KR101842907B1

KR101842907B1 - 제 ⅰ형 인터페론을 생산하는 세포를 표적화하기 위한 조성물 및 방법

Info

Publication number: KR101842907B1
Application number: KR1020127024197A
Authority: KR
Inventors: 지노 루이지 바이로; 앤드류 내쉬; 유진 마라스코브스키; 닉 윌슨; 사만타 버스필드; 콘 파노우시즈
Original assignee: 씨에스엘 리미티드
Priority date: 2010-02-17
Filing date: 2011-02-17
Publication date: 2018-03-28
Also published as: AU2011217728B2; CA2789810C; IL221504B; CA2789810A1; JP6018507B2; WO2011100786A1; CN103002913A; EP2536430A1; NZ601760A; EP2536430B1; EP2536430A4; KR20130004576A; NZ610826A; AU2011217728A1; JP2013519690A; CN103002913B; ES2618562T3

Abstract

본 발명은 인터루킨 3 수용체α(IL-3Rα)사슬이 결합하고, 형질세포양 수지상세포(pDCs) 및 호염구가 결합하는 면역글로불린에서 형질세포양 수지상세포 및 호염구가 제거 또는 부분적으로 제거된 면역글로불린은 포유류에 투여하는 단계를 포함하는 낭창, 쇼요르겐스 증후군(Sjorgen's syndrome) 또는 피부경화증 치료 방법을 제공한다.

Description

제 Ⅰ형 인터페론을 생산하는 세포를 표적화하기 위한 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR TARGETING TYPE Ⅰ INTERFERON PRODUCING CELLS}

관련된 출원 자료

본 출원은 2010년 8월 17일에 제출된 "제 Ⅰ형 인터페론을 생산하는 세포를 표적화하기 위한 조성물 및 방법이라는 발명의 명칭의 미국 특허 출원 번호 61/374,497, 2010년 8월 17일에 제출된 "인간화 항-인터루킨 3 수용체 알파 사슬 항체"라는 발명의 명칭의 미국 특허 출원 번호 61/374,489 및 2010년 2월 17일에 제출된 "만성 염증성 상태의 치료"라는 발명의 명칭의 미국 특허 출원 번호 12/707,297에 대한 우선권을 주장한다. 상기 출원의 전체 내용은 여기에 참조로 포함된다.

분야

본 발명은 염증성 질환의 치료에 관한 것이다.

사이토카인(cytokine)의 인터페론(IFN) 과(科)는 제 Ⅰ 및 Ⅱ형 서브그룹(subgroup)을 포함한다. 제 Ⅰ형 서브그룹은 IFNα, IFNβ, IFNω, IFNκ, 및 IFNτ로 구성되어 있고 제 Ⅱ형 서브그룹은 IFNγ로 대표되어진다. 제 Ⅰ형 인터페론은 다중클론 T 세포 반응, 동형 전환(isotype switching), 주조직적합 복합체(MHC) 클래스 Ⅰ분자 발현 및 수지상세포(DC) 분화의 유발을 포함하는 다양한 면역 조절 작용을 가진다. 제 Ⅰ형 인터페론은 항바이러스 작용을 끌어내기 위해 대식세포와 자연살해(NK) 세포를 자극하고, 또한 종양에 대해 활성화된다. 제 Ⅰ형 인터페론은 또한 시상하부에서 열감지 뉴런(neuron)의 활성을 바꿈으로서 발열성 요소 역할을 하여, 따라서 열을 발생시킨다. 제 Ⅰ형 인터페론 체계의 특징은 빠른 유발 및 신호전달 경로의 증폭, 활발한 항바이러스 면역 반응을 증가시키는데 있다.

하지만, 빠른 바이러스 제거를 위해 이런 경로가 매우 효과적인데 반하여, 이런 증폭은 주조직에 대해 직접인 면역반응으로 악용하여 자가면역질환을 유발한다. 실시예는 전신성 홍반 낭창(SLE), 류마티스성 관절염 및 사구체신염을 포함한다.

전신성 홍반 낭창(SLE)은 자가항체 생산 및 염증 뒤에 피부, 신장, 혈액, 뇌 및 관절을 포함하는 다양한 조직에서 조직 손상을 유발하는 면역 결함의 만성적 자가면역질환이다. 질환 과정은 만성적으로 활성화, 재발 및 이장 또는 장기간 이장이 될 수 있다. 전신성 홍반 낭창은 IFNα과 같은 제 Ⅰ형 인터페론을 포함하는 많은 사이토카인의 증가된 수준으로 특징되어진다.

전신성 홍반 낭창에서 IFNα 역할에 대한 증거는 정상 포유류의 단핵구로부터 전신성 홍반 낭창이 수지상세포 성숙을 유발한 환자에서부터 그 혈청을 보여주는 체외 연구에서 여러 가지로 입증되었다. 따라서, 전신성 홍반 낭창 환자에서 혈청 면역 반응을 유발할 수 있는 항원 제시 세포가 되기 위해 정상적으로 정지한 단핵 세포를 유도할 수 있다. 게다가, 마우스 전신성 홍반 낭창의 모델 (NZB 마우스)에서 IFNAR1의 억제(제 Ⅰ형 IFN에 대한 수용체의 사슬)는 용혈성 빈혈을 감소시키고, 사구체신염을 감소시킨다.

임상적으로, 활성화된 전신성 홍반 낭창의 환자는 종종 혈청 제 Ⅰ형 인터페론 수준이 올라가고 이런 수준은 양성적으로 질환 활성과 상관관계가 있다. 전신정 홍반 낭창에서 인터페론α의 추정적 역할에 대한 추가적인 임상적 증거는 전신성 홍반 낭창이 없는 환자를 종종 인터페론α로 치료는 자가항체 및 전신성 홍반 낭창과 일치하는 임상적인 징후를 개발하는 관찰에서 비롯된다.

제 Ⅰ형 인터페론은 림프구(NK 세포, B 세포 및 T 세포), 대식세포, 섬유아세포, 내피세포, 조골세포 및 특정 수지상세포를 포함하는 많은 세포 유형에 의해 생산된다. 형질세포양 수지상세포(pDCs)는 외부 항원에 반응하는 제 Ⅰ형 인터페론의 가장 강력한 생산자로 확인되었다. 형질세포양 수지상세포는 제 Ⅰ형 인터페론의 출처인 혈액뿐만 아니라 말초 림프기관에서 발견된 순환하는 수지상세포의 서브타입이다. 인간 형질세포양 수지상세포는 전형적으로 표면 표시자 IL-3 수용체 α 사슬(IL-3Rα, CD123), BDCA-2(CD303) 및 BDCA-4(CD304)를 발현하지만, 각각 기존의 수지상세포 또는 단핵구와 구별하는 CD11c 또는 CD14는 발현하지 않는다. 자극 및 활성화 후에서, 형질세포양 수지상세포는 제 Ⅰ형 인터페론(주로 인터페론-α 및 인터페론-β)의 많은 양을 생산한다.

전신성 홍반 낭창과 같은 제 Ⅰ형 인터페론 의존 염증성 질환에서 인터페론α에 대한 명백한 역할을 감안할 때, 항체 또는 가용성 IFNAR 단백질은 이런 사이토카인의 활동을 중화시켜 잠재적인 치료 접근방식으로 추진되고 있다.

전신성 홍반 낭창과 같은 제 Ⅰ형 인터페론 의존 염증성 질환의 치료에 대해 제안된 다른 접근방식은 제 Ⅰ형 인터페론을 발현하는 세포에 의해 발현되는 세포 표면 분자에 결합하는 화합물을 사용하는 것이다.

자가면역질환의 치료에 대해 연구되어진 화합물의 종류는 독소와 컨쥬게이트(conjugate)된 항체로부터의 단일사슬 Fv(scFv)로 구성된 항체독소이다. 이런 화합물은 IL-3R을 발현하는 세포를 죽이는데 유용하게 제안되어왔다. 하지만, 이런 분자는 수많은 단점으로 고통을 받는다. 예를 들면, 면역독소는 간 및 신장 손상을 유발한다고 알려져 있다. scFv에 컨쥬게이트된 독소의 작은 크기는 또한 면역독소는 간에 의해 빠르게 없애고, 이 기관에 더 악화시키는 손상시키는 것을 의미할 수 있고 면역독소는 이득을 주기 위해 인체에 충분한 시간을 유지하지 않을 수도 있다. 더욱이, 독소 성분은 일반적으로 환자에서 면역반응을 유발할 수 있는 인간이 만들지 않는 것을 의미한다. 이런 면역 반응은 분자를 중화할 수 있다. 따라서, 이런 면역독소는 만성적인 자가면역 질환을 치료하기 위해 필요로 하는 다양한 치료를 수정하지 않을 수도 있다.

요약

몇몇 이전의 접근 방식과 반대로, 본 발명자는 블로킹(blocking) 제 Ⅰ형 인터페론 수용체 및/또는 인터페론-알파는 제 Ⅰ형 인터페론의 양성적, 항바이러스 효과를 포함하는 것을 방지하기 위해 충분한 특이성이 없는 것을 깨달았다. 본 발명자는 대신에 인터루킨-3에 반응하는 세포에 대한 인터루킨-3의 활성을 줄이거나 방지 및/또는 형질세포양 수지상세포(pDCs) 및 호염구와 같은 인터루킨-3에 반응하는 세포를 제거하거나 없애는데 초점을 맞춘다. 본 발명자는 IL-3Rα에 대한 면역글로불린의 사용은 형질세포양 수지상세포와 같은 IL-3에 반응하는 세포(즉 IL-3 신호에서 IL-3 활성을 줄이거나 예방하기 위해 만들었다. 하지만, 발명자는 IL-3 신호가 중화된 면역글로불린이 치료적인 이득을 제공하기 위해 IFNα수준을 충분하게 줄이지 않는 것을 알아냈다. 따라서, 본 발명자는 제 Ⅰ형 IFN-의존 염증성 질환 및 형질세포양 수지상세포(pDCs) 및 호염구, 예를 들어 낭창과 관련된 상태를 치료하기 위하여, IL-3에 반응하는 세포를(예를 들어, 형질세포양 수지상세포 및 호염구) 제거 또는 부분적으로 제거하는 포유류의 면역체계를 추가적으로 유도할 수 있는 면역글로불린을 이용하였다. IL-3에 반응하는 세포의 IL-3 활성을 줄이거나 예방할 수 있고, IL-3에 반응하는 세포를 적어도 부분적으로 제거 또는 제거할 수 있는 면역글로불린을 사용하여, 본 발명자들은 체외에서 IFNα 수준을 줄일 수 있었다. IL-3에 반응하는 세포를 제거 또는 적어도 부분적으로 제거하기 위한 포유류의 면역 체계를 사용함으로서, 부작용이 있는 그리고 독성물질의 사용을 피할 수 있다.

형질세포양 수지상세포가 제 Ⅰ형 인터페론의 출처일 뿐만 아니라, 염증성 질환에서 제 Ⅰ형 인터페론의 중요한 출처임을 감안할 때, 발명자는 본 발명에 의해 제공되는 방법은 제 Ⅰ형 인터페론 수용체 및/또는 인터페론-알파에 직접적인 방법보다 제 Ⅰ형 인터페론의 양성적 효과를 덜 무효화할 거 같은 더 정확하고 표적화된 치료 접근방식으로 간주하였다. 특정 제 Ⅰ형 인터페론 의존 염증성 질환은 낭창, 예, 전신성 홍반성 낭창(SLE)이다.

본 발명자는 또한 항체 의존성 세포독성(ADCC)을 유발하기 위해 향상된 능력을 가지는 면역글로불린은 인터페론α 생산 및/또는 저용량에서 순환하는 형질세포양 수지상세포와 호염구의 수를 줄일 수 있는 것을 알아냈다. 본 발명자는 또한 투여 후 며칠간 효과가 지속되고 효과의 기간은 용량 의존적인 것을 확인하였다.

발명자는 또한 형질세포양 수지상세포 및 호염구 수가 면역글로불린의 투여 후에 회복된다는 것을 알아냈으며, 포유류의 면역 반응(예, 바이러스에) 또한 치료 후에 회복된다는 것을 의미한다.

본 발명은 포유류에서 낭창(lupus)을 치료하기 위하여, 인터루킨 3 수용체 α(IL-3Rα) 사슬과 결합하고, IL-3 신호를 중화시키며, 형질세포양 수지상세포(pDCs) 및 호염구가 결합하는 면역글로불린에서 형질세포양 수지상세포 및 호염구를 제거 또는 적어도 부분적으로 제거된 면역글로불린을 포유류에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공하고, 상기 면역글로불린은 면역글로불린과 결합하는 세포를 죽이는 독성 화합물이 컨쥬게이트 되지 않는, 포유류에서 낭창을 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시예에서, 낭창은 전신성 홍반 낭창(SLE)이다.

본 발명은 추가적으로 또는 대안적으로 포유류에서 낭창(lupus)을 치료하기 위하여, 인터루킨 3 수용체 α(IL-3Rα) 사슬과 결합하고, 단일클론항체 7G3이 IL-3Rα에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하며, 형질세포양 수지상세포(pDCs) 및 호염구가 결합하는 면역글로불린에서 형질세포양 수지상세포 및 호염구를 제거 또는 적어도 부분적으로 제거된 면역글로불린을 포유류에 투여하는 단계를 포함하고, 포유류에서 낭창을 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시예에서, 면역글로불린은 IL-3Rα에 결합하고 IL-3 신호를 중화시킨다. 한 실시예에서, 낭창은 전신성 홍반 낭창이다.

본 발명은 추가적으로 또는 대안적으로 포유류에서 낭창(lupus)을 치료하기 위하여, 인터루킨 3 수용체 α(IL-3Rα) 사슬과 결합하고, 단일클론항체 7G3이 IL-3Rα에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하며, 형질세포양 수지상세포(pDCs) 및 호염구가 결합하는 면역글로불린에서 형질세포양 수지상세포 및 호염구를 제거 또는 적어도 부분적으로 제거된 면역글로불린을 포유류에 투여하는 단계를 포함하고, 포유류에서 낭창을 치료하는 방법을 제공하고, 상기 면역글로불린은 면역글로불린과 결합하는 세포를 죽이는 독성 화합물이 컨쥬게이트 되지 않는, 포유류에서 낭창을 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시예에서, 면역글로불린은 IL-3Rα에 결합하고 IL-3 신호를 중화시킨다. 한 실시예에서, 낭창은 전신성 홍반 낭창이다.

본 발명은 추가적으로 또는 대안적으로 포유류에서 쇼그렌스(Sjogrens) 증후군을 치료하기 위하여, 인터루킨 3 수용체 α(IL-3Rα) 사슬과 결합하고, 단일클론항체 7G3이 IL-3Rα에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하며, 형질세포양 수지상세포(pDCs) 및 호염구가 결합하는 면역글로불린에서 형질세포양 수지상세포 및 호염구를 제거 또는 적어도 부분적으로 제거된 면역글로불린을 포유류에 투여하는 단계를 포함하고, 상기 면역글로불린은 면역글로불린과 결합하는 세포를 죽이는 독성 화합물이 컨쥬게이트 되지 않는, 포유류에서 쇼그렌스 증후군을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 포유류에서 피부경화증을 치료하기 위하여, 인터루킨 3 수용체 α(IL-3Rα) 사슬과 결합하고, 단일클론항체 7G3이 IL-3Rα에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제하며, 형질세포양 수지상세포(pDCs) 및 호염구가 결합하는 면역글로불린에서 형질세포양 수지상세포 및 호염구를 제거 또는 적어도 부분적으로 제거된 면역글로불린을 포유류에 투여하는 단계를 포함하고, 상기 면역글로불린은 면역글로불린과 결합하는 세포를 죽이는 독성 화합물이 컨쥬게이트 되지 않는, 포유류에서 피부경화증을 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시예에서, 피부경화증은 전신성 피부경화증이다.

추가적 실시예에서, 본 발명은 상기에서 언급한 실시예의 발명에 있어서 약학적 조성물의 용도를 제공하는데, IL-3Rα사슬 및 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 첨가제와 결합하는 면역글로불린을 포함하는 약학적 조성물. 바람직한 면역글로불린은 본 명세서에 기재되었고, 본 발명의 실시예에 적용한다. 한 실시예에서, 면역글로불린은 면역글로불린과 결합하는 세포를 죽이는 독성 화합물이 컨쥬게이트 되지 않는다. 한 실시예에서, 면역글로불린은 면역글로불린에 결합된 형질세포양 수지상세포(pDCs) 및 호염구를 제거 또는 적어도 부분적으로 제거한다. 한 실시예에서, 면역글로불린은 IL-3Rα와 결합하고, IL-3 신호를 중화시킨다. 한 실시예에서, 면역글로불린은 경쟁적으로 단일클론항체 7G3에 IL-3Rα의 결합을 저해한다.

더 추가적 실시예에서, 본 발명은 상기에서 언급한 실시예의 발명에 있어서 키트의 용도를 제공하는데, IL-3Rα사슬과 결합하는 면역글로불린; 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 첨가제; 및 키트 사용을 위한 지시사항을 포함하는 키트. IL-3Rα과 결합하는 바람직한 면역글로불린은 본 명세서에 기재되었고, 본 발명의 실시예에 필요한 부분만 수정하여 적용한다.

한 실시예에서, 방법은 포유류에서 면역글로불린의 양을 효과적으로 투여해 IL-3 신호를 중화하고 형질세포양 수지상세포(pDCs) 및 호염구를 제거 또는 부분적으로 제거하는 것을 포함한다.

한 실시예에서, IL-3Rα는 하나 혹은 그 이상의 제 Ⅰ형 인터페론이 생산하는 형질세포양 수지상세포(pDCs)에 의해 발현된다. 따라서, 한 실시예에서, 면역글로불린은 하나 혹은 그 이상의 제 Ⅰ형 인터페론이 생산하는 형질세포양 수지상세포의 IL-3Rα와 결합한다.

한 실시예에서, IL-3Rα는 하나 혹은 그 이상의 사이토카인이 생산하는 호염구에 의해 발현된다. 따라서, 한 실시예에서, 면역글로불린은 하나 혹은 그 이상의 사이토카인이 생산하는 형질세포양 수지상세포의 IL-3Rα와 결합한다.

한 실시예에서, 면역글로불린은 단일클론항체 7G3과 동일한 에피토프(epitope)에 결합한다.

다른 실시예에서, 면역글로불린은 단일클론항체 7G3에 의해 결합된 에피토프와 함께 오버랩(overlap)하는 에피토프에 결합한다.

한 실시예에서, 면역글로불린은 특이적으로 IL-3Rα에 결합한다.

한 실시예에서, 면역글로불린은 노출된 면역글로불린이다.

바람직한 면역글로불린은 본 발명의 항체 및 그것의 항원 결합 단편에 의해 고려된다.

한 실시예에서, 면역글로불린은 전체길이 항체이다.

한 실시예에서, 면역글로불린은 키메라 면역글로불린, 예., 키메라 항체는 인간이 아닌 포유류(예, 마우스) 및 인간의 불변 영역에 의해 생산되는 항체로부터 중쇄 가변 영역(V_Hs) 및 경쇄 가변 영역(V_Ls)을 포함한다. 한 실시예에서, 키메라 항체는 단일클론항체 7G3로부터 가변 영역을 포함한다.

다른 실시예에서, 면역글로불린은 인간화 면역글로불린, 예, 인간화 항체 또는 그것의 항원 결합 단편이다. 한 실시예에서, 인간화 항체 또는 그것의 항원 결합 단편은 단일클론항체 7G3 또는 그것의 항원 결합 단편의 인간화 형태이다. 예를 들면, 인간화 항체는 단일클론항체 7G3로부터 유래한 상보성 결정 영역(CDRs)를 포함한다. 한 실시예에서, 인간화 항체는 단일클론항체 7G3의 V_H의 상보성 결정 영역을 포함한다. 추가적 또는 대안적 실시예에서, 인간화 항체는 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환을 포함하는 단일클론항체 7G3의 V_L의 CDR2 및 CDR3과 단일클론 7G3의 CDR1로 구성한다. 한 실시예에서, 서열번호: 3에 기재된 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(V_L) 및 서열번호: 2에 기재된 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(V_H)으로 구성된 인간화 항체.

추가적 실시예에서, 면역글로불린은 인간 항체 또는 그것의 항원 결합 단편과 같은 인간 면역글로불린이다.

본 발명을 포함하는 것에 의해 고려된 대표적인 항원 결합 단편:

(i) 도메인(domain) 항체(dAb);

(ii) Fv;

(iii) scFv 또는 거기의 안정화된 형태(예, 이황화물 안정화된 scFv);

(iv) 이량체 scFv 또는 거기의 안정화된 형태);

(iv) 이량체, 삼량체, 사량체 또는 고차 다합체

(v) Fab 단편;

(v) Fab' 단편;

(vii) F(ab') 단편;

(viii)F(ab')₂ 단편;

(ix) (i)-(vii) 중에 어느 하나는 항체의 Fc 영역에 융합;

(x) (i)-(vii) 중에 어느 하나는 면역 작동 세포와 결합하는 항체 또는 그것의 항체 결합 단편에 융합.

여기의 발명으로부터 숙련된 장인의 명백함으로서, 바람직한 면역글로불린은 면역글로불린과 결합하는 독성 화합물과 컨쥬게이트 없이 제거 또는 적어도 부분적으로 세포를 제거할 수 있다.

한 실시예에서, 면역글로불린은 세포가 세포사멸을 받게 유발한다.

한 실시예에서, 면역글로불린은 효과기 기능을 유발할 수 있다, 예, 효과기 기능은 면역글로불린에 결합하는 세포를 죽이는 결과를 나타낸다. 바람직한 효과기는 항체 의존성 세포독성(ADCC), 항체 의존성 세포 매개성 식작용(ADCP) 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC)를 포함한다.

한 실시예에서, 면역글로불린은 항체 의존성 세포독성(ADCC)을 유발할 수 있다.

한 실시예에서, 면역글로불린은 효과기 기능을 유발할 수 있는 항체 Fc 영역을 포함한다. 예를 들면, 효과기 기능은 FC 매개 효과기 기능이다. 한 실시예에서, Fc 영역은 IgG1 Fc 영역 또는 IgG3 Fc 영역 또는 혼성체 IgG1/IgG2 Fc 영역이다.

한 실시예에서, 면역글로불린은 야생형 인간 IgG1 및/또는 인간 IgG3 영역으로서 유사한(예, 유의하게 다르거나 약 10% 이내) 또는 동일한 수준의 효과기 기능을 유발할 수 있다.

한 실시예에서, 면역글로불린은 여기에 기술한 ch7G3 또는 hz7G3으로서 유사한(예, 유의하게 다르거나 약 10% 이내) 또는 동일한 수준의 효과기 기능을 유발할 수 있다.

한 실시예에서, 면역글로불린은 효과기 기능의 향상된 수준을 유발할 수 있다.

한 실시예에서, 면역글로불린에 의해 유발된 효과기 기능의 수준은 면역글로불린이 야생형 IgG1 Fc 영역으로 구성될 때 상대적으로 향상된다.

한 실시예에서, 효과기 기능은 상대적으로 향상된, 또는 여기에 기술된 ch7G3 또는 hz7G3보다 더 향상된다.

한 실시예에서 면역글로불린은 비푸코실화된 또는 비푸코실화된 Fc 영역을 포함한다.

다른 실시예에서, 면역글로불린은 인간 또는 CHO 세포는 단백질의 푸코실화 수준을 줄이기 위해서 변화되어진 것에 의해 생산된 면역글로불린와 비교해 푸코실화의 낮은 수준을 가진다. 이 실시예에 따르면, 푸코실화의 낮은 수준은 푸코실화된 면역글로불린(예, 푸코오스를 포함하는 항체의 Asn297에 붙는 글리코실기)의 백분율이 인간 또는 CHO 세포가 단백질의 푸코실화 수준을 줄이기 위해서 변화되어진 것에 의해 생산된 것보다 낮은 면역글로불린을 포함하는 조성물에서 의미를 이해할 것이다.

한 실시예에서, 면역글로불린은 hz7G3V3이다. 예를 들면, 면역글로불린은 서열번호: 3에 기재된 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(V_L) 및 서열번호: 2에 기재된 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(V_H)를 포함하는 비푸코실화된 인간화 항체이다. 예를 들면, 면역글로불린은 서열번호: 5에 기재된 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(V_L) 및 서열번호: 4에 기재된 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(V_H)를 포함하는 비푸코실화된 인간화 항체이다.

한 실시예에서, 면역글로불린은 α-1,6-푸코오스 전이효소(FUT8)의 탐지할 수 있는 수준(또는 감소된 수준을 발현하는)을 발현하지 않는 포유류세포(예, CHO 세포)에 의해 발현된 서열번호: 3에 기재된 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(V_L) 및 서열번호: 2에 기재된 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(V_H)를 포함하는 비푸코실화된 인간화 항체이다. 한 실시예에서, 면역글로불린은 α-1,6-푸코오스 전이효소(FUT8)의 탐지할 수 있는 수준(또는 감소된 수준을 발현하는)을 발현하지 않는 포유류세포(예, CHO 세포)에 의해 발현된 서열번호: 5에 기재된 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(V_L) 및 서열번호: 4에 기재된 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(V_H)를 포함하는 비푸코실화된 인간화 항체이다.

한 실시예에서, 면역글로불린은 면역글로불린에 의해 유발되는 향상된 효과기 기능의 하나 또는 그 이상의 아미노산 서열 치환을 포함하는 Fc 영역을 구성한다. 예를 들면, 치환을 포함하지 않는 Fc 영역과 비교해 하나 또는 그 이상의 아미노산 서열 치환은 Fcγ수용체(FcγR)에 대한 Fc 영역의 친화성을 증가시킨다. 예를 들면, 치환을 포함하지 않는 Fc 영역과 비교해 하나 또는 그 이상의 아미노산 서열 치환은 FcγRI, FcγRIIα, FcγRIIc 및 FcγRIIIα으로 구성된 군으로부터 선택된 Fcγ수용체(FcγR)에 대한 Fc 영역의 친화성을 증가시킨다. 한 실시예에서, 하나 또는 그 이상의 아미노산 서열 치환은:

(i) 카바트(Kabat)의 EU 번호 체계에 따라 S2390D, A330L 및 I332E; 또는

(ii) 카바트의 EU 번호 체계에 따라 S239D 및 I332E이다.

예를 들면, 면역글로불린은 서열번호: 3에 기재된 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(V_L) 및 서열번호: 2에 기재된 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(V_H)를 포함하는 인간화 항체이다, 상기의 항체는 Fc 영역을 포함한다: Fc 영역을 포함하는 하나 또는 그 이상의 아미노산 서열 치환은:

(ii) 카바트의 EU 번호 체계에 따라 S239D 및 I332E이다.

한 실시예에서, 면역글로불린은 hz7G3V1 및 hz7G3V2로 구성된: 군으로 선택되어진다.

예를 들면, 면역글로불린은 서열번호: 5에 기재된 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(V_L) 및 서열번호: 6(hz7G3V1)에 기재된 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(V_H)를 포함 및 서열번호: 5에 기재된 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(V_L) 및 서열번호: 7(hz7G3V2)에 명시된 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(V_H)를 포함하는 항체이다.

한 실시예에서, 포유류에 면역글로불린을 투여 후 포유류 순환에서 형질세포양 수지상세포 및/또는 호염구의 수가 면역글로불린을 투여 전 순환에서 형질세포양 수지상세포 및/또는 호염구의 수와 비교하여 적어도 약 50% 줄었다.

예를 들면, 포유류에 면역글로불린을 6시간 투여 후 포유류 순환에서 형질세포양 수지상세포 및/또는 호염구의 수가 면역글로불린 투여 전 순환에서 형질세포양 수지상세포 및/또는 호염구의 수와 비교하여 적어도 약 50% 줄었다.

예를 들면, 포유류 순환에서 형질세포양 수지상세포 및/또는 호염구의 수가 투여 후 면역글로불린의 추가적인 투여없이 면역글로불린 투여 적어도 7일 전 순환에서 형질세포양 수지상세포 및/또는 호염구의 수와 비교해 적어도 50% 줄었다. 예를 들면, 포유류 순환에서 형질세포양 수지상세포 및/또는 호염구의 수가 투여후 면역글로불린의 추가적인 투여없이 면역글로불린 투여 적어도 8일 또는 10일 또는 11일 또는 15일 또는 20일 또는 21일 또는 22일 또는 28일 또는 35일 또는 42일 또는 49일 또는 50일 또는 57일 또는 60일 또는 63일 또는 70일 전 순환에서 형질세포양 수지상세포 및/또는 호염구의 수와 비교하여 적어도 50% 줄었다.

예를 들면, 포유류에 면역글로불린을 투여 후 포유류 순환에서 형질세포양 수지상세포 및/또는 호염구의 수가 면역글로불린을 투여 전 순환에서 형질세포양 수지상세포 및/또는 호염구의 수와 비교하여 적어도 약 50% 또는 55% 또는 60% 또 65% 또는 70% 또는 75% 또는 80% 또는 85% 또는 90% 또는 95% 또는 96% 또는 97% 또는 98% 또는 99% 줄었다.

예를 들면, 방법은 면역글로불린의 치료적으로 효과적인 양과 같은 면역글로불린의 효과적인 양을 투여하는 것을 포함한다.

한 실시예에서, 방법은 포유류에 약 0.0001mg/kg 내지 50mg/kg의 면역글로불린을 투여하는 단계를 포함한다. 예를 들면, 방법은 약 0.0005mg/kg 내지 약 50mg/kg 에서 투여하는 것을 포함한다. 예를 들면, 방법은 약 0.001mg/kg 내지 약 45mg/kg에서 투여하는 것을 포함한다. 예를 들면, 방법은 약 0.005mg/kg 내지 약 40mg/kg에서 투여하는 것을 포함한다. 예를 들면, 방법은 약 0.05mg/kg 내지 약 35mg/kg에서 투여하는 것을 포함한다. 예를 들면, 방법은 약 0.01mg/kg 내지 약 30mg/kg에서 투여하는 것을 포함한다. 예를 들면, 방법은 약 0.1mg/kg 내지 약 15mg/kg에서 투여하는 것을 포함한다. 예를 들면, 방법은 약 0.1mg/kg 내지 약 10mg/kg에서 투여하는 것을 포함한다. 예를 들면, 방법은 약 0.1mg/kg 내지 약 1mg/kg에서 투여하는 것을 포함한다. 예를 들면, 방법은 약 10mg/kg 내지 약 30mg/kg에서 투여하는 것을 포함한다. 예를 들면, 방법은 약 20mg/kg 내지 약 30mg/kg에서 투여하는 것을 포함한다.

한 실시예에서, 면역글로불린은 0.1mg/kg 양으로 투여된다.

한 실시예에서, 면역글로불린은 1mg/kg 양으로 투여된다.

한 실시예에서, 면역글로불린은 10mg/kg 양으로 투여된다.

한 실시예에서, 면역글로불린은 30mg/kg 양으로 투여된다.

한 실시예에서, 면역글로불린은 여러번 투여된다. 한 실시예에서, 투여 사이 기간은 적어도 약 7일, 예를 들어 적어도 8일, 예를 들면, 적어도 9일 또는 10일이다. 한 실시예에서 투여 사이 기간은 적어도 11일이다. 다른 실시예에서, 투여 사이 기간은 적어도 약 15일, 예를 들어 적어도 16일, 예를 들면, 적어도 18일 또는 20일이다. 한 실시예에서 투여 사이 기간은 적어도 22일이다. 다른 실시예에서, 투여 사이 기간은 적어도 약 25일, 예를 들어 적어도 30일, 예를 들면, 적어도 40일 또는 45일이다. 한 실시예에서, 투여 사이 기간은 적어도 57일 또는 60일이다.

예를 들면, 면역글로불린은 0.0001mg/kg 내지 5mg/kg, 예를 들어 0.0005mg/kg 내지 5mg/kg, 예를 들면, 0.001mg/kg 내지 5mg/kg, 예를 들어 0.005mg/kg 내지 5mg/kg 및 5mg/kg의 양에서 투여되고 투여 사이 기간은 적어도 약 7일 또는 8일 또는 9일 또는 10일 또는 11일이다. 예를 들면, 면역글로불린은 0.1mg/kg 내지 2mg/kg의 양에서 투여되고 투여 사이 기간은 적어도 7일 또는 8일 또는 9일 또는 10일 또는 11일이다. 예를 들면, 면역글로불린은 0.1mg/kg 내지 1mg/kg의 양에서 투여되고 투여 사이 기간은 적어도 약 7일 또는 8일 또는 9일 또는 10일 또는 11일이다. 몇몇 실시예에서, 투여 사이 기간은 적어도 약 7일 및 약 22일보다 적고, 예를 들어 적어도 약 11일 또는 약 15일 및 약 20일보다 적고, 예를 들면 적어도 약 13일 및 약 18일보다 적다.

한 실시예에서, 면역글로불린은 0.1mg/kg의 양에서 투여되고 투여 사이 기간은 6일 또는 7일 또는 8일 또는 9일 또는 10일 또는 11일 또는 14일 또는 15일이다.

한 실시예에서, 면역글로불린은 1mg/kg의 양에서 투여되고 투여 사이 기간은 6일 또는 7일 또는 8일 또는 9일 또는 10일 또는 11일 또는 14일 또는 15일 또는 20일 또는 21일 또는 22일이다.

예를 들면, 면역글로불린은 6mg/kg 내지 50mg/kg의 양에서 투여되고 투여 사이 기간은 적어도 약 15일이다. 예를 들면, 면역글로불린은 10mg/kg 내지 30mg/kg 의 양에서 투여되고 투여 사이 기간은 적어도 약 14 또는 15일이다. 예를 들면, 면역글로불린은 20mg/kg 내지 30mg/kg의 양에서 투여되고 투여 사이 기간은 적어도 약 14 또는 15일이다. 몇몇 실시예에서, 투여 사이 기간은 적어도 약 20일 및 약 70일보다 적고, 예를 들어 적어도 약 21 또는 22일 및 약 65일보다 적고, 예를 들면 적어도 약 25일 및 약 57일보다 적다.

한 실시예에서, 면역글로불린은 10mg/kg의 양에서 투여되고 투여 사이 기간은 14일 또는 15일 또는 21일 또는 22일 또는 30일 또는 48일 또는 50일 또는 56일 또는 57일 또는 60일이다.

한 실시예에서, 면역글로불린은 30mg/kg의 양에서 투여되고 투여 사이 기간은 14일 또는 15일 또는 21일 또는 22일 또는 30일 또는 48일 또는 50일 또는 56일 또는 57일 또는 60일이다.

한 실시예에서, 면역글로불린은 낭창 예, 전신성 홍반 낭창의 시간 및 상황으로부터 고생 받고 있는 포유류(예, 여기에 기술된 것으로)에서 순환하는 면역 복합체의 수준 및/또는 자가항체 및/또는 염증 또는 다른 낭창 예, 전신성 홍반 낭창의 증상을 줄이기 위해 포유류에 투여된다. 한 실시예에서, 면역글로불린은 한 번 또는 여러번 투여된다. 만약 면역글로불린이 여러번 투여된다면, 몇몇 실시예에서 그것은 포유류(예, 여기에 기술된 것으로)에서 순환하는 면역 복합체의 수준 및/또는 자가항체 및/또는 염증 또는 다른 낭창 예, 전신성 홍반 낭창의 증상을 유의하게 줄이기 위해 충분한 횟수로 투여된다. 몇몇 실시예에서, 면역글로불린은 포유류(예, 여기에 기술된 것으로)에서 순환하는 면역 복합체의 수준 및/또는 자가항체 및/또는 염증 또는 다른 낭창 예, 전신성 홍반 낭창이 더 이상 유의하게 줄어들지 않을 때 재투여된다.

몇몇 실시예에서, 만약 면역글로불린이 여러번 투여된다면, 그것은 포유류(예, 여기에 기술된 것으로)에서 건강한 대상의 수준과 유사하게(예, 10% 또는 20%) 순환하는 면역 복합체의 수준 및/또는 자가항체 및/또는 염증 또는 다른 낭창 예, 전신성 홍반 낭창의 증상을 줄이기 위해 충분한 횟수로 투여된다. 몇몇 실시예에서, 면역글로불린은 포유류(예, 여기에 기술된 것으로)에서 순환하는 면역 복합체의 수준 및/또는 자가항체 및/또는 염증 또는 다른 낭창 예, 전신성 홍반 낭창이 더 이상 유의하게 줄어들지 않을 때 재투여된다.

한 실시예에서, 방법은 추가적으로 포유류에서 순환하는 면역 복합체의 수준 및/또는 자가항체 및/또는 염증 또는 다른 낭창 예, 전신성 홍반 낭창의 수준을 탐지하는 것을 포함한다.

한 실시예에서, 포유류에서 순환하는 면역 복합체의 수준 및/또는 자가항체 및/또는 염증 또는 다른 낭창 예, 전신성 홍반 낭창의 수준은 건강한 포유류에서 탐지된 수준으로 줄어든다.

한 실시예에서, 방법은 추가적으로 순환에서 형질세포양 수지상세포 및/또는 호염구 및/또는 포유류에서 염증이 생긴 조직의 수를 탐지하는 것을 포함한다.

한 실시예에서, 방법은 추가적으로 순환에서 탐지된 형질세포양 수지상세포 및/또는 호염구의 수가 면역글로불린 투여 전에 순환에서 형질세포양 수지상세포 및/또는 호염구의 수의 약 50% 이내인 경우 면역글로불린의 반복 투여를 포함한다. 예를 들면, 방법은 추가적으로 순환에서 탐지된 형질세포양 수지상세포 및/또는 호염구의 수가 면역글로불린 투여 전에 순환에서 형질세포양 수지상세포 및/또는 호염구의 수의 약 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이내인 경우 면역글로불린의 반복 투여를 포함한다.

한 실시예에서, 면역글로불린의 투여가 중단된 후, 대상 순환에서 형질세포양 수지상세포 및/또는 호염구의 수가 증가한다. 예를 들면, 대상 순환에서 형질세포양 수지상세포 및/또는 호염구의 수의 수준이 정상 또는 건강한 대상에서 정상 또는 건강한 대상에서 수준과 유사하게 증가한다. 예를 들면, 대상 순환에서 형질세포양 수지상 세포 및/또는 호염구의 수는 치료 중단 후 약 11일, 또는 20일, 또는 22일, 또는 30일 또는, 57일 또는, 60일 또는, 65일 또는 70일 후에 증가한다.

본 발명은 또한 포유류에서 낭창 예, 전신성 홍반 낭창의 재발 예방을 위한 방법, 어느 실시예에서 낭창 예, 전신성 홍반 낭창이 재발하고 있는 또는 낭창 예, 전신성 홍반 낭창의 재발하여 발전하고 있는 위험에 있는 포유류에 있어서 여기 기술되어진 면역글로불린을 투여하는 것을 포함하는 따라서 낭창 예, 전신성 홍반 낭창의 재발을 예방하는 방법을 제공한다.

한 실시예에서, 방법은 면역글로불린의 예방적으로 효과적인 양과 같은 면역글로불린의 효과적인 양을 투여하는 것을 포함한다.

한 실시예에서, 방법은 추가적으로 낭창 예. 전신성 홍반 낭창이 재발하고 있는 포유류를 확인하는 것을 포함한다. 예를 들면, 방법은 포유류의 순환에서 자가항체(예, C1q에 대한) 및/또는 항-dsDNA 항체 및/또는 면역 복합체를 탐지하는 것을 포함한다. 낭창 예, 전신성 홍반 낭창이 재발하고 있는 포유류를 결정하는 방법은 기술 및/또는 여기에 기술된 것으로 알려져 있다.

한 실시예에서, 면역글로불린은 본 발명의 어느 실시예에 따라 여기에 기술된 것으로 투여된다.

한 실시예에서, 치료될 포유류는 이런 치료를 필요로 한다. 예를 들면, 포유류는 질환 또는 상태를 겪고 있고 또는 질환 또는 상태의 발전 위험이 있고 또는 질환 또는 상태의 재발을 겪고 있고 또는 재발의 위험이 있다. 한 실시예에서, 치료를 필요로 하는 포유류는 예, 건강한 포유류의 집단에서 탐지되는 수준과 비교해 순환에서 증가된 IFNα의 수준을 가진다.

적절하게, 본 발명의 앞서 언급한 실시예에 있어서, 포유류는 인간이다.

다른 목표, 실시예 및 장점은 다음의 자세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 자세한 설명 및 구체적 실시예는 다양한 변화 및 변형만 본 발명의 사상 및 범주 내에서 상세한 설명으로부터 발명이 속한 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백해질 것이기 때문에 자세한 설명 및 예제는 그림에 부여된다. 또한, 실시예는 본 발명에 공개된 방법의 원리를 설명하고 구체적으로 종래 기술 분야에서 통상의 지식을 가진자는 분명 도움이 될 모든 실시예로 본 발명의 출원에서는 설명하지 않는다.

도 1은 다양한 세포주(X축)에서 세포당 IL-3R 발현의 평균 수준을 보여주는 도표이다.
도 2는 IL-3R(hz7G3V3)이 결합하는 비푸코실화된 인간화 항체의 다양한 양의 전 및 후 투여가 호염구(왼쪽) 또는 형질세포양 수지상세포(pDCs)(오른쪽)의 백분율을 보여주는 2개의 도표를 포함한다. 숫자는 말초 혈액 샘플에서 전체 세포의 백분율을 나타낸다(Y축). 항체의 투여 시간에 상대적인 말초 혈액의 수집 시간은 X축에 나타낸다. 항체의 양 또한 나타낸다.
도 3은 다른 조건 하에서 다양한 항체에 의해 유발된 ADCC가 일으키는 세포용해의 수준을 보여주는 도표이다. 연구된 항체를 지칭하는 명명법은 여기에 설명과 일치한다. 항체는 자가 표적-효과기 조건(pDC-NK2, pDC2-NK1) 및 동종이계 표적-효과기 조건(pDC1-NK2, pDC2-NK1)하에서 연구되었다. 결과는 자연 용해 및 EXTRM^TM으로 해낸 최고 용해의 기능으로서 결정되어진 특정한 용해의 백분율로서 나타낸다.
도 4는 제 Ｃ형 CpG 올리고뉴클레오티드로 활성화된 pDCs를 포함하는 말초혈액단핵구(PBMC)에 의해 세포배양 배지로 분비되는 IFNα의 양을 보여주는 2개의 도표를 포함한다. 세포는 X축에 표시한 농도에서 나타낸 항체로 배양되었다. ELISA를 사용해 탐지한 IFNα의 양은 Y축에 나타낸다. 올리고뉴클레오티드로 6시간(왼쪽) 및 24시간(오른쪽)후 활성화를 수행한 분석의 결과를 보여준다.
도 5는 제 Ｃ형 CpG 올리고뉴클레오티드로 활성화된 pDCs를 포함하는 PBMC에 의해 세포배양 배지로 분비되는 IFNα의 양을 보여주는 도표를 포함한다. 세포는 IL-3R(hz7G3V3) 또는 이소타입 대조 항체(나타내어진)에 결합하는 비푸코실화된 인간화 항체의 다양한 농도에서 배양되었다. ELISA를 사용해 탐지한 IFNα의 양은 Y축에 나타낸다. 올리고뉴클레오티드 24시간 후 활성화를 수행한 분석의 결과를 보여준다.
도 6은 제 Ｃ형 CpG 올리고뉴클레오티드로 활성화된 pDCs를 포함하는 PBMC에 의해 세포배양 배지로 분비되는 IFNα의 양을 보여주는 도표를 포함한다. 세포는 IL-3R(hz7G3V3) 또는 동일 항체의 Fab 단편(나타내어진)에 결합하는 비푸코실화된 인간화 항체의 다양한 농도에서 배양되었다. ELISA를 사용해 탐지한 IFNα의 양은 Y축에 나타낸다. 올리고뉴클레오티드 24시간 후 활성화를 수행한 분석의 결과를 보여준다.

서열 목록의 기호 설명표

서열번호: 1은 IL-3Rα의 아미노산 서열이다.

서열번호: 2는 hzG3의 V_H의 아미노산 서열이다.

서열번호: 3은 hzG3의 V_L의 아미노산 서열이다.

서열번호: 4는 hz7G3의 중쇄의 아미노산 서열이다.

서열번호: 5는 hz7G3의 경쇄의 아미노산 서열이다.

서열번호: 6은 hz7G3V1의 중쇄의 아미노산 서열이다.

서열번호: 7은 hz7G3V2의 중쇄의 아미노산 서열이다.

일반

이 명세서를 통하여, 특별하게 다르게 언급하지 않거나 다르게 문맥이 필요하지 않거나 개별 단계와 관련하여, 물질의 조성물, 단계군 또는 물질의 구성군은 하나 및 다수의 이런 단계, 물질의 조성물, 단계군 또는 물질의 조성물군을 총망라해야한다.

기술 분야에서 통상의 지식을 갖춘 사람은 본 발명이 구체적으로 기술되어진 것외의 변화 및 수정을 허용하는 것을 이해할 것이다. 발명은 이러한 모든 변화와 수정을 포함한다는 것으로 이해되어야한다. 발명은 또한 나타내어진 단계, 특징, 조성 및 화합물의 모두 또는 이 명세서에서 나타낸, 개별적으로 또는 집합적으로, 및 어떤 및 모든 결합 또는 말한 단계 또는 특징의 어떤 둘 또는 그 이상을 포함한다.

본 발명은 여기에 기술된 특정한 실시예의 관점에 제한되지 않으며, 실례의 목적으로만 의미된다. 기능적으로 동등한 제품, 조성물 및 방법은 본 발명의 관점 안에서 명백하게 된다.

본 발명은 여기의 어떤 실시예는 특별히 다르게 언급하지 않는 한 발명의 어떠한 실시예를 필요한 부분만 약간 수정하여 출원해야만 한다.

특별히 다르게 정의되지 않는 한, 여기에 사용된 모든 기술 및 과학적 용어는 기술 분야(예를 들면, 세포 배양에서, 분자 유전학, 면역학, 면역조직화학, 단백질 생화학, 및 생화학)에서 보통의 지식을 갖춘 사람에 의해 공통적으로 이해될 수 있는 동일한 의미를 가져야만 한다.

다르게 나타내어진 것이 없는 한, 재조합 단백질, 세포 배양, 및 면역학적 기술은 본 발명에서 사용되어지는 것으로 표준 절차이고 기술 분야에서 통상의 지식을 갖춘 사람에 잘 알려진 것이다. 이런 기술은 J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996), and F.M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, including all updates until present), Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), and J.E. Coligan et al. (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (현재까지 모두 최신의 것을 포함)와 같은 출처의 문헌을 통해 기술되고 설명된다.

가변 영역 및 그거의 부분, 면역글로불린, 항체 및 여기에 그것의 단편의 설명 및 정의는 Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 및 1991, Bork et al, J Mol. Biol. 242, 309-320, 1994, Chothia and Lesk J. Mol Biol. 196:901 -917, 1987, Chothia et al. Nature 342, 877-883, 1989 및/또는 or Al-Lazikani et al., J Mol Biol 273, 927-948, 1997.에서 논의한 것으로 더 분류화하였을 것이다.

"및/또는, 예,"X 및/또는 Y" 용어는 "X 및 Y" 또는 "X 또는 Y" 둘 중에 하나를 의미하는 것으로 이해되어질 것이고 양쪽 의미 또는 둘 중에 하나의 의미를 위한 명시적 지원이 제공되어져야만 한다.

이 명세서를 통해서 "포함하다"라는 단어, 또는 "포함하다" 또는 "포함하는"과 같은 변화는 언급한 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소의 군, 정수 또는 단계의 포함을 의미하는 것으로 이해될 수 있다, 하지만 어떤 다른 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소의 군, 정수 또는 단계의 제외는 아니다.

여기에 사용된 "유래하다" 용어는 특정한 정수가 해당 출처에서 반드시 특정 출처에서 직접적으로 얻을 수도 있는 것을 나타내야만 한다.

선택된 정의

여기에 사용된, "면역글로불린" 용어는 면역글로불린 이소타입(isotype) IgA, IgD, IgM, IgG 및 IgE 및 그것의 항원결합 단편을 포함하는 면역글로불린 유전자 복합체의 어떤 항원결합 단백질 생산물을 포함한다. 바람직한 면역글로불린은 항체이다. 면역글로불린은 발명에서 단일클론이 하나의 바람직한 형태가 되는 다클론 또는 단일클론일 수 있다. "면역글로불린" 용어에 포함은 적절하게 탈면역화되어서 포유류에 투여된 면역글로불린에 대한 포유류의 면역반응을 줄이거나 제거한 어떤 면역글로불린이다. 인간 치료의 특정한 경우, 적합한 면역글로불린은 키메라, 인간화 또는 인간 면역글로불린을 포함한다. 또한 "면역글로불린" 용어에 포함은 자연적으로 발생되거나 인간 발명(예. 재조합 DNA기술에 의한)에 의해 생산되어지든 변화 또는 변형 아미노산 잔기, 서열 또는 글리코실화를 포함하는 변형, 돌연변이화, 키메라 및/또는 인간화 면역글로불린이다. 본 발명의 "면역글로불린"은 IL-3R에 결합에 조정되어진 대체 면역글로불린 또는 비면역글로불린 단백질 스캐폴드(scaffold)에 기반하는 다른 결합 구조(moiety) 및/또는 서열로 치환할 지도 모른다는것을 이해할 것이다. 바람직한 단백질은 Fc 수용체 결합 부분을 포함한다. 예를 들면, "면역글로불린" 용어에 의해 포함된 단백질은 도메인(domain) 항체, 카멜리드(camelid) 항체 및 연골 어류로부터 항체(예, 면역글로불린 신 항원 수용체 (IgNARs))를 포함한다. 일반적으로, 카멜리드 항체 및 IgNARs 는 V_H를 포함하지만 V_L이 없고 보통 중쇄 면역글로불린으로 나타내어진다. 다른 "면역글로불린"은 T 세포 수용체 및 항체 예,가변 영역을 포함하는 항원 결합 부위 때문에 결합할 수 있는 단백질을 포함하는 다른 면역글로불린 같은 도메인을 포함한다.

숙련된 전문가는 "항체"는 일반적으로 단백질로 다수의 폴리펩티드 예, V_L을 포함하는 폴리펩티드 및 V_H를 포함하는 폴리펩티드로 만들어진 가변 영역을 포함된다고 여기는 것을 알 것이다. 항체는 또한 일반적으로 불변 도메인, 불변 영역 또는 불변 단편 또는 결정화할 수 있는 단편(Fc)으로 배열할 수 있는 몇몇을 포함한다. V_H 및 V_L은 하나 또는 어느 정도 가깝게 연관된 항원에 특이하게 결합할 수 있는 항원 결합 영역을 포함하는 Fv를 형성하기 위해 상호작용한다. 일반적으로, 포유류로부터 경쇄는 κ 경쇄 또는 λ 경쇄 둘 중에 하나이고 포유류로부터 중쇄는 α,β,ε,γ, 또는 μ이다. 항체는 유형(예, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY), 종류(예, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ 및 IgA₂) 또는 서브클래스(subclass) 중 어느 것이 될 수 있다. "항체" 용어는 또한 인간화 항체, 영장류화 항체, 인간 항체 및 키메라 항체를 포함한다.

"전장 항체", "비손상 항체" 또는 "전체 항체" 용어는 항체의 항원 결합 단편에 반대되는 대체로 온전한 형태의 항체를 나타내는 것으로 교대해서 쓴다. 특이적으로, 전체 항체는 Fc 영역을 포함하는 중쇄 및 경쇄의 그것을 포함한다. 불변 도메인은 야생형 서열 불변 도메인(예, 인간 야생형 서열 불면 도메인) 또는 그것의 아미노산 서열 변형체일 수도 있다. 몇몇 경우에 있어, 비손상 항체는 하나 또는 그 이상의 효과기 기능을 가질 수도 있다.

항체의 "항원 결합 단편"은 항원 결합 및/또는 비손상 항체의 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 실시예는 Fab, F(ab')₂ 및 Fv 단편; 이량체; 선형 항체; 단쇄 항체 분자 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.

본 발명의 문맥에서, "효과기 기능"은 세포의 죽음을 초래한 항체의 Fc 영역(본래 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변형체 Fc 영역)에 결합하는 세포 또는 단백질에 의해 매개되는 그것의 생물학적 활동을 나타낸다. 효과기 기능의 실시예는 항체; 보체 의존 세포독성; 항체 의존 세포 매개성 세포독성(ADCC); 항체 의존 세포 식작용(ADCP; 및 B 세포 활성에 의해 유발된다. 본 발명의 문맥에서, "면역글로불린에 의해 유발된 효과기 기능" 용어 또는 용어와 같은 것은 "면역글로불린의 효과기 기능"처럼 과 교대로 쓰일 수 있거나 용어와 같은 것 및 각각은 다른 것의 직역 지원을 제공한다.

"항체 의존 세포 매개성 세포독성" 또는 "ADCC" 특정 세포독성 세포(예, 자연 살해("NK") 세포, 중성구 및 대식세포)에 대해 나타난 Fc 수용체("FcRs")에 결합된 분비된 Ig가 이런 세포독성 효과기가 항원 함유 표적 세포에 특이적으로 결합할 수 있게 하여 결과적으로 세포독소로 표적 세포를 죽이는 세포독성의 형성을 나타낸다. 관심있는 분자의 ADCC 활성도를 평가하기 위해서, 체외 ADCC 분석이 수행될 수도 있다. 이런 분석을 위한 유용한 효과기 세포는 말초혈액단핵구("PBMC") 및 자연 살해 세포를 포함한다.

여기에 사용된, "가변 영역"은 여기에 정의된 항체의 경쇄 및/또는 중쇄의 부분으로 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 것을 나타내고, 예를 들면 CDRs의 아미노산 서열; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3, 및 프레임워크 영역(FRs)을 포함한다. 예를 들면, 가변 영역은 CDRs와 함께 세가지 또는 네가지 FRs(예, FR1, FR2, FR3 및 선택적으로 FR4)를 포함한다. V_H는 중쇄의 가변 영역을 나타낸다. V_L은 중쇄의 가변 영역을 나타낸다. CDRs 및 FRs에 할당된 아미노산 위치는 본 발명에 따른 방법의 수행에 있어서 카바트(1987 및 1991, 앞에)에 따라 또는 다른 번호 체계 예, Clothia 및 Lesk (1987 및/또는 1989, 앞에 및/또는 Al-Lazikani 등, 1997, 앞에)과가변부위 번호 체계. 예를 들면, 카바트의 번호 체계를 따라서, 다음의 잔기 1-30 (FR1), 31-25 (CDRl), 36-49 (FR2), 50-65 (CDR2), 66-94 (FR3), 95-102 (CDR3) 및 103- 113 (FR4)로 위치된 V_H FRs 및 CDRs은 카바트 번호 체계에 따라서 번호가 붙여진다. 예를 들면, 카바트의 번호 체계를 따라서, V_H FRs 및 CDRs은 다음의 잔기 1-23 (FR1), 24-34 (CDRl), 35-49 (FR2), 50-56 (CDR2), 57-88 (FR3), 89-97 (CDR3) 및 98-107 (FR4)로 위치되어진다.

여기에 사용된, "상보성 결정 영역" 용어는(동의어 CDRs; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3) 항체간에 다른 서열의 FRs사이에 고리(loop)를 만들어 항체 가변 도메인의 아미노산 잔기를 나타낸다. CDRs의 몇몇 또는 모두는 항체에 항원을 결합할 수 있는 능력을 준다. 각 가변 도메인은 전형적으로 CDR1, CDR2 및 CDR3로 확인된 세가지 CDR 영역을 가진다. 각 상보성 결정 영역은 Kabat 등,(1987) 에 의해 정의된 "상보성 결정 영역"으로부터 아미노산 잔기 및/또는 "과가변부위" Clothia 및 Lesk (1987), 또는 IMGT 번호 체계 (Le Franc 등, 2003)을 포함하는 어떤 다른 알려진 번호 기술 또는 그것의 조합으로부터 그것의 잔기를 포함한다.

"프레임워크 영역"(이하 FR) CDR 잔기외에 그것의 가변 도메인 잔기이다.

여기서 사용된, "불변 영역" 또는 "결정화된 단편" 또는 "Fc" 또는 "Fc 영역" 또는 "Fc 부분"(여기서 교대로 쓰일 수 있는) 용어는 적어도 하나의 불변 도메인을 포함하는 항체의 부분을 나타내며 일반적으로(비록 반드시는 아닌) 글리코실화되었고 하나 또는 그 이상 Fc 수용체 및/또는 보체 반응의 성분에 결합할 수 있는 것이다. 중쇄 불변 영역은 다섯가지 이소타입: α, δ, ε, γ, 또는 μ 중에 어느 것으로부터 선택될 수 있다. 게다가, 다양한 서브클래스(중쇄의 IgG 서브클래스와 같은)의 중쇄는 다른 효과기 기능에 책임이 있어서, 원하는 중쇄 불변 영역을 선택함으로서 원하는 효과기 기능을 가진 단백질을 생산할 수 있다. 바람직한 중쇄 불변 영역은 감마 1(IgG1), 감마 2(IgG2) 및 감마3(IgG3), 또는 그것의 혼합체이다.

"불변 도메인"은 동일한 유형, 예, IgG 또는 IgM 또는 IgE의 항체/항체에서 매우 상동한 서열 항체에서 도메인이다. 항체의 불변 영역은 일반적으로 다수의 불변 도메인을 포함한다, 예, γ, α 및 δ 중쇄의 불변 영역은 두 가지 도메인을 포함한다.

여기서 사용된, "특이적으로 결합한다" 용어는 면역글로불린이 다른 항원 또는 세포에서처럼 보다 IL-3Rα 또는 동일하게 발현하는 세포의 더 오랜 지속 및/또는 더 큰 친화도로 더 자주, 더 빠르게 반응 또는 연관함을 의미되게 하는 것이다. 이 정의를 읽음으로서, 예를 들면, IL-3Rα에 특이적으로 결합한 면역글로불린은 두번째 항원에 특이적으로 결합할 수도 있고 아닐 수도 있다. 이를테면, "특이적 결합"은 다른 항원의 독점적 결합 또는 비탐지될 수 있는 결합을 반드시 필요로 하지 않는다. 여기서 용어: 특이적으로 결합한다"는 "선택적으로 결합한다"와 교대로 쓰일 수 있다. 일반적으로, 여기서 결합은 참고로 특이적 결합을 의미하고, 각 용어는 다른 용어를 위해 명시적 지원을 제공함으로서 이해되어야 한다.

"경쟁적으로 억제한다" 용어는 면역글로불린이 7G3에 IL-3R로 지칭된 단일클론항체의 결합을 줄이거나 예방하는 것을 의미함으로서 이해되어야 한다. 면역글로불린이 단일클론항체 7G3의 결합을 완전하게 억제하는 것이 필요하다라기 보다는, 통계학적으로 유의한 양, 예를 들면, 적어도 약 10% 또는 20% 또는 30% 또는 40% 또는 50% 또는 60% 또는 70% 또는 80% 또는 90% 또는 95%로 의해 결합이 줄어드는 것만 필요함의 앞서 말한 것에서부터 명백해 질 것이다. 결합의 결정하는 경쟁적 억제는 기술 분야 및/또는 여기에 기술된 것에서 알려져 있다. 예를 들면, 면역글로불린이 있거나 없는 것 중에 하나에서 단일클론항체 7G3이 IL-3Rα에 노출된다. 면역글로불린이 없을 때보다 면역글로불린이 있을 때에서 덜 단일클론항체가 결합하다면, 면역글로불린이 단일클론항체의 결합을 경쟁적으로 억제한다고 간주한다.

두 에피토프의 문맥에서 "오버랩핑(overlapping)"에 의함은 두 에피토프는 다른 에피토프에 결합하는 면역글로불린을 경쟁적으로 억제해 한 에피토프에 결합하는 것을 허가하기 위해 면역글로불린을 아미노산 잔기의 충분한 수를 공유하는 것을 의미되어져야 한다. 예를 들면, 두 에피토프는 적어도 1 또는 2 또는 3 또는 4 또는 5 또는 6 또는 그 이상의 아미노산을 공유한다.

여기에 사용된, "중화시키다" 용어는 면역글로불린이 세포에서 IL-3 매개 신호를 줄이거나 예방 및/또는 IL-3Rα에 IL-3 결합을 줄이거나 예방 및/또는 IL-3Rα와 IL-3β(집락 자극 인자 2 수용체로 또한 알려진)의 이종이합체(heterodimer)를 할 수 있는 것을 의미되어져야한다.

여기에 참고로 "단일클론항체 7G3" 또는 "7G3"는 ATCC 접근 번호 HB-12009 및 US6177078에 기탁된 융합세포주로 지칭된 7G3에 의해 생산된 단일클론항체를 나타낸다. 단일클론항체 7G3은 또한 상업적으로, 예. BD Bioscience(NJ, USA)로부터 이용가능하다.

"카바트의 EU 번호 체계" 용어는 면역글로불린 중쇄의 번호가 Kabat 등, 1991, Sequence of Protein of Immunology Interest, 5판, United States Public Health Service, National Institues of Health, Betheda.에서 배운 EU 지침에 따른다. EU 지침은 인체 IgG1 EU 항체의 잔기 번호에 근거를 둔다.

여기서 사용된, "치료" 용어는 임상적 병리학의 과정 동안 개체 또는 세포가 치료가 되는 자연적 과정을 바꾸기 위해 만들어진 임상적 개입을 나타낸다. 치료의 원하는 효과는 질환 진행의 비율 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화 및 차도 또는 향상된 예후를 포함한다. 개체는 성공적으로 "치료되었다"는, 예를 들면, 질환(예, 낭창)과 관련된 하나 또는 그 이상의 징후가 완화 또는 제거되었을 때다.

여기에 사용된, "예방" 용어는 개체에서 질병의 발생 또는 재발 측면에서의 예방을 제공하는 것을 포함한다. 개체가 질환에 잘 걸리거나 발생하는 위험 또는 질환이 재발할 수도 있지만 질환 또는 재발이 진단되어지는 것은 아니다.

여기에 사용된, 포유류에서 질환 또는 상태 또는 그것의(예, 전신성 홍반 낭창) 재발이 일어나는 "위험이 있는", 또는 본 발명에 있어서 치료 전에 질환 및 질환의 증상이 탐지될 수도 되지 않을 수도 있고 질환 및 질환의 증상이 탐지될 수 있어 나타날 수도 있고 아닐 수도 있다. "위험이 있는"은 포유류가 기술 분야 및/또는 여기에 기술된 것으로 알려진 질환 또는 상태의 발생과 연관된 측정할 수 있는 파라미터(parameter)인 하나 또는 그 이상의 위험 요소를 가지는 것을 나타낸다.

"효과적인 양"은 용량 및 필요한 시점, 원하는 치료적 또는 예방적 결과를 달성하기 위한 최소한의 양이 효과적인 것을 나타낸다. 효과적인 양은 하나 또는 그 이상의 투여로 제공할 수 있다. 본 발명의 몇몇 실시예에서, "효과적인 양" 용어는 이전에 기술된 질환 또는 상태의 치료에 영향을 미치는 필요한 양을 의미한다. 효과적인 양은 치료될 질환 또는 상태 그리고 또한 몸무게, 나이, 인종 배경, 성별, 건강 및/또는 신체 상태 및 치료될 포유류와 관련된 다른 요소에 따라 달라질 수 있다. 전형적으로, 효과적인 양은 의사에 의해 일상적인 시도 및 실험을 통해 결정될 수 있는 상대적인 폭넓은 범위(예 "용량" 범위) 안에서 낮아질 것이다. 효과적인 양은 단일 양에서 또는 한 번 반복된 양에서 또는 치료기간에 걸쳐 여러번 투여가 될 수 있다.

"치료적으로 효과적인 양"은 특정한 장애(예, 전신성 홍반 낭창)의 측정할 수 있는 향상 효과를 미치는 것을 필요로 하는 적어도 최소한의 농도이다. 여기에 치료적으로 효과적인 양은 질환 상태, 나이, 성별, 및 환자의 몸무게, 및 개체에서 원하는 반응을 유발하기 위한 면역글로불린의 능력과 같은 요소에 따라 달라질 수 있다. 치료적으로 효과적인 양은 또한 면역글로불린의 어떤 독성 또는 유해한 효과가 치료적으로 유익한 영향에 의한 것보다 더 큰 것 하나이다.

"예방적으로 효과적인 양"은 용량 및 필요한 시점, 원하는 예방적 결과를 달성하기 위한 양이 효과적인 것을 나타낸다. 전형적으로, 하지만 반드시는 아닌, 예방적 용량은 포유류에 전에 또는 질환의 빠른 단계에 사용되기 때문에, 예방적으로 효과적인 양은 치료적으로 효과적인 양보다 덜 할 수도 있다.

여기에 사용된, "형질세포양 수지상세포" 또는 "pDC"는 IFNα 및 IFNβ과 같은 제 Ⅰ형 인터페론을 생산하는 혈액 말초 림프 기관에서 발견되는 순환하는 수지상세포의 유형이다. 인간 pDCs는 표면 표지자 IL-3Rα, BDCA-2(CD303), BDCA-4(CD304) 및 톨-유사 수용체(toll-like receptor) 7 및 9를 발현한다. 일반적으로, 인간 pDCs는 CD11c 또는 CD14를 발현하지 않는다. 전형적인 인간 pDCs 표면 표현형은 CD20^-, CD3^-, CD14^-, CD19^-, CD56^-, HLA-DR⁺, CD11c^- 및 CD123⁺이다.

여기에 사용된, "호염구"는 다양한 사이토카인(예, IL-4, IL-6, IL-13), 히스타민(histamine) 및 류코트리엔(leukotriens)을 생산하는 과립구의 드문 유형이다. 인간 호염구는 IL-3Rα, FcεR1, CD49b, CD69 또는 CD203과 같은 세포 표면 표지자를 발현한다.

"순수 항체" 용어는 또다른 화합물 예,독성 화합물 또는 방사선표지로 컨쥬게이트(conjugate)되지 않은 항체를 나타낸다. 명명법의 목적에 대해서만 제한되지 않는, IL-3Rα사슬의 아미노산 서열은 유전자 ID 접근 번호 3563 및/또는 서열번호: 1에서 배웠다.

본 발명에 따라 치료된 "포유류"는 영장류, 가축(예, 양, 말, 소, 돼지, 당나귀), 반려동물(예, 개 및 고양이와 같은 애완동물), 실험용 동물(예, 마우스, 토끼, 백서(rats), 기니피그(guinea pigs)), 공연동물(예, 경주마, 낙타, 그레이하운드(greyhound)) 또는 사로잡힌 야생동물일 수 있다. 한 실시예에서, 포유류는 인간이다.

면역글로불린

본 발명의 방법에서 바람직한 면역글로불린에 적합한 용도는 여기에 기술된 것 및 다음 단락에 추가적 바람직한 면역글로불린을 기술한다.

한 실시예에서, 면역글로불린은 IFNα 분비의 유발자와 접촉되어진 PBMC로부터 IFNα 분비를 줄일 수 있다. 예를 들면, PBMC는 CpG 올리고뉴클레오티드, 예, 제 Ｃ형 CpG 올리고뉴클레오티드와 같은 톨 유사 수용체(TLR)-7/9 작용제에 노출된다. 예를 들면, 세포는 1μM 또는 2μM 또는 3μM 또는 4μM 또는 5μM의 농도로 제 Ｃ형 CpG 올리고뉴클레오티드와 접촉한다. 한 실시예에서, IFNα의 수준은 면역글로불린이 없거나 이소타입 대조 면역글로불린(예, 그것은 IL-3Rα와 결합하지 않는다)이 있는 수준과 비교해 줄어든다. 한 실시예에서, IFNα의 수준은 약 50% 또는 적어도 60% 또는 적어도 70% 또는 80% 또는 적어도 90%로 줄어든다. 예를 들면, 면역글로불린은 0.04㎍/㎖에서 4㎍/㎖, 예를 들면 0.1㎍/㎖에서 약 1㎍/㎖와 같은 0.01㎍/㎖에서 약 15㎍/㎖의 농도로 IFNα에서 감소의 달성을 이룰 수 있다.

다른 실시예에서, 면역글로불린은 말초혈액단핵구(PBMC)의 집단에서 탐지할 수 있는 형질세포양 수지상세포(pDCs) 및/또는 호염구의 수를 줄일 수 있다. 한 실시예에서, pDCs 및/또는 호염구의 수는 면역글로불린이 없거나 이소타입 대조 면역글로불린(예, 그것은 IL-3Rα와 결합하지 않는다)이 있는 수준과 비교해 줄어든다. 한 실시예에서, pDCs 및/또는 호염구의 수는 약 50% 또는 적어도 60% 또는 적어도 70% 또는 80% 또는 적어도 90%로 줄어든다. 한 실시예에서, 면역글로불린은 면역글로불린에 PBMC가 접촉한 후 4시간 안에 또는 면역글로불린에 PBMC가 접촉한 후 24시간 안에 또는 면역글로불린에 PBMC가 접촉한 후 48시간 안에 pDCs 및/또는 호염구를 줄일 수 있다.

추가적 실시예에서, 면역글로불린은 2㎎/㎏ 이내의 양 예, 1㎎/㎏ 이내의 양 또는 0.1㎎/㎏ 이내의 양으로 적어도 7일 단일 투여 후에 대한 포유류(예, 시노몰로구스 원숭이와 같은 비인간 영장류)의 순환에서 호염구 및/또는 pDCs의 수를 줄일 수 있다. 예를 들면, 호염구 및/또는 형질세포양 수지상세포(pDCs)의 수는 면역글로불린의 투여 전에 세포 수의 70%(또는 80% 또는 90% 또는 95%)이하로 줄어든다. 한 실시예에서, 세포 수는 말초 혈액에서 총 세포의 백분율로서 계산된다. 예를 들면, 세포는 적어도 8일 또는 10일 또는 11일에 줄어든다. 예를 들면, 형질세포양 수지상세포(pDCs)의 수는 적어도 8일 또는 9일 또는 10일 또는 11일 또는 12일 또는 13일 또는 14일 또는 15일에 줄어든다. 한 실시예에서 pDCs의 수는 적어도 11일에 줄어든다. 예를 들면, 호염구의 수는 적어도 5일 또는 6일 또는 7일 또는 8일 또는 9일 또는 10일에 줄어든다. 한 실시예에서, 호염구의 수는 적어도 8일에 줄어든다.

추가적 실시예에서, 면역글로불린은 40㎎/㎏ 이내의 양 예, 30㎎/㎏ 이내의 양 또는 10㎎/㎏ 이내의 양으로 적어도 7일 단일 투여 후에 대한 포유류(예, 시노몰로구스 원숭이와 같은 비인간 영장류)의 순환에서 호염구 및/또는 pDCs의 수를 줄일 수 있다. 예를 들면, 호염구 및/또는 pDCs의 수는 면역글로불린의 투여 전에 세포의 수의 70%(또는 80% 또는 90% 또는 95%)이하로 줄어든다. 한 실시예에서, 세포 수는 말초 혈액에서 총 세포의 백분율로서 계산된다. 예를 들면, 세포는 적어도 21일 또는 22일 또는 30일 또는 35일 또는 40일 또는 49일 또는 50일 또는 57일 또는 63일 또는 65일 또는 70일에 줄어든다. 예를 들면, pDCs의 수는 적어도 12일 또는 13일 또는 14일 또는 15일 또는 16일 또는 17일 또는 18일 또는 19일 또는 20일에 줄어든다. 한 실시예에서 pDCs의 수는 적어도 15일에 줄어든다. 예를 들면, 호염구의 수는 적어도 12일 또는 13일 또는 14일 또는 15일 또는 16일 또는 17일 또는 18일 또는 19일 또는 20일 또는 21일 또는 22일 또는 23일 또는 24일 또는 25일 또는 26일 또는 27일 또는 28일에 줄어든다. 한 실시예에서, 호염구의 수는 적어도 15일(예, 10㎎/㎏ 용량 후) 또는 22일(예, 30㎎/㎏용량 후)에 줄어든다.

한 실시예에서, 면역글로불린은 포유류(예, 시노몰로구스 원숭이와 같은 비인간 영장류)에 투여할 때 중성구 및/또는 T 세포 및/또는 B 세포 및/또는 단핵구 및/또는 적혈구 세포의 수를 감소 또는 제거되지 않는다. 예를 들면, 면역글로불린은 면역글로불린의 투여 전 수준과 비교해 약 10% 또는 20% 또는 30% 또는 40% 또는 50% 이상 또는 통계학적으로 유의한 양으로 중성구 및/또는 T 세포 및/또는 B 세포 및/또는 단핵구 및/또는 적혈구 세포의 수를 감소 또는 제거되지 않는다. 예를 들면, 면역글로불린은 중성구 및/또는 T 세포 및/또는 B 세포 및/또는 단핵구 및/또는 적혈구 세포의 죽음을 유발하지 않는다.

항체

한 실시예에서, 어느 실시예에 따라 여기에 기술된 면역글로불린은 항체이다.

항체 생성을 위한 방법은 발명에 속한 기술 분야 알려진 및/또는 Harlow and Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)에 기술된 것이다. 일반적으로, IL-3Rα 단백질 또는 면역성 단편 또는 그것의 에피토프 또는 세포가 동일하게 발현하고 나타내는(즉, 면역원)것의 이런 방법에서, 선택적으로 어느 적합한 또는 원하는 운반체, 보강제 또는 약학적으로 허용가능한 첨가제는 비인간 동물, 예를 들면, 마우스, 닭, 백서, 토끼, 기니피그, 개, 말, 소, 염소 또는 돼지에 투여된다. 면역원은 비강내, 근육내, 피하내, 정맥내, 피내, 복강내, 또는 다른 알려진 경로로 투여될 수 있다.

다클론항체의 생산은 면역접종 후 다양한 시점에서 면역화된 동물의 혈액 샘플링(sampling)에 의해 관찰(monitor) 된다. 원하는 항체 역가의 달성이 필요하면, 하나 또는 그 이상의 추가적 면역접종이 주어질 수 있다. 부스팅(boosting) 및 타이터링(titering)의 과정이 적절한 역가가 될 때까지 반복된다. 면역원성의 원하는 수준이 얻어질 때, 면역화된 동물을 출혈시켜서, 혈청을 분리하고 저장 및/또는 동물을 단일클론항체(Mab)를 생성시키는데 사용한다. 단일클론항체는 본 발명에 의해 고려된 항체의 한가지 대표적인 형태이다. "단일클론항체" 또는 "MAb" 용어는 동일한 항원, 예를 들면, 항원 안에 동일한 에피토프와 결합할 수 있는 동종의 항체 집단을 나타낸다. 이 용어는 항체의 출처 또는 그것이 만들어진 방식에 대해서 제한하는 것을 의도하지 않는다.

Mabs 생산을 위한 알려진 기술의 많은 것 중에 어느 하나가 예를 들면, US4196265 또는 Harlow 및 Lane (1988), 앞에서 예를 든 절차가 사용될 수 있다.

예를 들면, 적절한 동물은 항체 생산 세포를 자극하기 위해 충분한 상태하에 면역원와 함께 면역접종된다. 토끼, 마우스 및 백서와 같은 설치류가 바람직한 동물이다. 인간 면역글로불린 단백질을 표현하는 유전자 공학에 의해 생성된 마우스 및, 예를 들면, 쥐과 면역글로불린 단백을 발현하지 않는, 또한 본 발명(예, WO2002/066630에 기술된)의 항체를 생성하는데 사용되어질 수 있다.

면역접종 후, 항체를 생산하는 잠재적인 체세포는, 특히 B 림프구(B 세포), MAb 생성 프로토콜(protocol)에서 용도를 위해 선택된다. 이런 세포는 비장, 편도선 또는 림프절의 생검, 또는 말초 혈액 샘플로부터 얻을 수 있다. 면역화된 동물로부터의 B 세포는 그리고 나서 죽지 않는 골수종 세포, 일반적으로 면역원으로 면역화된 동물에서의 동일한 종으로부터 유래한 세포와 융합한다.

혼성체는 조직 배양 배지에서 뉴클레오티드의 신생 합성을 막는 약제를 포함하는 선택적 배지 배양에 의해 증폭된다. 바람직한 약제는 아미노프테린(aminopterin), 메토트렉사트(methotrexate) 및 아자세린(azaserine)이다.

증폭된 혼성세포는 예를 들면 유동 세포 계측법 및/또는 면역조직화학법 또는 면역분석(예 방사선 면역분석, 효소 면역분석, 세포독성 분석, 플라크(plaque) 분석, 점 면역분석, 등)에 의해 항체 특이성 및/또는 가역에 대한 기능적인 선택을 하기 쉽게 한다.

선택적으로, ABL-MYC 기술(NeoClone, Madison WI 53713, USA)이 세포주 분비의 MAbs(예, Largaespada et al, J. Immunol. Methods. 197: 85-95, 1996에 기술된) 생산을 위해 사용된다.

항체는 또한 디스플레이 라이브러리(display library), 예, 파지 디스플레이 라이브러리(phage display library), 예, US6300064 및/또는 US5885793에 기술된 탐색에 의해 생산되고 분리될 수 있다.

한 실시예에서, 항체는 US 6,177,078에 기술된 7G3, 6H6 또는 9F5이다. 이런 항체의 변형판(예, 여기에 기술된 방법에 의해 탈면역화, 키메라 또는 인간화 판)은 또한 고려된다.

키메라 항체

면역글로불린은 합성 면역글로불린일 것이다. 한 실시예에서 여기에 기술된 항체는 키메라 항체이다. "키메라 항체" 용어는 특정 종(예, 마우스와 같은 쥐과)으로부터 유래한 항체에 해당하는 서열 또는 특정 항체 집단 또는 서브클래스에 속하는 상동하거나 유사한 중쇄 및/또는 경쇄의 부분의 항체를 나타내지만, 사슬의 나머지는 다른 종(예, 인간과 같은 영장류)으로부터 유래한 항체에 해당하는 서열에 상동한 또는 다른 항체 집단 또는 서브클래스에 속하는 상동하거나 유사하다. 전형적으로 키메라 항체는 설치류 및 토끼 가변 영역 및 대부분 인간 도메인인 항체를 생산하기 위해, 인간 불변 영역을 이용한다. 키메라 항체 생산을 위한 방법은 예, US4816567; 및 US5807715에 기술되어있다.

본 발명은 또한 어느 한 종으로부터 가변 영역과 또 다른 한 종으로부터 단백질의 영역이 융합된 키메라 면역글로불린을 포함한다. 예를 들면, 발명은 어느 한 종의 T 세포 수용체로부터 가변영역과 서로 다른 종으로부터 T 세포 수용체 불변 도메인이 융합된 것을 포함하는 면역글로불린을 고려한다.

인간화된 및 인간 항체

본 발명의 항체는 인간화 또는 인간일 것이다.

"인간화 항체" 용어는 비인간 종의 항체로부터 유래한 항원 결합 부위 또는 가변 영역 및 구조에 기반한 분자의 나머지 항체 구조 및 인간 항체의 서열을 가지는 키메라 항체의 서브클래스를 나타내어지는 것으로 이해될 수 있다. 항원 결합 부위는 인간 항체의 가변 영역에서 적절한 FRs가 비인간 항체에 접목 및 인간 항체로부터 나머지 영역으로부터 상보성 결정 영역을 포함한다. 항원 결합 자리는 야생형 또는 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환에 의해 변형된 것일 수 있다. 몇몇 경우, 인간 면역글로불린의 FR 잔기는 해당하는 비인간 잔기에 의해 교체된다.

비인간 항체 또는 그것의 일부(예, 가변영역)를 인간화시키는 방법은 기술 분야에서 알려져있다. 인간화는 US5225539, 또는 US5585089의 방법에 따라 수행할 수 있다. 항체를 인간화시키기 위한 다른 방법은 배제되지 않는다.

항체와 관련하여 여기에 사용된 "인간 항체" 용어는 가변영역(예 V_H, V_L) 및, 선택적으로 인간, 예. 인간 생식세포 또는 체세포에서 발견된 서열에서 유래한 불변 영역 또는 해당하는 것을 가지는 항체를 나타낸다. "인간" 항체는 인간 서열 예 체외(보전적 치환 또는 항체 예 항체 잔기의 1, 2, 3, 4 또는 5에서, 예 항체의 CDRs의 하나 또는 그 이상을 차지하는 잔기의 1, 2, 3, 4 또는 5에서) 잔기의 적은 수에서의 돌연변이에서 임의 또는 특정부위 돌연변이에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기를 포함한다. 이런 "인간 항체"는 사실 인간에 의해 생산되어질 필요가 없는, 오히려, 그것이 재조합을 사용하여 생산할 수 있는 것을 및/ 또는 인간 항체 불변 및/또는 가변 영역(예, 위에 기술한)을 암호화하는 핵산을 포함하는 형질전환 동물(예, 마우스)로부터 분리된 것을 의미한다. 인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리(예, US5885793에 기술된)를 포함하는, 기술 분야에 알려진 여러가지 기술을 사용하여 생산될 수 있다.

선택된 에피토프를 인식하는 인간 항체는 또한 "유도된 선택(guided selection)"으로 나타낸 기술을 사용해 생성할 수 있다. 이 접근 방식에서 선택된 비인간 단일클론항체는, 예, 마우스 항체, 동일한 에페토프(US5565332)를 완전히 인식하는 인간 항체의 유도된 선택이 사용된다.

탈면역화된 항체 및 면역글로불린

본 발명은 또한 탈면역화된 항체 또는 단백질을 고려한다. 탈면역화된 항체 및 단백질은 하나 또는 그 이상의 에피토프 예, B 세포 에피토프 또는 T 세포 에피토프는 포유류가 항체 또는 단백질에 대해 면역반응을 일어나게 할 가능성을 줄이기 위해 제거(돌연변이)된다. 탈면역화된 항체 및 단백질을 생산하기 위한 방법은 기술 분야에서 알려져 있고 예를 들면, WO00/34317, WO2004/108158 및 WO2004/064724에서 기술되어 있다.

적절한 돌연변이를 도입 및 유발 및 그 결과 단백질을 분석하기 위한 방법은 여기에 설명에 기반을 둔 숙련된 전문가에서 명백해질 것이다.

중쇄 항체

중쇄 항체는 구조적으로 많은 다른 형태의 항체와 다르다, 그것이 중쇄를 포함하는 한, 하지만 경쇄를 포함하지 않는다. 따라서, 이런 면역글로불린을 또한 "중쇄만의 항체"라고 나타낸다. 중쇄 면역글로불린은 예를 들면, 카멜리드 및 연골성 생선(또한 IgNAR라고 불리는)에서 발견된다.

자연적으로 발생하는 중쇄 항체에서 존재하는 가변 영역은 전통적인 4-사슬 항체("V_H 도메인"으로 나타낸)에 존재하는 중쇄 가변 영역 및 전통적인 4-사슬 항체("V_L 도메인"으로 나타낸)과 구별하기 위해서, 일반적으로 카멜리드 항체에서 "V_HH 도메인" 및 IgNAR에서 V-NAR로 나타낸다.

카멜리드로부터 중쇄 항체의 일반적인 설명 및 그것의 가변 영역 및 그것의 생산 및/또는 분리 및/또는 용도를 위한 방법은 그 중에서도 다음 참고문헌 WO94/04678, WO97/49805 and WO 97/49805에서 발견된다.

연골성 생선으로부터 중쇄 항체의 일반적인 설명 및 그것의 가변 영역 및 그것의 생산 및/또는 분리 및/또는 용도를 위한 방법은 그 중에서도 WO2005/118629에서 발견된다.

항체 단편

단일-도메인 항체

몇몇 실시예에서, 발명의 면역글로불린은 단일-도메인 항체("도메인 항체" 또는 "dAb" 용어로 교대로 쓰일 수 있는)이다 또는 포함한다. 단일-도메인 항체는 전체 또는 항체의 중쇄 가변 도메인 부분을 포함하는 단일 폴리펩티드 사슬이다. 특정 실시예에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체(Domantis, Inc., Waltham, MA; 참조하라, 예, US6248516)이다.

이량체, 삼량체, 사량체

몇몇 실시예에서, 발명의 면역글로불린은 WO98/044001 및/또는 WO94/007921에 기술된 그것처럼 이량체, 삼량체, 사량체 또는 더 높은 고차 단백질 복합체이다 또는 포함한다.

예를 들면, 이량체는 V_L-X-V_H 또는 V_H-X-V_L 구조를 포함하는 두 개가 연관된 폴리펩티드, 각 폴리펩티드 사슬로 구성된 단백질이다, 상기의 V_L은 경쇄 가변 영역 항체이고, V_H은 중쇄 가변 영역 항체이고, X는 연관(Fv를 형성)시키기 위해 단일 폴리펩티드 사슬에서 V_H 및 V_L를 가능하게 위해 불충분한 잔기를 포함하는 연결자(linker)이거나 없는, 그리고 상기 하나의 펩티드 사슬의 V_H는 항원 결합 부위를, 예, 하나 또는 그 이상의 항원과 특이적으로 결합할 수 있는 Fv 분자를 형성하기 위해, 형성하기 위해 다른 폴리펩티드 사슬의 V_L과 결합한다. V_L 및 V_H는 각 폴리펩티드 사슬에서 동일할 수 있거나 V_L 및 V_H는 이중특이성 이량체(예, 다른 특이성을 가지는 2개의 Fvs를 포함하는)를 형성하기 위해서 각 폴리펩티드 사슬에서 다를 수 있다.

효과기 활성을 유발할 수 있는 이량체, 삼량체, 사량체, 등은 IL-3R에 결합할 수 항원 결합 도메인 및 면역세포 예, T 세포(예, CD3)에 대해 세포 표면 분자에 결할 수 있는 항원 결합 도메인을 사용하여 생산할 수 있다.

단일 사슬 Fv(ScFv) 단편

숙련된 기술자는 항원 결합(즉, 단일 폴리펩티드 사슬의 V_H 및 V_L에 대하여 Fv를 형성하기 위해 서로서로 연관된다)에 대해 scFv가 원하는 구조를 형성할 수 있게 V_H 및 V_L 사이에 단일 펩티드 사슬 및 폴리펩티드 연결자에서 V_H 및 V_L 영역을 포함하는 scFVs라는 것을 인식할 게 될 것이다. 예를 들면, 연결자는 scFv에 더 선호하는 연결자 중에 하나로(Gly4Ser)로 이루어진 12개의 아미노산 이상을 포함한다.

본 발명은 또한 안정한 Fv를 얻을 수 있는 이황화 결합에 의해 연결된 V_H의 FR 및 V_L의 FR 및 시스테인 잔기로 도입된 단일 시스테인 잔기는 이황화가 Fv(또는 diFv 또는 dsFv)를 안정화시킨다.

추가적으로, 또는 그밖에, 본 발명은 이량체 scFv, 즉, 비공유 또는 공유결합 예, 류신 지퍼 도메인(leucine zipper domain) (예, Fos 또는 Jun에 의해 유래한)에 의해 결합된 두 scFv 분자로 이루어진 단백질을 포함한다. 혹은, 두 scFvs는 예, US20060263367에 기술된 항원에 scFvs가 형성 및 결합 둘 다 가능하게 하기 위해서 충분한 길이의 펩티드에 의해 연결된다.

본 발명은 또한 효과기 활성을 유발할 수 있는 이량체 scFv를 포함한다. 예를 들면, 하나의 scFv는 IL-3R에 결합하고 다른 scFv는 면역세포 예, T 세포(예, CD3)에 대한 세포 표면 분자에 결합한다. 한 실시예에서, 이량체 단백질은 dAb 및 scFv의 결합이다. 이중 특이성 항체 단편은 예를 들어, US7235641에 기술된 효과기 기능을 유발할 수 있다. 본 발명은 또한 효과기 활성을 유발할 수 있는 이량체 scFv를 포함한다. 예를 들면, 하나의 scFv는 IL-3R에 결합하고 다른 scFv는 면역세포 예, T 세포(예, CD3)에 대한 세포 표면 분자에 결합한다. 한 실시예에서, 이량체 단백질은 dAb 및 scFv의 결합이다. 이중 특이성 항체 단편은 예를 들어, US7235641에 기술된 효과기 기능을 유발할 수 있다.

다른 항체 및 항체 단편

본 발명은 또한 다음의 다른 항체 및 항체 단편, 예를 들어:

(i) US5,731,168에 기술된 "키 앤 홀(key and hole)" 이중 특이성 단백질;

(ii) US4, 676,980에 기술된 예, 헤테로컨쥬게이트(heteroconjugate) 단백질;

(iii) US4,676,980에 기술된 예, 화학적 가교제를 사용하여 생산한 헤테로컨쥬게이트 단백질; 및

(iv) Fab(예, EP19930302894에 기술된)를 고려한다.

Fc 영역

본 발명은 Fc에 융합된 면역글로불린의 항원 결합 단편을 포함하는, 항체의 Fc를 이루는 면역글로불린을 포함한다.

본 발명의 단백질을 생산하기 유용한 Fc 영역의 서열은 많은 다른 출처로부터 얻어질 수 있다. 몇몇 실시예에서, Fc 또는 단백질 그것의 부분은 인간 항체로부터 유래한다. 게다가, Fc 또는 그것의 부분은 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE 및 IgG1, IgG2 IgG3 및 IgG4를 포함하는 어떤 항체 이소타입을 포함하는 어떤 항체 종류로부터 유래한다. 한 실시예에서, Fc는 인간 이소타입 IgG1 또는 인간 이소타입 IgG2 또는 인간 이소타입 IgG3 또는 앞서 말한 것의 어떤 혼성체이다.

한 실시예에서, Fc 영역은 효과기 기능을 유발할 수 있다. 예를 들면, Fc 영역은 인간 IgG1 또는 IgG2 Fc 영역이다. 또 다른 실시예에서, Fc 영역은 IgG1 및 IgG2 Fc 영역의 혼성체 또는 IgG1 및 IgG3 Fc 영역의 혼성체 또는 IgG2 및 IgG3의 혼성체이다. 인간 IgG1 및 IgG2 Fc 영역의 바람직한 혼성체는 Chappel et ah, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 88: 9036-9040, 1991에 기술되어져있다.

Fc 영역이 효과기를 유발할 수 있는지 없는지를 결정하는 방법은 숙련된 기술자 및/또는 여기에 기술된 것에 의해 명백해 질 것이다.

효과기 기능

적합하게, 본 발명의 방법에서 항 IL-3Rα 면역글로불린에 적합한 용도는 효과기 기능을 활용하게 하거나 적어도 부분적인 제거, 상당한 제거 또는 IL-3Rα⁺형질세포양 수지상 세포를 제거하는 것을 가지게 하거나 나타나게 한다. 이런 효과기 기능은 Fc 수용체, 항체 의존 세포 매개성 세포독성(ADCC), 항체 의존 세포 매개성 식세포(ADCP) 및/또는 항체 의존 세포독성(CDC)에 결합 친화도를 향상시킬 수 있다.

여기에 명세서에 근거한 숙련된 기술자에 의해 명백해질 것인, 본 발명의 몇몇 실시예에서 효과기 기능을 유발할 수 있는 면역글로불린을 사용한다.

한 실시예에서, 면역글로불린은 이러한 ADCC와 같은 효과기 기능을 유발할 수 있는 방식으로 IL-3Rα에 결합한다.

한 실시예에서, 면역글로불린은 ADCC와 같은 기능을 유발할 수 있는 IL-3Rα 내 에피토프에 결합한다.

또 다른 실시예에서, 면역글로불린은 포유류에서 pDC 및/또는 호염구에 대해 IL-3Rα에 결합할 수 있게함으로서 ADCC와 같은 효과기 기능을 유발한다.

예를 들면, 면역글로불린은 ADCC와 같은 효과기 기능을 유발하기에 충분한 시간 동안 세포의 표면에 IL-3Rα에 결합하여 남아 있다. 예를 들면, 면역글로불린은 ADCC를 유발할 수 있도록 너무 빨리 내재화되지 않는다.

추가적으로, 또는 그밖에, 면역글로불린은 면역글로불린의 Fc 영역에 결합하고 ADCC와 같은 효과기 기능을 유발하는 면역 효과기 세포를 허용하는 방식으로 세포의 표면에 IL-3Rα에 결합된다. 예를 들면, 면역글로불린의 Fc 영역은 면역글로불린은 면역 효과기 세포에 Fc 수용체(예, FcγR)와 상호작용할 수 있는 IL-3Rα에 결합되어 있는 방식으로 노출된다. 본 발명의 문맥에서, "면역 효과기 세포" 용어는 ADCC 또는 ADCP에 결합된 세포를 죽일 수 있고 Fc 수용체를 발현하는 어떤 세포로 이해되어질 수 있을 것이다.

면역글로불린의 효과기 기능과 연관된 위 단락의 각각은 CDC를 포함하여 필요한 부분만 약간 수정하여 출원되어졌다. 예를 들면, 면역글로불린은 면역글로불린에 Fc 영역에 결합및 CDC를 유발할 수 있는 방식으로 보체 성분 Clq에 있는 세포의 표면에 IL-3Rα에 결합하게된다.

한 실시예에서, Fc 영역에 의해 유발된 효과기 기능의 수준은 IgG1의 야생형 Fc 영역 또는 IgG3 항체의 야생형 Fc 영역에 상대적으로 향상되었다.

또 다른 실시에서, Fc 영역이 변형이 없는 것과 비교해 Fc 영역은 유발할 수 있는 효과기 기능의 수준을 증가시키기 위해 변형된다. 이런 변형은 아미노산 수준 및/또는 2차 구조 수준 및/또는 3차 구조 수준 및/또는 Fc 영역의 글리코실화를 할 수 있다.

한 실시예에서, 항-IL-3Ra 면역글로불린은 ch7G3(International Publication W02009/070844에서 CSL360에서 나타낸, 야생형 인간 IgG1 Fc 영역을 포함하는 7G3의 키메라 판) 또는 hz7G3(야생형 인간 IgG1 Fc 영역을 포함하는 7G3의 인간화 판)에 의해 나타낸 것보다 더 큰 효과기 기능의 수준을 가지거나 나타낸다. 본 발명 ch7G3 및 hz7G3의 문맥에서 본질적으로 효과기의 기능의 동일한 수준을 나타낸다.

숙련된 수신인은 더 큰 효과기 기능이 여러 방법 중 하나, 예를 들면, 영향의 더 큰 수준, 더 지속적 효과 또는 효과의 더 빠른 속도에 나타낼 수 있는 것에 감사할 것이다.

예를 들면, 항-IL-3Rα 면역글로불린은 항체 의존 세포 매개성 세포독성을 포함하는 효과기 기능을 가지거나 나타낸다.

한 실시예에서, Fc 영역은 향상된 효과기 기능을 유발할 수 있는 능력을 증가시키는 하나 또는 그 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 한 실시예에서, Fc 영역은 하나 또는 그 이상의 FcγRs에 더 큰 친화도로 결합한다. 한 실시예에서, Fc 영역은 FcγR가 야생형 Fc 영역보다 1배 이상 더 큰 또는 야생형 Fc 영역보다 5배 이상 더 큰 또는 야생형 Fc 영역보다 5배 및 300배 사이보다 더 큰 친화도를 가진다. 한 실시예에서, Fc 영역은 구성된 군으로부터 선택된: 카바트의 EU 지수에 의해 번호화된 230, 233, 234, 235, 239, 240, 243, 264, 266, 272, 274, 275, 276, 278, 302, 318, 324, 325, 326, 328, 330, 332, 및 335 자리에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다. 한 실시예에서, Fc 영역은 구성된 군으로부터 선택된: 카바트의 EU 지수에 의해 번호화된 P230A, E233D, L234E, L234Y, L234I, L235D, L235S, L235Y, L235I, S239D, S239E, S239N, S239Q, S239T, V240I, V240M, F243L, V264I, V264T, V264Y, V266I, E272Y, K274T, K274E, K274R, K274L, K274Y, F275W, N276L, Y278T, V302I, E318R, S324D, S324I, S324V, N325T, K326I, K326T, L328M, L328I, L328Q, L328D, L328V, L328T, A330Y, A330L, A330I, I332D, I332E, I332N, I332Q, T335D, T335R, 및 T335Y에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다. 한 실시예에서, Fc 영역은 구성된 군으로부터 선택된: 카바트의 EU 지수에 의해 번호화된 V264I, F243L/V264I, L328M, I332E, L328M/I332E, V264I/I332E, S298A/I332E, S239E/I332E, S239Q/I332E, S239E, A330Y, I332D, L328I/I332E, L328Q/I332E, V264T, V240I, V266I, S239D, S239D/I332D, S239D/I332E, S239D/I332N, S239D/I332Q, S239E/I332D, S239E/I332N, S239E/I332Q, S239N/I332D, S239N/I332E, S239Q/I332D, A330Y/I332E, V264I/A330Y/I332E, A330L/I332E, V264I/A330L/I332E, L234E, L234Y, L234I, L235D, L235S, L235Y, L235I, S239T, V240M, V264Y, A330I, N325T, L328D/I332E, L328V/I332E, L328T/I332E, L328I/I332E, S239E/V264I/I332E, S239Q/V264I/I332E, S239E/V264I/A330Y/I332E, S239D/A330Y/I332E, S239N/A330Y/I332E, S239D/A330L/I332E, S239N/A330L/I332E, V264I/S298A/I332E, S239D/S298A/I332E, S239N/S298A/I332E, S239D/V264I/I332E, S239D/V264I/S298A/I332E, S239D/V264I/A330L/I332E, S239D/I332E/A330I, P230A, P230A/E233D/I332E, E272Y, K274T, K274E, K274R, K274L, K274Y, F275W, N276L, Y278T, V302I, E318R, S324D, S324I, S324V, K326I, K326T, T335D, T335R, T335Y, V240I/V266I, S239D/A330Y/I332E/L234I, S239D/A330Y/I332E/L235D, S239D/A330Y/I332E/V240I, S239D/A330Y/I332E/V264T, S239D/A330Y/I332E/K326E, 및 S239D/A330Y/I332E/K326T에서 아미노산 치환을 포함한다.

다른 실시예에서, Fc 영역은 FcγRIIb 보다 더 효율적으로 FcγRIIa에 결합한다. 예를 들면, Fc 영역은 구성된 군으로부터 선택된: 카바트의 EU 지수에 의해 번호화된 234, 235, 239, 240, 264, 296, 330, 및 1332, 자리에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다. 한 실시예에서, Fc 영역은 구성된 군으로부터 선택된: 카바트의 EU 지수에 의해 번호화된 L234Y, L234I, L235I, S239D, S239E, S239N, S239Q, V240A, V240M, V264I, V264Y, Y296Q, A330L, A330Y, A330I, I332D, 및 I332E, 자리에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들면, Fc 영역은 선택된 군으로부터 구성된: 카바트의 EU 지수에 의해 번호화된 I332E, V264I/I332E, S239E/I332E, S239Q/I332E, Y296Q, A330L, A330Y, I332D, S239D, S239D/I332E, A330Y/I332E, V264I/A330Y/I332E, A330L/I332E, V264I/A330L/I332E, L234Y, L234I, L235I, V240A, V240M, V264Y, A330I, S239D/A330L/I332E, S239D/S298A/I332E, S239N/S298A/I332E, S239D/V264I/I332E, S239D/V264I/S298A/I332E, 및 S239D/V264I/A330L/I332E, 에서 아미노산 치환을 포함한다.

추가적인 실시예에서, Fc 영역은 야생형 Fc 영역에 의해 매개된 것보다 더 큰 수준의 ADCC를 유발한다. 예를 들면, Fc 영역은 야생형 Fc 영역에 의해 유발된 것 보다 5배 이상 또는 5배과 100배 사이의 더 큰 수준을 유발한다. 예를 들면, Fc 영역은 구성된 군으로부터 선택된: 카바트의 EU 지수에 의해 번호화된 230, 233, 234, 235, 239, 240, 243, 264, 266, 272, 274, 275, 276, 278, 302, 318, 324, 325, 326, 328, 330, 332, 및 335, 자리에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다. 한 실시예에서, Fc 영역은 구성된 군으로부터 선택된: 카바트의 EU 지수에 의해 번호화된 P230A, E233D, L234E, L234Y, L234I, L235D, L235S, L235Y, L235I, S239D, S239E, S239N, S239Q, S239T, V240I, V240M, F243L, V264I, V264T, V264Y, V266I, E272Y, K274T, K274E, K274R, K274L, K274Y, F275W, N276L, Y278T, V302I, E318R, S324D, S324I, S324V, N325T, K326I, K326T, L328M, L328I, L328Q, L328D, L328V, L328T, A330Y, A330L, A330I, I332D, I332E, I332N, I332Q, T335D, T335R, 및 T335Y, 자리에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다. 한 실시예에서, Fc 영역은 구성된 군으로부터 선택된: 카바트의 EU 지수에 의해 번호화된 V264I, F243L/V264I, L328M, I332E, L328M/I332E, V264I/I332E, S298A/I332E, S239E/I332E, S239Q/I332E, S239E, A330Y, I332D, L328I/I332E, L328Q/I332E, V264T, V240I, V266I, S239D, S239D/I332D, S239D/I332E, S239D/I332N, S239D/I332Q, S239E/I332D, S239E/I332N, S239E/I332Q, S239N/I332D, S239N/I332E, S239Q/I332D, A330Y/I332E, V264I/A330Y/I332E, A330L/I332E, V264I/A330L/I332E, L234E, L234Y, L234I, L235D, L235S, L235Y, L235I, S239T, V240M, V264Y, A330I, N325T, L328D/I332E, L328V/I332E, L328T/I332E, L328I/I332E, S239E/V264I/I332E, S239Q/V264I/I332E, S239E/V264I/A330Y/I332E, S239D/A330Y/I332E, S239N/A330Y/I332E, S239D/A330L/I332E, S239N/A330L/I332E, V264I/S298A/I332E, S239D/S298A/I332E, S239N/S298A/I332E, S239D/V264I/I332E, S239D/V264I/S298A/I332E, S239D/V264I/A330L/I332E, S239D/I332E/A330I, P230A, P230A/E233D/I332E, E272Y, K274T, K274E, K274R, K274L, K274Y, F275W, N276L, Y278T, V302I, E318R, S324D, S324I, S324V, K326I, K326T, T335D, T335R, T335Y, V240I/V266I, S239D/A330Y/I332E/L234I, S239D/A330Y/I332E/L235D, S239D/A330Y/I332E/V240I, S239D/A330Y/I332E/V264T, S239D/A330Y/I332E/K326E, 및

S239D/A330Y/I332E/K326T, 에서 아미노산 치환을 포함한다.

한 실시예에서, Fc 영역은 다음의 아미노산 카바트의 EU 지수에 의해 번호화된, S239D/I332E를 포함한다. 이 Fc 영역은 야생형 Fc 영역과 비교해 FcγRIIa에 대한 친화도가 약 14배 증가 및 야생형 Fc 영역과 비교해 ADCC를 유발할 수 있는 능력이 약 3.3배 증가하였다.

한 실시예에서, Fc 영역은 다음의 아미노산 카바트의 EU 지수에 의해 번호화된, S239D/A330L/I332E를 포함한다. 이 Fc 영역은 야생형 Fc 영역과 비교해 FcγRIIα에 대한 친화도가 약 138배 증가 및 야생형 Fc 영역과 비교해 ADCC를 유발할 수 있는 능력이 약 323배 증가하였다.

추가적인 아미노산 치환은 효과기 기능을 유발하기 위한 Fc의 능력을 증가시키는 것은 기술 분야 및 / 또는, 예를 들어, US6737056 또는 US7317091에 기술된 것에 알려져 있다.

한 실시예에서, Fc 영역의 글리코실화는 향상된 효과기 기능을 유발하는 능력을 높이기 위해 변한다. 이런 점에서, 포유류의 세포에 의해 생산된 선청성(native) 항체는 전형적으로 일반적으로 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 N-결합에 의해 연결되는 분지형(branched), 바이안테너리(biantennary) 올리고당을 포함한다. 올리고당은 다양한 탄수화물, 예를 들어, 만노오스(mannose), N-아세틸 글루코사민(GlcNAc), 갈락토오스, 및 시알산 뿐만 아니라 바이안테너리 올리고당 구조의 "줄기"에 GlcNAc에 부착 된 푸코오스를 포함할 수 있다. 몇몇 실시예서, 본 발명에 있어서 Fc 영역은 Fc 영역에 예, Fc 영역이 "비푸코실화된" 붙은(직접적으로 또는 간접적으로) 푸코오스가 결핍된 탄수화물 구조를 포함한다. 이런 변이체는 ADCC를 유발하는 향상된 능력을 가질 수 있다. 비푸코실화된 항체를 생산하기 위한 방법은 α-l,6-푸코오스 전이효소(FUT8) (예, Yumane-Ohnuki 등, Biotechnol. Bioengineer., 87: 614-622, 2004에 기술된)를 발현할 수 없는 세포주에서 면역글로불린을 발현, FUT8(예, Mori et al., Biotechnol. Bioengineer., 88: 901-908, 2004에 기술된)에 대한 짧은 길이의 간섭 유도 RNA를 발현하는 세포에서 면역글로불린을 발현, 구아노신 디포스페이트-만노오스 4,6-탈수효소(guanosine diphosphate(GDP)-mannose 4,6-dehydratase(GMD)) (예, Kanda 등, J. Biotechnol, 130: 300-310, 2007에 기술된)를 표현할 수 없는 세포에서 면역글로불린을 발현하는 것을 포함한다. 본 발명은 β-(1,4)-N-아세틸글루코사민전이효소 III ((β-(l,4)-N-acetylglucosaminyltransferase III(GnT-III)) (Umana et ah, Nat. Biotechnol, 17: 176-180, 1999에 기술된) 발현을 위해 변형된 세포주를 사용하여 생산된 푸코실화의 줄어든 수준을 가지는 면역글로불린의 용도를 고려한다.

한 실시예에서, 본 발명에 있어서 면역글로불린은 비푸코실화이다. 예를 들면, 면역글로불린은 FUT8을 발현하지 않는 세포(예, CHO 세포와 같은 포유류 세포)에서 생산된다.

다른 방법은 향상된 Fc 매개 효과기 기능(예, 바이러스 백신의 생산을 위한 오리 배아 유래 줄기세포, WO2008/129058; avian EBXcells에서 재조합 단백질 생산, WO 2008/142124)을 유발할 수 있는 항체를 본질적으로 생산하는 세포주의 용도를 포함한다.

본 발명의 방법에서 유용한 면역글로불린은 또한 예, GlcNAc에 의해 이등분 되어진 Fc에 붙은 바이안테나리 올리고당인 이등분된 올리고당을 포함한다. 이런 면역글로불린은 줄어든 푸고실화 및/또는 향상된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 이런 면역글로불린의 실시예는 예, US6602684 및 US20050123546에서 기술되어있다.

Fc 영역에 부착된 올리고당에서 적어도 하나의 갈락토오스 잔기의 면역글로불린은 또한 고려된다. 이런 면역글로불린은 향상된 CDC 기능을 가질 수 있다. 이런 면역글로불린은 WO1997/30087 및 WO 1999/22764에 기술되어있다.

ADCC 활성을 나타내는 면역글로불린의 비제한적 실시예는 여기에 지칭된 "hz7G3Vl", "hz7G3V2" 및 "hz7G3V3"로 단일클론항체를 포함한다. 효과기 기능의 수준 각각의 경우에 이러한 면역 글로불린에 의해 나타난 효과기 기능의 수준은 상대적으로 또는 ch7G3(야생형 인간 IgG1 Fc 영역을 포함하는 7G3의 키메라 형태) 또는 hz7G3 보다 더 크게 향상된다.

또 다른 비제한적 실시예에서, 항-IL-3Rα 면역글로불린은 다른 에피토프와 결합 또는 더 느린 내재화 동력학(예 ch7G3 또는 hz7G3와 비교해)의 결과로 향상된 ADCC 기능과 같은 향상된 효과기 기능을 가지는 새로운 것을 생산할 수 있다.

효과기 기능을 유발하는 면역 글로불린의 능력을 결정하고 기술 분야에서 알려진 방법은 및/또는 여기에 더 자세히 기술되어있다.

추가적인 변형

본 발명은 또한 면역글로불린에 추가적 변형을 고려한다.

예를 들면, 면역글로불린은 면역글로불린의 반감기를 증가시키는 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들면, 면역글로불린은 신생(neonatal) Fc 영역(FcRn)에 대한 Fc 영역의 친화도를 증가시키는 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환을 포함하는 Fc 영역을 구성한다. 예를 들면, Fc 영역은 엔도좀(endosome)에서 Fc/FcRn 결합을 가능하게 하기 위해 더 낮은 pH 예, 약 pH 6.0에서 FcRn에 대한 증가된 친화도를 가진다. 한 실시예에서, Fc 영역은 세포 순환 후 혈액으로 Fc의 재방출을 가능한 약 pH 7.4에서 그것의 친화도과 비교해 약 pH 6에서 FcRn에 대한 친화도를 증가시킨다. 이런 아미노산 치환은 혈액으로부터 허가(clearance)를 줄임으로서, 면역글로불린의 반감기를 연장하는데 유용하다.

바람직한 아미노산 치환은 카바트의 EU 번호 체계에 따른 T250Q 및/또는 M428L를 포함한다. 추가적인 또는 다른 아미노산 치환은 예를 들어, US20070135620에서 기술된다.

단백질 생산

한 실시예에서, 어느 실시예에 따른 여기에 기술된 면역글로불린은 여기에서 기술된 및/또는 기술분야에서 잘 알려진 면역글로불린을 생산하기 위한 충분한 조건하에 하이브리도마(hybridoma)를 배양한 것에 의해 생산된다.

재조합 발현

다른 실시예에서, 어느 실시예에 따른 여기에 기술된 면역글로불린은 재조합이다.

재조합 단백질의 경우에서, 동일한 핵산 암호화는 발현 벡터(vector)로 복제할 수 있다, 그리고 대장균(E. coli ) 세포, 효모 세포, 곤충세포같은 숙주 세포로 감염되고, 또는 원숭이 COS 세포, 중국 햄스터 난소 세포(CHO) 세포, 인간 배아 신장(HEK) 세포, 골수종 세포와 같은 포유류 세포는 다르게 면역글로불린 단백질을 생산하지 못한다. 면역글로불린을 발현하기 위해 사용된 바람직한 세포는 CHO 세포, 골수종 세포 또는 HEK 세포이다. 이런 끝을 달성하기 위한 분자 복제 기술은 기술분야에서 알려져 있고, 예를 들면 Ausubel 등, (Editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, 현재까지 모두 최신것을 포함하는) 또는 Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)에 기술되어져있다. 복제의 다양한 변화 및 체외 증폭 방법은 재조합 핵산의 구축을 위해 적합하다. 재조합 항체 생산의 방법은 또한 기술 분야에서 알려져 있다. US4,816,567 또는 US5530101를 참조.

분리 후, 핵산은 발현 구축물 또는 추가적 복제(DNA의 복제)를 위한 발현 벡터 또는 세포 비함유에서 또는 세포에서 발현을 위해 프로모터에 작동가능하게 연결되어 삽입된다.

여기에 사용된, “프로모터” 용어는 가장 넓은 문맥으로 쓰여졌고 핵산의 발현 예, 발생 및/또는 외부 자극, 또는 조직 특이적 방식을 바꾸는 추가적인 조절 요소(상위 활성 서열, 전사 인자 결합부위, 인핸서(enhancer) 및 사이런서(silencer))에 상관없이 정확한 전사 개시에 필요한 TATA 상자 또는 개시자 요소를 포함 유전체 유전자의 전사 조절 서열을 포함한다. 본 문맥에서, “프로모터” 용어는 또한 재조합, 합성 또는 융합 핵산, 또는 사용할 수 있게 연결된 핵산의 발현을 주고, 활성화 또는 향상시키는 유도체로 기술되는데 사용된다. 바람직한 프로모터는 추가적인 인핸서 발현을 위해 하나 또는 그 이상의 특이적 조절 요소의 추가 복사본 및/또는 공간 발현 및/또는 말한 핵산의 일시적 발현을 포함할 수 있다.

여기에 사용된, “작동가능하게 연결된” 용어는 핵산에 상대적인 프로모터 위치를 의미하며 핵산의 발현은 프로모터에 의해 조절받는다.

세포에서 발현을 위한 많은 벡터는 사용할 수 있다. 벡터 성분은 일반적으로, 이에 제한되지 않지만, 다음 중 하나 또는 그 이상: 신호 서열, 면역글로불린을 암호화하는 서열(예, 여기에 제공된 정보로부터 유래한), 인핸서 요소, 프로모터, 및 전사 종료 서열을 포함한다. 숙련된 기술자는 면역글로불린의 발현을 위한 적합한 서열을 알 것이다. 바람직한 신호 서열은 원핵세포 분비 신호(예, pelB, 알칼리 인산염, 페니실리네이스, Ipp, 또는 내열성독소 Ⅱ), 효모 분비 신호(예, 인버타아제 신호(invertase leader), 인자 신호, 또는 산성인산가수분해효소 신호) 또는 포유류 분비 신호 (예, 단순 포진 gD 신호)을 포함한다.

포유류 세포에서 바람직한 프로모터 활성은 사이토메갈로바이러스 즉시형 초기 프로모터(cytomegalovirus immediate early promoter(CMV-IE)), 인간 연장 인자 1-cc 프로모터(human elongation factor 1-cc promoter(EF1)), 소형 핵 RNA 프로모터(small nuclear RNA promoters(Ula and Ulb)), cc-미오신 중쇄 프로모터(cc-myosin heavy chain promoter), 유인원 바이러스 40 프로모터(Simian virus 40), 라우스 육종 바이러스 프로모터(Rous sarcoma virus promotor(RSV)), 아데노바이러스 주요 후발 프로모터(Adenovirus major late promoter), 베타 액틴 프로모터; CMV 인핸서/ 베타 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터 또는 그것의 활성 단편을 포함하는 혼성 조절 요소로 구성된다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 실시예는 SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651)에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1주; 인간 배아 신장주(현탁배양에서 생장을 위한 293 또는 서브클론(subclone)된 293 세포; 아기 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10)); 또는 중국 햄스터 난소 세포 (CHO)를 포함한다.

효모세포의 발현에 적합한 전형적인 프로모터는 예를 들면 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 및 S. 폼베(S. pombe)를 포함하는 군으로부터 선택된 효모세포, ADH1 프로모터, GAL1 프로모터, GAL4 프로모터, CUPl 프로모터, PH05 프로모터, nmt 프로모터, RPR1 프로모터, 또는 TEF1 프로모터는 포함하지만 이에 국한되지 않는다.

발현을 위해 동일한 것을 세포에 포함하는 분리된 핵산 또는 발현 구축물을 도입하기 위한 수단은 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려져 있다. 주어진 세포를 위해 사용된 기술은 알려진 성공한 기술에 달려있다. 세포에 재조합 DNA를 도입하기 위한 수단은 미세주사(microinjection), DEAE-덱스트란에 의한 형질감염, 리포펙타민(Gibco, MD, USA)을 사용한 리포솜(liposome)에 의해 매개된 형질감염 및/또는 셀펙틴(Gibco, MD, USA), 폴리에틸렌 글리콜 매개 DNA 침전법(PEG-mediated DNA uptake), 전기 충격법(electroporation) 및 다른 것들 사이에서 DNA가 부착된 텅스텐(DNA-coated tungsten) 또는 금 입자(Agracetus Inc., WI, USA)를 사용한 DNA-마이크로 입자 총 형질전환법(microparticle bombardment)을 포함한다.

면역글로불린을 생산하기 위해 사용된 숙주세포는 사용된 세포 유형에 따라서, 다양한 배지에서 배양될 수 있다. Ham's F10(Sigma), Minimal Essential Medium((MEM), (Sigma), RPM1-1640(Sigma), 및 Dulbecco's Modified Eagle's Medium((DMEM), Sigma)과 같은 상업적으로 이용할 수 있는 배지는 포유류 세포를 배양하는데 적합하다. 여기에서 논의된 다른 세포 유형을 배양하기 위한 배지는 기술분야에서 알려져 있다.

단백질 분리

면역글로불린을 정제하기 위한 방법은 기술분야 및/또는 여기에 기술된 것에 알려져 있다

면역글로불린이 배지로 분비되는데, 이런 발현 체계로부터의 상층액은 상업적으로 이용할 수 있는 단백질 농축 필터를 사용하여 일반적으로 처음 농축시킨다, 예를 들면, Amicon 또는 Millipore Pellicon 초미세여과기장치. PMSF와 같은 단백질 분해효소 저해제는 단백질 분해를 저해하기 위한 어떤 앞선 단계도 포함될 수 있고 항생제는 부정성 오염물의 성장을 예방하기 위해 포함될 수 있다.

세포로부터 준비된 면역글로불린은 예를 들면, 이온 교환, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피(hydroxyapatite chromatography), 소수성 상호반응 크로마토그래피(hydrophobic interaction chromatography), 겔 전기영동, 투석, 친화성 크로마토그래피(예, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 또는 단백질 G 크로마토그래피), 또는 앞서 말한 것 중의 어떤 결합을 사용해 정제될 수 있다. 이런 방법은 기술분야에 알려져 있고, 예를 들면 W099/57134 또는 Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988)에 기술되어져 있다.

숙련된 기술자는 또한 면역글로불린은 정제 또는 탐지 가능하기 위한 태그(tag), 예, 폴리-히스티딘 태그(poly-histidine tag), 예, 헥사-히스티딘태그(hexa-histidine tag), 또는 인플루엔자 바이러스 혈구응집소 태그(influenza virus hemagglutinin(HA) tag), 또는 유인원 바이러스 5(V5) 태그, 또는 FLAG 태그, 또는 글루타티온 S-전이효소(GST) 태그를 포함해 변형할 수 있는 것을 인식하게 될 것이다. 그 결과 면역글로불린은 그런 다음 친화성 정제와 같은 기술 분야에서 알려진 방법을 사용하여 정제된다. 예를 들면, 헥사-히스(hexa-his) 태그를 포함하는 면역글로불린은 고체 또는 반고체 매체에 특이적으로 헥사-히스 태그를 고정시킨 니켈-니트릴로트아세트산(nickel-nitrilotriacetic acid(Ni-NTA))의 면역글로불린을 포함하는 샘플을 접촉함으로서 정제되고 결합하지 않은 면역글로불린을 제거하기 위해 샘플을 씻고, 결과적으로 결합된 면역글로불린을 용출한다. 추가적으로, 또는 그밖에 태그에 결합하는 리간드(ligand) 또는 항체는 친화성 정제 방법에 사용되어진다.

면역글로불린의 활성화 시험분석

경쟁적 결합 결정

경쟁적으로 단일클론항체 7G3의 결합을 억제하는 면역글로불린을 결정하기 위한 시험은 숙련된 기술자에서 명백할 것이다. 예를 들면, 7G3는 탐지할 수 있는 표지(label), 예, 형광 표지 또는 방사성표지에 컨쥬게이트(conjugate)되어 있다. 표지된 항체 및 시험 면역글로불린은 그런 다음 혼합되고 IL-3R 또는 IL-3Rα 또는 그것의 에피토프 또는 동일하게 발현하는 세포와 접촉하게 된다. 표지된 7G3의 수준은 그런 다음 결정되고 표지된 항체가 IL-3Rα, 에피토프 또는 면역글로불린이 없는 세포와 접촉할 때 결정된 수준과 비교된다. 표지된 7G3의 수준은 면역글로불린이 없을 때와 비교해 시험 면역글로불린이 있을 때 줄어들게 되면, 면역글로불린은 IL-3Rα에 7G3의 결합이 경쟁적으로 저해되는 것으로 생각된다.

선택적으로, 시험 면역글로불린은 7G3에 다른 표지로 컨쥬게이트(conjugate)되어 있다. 이런 다른 표지는 시험 면역글로불린이 IL-3Rα 또는 에피토프 또는 세포의 결합 수준을 탐지할 수 한다.

또 다른 실시예에서, 면역글로불린은 IL-3Rα과 7G3가 접촉하기 전에 IL-3Rα에 결합할 수 있다. 면역글로불린이 있을 때 결합한 7G3의 양의 감소는 면역글로불린이 없을 때와 비교해 면역글로불린은 경쟁적으로 IL-3Rα에 7G3의 결합이 저해되었음을 나타낸다. 상호 분석도 7G3은 IL-3Rα에 결합할 수 있도록 표지된 면역글로불린을 먼저 사용하여 수행할 수 있다. 이 경우, 7G3이 있을 때 IL-3Rα에 결합된 표지된 면역 글로불린의 감소량은 7G3이 없을 때와 비교하여 면역 글로불린은 경쟁적으로 IL-3Rα에 7G3의 결합이 저해되었음을 나타낸다.

또 다른 실시예에서, 면역글로불린에 결합된 에피토프는 그것이 동일하거나 7G3에 결합된 에피토프와 오버랩핑(overlapping)을 결정하기 위해 맵(map)을 만든다. 에피토프 맵핑 방법은 숙련된 기술자로 명백해질 것이다. 예를 들면, IL-3Rα 서열을 걸쳐 겹치는 펩티드의 일련(series)은, 예, 10-15 아미노산을 포함하는 펩티드가 생산된다. 면역글로불린은 그런 다음 각 펩티드 및 결정된 것과 결합하는 펩티드와 접촉한다. 이것은 면역글로불린이 결합하는 에피토프를 포함하는 펩티드의 결정할 수 있다. 여러 비연속 펩티드는 면역글로불린에 의해 결합되면, 면역글로불린은 입체형태(conformational) 에피토프와 결합할 수 있다.

추가적으로, 또는 그밖에, IL-3Rα안에서 아미노산 잔기는 예, 알라닌 검사 돌연변이, 및 면역글로불린 및/또는 7G3 결합을 줄이거나 방지한 돌연변이를 결정한 것에 의해 돌연변이된다. 면역글로불린의 결합을 줄이거나 방지한 어떤 돌연변이는 면역글로불린에 의해 결합된 에피토프 내에서 될 수 있다.

추가적으로, 또는 그밖에, 면역글로불린은 7G3을 결합할 수 있는 에피토프를 사용하여 생산하여 동일한 에피토프에 결합할 가능성이 있다.

선택적으로, IL-3R 또는 그것의 에피토프에 대한 면역글로불린 해리상수(Kd)는 결정된다. IL-3Rα 결합 면역글로불린에 대한 "Kd" 또는 "Kd 값"은 방사성 표지된 IL-3Rα 결합 분(RIA)에 의해 측정된 실시예이다. 이 방법은 표지되지 않은 IL-3Rα의 역가 일련이 있을때에 방사성 IL-3Rα의 최소한 농도의 면역글로불린 균형을 유지하게 한다. 결합하지 않은 IL-3Rα를 제거하기 위해 씻은 후, 방사능의 양이 단백질의 Kd를 나타내는 것으로 결정된다.

또 다른 실시예에 따르면 Kd 또는 KD 값은 표면 플라즈몬 공명 분석(surface plasmon resonance assays) 예, 고정된 IL-3Rα와 BIAcore 표면 플라즈몬 공면(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)을 사용해 측정하였다.

몇몇 실시예에서, IL-3Rα에 결합하기 위해 경쟁할 가능성이 있기 때문에 상동한 Kd 또는 7G3보다 더 높은 Kd를 가지는 단백질이 선택된다.

중화 결정

본 발명의 몇몇 실시예에서, 면역글로불린은 IL-3 신호를 중화시킬 수 있다.

다양한 측정은 수용체를 통해 리간드의 신호를 중화할 수 있는 면역글로불린의 능력을 평가하기 위한 기술 분야에서 알려져 있습니다.

한 실시예에서, 면역글로불린은 3Rα 사슬 및/또는 IL-3Rα 및 IL-3RP 사슬의 체인의 이종이합체에 IL-3 결합을 감소 또는 방지할 수 있다. 표지된 IL-3 및/또는 표시 면역 글로불린을 사용하여 여기에 기술된 이러한 분석은 경쟁적 결합 분석으로 수행할 수 있다.

다른 실시예에서, 면역글로불린은 호염구로부터 방출되는 IL-3 매개 히스타민을 감소시키거나 방지한다. 예를 들면, 호염구를 포함하는 저밀도 백혈구는 IgE, IL-3 및 면역글로불린의 다양한 농도에서 배양된다. 대조 세포는 면역글로불린(양성 대조) 또는 IL-3(음성 대조)를 포함하지 않는다. 방출된 히스타민의 수준은 그런 다음 표준 기술, 예, RIA를 사용하여 평가한다. 양성 대조보다 적은 수준으로 히스타민 방출의 수준을 감소시킨 면역 글로불린은 IL-3 신호를 중화시키 것으로 생각된다. 한 실시예에서, 감소의 수준은 면역 글로불린 농도와 상관되어있다. IL-3 매개 히스타민 방출을 평가하기 위한 바람직한 방법은 예를 들어, Lopez et ah, J. Cell. Physiol, 145: 69, 1990에 기술되어 있다.

추가적인 실시예에서, 면역글로불린은 백혈병 세포주 TF-1의 IL-3 매개 분열을 감소 또는 방지한다. 예를 들면, TF-1 세포는 분열(예, 24-48 시간)을 멈추기 위해 TF-1 세포가 충분한 시간 동안 IL-3 또는 GM-CSF없이 배양된다. 세포는 그런 다음 IL-3이 있을 때 및 면역글로불린의 다양한 농도에서 배양된다. 대조 세포는 면역글로불린(양성 대조) 또는 IL-3(음성 대조)를 포함하지 않는다. 세포 분열은 그런 다음 표준 기술 예, 3H-티민(thymidine) 편입을 사용하여 평가한다. 양성 대조보다 적은 수준으로 IL-3가 있을 때 세포 분열을 감소 또는 방지한 면역 글로불린은 IL-3 신호를 중화시키는 것으로 생각된다.

IL-3 신호 중화를 평가하기 위한 다른 분석은 면역글로불린이 내피세포에서 IL-3매개 효과를 감소 또는 방지하는지 여부를 결정하는 것을 포함한다. 예를 들면, 인간 제대 혈관 내피 세포(HUVECs)는 IL-3(선택적으로, IFN-γ와 함께)가 있을 때 및 면역글로불린의 다양한 농도에서 배양된다. 분비된 IL-6의 양은 그런 다음, 예, 효소면역측정(ELISA)를 사용하여 평가한다. 대조 세포는 면역글로불린(양성 대조) 또는 IL-3(음성 대조)를 포함하지 않는다. 양성 대조보다 적은 수준으로 IL-3가 있을 때 IL-6 생산을 감소 또는 방지한 면역 글로불린은 IL-3 신호를 중화시키는 것으로 생각된다.

IL-3 신호의 중화를 평가하기 위한 다른 방법은 본 발명에 고려된다.

효과기 기능 결정

ADCC 활성을 평가하기 위한 방법은 기술 분야에 알려져 있다.

한 실시예에서, ADCC 활성의 수준은 ⁵¹Cr 방출 분석, 유로퓸(europium) 방출 분석 또는 ³⁵S 방출 분석을 사용하여 평가된다. 이런 방법의 각각에서, IL-3Rα를 발현하는 세포는 한 번에 열거된 화합물의 하나 또는 그 이상 및 세포에 의해 흡수되는 화합물에 대한 충분한 조건에서 배양된다. ³⁵S방출 분석의 경우에서, IL-3Rα을 발현하는 세포는 새롭게 합성된 단백질에 편입될 수 있게 표지된 아미노산에 대해 충분한 시간 동안 ³⁵S 표지된 메티오닌(methionine) 및/또는 시스테인에서 배양된다. 세포는 그런 다음 면역글로불린이 있을 때 또는 없을 때와 면역 효과기 세포 예, 말초혈액단핵구(PBMC) 및/ 자연살해(NK) 세포가 있을 때에서 배양된다. 세포 배양 배지에서 ⁵¹Cr, 유로퓸의 양 및/또는 ³⁵S가 그런 다음 탐지되고, 면역글로불린이 없을 때와 비교해 면역글로불린이 있을 때 증가는 면역글로불린이 효과기 기능을 가지고 있는 것을 나타낸다. 면역글로불린에 의해 유발된 ADCC의 수준을 평가하기 위한 측정의 바람직한 출판물은 Hellstrom, 등. Proc. Natl Acad. Sci. USA 55:7059-7063, 1986 및 Bruggemann, 등, J. Exp. Med. 166:1351-1361, 1987.을 포함한다.

면역글로불린에 의해 유발된 ADCC의 수준을 평가하기 위한 다른 분석은 ACTI^TM 유동세포계수법에 대한 비방사선 세포독성 분석(CellTechnology, Inc. CA, USA) 또는 CytoTox 96 비방사선 세포독성 분석(Promega, WI, USA)을 포함한다.

추가적으로, 또는 그밖에, 면역글로부린의 효과기 기능은 US7317091에 기술된 하나 또는 그 이상의 FCγRs에 대한 그것의 친화도를 결정함으로서 평가된다.

C1q 결합 분석은 또한 면역글로불린이 C1q와 결합할 수 있고 CDC를 유발할 수 있는 것을 확인하기 위해서 수행될 수 있다. 보체 활성화를 평가하기 위해서, CDC 분석이 수행될 수 있다(참조하라, 예를 들면, Gazzano-Santoro 등, J. Immunol. Methods 202: 163, 1996.

치료 효능 평가

체외 분석

다양한 체외 분석은 여기에 기술된 질환 또는 상태 예, 낭창을 치료하기 위한 면역글로불린의 능력을 평가할 수 있다.

예를 들면, pDCs 및/또는 호염구 또는 동일하게 구성된 세포 집단(예, PBMC)은 면역글로불린이 있을 때 또는 없을 때에서 배양되고 질환 또는 상태에서 발생한 이런 세포의 유발 인자(예를 들면, CpG 올리고뉴클로티드 및/또는 낭창의 경우에서 면역 복합체)이다. 질환 또는 상태를 치료하는데 면역글로불린의 효능은 그런 다음 ELISA를 사용하여 세포 배양 배지로 분비된 IFN의 수준을 결정함으로서 평가된다. 추가적으로 또는 그밖에 히스타민 분비 또는 IL-4, IL-6의 수준 및/또는 IL-13 분비가 평가된다. 면역글로불린이 없을 때(또는 이소타입 대조 면역글로불린이 있을 때)와 비교해 이런 사이토카인의 어떤 수준의 감소는 면역글로불린이 질환 또는 상태를 치료하는데 적합하다는 것을 나타낸다. 추가적으로, 또는 그밖에, 세포사의 수준이 평가된다. 세포사(특히, 위 배경의 다른 세포 유형 죽음 탐지 증가가 없을 때 pDC 및/또는 호염구 세포사) 의 증가는 면역글로불린이 질환 또는 상태를 치료하는데 적합하다는 것을 나타낸다. 위에서 설명한 바와 같이. 이 점에서, 이러한 IFNα와 같은 사이토카인은 일부 질환/상태, 예, 낭창에서 역할을 한다고 생각된다. 따라서, IFNα 생산을 줄이는 면역 글로불린은 이러한 상태를 치료하는데 적합한 것으로 생각된다.

체내 분석

한 실시예에서, 질환 또는 상태를 치료하기 위한 면역글로불린의 효능은 체내 분석을 사용하여 평가된다.

예를 들면, 면역글로불린은 비인간 동물(예, 비인간 영장류)에 투여되고 순환에서 pDCs 및/또는 호염구의 수/수준이 평가된다. 이전에 투여 및/또는 면역글로불린을 투여하지 않은 대조 포유류와 배교해 형질세포양 수지상세포(pDCs) 및/또는 호염구의 수/수준이 감소한 면역글로불린은 질환 또는 상태를 치료하는데 적합한 것으로 생각된다.

또 다른 실시예에서, IFNα와 같은 사이토카인의 수준은 예, ELISA를 사용하여 포유류의 순환에서 탐지된다. 이전에 투여 및/또는 면역글로불린을 투여하지 않은 대조 포유류와 비교하여 pDCs 및/또는 호염구의 수/수준이 감소한 면역글로불린은 질환 또는 상태를 치료하는데 적합한 것으로 생각된다. IFNα와 같은 사이토카인은 일부 질환/상태, 예, 낭창에서 역할을 한다고 생각되기 때문에, IFNα 생산을 줄이는 면역 글로불린은 이러한 상태를 치료하는데 적합한 것으로 생각된다.

또 다른 실시예에서, 면역글로불린은 낭창의 비인간 포유류(예, 비인간 영장류) 모델에 투여된다. 예를 들면, 전신 홍반성 낭창으로 고통 받는 인간으로부터 혈장을 시노모구스 원숭이와 같은 비인간 영장류에 전신 홍반성 낭창(예, Pincus et al., Clin. Immunol., 105: 141-154, 2002에 기술된)의 모델을 생산하기 위한 충분한 시간과 조건하에 주입한다. 면역글로불린은 비인간 영장류에 투여되고 전신 홍반성 낭창 징후에 대한 그것의 효과를 여기에 기술된 분석을 사용하여 평가된다. 예를 들면, 항dsDNA 항체 및/또는 면역 복합체의 수준이 평가된다. 하나 또는 그 이상의 전신 홍반성 낭창 징후를 줄이는 면역글로불린은 전신 홍반성 낭창을 치료하는데 적합한 것으로 생각된다.

치료할 상태

본 발명의 방법에 의해 치료할 질환 또는 상태는 제 1형 인터페론에 의해 전형적으로 연관된 또는 부분적으로 유발된 또는 매개된 및/또는 고갈, 제거, 제 1형 인터페론 및/또는 호염구가 생산하는 수지상세포의 적어도 부분적인 제거에 반응하는 것이다. 적합하게, 질환 또는 상태는 전신 홍반성 낭창(SLE), 쇼그렌스 증후군 및 전신 피부경화증(SSc)를 포함하는 피부경화증으로부터 선택된다.

한 실시예에서, 질환 또는 상태는 낭창이다. 예를 들면, 질환 또는 상태는 원반상 낭창, 아급성 피부형 홍반성 낭창, 약물 유발성 낭창, 신생아 낭창, 낭창성 신염 또는 전신 홍반성 낭창이다.

특정한 질환 또는 상태는 전신 홍반성 낭창이다.

한 실시예에서, SLE는 혈청 반응 양성의 SLE, 예, 자가항체에 의해 특징되어지지 않는다. 따라서, 한 실시예에서, 본 발명의 방법은 추가적으로 , 예, 여기에 기술된 것들과 같은 자가항체가 없을 때 탐지함으로서 혈청 반응 양성의 SLE로 고통 받는 포유류에서 확인하는 것을 포함한다.

또 다른 실시예에서, SLE는 혈청 반응 양성의 SLE이다. 예를 들면, 전신 홍반성 낭창은 항-핵 항체(anti-nuclear antibodies (ANA)), 항-C1q 항체, 항-이중가닥 DNA(dsDNA) 항체, 항-Sm 항체, 항-핵 리보핵단백질 항체, 항-인지질 항체, 항-리보솜 P antibodies, 항-Ro/SS-A 항체, 항-Ro 항체, 및 항-La 항체와 같은 자가항체에 의해 특징되어진다. 따라서, 한 실시예에서, 추가적으로 본 발명의 방법은 혈청 반응 양성의 SLE, 예, 여기에 기술된 그것처럼 자가항체가 있을 때를 탐지함으로서 고통 받는 포유류를 확인하는 것을 포함한다.

자가항체를 탐지하기 위한 방법은 숙련된 기술자로 명백해 질 것이다. 예를 들면, 대상으로부터의 혈청 또는 혈장 샘플을 항원 예, dsDNA 항원-항체 복합체를 형성하기에 충분한 시간과 조건하에서 함께 접촉한다. 그 결과 그런 다음 탐지된 표지의 양에 복합체를 형성하기 위한 시간 및 조건에 따라 포유류의 항체(예, 항-FC 항체)에 결합할 수 있는 표지된 항체와 접촉한다. 표지의 탐지는 자가항체가 있다는 것을 나타낸다.

어느 실시예에 따라서 여기에 기술된 방법은 추가적으로 질환 또는 상태를 가지는 것 또는 질환 또는 상태의 재발 발생의 위험이 있는 것을 근거로 치료에 대한 포유류 선택을 포함한다. 이런 상태 및 질환의 특정 실시예는 위에 기술되어져 있다.

예를 들면, 낭창 또는 낭창 발생의 위험 또는 그것의 재발을 가지는 개체는 자가항체, 예, 위에 기술된 탐지에 근거로 확인될 수 있다.

SLE의 진단은 게다가 또는 추가로 현재 American College of Rheumatology(ACR) 기준 및/또는 하나의 British Isles Lupus Activity Group(BILAG)의 "A" 기준 또는 두가지 BILAG "B" 기준 및/또는 European Consensus Lupus Activity Measure(ECLAM) 및/또는 Lupus Activity Index(LAI) 및/또는 National Institutes of Health SLE Index Score(SIS) 및/또는 Systemic Lupus Activity Measure(SLAM) 및/또는 SLE disease activity index(SLEDAI)에 의해 정의될 수 있는 활동적인 질환에 따를 수 있다. Tan 등 Arth Rheum 25, 1982로부터 개작된 SLE을 진단하기 위해 사용된 몇몇 증상, 징후, 또는 다른 지표는 볼 발진 같은 뺨 발진, 원반상 발진, 또는 붉게 부어오른 부분, 일광에 반응같은 광민감성은 피부 발진, 코 또는 입에서 궤양과 같은 구강 궤양, 두 개 또는 그 이상의 주변 관절(관절 주변 뼈가 파괴되지 않는 관절염)을 포함하는 비부식성 관절염과 같은 관절염, 장막염, 늑막염, 심낭염, 소변(0.5 gm/일 또는 시험 막대에 대한 3+)에서 과도한 단백질과 같은 신장병 및/또는 세포 주형(cellular casts) (소변 및/또는 흰색 세포 및/또는 신장 세관 세포로부터 유래한 비정상적인 요소), 신경학적 증상, 징후, 또는 다른 지표, 발작(경련), 및/또는 약물이 없을 때 정신병 또는 이런 영향으로 유발하는 것으로 알려진 대사장애, 그리고 혈액학적 증상, 징후, 또는 용혈성 빈혈 또는 백혈구 감소증(입방 밀리미터 당 4,000 세포 아래의 백혈구 수치) 또는 림프구 감소증(입방 밀리미터 당 1,500 림프구 이하) 또는 혈소판 감소증(입방 밀리미터 당 100,000 혈소판 이하)과 같은 다른 지표의 발생 또는 증가를 초래한다. 백혈구 감소증 및 림프구 감소증은 두 가지 또는 그 이상의 경우에 대해 탐지되어야 한다. 혈소판 감소증은 그것을 유발할 수 있다고 알려진 약물이 없을 때에 탐지되어야 한다. 본 발명은 이러한 증상, 징후 또는 낭창의 다른 지표에 국한되지 않는다.

한 실시예에서, 포유류는 예, 앞서 한 측정 중 하나 또는 그 이상에 의해 심각한 SLE부터 고통받는 것으로 진단되었다.

낭창의 재발로 고통받는 위험에 포유류는 또한 앞선 징후의 하나 또는 그 이상을 나타내고 이전에 낭창의 징후로 고통받는다.

추가적으로 또는 그밖에, 낭창의 재발로부터 고통받는 위험에 포유류는 낭창으로부터 고통받는 것으로 알려져 있고 에스트로겐 치료 및/또는 설폰아미드(sulphonamide) 약물 및/또는 인터페론으로 치료할 수 있다.

한 실시예에서, 대상은 쇼요르겐스 증후군(Sjorgen's syndrome)로 고통받고 있다. 여기에 기술된 각 실시예는 쇼요르겐스 증후군 치료에 필요한 부분만 약간 수정하여 적용할 수 있다.

쇼요르겐스 증후군은 자가항체(예, 항-핵 항체(예, SSA/깨 및 SSB/La), 류마티스성 인자, 알파-포드린(alpha-Fodrin) 및/또는 항-갑상선 항체), 안구 건조, 침샘 염증 및/또는 빈혈을 탐지하여 진단(쇼요르겐스 증후군으로부터 고통받는 대상이 선택될 수 있다) 할 수 있다.

한 실시예에서, 쇼요르겐스 증후군은 낭창과 연관되어 있다. 즉, 낭창으로부터 고통 받은 대상에서 발생한다.

한 실시예에서, 대상은 피부경화증으로 고통받고 있다. 여기에 기술된 각 실시예는 피부경화증 치료에 필요한 부분만 약간 수정하여 적용할 수 있다.

한 실시예에서, 피부경화증은 제한 전신 피부경화증 또는 확산 전신 피부경화증과 같은 전신 피부경화증이다.

피부경화증은 자가항체(예, 항-토포이소머라아제 항체 (피부경화증의 확산 전신 형태에서), 항-중심체(centromere) 항체(피부경화증의 제한 전신 형태에서), 항-U3 항체 또는 항-RNA 중합효소 항체), 피부를 단단하게 하거나 특히, 손가락, 발, 얼굴 및 목에 대한 피부의 경화를 초래할 수 있는 피부의 국소적 또는 광범위한 염증의 신호를(피부가 빨개짐, 부음, 유연함, 가려움, 및 고통) 탐지함으로서 진단(또는 피부경화증으로부터 고통받는 대상이 선택된다)되어질 수 있다.

한 실시예에서, 피부경화증은 예, 낭창으로부터 고통받는 대상에서 발생하는 낭창과 관련있다.

한 실시예에서, 포유류는 질환 또는 상태를 치료하기 위해 사용된 다른 화합물의 치료에 저항하고, 적절하게 반응하지 않거나 적합하지 않다. 예를 들면, 포유류는 코르티코스테로이드 및/또는 면역억제제 및/또는 항말라리아제 및/또는 아자시오프린(azathioprine) 및/또는 사이클로포스파미드(cyclophosphamide) 및/또는 마이코페노레이트 모페틸(mycophenolate mofetil) 및/또는 메토트렉사트(methotrexate) 및/또는 항-TNF 항체 및/또는 항-CD20 항체 및/또는 항-IL6 항체 및/또는 항-CD22 항체의 치료에 저항하고, 적절하게 반응하지 않거나 적합하지 않다.

조성물

적합하게, 포유류에 항-IL-3Rα 면역글로불린의 투여를 위한 조성물 또는 방법에서, 면역글로불린은 기술 분야에서 이해되어지는 약학적으로 허용가능한 운반체, 희석제 및/또는 첨가제와 결합한다. 따라서, 본 발명의 한 실시예는 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 첨가제와 결합하는 항-IL-3Rα를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 다른 실시예에서, 발명은 포유류에 투여하기 전 면역글로불린과 결합 또는 혼합에 적합한 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 첨가제를 포함하는 키트를 제공한다. 이 실시예에서, 키트는 사용에 대한 지시사항을 추가로 포함할 수 있다.

일반적인 용어에서 “담체, 희석제 또는 첨가제”에 의함은 어떤 포유류, 예, 인간에 안전하게 투여될 수 있는 고형 또는 액상 필러(filler), 고착제, 희석제, 캡슐화 물질, 유화제, 습윤제, 용제, 현탄제, 코팅 또는 윤활제를 의미한다. 투여의 특정 경로에 의하여, 기술 분야에서 얄려진 다양한 허용가능한 담체, 희석제 또는 첨가제는 예를 들어 Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co. N.J. USA, 1991)에 기술된 것으로 사용될 수 있다.

실시예의 방법으로만, 담체, 희석제 또는 첨가제는 당(예, 수크로오스, 말토오스, 트레할로오스, 글루코오스), 전분, 셀룰로오스 및 그것의 유도체, 맥아, 젤라틴, 활석, 황산칼슘, 채소 기름을 포함한 기름, 합성 기름 및 합성 모노-(mono-) 또는 디-글리세리드(di-glycerides), 저급 알코올, 폴리올스(polyols), 알긴산(alginic acid), 인산 완충 용액, 스테아린산 나트륨 또는 마그네슘과 같은 윤활제, 등장성 식염수 및 발열성물질 무함유 물을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 예를 들면, 담체, 희석제 또는 첨가제는 비경구 투여에 맞거나 적합하다. 비경구 투여는 소화관을 통하지 않은 투여의 어느 경로를 포함한다. 비경구 투여의 비제한 실시예는 주사, 주입 등등을 포함한다. 실시예의 방법으로, 주사에 의한 투여는 정맥내, 동맥내, 근육내 및 피하 주사를 포함한다. 또한 예를 들면 , 피내, 근육내 및 피하로 전달될 수 있는 데포(depot) 또는 점진적 감소 제제의 전달이 고려된다.

조합 요법

한 실시예에서, IL-3Rα에 결합하는 면역글로불린은 질환 또는 상태, 예, 낭창(SLE과 같은)을 치료하기 위해 유용한 다른 화합물과 조합하거나, 조합된 또는 추가적 치료 단계 또는 치료 제제의 추가적인 조성물 중에 하나로 투여된다.

예를 들면, 다른 화합물은 항염증 화합물이다. 추가적으로, 또는 그밖에, 다른 화합물은 면역억제제이다. 추가적으로, 또는 그밖에, 다른 화합물은 프레드니손(prednisone) 및/또는 프레드니솔론(prednisolone)과 같은 코르티코스테로이드(corticosteroid)이다. 추가적으로, 또는 그밖에, 다른 화합물은 하이드록시클로로퀸(hydroxychloroquine) 또는 클로로퀸(chloroquine)과 같은 항말라리아 화합물이다. 추가적으로, 또는 그밖에, 다른 화합물은 아자시오프린(azathioprine)이다. 추가적으로, 또는 그밖에, 다른 화합물은 사이클로포스파미드(cyclophosphamide)이다. 추가적으로, 또는 그밖에, 다른 화합물은 마이코페놀레이트 모페틸(mycophenolate mofetil)이다. 추가적으로,　또는 그밖에, 다른 화합물은 항-CD20 항체(예, 리툭시맵(rituximab) 또는 오파투무맵(ofatumumab))이다. 추가적으로,　또는 그밖에, 다른 화합물은 항-CD22 항체(예, 에프라투주맵(epratuzumab))이다. 추가적으로,　또는 그밖에, 다른 화합물은 항-TNF 항체(예, 인플릭시맵(inflixmab) 또는 아달리무맵(adalimumab) 또는 골리무맵(golimumab))이다. 추가적으로,　또는 그밖에, 다른 화합물은 항-CTLA-4 항체 (예, 아바타셉트(abatacept) 또는 CTLA4-Ig) 또는 골리무맵(golimumab))이다. 추가적으로,　또는 그밖에, 다른 화합물은 항-IL-6 항체이다. 추가적으로,　또는 그밖에, 다른 화합물은 항-BLys 항체(예, 벨리무맵(belimumab))와 같은 BLys 길항제이다.

투여의 용량과 시간

질환 또는 상태 또는 그것의 재발의 예방 또는 치료를 위해서, 활성제(예, 항-IL-3Rα 면역글로불린)의 적절한 용량은, 치료할 질환의 유형, 질환의 심각성 및 과정, 면역글로불린이 예방이든지 치료 목적이든지, 예전 요법, 환자의 병력과 면역글로불린에 반응 및 담당의사의 재량에 달려 있을 것이다. 특정한 투여 방법, 즉, 용량, 시간, 및 반복은, 특정한 개인 및 내과 의사에 의해 평가된 개인의 병력에 달려 있을 것이다. 전형적으로, 임상의는 용량이 원하는 결과에 이를때가지 면역글로불린을 투여할 것이다.

본 발명의 방법은 포유류에서 낭창(예, SLE)과 같은 질환 또는 상태의 징후를 치료, 개선 또는 예방을 위해서 또는 포유류의 예후를 향상시키기 위해서 유용하다. 낭창으로부터 고통받는 포유류에서 삶의 질이 향상될 수 있고, 낭창의 증후가 면역글로불린으로 치료 후 감소하거나 제거될 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 낭창 발생의 위험 또는 그것의 재발이 개체에서 발생을 늦추거나 예방하는데 유용하다.

여기에 기술된 면역글로불린의 체내 투여에 대해서, 하루에 정상 용량은 개체의 몸무게에 약 10ng/kg 에서 100mg/kg까지 또는 그 이상으로 다양할 수 있다. 바람직한 용량 및 그것의 범위는 여기에 기술되어있다. 수일 또는 더 이상 반복된 투여에 대해, 질환의 심각성 또는 치료할 병에 따라서, 치료는 증후의 원하는 억제가 달성될 때까지 유지될 수 있다.

몇몇 실시예에서, 면역글로불린은 약 1mg/kg에서 약 10mg/kg, 또는 약 2mg/kg 또는 약 3mg/kg 또는 4mg/kg 또는 5mg/kg까지와 같은 약 1mg/kg에서 약 30mg/kg 사이의 초기(또는 부하) 용량에 투여된다. 면역글로불린은 그런 다음 약 0.0005mg/kg에서 약 1mg/kg까지와 같은 0.0001mg/kg에서 약 1mg/kg 사이의 유지용량으로 투여될 수 있다, 예를 들면, 약 0.005mg/kg에서 약 1mg/kg와 같은0.001mg/kg에서 약 1mg/kg, 예를 들면 약 0.2mg/kg 또는 0.3 mg/kg 또는 0.4mg/kg 또는 0.5mg/kg과 같은 약 0.1 mg/kg에서 1mg/kg까지. 유지용량은 매 10-15일, 예를 들면, 매 10 또는 11 또는 12 또는 13 또는 14 또는 15일과 같은 매 7-30일로 투여될 수 있다.

몇몇 실시예에서, 면역글로불린은 약 0.0005mg/kg에서 약 50mg/kg사이에서와 같은 0.0001mg/kg에서 약 50mg/kg 사이에서 투여된다, 예를 들면, 0.001mg/kg에서 약 45mg/kg사이, 예를 들면, 0.05mg/kg에서 35mg/kg 사이에서와 같은 0.005mg/kg에서 약 40mg/kg. 예를 들면, 면역글로불린은 약 0.2mg/kg 또는 0.3mg/kg 또는 0.4mg/kg 또는 0.5mg/kg(예, 더 높은 부하 용량 없이)과 같은 약 0.1mg/kg에서 약 1mg/kg와 같은 약 0.01mg/kg에서 약 1mg/kg의 용량에 투여된다. 몇몇 실시예에서, 많은 용량이 투여된다, 예, 매 7-30일, 예를 들어, 매 10-22일, 예를 들면 매 10-15일, 예를 들면, 매 10 또는 11 또는 12 또는 13 또는 14 또는 15 또는 16 또는 17 또는 18 또는 19 또는 20 또는 21 또는 22일. 예를 들면, 면역글로불린은 매 7일 또는 매 14일 또는 매 21일 투여된다.

몇몇 실시예에서, 면역글로불린은 약 1mg/kg에서 약 10mg/kg사이에서와 같은 1mg/kg에서 약 30mg/kg 사이에서 투여된다, 또는 약 10mg/kg, 또는 약 2mg/kg 또는 3mg/kg 또는 4mg/kg 또는 5mg/kg 또는 약 10mg/kg에서 30mg/kg사이와 같은, 약 10mg/kg 또는 15mg/kg 또는 20mg/kg 또는 25mg/kg(예, 더 낮은 유지용량 없이). 몇몇 실시예에서, 많은 용량이 투여된다, 예, 매 10-70일, 예를 들어, 매 14-70일, 예를 들면 매 14-60일, 예를 들면, 매 14-40일 또는 매 14-30일과 같은 매 14-50일. 예를 들면 용량은 매 14 또는 21 또는 25 또는 28 또는 35 또는 40 또는 42 또는 49 또는 50 또는 55 또는 57 또는 63 또는 70일. 예를 들면, 면역글로불린은 매 21일 또는 매 28일 또는 매 35일 또는 매 42일 또는 매 49일 또는 매 56일 투여된다.

몇몇 실시예에서, 개시 요법의 시간에, 포유류는 7일 연속 또는 6일 연속 또는 5일 연속 또는 4일 연속 이내로 면역글로불린을 투여한다.

치료에 적절하게 반응하지 않는 포유류의 경우, 일주일에 여러 용량이 투여될 수 있다. 추가적으로, 또는 그밖에, 증가하는 용량이 투여될 수 있다.

다른 실시예에서, 부작용을 경험하는 포유류에 대해, 초기(또는 부하) 용량은 일주일안에 많은 날 또는 많은 날 연속으로 나눠질 수 있다.

특정한 면역글로불린을 위한 용량은 면역글로불린의 하나 또는 그 이상 투여한 포유류에서 경험적으로 결정될 수 있다. 면역글로불린의 효능을 평가하기 위해, 질환 또는 상태, 예, 낭창(SLE와 같은)의 임상적 증후가 관찰될 수 있다.

본 발명의 방법에 따른 면역글로불린의 투여는 예를 들면, 환자의 생리학적 상태에 따라 지속적 또는 간헐적일 수 있다, 투여의 목적은 치료적 또는 예방적인지 및, 다른 인자는 숙련된 의사로 알려진다. 면역글로불린의 투여는 미리 정한 시점을 통해 본질적으로 연속될 수 있거나 간격을 둔 용량, 예, 낭창(SLE와 같은)의 발생 동안이거나 후 둘 중에 하나의 일련일 수 있다.

한 실시예에서, 면역글로불린은 SLE의 심각성을 평가하는 점수에서 예, BILAG 기준 및/또는 ECLAM 및/또는 LAI 및/또는 SIS 및/또는 SLAM 및/또는 SLEDAI 감소를 달성하기 위해 투여된다. 예를 들면, 면역글로불린 치료는 BILAG 및/또는 SLEDAI에 따른 일 또는 이 또는 삼 점에서 감소를 달성한다. 예를 들면, 감소는 개시 요법 후 15주 또는 개시 요법 후 30주 또는 개시 요법 후 52 주에 달성된다. 예를 들면, 효과는 개시요법 후 약 20주 또는 30주 또는 40주 또는 50주 동안 유지된다.

제한 없는 실시예

실시예에서 사용된 항체 지칭은 다음: (i) 항-IL-3Rα 마우스 단일클론 항체(7G3로 지칭); (ii) 인간 IgG1 불변 도메인 7G3의 키메라 판(ch7G3로 지칭); (iii) 7G3의 인간화 IgG1 판(hz7G3로 지칭); (iv) Xencor V90을 포함하는 7G3의 인간화 판, S239D/I332E, G1/G2 Fc 변형(hz7G3Vl로 지칭); (v) Xencor V209를 포함하는 7G3의 인간화 판, S239D/I332E/A330L G1/G2 Fc 변형(hz7G3V2로 지칭); 및 (vi) CHO 세포주가 결핍된 푸코실전이효소를 사용하여 생산한 hz7G3의 비푸코실화 판(hz7G3V3로 지칭).

실시예 1

IL -3Rα의 발현

PBMC는 표준 기술을 사용한 인간 및 계통 특정 세포 표면 표지에 결합하는 항체를 사용하여 분리한 다양한 세포 계통으로부터 확인한다. 세포당 IL-3Rα 분자의 수 Quantibrite™ 비드(beads) (BD Biosciences) 사용은 각 계통을 통해 결정된다. 도 1에 보여진, IL-3Rα는 pDCs 및 호염구에서 높게 발현되어 있고 시험한 다른 세포 계통에서 낮은 수준이다. 이런 제한된 발현 형태는 IL-3Rα를 선택적으로 pDCs 및 호염구를 제거하기 위해 설계된 항체를 위한 유용한 대상으로 만든다.

실시예 2

체외에서 인간 pDCs 의 항- IL -3R mAb 제거

말초혈액단핵구(PBMC)는 Ficoll™ 분리에 의해 정상 기증자로부터 분리되고 항체(항체 아닌) 없이 RPMI/10% FCS에 여러 시간에 37℃, 10 μg/ml 항-ch7G3 또는 10 μg/ml 항-hz7G3V3과 함께 배양된다. 1 x 10^6 세포가 일상적으로 96웰(well) U자형 판에서 200ul로 배양한다. 형질세포양 수지상세포(pDCs) 수 및 호염구 수의 분석은 유동 세포 분석법(각각, 표 1 및 2)에 의해 결정된다. 인간 pDCs는 계통 표지자 음성(CD20^-, CD3^-, CD14^-, CD19^- CD56^-), HLA-DR 양성, CD11c 음성 및 IL-3Rα 양성(흐름도표에서 열린 상자(gated box) 참조)으로서 유동 세포분석법에 의해 확인된다. 인간 호염구는 계통 표지자 음성(CD20^-, CD3^-, CD14^-, CD19^- CD56^-), IgE 양성 및 IL-3Rα 양성으로서 유동 세포분석법에 의해 확인된다. Fc 도메인(hz7G3V3)에서 변형을 포함하는 항-IL-3Rα 항체는 PBMC로부터 pDCs 및 호염구를 4시간 후 추가처럼 빨리 제거되고 pDC 및 호염구 제거를 최대 48시간 후 추가로 유지한다. 향상된 효과기 기능(ch7G3)없이 항-IL-3R 항체의 추가는 24시간 및 48시간 후 추가로 관찰된 줄어든 형질세포양 수지상세포(pDc)수를 초래한다. 하지만 관찰된 효과는 hz7G3V3에 대한 관찰된 그것보다 실질적으로 이하이고 실질적으로 48시간에 pDCs가 완전히 제거되지 않았다.

	pDCs(배양에서 남아있는 총 세포의 % )
	4시간	24시간	48시간
대조(항체없음)	0.14	0.05	0.07
ch7G3	0.1	0.02	0.005
hz7G3V3	0.008	0	0

항체 치료 후 세포 배양에서 호염구 백분율

	호염구(배양에서 남아있는 총 세포의% )
	4시간	24시간	48시간
대조(항체없음)	0.66	1.08	1.94
hz7G3V3	0.25	0.07	0

실시예 3

비인간 영장류에서 pDCs 및 호염구의 체내 항-IL-3Rα 제거

비-GLP 사이노몰구스 비인간 영장류(NHP) 연구는 표준 작업 절차서에 따라서 Australian National Primate Facility에서 행해졌다. 모든 프로토콜(protocol) 및 개정은 Institutional Animal Care and Use Committee에 의해 승인받았다. 순한 원숭이는 정맥 주입을 통해 항체 효과기 기능을(hz7GV3) 향상된 Fc 도메인이 변형된 중화하는 항-IL-3Rα의 단일 용량을 투여한다. 말초 혈액은 여러 시점에서 수집하고 NHP 호염구 및 pDCs의 분석은 유동 세포분석법에 의해 뿌려진다. NHP 호염구는 IgE+/CD123 양성으로서 유동 세포분석법에 의해 확인된다. pDCs는 계통 표지자 음성(CD20, CD3 ,CD14 , CD19, CD56), HLA-DR 양성, CD11c 음성 및 IL-3Rα 양성으로서 유동 세포분석법에 의해 확인된다.

hz7G3V3의 투여는 모든 용량에 말초 혈액에서 6시간 후 항체 투여처럼 분명히 빠르게 호염구와 pDCs의 수가 상당히 감소하게 된다. 이 감소는 11일(호염구) 또는 15일(pDcs) 둘 중에 하나에서 세포 유형 모두의 용량 의존적 복귀 전 8일에 걸쳐 유지된다(도 2).

시험한 어떤 다른 세포 유형(중성구, T 세포, B 세포, 단핵구 및 적혈구)에서 유의한 감소는 모든 용량에서 어떤 원숭이에서 관찰되지 않았고 부작용이 관찰되지 않았다. 이러한 자료는 체내에 투여했을 때 hz7G3V3이 선택적으로 pDCs 및 호염구를 고갈하고 pDc 및 호염구 집단은 hz7G3V3이 체계로부터 제거될 때 회복할 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예 4

항- IL -3R mAbs 의 ADCC 활성 체외 비교

인간 pDCs 및 자연 살해 세포는 제조업체의 설명으로 음성 선택 키트를 사용하여 두 건강한 버피 코트(buffy coats)로부터 분리된다.

특정 용해은 다음 계산에 의해 결정된다:

특정 용해 = [샘플 용해 - 자연 용해] / [최대 용해 자연 용해] × 100 %.

최대 용해는 0.75 %의 최종 농도(v/v)에 Extran ™의 추가에 의해 평가된다. 자연 용해는 세포만 있는(Ab 없는) 웰에서 발생한 것이다.

pDC 용해의 유의한 수준은 항-IL-3Rα항체 hz7G3에 비교해 향상된 ADCC를 위해 만들어진 항-IL-3Rα mAbs와 함께 관찰된다.

실시예 5

항- IL -3Rα mAbs 에 의한 인터페론 생산의 저해

말초혈액단핵구(PBMC)는 정상 기증자로부터 분리하고 37℃에 18시간 동안 항체 없이(0 ㎍/㎖), 항-IL-3R 항체 hz7G3의 증가하는 용량(1, 10 또는 100 ㎍/㎖) 또는 항체 효과기 기능(hz7G3V3 및 hz7G3Vl)이 향상된 Fc 도메인에서 변형을 포함하는 항-IL-3R과 함께 배양한다. 제 Ｃ형 CpG 올리고뉴클레오티드(5 μM)는 형질세포양 수지상세포를 활성시키기 위해 첨가된다. 상층액은 6시간 또는 24시간 후 활성 둘 중에 하나를 수집하고 ELISA로 IFNα 생산을 측정한다. 도 4에서 보여진, 항체 hz7G3의 첨가는 IFNα 생산에서 적은 감소를 초래하고, 이 효과는 항체의 증가된 용량에 의해 영향을 받는 것으로 나타나지 않는다. 반대로, Fc 도메인에서 변형을 포함하는 항-IL-3Rα 항체의 추가는 항체의 모든 용량에서 6시간 및 24시간 후 활성 둘 다의 PBMC로부터 IFNα 생산이 상당히 줄어든다.

추가적인 연구에서, PBMC는 정상 기증자로부터 분리하고 37℃에 18시간 동안 항체 없이 또는 hz7G3V3의 증가하는 농도 또는 이소타입 대조 항체와 함께 배양한다. 제 C형 CpG 올리고뉴클레오티드(5 μM)은 pDCs를 활성시키기 위해 첨가된다. 상층액은 24시간 후 활성을 수집하고 ELISA로 IFNγ 생산을 측정한다. hz7G3V3의 첨가는 PBMC로부터 IFNα 생산을 상당히 줄인다. hz7G3V3의 pDCs의 체외 결핍은 TLR-7/9 리간드, CpG로 처리한 PBMC로부처 IFNα 생산의 억제와 연관있다(도 5). PBMC에 CpG의 첨가는 대부분 TLR-7/9 길항제인 크로마틴 조성물을 포함한 SLE 면역 복합체에 상동한 방식으로 IFNα 생산을 유발한다. 이런 자료는 hz7G3V3가 말초 혈액 세포에서 TLR-7/9 길항제에 의해 유발된 IFNα의 출저를 효과적으로 제거할 수 있다는 것을 나타낸다. 자료는 또한 말초 혈액에서 다른 세포 유형은 hz7G3V3가 TLR-7/9 자극에 반응하는 IFNα 생산에 대한 pDCs의 손실을 보충할 수 없어서 표지되지 않는다.

추가적인 연구는 IFNα 수준에 대한 세포 고갈의 영향을 결정하기 위해 수행되었다. PBMC는 정상 기증자로부터 분리되었고 37℃에 18시간 동안 항체 없이(0㎍/㎖), 항체 효과기 기능(hz7G3V3)이 향상된 Fc 도메인에서 변형을 포함하는 중성화 항-IL-3R 항체의 증가하는 농도 또는 동일한 항체의 Fab 영역(hz7G3 Fab)과 함께 배양된다. 제 Ｃ형 CpG 올리고뉴클레오티드(5μM)은 pDCs를 활성시키기 위해 첨가된다. 상층액은 6시간 또는 24시간 후 활성 둘 중에 하나를 수집하고 ELISA로 IFNα 생산을 측정한다. 도 6에서 보여진, 효과기 기능이 결핍된 중성화 항-IL-3R Fab(hz7G3V3)의 첨가는 IFNα 생산을 줄인다, 반면 Fc 도메인에서 변형을 포함하는 항-IL-3R의 첨가는 6시간 및 24시간 후 활성 모두에서 PBMC로부터 IFN 생산을 완전하게 저해한다.

이 명세서에서 나타낸 각 특허 및 과학적 문서, 컴퓨터 프로그램 및 알고리즘의 발명은 그것 전체의 참고로 포함된다.

<110> CSL Limited Vairo, Gino L Nash, Andrew Maraskovsky, Eugene Wilson, Nick Busfield, Samantha <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR TARGETING TYPE I INTERFERON-PRODUCING CELLS <130> 12FPI-08-06 <150> 12/707,297 <151> 2010-02-17 <150> 61/374,497 <151> 2010-08-17 <150> 61/374,489 <151> 2010-08-17 <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 359 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 1 Lys Glu Asp Pro Asn Pro Pro Ile Thr Asn Leu Arg Met Lys Ala Lys 1 5 10 15 Ala Gln Gln Leu Thr Trp Asp Leu Asn Arg Asn Val Thr Asp Ile Glu 20 25 30 Cys Val Lys Asp Ala Asp Tyr Ser Met Pro Ala Val Asn Asn Ser Tyr 35 40 45 Cys Gln Phe Gly Ala Ile Ser Leu Cys Glu Val Thr Asn Tyr Thr Val 50 55 60 Arg Val Ala Asn Pro Pro Phe Ser Thr Trp Ile Leu Phe Pro Glu Asn 65 70 75 80 Ser Gly Lys Pro Trp Ala Gly Ala Glu Asn Leu Thr Cys Trp Ile His 85 90 95 Asp Val Asp Phe Leu Ser Cys Ser Trp Ala Val Gly Pro Gly Ala Pro 100 105 110 Ala Asp Val Gln Tyr Asp Leu Tyr Leu Asn Val Ala Asn Arg Arg Gln 115 120 125 Gln Tyr Glu Cys Leu His Tyr Lys Thr Asp Ala Gln Gly Thr Arg Ile 130 135 140 Gly Cys Arg Phe Asp Asp Ile Ser Arg Leu Ser Ser Gly Ser Gln Ser 145 150 155 160 Ser His Ile Leu Val Arg Gly Arg Ser Ala Ala Phe Gly Ile Pro Cys 165 170 175 Thr Asp Lys Phe Val Val Phe Ser Gln Ile Glu Ile Leu Thr Pro Pro 180 185 190 Asn Met Thr Ala Lys Cys Asn Lys Thr His Ser Phe Met His Trp Lys 195 200 205 Met Arg Ser His Phe Asn Arg Lys Phe Arg Tyr Glu Leu Gln Ile Gln 210 215 220 Lys Arg Met Gln Pro Val Ile Thr Glu Gln Val Arg Asp Arg Thr Ser 225 230 235 240 Phe Gln Leu Leu Asn Pro Gly Thr Tyr Thr Val Gln Ile Arg Ala Arg 245 250 255 Glu Arg Val Tyr Glu Phe Leu Ser Ala Trp Ser Thr Pro Gln Arg Phe 260 265 270 Glu Cys Asp Gln Glu Glu Gly Ala Asn Thr Arg Ala Trp Arg Thr Ser 275 280 285 Leu Leu Ile Ala Leu Gly Thr Leu Leu Ala Leu Val Cys Val Phe Val 290 295 300 Ile Cys Arg Arg Tyr Leu Val Met Gln Arg Leu Phe Pro Arg Ile Pro 305 310 315 320 His Met Lys Asp Pro Ile Gly Asp Ser Phe Gln Asn Asp Lys Leu Val 325 330 335 Val Trp Glu Ala Gly Lys Ala Gly Leu Glu Glu Cys Leu Val Thr Glu 340 345 350 Val Gln Val Val Gln Lys Thr 355 <210> 2 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of a VH of hz7G3 <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Lys Trp Ala Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Ile Pro Ser Asn Gly Ala Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Thr Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser His Leu Leu Arg Ala Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of a VL of hz7G3 <400> 3 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Glu Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys Arg <210> 4 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of a heavy chain of hz7G3 <400> 4 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Lys Trp Ala Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Ile Pro Ser Asn Gly Ala Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Thr Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser His Leu Leu Arg Ala Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 5 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of a light chain of hz7G3 <400> 5 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Glu Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165 170 175 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 205 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 <210> 6 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of a heavy chain of hz7G3V1 <400> 6 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Lys Trp Ala Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Ile Pro Ser Asn Gly Ala Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Thr Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser His Leu Leu Arg Ala Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Glu Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 7 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of a heavy chain of hz7G3V2 <400> 7 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Lys Trp Ala Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Ile Pro Ser Asn Gly Ala Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Thr Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser His Leu Leu Arg Ala Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450

Claims

포유류에서 낭창(lupus)을 치료하기 위하여, 인터루킨 3 수용체 α(IL-3Rα) 사슬과 결합하고, 서열번호: 3에 기재된 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(V_L) 및 서열번호: 2에 기재된 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(V_H)을 포함하는 인간화 항체를 포함하는 약학적 조성물로서,
상기 인간화 항체가 이에 결합된 형질세포양 수지상세포(pDCs) 및 호염구를 제거 또는 부분적으로 제거하고,
여기서 상기 인간화 항체는 인간화 항체와 결합하는 세포를 죽이는 독성 화합물과 컨쥬게이트 되지 않으며,
여기서 상기 인간화 항체는 야생형 IgG1 Fc 영역을 포함하는 경우와 비교하여 효과기 기능(effector function)의 수준 향상을 유도할 수 있는 Fc 영역을 포함하고,
상기 효과기 기능은 항체 의존성 세포독성(ADCC), 항체 의존성 세포 매개성 식작용(ADCP) 또는 이의 조합이며,
상기 인간화 항체는 비푸코실화(afucosylated)된 Fc 영역을 포함하거나 하기로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 아미노산 서열 치환을 포함하는 Fc 영역을 포함하는 것인 약학적 조성물:
(i) 카바트(Kabat)의 유럽 연합(EU) 번호 체계에 따른 S239D, A330L 및 I332E; 또는
(ii) 카바트의 유럽 연합 번호 체계에 따른 S239D 및 I332E.
제 1항에 있어서, 상기 낭창은 전신성 홍반성 낭창(SLE)인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 IL-3Rα 사슬은 하나 또는 그 이상의 유형 I 인터페론을 생산하는 pDC에 의해서 발현되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 1 또는 3항에 있어서, 상기 IL-3Rα 사슬은 하나 또는 그 이상의 사이토카인을 생산하는 호염구에 의해서 발현되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
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제 1항에 있어서, 상기 인간화 항체는 IL-3 신호를 중화(neutralize)시키는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
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제 1항에 있어서, 상기 인간화 항체의 투여에 따라 포유류의 순환에서 형질세포양 수지상세포 및 호염구의 수는 인간화 항체 투여 전 포유류의 순환에서 형질세포양 수지상세포 및 호염구의 수와 비교해 적어도 50% 감소한 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 24항에 있어서, 상기 인간화 항체 투여에 따라 적어도 6시간 동안 포유류의 순환에서 형질세포양 수지상세포 및 호염구의 수는 인간화 항체 투여 전 포유류의 순환에서 형질세포양 수지상세포 및 호염구의 수와 비교해 적어도 50% 감소한 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 24항에 있어서, 상기 포유류의 순환에서 형질세포양 수지상세포 및 호염구의 수는 추가적인 인간화 항체 투여없이 인간화 항체 투여 적어도 7일 전에 포유류의 순환에서 형질세포양 수지상세포, 호염구 또는 이들의 조합의 수와 비교해 적어도 50% 감소하는 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 포유류에 0.001 mg/kg 및 50 mg/kg 사이의 인간화 항체를 투여하기 위해 제형화된 약학적 조성물.
제 27항에 있어서, 상기 조성물은 여러번 투여되고, 상기 투여 사이의 기간은 적어도 11일인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
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