KR101845445B1

KR101845445B1 - Abcg2의 억제제를 유효성분으로 포함하는 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR101845445B1
Application number: KR1020160096693A
Authority: KR
Inventors: 박은미
Original assignee: 이화여자대학교 산학협력단
Priority date: 2016-07-29
Filing date: 2016-07-29
Publication date: 2018-04-05
Also published as: KR20180014318A

Abstract

본 발명은 ABCG2의 억제제를 유효성분으로 포함하는 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 난소를 제거한 마우스에서 ABCG2의 발현이 증가하는 것을 확인한 후, 난소를 제거한 마우스에 다시 에스트로겐을 투여하였을 때, ABCG2의 발현이 다시 현저히 감소하는 것을 확인함을 확인하였고, 마우스에 허혈성 뇌졸중의 유도 후 재관류를 수행하였을 때, 난소를 제거한 마우스에서는 ABCG2의 발현이 증가하였으나 난소를 제거한 마우스에 다시 에스트로겐을 투여하였을 때 ABCG2의 발현이 감소되는 것을 확인하였으며 또한, 뇌혈관내피세포주에 에스트로겐을 처리하였을 때 대조군 대비 ABCG2의 발현량 및 기능이 감소함을 확인하였고, 에스트로겐을 처리한 뇌혈관내피세포주에 허혈 및 재관류(OGR/R)를 유도하였을 때 에스트로겐을 처리하지 않은 대조군 세포 대비 세포 생존도의 증가 및 세포 독성의 감소를 확인하여 ABCG2 발현의 감소가 에스트로겐에 의한 뇌혈관내피세포의 보호효과와 높은 관련이 있음을 확인하였으며, ABCG2의 발현을 억제시킨 뇌혈관내피세포에서 허혈 및 재관류를 유도하였을 때 세포의 생존도가 증가하고 세포의 독성이 감소함을 최종 확인함으로써, ABCG2의 억제제는 허혈성 뇌졸중과 연관된 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로써 유용하게 사용될 수 있다.

Description

ABCG2의 억제제를 유효성분으로 포함하는 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition comprising ABCG2 inhibitor for preventing or treating brain disease}

본 발명은 ABCG2의 억제제를 유효성분으로 포함하는 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

뇌졸중(stroke)은 흔히 '중풍'으로 알려져 있으며, 뇌에 혈액을 공급하고 있는 혈관이 막히거나 터짐으로써 그 부분의 뇌가 손상되어 급작스런 뇌혈류 장해에 의한 의식소실, 반신마비, 언어장애 등의 국소적 신경장애 증상을 일으킨 상태를 일컫는다.

뇌졸중은 크게 허혈성 뇌졸중(ischemic stroke)과 출혈성 뇌졸중 (hemorrhagic stroke)으로 구분된다. 허혈성 뇌졸중은 뇌조직으로 가는 혈액 공급의 감소 혹은 차단으로 뇌조직이 허혈상태가 되어 발생하며, 출혈성 뇌졸중은 혈관이 터져 뇌조직으로 출혈을 일으켜 발생한다. 즉, 원인에 따라 뇌혈관이 막혀서 생기는 뇌경색(cerebral infarction)과 반대로 뇌혈관이 터져서 발생하는 뇌출혈 (cerebral hemorrhage)로 구분되며, 뇌출혈은 다시 고혈압성 뇌내출혈 (intracerebral hemorrhage)과 뇌혈관이 꽈리모양의 변형을 일으켜 발생하는 뇌동맥류(cerebral aneurysm) 파열에 의한 뇌지주막하 출혈(subarachnoid hemorrhage, SAH)로 구분된다. 또한, 뇌경색은 뇌혈전증(뇌혈관에 혈전이 형성되어 혈관을 막는 것)과 뇌색전증(뇌혈관의 혈전조각이나 심장이상으로 인한 피떡이 머리 혈관으로 흘러들어가 혈관을 막는 것)으로 구분된다. 그밖에 소경색(아주 작은 뇌혈관이 막히는 것), 뇌염증 등으로 인한 혈관염, 선천성 혈관기형장애로 인한 뇌졸중 등이 있다.

통계청에 의하면, 뇌졸중은 심장질환, 암 다음의 사인이 되며, 우리나라의 45세 이상의 남녀에게서 단일질환으로서 주된 사망원인이며, 10만명 당 75.5명으로 높은 수치를 나타내고 있다. 이 중에서 허혈성 뇌졸중은 전체 뇌졸중 환자의 약 80% 정도를 차지한다.

뇌졸중은 뇌의 어느 부위에서나 발생할 수 있으므로 신체의 거의 모든 기능에 장애를 초래할 수 있다. 또한, 발생하는 뇌손상은 손상의 정도와 위치에 따라 결정되는데, 뇌졸중에 의한 심각한 뇌손상의 경우 운동, 감각기능의 손상 및 기억, 학습, 연산, 추리 등 고차원적 기능을 저해하며, 중풍, 지능 박약, 학습 장애, 간질 등과 같은 심각한 후유증을 유발시킨다. 또한, 뇌졸중에서 회복된다고 하여도 대부분의 경우 후유장해를 남기기 때문에 이에 관계되는 사회적, 경제적 손실은 지대하여 년간 70억 달러에 이르는 것으로 보고된 바 있다.

현대 사회의 고령화 추세로 인해 노인 인구의 급속한 증가는 뇌졸중 발생률을 증가시키며 발생 후 환자의 생존기간 증가를 야기하므로 환자 본인과 그 가족들에게 정신적, 육체적 고통을 유발한다. 따라서 뇌졸중과 같은 퇴행성 뇌질환은 여러 가지 사회적 문제를 야기하는 주된 요인으로 대두되고 있다.

이러한 이유로 인하여 지난 수십 년 동안 뇌졸중을 포함한 뇌질환을 치료하고자 하는 많은 노력은 뇌세포의 사멸에 대한 기전을 연구하고 이를 억제하여 뇌세포의 생존률을 증가시키는 방법을 찾는데 기울여져 왔다.

그 노력의 일환으로 최근 뇌세포의 생존률을 증가시키고 뇌혈류를 원상 회복시키기 위해, 뇌혈관의 폐색을 막을 수 있는 항응고제, 항혈소판제 또는 혈전용해제 등이 개발되어 뇌졸중 치료제로 사용되고 있다. 그 일례로, 이부프로펜 등과 같은 소염제가 노용균 반점의 형성을 억제하며 치매 발병을 예방할 수 있다고 보고되어 있다[Weggen, S. 등, Nature, 414:212-216 (2001); Wyss-Coray, T. 및 Mucke, L., Nat. Med., 6:973-974 (2000); Lim, G. P. 등, J. Neurosci., 20:5709-5714 (2000)]. 그러나 아직까지 복잡한 손상 기전을 지닌 뇌세포의 효과적인 보호 약물은 개발되지 못하고 있는 실정이다.

한편, ABCG2(ATP-binding cassette transporter G2) 또는 breast cancer resistance protein(BCRP)는 ATP-binding cassette(ABC) transporter의 일종으로, 생체 내 유입된 독성 물질 또는 대사물질들을 세포 밖으로 유출(efflux)시키는 기능으로써 세포보호 작용을 하지만, 치료 약물의 세포 내 농도를 낮춰 약물에 저항성을 가지게 하는 단백질이다. ABCG2는 뇌에도 존재하는데, 특히 혈액-뇌 장벽(blood-brain barrier; BBB)의 혈관내피세포에 많이 발현되어 있어 뇌 내 약물 유입과 관련된 연구들이 활발히 진행되고 있으나, 뇌졸중을 비롯한 뇌손상 및 뇌질환에서의 ABCG2 역할에 대해서는 알려진 바가 없다. 또한, ABCG2는 에스트로겐에 의해 발현이 감소하는 것으로 보고되었으나, 에스트로겐이 뇌 내 약물의 농도를 증가시킬 수 있는 도구적 역할로 사용될 수 있다는 것 외에는 에스트로겐에 의한 ABCG2 억제에 대한 생물학적인 의미 또한 아직까지 알려지지 않았다.

이에 본 발명자들은, 뇌졸중을 치료하기 위한 새로운 물질을 찾고자 뇌졸중 후 뇌혈관세포의 생존도를 향상시키는 물질을 탐색하던 중, 난소를 절제한 암컷 마우스에서 정상 상태 또는 허혈성 뇌중풍의 유도 후 뇌 내에서 높게 발현되는 ABCG2가, 강력한 뇌보호 효과를 갖는 것으로 알려진 에스트로겐에 의해 발현량의 증가가 억제됨을 확인하였고, 뇌혈관내피 배양세포주에서 ABCG2의 발현을 억제하였을 때, 허혈(ischemia)및 재관류(reperfusion)에 의한 산소 및 포도당 결핍(oxygen-glucose deprivation)유발성 손상으로부터 뇌혈관내피세포의 생존도를 향상시키는 효과를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 뇌질환의 예방 또는 치료를 위하여, ABCG2의 억제제를 유효성분으로 포함하는 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하기 위한 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 ABCG2(ATP-binding cassette transporter G2)의 단백질 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

아울러 본 발명은

1) ABCG2 단백질을 발현하는 세포 또는 ABCG2 단백질에 피검물질을 처리하는 단계;

2) 상기 세포에서 ABCG2 단백질의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및

3) 상기 ABCG2 단백질의 발현 또는 활성 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 뇌질환 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에서 난소를 제거한 마우스에서 ABCG2(ATP-binding cassette transporter G2)의 발현이 증가하는 것을 확인한 후, 난소를 제거한 마우스에 다시 에스트로겐을 투여하였을 때, ABCG2의 발현이 다시 현저히 감소하는 것을 확인함을 확인하였고, 마우스에 허혈성 뇌졸중의 유도 후 재관류를 수행하였을 때, 난소를 제거한 마우스에서는 ABCG2의 발현이 증가하였으나 난소를 제거한 마우스에 다시 에스트로겐을 투여하였을 때 ABCG2의 발현이 감소되는 것을 확인하였다. 또한, 뇌혈관내피세포주에 에스트로겐을 처리하였을 때 대조군 대비 ABCG2의 발현량 및 기능이 감소함을 확인하였고, 에스트로겐을 처리한 뇌혈관내피세포주에 허혈 및 재관류(OGR/R)를 유도하였을 때 에스트로겐을 처리하지 않은 대조군 세포 대비 세포 생존도의 증가 및 세포 독성의 감소를 확인하여 ABCG2 발현의 감소가 에스트로겐에 의한 뇌혈관내피세포의 보호효과와 높은 관련이 있음을 확인하였으며, ABCG2의 발현을 억제시킨 뇌혈관내피세포에서 허혈 및 재관류를 유도하였을 때 세포의 생존도가 증가하고 세포의 독성이 감소함을 최종 확인함으로써, ABCG2의 억제제는 허혈성 뇌졸중과 연관된 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로써 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 에스트로겐에 의한 마우스 뇌 내 ABCG2 발현의 감소를 나타낸 도이다:
A: 난소 유지(intact), 난소 제거(OVX), 난소 제거 후 에스트로겐 투여(OVX + E2)한 마우스 뇌 내 ABCG2의 발현 변화 (n = 5) *p < 0.05; 및
B: 난소 제거(OVX)군과 난소 제거 후 에스트로겐 투여(OVX + E2)군의 뇌피질 내 CD31(녹색)과 ABCG2(적색)의 면역형광 염색결과(n = 3).
도 2는 에스트로겐에 의한 허혈성 뇌졸중 유도 마우스 뇌 내 ABCG2 발현의 감소를 나타낸 도이다:
A: 난소를 유지(intact)한 군에서 허혈성 뇌졸중 유도 후 6시간 및 24시간 동안 재관류를 수행하였을 때의 마우스 뇌 내 ABCG2 발현 변화 (n = 5);
B: 난소 제거(OVX)군에서 허혈성 뇌졸중 유도 후 6시간 및 24시간 동안 재관류를 수행하였을 때의 마우스 뇌 내 ABCG2 발현 변화 (n = 5); 및
C: 난소 제거 후 에스트로겐 투여(OVX + E2)군에서 허혈성 뇌졸중 유도 후 6시간 및 24시간 동안 재관류를 수행하였을 때의 마우스 뇌 내 ABCG2 발현 변화 (n = 5).
도 3은 뇌혈관내피세포주(bEnd.3)에서 에스트로겐에 의한 ABCG2의 발현 변화를 나타낸 도이다:
A: 본 발명자들이 뇌혈관내피세포주(bEnd.3)에서 수행한 실험들의 개략적인순서;
B: Vehicle(0.1 % DMSO)과 에스트로겐(E2) 처리에 의한 ABCG2의 발현 변화 (n = 5) *p < 0.05; 및
C: Vehicle(0.1 % DMSO)과 에스트로겐(E2) 처리에 의한 CD31(녹색)과 ABCG2(적색)의 면역형광 염색결과 (n = 3).
도 4는 뇌혈관내피세포주(bEnd.3)에서 에스트로겐에 의한 ABCG2의 유출 (efflux)기능 변화를 나타낸 도이다.
도 5는 뇌혈관내피세포주(bEnd.3)에서 허혈 및 재관류 유도 손상 후 에스트로겐에 의한 세포의 보호효과 및 ABCG2의 발현 변화를 나타낸 도이다:
A: 정상 및 허혈/재관류(OGD/R) 후 vehicle(0.1 % DMSO)과 에스트로겐(E2) 처리에 의한 세포 생존도의 변화 (n = 6) *p < 0.05;
B: 정상 및 허혈/재관류(OGD/R) 후 vehicle(0.1 % DMSO)과 에스트로겐(E2) 처리에 의한 세포 독성의 변화 (n = 6) *p < 0.05;
C: 에스트로겐(E2) 비 처리세포에서 허혈 이후 6, 12 및 18시간 동안 재관류를 수행하였을 때의 ABCG2의 발현 변화 (n = 6) *p < 0.05; 및
D: 에스트로겐 처리세포에서 허혈 이후 6, 12 및 18시간 동안 재관류를 수행하였을 때의 ABCG2의 발현 변화 (n = 6) *p < 0.05.
도 6은 ABCG2 siRNA를 형질도입(transfection)한 뇌혈관내피세포주(bEnd.3)의 ABCG2의 발현 변화 및 세포 생존도를 나타낸 도이다:
A: Mock, control siRNA 및 ABCG2 siRNA의 형질도입(transfection)후 정상 상태에서의 ABCG2의 발현 변화 (n = 6) *p < 0.05;
B: Mock, control siRNA 및 ABCG2 siRNA의 형질도입(transfection)후 허혈/재관류(OGD/R) 유도 손상 후 ABCG2의 발현 변화 (n = 6) *p < 0.05;
C: Mock, control siRNA 및 ABCG2 siRNA의 형질도입(transfection)후 정상 상태 및 허혈/재관류(OGD/R) 유도 손상 후의 세포 생존도의 변화 (n = 6) *p < 0.05; 및
D: Mock, control siRNA 및 ABCG2 siRNA의 형질도입(transfection)후 정상 상태 및 허혈/재관류(OGD/R) 유도 손상 후의 세포 독성의 변화 (n = 6) *p < 0.05.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 ABCG2(ATP-binding cassette transporter G2)의 단백질 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 ABCG2 단백질은 서열번호 1 또는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 한다.

ABCG2 단백질의 아미노산 서열

서열번호	서열
서열번호 1	MSSSNVEVFIPVSQGNTNGFPATASNDLKAFTEGAVLSFHNICYRVKLKSGFLPCRKPVEKEILSNINGIMKPGLNAILGPTGGGKSSLLDVLAARKDPSGLSGDVLINGAPRPANFKCNSGYVVQDDVVMGTLTVRENLQFSAALRLATTMTNHEKNERINRVIQELGLDKVADSKVGTQFIRGVSGGERKRTSIGMELITDPSILFLDEPTTGLDSSTANAVLLLLKRMSKQGRTIIFSIHQPRYSIFKLFDSLTLLASGRLMFHGPAQEALGYFESAGYHCEAYNNPADFFLDIINGDSTAVALNREEDFKATEIIEPSKQDKPLIEKLAEIYVNSSFYKETKAELHQLSGGEKKKKITVFKEISYTTSFCHQLRWVSKRSFKNLLGNPQASIAQIIVTVVLGLVIGAIYFGLKNDSTGIQNRAGVLFFLTTNQCFSSVSAVELFVVEKKLFIHEYISGYYRVSSYFLGKLLSDLLPMRMLPSIIFTCIVYFMLGLKPKADAFFVMMFTLMMVAYSASSMALAIAAGQSVVSVATLLMTICFVFMMIFSGLLVNLTTIASWLSWLQYFSIPRYGFTALQHNEFLGQNFCPGLNATGNNPCNYATCTGEEYLVKQGIDLSPWGLWKNHVALACMIVIFLTIAYLKLLFLKKYS
서열번호 2	MSSSNVEVFIPVSQGNTNGFPATASNDLKAFTEGAVLSFHNICYRVKLKSGFLPCRKPVEKEILSNINGIMKPGLNAILGPTGGGKSSLLDVLAARKDPSGLSGDVLINGAPRPANFKCNSGYVVQDDVVMGTLTVRENLQFSAALRLATTMTNHEKNERINRVIQELGLDKVADSKVGTQFIRGVSGGERKRTSIGMELITDPSILFLDEPTTGLDSSTANAVLLLLKRMSKQGRTIIFSIHQPRYSIFKLFDSLTLLASGRLMFHGPAQEALGYFESAGYHCEAYNNPADFFLDIINGDSTAVALNREEDFKATEIIEPSKQDKPLIEKLAEIYVNSSFYKETKAELHQLSGGEKKKKITVFKEISYTTSFCHQLRWVSKRSFKNLLGNPQASIAQIIVTVVLGLVIGAIYFGLKNDSTGIQNRAGVLFFLTTNQCFSSVSAVELFVVEKKLFIHEYISGYYRVSSYFLGKLLSDLLPMRMLPSIIFTCIVYFMLGLKPKADAFFVMMFTLMMVAYSASSMALAIAAGQSVVSVATLLMTICFVFMMVCWSISQPLHLGCHGFSTSAFHDMDLRLCSIMNFWDKTSAQDSMQQETILVTMQHVLAKNIW

또한, 상기 ABCG2 단백질의 발현 억제제는 ABCG2 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA; siRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하다.

상기 siRNA는 상기 표적서열에 상동인 독립적인 센스 RNA 가닥 및 이에 상보적인 안티센스 RNA 가닥을 포함하거나 상기 센스 RNA 가닥 및 안티센스 RNA 가닥이 루프에 의해 연결된 스템-루프 구조의 단일 RNA 가닥일 수 있다.

상기 siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고, 스템-루프(stem-loop)의 구조를 이루는 헤어핀 구조를 가질 수 있는데, 이를 특히 shRNA(short hairpin RNA)라 지칭한다. 한편, 상기 이중사슬 또는 스템 부위는 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수도 있다. 전체 길이는 10 내지 80 염기, 바람직하게는 15 내지 60 염기, 더욱 바람직하게는 20 내지 40 염기이다. 또한, 상기 루프 영역은 서열에 특별한 의미가 없으며, 단지 센스서열과 안티센스 서열을 적당한 간격으로 연결하기 위하여 3-10 정도의 염기를 가지고 있으면 족하다. 종래에 siRNA의 루프 영역으로 많이 사용되어온 예들은 다음과 같다: AUG(Sui et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(8):5515-5520, 2002), CCC, CCACC 또는 CCACACC(Paul et al., Nature Biotechnology 20:505-508, 2002), UUCG(Lee et al., Nature Biotechnology 20:500-505), CTCGAG, AAGCUU(Editors of Nature Cell Biology Whither RNAi, Nat Cell Biol. 5:489-490, 2003), UUCAAGAGA(Yu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(9):6047-6052, 2002) 및 TTGATATCCG(www.genscript.com의 default spacer). siRNA 말단 구조는 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3' 말단 돌출한 구조(protruding structure)와 5' 말단 쪽이 돌출한 구조가 모두 가능하고 돌출하는 염기 수는 한정되지 않는다. 예를 들어, 염기 수로는 1 내지 8 염기, 바람직하게는 2 내지 6 염기로 할 수 있다. 또한, siRNA는 표적유전자의 발현억제 효과를 유지할 수 있는 범위에서 예를 들어, 한쪽 말단의 돌출 부분에 저분자 RNA(예를 들어, tRNA, rRNA, 바이러스 RNA와 같은 천연의 RNA분자 또는 인공의 RNA분자)를 포함할 수 있다. siRNA 말단구조는 양측 모두 절단 구조를 가질 필요는 없고, 이중사슬 RNA의 일방의 말단 부위가 링커 RNA에 의하여 접속된 스템 루프형 구조일 수도 있다. 링커의 길이는 스템 부분의 쌍을 이루는 데 지장이 없는 길이면 특별히 한정되지 않는다.

더불어, 본 발명에 따른 siRNA에서, 센스 RNA 가닥 및/또는 안티센스 RNA가닥은 이의 당 부분, 뉴클레오베이스 부분 또는 인터뉴클레오타이드 구조 내에 최소한 1개의 화학적 변형을 포함하는 것이 가능하다. 이러한 변형은 생체 내에서 뉴클레아제에 의해 siRNA의 파괴를 저해하는 것을 가능하게 할 수 있다. 본 발명에 따른 siRNA의 안정성과 생적합성을 생체 내에서 향상시킬 수 있는 모든 화학적 변형이 본 발명의 범위에 포함된다. 당 부분에 대한 바람직한 변형 중에서, 언급될 수 있는 것은 2'-데옥시, 2'-플루오로, 2'-아미노, 2'-티오, 또는 2'-O-알킬과 같은 리보오스의 포지션 2', 그리고 바람직하게는 리보뉴클레오타이드 상의 정상 2'-OH 그룹을 대체하는 2'-O-메틸 또는 LNA의 포지션 2' 및 4' 사이에 있는 메틸렌 브릿지의 존재에서 일어나는 변형이다. 뉴클레오베이스의 경우, 5-브로모-유리딘, 5-이오도-유리딘, N3-메틸-유리딘, 2,6-디아미노퓨린(DAP, 5-메틸-2'-데옥시시티딘, 5-(1-프로피닐)-2'-데옥시-유리딘(pdU), 5-(1-프로피닐)-2'-데옥시시티딘(pdC)과 같은 변형된 염기 또는 콜레스테롤과 결합한 염기를 이용하는 것이 가능하다. 마지막으로, 인터뉴클레오타이드 골격의 바람직한 변형은 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 메틸포스포네이트, 포스포로디아미데이트 그룹에 의한 골격에 있는 포스포디에스터 그룹을 치환하는 것을 포함하거나, 펩타이드 결합에 의해 연결된 N-(2-아미노에틸)-글리신(PNA, 펩타이드 핵산)으로 구성되는 골격을 이용한다. 다양한 변형(염기, 당, 골격)은 몰포리노(morpholino) 타입의 변형된 핵산(몰포린 링에 고정되고 포스포로디아미데이트 그룹에 의해 연결된 염기) 또는 PNA(펩타이드 결합에 의해 연결된 N-(2-아미노에틸)-글리신 단위에 고정된 염기)에 결합될 수 있다.

본 발명에 따른 siRNA는 "분리된 것"이며, 이는 자연 상태에 있지 않은 것을 의미하지만 인간의 개입과 관련된 모든 수단에 의해 얻어질 수 있는 것을 의미한다. 특히, 본 발명에 따른 siRNA는 화학적 합성, 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의한 요구되는 뉴클레오타이드 서열의 증폭, 또는 재조합 합성에 의해 이미 존재하는 siRNA를 정제함으로써 얻어질 수 있다.

또한, 상기 ABCG2 단백질의 활성 억제제는 ABCG2 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머 및 항체로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하다.

상기 ABCG2 단백질에 상보적으로 결합하는 항체는 ABCG2의 주입을 통해 제조된 것 또는 시판되어 구입한 것이 모두 사용 가능하다. 또한, 상기 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 에피토프와 결합할 수 있는 단편 등을 포함한다. 상기 다클론 항체는 ABCG2를 동물에 주사하고 해당 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 종래의 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 당업계에 알려진 어떠한 방법에 의해서든 정제될 수 있고, 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 만들어질 수 있다. 상기 단클론 항체는 연속 세포주의 배양을 통한 항체 분자의 생성을 제공하는 어떠한 기술을 사용하여도 제조할 수 있다. 이러한 기술로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 하이브리도마 기술, 사람 B-세포 하이브리도마 기술 및 EBV-하이브리도마 기술이 포함된다(Kohler G et al., Nature 256:495-497, 1975; Kozbor D et al., J Immunol Methods 81:31-42, 1985; Cote RJ et al., Proc Natl Acad Sci 80:2026-2030, 1983; 및 Cole SP et al., Mol Cell Biol 62:109-120, 1984). 또한, 상기 ABCG2에 대한 특정 결합 부위를 함유한 항체 단편이 제조될 수 있다. 예를 들면 이들로 한정되는 것은 아니지만 F(ab')2 단편은 항체 분자를 펩신으로 분해시켜 제조할 수 있으며, Fab 단편은 F(ab')2 단편의 디설파이드 브릿지를 환원시킴으로써 제조할 수 있다. 다른 방도로서, Fab 발현 라이브러리를 작게 하여 원하는 특이성을 갖는 단클론 Fab 단편을 신속하고 간편하게 동정할 수 있다(Huse WD et al., Science 254: 1275-1281, 1989).

상기 ABCG2 단백질의 발현 또는 활성 억제제는 세포보호 효과를 나타내는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 뇌질환은 허혈성 뇌질환인 것이 바람직하나 이에 한정되지는 않는다.

아울러, 상기 허혈성 뇌질환은 중풍, 뇌졸중, 뇌경색, 뇌허혈, 혈전증(thrombosis), 색전증(em-bolism), 일과성 허혈 발작(transient ischemic attack), 소경색(lacune), 두부손상(head trauma), 뇌순환대사장애, 뇌 기능혼수, 혈관성 치매, 쇼크 뇌손상, 외상성 뇌손상 및 저산소성 뇌손상으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 구체적인 실험예에서, 본 발명에서 난소를 제거한 마우스에서 ABCG2(ATP-binding cassette transporter G2)의 발현이 증가하는 것을 확인한 후, 난소를 제거한 마우스에 다시 에스트로겐을 투여하였을 때, ABCG2의 발현이 다시 현저히 감소하는 것을 확인하였고(도 1 참조), 마우스에 허혈성 뇌졸중의 유도 후 재관류를 수행하였을 때, 난소를 제거한 마우스에서는 ABCG2의 발현이 증가하였으나 난소를 제거한 마우스에 다시 에스트로겐을 투여하였을 때 ABCG2의 발현이 감소되는 것을 확인하였다(도 2 참조). 또한, 뇌혈관내피세포주에 에스트로겐을 처리하였을 때 대조군 대비 ABCG2의 발현량 및 기능이 감소함을 확인하였고(도 3 및 4참조), 에스트로겐을 처리한 뇌혈관내피세포주에 허혈 및 재관류(OGR/R)를 유도하였을 때 에스트로겐을 처리하지 않은 대조군 세포 대비 세포 생존도의 증가 및 세포 독성의 감소를 확인하여 ABCG2 발현의 감소가 에스트로겐에 의한 뇌혈관내피세포의 보호효과와 높은 관련이 있음을 확인하였으며(도 5 참조), ABCG2의 발현을 억제시킨 뇌혈관내피세포에서 허혈 및 재관류를 유도하였을 때 세포의 생존도가 증가하고 세포의 독성이 감소함을 확인하였다(도 6 참조).

따라서 ABCG2의 억제제는 허혈 및 재관류 유도성 손상으로부터 세포 독성을 감소시키고 세포의 생존성을 향상시키므로, 허혈성 뇌졸중과 연관된 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로써 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조될 수 있다.

경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 상기 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스(sucrose), 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 제조될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘스테아레이트(magnesium stearate), 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제 및 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라, 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강내, 직장, 정맥, 근육, 피하, 흉부내 또는 뇌혈관내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하다.

본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 개별 투약량은 구체적으로 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유한다.

일일 투여량은 siRNA의 양을 기준으로 0.6 내지 1.2 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.7 내지 1.1 ㎎/㎏이고, 더욱 바람직하게는 0.8 내지 1.1 ㎎/㎏이며, 하루 1회 투여되고 이때 여러 부위에 나누어 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

아울러, 본 발명은

상기 단계 2)의 단백질의 발현 정도는 면역형광법, 효소면역분석법(ELISA), 웨스턴 블롯(Western Blot) 및 RT-PCR로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않고 당업계에 알려진 모든 단백질 발현 수준 분석 방법일 수 있다.

아울러, 상기 단계 2의 ABCG2 단백질의 활성 정도는 SDS-PAGE, 면역형광법, 효소면역분석법(ELISA), 질량분석 및 단백질 칩으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않고 당업계에 알려진 모든 단백질 활성 수준 분석 방법일 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서 ABCG2의 siRNA를 처리한 경우, 세포독성이 감소하고 세포의 생존도가 증가함을 확인하였으므로, ABCG2를 억제하는 피검물질은 뇌질환의 치료제 후보물질이 될 수 있으며, 본 치료제 스크리닝 방법에 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예 및 실험예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 난소의 제거방법

C57Bl/6 10주령 암컷 마우스를 1.2% isoflurane을 사용하여 흡입마취 한 후, 요추부 피부의 중앙을 절개하고 양쪽의 난소를 노출시킨 후, 전기소작 방법을 이용하여 난소를 절개하였다. 절개된 피부를 다시 봉합하여 마취에서 회복시켰으며, 2주 후 실험을 위한 마우스 그룹에는 6일간 매일 에스트로겐(E2, 1μg)을 피하주사 방식으로 투여하였다.

< 실시예 2> 마우스의 허혈성 뇌졸중 유도 방법

C57Bl/6 10주령 암컷 마우스를 1.2% isoflurane을 사용하여 흡입마취 한 후, 오른쪽 두정부(parietal area)의 피부를 절개하고 정수리점(bregma)에서 뒤로 2mm, 오른쪽으로 5mm 부위의 두정골(parietal bone)에 컴퓨터와 연결된 레이저 도플러 뇌혈류 측정기(laser-Doppler flowmeter)의 광섬유 측정소자(fiber optic probe)를 연결하여 뇌혈류를 측정하였다. 마우스의 앞쪽 경부(anterior neck)의 피부를 절개 후 오른쪽 외경동맥(external carotid artery)을 분리하여 폐쇄시키고 오른쪽 내경동맥(internal carotid artery)의 동맥 절개(arteriotomy) 부위에 실리콘으로 끝부분이 코팅된 6-0 나일론 봉합사를 삽입하여 컴퓨터상으로 정상 뇌혈류의 85% 이상이 감소되는 지점인 중뇌동맥(middle cerebral artery)의 시작 부위(origin)까지 도달하도록 하였다.

< 실시예 3> 뇌혈관내피세포주에서의 허혈(ischemia)유도 및 재관류 (reperfusion) 방법

정상 배양액(Dulbecco’s Modified Eagle Medium에 10% fetal bovine serum, 100 U/ml penicillin과 100 mg/ml streptomycin 포함)에 37℃의 습도 조절된 인큐베이터(95% air/5% CO₂)에서 배양된 마우스 뇌 유래 뇌혈관내피세포주인 bEnd.3 세포를 포도당이 배제된 배양액(Earle’s solution:pH 7.4, NaCl (116 mM), KCl (5.4 mM), MgSO₄ (0.8 mM), NaH₂PO₄ (1.0 mM), CaCl₂ (1.8 mM)과 NaHCO₃(26 mM) 포함)으로 교환하고 6시간 동안 산소 결핍된 인큐베이터(94% N₂/5% CO₂/1% O₂)에서 배양하여 산소-포도당 결핍(oxygen-glucose deprivation, OGR)을 유도하였고, 정상 배양액으로 다시 교환하여 산소가 포함된 인큐베이터에 재관류(reperfusion)하여 18시간 동안 유지시켰다.

< 실시예 4> 통계 분석

본 발명의 모든 실험의 결과는 평균± 표준오차로 표기하였다. 또한, 두 그룹 간의 비교는 Unpaired Student's t-tests를 사용하여 분석하였고, 두 그룹 이상의 비교에 있어서 평균값의 집단 간 비교는 사후 피셔의 최소유의차검정(Fisher's least significant difference tests)방법을 이용하여 ANOVA 단방향 분석으로 수행하였다. 유의성이 있는 p 값은 < 0.05로 표기하였다.

< 실험예 1> 암컷 마우스 뇌에서 에스트로겐에 의한 ABCG2 발현 감소

우선, 난소의 에스트로겐에 의한 ABCG2 발현량의 변화를 확인해보기 위해, 본 발명자들은 마우스에서 실험을 수행하였다.

상기 <실시예 1>의 난소를 제거한 마우스(ovariectomized mouse (OVX))와 난소를 제거하지 않은 마우스(intact)를 식염수로 심장 관류(perfusion)시킨 후, 뇌조직을 얻어 추출한 단백질을 전기영동하여 분리하고, ABCG2 항체와 반응시킨 후 luminol reagent으로 특정 밴드를 확인하고 액틴(actin)으로 정량화하여 ABCG2 발현량의 차이를 확인하였다.

또한, 난소를 제거한 마우스(ovariectomized mouse (OVX))와 난소를 제거하지 않은 마우스(intact)를 식염수로 심장 관류(perfusion)시킨 후 얻은 뇌조직을 4% paraforaldehyde로 고정 후 30 μm 두께의 관상면으로 자른 뇌조직을 유리 슬라이드에서 혈관 표지자인 CD31 항체와 ABCG2 항체에 각각 2차 항체 처리하여 형광 현미경을 사용하여 ABCG2 발현량의 차이를 관찰하였다.

그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 난소를 제거한 마우스(OVX)에서 ABCG2의 발현이 증가하는 것을 단백질 밴드 및 형광 현미경으로 확인하였다(도 1). 또한, 이러한 증가현상이 난소를 제거한 마우스에 다시 에스트로겐을 투여(E2)하였을 때 다시 현저히 감소하는 것을 확인하였다(도 1의 A 및 B).

또한, 상기의 <실시예 2>에서와 같이 마우스에 허혈성 뇌졸중(Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO))을 유도한 후, 재관류(reperfusion)를 6시간 및 24시간 동안 수행하였을 때의 마우스의 ABCG2 발현량을 측정하고자, 마우스의 심장관류(perfusion)후 얻은 뇌조직으로부터 추출한 단백질을 상기와 같은 방법으로 전기영동 후 확인하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 난소를 제거한 마우스(OVX)에서는 ABCG2의 발현이 증가하였으나(도 2의 A) 대조군 마우스(intact)와 에스트로겐 투여한 마우스(E2)에서는 ABCG2의 발현이 오히려 감소되는 것을 확인하였다(도 2의 B 및 C). 이는 난소를 제거한 마우스에 에스트로겐을 투여하였을 경우 뇌손상이 줄어드는 뇌보호의 효과를 기입증한 본 발명자의 연구결과(Shin et al., 2011)와도 관련되어 에스트로겐의 뇌보호 효과와 ABCG2 발현의 감소가 연관이 있음을 보여준다.

< 실험예 2> 뇌혈관내피세포주에서 에스트로겐에 의한 ABCG2의 발현 및 기능의 감소

뇌혈관내피세포주에 에스트로겐을 처리하였을 때, ABCG2 발현량의 차이를 직접 확인해보기 위해, bEnd.3 세포에 에스트로겐 (1 nM, E2) 및 대조군 약물(0.1 % DMSO)을 72시간 동안 처리하였다(도 3의 A중 일부 참조). 그리고 bEnd.3 세포의 세포 용해물(lysate)의 단백질을 전기영동하여 분리하고, ABCG2 항체와 반응시킨 후 luminol reagent으로 특정 밴드를 확인하고 액틴(actin)으로 정량화하여 ABCG2 발현량의 차이를 확인하였다. 또한, 같은 조건에서 처리한 bEnd.3 세포를 4% paraforaldehyde로 고정 후 유리 슬라이드에서 혈관 표지자인 CD31 항체와 ABCG2 항체에 각각 2차 항체 처리하여 형광 현미경을 사용하여 ABCG2 발현량을 관찰하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, bEnd.3 세포에 에스트로겐(1 nM, E2)을 처리하였을 때, ABCG2의 발현량이 감소하는 것을 확인하였다(도 3의 B 및 C).

또한, 본 발명자들은 ABCG2의 기질(substrate)로 알려져 있는 pheophorbide A의 유출(efflux)기능의 비교를 통해 bEnd.3 세포에서의 ABCG2 기능의 변화를 알아보기 위하여, 에스트로겐(1 nM, E2) 또는 0.1 % DMSO를 72시간 동안 처리한 bEnd.3 세포가 담겨있는 배양액에 pheophorbide A (1 μM)을 30분간 처리한 후, 세포를 다시 회수하여 세포 내 phophorbide A 축적의 정도를 flow cytometry analysis 장비를 사용하여 평균 형광발현의 정도를 정량화하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, ABCG2의 기질(substrate)인 pheophorbide A의 유출(efflux)기능이 에스트로겐(E2)에 의해 감소한 것을 확인하였다(도 4). 이는 뇌혈관내피세포 수준에서 에스트로겐이 ABCG2의 발현 및 기능을 감소시킴을 나타낸다.

< 실험예 3> 에스트로겐에 의한 세포보호 효과 및 ABCG2 발현 증가의 억제

에스트로겐을 처리한 뇌혈관내피세포주에 허혈 및 재관류(oxygen-glucose deprivation/reperfusion (OGR/R))를 유도한 후의 세포 보호효과를 확인하기 위하여, bEnd.3 세포에 48시간 전부터 미리 에스트로겐(1nM, E2)을 처리한 후, 6시간 동안 산소-포도당 결핍을 유도하여 허혈(ischemia)환경을 만들고, 다시 정상 배양액으로 18시간 동안 재관류(reperfusion)하였다(도 3의 A 참조).

다음으로, bEnd.3 세포의 생존도를 MTT assay로 확인하였다. bEnd.3 세포에 MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide) agent (5 mg/ml)를 투여한 뒤 microplate reader를 이용하여 MTT가 미토콘드리아에 의해 formazan으로 환원되는 정도를 측정하였다. 세포 생존도는 정상세포(control cells)의 흡광도에 대한 산소-포도당 결핍 노출 세포의 흡광도 퍼센트(%)로 표시하였다.

또한, 상기 조건의 뇌혈관내피세포주에서의 세포 독성 역시 측정하기 위해 bEnd.3 세포의 배양액 내에서의 lactate dehydrogenase (LDH) 활성을 형광발현의 정도를 측정하여 확인하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 에스트로겐(E2)을 처리하였을 때 bEnd.3 세포의 세포 생존도가 현저히 증가하고, 세포 독성 역시 현저히 감소함을 확인하였다(도 5의 A 및 B).

또한, 에스트로겐을 처리하고, 허혈(ischemia)후 재관류(reperfusion)시간을 각각 6, 12 및 18시간으로 달리한 bEnd.3 세포에서의 ABCG2 발현량의 차이를 알아보고자 bEnd.3 세포 용해물(lysate)의 단백질을 전기영동 하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이. 에스트로겐을 처치하지 않은 그룹에서는 재관류 시간이 증가함에 따라 ABCG2의 발현이 점점 증가하였으나, 에스트로겐(E2)을 처치한 그룹에서는 ABCG2의 발현 증가가 관찰되지 않음을 확인하였다(도 5의 C 및 D). 이는 ABCG2 발현의 감소가 에스트로겐에 의한 뇌혈관내피세포의 보호효과와 높은 관련이 있음을 나타낸다.

< 실험예 4> ABCG2 의 발현 억제에 의한 허혈 후 재관류 세포 보호 효과

ABCG2의 발현을 억제시킨 뇌혈관내피세포주에서 허혈 및 재관류(oxygen-glucose deprivation/reperfusion (OGR/R))를 유도한 후 세포의 보호효과를 확인해 보기 위해, 에스트로겐의 투여 24시간 전 bEnd.3 세포에 ABCG2 small interfering RNA(siRNA, 200 nM; Santa Cruz Biotechnology) 또는 대조 siRNA (200 nM)를 lipofectamine과 함께 3시간 동안 처리하여 형질도입(transfection)시켰다. siRNA의 농도는 이전에 발표된 논문에 근거하였다(Jin 등, 2014). 다음으로, 형질도입된 bEnd.3 세포에 48시간 동안 에스트로겐(1nM, E2)을 처리한 후, 허혈 및 재관류(oxygen-glucose deprivation/reperfusion (OGR/R))를 유도한 후(재관류 18시간), 세포 용해물(lysate)의 단백질을 전기영동 하였다.

또한, 같은 방법으로 ABCG2의 발현을 억제한 bEnd.3 세포에서 허혈 및 재관류(oxygen-glucose deprivation/reperfusion (OGR/R))의 유도 후, 세포 생존도(MTT assay) 및 세포 독성을 상기 <실험예 3>과 같은 방법으로 측정하였다.

그 결과, 정상조건(대조군) 세포 또는 허혈 및 재관류 유도 세포 모두에서 ABCG2 발현이 현저히 감소함을 확인하였을 뿐만 아니라(도 6의 A 및 B), 세포 생존도가 유의적으로 상승하고, 세포의 독성 역시 감소함을 확인하였다(도 6의 C 및 D). 이러한 결과는 뇌혈관내피세포의 ABCG2 발현을 감소시키는 것이 허혈 및 재관류(oxygen-glucose deprivation/reperfusion (OGR/R)) 유도성 손상으로부터 뇌혈관내피세포의 보호 작용을 나타낸다는 것을 보여준다.

<110> Ewha University - Industry Collaboration Foundation <120> Pharmaceutical composition comprising ABCG2 inhibitor for preventing or treating brain disease <130> 2016P-05-001 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 655 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ATP-binding cassette sub-family G member 2 isoform 1 <400> 1 Met Ser Ser Ser Asn Val Glu Val Phe Ile Pro Val Ser Gln Gly Asn 1 5 10 15 Thr Asn Gly Phe Pro Ala Thr Ala Ser Asn Asp Leu Lys Ala Phe Thr 20 25 30 Glu Gly Ala Val Leu Ser Phe His Asn Ile Cys Tyr Arg Val Lys Leu 35 40 45 Lys Ser Gly Phe Leu Pro Cys Arg Lys Pro Val Glu Lys Glu Ile Leu 50 55 60 Ser Asn Ile Asn Gly Ile Met Lys Pro Gly Leu Asn Ala Ile Leu Gly 65 70 75 80 Pro Thr Gly Gly Gly Lys Ser Ser Leu Leu Asp Val Leu Ala Ala Arg 85 90 95 Lys Asp Pro Ser Gly Leu Ser Gly Asp Val Leu Ile Asn Gly Ala Pro 100 105 110 Arg Pro Ala Asn Phe Lys Cys Asn Ser Gly Tyr Val Val Gln Asp Asp 115 120 125 Val Val Met Gly Thr Leu Thr Val Arg Glu Asn Leu Gln Phe Ser Ala 130 135 140 Ala Leu Arg Leu Ala Thr Thr Met Thr Asn His Glu Lys Asn Glu Arg 145 150 155 160 Ile Asn Arg Val Ile Gln Glu Leu Gly Leu Asp Lys Val Ala Asp Ser 165 170 175 Lys Val Gly Thr Gln Phe Ile Arg Gly Val Ser Gly Gly Glu Arg Lys 180 185 190 Arg Thr Ser Ile Gly Met Glu Leu Ile Thr Asp Pro Ser Ile Leu Phe 195 200 205 Leu Asp Glu Pro Thr Thr Gly Leu Asp Ser Ser Thr Ala Asn Ala Val 210 215 220 Leu Leu Leu Leu Lys Arg Met Ser Lys Gln Gly Arg Thr Ile Ile Phe 225 230 235 240 Ser Ile His Gln Pro Arg Tyr Ser Ile Phe Lys Leu Phe Asp Ser Leu 245 250 255 Thr Leu Leu Ala Ser Gly Arg Leu Met Phe His Gly Pro Ala Gln Glu 260 265 270 Ala Leu Gly Tyr Phe Glu Ser Ala Gly Tyr His Cys Glu Ala Tyr Asn 275 280 285 Asn Pro Ala Asp Phe Phe Leu Asp Ile Ile Asn Gly Asp Ser Thr Ala 290 295 300 Val Ala Leu Asn Arg Glu Glu Asp Phe Lys Ala Thr Glu Ile Ile Glu 305 310 315 320 Pro Ser Lys Gln Asp Lys Pro Leu Ile Glu Lys Leu Ala Glu Ile Tyr 325 330 335 Val Asn Ser Ser Phe Tyr Lys Glu Thr Lys Ala Glu Leu His Gln Leu 340 345 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Val Leu Ala Ala Arg 85 90 95 Lys Asp Pro Ser Gly Leu Ser Gly Asp Val Leu Ile Asn Gly Ala Pro 100 105 110 Arg Pro Ala Asn Phe Lys Cys Asn Ser Gly Tyr Val Val Gln Asp Asp 115 120 125 Val Val Met Gly Thr Leu Thr Val Arg Glu Asn Leu Gln Phe Ser Ala 130 135 140 Ala Leu Arg Leu Ala Thr Thr Met Thr Asn His Glu Lys Asn Glu Arg 145 150 155 160 Ile Asn Arg Val Ile Gln Glu Leu Gly Leu Asp Lys Val Ala Asp Ser 165 170 175 Lys Val Gly Thr Gln Phe Ile Arg Gly Val Ser Gly Gly Glu Arg Lys 180 185 190 Arg Thr Ser Ile Gly Met Glu Leu Ile Thr Asp Pro Ser Ile Leu Phe 195 200 205 Leu Asp Glu Pro Thr Thr Gly Leu Asp Ser Ser Thr Ala Asn Ala Val 210 215 220 Leu Leu Leu Leu Lys Arg Met Ser Lys Gln Gly Arg Thr Ile Ile Phe 225 230 235 240 Ser Ile His Gln Pro Arg Tyr Ser Ile Phe Lys Leu Phe Asp Ser Leu 245 250 255 Thr Leu Leu Ala Ser Gly Arg Leu Met Phe His Gly Pro Ala Gln Glu 260 265 270 Ala Leu Gly Tyr Phe Glu Ser Ala Gly Tyr His Cys Glu Ala Tyr Asn 275 280 285 Asn Pro Ala Asp Phe Phe Leu Asp Ile Ile Asn Gly Asp 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Met Phe Thr 500 505 510 Leu Met Met Val Ala Tyr Ser Ala Ser Ser Met Ala Leu Ala Ile Ala 515 520 525 Ala Gly Gln Ser Val Val Ser Val Ala Thr Leu Leu Met Thr Ile Cys 530 535 540 Phe Val Phe Met Met Val Cys Trp Ser Ile Ser Gln Pro Leu His Leu 545 550 555 560 Gly Cys His Gly Phe Ser Thr Ser Ala Phe His Asp Met Asp Leu Arg 565 570 575 Leu Cys Ser Ile Met Asn Phe Trp Asp Lys Thr Ser Ala Gln Asp Ser 580 585 590 Met Gln Gln Glu Thr Ile Leu Val Thr Met Gln His Val Leu Ala Lys 595 600 605 Asn Ile Trp 610

Claims

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1) 생체 외에서, ABCG2 단백질을 발현하는 세포 또는 ABCG2 단백질에 피검물질을 처리하는 단계;
2) ABCG2 단백질의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및
3) 상기 ABCG2 단백질의 발현 또는 활성 정도가 피검물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 허혈성 뇌질환 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.
제 7항에 있어서, 상기 단계 2)의 단백질의 발현 정도는 면역형광법, 효소면역분석법(ELISA), 웨스턴 블롯(Western Blot) 및 RT-PCR로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것을 특징으로 하는 허혈성 뇌질환 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.
제 7항에 있어서, 상기 단계 2의 ABCG2 단백질의 활성 정도는 SDS-PAGE, 면역형광법, 효소면역분석법(ELISA), 질량분석 및 단백질 칩으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것을 특징으로 하는 허혈성 뇌질환 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.
제 7항에 있어서, 상기 허혈성 뇌질환은 중풍, 뇌졸중, 뇌경색, 뇌허혈, 혈전증(thrombosis), 색전증(em-bolism), 일과성 허혈 발작(transient ischemic attack), 소경색(lacune), 두부손상(head trauma), 뇌순환대사장애, 뇌 기능혼수, 혈관성 치매, 쇼크 뇌손상, 외상성 뇌손상 및 저산소성 뇌손상으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 허혈성 뇌질환 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.