CN103002913A - 靶向产生i型干扰素的细胞的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了治疗狼疮、干燥综合征或硬皮病的方法，所述方法包括给予哺乳动物一种免疫球蛋白，所述免疫球蛋白能结合白介素3受体α(IL-3Rα)链并消耗或至少部分消除与其结合的浆细胞样树突状细胞(pDC)和嗜碱性粒细胞。

Description

靶向产生I型干扰素的细胞的组合物和方法
引用的相关申请
本申请要求2010年8月17日提交的题目为“Compositions andMethods for Targeting type I Interferon-Producing Cells(靶向产生I型干扰素的细胞的组合物和方法)”的美国专利申请号61/374，497、2010年8月17日提交的题目为“Humanized Anti-Interleukin 3 Receptor Alpha ChainAntibodies(人源化的抗白介素3受体α链抗体)”的美国专利申请号61/374，489和2010年2月17日提交的题目为“Treatment of ChronicInflammatory Conditions(慢性炎症疾病状况的治疗)”的美国专利申请号12/707，297的权益。通过引用将这些申请的全部内容并入本文。
技术领域
本公开涉及炎性疾病的治疗。
发明背景
细胞因子的干扰素(IFN)家族包括I型和II型亚型。I型亚型由IFNα、IFNβ、IFNω、IFNκ和IFNτ组成，II型以IFNγ为代表。I型IFN具有多种免疫调节效应，包括多克隆T细胞应答的刺激、同种型转换、I类主要组织相容性复合体(MHC)分子的表达以及树突状细胞(DC)分化的诱导。I型IFN刺激巨噬细胞和天然杀伤(NK)细胞以引发抗病毒应答，并且针对肿瘤也是有活性的。I型IFN还通过改变下丘脑中热敏神经元的活性，进而引起发烧，而起到致热因子的作用。I型IFN系统的特征为快速诱导和放大信号转导通路，确保发起强烈的抗病毒免疫应答。
然而，尽管这类通路对快速的病毒清除是高度有效的，但这种放大在针对宿主组织的免疫应答中可能不适用的，引起自身免疫病。实例包括系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎和血管球性肾炎。
SLE是一种慢性自身免疫病，其中免疫缺陷导致多种器官中自身抗体的产生和随后的炎症和/或组织损伤，所述器官包括皮肤、肾脏、血液、脑和关节。疾病过程可以是长期活性的、再度恶化和缓和的或者长期缓和的。SLE的特征为很多细胞因子包括I型IFN如IFNα的水平升高。
SLE中IFNα的作用的证据已在数项体外研究中得到证实，所述研究表明，来自SLE患者的血清从正常哺乳动物的单核细胞诱导DC成熟。因此，来自SLE患者的血清能够诱导正常的静态单核细胞变成呈递能够诱导免疫应答的抗原。此外，SLE小鼠模型(NZB小鼠)中IFNAR1(I型IFN受体的α链)表达的抑制减弱了溶血性贫血并且减弱了血管球性肾炎。
临床上，活性SLE患者的血清I型IFN水平通常升高，并且这些水平与疾病活动性正相关。IFNα在SLE中的推定的作用的其他临床证据来自这样的观察结果，用IFNα治疗的未患SLE的患者偶尔会产生自身抗体和与SLE相符的临床表现。
I型干扰素由很多细胞类型产生，包括淋巴细胞(NK细胞、B细胞和T细胞)、巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞、成骨细胞和某些树突状细胞。浆细胞样树突状细胞(pDC)已被鉴定为是应答外来抗原时，I型IFN最有效的产生者。pDC是存在于血液以及I型干扰素来源的外周淋巴器官中的循环的树突状细胞亚型。人pDC通常表达表面标志物IL-3受体α链(IL-3Rα，CD123)、BDCA-2(CD303)和BDCA-4(CD304)，但是不表达CD11c或CD14，这使pDC与常规的树突细胞或单核细胞相区别。在刺激以及随后活化后，pDC产生大量的I型干扰素(主要为IFN-α和IFN-β)。
鉴于IFNα在I型IFN依赖的炎性疾病如SLE中的明显作用，寻求能够中和该细胞因子的作用的抗体或可溶性IFNAR蛋白作为潜在的治疗方法。
为治疗I型IFN依赖的炎性疾病如SLE而提出的可选方法是使用能与表达I型干扰素的细胞所表达的细胞表面分子结合的化合物。
已经研究的一类用于治疗自身免疫病的化合物是免疫毒素，所述免疫毒素包含与毒素缀合的来自抗体的单链Fv(scFv)。已提出这些化合物可用于杀死表达IL-3Rα的细胞。然而，这些分子具有很多缺点。例如，已知免疫毒素能引起肝脏和肾脏损伤。与scFv缀合的小尺寸的毒素还意味着，免疫毒素会被肾脏快速清除，这进一步恶化对该器官的损伤，并且意味着免疫毒素可能不能在体内保留足以赋予益处的时间。此外，毒素组分通常是非人的，这意味着它们可能在患者内诱导免疫应答。该免疫应答能够中和毒素分子。因此，这类免疫毒素可能不适合治疗慢性自身免疫病可能所需的多种治疗。
发明概述
与以前的一些方法相反，本发明人意识到，阻断I型IFN受体和/或IFN-α可能达不到足以避免损害I型IFN的阳性抗病毒效应的特异性。本发明人而是集中在降低或阻止IL-3对IL-3响应细胞的活性和/或消耗或消除IL-3响应细胞如pDC和嗜碱性粒细胞。本发明人利用针对IL-3Rα的免疫球蛋白来降低或阻止IL-3对IL-3响应细胞如pDC和嗜碱性粒细胞的活性(即中和IL-3信号转导)。然而，本发明人发现，仅中和IL-3信号转导的免疫球蛋白不可能将IFNα水平降低至足以提供治疗效果。因此，本发明人还使用能诱导哺乳动物的免疫系统的免疫球蛋白来至少部分消耗或消除IL-3响应细胞(例如pDC和嗜碱性粒细胞)，从而治疗I型IFN依赖性炎性疾病以及与pDC和嗜碱性粒细胞相关的疾病状态例如狼疮。通过使用能降低或阻止IL-3对IL-3响应细胞的活性和至少部分消耗或消除IL-3响应细胞的免疫球蛋白，本发明人能在体外降低IFNα水平。通过利用哺乳动物免疫系统至少部分消耗或消除IL-3响应细胞，避免毒素的使用及与其相关的副作用是可能的。
鉴于pDC不仅是I型IFN的唯一来源，而且是炎性疾病中I型IFN的重要来源，本发明人考虑到，本公开所提供的方法比针对I型IFN受体和/或IFN-α的方法提供了更精确的靶向治疗方法，这种方法不大可能使I型IFN的积极效果无效。一类具体的I型IFN依赖性炎性疾病是狼疮，例如SLE。
本发明人还发现，诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的能力增强的免疫球蛋白能够以低剂量减少IFNα产生和/或循环pDC和嗜碱性粒细胞的数量。本发明人还发现，这些效应在给药后持续数天，并且效应的长度是剂量依赖性的。
本发明人还发现，pDC和嗜碱性粒细胞数量在免疫球蛋白给药后恢复，这表明哺乳动物的免疫应答(例如对病毒的应答)也在治疗后恢复。
本公开提供了治疗哺乳动物的狼疮的方法，所述方法包括给予哺乳动物一种免疫球蛋白，所述免疫球蛋白能结合IL-3Rα链并中和IL-3信号转导，并且能消耗或至少部分消除与之结合的pDC和嗜碱性粒细胞，从而治疗哺乳动物中的狼疮，其中所述免疫球蛋白不与毒性化合物缀合，所述毒性化合物会杀死免疫球蛋白所结合的细胞。在一实例中，狼疮是SLE。
另外或可选地，本公开提供了治疗哺乳动物的狼疮的方法，所述方法包括给予哺乳动物一种免疫球蛋白，所述免疫球蛋白能结合IL-3Rα链并竞争性抑制单克隆抗体7G3与IL-3Rα的结合，并且能消耗或至少部分消除与之结合的pDC和嗜碱性粒细胞，从而治疗哺乳动物中的狼疮。在一实例中，免疫球蛋白能结合IL-3Rα并中和IL-3信号转导。在一实例中，狼疮是SLE。
另外或可选地，本公开提供了治疗哺乳动物的狼疮的方法，所述方法包括给予哺乳动物一种免疫球蛋白，所述免疫球蛋白能结合IL-3Rα链并竞争性抑制单克隆抗体7G3与IL-3Rα的结合，并且能消耗或至少部分消除与之结合的pDC和嗜碱性粒细胞，从而治疗哺乳动物中的狼疮，其中所述免疫球蛋白不与毒性化合物缀合，所述毒性化合物会杀死免疫球蛋白所结合的细胞。免疫球蛋白能结合IL-3Rα并中和IL-3信号转导。在一实例中，狼疮是SLE。
本公开还提供了治疗哺乳动物中干燥综合征(syndrome)的方法，所述方法包括给予哺乳动物一种能结合IL-3Rα链的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白能中和IL-3信号转导和/或竞争性抑制单克隆抗体7G3与IL-3Rα的结合，并且其中所述免疫球蛋白能消耗或至少部分消除与之结合的pDC和嗜碱性粒细胞，从而治疗哺乳动物中的干燥综合征，并且其中所述免疫球蛋白不与毒性化合物缀合，所述毒性化合物会杀死免疫球蛋白所结合的细胞。
本公开还提供了治疗哺乳动物中硬皮病的方法，所述方法包括给予哺乳动物一种能结合IL-3Rα链的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白能中和IL-3信号转导和/或竞争性抑制单克隆抗体7G3与IL-3Rα的结合，并且其中所述免疫球蛋白能消耗或至少部分消除与之结合的pDC和嗜碱性粒细胞，从而治疗哺乳动物中的系统性硬皮病，并且所述免疫球蛋白不与毒性化合物缀合，所述毒性化合物会杀死免疫球蛋白所结合的细胞。在一实例中，硬皮病是系统性硬皮病。
在另一实例中，本公开提供了供本公开的上述实例使用的药物组合物，所述药物组合物包含能与IL-3Rα链结合的免疫球蛋白和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。示例性的免疫球蛋白如本文所述且适用于本公开的实例。在一实例中，免疫球蛋白不与毒性化合物缀合，所述毒性化合物会杀死免疫球蛋白所结合的细胞。在一实例中，免疫球蛋白消耗或至少部分消除与之结合的pDC和嗜碱性粒细胞。在一实例中，免疫球蛋白能结合IL-3Rα并中和IL-3信号转导。在一实例中，免疫球蛋白竞争性抑制单克隆抗体7G3与IL-3Rα的结合。
在另一实例中，本公开提供了供本公开的上述实例使用的试剂盒，所述试剂盒包含能与IL-3Rα链结合的免疫球蛋白；药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂；以及试剂盒的使用说明书。能与IL-3Rα结合的示例性的免疫球蛋白如本文所述，并且被认为准用于本公开的本实例。
在一实例中，所述方法包括给予有效中和IL-3信号转导并消耗或至少部分消除哺乳动物中pDC和嗜碱性粒细胞的量的免疫球蛋白。
在一实例中，IL-3Rα由产生一种或多种I型干扰素的pDC表达。因此，在一实例中，免疫球蛋白能与产生一种或多种I型干扰素的pDC上的IL-3Rα结合。
在一实例中，IL3Rα链由产生一种或多种细胞因子的嗜碱性粒细胞表达。因此，在一实例中，免疫球蛋白能与产生一种或多种细胞因子的嗜碱性粒细胞上的IL-3Rα结合。
在一实例中，免疫球蛋白能与单克隆抗体7G3结合相同的表位。
在另一实例中，免疫球蛋白结合的表位与单克隆抗体7G3所结合的表位重叠。
在一实例中，免疫球蛋白能与IL-3Rα特异性结合。
在一实例中，免疫球蛋白是裸免疫球蛋白。
本公开所考虑的示例性免疫球蛋白是抗体及其抗原结合片段。
在一实例中，免疫球蛋白是全长抗体。
在一实例中，免疫球蛋白是嵌合免疫球蛋白，例如嵌合抗体或其抗原结合片段。例如，嵌合抗体包含来自非人哺乳动物(例如，小鼠)产生的抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)和来自人的恒定区。在一实例中，嵌合抗体包含单克隆抗体7G3的可变区。
在另一实例中，免疫球蛋白是人源化免疫球蛋白，例如人源化抗体或其抗原结合片段。在一实例中，人源化抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体7G3或其抗原结合片段的人源化形式。例如，人源化抗体包含来源于单克隆抗体7G3的互补性决定区(CDR)。在一实例中，人源化抗体包含单克隆抗体7G3的VH的CDR。在另一或可选的实例中，人源化抗体包含单克隆抗体7G3的VL的CDR2和CDR3以及单克隆抗体7G3的CDR1(包含一个或多个氨基酸取代)。在一实例中，人源化抗体包含轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)，轻链可变区(VL)包含SEQ ID NO:3所示的序列，重链可变区包含SEQ ID NO:2所示的序列。
在另一实例中，免疫球蛋白是人免疫球蛋白，诸如人抗体或其抗原结合片段。
本公开所考虑的示例性抗原结合片段包括：
(i)结构域抗体(dAb)；
(ii)Fv；
(iii)scFv或其稳定形式(例如，二硫化物稳定的scFv)；
(iv)二聚scFv或其稳定形式；
(iv)双链抗体、三链抗体、四链抗体或更高级别的多聚体；
(v)Fab片段；
(vi)Fab’片段；
(vii)F(ab’)片段；
(viii)F(ab’)2片段；
(ix)融合至抗体的Fc区的(i)-(viii)中的任一个；
(x)融合至能与免疫效应细胞结合的抗体或其抗原结合片段的(i)-(viii)中的任一个。
如同根据本文公开的内容对本领域技术人员所显而易见的，在没有与毒性化合物缀合的情况下，示例性的免疫球蛋白能够消耗或至少部分消除与之结合的细胞。
在一实例中，免疫球蛋白促使细胞经历凋亡。
在一实例中，免疫球蛋白能够诱导效应子功能，例如导致杀死免疫球蛋白所结合的细胞的效应子功能。示例性的效应子功能包括ADCC、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。
在一实例中，免疫球蛋白能够诱导ADCC。
在一实例中，免疫球蛋白包含能够诱导效应子功能的抗体Fc区。例如，效应子功能是FC介导的效应子功能。在一实例中，Fc区是IgG1Fc区或IgG3Fc区或杂合体IgG1/IgG2Fc区。
在一实例中，免疫球蛋白能够诱导与野生型人IgG1和/或人IgG3Fc区相似(例如，没有显著不同或处于约10%内)或相同水平的效应子功能。
在一实例中，免疫球蛋白能够诱导与本文所述的ch7G3或hz7G3相似(例如，没有显著不同或处于约10%内)或相同水平的效应子功能。
在一实例中，免疫球蛋白能够诱导水平提高的效应子功能。
在一实例中，由免疫球蛋白诱导的效应子功能水平相对于包含野生型IgG1Fc区时的免疫球蛋白的效应子功能水平是提高的。
在一实例中，效应子功能相对于本文所述的ch7G3或hz7G3的效应子功能是提高的，或大于本文所述的ch7G3或hz7G3的效应子功能。
在一实例中，免疫球蛋白是去岩藻糖化的或包含去岩藻糖化的Fc区。
在另一实例中，免疫球蛋白与未经改变以降低蛋白岩藻糖化的人细胞或CHO细胞所产生的免疫球蛋白相比具有较低水平的岩藻糖化。按照本实例，较低水平的岩藻糖化应当被理解为表示，在包含免疫球蛋白的组合物中，岩藻糖化免疫球蛋白(例如，与包含岩藻糖的抗体的Asn297相连的糖基基团)的百分比低于未经改变以降低蛋白岩藻糖化的人细胞或CHO细胞所产生的免疫球蛋白。
在一实例中，免疫球蛋白是hz7G3V3。例如，免疫球蛋白是包含轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)的去岩藻糖化的人源化抗体，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:3所示的序列，所述重链可变区包含SEQ ID NO:2所示的序列。例如，免疫球蛋白是包含轻链和重链的去岩藻糖化的人源化抗体，所述轻链包含SEQ ID NO:5所示的序列，所述重链包含SEQ IDNO:4所示的序列。
在一实例中，免疫球蛋白是人源化抗体，其包含由不表达可检测水平的(或表达降低水平的)α-1,6-岩藻糖基转移酶(FUT8)的哺乳动物细胞(例如，CHO细胞)表达的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:3所示的序列，所述重链可变区包含SEQ ID NO:2所示的序列。在一实例中，免疫球蛋白是去岩藻糖化的人源化抗体，其包含由不表达可检测水平的(或表达降低水平的)α-1,6-岩藻糖基转移酶(FUT8)的哺乳动物细胞(例如，CHO细胞)表达的轻链和重链，所述轻链包含SEQ ID NO:5所示的序列，所述重链包含SEQ ID NO:4所示的序列。
在一实例中，免疫球蛋白包含Fc区，所述Fc区包含增强免疫球蛋白所诱导的效应子功能的一个或多个氨基酸序列取代。例如，与不含取代的Fc区相比，一个或多个氨基酸序列取代增加了Fc区对Fcγ受体(FcγR)的亲和力。例如，与不含取代的Fc区相比，一个或多个氨基酸序列取代增加了Fc区对选自FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIc和FcγRIIIa的FcγR的亲和力。在一实例中，一个或多个氨基酸序列取代是：
(i)按照Kabat EU编号系统的S239D、A330L和I332E；或
(ii)按照Kabat EU编号系统的S239D和I332E。
例如，免疫球蛋白是包含轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)的人源化抗体，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:3所示的序列，所述重链可变区包含SEQ ID NO:2所示的序列，其中所述抗体包含含有以下的Fc区：
一个或多个氨基酸序列取代是：
(i)按照Kabat EU编号系统的S239D、A330L和I332E；或
(ii)按照Kabat EU编号系统的S239D和I332E。
在一实例中，免疫球蛋白选自hz7G3V1和hz7G3V2。例如，免疫球蛋白是包含这样的轻链和重链的抗体(hz7G3V1)，所述轻链包含SEQ IDNO:5所示的序列，所述重链包含SEQ ID NO:6所示的序列，或是包含这样的轻链和重链的抗体(hz7G3V2)，所述轻链包含SEQ ID NO:5所示的序列的轻链，所述重链包含SEQ ID NO:7所示的序列。
在一实例中，给予哺乳动物免疫球蛋白之后，哺乳动物中循环的pDC和/或嗜碱性粒细胞的数量与给予免疫球蛋白之前循环的pDC和/或嗜碱性粒细胞数量相比减少至少约50%。
例如，给予哺乳动物免疫球蛋白之后至少约6小时，哺乳动物中循环的pDC和/或嗜碱性粒细胞的数量与给予免疫球蛋白之前循环的pDC和/或嗜碱性粒细胞数量相比减少至少约50%。
例如，在给予后没有进一步给予免疫球蛋白的情况下，哺乳动物中循环的pDC和/或嗜碱性粒细胞的数量与给予免疫球蛋白之前循环的pDC和/或嗜碱性粒细胞数量相比减少至少约50%，持续至少7天。例如，在给予后没有进一步给予免疫球蛋白的情况下，哺乳动物中循环的pDC和/或嗜碱性粒细胞的数量与给予免疫球蛋白之前循环的pDC和/或嗜碱性粒细胞数量相比减少至少约50%，持续至少8天或10天或11天或15天或20天或21天或22天或28天或35天或42天或49天或50天或57天或60天或63天或70天。
例如，哺乳动物中循环的pDC和/或嗜碱性粒细胞的数量与给予免疫球蛋白之前循环的pDC和/或嗜碱性粒细胞数量相比减少至少约50%或55%或60%或65%或70%或75%或80%或85%或90%或95%或96%或97%或98%或99%。
在一实例中，所述方法包括给予有效量的免疫球蛋白，诸如治疗有效量的免疫球蛋白。
在一实例中，所述方法包括给予哺乳动物约0.0001mg/kg至50mg/kg免疫球蛋白。例如，所述方法包括给予约0.0005mg/kg至约50mg/kg。例如，所述方法包括给予约0.001mg/kg至约45mg/kg。例如，所述方法包括给予约0.005mg/kg至约40mg/kg。例如，所述方法包括给予约0.05mg/kg至约35mg/kg。例如，所述方法包括给予约0.1mg/kg至约30mg/kg。例如，所述方法包括给予约0.1mg/kg至约15mg/kg。例如，所述方法包括给予约0.1mg/kg至约10mg/kg。例如，所述方法包括给予约0.1g/kg至约1mg/kg。例如，所述方法包括给予约10mg/kg至约30mg/kg。例如，所述方法包括给予约20mg/kg至约30mg/kg。
在一实例中，给予免疫球蛋白的剂量为0.1mg/kg。
在一实例中，给予免疫球蛋白的剂量为1mg/kg。
在一实例中，给予免疫球蛋白的剂量为10mg/kg。
在一实例中，给予免疫球蛋白的剂量为30mg/kg。
在一实例中，多次给予哺乳动物免疫球蛋白。在一实例中，给药间的时间为至少约7天，诸如至少约8天，例如，至少约9天或10天。在一实例中，给药间的时间为至少约11天。在另一实例中，给药间的时间为至少约15天，诸如至少约16天，例如，至少约18天或20天。在一实例中，给药间的时间为至少约22天。在另一实例中，给药间的时间为至少约25天，诸如至少约30天，例如，至少约40天或45天。在一实例中，给药间的时间为至少约57或60天。
例如，给予免疫球蛋白的剂量为0.0001mg/kg至5mg/kg，诸如0.0005mg/kg至5mg/kg，例如，0.001mg/kg至5mg/kg，诸如0.005mg/kg至5mg/kg，以及5mg/kg，并且给药间的时间为至少约7天或8天或9天或10天或11天。例如，给予免疫球蛋白的剂量为0.01mg/kg至5mg/kg，并且给药间的时间为至少约7天或8天或9天或10天或11天。例如，给予免疫球蛋白的剂量为0.1mg/kg至2mg/kg，并且给药间的时间为至少约7天或8天或9天或10天或11天。例如，给予免疫球蛋白的剂量为0.1mg/kg至1mg/kg，并且给药间的时间为至少约7天或8天或9天或10天或11天。在一些实例中，给药间的时间为至少约7天且小于约22天，诸如至少约11天或15天且小于约20天，例如至少约13天且小于约18天。
在一实例中，给予免疫球蛋白的剂量为0.1mg/kg，并且给药间的时间为6天或7天或8天或9天或10天或11天或14天或15天。
在一实例中，给予免疫球蛋白的剂量为1mg/kg，并且给药间的时间为6天或7天或8天或9天或10天或11天或14天或15天或20天或21天或22天。
例如，给予免疫球蛋白的剂量为6mg/kg至50mg/kg，并且给药间的时间为至少约15天。例如，给予免疫球蛋白的剂量为10mg/kg至30mg/kg，并且给药间的时间为至少约14或15天。例如，给予免疫球蛋白的剂量为20mg/kg至30mg/kg，并且给药间的时间为至少约14或15天。在一些实例中，给药间的时间为至少约20天且小于约70天，诸如至少约21或22天且小于约65天，例如至少约25天且小于约57天。
在一实例中，给予免疫球蛋白的剂量为10mg/kg，并且给药间的时间为14天或15天或21天或22天或30天或48天或50天或56天或57天或60天。
在一实例中，给予免疫球蛋白的剂量为30mg/kg，并且给药间的时间为14天或15天或21天或22天或30天或48天或50天或56天或57天或60天。
在一实例中，在一段时间和一定条件下，将免疫球蛋白给予患狼疮如SLE的哺乳动物，从而降低哺乳动物(例如，如本文所述)中循环的免疫复合物和/或自身抗体和/或狼疮如SLE的炎症或其他症状的水平。在一实例中，一次或多次给予免疫球蛋白。在一些实例中，如果多次给予免疫球蛋白，则应当给予足以显著降低哺乳动物(例如，如本文所述)中循环的免疫复合物和/或自身抗体和/或狼疮如SLE的炎症或其他症状的水平的次数。在一些实例中，当哺乳动物(例如，如本文所述)中循环的免疫复合物和/或自身抗体和/或狼疮如SLE的炎症或其他症状的水平不再显著降低时，再次给予免疫球蛋白。
在一些实例中，如果多次给予免疫球蛋白，应当给予足以将哺乳动物(例如，如本文所述)中循环的免疫复合物和/或自身抗体和/或狼疮如SLE的炎症或其他症状的水平降低至与健康个体的水平相似的水平(例如，10%或20%内)的次数。在一些实例中，当哺乳动物(例如，如本文所述)中循环的免疫复合物和/或自身抗体和/或狼疮如SLE的炎症或其他症状的水平不再显著降低时，再次给予免疫球蛋白。
在一实例中，所述方法还包括检测哺乳动物中循环的免疫复合物和/或自身抗体和/或狼疮如SLE的炎症或其他症状的水平，如果水平没有降低，重复给予免疫球蛋白。
在一实例中，哺乳动物中循环免疫复合物和/或自身抗体和/或狼疮如SLE的炎症或其他症状的水平降低至在健康哺乳动物中所检测的水平。
在一实例中，所述方法还包括检测哺乳动物的循环和/或发炎组织中的pDC和/或嗜碱性粒细胞的数量。
在一实例中，方法还包括如果在循环中所检测到的pDC和/或嗜碱性粒细胞的数量是给予免疫球蛋白之前循环中的pDC和/或嗜碱性粒细胞数量的约50%内，则重复给予免疫球蛋白。例如，方法还包括如果在循环中所检测到的pDC和/或嗜碱性粒细胞的数量是给予免疫球蛋白之前循环中的pDC和/或嗜碱性粒细胞数量的约60%、70%、75%、80%、85%、90%或95%内，则重复给予免疫球蛋白。
在一实例中，在免疫球蛋白给药停止之后，个体中循环的pDC和/或嗜碱性粒细胞的数量增加。例如，个体中循环的pDC和/或嗜碱性粒细胞的数量增加至与正常或健康个体和/或正常或健康个体群体中的水平相似的水平。例如，在停止治疗后约11天或20天或22天或30天或57天或60天或65天或70天之后，个体中循环的pDC和/或嗜碱性粒细胞的数量增加。
本公开还提供了预防哺乳动物的狼疮如SLE复发的方法，所述方法包括将本文根据任何实例所述的免疫球蛋白给予经历狼疮如SLE复发或有发展狼疮如SLE复发风险的哺乳动物，从而预防狼疮如SLE的复发。
在一实例中，方法包括给予有效量的免疫球蛋白，诸如预防有效量的免疫球蛋白。
在一实例中，方法还包括鉴定经历狼疮如SLE复发的哺乳动物。例如，所述方法包括检测哺乳动物循环中的自身抗体(例如，抗C1q)和/或抗dsDNA抗体和/或免疫复合物。确定经历狼疮如SLE复发的哺乳动物的方法是本领域内已知的和/或是本文所描述的。
在一实例中，按照本文根据本公开的任何实例所述给予免疫球蛋白。
在一实例中，待治疗的哺乳动物需要这种治疗。例如，哺乳动物患有疾病或疾病状态或有发展出疾病或疾病状态的风险或正在经历疾病或疾病状态的复发或有复发的风险。在一实例中，需要治疗的哺乳动物循环中的IFNα水平升高，例如与健康哺乳动物群体中所检测的水平相比。
合适地，按照本公开的前述实例，哺乳动物是人。
根据以下的详细描述，其他方面、实例和优势将变得显而易见。给予的详细描述和具体实例仅为说明性的，因为根据该详细描述，本公开实质和范围内的各种改变和变动对本领域技术人员而言都将是显而易见的。此外，实例表明了本公开所公开的方法的原理，并未具体说明本公开适用的对本领域技术人员而言明显有用的所有实例。
附图的简要说明
图1图示了多种细胞谱系(X轴)中每个细胞的IL-3Rα的平均表达水平(Y轴)。
图2包括两幅图，显示了多种剂量的能结合IL-3Rα的去岩藻糖化人源化抗体(hz7G3V3)给药之前和之后，嗜碱性粒细胞(左侧)或pDC(右侧)的百分比。数量表示为外周血样品中总细胞的百分比(Y轴)。相对于抗体给药时间的外周血收集时间显示在X轴上。还显示了抗体的剂量。
图3图示了多种抗体在不同条件下诱导的ADCC所引起的细胞裂解水平。命名所研究的抗体的系统命名法与本文描述的一致。在自体靶标效应子条件(pDC1-NKl、pDC2-NK2)和异体靶标效应子条件(pDC1-NK2、pDC2-NK1)下研究抗体。结果表示为所测定的特异性裂解的百分比，为用ExtranTM获得的自发裂解和最大裂解的函数。
图4包括两幅图，显示了含有用C型CpG寡核苷酸活化的pDC的PBMC分泌到细胞培养基中的IFNα的量。细胞与X轴上所示浓度的所示抗体一起培养。利用ELISA检测到的IFNα的量显示在Y轴上。显示了利用寡核苷酸活化后6小时(左侧)和24小时(右侧)进行测定的结果。
图5图示了含有用C型CpG寡核苷酸活化的pDC的PBMC分泌到细胞培养基中的IFNα的量。细胞与多种浓度的能结合IL-3Rα的去岩藻糖化人源化抗体(hz7G3V3)或同种型对照抗体(如图所示)一起培养。利用ELISA检测到的IFNα的量显示在Y轴上。显示了利用寡核苷酸活化后24小时进行测定的结果。
图6图示了用含有C型CpG寡核苷酸活化的pDC的PBMC分泌到细胞培养基中的IFNα的量。细胞与多种浓度的能结合IL-3Rα的去岩藻糖化人源化抗体(hz7G3V3)或相同抗体的Fab片段(7G3Fab)(如图所示)一起培养。利用ELISA检测到的IFNα的量显示在Y轴上。显示了利用寡核苷酸活化后24小时进行测定的结果。
发明的详细描述
序列表说明
SEQ ID NO:1是IL-3Rα链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2是hz7G3的VH的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3是hz7G3的VL的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4是hz7G3的重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5是hz7G3的轻链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:6是hz7G3V1的重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7是hz7G3V2的重链的氨基酸序列。
通则
在整个说明书中，除非明确陈述并非如此或上下文指示并非如此，提及一个步骤、物质组成、步骤组或物质组合物组应当被认为包括一个和多个(即一或多)步骤、物质组成、步骤组或物质组成组。
本领域技术人员应当理解，本公开允许进行除了所具体描述的那些之外的变化和修改。应当理解，本公开包括所有这些变化和修改。本公开还包括本说明书中单独或共同提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及任何两个或更多个步骤或特征的任何和所有组合。
本公开并非限制于本文描述的具体实例的范围，这些实例仅意图示例的目的。功能等同的产物、组合物和方法明确处于本公开的范围内。
本公开的任何实例应被认为准用于本公开的任何其他实例，除非本公开明确陈述并非如此。
除非明确限定并非如此，本文所用的所有技术和科学术语应当被认为具有与本领域技术人员(例如，细胞培养、分子遗传学、免疫学、免疫组织化学、蛋白化学和生物化学中)所通常理解的相同的含义。
除非指出并非如此，本公开中所用的细胞培养和免疫学技术是本领域技术人员公知的标准方法。这类技术在以下来源的文献中有描述和解释，诸如J.Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning,John Wiley andSons(1984),J.Sambrook et al.Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册),Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989),T.A.Brown(主编),Essential Molecular Biology:A Practical Approach(基础分子生物学：实践方法),Volumes 1 and 2,IRL Press(1991),D.M.Glover andB.D.Hames(主编),DNA Cloning:A Practical Approach(DNA克隆：实践方法),Volumes 1-4,IRL Press(1995and 1996),and F.M.Ausubel et al.(主编),Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学现行规范),Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience(1988,包括至今的所有更新),Ed Harlowand David Lane(主编)antibodies:A Laboratory Manual(抗体：实验室手册),Cold Spring Harbour Laboratory,(1988),以及J.E.Coligan et al.(主编)Current Protocols in Immunology(免疫学最新实验方案),John Wiley &Sons(包括至今的所有更新)。
通过Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest,NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.,1987 and 1991,Bork et al.,J Mol.Biol.242,309-320,1994,Chothia and Lesk J.Mol Biol.196:901-917,1987,Chothia et al.Nature 342,877-883,1989和/或Al-Lazikani et al.,J Mol Biol273,927-948,1997中的论述可以进一步阐明本文关于可变区及其一部分、免疫球蛋白、抗体及其片段的的描述和定义。
术语“和/或”，例如“X和/或Y”应被理解为表示“X和Y”或“X或Y”，并且应当被认为为两种含义或任一种含义提供了明确的支持。
在整个说明书中，词语“包含(comprise)”或变型如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”应被理解为暗指包括所陈述的元件、整体或步骤，或元件、整体或步骤组，但是不排除任何其他元件、整体或步骤，或元件、整体或步骤组。
本文所用的术语“来源于”用来表示指定的整体可以获自特定的来源，尽管并不必然直接来自该来源。
选择的定义
本文所用的术语“免疫球蛋白”包括免疫球蛋白基因复合物的任何抗原结合蛋白产物，包括免疫球蛋白同种型IgA、IgD、IgM、IgG和IgE及以上的抗原结合片段。示例性的免疫球蛋白是抗体。免疫球蛋白可以是多克隆的或单克隆的，单克隆抗体是本公开的一种示例性形式。术语“免疫球蛋白”包括适于去免疫化从而降低或消除哺乳动物对已给予所述哺乳动物的免疫球蛋白的免疫应答的任何免疫球蛋白。在治疗人的特定情况下，合适的免疫球蛋白包括嵌合、人源化或人免疫球蛋白。术语“免疫球蛋白”还包括包含改变的或变异的氨基酸残基、序列或糖基化的经修饰、诱变、嵌合和/或人源化的免疫球蛋白，不管其是天然存在的还是人类干预所产生的(例如通过重组DNA技术)。本领域技术人员应当理解，基于适合结合IL-3Rα链的可选的免疫球蛋白或非免疫球蛋白支架，本公开的“免疫球蛋白”可以用其他结合部分和/或序列替代。示例性的蛋白包括Fc受体结合部分。例如，术语“免疫球蛋白”所包括的蛋白包括结构域抗体、骆驼抗体和来自软骨鱼的抗体(即，免疫球蛋白新抗原受体(IgNAR))。通常，骆驼抗体和IgNAR包含VH，而缺少VL，并且通常被称为重链免疫球蛋白。其他“免疫球蛋白”包括T细胞受体和含有其他免疫球蛋白样结构域的能够结合抗原的蛋白，例如借助包含可变区的抗原结合位点。
本领域技术人员应当意识到，“抗体”通常被认为是由多条多肽链(例如包含VL的多肽和包含VH的多肽)组成的包含可变区的蛋白。抗体通常还包含恒定结构域，其中的一些可以排列成恒定区或恒定片段或可结晶片段(Fc)。VH和VL相互作用，从而形成包含抗原结合区的Fv，所述抗原结合区能够特异性结合一种或数种密切相关的抗原。通常，来自哺乳动物的轻链是κ轻链或λ轻链，来自哺乳动物的重链是α、δ、ε、γ或μ。抗体可以为任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、种类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。术语“抗体”还包括人源化抗体、灵长类源化抗体(primatized antibody)、人抗体和嵌合抗体。
术语“全长抗体”、“完整抗体”或“全抗体”可交换使用，与抗体的抗原结合片段相反，是指处于基本完整形式的抗体。具体而言，全抗体包括具有包含Fc区的重链和轻链的抗体。恒定结构域可以是野生型序列的恒定结构域(例如，人野生型序列的恒定结构域)或其氨基酸序列变体。在某些情况下，完整抗体可以具有一种或多种效应子功能。
抗体的“抗原结合片段”包含完整抗体的抗原结合区和/或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab′)2和Fv片段；双链抗体；线性抗体；单链抗体分子以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
在本公开的背景下，“效应子功能”是指由能与抗体的Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变异的Fc区)结合的细胞或蛋白介导的那些生物活性，其会导致杀死细胞。由抗体诱导的效应子功能的实例包括：补体依赖性细胞毒性；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)；和B细胞活化。在本公开的背景下，术语“由免疫球蛋白诱导的效应子功能”或类似用语与“免疫球蛋白的效应子功能”或类似用语可交换使用，且每一种都为另一种提供文字支持。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”指一种形式的细胞毒性，其中分泌的Ig结合至某些细胞毒性细胞(例如，自然杀伤(“NK”)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)展示的Fc受体(“FcR”)上，致使这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合承载抗原的靶细胞，随后用细胞毒素杀死靶细胞。为了评价目的分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC测定。用于这类测定的可用效应细胞包括外周血单核细胞(“PBMC”)和NK细胞。
本文所用的“可变区”是指本文所定义的能够特异性结合抗原的抗体的轻链和/或重链部分，并且例如包括CDR的氨基酸序列，即，CDRl、CDR2和CDR3以及框架区(FR)。例如，可变区包含三或四个FR(例如，FR1、FR2、FR3和任选的FR4)以及三个CDR。VH是指重链的可变区。VL是指轻链的可变区。在实施本公开的方法的过程中，归于CDR和FR的氨基酸位置可以按照Kabat(1987 and 1991，同上)或其他编号系统限定，例如Clothia and Lesk(1987和/或1989，同上和/或Al-Lazikani et al.，1997，同上)的高变环编号系统。例如，按照Kabat编号系统，VH FR和CDR的定位如下：按照Kabat编号系统编号的残基1-30(FRl)，31-25(CDR1)，36-49(FR2)，50-65(CDR2)，66-94(FR3)，95-102(CDR3)和103-113(FR4)。例如，按照Kabat编号系统，VL FR和CDR的定位如下：残基1–23(FRl)，24-34(CDR1)，35-49(FR2)，50-56(CDR2)，57-88(FR3)，89-97(CDR3)和98-107(FR4)。
本文所用的术语“互补性决定区”(同义：CDR；即CDRl、CDR2和CDR3)是指在FR间形成环的抗体可变结构域的氨基酸残基，其序列随抗体不同而不同。一些或所有CDR赋予抗体结合抗原的能力。每个可变结构域通常具有被称为CDRl、CDR2和CDR3的三个CDR区。每个互补性决定区可以包含来自Kabat et al.,(1991)所定义的“互补性决定区”的氨基酸残基和/或来自Chothia and Lesk(1987)或任何其他已知的编号技术或以上的组合的“高变环”的那些残基，包括IMGT编号系统(Le Franc et al.,2003)。
“框架区”(下文称为FR)是除了CDR残基之外的那些可变结构域残基。
本文所用的术语“恒定区”或“可结晶片段”或“Fc”或“Fc区”或“Fc部分”(其在本文可交换使用)是指包含至少一个恒定结构域的抗体部分，并且其通常(尽管不是必需)是糖基化的且能够与一种或多种Fc受体和/或补体级联的组分结合。重链恒定区可以选自五种同种型即α、δ、ε、γ或μ中的任一种。此外，不同亚类的重链(诸如IgG亚类的重链)负责不同的效应子功能，并且因而，通过选择所需的重链恒定区，可以产生具有期望效应子功能的蛋白。示例性的重链恒定区是γ1(IgG1)、γ2(IgG2)和γ3(IgG3)或以上的杂合体。
“恒定结构域”是抗体中的结构域，其序列在同种型抗体/抗体如IgG或IgM或IgE间是高度相似的。抗体的恒定区通常包含多个恒定结构域，例如γ、α和δ重链的恒定区包含两个恒定结构域。
本文所用的术语“特异性结合”应该认为表示，与备选抗原或细胞相比，免疫球蛋白能更频繁、更快速、更持久和/或以更高的亲和力与IL-3Rα或表达IL-3Rα的细胞反应或结合。通过阅读本定义还应当理解，例如，能够特异性结合IL-3Rα的免疫球蛋白可以特异性结合第二抗原或者可以不特异性结合第二抗原。因此，“特异性结合”并不必然排除另一种抗原的结合或非可检测结合。术语“特异性结合”与本文的“选择性结合”可以交换使用。通常，本文提及结合表示特异性结合，并且每个术语应被理解为为另一术语提供明确的支持。
术语“竞争性抑制”应当被理解为表示，免疫球蛋白降低或防止称为7G3的单克隆抗体与IL-3Rα的结合。从上文显而易见的是，免疫球蛋白不需要完全抑制单克隆抗体7G3的结合，而是其仅需要将结合降低统计学显著的量，例如，降低至少约10%或20%或30%或40%或50%或60%或70%或80%或90%或95%。测定结合的竞争性抑制的方法是本领域内已知的和/或如本文所述。例如，在存在或不存在免疫球蛋白的情况下，将单克隆抗体7G3暴露于IL-3Rα。如果在存在免疫球蛋白的情况下比在不存在免疫球蛋白的情况下结合的单克隆抗体少，则认为免疫球蛋白竞争性抑制单克隆抗体7G3的结合。
两个表位背景下的“重叠”应该被认为表示，两个表位共享足以允许能结合一个表位的免疫球蛋白竞争性抑制能结合另一表位的免疫球蛋白的结合的数量的氨基酸残基。例如，两个表位共享至少1或2或3或4或5或6或更多个氨基酸。
本文所用的术语“中和”应该被认为表示，免疫球蛋白能够降低或防止细胞中的IL-3介导的信号转导和/或降低或防止IL-3与IL-3Rα链和/或IL-3Rα链与IL-3Rβ链的异二聚体(也称为集落刺激因子2受体)的结合。
本文提及“单克隆抗体7G3”或“7G3”是指以登录号HB-12009保藏在ATCC以及在US6177078中所描述的称为7G3的杂交瘤所产生的单克隆抗体。单克隆抗体7G3也是商购可获得的，例如从BD Biosciences(NJ，USA)获得。
术语“Kabat的EU编号系统”应当被理解为表示，免疫球蛋白重链的编号是按照Kabat et al.,1991,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,5th Ed.,United States Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda中所教导的EU指数。EU指数基于人IgG1 EU抗体的残基编号。
本文所用的术语“治疗”是指在临床病理过程中为改变被治疗的个体或细胞的自然过程而设计的临床干预。期望的治疗效果包括降低疾病进展的速率、改善或缓和疾病状态以及缓和或改良预后。例如，如果与疾病(例如，狼疮)相关的一种或多种症状减轻或消除了，则个体被成功“治疗”。
本文所用的术语“预防”包括在个体中提供与疾病的发作或复发相关的预防。个体可以倾向于或有发展疾病或疾病复发风险，但是还没有诊断出疾病或疾病复发。
如本文所用的，有发展疾病或疾病状态或其复发(例如SLE)或再度恶化“风险”的哺乳动物，在按照本公开进行治疗之前可能具有或可能不具有可检测的疾病或疾病症状，以及可能已表现出或可能还未表现出可检测的疾病或疾病症状。“有风险”表示哺乳动物具有一种或多种风险因子，所述风险因子是与本领域已知的和/或本文所描述的疾病或疾病状态发展相关的可测量的参数。
“有效量”是指至少在剂量上有效的量且持续实现期望的治疗或预防效果所需的时间。可以在一次或多次给药中提供有效量。在本公开的一些实例中，术语“有效量”表示实现上文所述的疾病或疾病状态的治疗所需的量。有效量可以随待治疗的疾病或疾病状态而不同，并且还可以随与被治疗的哺乳动物相关的体重、年龄、种族背景、性别、健康状况和/或身体状况以及其他因素而不同。通常，有效量可以落入医学从业者通过常规测试和实验可以确定的相对宽泛的范围(例如“剂量”范围)内。可以以单剂量或可以以在一段治疗时间重复一次或数次的剂量给予有效量。
“治疗有效量”至少是实现特定病症(例如，SLE)可测量的改善所需的最低浓度。本文的治疗有效量可以随诸如患者的疾病状态、年龄、性别和体重的因素以及个体中免疫球蛋白引发期望应答的能力而不同。治疗有效量还是其中治疗有益作用超过免疫球蛋白的任何毒性或有害作用的量。
“预防有效量”是指在剂量上有效的量且持续实现期望的预防效果所需的时间。通常但并非必需的，由于预防剂量在疾病之前或在疾病早期阶段用于哺乳动物中，因此预防有效量可以小于治疗有效量。
如本文所用的，“浆细胞样树突状细胞”或“pDC”是见于外周血淋巴器官中的能产生I型干扰素如IFNα和IFNβ的一类循环树突状细胞。人pDC表达表面标志物IL-3Rα、BDCA-2(CD303)、BDCA-4(CD304)和toll样受体7和9。通常，人pDC不表达CD11c或CD14。典型的人pDC表面表型是CD20-、CD3-CD14-、CD19-CD56-、HLA-DR+、CD11c-和CD123+。
如本文所用的，“嗜碱性粒细胞”是一类能产生多种细胞因子(例如，IL-4、IL-6、IL-13)、组胺和白三烯的稀有的粒细胞。人嗜碱性粒细胞表达细胞表面标志物如IL-3Rα、FcεR1、CD49b、CD69或CD203。
术语“裸抗体”是指没有与另一种化合物，例如毒性化合物或放射性标记物缀合的抗体。
仅为了系统命名的目的且并非限制，IL-3Rα链的氨基酸序列参见Gene ID登录号3563和/或SEQ ID NO:1。
按照本公开治疗的“哺乳动物”可以灵长类、牲畜(例如绵羊、马、牛、猪、驴)、伴生动物(例如诸如狗和猫的宠物)、实验室试验动物(例如小鼠、兔、大鼠、豚鼠)、表演动物(例如赛马、骆驼、灵缇犬)或捕获的野生动物。在一实例中，哺乳动物是人。
免疫球蛋白
适用于本公开方法的示例性免疫球蛋白如本文所述，并且以下的段落描述了其他示例性的免疫球蛋白。
在一实例中，免疫球蛋白能够减少已与IFNα分泌诱导剂接触的PBMC的IFNα分泌。例如，将PBMC暴露于toll样受体(TLR)-7/9激动剂，例如CpG寡核苷酸，例如C型CpG寡核苷酸。例如，将细胞与浓度为1μM或2μM或3μM或4μM或5μM的C型CpG寡核苷酸接触。在一实例中，与在不存在免疫球蛋白或存在同种型对照免疫球蛋白(例如，其不结合IL-3Rα)情况下的水平相比，IFNα的水平降低。在一实例中，IFNα的水平降低约50%或至少60%或至少70%或至少80%或至少90%。例如，免疫球蛋白能够实现IFNα的降低，其浓度为0.01μg/ml至约15μg/ml，例如0.04μg/ml至约4μg/ml，例如，0.1μg/ml至约1μg/ml。
在另一实例中，免疫球蛋白能够减少PBMC群体中可检测的pDC和/或嗜碱性粒细胞的数量。在一实例中，与在不存在免疫球蛋白或存在同种型对照免疫球蛋白(例如，其不结合IL-3Rα)情况下的水平相比，pDC和/或嗜碱性粒细胞的数量减少。在一实例中，pDC和/或嗜碱性粒细胞的数量减少约50%或至少60%或至少70%或至少80%或至少90%。在一实例中，免疫球蛋白能够在PBMC与免疫球蛋白接触后4小时内，或PBMC与免疫球蛋白接触后24小时内或PBMC与免疫球蛋白接触后48小时内减少pDC和/或嗜碱性粒细胞的数量。
在另一实例中，在以不超过2mg/kg的剂量，例如不超过1mg/kg的剂量或不超过0.1mg/kg的剂量单次给药后，免疫球蛋白能够减少哺乳动物(例如，非人灵长类，诸如石蟹猴)中循环的嗜碱性粒细胞和/或pDC的数量，持续至少7天。例如，嗜碱性粒细胞和/或pDC的数量减少至小于给予免疫球蛋白之前的细胞数量的70%(或80%或90%或95%)。在一实例中，将细胞的数量计算为外周血中总细胞的百分比。例如，细胞减少持续至少8天或10天或11天。例如，pDC数量减少持续至少8天或9天或10天或11天或12天或13天或14天或15天。在一实例中，pDC数量减少持续至少11天。例如，嗜碱性粒细胞数量减少持续至少5天或6天或7天或8天或9天或10天。在一实例中，嗜碱性粒细胞数量减少持续至少8天。
在另一实例中，在以不超过40mg/kg的剂量，例如不超过30mg/kg的剂量或不超过10mg/kg的剂量单次给药后，免疫球蛋白能够降低哺乳动物(例如，非人灵长类，诸如石蟹猴)中循环的嗜碱性粒细胞和/或pDC的数量，持续至少15天。例如，嗜碱性粒细胞和/或pDC的数量降低至小于给予免疫球蛋白之前的细胞数量的70%(或80%或90%或95%)。在一实例中，将细胞的数量计算为外周血中总细胞的百分比。例如，细胞降低持续至少21天或22天或30天或35天或40天或49天或50天或57天或63天或65天或70天。例如，pDC数量降低持续至少12天或13天或14天或15天或16天或17天或18天或19天或20天。在一实例中，pDC数量降低持续至少15天。例如，嗜碱性粒细胞数量降低持续至少12天或13天或14天或15天或16天或17天或18天或19天或20天或21天或22天或23天或24天或25天或26天或27天或28天。在一实例中，嗜碱性粒细胞数量降低持续至少15天(例如，10mg/kg剂量之后)或22天(例如，30mg/kg剂量之后)。
在一实例中，当给予哺乳动物(例如，非人灵长类，诸如石蟹猴)时，免疫球蛋白不减少或消耗嗜中性粒细胞和/或T细胞和/或B细胞和/或单核细胞和/或红细胞的数量。例如，与给予免疫球蛋白之前的水平相比，免疫球蛋白不能使嗜中性粒细胞和/或T细胞和/或B细胞和/或单核细胞和/或红细胞的数量减少或消耗超过约10%或20%或30%或40%或50%或统计学显著的量。例如，免疫球蛋白不诱导嗜中性粒细胞和/或T细胞和/或B细胞和/或单核细胞和/或红细胞的死亡。
抗体
在一实例中，按照任何实例，本文所述的免疫球蛋白是抗体。
产生抗体的方法在本领域内是已知的和/或描述于Harlow and Lane(主编)Antibodies:A Laboratory Manual(抗体：实验室手册),Cold SpringHarbor Laboratory,(1988)。通常，在这类方法中，将IL-3Rα蛋白或其免疫原性片段或表位或表达并展示这些(即，免疫原)的细胞，任选地与任何合适的或期望的载体、佐剂或药学上可接受的赋形剂一起配制，并给予非人动物，例如，小鼠、鸡、大鼠、兔、豚鼠、狗、马、牛、山羊或猪。可以通过鼻内、肌肉内、皮下、静脉内、皮内、腹膜内途径或通过任何其他已知的途径给予免疫原。
可以通过对免疫后不同时间点的免疫动物采集血液来监测多克隆抗体的产生。如果需要达到期望的抗体滴度，可以给予一次或多次另外的接种免疫。重复增强和滴定的过程直到达到合适的滴度。当获得期望的免疫原性水平时，对免疫动物取血，分离血清并储存，和/或使用动物来产生单克隆抗体(Mab)。
单克隆抗体是本公开所考虑的一种示例性的抗体形式。术语“单克隆抗体”或“MAb”是指能够与相同的抗原，例如，抗原内相同的表位结合的同质抗体群。该术语并非意图限制抗体的来源或产生抗体的方式。
为了产生Mab，可以使用多种已知技术中的任何一种，诸如例如，US4196265或Harlow and Lane(1988)，同上中示例的方法。
例如，在足以刺激产抗体细胞的条件下，用免疫原免疫合适的动物。诸如兔、小鼠和大鼠的啮齿动物是示例性动物。经遗传改造以表达人免疫球蛋白并且例如不表达鼠免疫球蛋白的小鼠，也可以用于产生本公开的抗体(例如，如WO2002/066630中所描述)。
免疫后，选择具有产生抗体潜能的体细胞，尤其是B淋巴细胞(B细胞)，用于产生MAb的方案中。这些细胞可以获自脾、扁桃体或淋巴结的活检组织，或获自外周血样品。然后将来自免疫动物的B细胞与永生的骨髓瘤细胞融合，所述骨髓瘤细胞通常来源于与免疫原所免疫的动物相同的物种。
通过在选择培养基中培养来扩增杂合体，所述选择培养基包含能在组织培养基中阻断核苷酸重新合成的试剂。示例性的试剂氨基蝶呤、氨甲蝶呤和重氮丝氨酸。
例如，通过流式细胞术和/或免疫组化和/或免疫测定(例如放射性免疫测定、酶免疫测定、细胞毒性测定、空斑测定、斑点免疫测定等)，将扩增的杂交瘤进行抗体特异性和/或滴度的功能选择。
可选地，ABL-MYC技术(NeoClone，Madison WI 53713，USA)用于产生分泌MAb的细胞系(例如，如Largaespada et al,J.Immunol.Methods.197:85-95,1996中所描述的)。
还可以通过筛选展示文库，例如噬菌体展示文库，来产生和分离抗体，例如如US6300064和/或US5885793中所描述的。
在一实例中，抗体是US 6,177,078中所描述的7G3、6H6或9F5。还考虑这些抗体的修饰版本(例如，诸如通过本文所述方法的去免疫化、嵌合或人源化版本)。
嵌合抗体
免疫球蛋白可以是合成的免疫球蛋白。在一实例中，本文所述的抗体是嵌合抗体。术语“嵌合抗体”是指这样抗体，其中重链和/或轻链的一部分与来源于特定物种(例如，鼠，诸如小鼠)或属于特定抗体种类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，而链的其余部分与与来源于另一物种(例如，灵长类，诸如人)或属于另一抗体种类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源。通常，为了产生主要具有人结构域的抗体，嵌合抗体利用啮齿动物或兔的可变区以及人的恒定区。产生嵌合抗体的方法描述于例如US4816567和US5807715中。
本公开还包括嵌合免疫球蛋白，例如其中将来自一个物种的可变区与来自另一物种的蛋白区融合。例如，本公开考虑包含来自一物种的T细胞受体的可变区的免疫球蛋白，所述T细胞受体的可变区与来自不同物种的T细胞受体恒定结构区域融合。人源化抗体和人抗体
本公开的抗体可以是人源化的或人的。
术语“人源化抗体”应被理解为指一种嵌合抗体亚类，其具有来源于非人物种的抗体的抗原结合位点或可变区和其余的基于人抗体的结构和/或序列的抗体结构。抗原结合位点包含移植到人抗体可变结构域的适当FR上的来自非人抗体的互补性决定区(CDR)和其余来自人抗体的区域。抗原结合位点可以是野生型的或通过一个或多个氨基酸取代而修饰的。在某些情况下，人免疫球蛋白的FR残基由对应的非人残基取代。
非人抗体或或其一部分(例如，可变区)人源化的方法是本领域内已知的。可以按照US5225539或US5585089的方法进行人源化。不排除抗体人源化的其他方法。
本文所用的与抗体相关的术语“人抗体”是指具有来源于或对应于人(例如人种系细胞或体细胞)中所见的序列的可变区(例如VH、VL)以及任选地恒定区的抗体。“人抗体”可以包括不是人序列所编码的氨基酸残基，例如通过随机或体外定点突变所引入的突变(尤其是涉及少量的抗体残基，例如抗体的1、2、3、4或5个残基，例如构成抗体的一个或多个CDR的1、2、3、4或5个残基中的保守型取代或突变)。这些“人抗体”实际上并非必需由人产生，而是，它们可以利用重组方法产生和/或可以从包含编码人抗体恒定区和/或可变区的核酸的转基因动物(例如，小鼠)分离(例如，如上文所述)。人抗体可以利用本领域内已知的多种技术来产生，包括噬菌体展示文库(例如，如US5885793中所描述的)。
识别所选表位的人抗体还可以利用称为“定向选择(guided selection)”的技术来产生。在该方法中，所选的非人单克隆抗体，例如小鼠抗体，用于指导识别相同表位的完全为人的抗体的选择(例如，如US5565332中所描述的)。
去免疫化抗体和免疫球蛋白
本公开还考虑去免疫化抗体或蛋白。去免疫化抗体和蛋白已被移除(即，突变)了一个或多个表位，例如B细胞表位或T细胞表位，从而降低了哺乳动物将激发对所述抗体或蛋白的免疫应答的可能性。产生去免疫化抗体和蛋白的方法是本领域内已知的，且描述于例如WO00/34317、WO2004/108158和WO2004/064724中。
引入合适的突变并表达和测定所产生的蛋白的方法基于本文的描述对于本领域技术人员而言是显而易见的。
重链抗体
重链抗体在结构上与很多其他形式的抗体的不同在于，它们包含重链但不包含轻链。因此，这些免疫球蛋白也被称为“只有重链的抗体”。重链免疫球蛋白见于例如，骆驼和软骨鱼(也称为IgNAR)中。
为了将天然存在的重链抗体中所存在的可变区与常规4链抗体中所存在的重链可变区(其被称为“VH结构域”)和常规4链抗体中所存在的轻链可变区(其被称为“VL结构域”)区别开来，通常将重链抗体中所存在的可变区称为骆驼抗体中的“VHH结构域”和IgNAR中的V-NAR。
来自骆驼的重链抗体及其可变区以及用于其产生和/或分离和/或使用的方法的一般描述特别参见以下参考文献：WO94/04678、WO97/49805和WO 97/49805。
来自软骨鱼的重链免疫球蛋白及其可变区以及用于其产生和/或分离和/或使用的方法的一般描述特别参见WO2005/118629。
抗体片段
单结构域抗体
在一些实例中，本公开的免疫球蛋白是或包含单结构域抗体(其与术语“结构域抗体”或“dAb”可交换使用)。单结构域抗体是包含抗体的所有或一部分重链可变结构域的单条多肽链。在某些实例中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见例如US6248516)。
双链抗体、三链抗体、四链抗体
在一些实例中，本公开的免疫球蛋白是或包含双链抗体、三链抗体四链抗体或诸如WO98/044001和/或WO94/007921中所描述的更高级别的蛋白复合物。
例如，双链抗体是包含两条相关多肽链的蛋白，每条多肽链都包含结构VL-X-VH或VH-X-VL，其中VL是抗体轻链可变区，VH是抗体重链可变区，X是包含不足以允许单条多肽链中的VH和VL连接(或形成Fv)的残基的连接体或不存在，并且其中一条多肽链的VH与另一条多肽链的VL结合，从而形成抗原结合位点，即，形成能够特异性结合一种或多种抗原的Fv分子。VL和VH在每条多肽链中可以是相同的，或者VL和VH在每条多肽链中可以是不同的，以便形成双特异性双链抗体(即，包含具有不同特异性的两个Fv)。
能够诱导效应子活性的双链抗体、三链抗体、四链抗体等可以利用能够结合IL-3Rα的抗原结合结构域和能够结合免疫细胞例如T细胞(例如，CD3)上的细胞表面分子的抗原结合结构域来产生。
单链Fv(scFv)片段
本领域技术人员应当意识到，scFvs包含处于单条多肽链中的VH和VL区以及VH和VL间的多肽连接体，所述多肽连接体能够使得scFv形成期望的用于抗原结合的结构(即，用于单条多肽链的VH和VL彼此连接从而形成Fv)。例如，连接体包含超过12个氨基酸残基，(Gly4Ser)3是scFv的多个优选连接体之一。
本公开还考虑二硫化物稳定的Fv(或diFv或dsFv)，其中将一个半胱氨酸残基引入VH的FR和VL的FR，并且半胱氨酸残基通过二硫键连接从而产生稳定的Fv。
可选地或此外，本公开包括二聚scFv，即，包含通过非共价或共价键，例如通过亮氨酸拉链结构域(例如，来源于Fos或Jun)而连接的两个scFv分子的蛋白。可选地，两个scFv通过长度足以允许两个scFv形成并能够结合抗原的肽连接体而连接，如在S20060263367中所描述
本公开还考虑能够诱导效应子活性的二聚scFv。例如，一个scFv能结合IL-3Rα，另一个scFv能结合免疫细胞例如T细胞(例如，CD3)上的细胞表面分子。在一实例中，二聚蛋白是dAb和scFv的组合。能够诱导效应子功能的双特异性抗体片段的实例描述于例如US7235641中。
其他抗体和抗体片段
本公开还考虑其他抗体和抗体片段，例如：
(i)US5,731,168中所描述的“钥孔(key and hole)”双特异性蛋白；
(ii)异源缀合蛋白，例如US4,676,980中所描述的；
(iii)利用化学交联连接体产生的异源缀合蛋白，例如如US4,676,980中所描述的；以及
(iv)Fab3(例如，如EP19930302894中所描述的)。
Fc区
本公开包括包含抗体的Fc区的免疫球蛋白，包括与Fc融合的免疫球蛋白的抗原结合片段
用于产生本公开蛋白的Fc区的序列可以从很多来源获得。在一些实例中，蛋白的Fc或其一部分来源于人抗体。此外，Fc或其一部分可以来源于任何抗体种类(包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE)和任何抗体同种型(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)。在一实例中，Fc是人同种型IgG1或人同种型IgG2或人同种型IgG3或以上任一个的杂合体。
在一实例中，Fc区能够诱导效应子功能。例如，Fc区是人IgG1或IgG3Fc区。在另一实例中，Fc区是IgG1和IgG2Fc区的杂合体或IgG1和IgG3Fc区的杂合体或IgG2和IgG3Fc区的杂合体。人IgG1和IgG2Fc区的示例性杂合体描述于Chappel et al.，Proc.Natl Acad.Sci.USA，88:9036-9040，1991中。
用于确定Fc区是否能诱导效应子功能的方法对本领域技术人员是显而易见的和/或在本文做了描述。
效应子功能
合适的是，适用于本公开方法的抗IL-3Rα免疫球蛋白具有或表现出促进或能够使IL-3Rα+浆细胞样树突状细胞至少部分消耗、大量消耗或消除的效应子功能。这种效应子功能可以是增强的对Fc受体的结合亲和力、增强的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、增强的抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)和/或增强的补体依赖性细胞毒性(CDC)。
如同基于本文的描述对本领域技术人员所显而易见的，本公开的一些实例利用能够诱导效应子功能的免疫球蛋白。
在一实例中，免疫球蛋白以其能够诱导效应子功能，如ADCC这样的方式结合IL-3Rα。
在一实例中，免疫球蛋白结合IL-3Rα内的表位，该表位允许免疫球蛋白诱导效应子功能，如ADCC。
在另一实例中，免疫球蛋白能够结合哺乳动物中pDC和/或嗜碱性粒细胞上的IL-3Rα，从而诱导效应子功能，如ADCC。
例如，免疫球蛋白保持结合细胞表面上的IL-3Rα持续足以诱导效应子功能，如ADCC的时间。例如，免疫球蛋白不会被太快内在化，而允许诱导ADCC。
可选地或此外，免疫球蛋白以允许免疫效应细胞结合免疫球蛋白中的Fc区并诱导效应子功能如ADCC的方式，结合细胞表面上的IL-3Rα。例如，当免疫球蛋白结合能够与免疫效应细胞上的Fc受体(例如，FcγR)相互作用的IL-3Rα结合时，免疫球蛋白的Fc区就以这样的方式暴露。在本公开的背景下，术语“免疫效应细胞”应被理解为表示，表达Fc受体且能够通过ADCC或ADCP杀死与其结合的细胞的任何细胞。
涉及免疫球蛋白的效应子功能的上述段落的每一个都应被认为准用于诱导CDC。例如，免疫球蛋白以允许补体成分C1q结合免疫球蛋白中的Fc区并诱导CDC的方式结合到细胞表面上的IL-3Rα。
在一实例中，免疫球蛋白能够诱导水平升高的效应子功能。
在一实例中，由Fc区所诱导的效应子功能水平相对于IgG1抗体的野生型Fc区或IgG3抗体的野生型Fc区升高。
在另一实例中，与没有修饰的Fc区相比，Fc区经修饰能提高其能够诱导的效应子功能水平。这类修饰可以在氨基酸水平和/或二级结构水平和/或三级结构水平和/或是对Fc区的糖基化。
在一实例中，抗IL-3Rα免疫球蛋白具有或表现出的效应子功能水平大于ch7G3(含有野生型人IgG1Fc区的7G3的嵌合版本，在国际公开W02009/070844中称为CSL360)或hz7G3(包含野生型人IgG1Fc区的7G3的人源化版本)所表现出的水平。在本公开的背景下，ch7G3和hz7G3表现出基本相同水平的效应子功能。
本领域技术人员应当理解，可以以很多方式中的任何一种来表明较高的效应子功能，例如较高水平的影响、更持久的影响或更快速的影响。
例如，抗IL-3Rα免疫球蛋白具有或表现出包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)在内的效应子功能。
在一实例中，Fc区包含能提高其诱导增强的效应子功能的能力的一个或多个氨基酸修饰。在一实例中，Fc区以更高的亲和力结合一种或多种FcγR。在一实例中，Fc区对FcγR的亲和力比野生型Fc区亲和力大1倍多或比野生型Fc区亲和力大5倍多或比野生型Fc区亲和力大5倍至300倍。在一实例中，Fc区在选自以下的位置处包含至少一个氨基酸取代：230、233、234、235、239、240、243、264、266、272、274、275、276、278、302、318、324、325、326、328、330、332和335，所述位置按Kabat的EU指数编号。在一实例中，Fc区包含选自以下的至少一个氨基酸取代：P230A、E233D、L234E、L234Y、L234I、L235D、L235S、L235Y、L235I、S239D、S239E、S239N、S239Q、S239T、V240I、V240M、F243L、V264I、V264T、V264Y、V266I、E272Y、K274T、K274E、K274R、K274L、K274Y、F275W、N276L、Y278T、V302I、E318R、S324D、S324I、S324V、N325T、K326I、K326T、L328M、L328I、L328Q、L328D、L328V、L328T、A330Y、A330L、A330I、I332D、I332E、I332N、I332Q、T335D、T335R和T335Y、其按Kabat的EU指数编号。在一实例中、Fc区包含选自以下的氨基酸取代：V264I、F243L/V264I、L328M、I332E、L328M/I332E、V264I/I332E、S298A/I332E、S239E/I332E、S239Q/I332E、S239E、A330Y、I332D、L328I/I332E、L328Q/I332E、V264T、V240I、V266I、S239D、S239D/I332D、S239D/I332E、S239D/I332N、S239D/I332Q、S239E/I332D、S239E/I332N、S239E/I332Q、S239N/I332D、S239N/I332E、S239Q/I332D、A330Y/I332E、V264I/A330Y/I332E、A330L/I332E、V264I/A330L/I332E、L234E、L234Y、L234I、L235D、L235S、L235Y、L235I、S239T、V240M、V264Y、A330I、N325T、L328D/I332E、L328V/I332E、L328T/I332E、L328I/I332E、S239E/V264I/I332E、S239Q/V264I/I332E、S239E/V264I/A330Y/I332E、S239D/A330Y/I332E、S239N/A330Y/I332E、S239D/A330L/I332E、S239N/A330L/I332E、V264I/S298A/I332E、S239D/S298A/I332E、S239N/S298A/I332E、S239D/V264I/I332E、S239D/V264I/S298A/I332E、S239D/V264I/A330L/I332E、S239D/I332E/A330I、P230A、P230A/E233D/I332E、E272Y、K274T、K274E、K274R、K274L、K274Y、F275W、N276L、Y278T、V302I、E318R、S324D、S324I、S324V、K326I、K326T、T335D、T335R、T335Y、V240I/V266I、S239D/A330Y/I332E/L234I、S239D/A330Y/I332E/L235D、S239D/A330Y/I332E/V240I、S239D/A330Y/I332E/V264T、S239D/A330Y/I332E/K326E和S239D/A330Y/I332E/K326T，其按Kabat的EU指数编号。
在另一实例中，相对于FcγRIIb，Fc区能更有效地结合FcγRIIIa。例如，Fc区在选自以下的位置处包含至少一个氨基酸取代：234、235、239、240、264、296、330和I332，所述位置按Kabat的EU指数编号。在一实例中，Fc区包含选自以下的至少一个氨基酸取代：L234Y、L234I、L235I、S239D、S239E、S239N、S239Q、V240A、V240M、V264I、V264Y、Y296Q、A330L、A330Y、A330I、I332D和I332E，其按Kabat的EU指数编号。例如，Fc区包含选自以下的氨基酸取代：I332E、V264I/I332E、S239E/I332E、S239Q/I332E、Y296Q、A330L、A330Y、I332D、S239D、S239D/I332E、A330Y/I332E、V264I/A330Y/I332E、A330L/I332E、V264I/A330L/I332E、L234Y、L234I、L235I、V240A、V240M、V264Y、A330I、S239D/A330L/I332E、S239D/S298A/I332E、S239N/S298A/I332E、S239D/V264I/I332E、S239D/V264I/S298A/I332E和S239D/V264I/A330L/I332E，其按Kabat的EU指数编号。
在另一实例中，Fc区诱导的ADCC的水平大于野生型Fc区介导的水平。例如，Fc区诱导ADCC的水平比野生型Fc区诱导的水平大5倍多或比野生型Fc区诱导的水平大5倍至1000倍。在一实例中，Fc区在选自以下的位置处包含至少一个氨基酸取代：230、233、234、235、239、240、243、264、266、272、274、275、276、278、302、318、324、325、326、328、330、332和335，所述位置按Kabat的EU指数编号。在一实例中，Fc区包含选自以下的至少一个氨基酸取代：P230A、E233D、L234E、L234Y、L234I、L235D、L235S、L235Y、L235I、S239D、S239E、S239N、S239Q、S239T、V240I、V240M、F243L、V264I、V264T、V264Y、V266I、E272Y、K274T、K274E、K274R、K274L、K274Y、F275W、N276L、Y278T、V302I、E318R、S324D、S324I、S324V、N325T、K326I、K326T、L328M、L328I、L328Q、L328D、L328V、L328T、A330Y、A330L、A330I、I332D、I332E、I332N、I332Q、T335D、T335R和T335Y，其按Kabat的EU指数编号。在一实例中，Fc区包含选自以下的氨基酸取代：V264I、F243L/V264I、L328M、I332E、L328M/I332E、V264I/I332E、S298A/I332E、S239E/I332E、S239Q/I332E、S239E、A330Y、I332D、L328I/I332E、L328Q/I332E、V264T、V240I、V266I、S239D、S239D/I332D、S239D/I332E、S239D/I332N、S239D/I332Q、S239E/I332D、S239E/I332N、S239E/I332Q、S239N/I332D、S239N/I332E、S239Q/I332D、A330Y/I332E、V264I/A330Y/I332E、A330L/I332E、V264I/A330L/I332E、L234E、L234Y、L234I、L235D、L235S、L235Y、L235I、S239T、V240M、V264Y、A330I、N325T、L328D/I332E、L328V/I332E、L328T/I332E、L328I/I332E、S239E/V264I/I332E、S239Q/V264I/I332E、S239E/V264I/A330Y/I332E、S239D/A330Y/I332E、S239N/A330Y/I332E、S239D/A330L/I332E、S239N/A330L/I332E、V264I/S298A/I332E、S239D/S298A/I332E、S239N/S298A/I332E、S239D/V264I/I332E、S239D/V264I/S298A/I332E、S239D/V264I/A330L/I332E、S239D/I332E/A330I、P230A、P230A/E233D/I332E、E272Y、K274T、K274E、K274R、K274L、K274Y、F275W、N276L、Y278T、V302I、E318R、S324D、S324I、S324V、K326I、K326T、T335D、T335R、T335Y、V240I/V266I、S239D/A330Y/I332E/L234I、S239D/A330Y/I332E/L235D、S239D/A330Y/I332E/V240I、S239D/A330Y/I332E/V264T、S239D/A330Y/I332E/K326E和S239D/A330Y/I332E/K326T，其按Kabat的EU指数编号。
在一实例中，Fc区包含以下氨基酸取代S239D/I332E，其按Kabat的EU指数编号。该Fc区与野生型Fc区相比对FcγRIIIa的亲和力提高约14倍，且与野生型Fc区相比诱导ADCC的能力提高约3.3倍。
在一实例中，Fc区包含以下氨基酸取代S239D/A330L/I332E，其按Kabat的EU指数编号。该Fc区与野生型Fc区相比对FcγRIIIa的亲和力提高约138倍，且与野生型Fc区相比诱导ADCC的能力提高约323倍。
能够提高Fc区诱导效应子功能的能力的其他氨基酸取代，是本领域内已知的和/或描述于例如US6737056或US7317091中。
在一实例中，改变Fc区的糖基化以提高其诱导增强的效应子功能的能力。就这点而言，由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含分支的二分支寡糖，所述寡糖通常是通过N-连接连接于Fc区CH2结构域的Asn297。寡糖可以包括多种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及与二分支(biantennary)寡糖结构“茎部”中的GlcNAc连接的岩藻糖。在一些实例中，本公开的Fc区包含缺少与Fc区(直接或间接)连接的岩藻糖的碳水化合物结构，即，Fc区是“去岩藻糖化的”。这类变体可以具有提高的诱导ADCC的能力。产生去岩藻糖化抗体的方法包括，在不能表达α-1,6-岩藻糖基转移酶(FUT8)的细胞系中表达免疫球蛋白(例如，如Yumane-Ohnuki et al.,Biotechnol.Bioengineer.,87:614-622,2004中所描述的)、在表达针对FUT8的小干扰RNA的细胞中表达免疫球蛋白(例如，如Mori et al.,Biotechnol.Bioengineer.,88:901-908,2004中所描述的)、在不能表达鸟苷二磷酸(GDP)-甘露糖4，6-脱水酶(GMD)的细胞中表达免疫球蛋白(例如，如Kanda et al.,J.Biotechnol.,130:300-310,2007中所描述的)。本公开还考虑了具有降低的岩藻糖化水平的免疫球蛋白的用途，所述免疫球蛋白例如利用经修饰以表达β—(1,4)-N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶III(GnT-III)的细胞系产生(例如，如Umāna et al.,Nat.Biotechnol.,17:176-180,1999中所描述的)。
在一实例中，本公开的免疫球蛋白是去岩藻糖化的。例如，免疫球蛋白在不表达FUT8的细胞(例如，哺乳动物细胞，诸如CHO细胞)中产生。
其他方法包括使用本身就产生能够诱导增强的Fc介导的效应子功能的抗体的细胞系(例如用于产生病毒疫苗的鸭胚胎来源的干细胞，WO2008/129058；产生重组蛋白的鸟
Figure BDA00002199991900331
细胞，WO 2008/142124)。
可用于本公开方法中的免疫球蛋白还包括具有二分化寡糖(bisectedoligosaccharide)的那些，例如其中与Fc区连接的二分支寡糖由GlcNAc平分。这类免疫球蛋白可以具有降低的岩藻糖化和/或提高的ADCC功能。这类免疫球蛋白的实例描述于例如US6602684和US20050123546中。
还考虑了在寡糖中具有至少一个与Fc区连接的半乳糖残基的免疫球蛋白。这类免疫球蛋白可以具有提高的CDC功能。这类免疫球蛋白描述于例如WO1997/30087和WO1999/22764中。
表现出ADCC活性的免疫球蛋白的非限制性实例包括本文称为“hz7G3Vl”、“hz7G3V2”和“hz7G3V3”的单克隆抗体。在每种情况下，由这些免疫球蛋白表现出的效应子功能水平相对于ch7G3(包含野生型人IgG1 Fc区的7G3的嵌合形式)或hz7G3的水平是提高的或大于ch7G3或hz7G3的水平。
在另一非限制性实例中，可以重头产生这样的抗IL-3Rα免疫球蛋白，所述免疫球蛋白由于结合不同的表位或具有较慢的内在化动力学(例如与ch7G3或hz7G3相比)而具有增强的效应子功能，如增强的ADCC功能。
测定免疫球蛋白诱导效应子功能的能力的方法是本领域已知的和/或在本文中有较详细的描述。
其他修饰
本公开还考虑了对免疫球蛋白的其他修饰。
例如，免疫球蛋白包含能增加免疫球蛋白的半衰期的一个或多个氨基酸取代。例如，免疫球蛋白包含的Fc区包含能提高Fc区对新生儿Fc区(FcRn)的亲和力的一个或多个氨基酸取代。例如，Fc区在较低的pH，例如约pH 6.0时对FcRn具有提高的亲和力，以促进内涵体中的Fc/FcRn结合。在一实例中，与Fc区在约pH7.4时的亲和力相比，其在约pH 6时对FcRn的亲和力增加，这促进了Fc在细胞再循环之后重新释放入血液中。这些氨基酸取代通过降低从血液的清除可用于延长免疫球蛋白的半衰期。
示例性的氨基酸取代包括按照Kabat的EU编号系统的T250Q和/或M428L。例如，在US20070135620中描述了其他或可选的氨基酸取代。
蛋白产生
在一实例中，本文所述的任何实例的免疫球蛋白通过在足以产生免疫球蛋白的条件下培养杂交瘤来产生，例如如本文所描述和/或本领域内已知的。
重组表达
在另一实例中，本文所述的任何实例的免疫球蛋白是重组的。
就重组蛋白而言，可以将编码重组蛋白的核酸克隆入表达载体，然后将表达载体转染入宿主细胞，如大肠杆菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞，诸如猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚胎肾(HEK)细胞或除此之外不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞。用于表达免疫球蛋白的示例性细胞是CHO细胞、骨髓瘤细胞或HEK细胞。实现这些目标的分子克隆技术是本领域内已知的，且描述于例如如Ausubel et al.,(主编),Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates andWiley-Interscience(1988,包括至今的所有更新)或Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989)中。大量的克隆和体外扩增方法适用于重组核酸的构建。产生重组抗体的方法在本领域内是已知的。参见US4,816,567或US5530101。
分离后，将插入的核酸与表达构建体或表达载体中的启动子可操作地连接，用于进一步的克隆(DNA的扩增)或用于在无细胞系统或细胞中表达。
本文所用的术语“启动子”应在其最宽泛的背景下来理解，并且包括基因组基因的转录调控序列，包括TATA盒或起始元件，在具有或不具有改变核酸表达(例如响应于发育和/或外部刺激，或以组织特异性方式)的其他调控元件(例如，上游激活序列、转录因子结合位点、增强子和沉默子)，所述TATA盒或起始元件是精确转录起始所需的。在本背景下，术语“启动子”还用于描述重组的、合成的或融合核酸，或赋予、激活或增强启动子可操作地连接的核酸的表达的衍生物。示例性的启动子可以含有其他拷贝的一个或多个特异性调控元件以进一步增强所述核酸的表达和/或改变所述核酸的空间表达和/或时间表达。
本文所用的术语“与……可操作地连接”表示相对于核酸定位启动子，使得核酸的表达受启动子的控制。
用于在细胞中表达的很多载体是可获得的。载体组分通常包括但不限于，一个或多个以下元件：信号序列、编码免疫球蛋白的序列(例如，来源于本文提供的信息)、增强子元件、启动子和转录终止序列。本领域技术人员应当了解用于表达免疫球蛋白的合适序列。示例性的信号序列包括原核分泌信号(例如，pelB、碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp或耐热肠毒素II)、酵母分泌信号(例如，转化酶前导序列(invertase leader)、α因子前导序列或酸性磷酸酶前导序列)或哺乳动物分泌信号(例如，单纯疱疹gD信号)。
在哺乳动物细胞中有活性的示例性启动子包括巨细胞病毒立即早期启动子(CMV-IE)、人延伸因子1-α启动子(EF1)、小核RNA启动子(U1a和U1b)、α-肌凝蛋白重链启动子、猿猴病毒40启动子(SV40)、劳氏肉瘤病毒启动子(RSV)、腺病毒主要晚期启动子、β-肌动蛋白启动子；包含CMV增强子/β-肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子或其活性片段的杂合体调控元件。可用的哺乳动物宿主细胞系的实例是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚胎肾系(293或经亚克隆用于在悬浮培养物中生长的293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；或中国仓鼠卵巢细胞(CHO)。
适于在酵母细胞中表达的典型的启动子包括但不限于，ADHl启动子、GAL1启动子、GAL4启动子、CUP1启动子、PHO5启动子、nmt启动子、RPR1启动子或TEF1启动子，所述酵母细胞诸如例如选自以下的酵母细胞：毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和裂殖酵母(S.pombe)。
将分离的核酸或包含所述分离的核酸的表达构建体导入细胞中用于表达的方法是本领域技术人员已知的。用于给定细胞的计数取决于已知的成功技术。将重组DNA导入细胞中的方法包括显微注射、DEAE葡聚糖介导的转染、脂质体例如通过使用lipofectamine(Gibco，MD，USA)和/或cellfectin(Gibco，MD，USA)介导的转染、PEG介导的DNA摄取、电穿孔和诸如通过使用包被DNA的钨或金粒子(Agracetus Inc.，WI，USA)的微粒轰击等。
用于产生免疫球蛋白的宿主细胞可以在多种培养基中培养，这取决于所用的细胞类型。诸如Ham's Fl0(Sigma)、最小必需培养基((MinimalEssential Medium,MEM)，Sigma))、RPMl-1640(Sigma)和达尔伯克氏改良伊格尔培养基((Dulbecco's Modified Eagle's Medium,DMEM)，Sigma)的可商购的培养基适合培养哺乳动物细胞。培养本文论述的其他细胞类型的培养基是本领域内已知的。
蛋白的分离
纯化免疫球蛋白的方法是本领域内已知的和/或在本文中有描述。
如果免疫球蛋白被分泌到培养基中，通常首先利用可商购获得的蛋白浓缩滤器，例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元，从这类表达系统中浓缩上清液。可以在上述步骤的任一步中包括诸如PMSF的蛋白酶抑制剂以抑制蛋白水解，并且可以包括抗生素以防止外来污染物生长。
例如，可以利用离子交换、羟基磷灰石层析、疏水作用层析、凝胶电泳、透析、亲和层析(例如，蛋白A亲和层析或蛋白G层析)或上述的任意组合纯化从细胞制备的免疫球蛋白。这些方法是本领域内已知的，且描述于例如WO99/57134或Ed Harlow and David Lane(主编)Antibodies:A Laboratory Manual(抗体：实验室手册)，Cold Spring Harbour Laboratory，(1988)中。
本领域技术人员还应当了解，可以修饰免疫球蛋白使之包括能够促进纯化或检测的标签，例如多组氨酸标签(例如六组氨酸标签)、或流感病毒血凝素(HA)标签、或猿猴病毒5(V5)标签、或FLAG标签、或谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签。然后，利用本领域内已知的方法如亲和纯化来纯化得到的免疫球蛋白。例如，通过以下来纯化包含六组氨酸标签的免疫球蛋白：将包含免疫球蛋白的样品与能特异性结合固定于固体或半固体支持物上的六组氨酸标签的镍-氨基三乙酸(Ni-NTA)接触，洗涤样品已去除未结合的免疫球蛋白，以及随后洗脱结合的免疫球蛋白。可选地或此外，能结合标签的配体或抗体用于亲和纯化方法中。
测定免疫球蛋白的活性
确定竞争性结合
确定竞争性抑制单克隆抗体7G3的结合的免疫球蛋白的测定，对本领域技术人员而言是显而易见的。例如，将7G3与可检测的标记，例如荧光标记或放射性标记缀合。然后将标记的抗体与测试免疫球蛋白混合，并与IL-3Rα或其表位或表达IL-3Rα或其表位的细胞接触。然后测定标记7G3的水平，并与标记抗体与不存在免疫球蛋白情况下的IL-3Rα、表位或细胞接触时所测定的水平进行比较。如果与不存在测试免疫球蛋白的情况相比，存在测试免疫球蛋白的情况下标记7G3的水平降低，则免疫球蛋白被认为竞争性抑制7G3与IL-3Rα的结合。
任选地，将测试免疫球蛋白缀合于不同于7G3的标记。这种可选的标记允许检测测试免疫球蛋白与IL-3Rα或表位或细胞结合的水平。
在另一实例中，允许免疫球蛋白在IL-3Rα与7G3接触之前结合IL-3Rα。与不存在免疫球蛋白的情况相比，存在免疫球蛋白的情况下结合的7G3的量降低，表明免疫球蛋白竞争性抑制7G3与IL-3Rα的结合。还可以利用标记的免疫球蛋白并首先允许7G3结合IL-3Rα来进行相互测定。在这种情况下，与不存在7G3的情况相比，存在7G3的情况下结合IL-3Rα的标记免疫球蛋白的量降低，表明免疫球蛋白竞争性抑制7G3与IL-3Rα的结合。
在另一实例中，绘制免疫球蛋白结合的表位以确定其与7G3结合的表位是相同还是重叠。表位绘制方法对本领域技术人员而言是显而易见的。例如，产生一系列跨越IL-3Rα序列的重叠肽，例如包含10-15个氨基酸的肽。然后将免疫球蛋白与所确定的其能结合的每种肽接触。这允许确定包含免疫球蛋白所结合的表位的肽。如果免疫球蛋白结合多个非连续的肽，则免疫球蛋白可以结合构象表位。
可选地或此外，例如通过丙氨酸扫描诱变使IL-3Rα内的氨基酸残基突变，并确定降低或防免疫球蛋白和/或7G3结合的突变。降低或防止免疫球蛋白结合的任何突变都可能位于免疫球蛋白所结合的表位内。
可选地或此外，用7G3结合的表位产生免疫球蛋白，因而其可能结合相同的表位。
任选地，测定免疫球蛋白对IL-3Rα或其表位的解离常数(Kd)。在一实例中，IL-3Rα结合免疫球蛋白的“Kd”或“Kd值”通过放射性标记的IL-3Rα结合测定(RIA)来测量。该测定在存在滴定系列的未标记IL-3Rα的情况下，利用最低浓度的放射性IL-3Rα平衡免疫球蛋白。在洗涤以去除未结合的IL-3Rα之后，测定放射量，其表明蛋白的Kd。
按照另一实例，通过利用表面等离子体共振测定，例如利用BIAcore表面等离子体共振(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)，用固定的IL-3Rα来测量Kd或Kd值。
在一些实例中，选择与7G3具有相似Kd或具有比7G3高的Kd的蛋白，因为它们可能竞争与IL-3Rα的结合。
确定中和
在本公开的一些实例中，免疫球蛋白能够中和IL-3信号转导。
用于评价免疫球蛋白通过受体中和配体信号转导的能力的各种测定是本领域内已知的。
在一实例中，免疫球蛋白降低或防止IL-3与3Rα链和/或IL-3Rα链与IL-3Rβ链的异二聚体结合。可以利用标记的IL-3和/或标记的免疫球蛋白作为本文所述的竞争结合测定进行这些测定。
在另一实例中，免疫球蛋白降低或防止来自嗜碱性粒细胞的IL-3介导的组胺释放。例如，将包含嗜碱性粒细胞的低密度白细胞与IgE、IL-3和多种浓度的免疫球蛋白一起孵育。对照细胞不包含免疫球蛋白(阳性对照)或IL-3(阴性对照)。然后利用标准技术例如RIA评价释放的组胺水平。将组胺释放的水平降低至低于阳性对照水平的免疫球蛋白被认为能中和IL-3信号转导。在一实例中，降低的水平与免疫球蛋白浓度相关。例如，在Lopez et al.,J.Cell.Physiol.,145:69,1990中描述了评价IL-3介导的组胺释放的示例性方法。
在另一实例中，免疫球蛋白降低或防止白血病细胞系TF-1的IL-3介导的增殖。例如，将TF-1细胞在没有IL-3或GM-CSF的情况下培养足以使它们停止增殖的时间(例如，24-48小时)。然后，在存在IL-3和多种浓度的免疫球蛋白的情况下培养细胞。对照细胞不包含免疫球蛋白(阳性对照)或IL-3(阴性对照)。然后利用标准技术例如3H-脱氧胸苷掺入法评价细胞增殖。在存在IL-3的情况下，将细胞增殖降低或防止至低于阳性对照水平的免疫球蛋白被认为能中和IL-3信号转导。
评价IL-3信号转导中和的另一测定包括，确定免疫球蛋白是否降低或防止对内皮细胞的IL-3介导的作用。例如，在存在IL-3(任选地，有IFN-γ)和多种浓度的免疫球蛋白的情况下，培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。然后，例如利用酶联免疫吸附测定(ELISA)评价分泌IL-6的量。对照细胞不包含免疫球蛋白(阳性对照)或IL-3(阴性对照)。在存在IL-3的情况下，将IL-6产生降低或防止至低于阳性对照水平的免疫球蛋白被认为能中和IL-3信号转导。
本公开还考虑了评价IL-3信号转导中和的其他方法。
确定效应子功能
评价ADCC活性的方法在本领域内是已知的。
在一实例中，利用51Cr释放测定、铕释放测定或35S释放测定评价ADCC活性水平。在这些测定的每一种中，将表达IL-3Rα的细胞与一种或多种所述化合物在足以使化合物被细胞摄取的条件下培养一段时间。就35S释放测定而言，可以将表达IL-3Rα的细胞与35S标记的蛋氨酸和/或半胱氨酸培养足以使标记的氨基酸并入新合成的蛋白中的时间。然后，在存在或不存在免疫球蛋白以及存在免疫效应细胞如外周血单核细胞(PBMC)和/或NK细胞的情况下培养细胞。然后检测细胞培养基中51Cr、铕和/或35S的量，与不存在免疫球蛋白的情况相比，存在免疫球蛋白情况下的增加表明免疫球蛋白具有效应子功能。公开了评价免疫球蛋白所诱导的ADCC水平的示例性出版物包括Hellstrom,et al.Proc.Natl Acad.Sci.USA 83:7059-7063,1986以及Bruggemann,et al.,J.Exp.Med.166:1351-1361,1987。
评价免疫球蛋白所诱导的ADCC水平的其他测定包括流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology，Inc.CA，USA)或CytoTox
Figure BDA00002199991900401
非放射性细胞毒性测定(Promega，WI，USA)。
可选地或此外，通过测定免疫球蛋白对一种或多种FcγRs的亲和力来评价免疫球蛋白的效应子功能，例如如US7317091中所描述的。
还可以实施C1q结合测定以证实免疫球蛋白能结合C1q并可以诱导CDC。为了评价补体活化，可以进行CDC测定(参见例如，Gazzano-Santoroet al,J.Immunol.Methods 202:163,1996)。
评价治疗功效
体外测定
可利用多种体外测定来评价免疫球蛋白治疗本文所述的疾病或疾病状态如狼疮的能力。
例如，在存在或不存在免疫球蛋白和疾病或疾病状态中存在的那些细胞的诱导剂(例如，狼疮情况下的CpG寡核苷酸和/或免疫复合物)的情况下，培养pDC和/或嗜碱性粒细胞或包含这些细胞的细胞群(例如，PBMC)。然后，例如通过利用ELISA测定分泌入细胞培养基中的IFNα的水平，来评价免疫球蛋白在治疗疾病或疾病状态中的功效。可选地或此外，评价组胺分泌或IL-4、IL-6和/或IL-13分泌的水平。与不存在免疫球蛋白(或存在同种型对照免疫球蛋白)的情况相比，这些细胞因子中任一种的水平的降低，表明所述免疫球蛋白适于治疗疾病或疾病状态。可选地或此外，评价细胞死亡的水平。细胞死亡(尤其是在不存在其他细胞类型的死亡在背景以上的可检测的增加的情况下的pDC和/或嗜碱性粒细胞细胞死亡)的增加，表明免疫球蛋白适于治疗疾病或疾病状态。在这点上，如上文所论述的，认为诸如IFNα的细胞因子在某些疾病/疾病状态例如狼疮中起作用。因此，降低IFNα产生的免疫球蛋白被认为适于治疗这种疾病状态。
体内测定
在一实例中，利用体内测定评价免疫球蛋白治疗疾病或疾病状态的功效。
例如，将免疫球蛋白给予非人动物(例如，非人灵长类)，并评价循环的pDC和/或嗜碱性粒细胞数量/水平。与给予之前和/或没有给予免疫球蛋白的对照哺乳动物相比，降低pDC和/或嗜碱性粒细胞的数量/水平的免疫球蛋白被认为适于治疗疾病或疾病状态。
在另一实例中，例如利用ELISA，检测哺乳动物循环中的诸如IFNα的细胞因子的水平。与给予之前和/或没有给予免疫球蛋白的对照哺乳动物相比，降低细胞因子水平的免疫球蛋白被认为适于治疗疾病或疾病状态。由于诸如IFNα的细胞因子被认为在某些疾病/疾病状态例如狼疮中起作用，因此降低IFNα产生的免疫球蛋白被认为适于治疗这种疾病状态。
在另一实例中，将免疫球蛋白给予狼疮的非人哺乳动物(例如，非人灵长类)模型。例如，在足以产生SLE模型的条件下，将来自患有SLE的人的血浆输入非人灵长类如石蟹猴中，持续一段时间(例如，如Pincus etal.,Clin.Immunol.,105:141-154,2002中所描述的)。将免疫球蛋白给予非人灵长类，并例如利用本文所述的测定评价其对SLE症状的影响。例如，评价抗dsDNA抗体和/或免疫复合物的水平。降低一种或多种SLE症状的免疫球蛋白被认为适于治疗SLE。
待治疗的疾病状态
待通过本公开方法治疗的疾病或疾病状态通常与I型干扰素相关或部分由I型干扰素引起或介导和/或响应产生I型干扰素的树突细胞和/或嗜碱性粒细胞的消耗、去除或至少部分消除。合适的是，疾病或疾病状态选自系统性红斑狼疮(SLE)、干燥综合征和包括系统性硬皮病(SSc)在内的硬皮病。
在一实例中，疾病或疾病状态是狼疮。例如，疾病或疾病状态是盘状狼疮、亚急性皮肤型红斑狼疮、药物诱导性狼疮、新生儿狼疮、狼疮性肾炎或SLE。
具体的疾病或疾病状态是SLE。
在一实例中，SLE是血清阴性SLE，即，不以自身抗体为特征。因此，在一实例中，本公开的方法还包括鉴定患有血清阴性SLE的哺乳动物，例如通过检测自身抗体如本文所述的自身抗体的缺乏。
在另一实例中，SLE是血清阳性SLE。例如，SLE的特征为自身抗体，诸如抗核抗体(ANA)、抗C1q抗体、抗双链DNA(dsDNA)抗体、抗Sm抗体、抗核核糖核蛋白抗体、抗磷脂抗体、抗核糖体P抗体、抗Ro/SS-A抗体、抗Ro抗体和抗La抗体。因此，在一实例中，本公开的方法还包括鉴定患有血清阳性SLE的哺乳动物，例如通过检测自身抗体如本文所述的自身抗体的存在。
检测自身抗体的方法对本领域技术人员而言应是显而易见的。例如，在足以形成抗体抗原复合物的条件下，将来自个体的血清或血浆与抗原例如dsDNA接触一段时间。然后，在用于形成复合物的条件下，将得到的复合物与能够结合哺乳动物抗体的标记抗体(例如，抗Fc抗体)接触一段时间，并检测标记的量。标记的检测表明自身抗体的存在。
本文所述的任何实例的方法还可以包括，基于患有疾病或疾病状态或有发展疾病或疾病状态复发的风险，来选择用于治疗的哺乳动物。这类疾病状态和疾病的具体实例如上文所述。
例如，可以基于例如上文所述的自身抗体的检测，来鉴定患有狼疮或有发展出狼疮或其复发风险的个体。
此外或可选地，可以按照当前的美国风湿病学会(American College ofRheumatology，ACR)标准来诊断SLE和/或可以通过一个大不列颠群岛狼疮活动组(British Isles Lupus Activity Group，BILAG)“A”标准或两个BILAG“B”标准和/或通过欧洲统一狼疮活动测定(European ConsensusLupus Activity Measure，ECLAM)和/或通过狼疮活动指数(LAI)和/或通过国立卫生研究院SLE指数评分(National Institutes of Health SLE IndexScore，SIS)和/或通过系统性狼疮活动测定(Systemic Lupus ActivityMeasure，SLAM)和/或通过SLE疾病活动指数(SLEDAI)来定义活动疾病。根据Tan et al.Arth Rheum 25,1982改编的用来诊断SLE的一些病征、症状或其他指征可以是面颊红疹(例如脸颊上的疹子)、盘状红疹或红色凸起的板块(red raised patches)；光敏性诸如对阳光起反应，导致皮疹的发生或增加；口腔溃疡诸如鼻子或口的溃疡；关节炎诸如涉及两个或更多个周边关节的非侵蚀性关节炎(其中关节周围的骨头没有损坏的关节炎)；浆膜炎、胸膜炎或心包炎；肾病症诸如尿中蛋白过量(大于0.5gm/天或测试棒上为3+)和/或细胞管型(源于尿和/或白细胞和/或肾管细胞的异常部分)；神经学病征、症状或其他指征、突然发作(痉挛)和/或在没有药物情况下的精神病或已知能引起这类效应的代谢紊乱；以及血液学病征、症状或其他指征诸如溶血性贫血或白细胞减少症(每立方毫米白细胞计数低于4,000细胞)或淋巴球减少症(每立方毫米少于1,500个淋巴细胞)或血小板减少症(每立方毫米少于100,000个血小板)。必须有两次或更多次机会检测到白细胞减少症和淋巴球减少症。必须在没有已知能诱导血小板减少症的药物的情况下检测到血小板减少症。本公开并不局限于狼疮的这些病征、症状或其他指征。
在一实例中，例如通过一个或多个上述标准，哺乳动物已被诊断为患有重度SLE。
有狼疮复发风险的哺乳动物也可以表现出一种或多种上述症状并且之前已患有狼疮的症状。可选地或此外，已知有狼疮复发风险的哺乳动物在之前已患有狼疮，并且正在用雌激素疗法和/或磺胺类药物和/或干扰素治疗。
在一实例中，个体患有干燥综合征。本文所述的每一实例都应被认为准用于治疗干燥综合征。
可以通过检测自身抗体(例如，抗核抗体(例如，SSA/Ro和SSB/La)、类风湿因子、α-胞衬蛋白和/或抗甲状腺抗体)、眼干燥、唾液腺炎症和/或贫血症来诊断干燥综合征(或选择患有干燥综合征的个体)。
在一实例中，干燥综合征与狼疮相关，即发生在患有狼疮的个体中。
在一实例中，个体患有硬皮病。本文所述的每一实例都应被认为准用于治疗硬皮病。
在一实例中，硬皮病是系统性硬皮病，诸如限制型系统性硬皮病或弥漫型系统性硬皮病。
可以通过检测以下来诊断硬皮病(或选择患有硬皮病的个体)：自身抗体(例如，抗拓扑异构酶抗体(在弥漫型系统性硬皮病形式中)、抗着丝粒抗体(在限制型系统性硬皮病形式中)、抗U3抗体或抗RNA聚合酶抗体)、导致皮肤紧绷或皮肤硬化，尤其是手指、脚、面部和颈部上的皮肤的皮肤炎症的局部迹象或大范围迹象(红、肿、敏感、痒和痛)。还可以在例如消化系统、肺和血管中发生多种症状。
在一实例中，硬皮病与狼疮相关，即发生在患有狼疮的个体中。
在一实例中，哺乳动物对用于治疗疾病或疾病状态的另一化合物的治疗有抵抗力、没有足够的响应或不适于用于治疗疾病或疾病状态的其他化合物的治疗。例如，哺乳动物对用以下药剂的治疗有抵抗力、没有足够的响应或不适于用以下药剂治疗：皮质类固醇和/或免疫抑制剂和/或抗疟剂和/或咪唑硫嘌呤和/或环磷酰胺和/或麦考酚酸莫酯和/或氨甲蝶呤和/或抗TNF抗体和/或抗CD20抗体和/或抗IL6抗体和/或抗CD22抗体。
组合物
合适的是，在用于将抗IL-3Rα免疫球蛋白给予哺乳动物的组合物或方法中，如本领域所理解的，将免疫球蛋白与药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂组合。因此，本公开的一个实例提供了包含与药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂组合的抗IL-3Rα免疫球蛋白的药物组合物。在另一实例中，本公开提供了包含适于与给予哺乳动物之前的免疫球蛋白组合或混合的药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂的试剂盒。在该实例中，试剂盒还可以包含使用说明书。
在一般术语中，“载体、稀释剂或赋形剂”表示可以被安全地给予任何哺乳动物例如人的固体或液体掺入物、粘合剂、稀释剂、包封物质、乳化剂、润湿剂、溶剂、悬浮剂、涂布剂或润滑剂。取决于具体的给药途径，可以使用本领域内已知的各种可接受的载体、稀释剂或赋形剂，例如如Remington's Pharmaceutical Sciences(雷明顿药物学)(MackPublishing Co.N.J.USA,1991)中所描述的。
仅为了举例，载体、稀释剂或赋形剂可以选自糖(例如蔗糖、麦芽糖、海藻糖、葡萄糖)、淀粉、纤维素及其衍生物、麦芽、明胶、滑石、硫酸钙、包括植物油、合成油和合成甘油单酯和甘油二脂在内的油、低级醇、多元醇、褐藻酸、磷酸盐缓冲溶液、诸如硬脂酸钠或硬脂酸镁的润滑剂、等渗盐水以及无热原水。例如，载体、稀释剂或赋形剂与肠胃外给药兼容或适于肠胃外给药。肠胃外给药包括不通过消化道的任何给药途径。肠胃外给药的非限制性实例包括注射、输注等。举例来说，注射给药包括静脉内注射、动脉内注射、肌肉内注射和皮下注射。还考虑了通过贮库制剂或缓释试剂递送，所述贮库制剂或缓释试剂例如可以通过皮内、肌肉内和皮下递送。
联合疗法
在一实例中，将能结合IL-3Rα的免疫球蛋白与用于治疗疾病或疾病状态例如狼疮(诸如SLE)的另一种化合物联合给药，或者作为联合或其他治疗步骤，或者作为治疗制剂的其他组分。
例如，其他化合物是抗炎化合物。可选地或此外，其他化合物是免疫抑制剂。可选地或此外，其他化合物是皮质类固醇如泼尼松和/或强的松龙。可选地或此外，其他化合物是抗疟化合物如羟化氯喹或氯奎宁。可选地或此外，其他化合物是氨甲蝶呤。可选地或此外，其他化合物是咪唑硫嘌呤。可选地或此外，其他化合物是环磷酰胺。可选地或此外，其他化合物是麦考酚酸莫酯。可选地或此外，其他化合物是抗CD20抗体(例如，利妥昔单抗或奥法单抗(ofatumumab))。可选地或此外，其他化合物是抗CD22抗体(例如，依帕珠单抗)。可选地或此外，其他化合物是抗TNF抗体(例如，英夫利昔单抗或阿达木单抗或戈利木单抗)。可选地或此外，其他化合物是CTLA-4拮抗剂(例如，阿贝西普、CTLA4-Ig)。可选地或此外，其他化合物是抗IL-6抗体。可选地或此外，其他化合物是BLys拮抗剂如抗BLys抗体(例如，贝利单抗)。
给药的剂量和时机
为了预防或治疗疾病或疾病状态或其复发，活性药剂(即，抗IL-3Rα免疫球蛋白)的合适剂量，取决于待治疗的疾病的类型、疾病的严重程度和进程、给予的免疫球蛋白是用于预防性目的还是治疗性目的、以前的治疗、患者的临床史和对免疫球蛋白的响应以及主治医师的决定。具体的剂量方案，即剂量、时机和重复，取决于具体的个体和由医师评价的该个体的医疗史。通常，临床医生将给予免疫球蛋白，直到达到实现预期结果的剂量。
本公开的方法可用于治疗、减轻或预防哺乳动物中疾病或疾病状态如狼疮(例如，SLE)的症状，或用于改善哺乳动物的预后。可以改善患有狼疮的哺乳动物的生活质量，并且在用免疫球蛋白治疗之后可以减轻或消除狼疮的症状。本公开的方法还可以用于延迟有发展出狼疮或其复发风险的个体中狼疮的发展或预防狼疮。
对于本文所述的免疫球蛋白的体内给药，正常剂量的量可以为每天约10ng/kg至高达约100mg/kg个体体重或更高。示例性剂量及其范围在本文中有描述。对于数天或更长时间的重复给药，取决于待治疗的疾病或病症的严重程度，可以持续治疗，直到实现期望的症状抑制。
在一些实例中，给予免疫球蛋白的初始(或负荷)剂量为约1mg/kg至约30mg/kg，例如约1mg/kg至约10mg/kg或约2mg/kg或约3mg/kg或4mg/kg或5mg/kg。然后，给予免疫球蛋白的维持剂量为约0.0001mg/kg至约1mg/kg，例如约0.0005mg/kg至约1mg/kg，例如约0.001mg/kg至约1mg/kg，例如约0.005mg/kg至约1mg/kg，例如约0.1mg/kg至约1mg/kg，例如约0.2mg/kg或0.3mg/kg或0.4mg/kg或0.5mg/kg。可以每7-30天，例如每10-15天，例如每10或11或12或13或14或15天给予维持剂量。
在一些实例中，给予免疫球蛋白的剂量为约0.0001mg/kg至约50mg/kg，例如约0.0005mg/kg至约50mg/kg，例如约0.001mg/kg至约45mg/kg，例如约0.005mg/kg至约40mg/kg，例如约0.05mg/kg至约35mg/kg。例如，给予免疫球蛋白的剂量为约0.01mg/kg至约1mg/kg，例如约0.1mg/kg至约1mg/kg，例如约0.2mg/kg或0.3mg/kg或0.4mg/kg或0.5mg/kg(例如，没有更高的负荷剂量)。在一些实例中，例如每7-30天，例如每10-22天，例如每10-15天，例如每10或11或12或13或14或15或16或17或18或19或20或21或22天，给予多种剂量。例如，每7天或每14天或每21天给予免疫球蛋白。
在一些实例中，给予免疫球蛋白的剂量为约1mg/kg至约30mg/kg，例如约1mg/kg至约10mg/kg，或约2mg/kg或约3mg/kg或4mg/kg或5mg/kg，或例如约10mg/kg至30mg/kg，例如约10mg/kg或15mg/kg或20mg/kg或25mg/kg(例如，没有更低的维持剂量)。在一些实例中，例如每10-70天，例如每14-70天，例如每14-60天，例如每14-50天，例如每14-40天，或每14-30天给予多种剂量。例如每14或21或25或28或35或40或42或49或50或55或57或63或70天给予剂量。例如，每21天或每28天或每35天或每42天或每49天或每56天给予免疫球蛋白。
在一些实例中，在开始治疗时，在不超过连续7天或连续6天或连续5天或连续4天给予哺乳动物免疫球蛋白。
就没有对治疗作出足够响应的哺乳动物而言，可以在一周内给予多剂量。可选地或此外，给予的剂量可以逐渐增加。
在另一实例中，对于经历不良反应的哺乳动物，可以在一周内多天或连续多天内将初始(或负荷)剂量分开。
可以在已进行一次或多次免疫球蛋白给药的哺乳动物中，凭经验确定特定免疫球蛋白的剂量。为了评价免疫球蛋白的功效，可以监测疾病或疾病状态例如狼疮(例如SLE)的临床症状。
按照本公开的方法，免疫球蛋白的给药可以是连续的或间歇性的，这取决于例如接受者的生理状况、给药的目的是治疗性的还是预防性的以及熟练的从业者已知的其他因素。免疫球蛋白的给药在预选的一段时间内可以基本上是连续的，或可以以一系列间隔的剂量，例如在狼疮(例如SLE)发作期间或之后给予免疫球蛋白。
在一实例中，给予免疫球蛋白以便实现评价SLE严重程度的评分的下降，例如BILAG标准和/或ECLAM和/或LAI和/或SIS和/或SLAM和/或SLEDAI。例如，利用免疫球蛋白的治疗实现BILAG和/或SLEDAI下降一个或两个或三个点。例如，到开始治疗后15周或开始治疗后30周或开始治疗后52周实现下降。例如，效应维持到开始治疗后约20周或30周或40周或50周。
非限制性实施例
实施例中所用的抗体名称如下：(i)抗IL-3Rα小鼠单克隆抗体(命名为7G3)；(ii)7G3与人IgG1恒定结构域的嵌合版本(命名为ch7G3)；(iii)7G3的人源化IgG1版本(命名为hz7G3)；(iv)含有Xencor V90、S239D/I332E、G1/G2Fc修饰的7G3的人源化版本(命名为hz7G3V1)；(v)含有Xencor V209、S239D/I332E/A330L、G1/G2Fc修饰的7G3的人源化版本(命名为hz7G3V2)；以及(vi)利用岩藻糖基转移酶缺陷的CHO细胞系产生的hz7G3的去岩藻糖化版本(命名为hz7G3V3)。
实施例1
IL-3Rα的表达
利用标准技术从人鉴定PBMC，并利用能结合谱系特异性细胞表面标志物的抗体分离各种细胞系。利用QuantibriteTM珠(BD Biosciences)，确定每种谱系的每个细胞的IL-3Rα分子的数量。如图1所示，IL-3Rα在pDC和嗜碱性粒细胞上高度表达，而在测试的其他细胞谱系上以低水平表达。这种限制性表达模式使得IL-3Rα成为经设计以选择性消除pDC和嗜碱性粒细胞的抗体的有用靶标。
实施例2
抗IL-3RαmAb体外消耗人pDC
通过FicollTM分离从正常供体分离外周血单核细胞(PBMC)，并将PBMC在没有抗体(无抗体)、有10μg/ml抗ch7G3或有10μg/ml抗hz7G3V3的条件下，在37°C下，在RPMI/10%FCS中孵育不同的时间。在96孔U-底平板中，在200μL体积内，常规培养1x106个细胞。通过流式细胞术测定浆细胞样树突状细胞(pDC)数量和嗜碱性粒细胞数量的分析(分别为表1和2)。通过流式细胞术将人pDC鉴定为谱系标志物阴性(CD20-、CD3-、CD14-、CD19-CD56-)、HLA-DR阳性、CD11c阴性和IL-3Rα阳性(参见流程图中的门控盒)。通过流式细胞术将人嗜碱性粒细胞鉴定为谱系标志物阴性(CD20-、CD3-、CD14-、CD19-CD56-)、IgE阳性和IL-3Rα阳性。在Fc结构域中含有修饰的抗IL-3Rα抗体(hz7G3V3)早在添加后4小时就消耗PBMC的pDC和嗜碱性粒细胞，并且维持pDC和嗜碱性粒细胞消耗高达添加后48小时。没有增强效应子功能的抗IL-3R抗体(ch7G3)的添加导致在添加后24小时和48小时时观察到pDC数量减少。然而，所观察到的效应远远小于针对hz7G3V3所观察到的效应，并且到48小时时实质上也没有完全消耗pDC。
表1：抗体处理后细胞培养物中pDC的百分比
Figure BDA00002199991900491
表2：抗体处理后细胞培养物中嗜碱性粒细胞的百分比
Figure BDA00002199991900492
实施例3
非人灵长类中pDC和嗜碱性粒细胞的体内抗IL-3Rα消耗
在澳大利亚国家灵长类机构(Australian National Primate Facility)按照其标准操作程序进行非GLP食蟹猴非人灵长类(NHP)研究。所有操作和修改都获得机构动物管理与使用委员会(Institutional Animal Care and UseCommittee)的批准。通过静脉输注给予幼猴单剂量的中和抗IL-3Rα抗体(hz7G3V3)，所述抗体在Fc结构域内具有增强抗体效应子功能的修饰。在不同的时间点收集外周血，并通过流式细胞术进行NHP嗜碱性粒细胞和pDC的分析。通过流式细胞术将NHP嗜碱性粒细胞鉴定为IgE+/CD123阳性。通过流式细胞术将pDC鉴定为谱系标志物阴性(CD20-、CD3-、CD14-、CD19-、CD56-)、HLA-DR阳性、CD11c阴性和IL-3Rα阳性。
在所有剂量时，hz7G3V3的给药导致外周血中嗜碱性粒细胞和pDC数量的大量减少，早在抗体给药后6小时就显示出来。在第11天(嗜碱性粒细胞)或第15天(pDC)两种细胞类型的剂量依赖性恢复之前，这种减少维持超过8天(图2)。
对于任何猴子而言，在任何剂量时，没有观察到测试的任何其他细胞类型(包括嗜中性粒细胞、T细胞、B细胞、单核细胞和红细胞)的显著减少，并且没有观察到不利事件。这些数据表明，当体内给予时，hz7G3V3选择性消耗pDC和嗜碱性粒细胞，以及当hz7G3V3从系统中消除时，pDC和嗜碱性粒细胞群可以恢复。
实施例4
抗IL-3RαmAb的体外ADCC活性比较
利用阴性选择试剂盒按厂商说明(Miltenyi Biotech)的从两份健康的血沉棕黄层(buffy coat)分离人pDC和NK细胞。在存在10μg/ml的各种版本的抗IL-3Rα抗体(hz7G3Vl、hz7G3V2和hz7G3V3)的条件下，在96孔U底平板中，，将NK细胞(效应细胞“E”=100,000个细胞)和pDC(靶标“T”=10,000细胞)以10:1的E:T比一起孵育，终体积为150μL。在37°C下，在RPMI/10%FCS中孵育4小时后，检查自体裂解(pDC1-NKl、pDC2-NK2)和异体裂解(pDC1-NK2、pDC2-NK1)。利用LDH CytoTox 96非放射性细胞毒性试剂盒(Promega)测量细胞裂解。
通过以下的计算确定特异性裂解：
特异性裂解=[样品裂解-自发裂解]/[最大裂解自发裂解]x 100%
通过添加ExtranTM至0.75%(v/v)的终浓度来估算最大裂解。自发裂解为孔中只存在细胞(无Ab)时所发生的裂解。
与抗IL-3Rα抗体hz7G3相比，用为提高ADCC能力而改造的抗IL-3RαmAb观察到显著的pDC裂解水平(图3)。
实施例5
抗IL-3RαmAb抑制干扰素产生
从正常供体分离外周血单核细胞(PBMC)，并在没有抗体(0μg/ml)、有剂量增加(1、10或100μg/ml)的抗IL-3R抗体hz7G3或在Fc结构域中含有修饰的抗IL-3R抗体(hz7G3V3和hz7G3Vl)的条件下，将PBMC在37°C下孵育18小时，所述修饰增强抗体效应子功能。添加C型CpG寡核苷酸(5μM)以活化浆细胞样树突状细胞。在活化后6小时或24小时时收集上清液，并通过ELISA测定IFNα产生。如图4所示，添加抗体hz7G3导致IFNα产生小幅下降，并且这种效应似乎不受抗体剂量增加的影响。相比之下，添加在Fc结构域内含有修饰的抗IL-3R抗体(hz7G3V3和hz7G3V1)在所有抗体剂量下，在活化后6小时和24小时时都从PBMC大量减少IFNα产生。
在另一项研究中，从正常供体分离PBMC，并在没有抗体或有剂量增加的hz7G3V3或同种型对照抗体的条件下，将PBMC在37°C下孵育18小时。添加C型CpG寡核苷酸(5μM)以活化pDC。在活化后24小时时收集上清液，并通过ELISA测定IFNγ产生。添加hz7G3V3从PBMC大量减少IFNα。hz7G3V3对pDC的体外消耗与抑制用TLR-7/9配体即CpG处理的PBMC产生IFNα相关(图5)。向PBMC添加CpG以与SLE免疫复合物相似的方式诱导IFNα产生，所述SLE免疫复合物含有主要是TLR-7/9激动剂的染色质成分。这些数据表明，hz7G3V3能够在外周血细胞中有效消除由TLR-7/9激动剂诱导IFNα的来源。这些数据还表明，外周血中不被hz7G3V3靶向的其他细胞类型对于响应TLR-7/9刺激的IFNα产生无法补偿pDC的损失。
进行进一步的研究以确定细胞消耗对IFNα水平的影响。从正常供体分离PBMC，并在没有抗体或有剂量增加的在Fc结构域中含有修饰的中和抗IL-3R抗体(hz7G3V3)或相同抗体的Fab区(hz7G3Fab)的条件下，将PBMC在37°C下孵育18小时，所述修饰增强抗体效应子功能。添加C型CpG寡核苷酸(5μM)以活化pDC。在活化后6小时或24小时时收集上清液，并通过ELISA测定IFNα产生。如图6所示，添加缺少效应子功能的中和抗IL-3R Fab(hz7G3Fab)没有减少IFNα产生，而添加在Fc结构域内含有修饰的抗IL-3R抗体(hz7G3V3)，在活化后6小时或24小时时，完全抑制PBMC产生IFNα。
本说明书中提及的每一篇专利和科技文献、计算机程序和算法的公开内容都通过引用全文并入。
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Claims (30)

1.治疗哺乳动物的狼疮的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物一种免疫球蛋白，所述免疫球蛋白能结合白介素3受体α(IL-3Rα)链并竞争性抑制单克隆抗体7G3与IL-3Rα的结合，并且所述免疫球蛋白能消耗或至少部分消除与之结合的浆细胞样树突状细胞(pDC)和嗜碱性粒细胞，从而治疗所述哺乳动物的狼疮，其中所述免疫球蛋白不与毒性化合物缀合，所述毒性化合物会杀死所述免疫球蛋白所结合的细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述狼疮是系统性红斑狼疮(SLE)。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述IL3Rα链由产生一种或多种I型干扰素的pDC表达。
4.如权利要求1或3所述的方法，其中所述IL3Rα链由产生一种或多种细胞因子的嗜碱性粒细胞表达。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述免疫球蛋白与单克隆抗体7G3结合相同的表位或重叠的表位。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述免疫球蛋白能中和IL-3信号转导。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述免疫球蛋白是抗体或其抗原结合片段。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述抗体是嵌合抗体。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述嵌合抗体是包含单克隆抗体7G3的可变区的嵌合抗体。
10.如权利要求7所述的方法，其中所述抗体是人源化抗体。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述人源化抗体是包含来源于单克隆抗体7G3的互补性决定区的人源化抗体。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述人源化抗体包含轻链可变区(VL)重链可变区(VH)，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:3所示的序列，所述重链可变区包含SEQ ID NO:2所示的序列。
13.如权利要求7所述的方法，其中所述抗体是人抗体。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述免疫球蛋白能够诱导效应子功能。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述效应子功能是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。
16.如权利要求14所述的方法，其中由所述免疫球蛋白诱导的效应子功能水平相对于包含野生型IgG1 Fc区时的免疫球蛋白的效应子功能水平是提高的。
17.如权利要求14所述的方法，其中所述效应子功能相对于ch7G3或hz7G3的效应子功能是提高的，或大于ch7G3或hz7G3的效应子功能。
18.如权利要求14所述的方法，其中所述免疫球蛋白包含去岩藻糖化的Fc区。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述免疫球蛋白是hz7G3V3。
20.如权利要求16所述的方法，其中所述免疫球蛋白包含Fc部分，所述Fc部分包含增强所述免疫球蛋白所诱导的效应子功能的一个或多个氨基酸序列取代。
21.如权利要求20所述的方法，其中与不含所述取代的Fc部分相比，所述一个或多个氨基酸序列取代增加了所述Fc部分对Fcγ受体(FcγR)的亲和力。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述一个或多个氨基酸序列取代是：
(i)按照Kabat EU编号系统的S239D、A330L和I332E；或
(ii)按照Kabat EU编号系统的S239D和I332E。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述免疫球蛋白选自hz7G3V1和hz7G3V2。
24.如权利要求1所述的方法，其中在给予所述免疫球蛋白之后，所述哺乳动物中循环的浆细胞样树突状细胞(pDC)和嗜碱性粒细胞的数量与给予所述免疫球蛋白之前所述哺乳动物中循环的pDC和/或嗜碱性粒细胞数量相比降低至少约50%。
25.如权利要求24所述的方法，给予所述免疫球蛋白之后至少约6小时，所述哺乳动物中循环的pDC和嗜碱性粒细胞的数量与给予所述免疫球蛋白之前所述哺乳动物中循环的pDC和/或嗜碱性粒细胞数量相比降低至少约50%。
26.如权利要求24所述的方法，其中在给予后没有进一步给予所述免疫球蛋白的情况下，所述哺乳动物中循环的pDC和嗜碱性粒细胞的数量与给予所述免疫球蛋白之前所述哺乳动物中循环的pDC和/或嗜碱性粒细胞数量相比降低至少约50%，持续至少7天。
27.如权利要求1所述的方法，包括给予所述哺乳动物约0.001mg/kg至50mg/kg免疫球蛋白。
28.如权利要求26所述的方法，其中多次给予所述哺乳动物所述免疫球蛋白，并且其中给药间的时间为至少约11天。
29.用于治疗哺乳动物的狼疮的药物组合物，所述药物组合物包含免疫球蛋白和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，所述免疫球蛋白能结合白介素3受体α(IL-3Rα)链并竞争性抑制单克隆抗体7G3与IL-3Rα的结合，其中所述免疫球蛋白能消耗或至少部分消除与之结合的浆细胞样树突状细胞(pDC)和嗜碱性粒细胞，并且其中所述免疫球蛋白不与毒性化合物缀合，所述毒性化合物会杀死所述免疫球蛋白所结合的细胞。
30.用于权利要求1-27中任一项所述方法的试剂盒，所述试剂盒包含免疫球蛋白，所述免疫球蛋白能结合IL-3Rα链并竞争性抑制单克隆抗体7G3与IL-3Rα的结合；药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂；以及所述试剂盒的使用说明书，其中所述免疫球蛋白能消耗或至少部分消除与之结合的浆细胞样树突状细胞(pDC)和嗜碱性粒细胞，其中所述免疫球蛋白不与毒性化合物缀合，所述毒性化合物会杀死所述免疫球蛋白所结合的细胞。
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