이트(palmitic acid anhydrate), 팔미트산 안하이드라이드(1-13C-palmitate), 팔미트산 안하이드라이드(2,2-d2-palmitate), 헵타노일(heptanoyl), 카복시벤질옥시-알라닌(Carboxy benzyloxy-alanine), 카복시벤질옥시-알라닌-알라닌(Carboxylbenzyloxy-alanine-alanine), 또는 임의의 아미노산이며, 상기 아미노산은 알라닌, 알지닌, 아스파라진, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글라이신, 히스티딘, 아이소루이신, 루이신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 쓰레오닌, 트립토판, 타이로신, 또는 발린);

ii) 구아노신 모노포스페이트;

iii) 이노신 모노포스페이트;

iv) 아데노신 2’,5’-다이포스페이트(2’,5’-ADP);

v) 데옥시아데노신 모노포스페이트(dAMP);

vi) 아데노신 3’,5’-다이포스페이트(3’,5’-ADP);

vii) 아데노신 3’-모노포스페이트(3’-AMP);

viii) 아데노신 다이포스페이트(ADP); 및

ix) 아데노신 트리포스페이트(ATP).

다른 양태에서 본원은 또한 상기 화합물을 포함하는 C형 베타-락타메이즈를 생산하는 박테리아에 대한 항생제 조성물을 제공한다.

본원에 따른 조성물은 베타-락탐계열 항생제, 예를 들면 페니실린계, 세팔로스포린계, 모노박탐계 및 카바페넴계 항생제를 추가로 포함할 수 있다. 본원에 따른 일 구현예에서는 세팔로스포린계 항생제와 함께 사용되며, 이의 최소생육저지농도를 획기적으로 낮출 수 있다.

본원에 따른 퓨린리보뉴클레오사이드모노포스페이트 또는 그 유도체는 비락탐 구조에 기반을 둔 베타-락타메이즈 저해제로서 단독으로 또는 베타-락탐 계열의 항생제와 함께 사용되어, 특히 C형 베타-락타메이즈를 생산하는 박테리아 예를 들면 대장균, 엔테로박터, 아시네토박터 등을 포함한 광범위한 장내 병원균 또는 그람음성균으로 인한 항생제 내성 문제를 해결할 수 있어, 상기 박테리아의 감염으로 인한 질환의 치료에 유효하게 사용될 수 있다. 아울러 기존에 락탐 구조를 포함하는 저해제와 비교하여, 락타메이즈에 의한 분해를 방지하여 항생제의 효과를 더욱 높일 수 있다.

또한, 본원은 단백질 결정 구조 분석 결과를 통해, 본원에 따른 퓨린리보뉴클레오사이드모노포스페이트화합물의 일부분인 아데노신모노포스페이트 부분(moiety)이 C형 베타-락타메이즈의 활성부위와 결합하는 것을 밝힘으로써 아데노신모노포스페이트가 C형 베타-락타메이즈 저해제의 모핵으로 작용할 수 있다는 것을 밝혔다. 따라서 상기 모핵을 바탕으로 다양한 C형 베타-락타메이즈 저해제 개발이 또한 가능하다.

도 1은 AmpC형 베타-락타메이즈인 CMY-10의 정상상태 효소반응 동력학 지표를 확인한 결과로 기질로서 나이트로세핀이 사용되었다.
도 2는 다양한 농도의 아데노신 5' -1인산의 CMY-10 저해 활성을 나타내는 Michaelis-Menten 그래프로, 기질로 나이트로세핀이 사용되었다.
도 3은 다양한 농도의 아데노신 5' -1인산의 CMY-10 저해 활성을 나타내는 Lineweaver-Burk 그래프로, 기질로 나이트로세핀이 사용되었다.
도 4는 다양한 농도의 구아노신 5' -1인산의 CMY-10 저해 활성을 나타내는 Michaelis-Menten 그래프로, 기질로 나이트로세핀이 사용되었다.
도 5는 다양한 농도의 구아노신 5' -1인산의 CMY-10 저해 활성을 나타내는 Lineweaver-Burk 그래프로, 기질로 나이트로세핀이 사용되었다.
도 6은 다양한 농도의 이노신 5' -1인산의 CMY-10 저해 활성을 나타내는 Michaelis-Menten 그래프로, 기질로 나이트로세핀이 사용되었다.
도 7은 다양한 농도의 이노신 5' -1인산의 CMY-10 저해 활성을 나타내는 Lineweaver-Burk그래프로, 기질로 나이트로세핀이 사용되었다.
도 8은 본원에 따른 AmpC-BER (extended spectrum class C 형 베타락타메이즈)의 리본 다이아그램을 나타낸 것이다. a: 큰 도메인(1-78 및 166-360 잔기) 및 작은 도메인(79-165 잔기)를 각각 황색 및 시안색으로 나타내었다. 친핵성 세린 잔기(녹색, Ser61) 및 이와 공유결합된 AMP(마젠타)가 스틱형태로 나타나 있다. 모든 도면에서, 질소, 산소 및 인 원자는 각각 청색, 적색, 및 오렌지색으로 나타나 있다. 적색 점선은 무질서(disordered) 상태의 H10 헬릭스를 나타낸다. b: 초기 최대우도로 가중된(maximum-likelihood weighted) Fo -Fc 전자-밀도 맵에서 분자 교체 후 3 σ에서 윤곽을 나타내었고, c: 최종 최대우도로 가중된 2Fo - Fc 전자-밀도 맵에서 최종모델에서 AMP에 대해 1 σ에서 윤곽을 나타내었고, 이들은 각각 적색 및 청색으로 나타나 있다.
도 9는 본원에 따른 AMP-결합 모드를 클로즈업하여 나타낸 것이다. a: AmpC-BER 및 AMP 사이의 상호작용에서의 정전기 상보성을 나타낸 것이다. Amp-BER은 정전기 포텐셜을 나타내는 투명 표면으로 나타내었다. 양성, 중성 및 음성 정전기 포텐셜은 각각 청색, 흰색 및 적색으로 나타내었다. Ser61(녹색), Gln117(녹색), Tyr218(녹색), 및 공유결합된 AMP(마젠타)는 스틱 형태로 나타내었다. b: AmpC-BER 및 AMP 사이의 상호작용을 입체적(stereo)으로 본 것이다. 본 도면에서, 아데닐화된 Ser65(AmpC-BER의 Ser61과 동일 위치)가 결합된 CMY-10 최종 모델을 아데닐화된 Ser61이 결합된 AmpC-BER의 것 위에 겹쳐놓았다. AmpC-BER의 활성부위 잔기(녹색 스틱) 및 AMP(마젠타 스틱)를 나타내었지만, 분명하게 하기 위하여 CMY-10의 AMP(노란색 스틱)만을 나타내었다. 황 분자(오렌지색) 및 물 분자(적색)는 각각 스틱 및 구 형태로 나타나 있다. 검은 점선은 원자간 상호작용을 나타낸다.
도 10은 본원에 따른 친핵성 세린 잔기의 아데닐화 메카니즘을 나타낸 것이다. Enz-Ser-OH는 친핵성 세린 잔기를 나타낸다 (AmpC-BER의 Ser61 및 CMY-10의 Ser65). “X”는 acAMP 에서의 아세틸 그룹을 나타낸다.
도 11은 본원의 일 실시예에 따른 AMP-함유 화합물의 저해 효과를 나타낸 것이다. a: AMP-함유 화합물의 존재하에서 CMY-10의 니트로세핀(nitrocefin) 가수분해 활성을 퍼센트 변화로 나타낸 것이다. 에러바는 3번 반복 실험에 대해 ± 표준 편차한 것이다. b: 본 명세서에 사용한 AMP-함유 화합물의 화학 구조를 나타낸 것이다.

본원은 화학식 1의 화합물 중 하나인 아데노신 모노포스페이트(AMP)와 C형 베타-락타메이즈의 결합구조를 분석한 결과 아데노신 모핵은 C형 베타 락타메이즈의 활성 부위에 존재하는 아미노산 잔기들과 수소결합 또는 소수성 상호작용을 통해 강하게 결합함을 확인하였다.

이에 본원은 항생제에 대한 내성 유발하는 C형 베타-락타메이즈의 저해제로서 작용할 수 있는 화학식 1 내지 9의 화합물에 관한 것이다.

현재까지 임상적으로 사용되고 있는 베타-락타메이즈 저해제인 클러벌란산, 설박탐, 및 타조박탐 등은 모두 베타-락탐 구조를 기본 골격으로 갖고 있으며, 이들은 후술하는 바와 같이 A형 베타-락타메이즈에는 저해 효과를 보이지만 C형 베타-락타메이즈에는 저해 효과를 보이지 않는다. 그리고 베타-락탐 골격의 저해제는 베타-락타메이즈의 기질과 구조가 유사하여 다제 내성 병원균의 베타-락타메이즈에 의해 분해되어 저해 효과가 사라지는 문제점이 있으며, 따라서 항생제 내성 문제의 주요 원인이 되고 있다. 따라서 비 베타-락탐 계열의 구조 골격을 가진 저해제의 개발이 필수적이다.

C형 베타-락타메이즈는 통상 β-락탐 고리의 카르보닐 탄소를 공격하여 아실-효소 부가물을 형성하는 친핵성 세린 잔기를 가지고 있다. 이러한 전이적 공유 중간물질은 연이어 물 분자의 공격을 받아 불활성화된 β-락탐 항생제를 방출하게 된다. AmpC-BER은 에세리키아 콜라이 임상 분리주에서 얻었으며, 협범위(narrow-spectrum) AmpC-EC2와 비교하여 H10 헬릭스에 삽입된 두 H10의 잔기를 가진 광범위 C형 베타-락타메이즈인데, AmpC-BER은 세프타지딤에 내성을 가지며 다른 옥시이미노-세파로스포린(세포탁심 및 세페핌)에 대한 감수성은 감소되어 있다.

이러한 AmpC-BER의 결정 구조를 보면 활성 부위의 친핵성 세린이 아데닐화되므로 AMP(아데노신 모노포스페이트)는 비-공유결합성 경쟁적 저해제가 되며, 아세틸-AMP(acAMP)는 이미페넴 가수분해 활성을 가지는 광범위 C형 베타-락타메이즈인 CMY-10의 친핵성 세린에 AMP 부분(moiety)이 공유결합성 결합을 함으로써 CMY-10을 저해하였다.

이와 같이 본 발명은 C형 베타-락타메이즈의 활성부위 및 비 베타-락탐 계열인 퓨린리보뉴클레오사이드모노포스페이트 화합물 또는 그 유도체 화합물의 결합을 단백질 결정 구조로 분석하여, 퓨린리보뉴클레오사이드모노포스페이트 화합물 또는 그 유도체의 AMP 부분이 C형 베타-락타메이즈의 활성부위와 결합하므로 AMP 부분이 C형 베타-락타메이즈 저해제의 모핵이 될 수 있고, 퓨린리보뉴클레오사이드모노포스페이트 화합물 또는 그 유도체 화합물이 효소 활성 저해효과를 보이는 것을 확인하여 C형 베타-락타메이즈 저해제로 이용될 수 있다는 것을 밝혔다.

따라서 한 양태에서 본원은 하기에 기재된 화합물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 화합물 또는 그 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 C형 베타-락타메이즈 저해용 조성물에 관한 것이다:

i) 하기 화학식 1의 화합물;

[화학식 1]

(상기 화학식 1에서 R은 수소, 아세틸, 바이오티닐, 리포일, 몰리브도프테린, L-2-아미노아데페이트(aminoadipate), 팔미트산 안하이드레이트(palmitic acid anhydrate), 팔미트산 안하이드라이드(1-13C-palmitate), 팔미트산 안하이드라이드(2,2-d2-palmitate), 헵타노일(heptanoyl), 카복시벤질옥시-알라닌(Carboxy benzyloxy-alanine), 카복시벤질옥시-알라닌-알라닌(Carboxylbenzyloxy-alanine-alanine) 또는 임의의 아미노산이며, 상기 아미노산은 알라닌, 알지닌, 아스파라진, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글라이신, 히스티딘, 아이소루이신, 루이신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 쓰레오닌, 트립토판, 타이로신, 또는 발린)

ii) 구아노신 모노포스페이트(GMP, 하기 화학식 2의 화합물);

iii) 이노신 모노포스페이트(IMP, 하기 화학식 3의 화합물);

iv) 아데노신 2’,5’-다이포스페이트(2’,5’-ADP, 하기 화학식 4의 화합물);

v) 데옥시아데노신 모노포스페이트(dAMP, 하기 화학식 5의 화합물);

vi) 아데노신 3’,5’-다이포스페이트(3’,5’-ADP, 하기 화학식 6의 화합물);

vii) 아데노신 3’-모노포스페이트(3’-AMP, 하기 화학식 7의 화합물);

viii) 아데노신 다이포스페이트(ADP, 하기 화학식 8의 화합물); 및

ix) 아데노신 트리포스페이트(ATP, 하기 화학식 9의 화합물).

본원에 따른 화학식 1의 화합물은 또한 AMP-R로 표시될 수 있다. 상기 화학식 1에서 상기 R은 수소(AMP, 하기 화학식 1-1), 아세틸(acAMP, 하기 화학식 1-2), 바이오티닐(하기 화학식 10), 리포일(하기 화학식 11), 몰리브도프테린(하기 화학식 12), L-2-아미노아데페이트(aminoadipate)(하기 화학식 13), 팔미트산 안하이드레이트(palmitic acid anhydrate)(하기 화학식 14), 팔미트산 안하이드라이드(1-13C-palmitate)(하기 화학식 15), 팔미트산 안하이드라이드(2,2-d 2-palmitate)(하기 화학식 16), 헵타노일(heptanoyl)(하기 화학식 17), 카복시벤질옥시-알라닌(Carboxybenzyloxy-alanine)(하기 화학식 18), 카복시벤질옥시-알라닌-알라닌(Carboxylbenzyloxy-alanine-alanine)(하기 화학식 19), 또는 임의의 아미노산 (알라닌, 알지닌, 아스파라진, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글라이신, 히스티딘, 아이소루이신, 루이신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 쓰레오닌, 트립토판, 타이로신, 발린 중 하나)이다.

따라서 다른 측면에서 본원은 하기 화학식 1-1, 1-2, 2 내지 19로 표시되는 하나 이상의 화합물을 포함하는 C형 베타-락타메이즈 저해용 조성물 또는 이를 포함하는 C형 베타-락타메이즈를 생산하는 박테리아에 대한 항생제 조성물을 제공한다.

[화학식 1-1]

[화학식 1-2]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]

[화학식 8]

[화학식 9]

[화학식 10]

[화학식 11]

[화학식 12]

[화학식 13]

[화학식 14]

[화학식 15]

[화학식 16]

[화학식 17]

[화학식 18]

[화학식 19]

본원에서 유도체란 화학식 1 내지 19와 같은 화합물의 염, 에스테르, 에놀 에테르, 에놀 에스테르, 아세탈, 케탈, 올쏘에스테르, 헤미아세탈, 헤미케탈, 산, 염기, 용매화물, 또는 수화물을 포함한다. 이러한 유도체는 기술분야의 공지된 방법을 이용하게 용이하게 제조될 수 있다.

본원에서 약학적으로 허용가능한 염은 본원의 활성 화합물의 치환체의 종류에 따라 비독성의 산 또는 염기와 함께 제조된 화합물을 일컫는다. 본원의 화합물이 산성의 작용기를 포함하는 경우, 이러한 화합물을 충분한 양의 원하는 염기와 적절한 불활성 용매 중에서 반응하여 염기성 부가염을 얻을 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염기 부가염의 예로는 소디움, 포타슘, 칼슘, 암모늄, 유기 아미노, 또는 마그네슘염 등을 포함한다. 본원의 화합물이 염기성인 작용기를 포함하는 경우, 이러한 화합물을 충분한 양의 원하는 산과 적절한 불활성 용매 중에서 반응하여 산부가염을 얻을 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염기 부가염의 예로는 무기산 유래의 산 예컨대 염산, 하이드로브롬산, 니트르 산, 카르본산, 모노하이드로젠카르본산, 포스포르산, 모노하이드로젠포스포르산, 디하이드로젠포스포르산, 황산, 모노하이드로황산, 또는 인산 등과 같은 것 및 무독성 유기산 유래의 염, 예컨대 아 V산, 프로피온산, 이소부티르산, 말레산, 말론산, 벤조산, 숙신산, 푸마르산, 락트산, 만델산, 프탈산, 벤젠설폰산, p-톨릴 설폰산, 시트르산, 타르타르산, 메탄설폰산 등을 포함한다. 본원의 특정 화합물이 산성 및 염기성 작용기를 모두 포함하는 경우 염기부가염 또는 산부가염으로 전환될 수 있다.

베타-락타메이즈는 베타-락탐 계열 항생제를 가수분해하여 락탐계 항생제에 대한 세균의 내성을 가져오는 주요 원인이다. 따라서 본원의 베타-락타메이즈 저해제는 베타-락탐계열 항생제와 함께 투여되는 경우 이러한 내성을 가져오는 세균의 활성을 피할 수 있게 하여 항생제가 제대로 작용할 수 있도록 하는 역할을 한다.

본원에서 베타-락타메이즈는 박테리아가 생산하는 락탐 계열 항생제의 락탐링을 가수분해하여 항생제의 활성을 불활성화하는 효소로서, 앰블러(Ambler) 분류 기준에 따라 단백질의 상동성 정도를 근거로 A, B, C 및 D의 4개의 그룹으로 나눌 수 있다. 본원의 한 구현예에서 본원의 조성물 특히 활성부위에 세린이 있는 A, C 및 D군, 특히 C형 락타메이즈 에 효과가 있다.

따라서 본원에 따른 조성물은 C형 락타메이즈를 생산하는 다양한 박테리아에 대하여 항생제로서 작용할 수 있다.

일 구현예에서 본원의 저해제가 효과가 있는 C형 락타메이즈는 이로 제한하는 것은 아니나, 장내 병원성 또는 그람 음성 박테리아 예를 들면 엔테로코커스 파에시움(Enterococcus faecium), 스타필로코커스 아우레스(Staphyloccus aureus), 클렙시엘라 뉴모니에(Klebsiella pneumoniae), 아시네토박터 속(Acinetobacter sp .), 대장균, 또는 엔테로박터속(Enterobacter sp.) 박테리아 유래이다.

따라서 본원의 상기 화학식 1 내지 9의 화합물은 항생제와 함께 또는 별도로 약학조성물로서 제공될 수 있다.

한 양태에서 본원에 따른 조성물은 베타-락탐계열 항생제를 추가로 포함할 수 있다. 베타-락탐계열 항생제는 화학구조상 베타 락탐 고리를 기본구조로 하는 항생제로, 페니실린과 세팔로스포린, 모노박탐 및 카바페넴 계열의 항생제가 여기에 포함된다. 본원의 조성물에 포함될 수 있는 베타-락탐계열 항생제는 이로 제한하는 것은 아니나, 예를 들면 페니실린, 세팔로스포린, 아미노글리코사이드, 설폰아미드, 마크롤리드, 테트라사이클린, 리노코사이드, 퀴놀론, 클로로암페니콜, 반코마이신, 메트로니다졸, 리팜핀, 이소니아지드, 스펙티노마이신, 트리메토프림, 설파메톡 사졸, 페넴, 카바페넴, 및 모노박탐을 포함한다. 본원의 따른 저해제가 효과가 있는 C형 락타메이즈는 특히 일구현예에서 특히 세팔로스포린 계열의 항생제제 기질 확장성을 나타낸다. 따라서 본원에 따른 저해제는 제1 세대, 제2 세대, 제3 세대 및 제4 세대, 특히 제3 세대 및 제4 세대의 세팔로스포린 계열의 항생제와 사용될 수 있으며, 이는 예를 들면 제1 세대 항생제로서 세파드린, 세파트리진, 세팔렉신, 세파드록실, 세팍터, 세프로자딘, 제2 세대 항생제로서 세푸록신, 그리고 제3 세대 항생제로서 세픽심, 세프타지딤 및 세파독심 등을 포함한다. 특히 본원에 따른 일 구현예에서는 세프타지딤 및 acAMP를 조합하여 사용하면 그람 음성 박테리아 임상분리주에 대한 세프타지딤의 최소생육저지농도가 감소되는 것으로 나타났다.

베타-락탐계열 항생제는 내성이 없는 경우, 광범위한 세균 감염 치료에 효과가 있다. 그람-양성, 그람-음성 세균이 모두 포함되며, 예를 들면 스타필로코커스 속 균주 예컨대 스타필로코커스 아루레스, 스타필로코커스 에피더미스; 스트렙토코커스 속 균주 예컨대 스트렙토코커스. 아갈락틴, 스트렙토코커스. 뉴모니에 및 스트렙토코커스 피칼리스; 마이크로코커스 속 균주 예컨대 마이크로코커스 루테우스; 박실러스 속 균주 예컨대 박실러스 서브틸리스; 리스테렐라 속 균주 예컨대 리스테렐라 모노사이토제네스; 에스쉐리키아 속 균 주 예컨대 에스쉐리키아 콜라이; 클렙시엘라 속 균주 예컨대 클렙시엘라 뉴모니에; 프로테우스 속 균주 예컨대 프로테우스 미라빌리스 및 프로테우스 벌개리스; 살모넬라 속 균주 예컨대 살모넬라 타이포사; 쉬겔라 속 균주 예컨대 쉬겔라 소네이; 엔테로박터 속 균주 예컨대 엔테로박터 에어로제네스 및 엔테로박터 클로아세; 서레시아 속 균주 예컨대 서레시아 마르센신; 슈도모나스 속 균주 예컨대 슈도모나스 에루기노사; 아시네토박터 속 균주 예컨대 아시네토박터 아니트라터스; 노카르디아 속 균주 예컨대 노카르디아 어토트로피카; 및 마이코박테리움 속 균주 예컨대 마이코박테리움 폴투이텀에 효과가 있다.

일 구현예에서 본원에 따른 조성물은 C형 베타-락타메이즈를 생산하는 병원균 예를 들면 엔테로코커스 파에시움(Enterococcus faecium), 스타필로코커스 아우레스(Staphyloccus aureus), 클렙시엘라 뉴모니에(Klebsiella pneumoniae), 아시네토박터 속(Acinetobacter sp .), 대장균 또는 엔테로박터 속(Enterobacter sp .) 박테리아의 치료에 사용되어 항생제 내성 문제를 해결할 수 있다.

다른 구현예에서 본원에 따른 조성물은 C형 베타-락타메이즈를 생산하는 병원균, 예를 들면 대장균 또는 장내 감염의 주요한 원인균인 아시네토박터(Acinetobacter)와 같은 장내 병원균의 치료에 사용되어 항생제 내성 문제를 해결할 수 있다. 아시네토박터 속 균주는 예를 들면 아시네토박터 바우만이(Acinetobacter baumannii), 아시네토박터 바이제린키이(Acinetobacter beijerinckii), 아시네토박터 베레지니에(Acinetobacter bereziniae), 아시네토박터 보이시에리(Acinetobacter boissieri), 아시네토박터 보우베티이(Acinetobacter bouvetii), 아시네토박터 브리소이(Acinetobacter brisouii), 아시네토박터 칼코아세티쿠스(Acinetobacter calcoaceticus), 아시네토박터 게르네리(Acinetobacter gerneri), 아시네토박터 구일루이에(Acinetobacter guillouiae), 아시네토박터 길렌베르기이(Acinetobacter gyllenbergii), 아시네토박터 헤몰리티쿠스(Acinetobacter haemolyticus), 아시네토박터 인디쿠스(Acinetobacter indicus), 아시네토박터 준이이(Acinetobacter junii), 아시네토박터 ?피이(Acinetobacter lwoffii), 아시네토박터 넥타리스(Acinetobacter nectaris), 아시네토박터 노소코미알리스(Acinetobacter nosocomialis), 아시네토박터 파르버스(Acinetobacter parvus), 아시네토박터 피티이(Acinetobacter pittii), 아시네토박터 라디오레시스텐스(Acinetobacter radioresistens), 아시네토박터 루디스(Acinetobacter rudis), 아시네토박터 쉰들러리(Acinetobacter schindleri), 아시네토박터 솔이(Acinetobacter soli), 아시네토박터 탄도이(Acinetobacter tandoii), 아시네토박터 트제른베르지에(Acinetobacter tjernbergiae), 아시네토박터 타우네리(Acinetobacter towneri), 아시네토박터 우르신지이(Acinetobacter ursingii), 및 아시네토박터 베네티아누스(Acinetobacter venetianus)를 포함한다.

본원의 화학식 1 내지 9의 화합물은 상기 언급한 세균을 포함하는 세균의 성장 및 생장을 억제할 수 있으며, 이는 세포 분열의 억제는 물론, 궁극적으로 세포 분열이 일어나지 않게 하여 세포를 박멸하는 것까지를 의미하는 것이다.

본원의 베타-락타메이즈 저해제 또는 그 약학적으로 허용가능한 염은 약학 조성물로서 예를 들면 베타-락탐계열 항생제의 활성을 증가시키기 위하여 치료적으로 유효한 양으로 대상체에 투여될 수 있다. 치료적으로 유효한 양은 여러 요인에 따라 변할 수 있는 양으로, 예를 들면, 대상체의 질환의 심각성 정도, 나이, 성별, 체중 등에 따라 달라질 수 있다. 투여량 및 횟수는 최적의 치료효과를 가져오도록 조절될 수 있으며, 예를 들면, 하루에 일회, 또는 수회, 또는 점차 증감하는 양으로 투여될 수 있다. 또한 투여경로 및 제형의 종류에 따른 약동학적 특성에 맞추어 투여횟수를 조절할 수 있다.

투여방법은 당업계의 공지된 방법을 사용할 수 있으며, 예를 들면, 정맥, 피하, 근육, 경피, 경구 투여될 수 있으며, 생체외 치료 방법의 경우, 세포에 투여될 수 있다. 필요한 경우, 투여는 주사와 같이 단번에, 또는 링거를 통한 주입 및 서방형 제제를 사용하는 경우와 같이 서서히 투여될 수 있다.

본원의 락타메이즈 저해제는 원하는 약학적, 약동학적 효과를 나타내는 물질과 컨쥬게이트될 수 있다. 예를 들면, 본원의 베타-락타메이즈 저해제는 블러드 -브레인 장벽의 통과를 위해 트렌스페린 수용체에 대한 항체와 연결될 수 있다. 나아가 폴리에틸렌글리콜과 같은 폴리머와 연결되어 용해도, 안정성, 반감기와 같은 약학적으로 유용한 특성을 변형시킬 수 있다.

본원의 베타-락타메이즈 저해제는 또한 세포질내로의 직접 전달을 위한 제형일 수 있다. 예를 들면 본원의 저해제는 리포좀과 같이 세포질내로의 도입이 가능한 담체와 컨쥬케이트 될 수 있다. 이러한 방법은 공지되어 있다 (예를 들면 Amselem S et al., Chem. Phys. Lipids 64:219-37, 1993). 대안적으로 마이크로인젝션을 통해 세포내로 직접 주입될 수 있다.

본원의 베타-락타메이즈 저해제 또는 그 약학적으로 허용가능한 염은 베타-락탐 항생제와 동시에 또는 별도로 투여될 수 있으며, 하나의 제형이 두 가지의 활성 성분을 포함할 수도 있으며, 각각 별개의 제형으로 제조될 수 있다.

본원의 베타-락타메이즈 저해제 또는 그 약학적으로 허용가능한 염은 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제형화 할 수 있다. 본원에 사용될 수 있는 부형제는 제형의 pH, 점도, 탁도, 색, 멸균성, 안정성, 용해속도, 향 등의 조절 유지를 위한 물질을 포함한다.

본원의 치료제의 투여방법은 특별히 이에 제한되는 것은 아니며, 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여의 경우 피부에 붙이는 패치형, 코/호흡기를 통해 투여할 수 있으며, 신속한 치료효과를 얻기 위해서는 정맥내 주사에 의한 투여가 바람직하다. 투여량은 환자의 감염 상태, 감염균의 종류, 체중, 연령, 성별, 일반적 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 매우 다양하다. 예를 들면 60kg 성인의 경우 50mg 내지 200mg을 근육 또는 정맥 주사로 투여할 수 있으며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 전형적인 약물의 경우 투약단위체는, 예를 들어 약 0.01mg 내지 100mg를 포함하나 상기 범위의 이하 및 이상의 범위를 배제하는 것은 아니다.

본원의 베타-락타메이즈 저해제 또는 그 약학적으로 허용가능한 염의 투여량 대 락탐계열 항생제의 비도 그 변화 범위가 크며, 개인의 상태, 감염세균의 종류와 같이 특정 케이스별로 정해져야 한다. 예를 들면, 항생제 대 저해제 사용비는 약 1:2 내지 약 1:15로 사용될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1. C형 베타- 락타메이즈 단백질 제조

엔테로박터 에로겐스(Enterobacter aerogens) 유래의 AmpC 형 베타-락타메이즈(CMY-10) 유전자(GenBank Accession No: ACO24915.1)를 의뢰하여 합성하였고 (주식회사 바이오니아), 상기 합성된 CMY-10 단편을 pET24a 플라스미드에 클로닝 하여 단백질 발현에 사용하였다. 정제된 CMY-10 단백질은 삼차증류수 또는 10 mM MES pH 6.5 버퍼 조건에서 4℃에서 사용하기까지 보관하였다.

실시예 2. CMY -10 정상상태 효소반응 동력학 지표 결정

본 실험을 위해 나이트로세핀(nitrocefin, NCF)을 기질로 사용하였다. NCF는 발색성을 갖고 있는 세팔로스포린 계열의 기질이며, 베타-락타메이즈 활성 측정에 범용되는 기질이다. 베타-락타메이즈에 의해 나이트로세핀의 베타-락탐링이 가수분해되면 적색 계열의 빛을 나타내게 되고 이를 자외선-가시광선 흡수 분광기를 통해 486nm 파장에서 관찰하게 되면 가수분해된 나이트로세핀의 양이 증가할수록 흡광도가 증가하게 된다.

하기 표 1의 조성으로 반응시킨 1mL 반응 용액을 자외선-가시광선 흡수 분광기에 넣고 486nm 흡광도를 2분 동안 연속적으로 측정하여, 동일 시간 간격 내에 직선 구간 기울기를 효소의 활성으로 보고 이를 효소 농도, 기질 농도 대비 환산하여 기질 농도에 따른 초기 반응 속도 (V0) 그래프를 구하였다. 이 그래프를 통해 정상상태 효소반응 동력학 지표인 Km, kcat을 결정하였다. 반응 조건은 다음과 같다: 효소: CMY-10; 기질: 나이트로세핀; 효소 농도: 200 pM; 반응 완충 용액: 50 mM MES pH 6.5; 반응 온도: 37℃; 사용 기질 농도 범위: 5, 7.5, 10, 15, 20, 40, 60, 80, 120, 150, 200 μM.

[표 1] CMY-10의 나이트로세핀에 대한 정상상태 효소반응 동력학 지표 확인 실험 조건

결과는 도 1에 기재되어 있다. 도 1에 나타난 바와 같이 CMY-10의 Km = 23.3 μM, kcat = 680.3 s^-1 로 결정되었다.

실시예 3. 아데노신 5'- 1인산의 CMY -10 활성 저해상수 결정

AMP에 의한 CMY-10의 저해여부를 다음과 같이 분석하였다.

하기 표 2의 조성으로 반응시킨 1mL 반응 용액을 자외선-가시광선 흡수 분광기에 넣고 486nm 흡광도를 2분 동안 연속적으로 측정하여, 동일 시간 간격 내에 직선 구간 기울기를 효소의 활성으로 보고 이를 효소 농도, 기질 농도, 저해제 농도 대비 환산하여 기질 농도 및 저해제 농도에 따른 CMY-10 단백질의 초기 반응 속도 (V0) 그래프를 구하였다. 이 그래프를 통해 아데노신 5'-1인산에 의한 CMY-10 활성 저해상수 Ki를 결정하였다. 반응 조건은 다음과 같다: 효소: CMY-10; 기질(substrate): 나이트로세핀; 저해제: 아데노신5'-1인산(Adenosine 5'-monophosphate, AMP); 효소 농도: 200 pM; 반응 완충 용액: 50 mM MES pH 6.5; 반응 온도: 37℃; 사용 기질 농도 범위: 10, 30, 50, 70, 90 μM (nitrocefin); 사용 저해제 농도 범위: 0, 20, 40, 200, 400 μM.

[표 2] 아데노신5'-1인산의 CMY-10 효소 활성 저해상수 결정 실험 조건

결과는 도 2 및 3에 기재되어 있다. 아데노신5'-1인산에 의해 저해되는 CMY-10의 활성을 기질 및 저해제 농도별로 측정하여 효소반응 동력학 상수 분석 프로그램(SigmaPlot)으로 분석한 결과 아데노신 5'-1 인산은 CMY-10에 대한 경쟁적 저해제로 작용하며, Ki = 58.3 μM 임을 확인하였다. 정상 효소의 기질에 대한 친화도인 Km = 23.3 μM 과 2배 정도 차이의 Ki 값을 가지는 것으로 나타났다. 이는 효소 활성 부위에 기질의 1/2 정도의 친화도를 AMP가 갖고 있는 것으로, 베타-락타메이즈의 활성 부위에 항생제와 경쟁적으로 높은 친화도로 결합하여 항생제 분해 효과를 저해시킬 수 있음을 나타내는 것이다. kcat = 680.3 s^-1 은 효소 자체의 기질 분해능에 대한 값을 나타낸다.

실시예 4. 아세틸 아데노신 5‘-1 인산에 의한 3세대 세팔로스포 린(cephalosporin) 계열 항생제인 셉타지딤(ceftazidime)에 대한 항생제 내성 대장균의 최소생육저지농도(Minimum Inhibitory Concentration, MIC) 감소 효과

항생제 내성 대장균(E. coli BER)의 3세대 세팔로스포린계열 항생제인 셉타지딤에 대한 MIC(minimum inhibitory concentration) 시험은 96 멀티웰플레이트를 이용하여 셉타지딤(Sigma)을 2배 연속 희석법에 따라 희석한 후, 5 x 10² cfu/ml의 농도로 대장균을 접종하고 37℃에 24시간 이상 배양한 다음 대장균의 생장여부를 탁도 기준으로 육안 판정하는 방법으로 MIC 값을 측정하여, 측정 결과를 하기의 표 3에 나타내었다. 이때 배지는 머크사의 LB 브로스를 사용하여 탁도를 관찰하였으며, 세균의 희석도 동일한 배지를 사용하였다.

하기 표 3의 농도로 셉타지딤을 LB 브로스에 2배 연속 희석법으로 희석시킨 100μL 배지를 멀티웰플레이트에 분주한 후, 5 x 10² cfu/ml 농도의 항생제 내성 대장균 100μL에 10 mM acetyl-AMP를 첨가하고 분주된 배지에 접종하였다. 이때 대조군으로 10 mM acetyl-AMP를 첨가하지 않은 대장균을 동일한 농도로 접종하여 실험하였고, acetyl-AMP의 독성을 확인하기 위해 셉타지딤을 처리하지 않고 10 mM acetyl-AMP만을 첨가한 대장균을 동일 조건에서 배양하여 생장 여부를 육안으로 확인하여 하기 표 4의 값으로 MIC를 정하였다. 셉타지딤에 내성을 갖는 대장균인 E. coli BER 균주는 참고문헌1 상에서는 128μg/ml 농도의 셉타지딤에서도 자랄 수 있고 본 실험 결과에서는 25μg/ml의 셉타지딤에서도 자랄 수 있는 것으로 나타났다. 그러나, acetyl-AMP와 셉타지딤을 동시에 투약한 결과 3.13μg/ml로 MIC 값이 감소하였고 이는, acetyl-AMP와 항생제의 동시 투약이 E. coli BER 균주의 셉타지딤에 대한 민감도를 증가시켜 적은 양의 항생제로도 생장을 억제할 수 있음을 보여주는 결과이다. 따라서 현재 임상적으로 사용되는 항생제 투약 방법인 항생제+저해제 동시 투약과 유사한 효과를 보이는 acetyl-AMP는 베타 락타메이즈 저해제 역할을 할 수 있다.

[표 3] 대장균 MIC 실험 조건 및 생장 관찰 결과

[표 4] 대장균 MIC (μg/ml)

본 실험에 균주로 사용된 E. coli BER는 요로 감염환자에서 분리된 3세대 항생제 내성 균주로 C형 베타-락타메이즈인 AmpC의 자연적인 돌연변이에 의해 내성을 획득한 균주이다. 야생형인 E. coli EC2 균주의 셉타지딤에 대한 MIC 값은 0.06μg/ml인 반면 E. coli BER 균주의 MIC 값은 128μg/ml로 셉타지딤에 2000배 이상의 내성을 갖고 있는 것으로 보고되었다 (Mammeri H. et al, Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 60:490-494, 2007). 본원에 따른 acAMP는 E. coli BER에 대한 최소생육저지농도(Minimum Inhibitory Concentration, MIC)를 감소시키는 효과를 가져왔다.

실시예 5. 구아노신 5'- 1인산의 CMY -10 활성 저해상수 결정

GMP에 의한 CMY-10의 저해여부를 다음과 같이 분석하였다. 하기 표 5의 조성으로 반응시킨 1mL 반응 용액을 자외선-가시광선 흡수 분광기에 넣고 486nm 흡광도를 2분 동안 연속적으로 측정하여, 동일 시간 간격 내에 직선 구간 기울기를 효소의 활성으로 보고 이를 효소 농도, 기질 농도, 저해제 농도 대비 환산하여 기질 농도 및 저해제 농도에 따른 CMY-10 단백질의 초기 반응 속도 (V0) 그래프를 구하였다. 이 그래프를 통해 구아노신 5’-1인산에 의한 CMY-10 활성 저해상수 Ki를 결정하였다. 반응 조건은 다음과 같다: 효소: CMY-10; 기질: 나이트로세핀; 저해제: 구아노신5'-1인산(Guanosine 5’-monophosphate, GMP); 효소 농도: 200 pM; 반응 완충 용액: 50 mM MES pH 6.5; 반응 온도: 37℃; 사용 기질 농도 범위: 10, 30, 50, 70, 90 μM (nitrocefin); 사용 저해제 농도 범위: 0, 5, 10, 50, 100 μM.

[표 5] 구아노신5‘-1인산의 CMY-10 효소 활성 저해상수 결정 실험 조건

결과는 도 4 및 5에 기재되어 있다. 구아노신 5’-1인산에 의해 저해되는 CMY-10의 활성을 기질 및 저해제 농도별로 측정하여 효소반응 동력학 상수 분석 프로그램(SigmaPlot)으로 분석한 결과 구아노신5’-1인산은 CMY-10에 대한 경쟁적 저해제로 작용하며, Ki = 12.6 μM 임을 확인하였다. 정상 효소의 기질에 대한 친화도인 Km = 23.3 μM 과 2배 정도 차이의 Ki 값을 가지는 것으로 나타났다. 이는 효소 활성 부위에 기질보다 2배 정도 강한 친화도를 GMP가 갖고 있는 것으로, 베타-락타메이즈의 활성 부위에 항생제와 경쟁적으로 높은 친화도로 결합하여 항생제 분해 효과를 저해시킬 수 있음을 나타내는 것이다. kcat = 680.3 s^-1 은 효소 자체의 기질 분해능에 대한 값을 나타낸다.

실시예 6. 이노신5 '- 1인산의 CMY -10 활성 저해상수 결정

IMP에 의한 CMY-10의 저해여부를 다음과 같이 분석하였다. 하기 표 6의 조성으로 반응시킨 1mL 반응 용액을 자외선-가시광선 흡수 분광기에 넣고 486nm 흡광도를 2분 동안 연속적으로 측정하여, 동일 시간 간격 내에 직선 구간 기울기를 효소의 활성으로 보고 이를 효소 농도, 기질 농도, 저해제 농도 대비 환산하여 기질 농도 및 저해제 농도에 따른 CMY-10 단백질의 초기 반응 속도 (V0) 그래프를 구하였다. 이 그래프를 통해 이노신5’-1인산에 의한 CMY-10 활성 저해상수 Ki를 결정하였다. 반응 조건은 다음과 같다: 효소: CMY-10; 기질: 나이트로세핀; 저해제: 이노신5'-1인산(Acetyl adenosine 5’-monophosphate, acetyl-AMP); 효소 농도: 200 pM; 반응 완충 용액: 50 mM MES pH 6.5; 반응 온도: 37℃; 사용 기질 농도 범위: 10, 30, 50, 70, 90 μM (nitrocefin); 사용 저해제 농도 범위: 0, 10, 20, 100, 200 μM.

[표 6] 이노신5‘-1인산의 CMY-10 효소 활성 저해상수 결정 실험 조건

결과는 도 6 및 7에 기재되어 있다. 이노신5’-1인산에 의해 저해되는 CMY-10의 활성을 기질 및 저해제 농도별로 측정하여 효소반응 동력학 상수 분석 프로그램(SigmaPlot)으로 분석한 결과 이노신5’-1인산은 CMY-10에 대한 경쟁적 저해제로 작용하며, Ki = 8.2 μM 임을 확인하였다. 정상 효소의 기질에 대한 친화도인 Km = 23.3 μM 과 4배 정도 차이의 Ki 값을 가지는 것으로 나타났다. 이는 효소 활성 부위에 기질보다 4배 강한 정도의 친화도를 IMP가 갖고 있는 것으로, 베타-락타메이즈의 활성 부위에 항생제와 경쟁적으로 높은 친화도로 결합하여 항생제 분해 효과를 저해시킬 수 있음을 나타내는 것이다. kcat= 680.3 s^-1 은 효소 자체의 기질 분해능에 대한 값을 나타낸다.

실시예 7. AmpC - BER 및 CMY -10 와 AMP(아데노신 모노포스페이트 )의 결합모드 를 단백질 구조결정으로 관찰하여 아데노신 뉴클레오타이드가 C형β - 락타메이즈 저해제의 스캐폴드(모핵)임을 확인

실시예 7-1. 클로닝 , 발현, 정제, 결정화 및 데이터 수집

pET-24a에서의 AmpC-BER (ampC gene from E. coli BER, 시그널펩타이드를 포함하는 단백질 서열: 서열번호 1; 및 상응하는 핵산서열: 서열번호 2) 및 CMY-10 (plasmid encoded class C beta-lactamase; 시그널펩타이드를 포함하는 단백질 서열: 서열번호 3; 및 상응하는 핵산서열: 서열번호 4) 컨스트럭트는 각각 N-말단에 추가 7개의 잔기(MHHHHHH) 및 시그널펩타이드에 상응하는 잔기를 제외한 잔기 21-379 및 24-382 잔기를 포함한다. 시그널펩타이드에 상응하는 N-말단 잔기 1-20 및 1-23이 없는 컨스트럭트를 AmpC-BER 및 CMY-10에 대해 각각 E. coli 균주 Rosetta (DE3) 및 BL21 (DE3)에서 발현하였다. NTA(nickel-nitrilotriacetic acid) 컬럼 및 슈퍼덱스 75 HR 16/60 컬럼을 사용하여 친화 및 사이즈 배제 크로마토그래피를 각각 수행하여 재조합 단백질을 분리하였다. 그 후 정제된 20 mM Tris-HCl pH 7.0의 AmpC-BER 및 TDW의 CMY-10을 각각 ~30 mg·mL^-1 및 ~40mg·mL^-1로 농축시켜 결정화하였다. 결정 스크리닝은 22℃에서 마이크로배치 결정화 방법을 사용하여 수행하였다. 2.0 M 암모늄 설페이트 및 0.1 M Tris-HCl pH 8.5을 함유하는 침전제 용액 내에서 AmpC-BER 결정을 만들었다. 데이터를 수집하기 위하여, 2.0 M 암모늄 설페이트, 0.1 M Tris-HCl pH 8.5, 및 20% 에틸렌 글리콜을 함유하는 동해방지제(cryoprotectant) 용액내에 짧게 담근 후 결정을 냉동시켰다. CMY-10 결정은 0.2 M 카드뮴 아세테이트, 0.1 M 소디움 아세테이트 pH 4.6, 및 30% 폴리에틸렌 글리콜 4,000을 함유하는 침전 용액 내에서 만들었다. 데이터를 수집하기 위하여, 동일한 침전 용액에서 5% 에틸렌 글리콜을 함유하는 동해방지제 용액내에 짧게 담근 후 결정을 냉동시켰다. 싱크로트론(synchrotron) 방사선을 사용하여 100 K에서 플래시-냉각(flash-cooled) 결정으로부터 AmpC-BER의 1.76Å 해상도(resolution) 데이터 세트 및 CMY-10의 1.55Å 해상도 데이타 세트를 수집하였다 (supp table 3).

실시예 7-2. 데이타 프로세싱, 위상(phasing) 및 정제

HKL-2000 프로그램 수트(suite)에서 DENZO 및 SCALEPACK를 사용하여 분절 데이터를 프로세싱하여 스케일화하였다. 서치 모델로서 AmpC-BER에 대해서는 에세리키아 콜라이 AmpC β-락타메이즈 (PDB code 1KE4)의 구조를, 그리고 CMY-10에 대해서는 CMY-10 (PDB code 1ZKJ)의 구조를 사용하여 MOLREP30으로 분자 교체(replacement)를 수행하였다. 연이어 상기 모델을 정제(refinement) 및 매뉴얼 리핏팅(manual refitting)하여 AmpC-BER의 R 및 R_free 수치를 17.15 및 19.23%로, CMY-10은 16.58 및 19.65%로 각각 감소시켰다. 최종 모델의 원자 좌표(coordinate) 및 구조 인자(structure factor)를 단백질 데이터 뱅크에 기탁(deposit)하였다. 최종 모델의 라마찬드란 조사구(Ramachandran plot)에서 비-글리신 잔기의 96.54% (AmpC-BER) 및 96.66% (CMY-10)가 가장 선호하는(favored) 영역에 있으며 나머지 3.17% (AmpC-BER) 및 2.79% (CMY-10) 잔기는 허용 영역(allowed region)에 있다는 것을 나타내었다.

실시예 7-3. AMP-함유 화합물의 β- 락타메이즈에 대한 저해 시험

AMP-함유 화합물의 β-락타메이즈에 대한 저해 효과를 테스트하기 위하여, 실온에서 5분간 50 mM MES pH 6.5 내의 AMP-함유 화합물(2 mM)과 함께 CMY-10 (0.2 nM)를 배양하였다. 이어 1시간 동안 486nm (ε = 20,500 M^-1·cm^{- 1})에서 100mM 나이트로세핀을 가수분해하여 SpectraMAX Plus spectrophotometer (Molecular Devices, USA)를 사용하여 CMY-10의 활성을 연속적으로 측정하였다. 측정된 CMY-10 활성을 하기 방정식 : [Abs_I/Abs_E×100] (상기에서 Abs_I는 AMP-함유 화합물과 1시간 동안 배양한 CMY-10의 흡광도를 측정한 것이고 Abs_E는 동일한 시점에서 CMY-10 단독만의 흡광도를 측정한 것이다)에 따라 퍼센트에 근거하여 정량하였다.

AMP의 정상 상태(steady-state) 키네틱 파라미터는 20-400 mM AMP 존재하에서 CMY-10의 초기 비율을 경쟁적 저해 방정식(1)에 피팅(fitting)하여 계산하였다:

(1)

상기에서 [S]는 기질의 농도이고,

는 Κ _m (1 + [I]/Κ _i )와 동등하며, [I]는 저해제의 농도이고, 그리고 Κ _i 는 저해제의 해리 상수이다. SigmaPlot software (Systat software Inc., USA)를 사용하여 기록된 수치를 계산하였다.

해리 상수 Κ(

/

), 및 acAMP, 아비박탐, 및 클라블라네이트의 불활성화 비율 상수

를 결정하기 위하여, 0.2 nM CMY-10와의 100μM 나이트로세핀의 가수분해를 25-400μM acAMP, 0.5-25μM 아비박탐, 및 500-3,500μM 클라블라네이트 각각 존재하에서 연속하여 관찰하였다. 모든 실험은 세 배수로 여러번 반복하였다.

CMY-10에서 얻은 acAMP, 아비박탐, 및 클라블라네이트 데이터를 하기 단순 불활성화 모델에 피팅하였다.

상기에서

및

은 각각 CMY-10와의 저해제의 결합 및 해리 비율 상수를 나타내며, 반면

및

은 각각 공유결합 형성 비율 상수 및 방출 비율 상수에 상응한다. 유사(pseudo) 1ck 비율 상수

를 얻기 위하여 방정식 (2)에 시간을 대입하였다:

(2)

상기에서 [P]는 생성물의 농도를,

및

는 각각 초기 및 최종 반응 속도를 나타내며, t는 시간을 나타낸다.

이러한 불활성화 모델에서, 방정식 (2)에서 결정된

를 방정식 (3)에 대입하여

및

수치를 얻었다:

(3)

상기에서 Κ _i 는

/

와 동등하다.

클라블라네이트의 Κ _i 가 [I] 보다 큰 경우에, 방정식 (3)은 방정식 (4)와 같이 단순화시킬 수 있다.

(4)

vs [I] 기울기에 대해 기록된 수치는 나이트로세핀 기질 농도(CMY-10에 대해 20.2μM의 나이트로세핀 Κ _m 에 상대적인 (relative to) 100μM)를 설명하기 위하여 (1 + [S]/Κ _m ) 식에 대한 조정(adjustment)을 포함한다. 기록된 수치는 Origin software (OriginLab, USA)를 사용하여 계산하였다.

실시예 7-4. 반응 어쎄이

50 mM 아비박탐, 500 mM acAMP, 및 1 mM 클라블라네이트와 함께 실온에서 30분 동안 배양함으로써 CMY-10 (4 mM)를 완전히 불활성화하였다. 과잉의 저해제를 제거하기 위하여, 저해제 존재 또는 부존재 하에서 50 mM MES pH 6.5에서 8,000배로 불활성화된 효소를 즉시 희석하였다. 16시간 동안 100μM 나이트로세핀을 함유하는 용액에서 SpectraMAX Plus spectrophotometer (Molecular Devices, USA)를 사용하여 CMY-10의 반응 활성을 측정하였다.

실시예 7-5. 항생제 감수성 테스트

세 개의 임상 분리주 엔테로박터 에어로진(Enterobacter aerogenes), 클랩시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumonia), 및 아시네토박터 바우만니(Acinetobacter baumannii)를 항생제 감수성 테스트에서 사용하였다. 최소저해농도(MIC) 수치는 임상검사표준연구원(Clinical and Laboratory Standards Institute) 가이드라인에 따라 결정하였다. 임상 박테리아에 대한 3-세대 β-락탐 세프타지딤과의 시너지에 대해 acAMP를 시험하였다. 최종 5 X 10⁵ c.f.u.·mL^-1 세포를 배양하였고 세프타지딤을 500 내지 0.24 mg·mL^-1의 농도 범위에서 사용하였다. 기록된 각 MIC 수치는 세 번의 독립적인 실험의 평균을 반영하였다. 37℃에서 밤새 배양한 후 가시적으로 박테리아 성장을 저해하는 것을 보여준 세프타지딤의 최고 농도를 acAMP의 MIC로 정하였다.

실시예 7-6. 질량 분석법

타겟 밴드를 겔에서 분리해내어 20 mM 암모늄 바이카보네이트/50% 아세토니트릴 용액으로 세척하여 염료를 제거하였다. DTT로 단백질을 감소시키고 아이오다이도아세타미드로 알킬화하였다. 그 후, 겔 조각을 100% 아세토니트릴 용액으로 탈수화하였다. 아세토니트릴을 제거한 후, 아이스배스에서 겔 조각을 0.1 μg·μL^-1 트립신 용액을 첨가하여 재수화시켰다. 재수화한 후 과잉의 트립신 용액을 제거하였다. 25 mM 암모늄 바이카보네이트 용액의 25μL를 첨가한 후, 겔 조각 내 단백질을 37℃에서 밤새 소화시켰다. 얻어진 펩타이드를 70% 아세토니트릴 용액으로 추출하여 건조시켰다.

건조된 펩타이드를 10μL의 2% 아세토니트릴/0.1% 포르만 용액으로 재건하였다. 2μL 샘플 용액을 주입하여 NanoAcquity/Synapt LC/MS/MS system (Waters, USA)으로 분석하였다. 45분 선형(linear) 구배의 2% 내지 40%(부피/부피) 아세토니트릴(0.1%(부피/부피) 포름산 내)과 함께 300 nL·min^-1로 1.7μm BEH C18 컬럼(75μm × 150mm; Waters, USA)을 사용하여 주입된 펩타이드 샘플을 분리하였다. [Glu1]피브리노펩타이드B(400fmol·μL^-1 ; Sigma, USA) 스펙트라를 30초 간격으로 0.5초동안 기록하여 대조군으로 사용하였다(lock mass). 데이터-의존적 조정 방법으로 양성 모드에서 Synapt MS를 작동시켰다. 350-1,600m/z 범위 이상의 MS surveyscan(0.68sec)에서 탐지되는 대부분 강력한 다수 전하를 띄는 두 개의 이온에 대해 펩타이드 분획화를 수행하였다. 일단 MS/MS 스펙트럼이 기록되면, 이으 ㅣ전구체 매스는 동적 배제 방법으로 다음 90초 동안 배제되었다. 관찰된 전구체 m/z 및 전하 상태에 근거하여 자동적으로 조정된 충돌 에너지 존재하에서 펩타이드가 분획화되었다. LC/MS/MS 데이터는 PLGS 2.4 software(Waters, USA)로 pkl 파일로 전화시켰다. 인-하우스 Mascot server 2.5 (MatrixScience, USA)를 사용하여 데이터 베이스 연구를 수행하였다. 데이터 베이스 연구 파라미터는 분류학(다른 프로테오박테리아), 효소(트립신), 다양한 변형(산화[M], 포스포아데노신[HTKYS]), 고정 변형(카바미도메틸[C]), 질량 수치(단일동위), 펩타이드 질량 톨러런스(30ppm), 분획 질량 톨러런스(0.1Da), 최대 missed cleavages(2), 및 기구 타입(ESI-QUAD-TOF)이다. 세린 특이적 부위를 포스포아데노신 변형에 첨가하였고 347Da의 가능한 중성 손실(neutral loss) 또한 배제하였다. 세미-정량화를 하기 위하여, 1μL의 샘플 용액을 주입하였고 동일한 LC 구배로 펩타이드를 분리하였다. MS/MS 수집(acquisition) 없이 MS 스펙트럼을 기록하였다(2초). MS/MS 런(run)으로부터의 질량 및 유지 시간으로 피크 식별을 수행하였다. 두 배 및 세 배 전하를 띈 이온 시그널을 첨가하여 추출된 이온 크로마토그램(XIC)을 생성시키는데 사용하였다. 각 펩타이드의 상대적 정량은 XIC의 통합 면적(integrated area)으로 결정하였다.

실시예 8. AmpC - BER 및 AMP의 구조결정을 통해 AmpC - BER의 활성 부위에서 세린(Ser61)의 아데닐화 규명

Amp-BER은 도메인 인터페이스에 활성 부위가 존재하는 두-도메인 구조를 취하고 있다(도 8a). 전형적인 C형 베타 락타메이즈의 잔기 순서 명명법에 따라 잔기 순서를 정하였다. 하나의 큰 도메인(1-78 및 166-360 잔기)은 헬릭스에 의해 시트가 둘러 쌓인 샌드위치 형태의 구조를 가지고 있고 다른 작은 도메인(79-165 잔기)는 시트 구조 없이 헬릭스로만 구성되어 있다. AmpC-BER의 전체 구조는 C형 β-락타메이즈의 전형적인 구조와 거의 동일하였다. AmpC-BER에서 두 잔기 삽입(insertion)이 있는 H10 헬릭스 부위는 비정형(disordered) 상태이다(도 8a). 동일한 부위가 많은 C형 효소의 결정 구조에서 역시 유연성(flexible)이 있어 비정형 상태인 것으로 보고되었고, 따라서 H10 헬릭스 부위의 잔기 삽입 구조를 설명하는데 부족하다.

상기 정의(refinement)의 초기 단계부터, 전자 밀도 지도에서는 친핵성 세린 잔기(Ser61)에 직접적으로 연결된 잘-정의된 전자밀도를 나타내었다. 본원에서 정제 및 결정화동안 다른 기질 또는 저해제를 첨가하기 않았으므로, 부가물(adduct) 관찰을 전혀 기대하지 않았다. 1.76Å 해상의 전자-밀도 지도를 해석에서, 친화적 Ser61이 아데닐화 되었다는 것이 나타났다. Ser61의 히드록시기가 아데노신 모노포스페이트(AMP)의 인원자에 공유결합되어 있다(도 8). Ser61의 공유결합적 변형 또한 질량분석법으로 확인하였다: 본 발명에 사용된 재조합 AmpC-BER 단백질의 일부분(portion)이 아데닐화된 Ser61을 가지는 것으로 나타났다. 따라서 구조 결정에 활용된 결정이 아데닐화된 Ser61를 함유하는 AmpC-BER로 구성되어 있다는 것을 나타낸다.

실시예 9. AmpC - BER과 결합한 AMP의 결합 모드를 정밀분석(dissection)을 통한 AmpC-BER의 활성부위와 AMP가 정전기적 상보성을 통해 결합 규명

본원에서는 저해제 또는 β-락탐 항생제와 공유결합된 Amp β-락타메이즈의 11개의 결정 구조를 사용하여 열적(thermal) B-인자 비율(리간드 B-인자/단백질 B-인자)을 계산하였다. 흥미롭게도, AmpC-BER의 결정 구조에서 가장 낮은 비율이 나타났는데, 이는 AMP 부가물이 AmpC-BER에 완고하게(rigidly) 결합되어 있다는 것을 말한다. 이와 일치하게, AMP 부가물이 뛰어난 정전기적 상보성을 가지고 AmpC-BER의 활성 부위에 자리잡고 있다(도 9a). 포스페이트 및 라이보스 고리의 두 개의 히드록시기, 라이보스 고리의 탄소 백본, 및 퓨린 염기는 각각 활성부위의 양성, 중성 및 음성적 정전기 포텐셜을 나타내는 파란색, 흰색 및 적색 부위와 접촉한다(도 9a). 놀랍게도 자연의 β-락탐 기질과 구조적으로 구별되는 아데노신 뉴클레오타이드 스캐폴드에 AmpC-BER가 잘 들어맞았다(accomodate).

AMP의 인 원자는 4면체 배열(tetrahedral arrangement)에서 Ser61의 히드록시기의 산소를 포함한 제 개의 산소원자로 둘러싸여 있다(도 9b). 히드록시기 산소는 Lys64에 수소결합 되어 있으며 하나의 말단의 산소원자(01)는 Ser61 및 Ala317의 백본 -NH 그룹과 함께 수소결합을 형성한다(도 9b). C형 β-락타메이즈에서, 두 개의 백본 -NH 기는 산소음이온 구멍을 형성하여 β-락탐 고리의 카르보닐 산소음이온이 잘 수용되고 그럼으로써 가수분해 반응 중의 친핵성 공격에 의해 카르보닐 산소에 생성되는 음전하를 안정화시키게 된다. 다른 말단 산소 원자(03)는 직접적으로 Tyr147과 상호작용을 하여 Asn345 및 Arg348과 물-매개의 상호작용을 형성한다(도 9b). 결과적으로, 산소음이온에서의 01의 위치 및 인 원자에 관한 4면체 기하학은 AMP의 포스페이트 부분(moiety)은 β-락타메이즈-촉매 반응의 4면체 전이 상태와 닮았다는 것을 말한다.

라이보스 고리는 그의 3‘-OH기가 Ala317의 백본 -CO 기와 수소결합하여 Tyr218의 방향족 고리와 맞붙어 구성되어 있는 것으로 나타났다(도 9b). 결정화에 필요한 모 액체의 요소인 주변의 설페이트 이온과 라이보스 고리의 2’-OH가 수소결합을 형성한다(도 9b): 설페이트 이온은 Ser209 및 Gly319의 백본 -NH 기와 직접적으로 상호작용하여, Glu58의 곁가지 및 His207의 백본 -CO기와 물-매개 상호작용을 형성한다. 라이보스 고리 산소(O4‘)는 Asn149의 곁가지 아미드 질소 원자와 4Å 떨어져 있는 것으로 나타났다(도 9b). 아데닌 부분의 피리미딘 고리 및 이미다졸 고리는 각각 Gln117 및 Tyr218의 곁가지와 반 데르 발스 결합을 형성하는 것으로 나타났다(도 9b). Asp120의 곁가지 아미드 산소 및 Val118의 백본 -CO 기는 C-6의 NH2와 상호작용한다. N7은 Val118의 백본 -NH기와 물-매개 상호작용을 형성하는 것으로 나타났다(도 9b). C형 β-락타메이즈에서 절대적 또는 매우 잘 보존된 산소음이온, Gln117, 및 Tyr218이 주로 활성 부위에서의 AMP 부분 수용에 기여한다는 것에 주목할 필요가 있다.

실시예 10. AMP 스캐폴드를 포함하고 있는 AMP 유도체의 저해 활성의 정량분석

결정 구조에 근거하여, 친핵성 공격에 의해 유리되는 미확인 대체물을 X로 표시한 아데노신-포스페이트-X를 구성하는 AMP 스캐폴드를 포함하는 AMP 유도체의 포스페이트 부분의 인 원자를 친핵성 세린이 공격하는 것으로 가정하였다(도 10). 비록 AMP 부가물의 소스가 되는 실 대사물질의 실체는 확인하지 않았지만, AMP가 AmpC-BER의 활성부위에 결합한다는 것은 자명하다. 따라서 AMP가 β-락타메이즈 저해제로 작용할 수 있는지를 조사하였다. 활성 부위에서 공유결합된 AMP가 있는 AmpC-BER은 저해 어쎄이에 적합하지 않기 때문에, 이미페넴-가수분해 활성을 지닌 광범위 C형 β-락타메이즈인 CMY-10을 대신 사용하였다. CMY10 및 AmpC-BER 사이의 서열 동일성은 39.3%이고 이들의 결정 구조는 모든 Ca 원자에 대해 0.82Å의 r.m.s.d.로 포개어 겹쳤다.

본원에서는 2mM AMP 존재하에서 CMY-10에 의한 나이트로세핀(nitrocefin)의 가수분해를 측정하여 나이트로세핀 가수분해가 ~40% 정도 감소하는 것을 관찰하였는데, 이로써 AMP 저해 활성을 정량적으로 분석하였다(도 11a). 반응속도론적 연구를 통해 AMP가 58.3μM의 Κ _i 수치를 가지는 경쟁적 저해자라는 것이 나타났는데, 이는 AmpC-BER 활성 부위에서의 AMP 부가물의 결정학상의 발견과 일치하는 것이다. C형 β-락타메이즈인 CMY-2에 대해, 임상적으로 사용되는 세 개의 저해제, 클라블라네이트(4.365μM), 설박탐(101μM), 및 타조박탐(50μM)의 보고된 Κ _i 수치보다 AMP의 Κ _i 수치가 훨씬 낮거나 필적할 수준인 것으로 나타났다. 이러한 결과에 근거하여 구조 내에 AMP 부분을 함유하는 시중의 화합물에 대해 저해 어쎄이를 수행하였다(도 11b). 그 결과 흥미롭게도, 아데노신 다이포스페이트 라이보스(ADP-라이보스)를 제외한 모든 화합물이 저해활성을 나타내었는데, 이로써 AMP 모이어티의 저해 효능을 확인하였다(도 11a).

실시예 11. CMY -10 및 아세틸-AMP의 구조결정 분석을 통한 CMY -10의 친핵성 세린이 아데닐화를 통해 아세틸-AMP의 저해활성을 확인.

본 실시예에서는 아데노신-포스페이트-X’라는 동일한 분자 패턴을 가진 AMP-유도체를 조사하였다. 인-카르복실 무수 결합이 친핵 공격에 취약하며 간단한 반응을 통해 합성할 수 있는, ‘X’ 위치에 아세틸기를 가진 아세틸-AMP(acAMP)에 주목하였다. 세포 내에서, acAMP는 아세틸 코엔자임 A(아세틸-CoA)의 생합성에서 고 에너지 중간물질인데, 이는 많은 생화학 반응에 사용되는 주요 대사물질이다. 친핵성 Ser61이 포스포-카르복실 무수 결합의 인 원자를 공격한다면 acAMP의 AMP 부분은 Ser61 방출 아세테이트로 옮겨질 수 있다(도 10). 놀랍게도, AMP-함유 화합물 중에서 acAMP는 CMY-10의 나이트로세핀-가수분해 활성을 저해하는데 가장 효율적이다(도 11a). 이를 종합하여 보면, AmpC-BER의 결정구조에서 관찰된 세린 잔기에 AMP가 공유적으로 부착된다는 것을 입증하는데에 acAMP가 이상적인 분자이다. 이러한 고찰을 입증하기 위하여, acAMP 존재하에서 성장한 결정 존재하에서 CMY-10의 구조를 결정하여 친핵성 세린에 공유결합된 것으로 기대하는 AMP 부가물을 관찰하였다 (CMY-10 내의 Ser64). CMY-10의 결정 구조 내에서의 AMP 부가물의 결합 양상은, 라이보스 고리와 상호작용하는 설페이트 이온이 부재하는 것을 제외하고는 AmpC-BER의 결정 구조 내에서와 실질적으로 동일하였는데(도 9b), 이는 설페이트 이온 부존재시의 CMY-10의 결정 조건에 기인한 것이다.

실시예 12. acAMP의 저해 동력학

acAMP가 공유결합 저해제라는 것을 결정학적으로 입증한 후, 관찰된 일차 반응 상수인

를, 여러 acAMP 농도에서 1시간 동안 시간-의존적 나이트로세핀 가수분해를 모니터링하여 결정하였다. 저해 효율(

/Κ _i )을 얻기 위하여

수치를 저해제에 대해 재-플랏하였다 : Κ _i 는 초기 비-공유결합 친화력을 나타내며,

는 공유결합 형성의 반응 비율을 나타낸다. acAMP의 저해 효율(

/Κ _i )은, 임상적으로 사용되도록 최근-승인된 β-락타메이즈 저해제인 아비박탐에 비해 ~70배 더 낮다(표 7).

수치가 유사한 것을 고려하여 보면, acAMP 및 아비박탐 사이의 저해 효율 차이는 초기 비-공유결합 친화력 차이에 의한 것이다. 흥미롭게도, acAMP의 저해 효율은 전통적 β-락탐 저해제인 클라블라네이트보다 ~70배 더 높다(표 7).

본원에서는 점프 희석 방법 (Copeland, R.A., Basavapathruni, A., Moyer, M. & Scott, M.P. Impact of enzyme concentration and residence time on apparent activity recovery in jump dilution analysis. Anal. Biochem. 416, 206-10 (2011))을 사용하여 acAMP, 아비박탐, 또는 클라블라네이트에 의해 저해되는 CMY-10의 재활성화를 측정하였다. 아비박탐에 의해 저해되는 CMY-10의 나이트로세핀-가수분해 활성은 시간-의존적 방식으로 회복되었는데, 이는 아비박탐이 공유결합하는 가역적 저해제라는 최근 보고서 (Ehmann, D.E. et al. Avibactam is a covalent, reversible, non-b-lactam b-lactamase inhibitor. Proc . Natl . Acad . Sci. USA 109, 11663-11668 (2012))와 양립가능한 내용이다. 클라블라네이트에 의해 저해되는 CMY-10의 경우에, 이의 활성은 1.5시간 후에 회복되기 시작하였다. 그러나 acAMP에 의해 저해되는 CMY-10은 16시간 동안 아무런 반응을 나타내지 않았는데, 이는 아비박탐-CMY-10 및 클라블라네이트-CMY-10 부가물과 비교하여 AMP-CMY-10 부가물이 안정한 형태임을 나타내는 것이다.

실시예 13. 임상분리주에 대한 세프타지딤의 최소 저해 농도에 대해 acAMP의 효과

동력학적 연구에 따라, 본원에서는 임상적으로 분리된 세프타지딤-내성 그램-음성 박테리아(Enterobacter aerogenes , Klebsiella pneumoniae , 및 Acinetobacter baumannii)에 대해 세프타지딤의 최소 저해 농도(MIC)에 대한 acAMP의 영향에 대하여 조사하였다. 비록 acAMP 낮은 농도에서는 단독으로는 MIC에 효과를 미치지 않았지만, 2.5-5 mM acAMP는 세프타지딤의 MIC 수치를 ~2 내지 20배 감소시켰다(표 8). acAMP 단독으로는 5 mM 농도에서도 박테리아 성장을 전혀 저해하지 못하였는데, 이는 아세틸-CoA의 중간 매개물은 항생활성을 가지지 않는다는 것을 의미한다.

[표 7] acAMP, 아비박탐 및 클라블라네이트에 대한 CMY-10의 동력학적 파라미터의 비교

[표 8]

상기와 같은 결과는 자연의 β-락탐 기질 및 기존의 베타-락타메이즈 저해제와 구조적으로 구별되는 아데노신 뉴클레오타이드 스캐폴드가 C형 베타-락타메이즈에 결합하여 C형 베타-락타메이즈 저해제로 효과적으로 사용될 수 있는 것을 나타내는 것이다. 또한 친핵성 세린 잔기의 아데닐화가 효소 저해에 중요한 표적이 될 수 있음을 입증하였다.

이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

<110> Korea Institute of Ocean Science & Technology <120> Use of purine ribonucleoside and its derivative as beta-lactamase inhibitor <130> DP201605005P <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 379 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(20) <223> Escherichia coli strain BER AmpC <400> 1 Met Phe Lys Thr Thr Leu Cys Ala Leu Leu Ile Thr Ala Ser Cys Ser 1 5 10 15 Thr Phe Ala Ala Pro Gln Gln Ile Asn Asp Ile Val His Arg Thr Ile 20 25 30 Thr Pro Leu Ile Glu Gln Gln Lys Ile Pro Gly Met Ala Val Ala Val 35 40 45 Ile Tyr Gln Gly Lys Pro Tyr Tyr Phe Thr Trp Gly Tyr Ala Asp Ile 50 55 60 Ala Lys Lys Gln Pro Val Thr Gln Gln Thr Leu Phe Glu Leu Gly Ser 65 70 75 80 Val Ser Lys Thr Phe Thr Gly Val Leu Gly Gly Asp Ala Ile Ala Arg 85 90 95 Gly Glu Ile Lys Leu Ser Asp Pro Ala Thr Lys Tyr Trp Pro Glu Leu 100 105 110 Thr Ala Lys Gln Trp Asn Gly Ile Thr Leu Leu His Leu Ala Thr Tyr 115 120 125 Thr Ala Gly Gly Leu Pro Leu Gln Val Pro Asp Glu Val Lys Ser Ser 130 135 140 Ser Asp Leu Leu Arg Phe Tyr Gln Asn Trp Gln Pro Ala Trp Ala Pro 145 150 155 160 Gly Thr Gln Arg Leu Tyr Ala Asn Ser Ser Ile Gly Leu Phe Gly Ala 165 170 175 Leu Ala Val Lys Pro Ser Gly Leu Ser Phe Glu Gln Ala Met Gln Thr 180 185 190 Arg Val Phe Gln Pro Leu Lys Leu Asn His Thr Trp Ile Asn Val Pro 195 200 205 Pro Pro Glu Glu Lys Asn Tyr Ala Trp Gly Tyr Arg Glu Gly Lys Ala 210 215 220 Val His Val Ser Pro Gly Ala Leu Asp Ala Glu Ala Tyr Gly Val Lys 225 230 235 240 Ser Thr Ile Glu Asp Met Ala Arg Trp Val Arg Ser Asn Met Asn Pro 245 250 255 Arg Asp Ile Asn Asp Lys Thr Leu Gln Gln Gly Ile Gln Leu Ala Gln 260 265 270 Ser Arg Tyr Trp Gln Thr Gly Asp Met Tyr Gln Gly Leu Gly Trp Glu 275 280 285 Met Leu Asp Trp Pro Val Asn Pro Asp Ser Ile Ile Asn Gly Ser Gly 290 295 300 Asn Lys Ile Ala Leu Ala Ala Ala Ala His Pro Val Lys Ala Ile Thr 305 310 315 320 Pro Pro Thr Pro Ala Val Arg Ala Ser Trp Val His Lys Thr Gly Ala 325 330 335 Thr Gly Gly Phe Gly Ser Tyr Val Ala Phe Ile Pro Glu Lys Glu Leu 340 345 350 Gly Ile Val Met Leu Ala Asn Lys Asn Tyr Pro Asn Pro Ala Arg Val 355 360 365 Ala Ala Ala Trp Gln Ile Leu Asn Ala Leu Gln 370 375 <210> 2 <211> 1140 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 2 atgttcaaaa cgacgctctg cgccttatta attaccgcct cttgctccac atttgctgcc 60 cctcaacaaa tcaacgatat tgtgcatcgc acaattaccc cgcttataga gcaacaaaag 120 atccccggta tggcggtggc ggtaatttat cagggtaaac cttattactt tacctggggc 180 tatgcggaca tcgccaaaaa gcagcccgtc acacagcaaa cgttgtttga gttaggttcg 240 gtcagcaaaa catttacggg cgtgcttggt ggcgacgcta ttgctcgagg ggaaatcaag 300 ttaagcgatc ccgcaacaaa atactggcct gaacttaccg ctaaacagtg gaatgggatc 360 acactattac atcttgcgac ctacaccgct ggcggcctgc cattgcaggt gccggatgaa 420 gtgaaatcct caagcgactt gctgcgcttc tatcaaaact ggcagcctgc atgggctcca 480 ggaacacaac gtctgtatgc caactccagt atcggtttgt tcggcgcact ggctgtgaag 540 ccgtctggtt tgagttttga gcaggcgatg caaactcgtg tcttccagcc actcaaactc 600 aaccatacgt ggattaatgt acctccccca gaagaaaaga attacgcctg gggatatcgc 660 gaaggtaagg cagtgcatgt ttcgccaggg gcgttagatg ctgaagctta 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Ser Gly Ala Gly Val Ser Glu 65 70 75 80 Gln Thr Leu Phe Glu Ile Gly Ser Val Ser Lys Thr Leu Thr Ala Thr 85 90 95 Leu Gly Ala Tyr Ala Val Val Lys Gly Ala Met Gln Leu Asp Asp Lys 100 105 110 Ala Ser Arg His Ala Pro Trp Leu Lys Gly Ser Ala Phe Asp Ser Ile 115 120 125 Thr Met Gly Glu Leu Ala Thr Tyr Ser Ala Gly Gly Leu Pro Leu Gln 130 135 140 Phe Pro Glu Glu Val Asp Ser Ser Glu Lys Met Arg Ala Tyr Tyr Arg 145 150 155 160 Gln Trp Ala Pro Val Tyr Ser Pro Gly Ser His Arg Gln Tyr Ser Asn 165 170 175 Pro Ser Ile Gly Leu Phe Gly His Leu Ala Ala Ser Ser Leu Lys Gln 180 185 190 Pro Phe Ala Pro Leu Met Glu Gln Thr Leu Leu Pro Gly Leu Gly Met 195 200 205 His His Thr Tyr Val Asn Val Pro Lys Gln Ala Met Ala Ser Tyr Ala 210 215 220 Tyr Gly Tyr Ser Lys Glu Asp Lys Pro Ile Arg Val Asn Pro Gly Met 225 230 235 240 Leu Ala Asp Glu Ala Tyr Gly Ile Lys Thr Ser Ser Ala Asp Leu Leu 245 250 255 Arg Phe Val Lys Ala Asn Ile Gly Gly Val Asp Asp Lys Ala Leu Gln 260 265 270 Gln Ala Ile Ser Leu Thr His Gln Gly His Tyr Ser Val Gly Gly Met 275 280 285 Thr Gln Gly Leu Gly Trp Glu Ser Tyr Ala Tyr Pro Val Thr Glu Gln 290 295 300 Thr Leu Leu Ala Gly Asn Ser Ala Lys Val Ile Leu Glu Ala Asn Pro 305 310 315 320 Thr Ala Ala Pro Arg Glu Ser Gly Ser Gln Val Leu Phe Asn Lys Thr 325 330 335 Gly Ser Thr Asn Gly Phe Gly Ala Tyr Val Ala Phe Val Pro Ala Arg 340 345 350 Gly Ile Gly Ile Val Met Leu Ala Asn Arg Asn Tyr Pro Ile Glu Ala 355 360 365 Arg Ile Lys Ala Ala His Ala Ile Leu Ala Gln Leu Ala Gly 370 375 380 <210> 4 <211> 1149 <212> DNA <213> Enterobacter aerogenes <400> 4 atgcaacaac gacaatccat cctgtggggg gccgtggcca ccctgatgtg ggccggtctg 60 gcccatgcag gtgaggcttc accggtcgat cccctgcgcc ccgtggtgga tgccagcatc 120 cagccgctgc tcaaggagca caggatcccg ggcatggcgg tggccgtgct caaggatggc 180 aaggcccact acttcaatta cggggtggcc aaccgggaga gcggggccgg cgtcagcgag 240 cagaccctgt tcgagatagg atccgtgagc aagaccctga ctgcgaccct gggggcctat 300 gcggtggtca agggagcgat gcagctggat gacaaggcga gccggcacgc gccctggctc 360 aagggatccg cctttgacag catcaccatg ggggagcttg ccacctacag cgccggaggc 420 ctgccactgc aattccccga ggaggtggat tcatccgaga agatgcgcgc ctactaccgc 480 cagtgggccc ctgtctattc gccgggctcc catcgccagt actccaaccc cagcataggg 540 ctgttcggcc acctggcggc gagcagcctg aagcagccgt ttgccccctt gatggagcag 600 accctgctgc ccgggctcgg catgcaccac acctatgtca atgtgccgaa gcaggccatg 660 gcgagttatg cctatggcta ttcgaaagag gacaagccca tccgtgtcaa ccctggcatg 720 ctggcggacg aggcctatgg catcaagacc agctcggcgg atctgctgcg ttttgtgaag 780 gccaacatcg gcggggttga tgacaaggcg ttgcagcagg ccatctccct gacccaccaa 840 gggcattact cggtaggcgg gatgacccag gggctgggtt gggagagtta cgcctatccc 900 gtcaccgagc agacattgct ggcgggcaat tcggccaagg tgatcctcga agccaatccg 960 acggcggcgc cccgggagtc ggggagccag gtgctcttca acaagaccgg ctcgaccaat 1020 ggctttggcg cctatgtggc cttcgtgccg gccaggggga tcggcatcgt catgctggcc 1080 aatcgcaact accccatcga ggcgcgcatc aaggcggccc acgccatcct ggcgcagttg 1140 gccggttga 1149

Claims (11)

1. 하기 기재된 화합물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 화합물 또는 그 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 C형 베타-락타메이즈를 생산하는 박테리아에 대한 항생제 조성물:
   1) 하기 화학식 1-1의 화합물:
   [화학식 1-1]
   

   

   
   
   2) 구아노신 모노포스페이트;
   3) 이노신 모노포스페이트;
   4) 아데노신 2’,5’-다이포스페이트(2’,5’-ADP);
   5) 데옥시아데노신 모노포스페이트(dAMP);
   6) 아데노신 3’,5’-다이포스페이트(3’,5’-ADP);
   7) 아데노신 3’-모노포스페이트(3’-AMP);
   8) 아데노신 다이포스페이트(ADP); 및
   9) 아데노신 트리포스페이트(ATP);
   
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 C형 베타-락타메이즈를 생산하는 박테리아는 엔테로코커스 파에시움(Enterococcus faecium), 스타필로코커스 아우레스(Staphyloccus aureus), 클렙시엘라 뉴모니에(Klebsiella pneumoniae), 아시네토박터 속(Acinetobacter sp.), 대장균, 또는 엔테로박터속(Enterobacter sp.) 박테리아인, 항생제 조성물.
   
3. 제 1 항에 있어서,
   상기 조성물은 베타-락탐계열 항생제를 추가로 포함하는, 항생제 조성물.
   
4. 제 3 항에 있어서,
   상기 베타-락탐계열 항생제는 페니실린계, 세팔로스포린계, 모노박탐계 또는 카바페넴계 항생제 중 하나 이상인, 항생제 조성물.
   
5. 하기 화학식 1-2의 화합물; 및
   페니실린계, 세팔로스포린계, 모노박탐계 또는 카바페넴계 항생제로 구성되는 군으로 부터 선택되는 하나 이상의 베타-락탐계열 항생제를 조합으로 포함하는, C형 베타-락타메이즈를 생산하는 박테리아에 대한 항생제 조성물:
   [화학식 1-2]
   

   

   .
   
   
   
   
   
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