KR101841088B1 - 주름개선 효능을 갖는 굴 가수분해 분획물의 생산 방법 및 이를 포함하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 펩타이드 GPN 또는 PGN의 생산 방법에 관한 것으로, 본 발명의 방법을 사용하는 경우, 굴 효소 가수분해물로부터 높은 수율로 펩타이드 GPN 또는 PGN을 생산할 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 생산된 펩타이드 GPN/PGN은 콜라게나제 활성을 효과적으로 억제함으로써 주름 개선에 유용하게 사용할 수 있는바, 의약품 산업, 식품산업 및 화장품 산업과 같은 다양한 분야의 소재로서 폭넓게 사용될 수 있고, 천연물로부터 유래되어 세포독성 없이 안정성을 가지므로 장기적 사용에도 안전한 이점을 가진다.

Description

주름개선 효능을 갖는 굴 가수분해 분획물의 생산 방법 및 이를 포함하는 화장료 조성물 {Method for producing Oyster hydrolysis fraction having wrinkle-improving effect and cosmetic composition including the same}

본 발명은 주름개선 효능을 갖는 굴 가수분해 분획물의 생산 방법 및 이를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

어육 단백질의 효소 가수분해물은 단백질의 기능적 특성을 수식하거나 향상시키는 장점을 지니며, 단백질의 기능성을 지배하는 물리화학적 특성들은 펩티드 혹은 단백질의 크기, 아미노산 조성 및 결합서열, 다른 화합물과의 상호반응 등이다(Damodaran, 1996). 단백질의 효소 가수분해물은 2차 구조가 다른 분자량이 적은 peptide를 생성하며 근육에서 유래하는 단백질 가수분해로 생성된 펩티드는 항산화능, 혈압강하작용, 말초 혈액 lymphocytes의 자극, 면역조절작용, 콜레스테롤혈증 저하 효과가 인정되고 있다.

특히 최근에는 동식물 단백질을 각종 효소를 이용하여 가수분해 시킨 가수분해물을 분리 정제하여 이들의 생리 활성 검토에 관한 연구가 진행되고 있으며, 각종 가공식품이나 조미료, 샴푸, 화장품 등 기타 여러 분야에서 필수적으로 이용되고 있다.

그러나 국내에서는 단백질의 가수분해물 제조를 위해 산(acid) 가수분해법을 이용하고 있는 실정이며, 단백질을 산이나 알칼리로 가수분해 할 경우 트립토판(tryptophan), 시스테인(cysteine)과 같은 필수 아미노산이 손실될 뿐만 아니라 리지노알라닌(lysinoalanine)과 같은 독성이 있는 부산물이 생성되어 일본을 비롯한 선진국에서는 단백질의 산가수분해물의 안전성 문제가 대두되고 있다.

한편, 화장품 효능 물질이 피부 깊숙이 흡수되기 위해서는 피부 표피층의 최외각에 존재하는 각질층을 먼저 투과해야 하는데, 각질층은 대부분 외부 물질의 흡수에 있어 가장 큰 장벽으로 작용한다. 각질층은 케라틴화된 각질세포와 이 각질세포 사이에 지질이 라멜라층을 형성하여 마치 “벽돌과 모르타르” 형태로 구성되어있다. 일반적으로 효능물질의 피부 속 투과는 피부 각질세포를 직접 투과(transcellular pathway)하기보다는 각질세포 사이의 지질층을 통한 투과(intercellular pathway)가 더욱 효과적인 것으로 알려지고 있다.

이에 본 발명자들은, 부작용이 없으면서 콜라게나제의 활성을 억제할 수 있는 물질의 생산 방법 및 상기 생산된 물질의 피부 흡수 촉진 방법을 찾고자 예의 노력한 결과, 굴 효소 가수분해물에서 세포독성 없이 콜라게나제의 활성을 효과적으로 억제시킬 수 있는 특정 펩타이드를 높은 수율로 분리시킬 수 있는 방법을 확인하였으며, 나아가 리포좀(liposome)을 활용하여 상기 분획물을 피부 투과 시킬 경우, 피부 흡수 및 경피 투과가 더욱 촉진되는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

대한민국 공개특허공보 제10-1997-0009387호.

본 발명은 굴 효소 가수분해 분획물의 생산 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 굴 효소 가수분해 분획물을 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

1. 굴 효소 가수분해물을 pH 1 내지 3의 제1 완충액에 용해시키는 단계; 상기 용해액을 양이온 교환 수지에 로딩하는 단계; 및 상기 양이온 교환 수지에 결합된 물질을 pH 3.5 내지 5의 제2 완충액으로 용출하는 단계를 포함하는 굴 효소 가수분해 분획물의 생산 방법.

2. 위 1에 있어서, 상기 효소는 트랜스 글루타미나제(Transglutaminase), 플라보자임(Flavourzyme), 뉴트라제(Neutrase), 파파인(Papain), 펩신(pepsin), 트립신(Trypsin), 알파-키모트립신(α-Chymotrypsin), 알칼라제(Alcalase) 및 프로타맥스(Protamex)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인, 방법.

3. 위 1에 있어서, 굴에 트랜스글루타미나제(Transglutaminase), 프로타맥스(Protamex), 및 뉴트라제(Neutrase)를 순차적으로 처리하여 굴 효소 가수분해물을 얻는 단계를 더 포함하는, 방법.

4. 위 1에 있어서, 상기 제1 완충액의 pH가 2 내지 2.5인, 방법.

5. 위 1에 있어서, 상기 양이온 교환 수지는 pH 3.1 내지 3.5의 완충액으로 평형된 것인, 방법.

6. 위 1에 있어서, 상기 제2 완충액의 pH가 4 내지 5인, 방법.

7. 위 1에 있어서, 상기 제1 및 제2 완충액은 소듐 시트레이트 완충액(Sodium citrate buffer)인, 방법.

8. 위 1 내지 7 중 어느 하나의 방법으로 생산된 굴 효소 가수분해 분획물을 포함하는 화장료 조성물.

9. 위 8에 있어서, 상기 분획물은 주름 개선 효과를 갖는 것인, 화장료 조성물.

10. 위 8에 있어서, 상기 분획물은 리포좀에 포집되어 포함된 것인, 화장료 조성물.

11. 위 10에 있어서, 상기 조성물은 경피흡수능이 개선된 것인, 화장료 조성물.

본 발명은 굴 효소 가수분해 분획물에 관한 것으로, 본 발명의 방법을 사용하는 경우, 굴 효소 가수분해물로부터 콜라게나제 활성 억제 효과가 더욱 우수한 굴 효소 가수분해 분획물을 생산할 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 생산된 분획물은 콜라게나제 활성을 효과적으로 억제함으로써 주름 개선에 유용하게 사용할 수 있는바, 의약품 산업, 식품산업 및 화장품 산업과 같은 다양한 분야의 소재로서 폭넓게 사용될 수 있고, 천연물로부터 유래되어 세포독성 없이 안정성을 가지므로 장기적 사용에도 안전한 이점을 가진다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 굴 효소 가수분해물의 분획물에서 GPN/PGN의 peak를 확인한 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 Sodium citrate 완충액 pH 3.2 분획물의 아미노산 분석 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 Sodium citrate 완충액 pH 3.2→pH 4.25 분획물의 아미노산 분석 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 Sodium citrate 완충액 pH 3.2→pH 4.25→pH 6.25 분획물의 아미노산 분석 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 Sodium citrate 완충액 pH 4.2 분획물의 아미노산 분석 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 Sodium citrate 완충액 pH 4.2→6.2 분획물의 아미노산 분석 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 인지질 종류에 따른 리포좀 외관 성을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 최적 조성비로 안정하게 형성된 리포좀의 입도 분포를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 분획물, 굴 가수분해 추출물, 아데노신, 및 Cu-peptide의 콜라게나아제 활성 저해능을 평가한 것이다.
도 10은 인간 피부 섬유아세포주인 LFF(a) 및 피부 표피세포주인 HACAT(b)에 대한 세포 독성을 평가한 것이다,
도 11은 본 발명의 분획물, 합성 펩타이드, 굴 가수분해 추출물, Cu-peptide, 아데노신, 및 레티놀의 콜라겐 생성능을 평가한 것이다.
도 12는 본 발명의 분획물, 합성 펩타이드, 굴 가수분해 추출물, Cu-peptide, 아데노신, 및 레티놀의 표피세포 재생활성을 평가한 것이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 경피 흡수 시험과정을 나타낸 것이다,
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따라, 리포좀 내 포집 여부에 따른 GPN, PGN의 누적 피부 투과율을 나타낸 것이다,
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따라, 리포좀 내 포집 여부에 따른 GPN, PGN의 피부 흡수 개선도를 나타낸 것이다,
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따라, 리포좀 내 포집 여부에 따른 GPN, PGN의 피부 주름 개선도를 나타낸 것이다,

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 굴 효소 가수분해물을 pH 1 내지 3의 제1 완충액에 용해시키는 단계; 상기 용해액을 양이온 교환 수지에 로딩하는 단계; 및 상기 양이온 교환 수지에 결합된 물질을 pH 3.5 내지 5의 제2 완충액으로 용출하는 단계를 포함하는 굴 효소 가수분해 분획물의 생산 방법에 관한 것이다.

이하 본 발명의 일 구현예에 따른 굴 효소 가수분해 분획물의 생산 방법을 상세히 설명한다.

먼저, 굴 효소 가수분해물을 제1 완충액에 용해시킨다.

본 발명에서 굴은 참굴(Crassostrea gigas), 넓적굴(Ostrea edulis), 벚굴(Ostrea denselamellosa), 및 바위굴(Saccostrea glomerata) 등이 사용될 수 있고, 냉동 혹은 냉장시킨 것일 수 있으나, 그 보관 방법 및 종류는 이에 제한되지 않으며, 구체적으로는 참굴(Crassostrea gigas)일 수 있다.

본 발명에서 굴 효소 가수분해물은 굴을 트랜스 글루타미나제(Transglutaminase), 플라보자임(Flavourzyme), 뉴트라제(Neutrase), 파파인(Papain), 펩신(pepsin), 트립신(Trypsin), 알파-키모트립신(α-Chymotrypsin), 알칼라제(Alcalase) 및 프로타맥스(Protamex)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 효소를 첨가하여 가수분해하여 얻을 수 있으며, 바람직하게는 굴에 트랜스글루타미나제(Transglutaminase), 프로타맥스(Protamex), 및 뉴트라제(Neutrase)를 순차적으로 첨가하여 가수분해하여 얻어진 것일 수 있다.

제1 완충액의 pH는 예를 들면 1 내지 3일 수 있고, 바람직하게는 2 내지 2.5일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 제1 완충액의 pH가 1보다 낮을 경우, 굴 효소 가수분해물 내 펩타이드가 양이온 교환 수지에 강하게 달라붙어 최종적으로 용출이 어렵고, 3보다 높을 경우, 펩타이드가 양이온 교환 수지에 붙지 않아 용출되지 않고 씻겨나가게 되는 문제가 있다.

다음으로, 상기 단계의 결과로 얻어진 용해액을 양이온 교환 수지에 로딩한다.

로딩은 얻어진 용해액을 양이온 교환 수지와 접촉시키는 것에 의해 수행될 수 있고, 구체적으로 용해액을 원심분리하여 분리한 상층액을 양이온 교환 수지에 접촉시켜 수행될 수 있다. 이는 양이온 교환 수지로 충전된 컬럼에 상기 상층액을 통과시키는 방식으로 수행될 수 있다.

상기 양이온 교환 수지는 강양이온성 이온 교환 수지(예컨대, WorkBeads 40S), 약양이온성 이온 교환 수지(예컨대, DIAION WK11)가 모두 사용가능하며, 바람직하게는 강양이온성 이온 교환 수지를 사용한다. 약양이온성 이온 교환 수지는 강양이온성 이온 교환 수지에 비해 가격이 비싸고, 표적 물질이 덜 결합할 수 있기 때문이다.

이때, 강양이온성 이온 교환 수지로는 H형(H form) 강양이온성 이온 교환 수지 또는 Na 형(Na form) 강양이온성 이온 교환 수지 등이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 Na 형 강양이온성 이온 교환 수지가 사용될 수 있다.

또한, 상기 양이온 교환 수지 컬럼 장치에는 특별한 제한이 없으며, 당 분야에 알려진 공지의 장치를 그대로 또는 적절히 변형하여 활용할 수 있다.

본 단계에서 필요에 따라서는, 상기 단계의 결과로 얻어진 용해액을 pH 3.1 내지 3.5의 완충액으로 평형된 양이온 교환 수지에 로딩할 수 있다.

상기 pH로 평형된 양이온 교환 수지에 로딩하는 경우, 로딩되는 물질의 양이 많아져 최종 용출되는 펩타이드의 수율이 다소 높아지는 장점이 있다.

다음으로, 상기 양이온 교환 수지에 결합된 물질을 제2 완충액으로 용출한다.

제2 완충액의 pH는 예를 들면 3.5 내지 5일 수 있고, 바람직하게는 4 내지 5일 수 있고, 보다 바람직하게는 4내지 4.5일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 범위의 pH의 완충액으로 용출하는 경우, 양이온 교환 수지에 붙어 남아 있는 펩타이드가 높은 수율로 용출될 수 있다.

본 발명에서 상기 제1 및 제2 완충액은 각 단계의 pH를 유지할 수 있는 완충액이면 제한 없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 수용성 완충액을 사용할 수 있다. 예를 들면 구연산염(citrate) 완충액, 인산염(phosphate) 완충액, 및 글리신-염산 완충액(Glycine-HCl buffer) 등을 사용할 수 있으나, 최종 용출된 펩타이드에서 독성이 나타나지 않는 소듐 시트레이트 완충액(Sodium citrate buffer)을 사용하는 것이 바람직하다. 제1 및 제2 완충액은 서로 동일하거나 상이할 수 있다.

상기 단계를 포함하는 방법으로 제조되는 굴 효소 가수분해 분획물은 콜라게나아제 활성 저해 효과가 우수하여, 화장료 등에 적용시 주름 개선 효능이 우수하다.

또한, 상기 굴 효소 가수분해 분획물은 주름 개선 효능 등이 우수한 것으로 알려진 펩타이드 GPN 또는 PGN을 다량으로 함유할 수 있다.

본 명세서에서 펩타이드 GPN 또는 PGN은 Glycine(G)-Proline(P)-Asparagine(N)의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 Proline(P)-Glycine(G)-Asparagine(N)의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 의미한다.

또한, 본 발명은 펩타이드 GPN 또는 PGN의 생산 방법에 관한 것이다.

펩타이드 GPN 또는 PGN은 굴 효소 가수분해물에 포함된 것으로 알려져 있는데, 상기 방법으로 제조되는 굴 효소 가수분해 분획물은 펩타이드 GPN, PGN을 보다 다량으로 포함하고 있어, 상기 방법으로 얻어진 굴 효소 가수분해 분획물로부터 펩타이드 GPN, PGN을 분리하는 경우에 종래 방법에 비해 보다 펩타이드를 다량으로 생산할 수 있다.

펩타이드를 분리하는 방법은 당 분야에 공지된 방법이 제한 없이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 생산된 굴 효소 가수분해 분획물을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 굴 효소 가수분해 분획물은 펩타이드 GPN 또는 PGN을 다량 포함할 수 있으며, 주름 개선 효과를 갖는 바, 피부 주름 개선을 위한 다양한 용도로 활용될 수 있다.

또한, 본 발명의 굴 효소 가수분해 분획물은 리포좀에 포집되어 포함될 수 있으며, 상기 분획물이 포집(안정화)된 리포좀은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 ~30중량%(굴 효소 가수분해 분획물 + 리포좀의 중량)로 포함된 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 0.01~20중량%로 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 굴 효소 가수분해 분획물은 리포좀 총 중량에 대하여 0.01~20중량%로 포집되는 것이 좋다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "리포좀"은 제약, 화장품 및 식품 분야에서 생리활성 성분을 안정하게 전달하고, 침투 효과를 극대화하는 데에 사용되는 리포좀의 형태를 갖는 것을 의미한다.

리포좀의 평균 입자 지름은 30~70 nm인 것이 바람직하다. 상기 리포좀의 평균 입자 지름이 70 nm를 초과하는 경우에는 본 발명에서 달성하고자 하는 기술적 효과 중 경피 흡수능 및 제형 안정성의 개선이 매우 미약할 수 있다.

리포좀은 폴리올(polyol), 계면활성제(edge activator), 인지질, 지방산 및 물을 포함하는 혼합물에 의해 제조될 수 있으며, 상기 혼합물에는 1가 알코올(예: 에탄올 등)을 이용하지 않는다는 것이 좋다.

본 발명의 리포좀의 제조에 이용되는 폴리올(polyol)은 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어 프로필렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜(부틸렌글리콜), 2,3-부틸렌글리콜, 글리세린, 메틸프로판디올, 이소프렌글리콜, 펜틸렌글리콜, 에리스리톨, 자이리톨 및 솔비톨 등로 이루어진 군중에서 선택된 하나 이상을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 부틸렌글리콜을 사용할 수 있다. 그 사용량은 리포좀 총 중량에 대하여 0.001 ~30중량%일 수 있으며, 바람직하게는 0.01~20중량%일 수 있다.

본 발명의 리포좀의 제조에 이용되는 계면활성제(edge activator)는 당업계에 공지된 어떠한 것도 사용할 수 있으며, 예를들어 트리에탄올아민, 알킬아실글루타메이트, 알킬포스페이트, 알킬락틸레이트, 디알킬포스페이트, 트리알킬포스페이트, 알콕시레이티드알킬에테르, 알콕시레이티드알킬에스테르, 알킬폴리글리코사이드, 폴리글리세릴에스테르 및 슈가에스테르 등을 들 수 있다. 바람직하게는, 트리에탄올아민을 사용할 수 있다. 그 사용량은 리포좀 총 중량에 대하여 0.001~10중량%일 수 있으며, 바람직하게는 0.01~5중량%일 수 있다.

본 발명의 리포좀의 제조에 이용되는 인지질은 양쪽친화성 지질로 이용된 것으로서, 천연 인지질(예: 난황 레시틴 또는 대두 레시틴, 스핑고마이엘린) 및 합성 인지질(예: 디팔미토일포스파티딜콜린 또는 수첨 레시틴)을 포함하며, 바람직하게는 레시틴을 사용할 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 레시틴은 천연 유래의 불포화 레시틴 및/또는 포화 레시틴을 사용할 수 있으며, 불포화 레시틴 대비 포화 레시틴을 1:1 내지 10의 비율로 혼합 하였을 때, 보다 바람직하게는 1:1 내지 5의 비율로 혼합하였을 때 더 안정한 리포좀이 형성될 수 있다. 총 레시틴의 사용량은 리포좀 총 중량에 대하여 0.01~10중량%일 수 있으며, 바람직하게는 0.1~5중량%일 수 있다.

본 발명의 리포좀 제조에 이용되는 지방산은 고급 지방산으로서, 바람직하게는 C_12-22 알킬 체인의 포화 또는 불포화 지방산으로, 예컨대, 라우린산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아린산, 올레산 및 리놀레산을 포함할 수 있다. 그 사용량은 리포좀 총 중량에 대하여 0.05~3.0중량%일 수 있으며, 바람직하게는 0.1~1.0중량%일 수 있다.

본 발명의 리포좀의 제조에 이용되는 물은 일반적으로 탈이온화된 증류수이며, 그 사용량은 리포좀 총 중량에 대하여 5.0~40중량%일 수 있다.

위와 같은 리포좀의 제조는 다양한 방법을 통해 이루어질 수 있으나, 가장 바람직하게는 상기 성분들을 포함하는 혼합물과 굴 효소 가수분해 분획물을 미세용액화 장비(microfluidize)에 적용하여 제조한다. 상기 미세용액화 장비에 의한 리포좀의 제조는 소망하는 입자 크기에 따라 다양한 조건(예: 압력, 횟수 등)으로 실시할 수 있는 이점이 있다. 이때, 바람직하게는 500~1000 bar 압력 하에서 1~6회 미세용액화 장비를 통과하도록 하여 리포좀을 제조하는 것이 좋다.

위와 같이 제조된 리포좀은 여러 종류의 난용성 물질을 녹임과 동시에 불안정한 물질을 안정화시켜 피부 침투 효과를 극대화하는 장점을 가지고 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 유효 성분으로서 굴 효소 가수분해 분획물(바람직하게는 굴 효소 가수분해 분획물을 포집(안정화)한 리포좀) 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.

또한, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 당업계에서 일반적인 제형, 예를 들어 유화 제형이나 가용화 제형 등의 형태로 제조될 수 있다. 유화 제형으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등을 예로 들 수 있으며, 가용화 제형으로는 유연화장수를 예로 들 수 있다. 또한, 본 발명의 화장료 조성물은 화장품 이외에도 피부 과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 함유함으로써 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 국소 적용 또는 전신 적용할 수 있는 보조제 형태로 제조될 수 있다.

적합한 화장품의 제형으로는 예를 들면, 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱(conceal stick)의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 펩타이드 GPN 또는 PGN 분획물(또는 리포좀으로 안정화한 펩타이드 GPN 또는 PGN 분획물)에 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제, 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 그리고, 상기의 성분들은 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 수렴화장수, 유연화장수, 영양화장수, 각종 크림, 에센스, 팩, 파운데이션 등과 같은 화장품류와 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액 등이 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 구체적인 제형으로서는 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더, 아이섀도, 패취, 분무제 등의 제형을 포함한다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.

제조예

1. 재료

본 실험에 사용한 냉동굴(Crassostrea gigas; 각장, 5.8±0.4 cm; 각고, 3.2±0.4 cm; 체중, 9.8±2.1 g)은 경남 통영시 연안의 양식장에서 2014년 10월부터 2015년 4월에 걸쳐 채취하여 인근의 가공 공장에서 알굴의 형태로 급속 동결한 굴제품(Individually Quick Frozen, IQF)으로 2015년 8월 경남 통영시에 소재하는 D 식품에서 구입하여 사용하였다. 가수분해를 위한 상업용 효소 Protamex와 Neutrase 0.8L(0.8 AU/g, endoprotease, Bacillus amyloliquefaciens)는 Biosis(Busan, Korea)에서 구입하였으며, Microbial transglutaminase (MTGase, 103 U/g)은 아지모노토 사(Tokyo, Japan)에서 구입하였다.

HPLC 급 acetonitrile(ACN)과 메탄올(MeOH)은 Burdick & Jackson(Muskegon, MI, USA)에 구입하였으며, 모든 다른 시약들은 분석용을 사용하였고, 증류수는 nanopure 급 탈이온수를 사용하였다. 펩타이드 분리를 위한 역상 칼럼은 DiscoveryBIO Wide Pore C18(5 μm, 4.6x150 mm, Supelco, Bellafonte, PA, USA)를 사용하였다.

2. 굴 효소 가수분해물의 제조

수도수에서 해동한 냉동굴을 어취와 해수에서 유래하는 염을 제거하기 위하여 30분 동안 100 ℃의 끊는 물에 데친 후 5 mm plate를 장착한 육마쇄기로(M-12S, Hankook Fujee Industries Co., Ltd., Siheung-si, Korea) 마쇄하였다. 마쇄한 육을 2배량의 수도수에 현탁하여 단백질 가교결합을 형성하기 위해 1%(w/w)의 MTGase를 첨가하고 30℃의 추출 농축기(5,000 L, Kobiotech Co., Ltd., Incheon, Korea)에서 1시간 동안 항온하였다. 가교결합 형성으로 수식한 굴 단백질에 1%(w/w)의 Protamex를 첨가하여 교반하면서 40℃에서 1시간 가수분해한 후, 다시 1%(w/w)의 Neutrase를 첨가하여 50℃에서 1시간 동안 교반하면서 가수분해하였다. 가수분해물은 100 ℃에서 30분 동안 가열하여 첨가한 효소를 불활성화시키고 200 mesh로 여과하였다. 여과물은 85 ℃에서 농축기(5,000 L, Kobiotech Co., Ltd., Incheon, Korea)를 이용하여 30 Brix까지 농축한 후, 동결 건조하였다. 동결 건조한 굴 가수분해물 분말은 -20 ℃에서 저장하면서 실험에 사용하였다.

3. GPN / PGN 분획물 ( OPF , Oyster PGN / GPN fraction)의 제조

굴 효소 가수분해물 80 g을 25 mM sodium citrate 완충액(pH 2.2)에 용해하고 5,000xg에서 30분 동안 원심분리하여 얻은 상층액을 여과지(Toyo No.2)로 감압 여과한 후, 여액을 분리용 시료로 사용하였다. 25 mM sodium citrate pH 3.2 용매로 평형된 강 양이온교환 수지(SO₃ ^-)인 WorkBeads 40S(Agarose bead, www.bio-works.net, Sweden)를 충진한 Screw Axial Comprssion 칼럼(9x27 cm, SAC-Bio-72-650G-20, LISUAE Science, China)에 페리스탈틱 펌프(MasterFlex, Cole-Parmer Instrument Co.)로 유속 20 mL/min의 속도로 시료를 loading하였다. 수지에 결합한 물질은 1 L 의 25 mM sodium citrate(pH 4.2)로 용출하였다. 용리되지 않은 물질은 0.1 N NaOH 용액으로 해착시킨 후 증류수로 pH 7.0까지 충분히 세척한 후, 25 mM sodium citrate (pH 3.2)로 평행화하였다.

4. GPN / PGN 분획물 리포좀 ( OPF liposome )의 제조

4-1. GPN / PGN 분획물 리포좀 ( OPF liposome )의 최적 조성비 결정

리포좀은 막을 이루는 주성분인 인지질의 종류에 따라 성상 및 안정성에 많은 영향을 미친다. 이에, 먼저 포스파티딜콜린(PC, Phosphatidylcholine)의 함량에 따른 리포좀의 안정성을 확인하였다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 포화레시틴(Phosphatidylcholine 70% 함유)의 경우, 제조 직후 바로 gelling되는 현상이 나타나고, 매우 불안정한 상태를 나타낸 반면, 불포화레시틴(Phosphatidylcholine 90% 함유)의 경우, 맑고 투명한 액상의 리포좀이 형성되는 것을 확인하였다. 따라서, 포화레시틴을 적은 비율로 혼합 하였을 때 더 안정한 리포좀이 형성되는 것을 알 수 있었다.

다음으로, 리포좀은 리포좀의 막에 존재하여 막을 더 견고하게 해주는 cholesterol 또는 ceramide, 그리고 막에 가변 형성을 주는 edge activator의 함량에 따라 리포좀의 안정성에 차이가 크게 나타난다. 이에, 상기 성분들의 함량 차이에 따른 리포좀의 안정성을 확인하였다. 이때, 입도 분석과 제타 전위는 Otsuka ELSZ-2000ZS를 사용하여 측정하였다.

그 결과, cholesterol 및 ceramide는 함량이 증가할수록, edge activator는 함량이 감소할수록 엉김이나 부유물 발생 없이 더 안정한 리포좀이 형성되는 것을 확인할 수 있었으며, 도 8에 나타낸 바와 같이, 입도 분포 또한 평균 입경 54.4nm, 평균 제타전위 (-)15.86 mV로 균일한 분포도를 나타냄을 확인할 수 있었다.

4-2. GPN / PGN 분획물 리포좀 ( OPF liposome )의 제조

상기 실시예 4-1의 결과를 바탕으로, 트랜스퍼좀(유연성이 증대된 리포좀)과 동일한 방법(유화 방식)을 이용하여 GPN/PGN 분획물 리포좀을 제조하였다.

보다 구체적으로, 레시틴(lecithin) 0.80% 및 하이드로제네이티드레시틴(hydrogenated lecithin) 0.20%에 세라마이드(ceramide) 0.02%, 콜레스테롤(cholesterol) 0.15%, 트리에탄올아민(triethanolamine) 0.10%, 부틸렌글리콜(butylene glycol) 10.0%를 첨가하여 용해한 후(유상), 디포타슘글리시리제이트(dipotassium glycyrrhizate) 0.03%, 페녹시에탄올(phenoxyethanol) 0.06%, 에틸헥실글리세린(ethylhexylglycerin) 0.10%, GPN/PGN 분획물 16.0%, 증류수 72.0%를 용해한 혼합물(수상)에 투입하여, agi-mixer로 교반 후 조대 분산계(coarse dispersion)를 제조하였다. 조대 분산계를 나노 단위의 크기로 균질화하기 위하여 마이크로플루이다이저(microfluidizer)를 600~900 bar의 압력으로 2~5 회 처리하였다.

5. GPN / PGN 분획물 리포좀을 함유하는 화장료의 제조

정제수, 글리세린, 부틸렌글라이콜, 피이지-60하이드로제네이티드캐스터오일, 소듐하이알루로네이트, 아데노신, 알란토인, 디메치콘, 사이클로메치콘, 스쿠알란, 세테아릴알코올, 글리세릴스테아레이트, 피이지-100스테아레이트, 디포타슘글리시리제이트, 레시틴, 하이드로제네이티드레시틴, 세라마이드엔피, 콜레스테롤, 카보머, 디소듐이디티에이, 페녹시에탄올, 에칠헥실글리세린, 트리에탄올아민, 및 향료를 포함하는 무색 반투명 크림상의 대조시료, 및 상기 대조시료에 제조예 4-2의 GPN/PGN 분획물 리포좀을 더 포함하는 시험시료를 각각 제조하였다.

실시예

1. 굴 효소 가수분해물 중 GPN / PGN의 존재 여부 확인

굴 효소 가수분해물 중 GPN/PGN 분자량 물질의 존재 여부를 확인하기 위해 굴 효소 가수분해물을 sodium citrate loading 완충액(pH 2.2)에 용해시킨 후, 아래의 조건에 따라 BabyBio-S 칼럼(0.5 mL)에서 분리하여 각 분획물을 취하여 SpeedVac 원심분리기(ScanSpped 40, LaboGene Aps, Lynge, Denmark)로 휘발성 용매를 제거한 후, 시료와 calibration CHCA matrix를 1:1로 혼합하여 그 중 2 μL를 MALDI plate에 spotting하여 air-dry한 후 MALDI-TOF/TOF MS(Ultraflex III, Bruker, Bremen, Germany)를 이용하여 하기 표 1의 조건으로 분석하였다.

항목	조건	항목	조건
Mode of operation	reflector	Acquisition mass range	400-6000 m/z
Extraction mode	Delayed	Nmuber of laser shots	800/spectrum
Polarity	Positive	Laser intensity	25-30%
Acquisition control	Manual	Laser Rep rate	20.0 Hz
Accelerating voltage	20,000 V	Calibration type	Cal Mix 2
Gride voltage	80.5%	Calibration matrix	CHCA
Gride wire 0	1.0%	Low mass gate	-
Extraction delayed time	200 nsec	Instrument name	Ultraflex III

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 굴 효소 가수분해물의 BabyBio-S 칼럼 F5 분획물에서 GPN/PGN(C₁₁H₁₈N₄O₅, 286.284 Da)의 m/z 287.318에 해당하는 peak를 확인하였다.

2. 굴 효소 가수분해물의 펩타이드 분획 대량 생산을 위한 최적 pH 확인

다음으로, 굴 효소 가수분해물 중 GPN/PGN 분획을 대량 생산하기 위한 최적 pH를 확인하기 위해 굴 효소 가수분해물 0.5063g을 10 mL의 sodium citrate loading buffer(pH 2.2)에 녹이고 2500xg에서 20분 동안 원심분리하여 얻은 상층액을 여과지(Toyo No.2)로 여과한 후, 0.45 um의 막으로 여과하였다(21.39±0.39 mg/mL). 여과액 0.5 mL(10.7 mg)을 sodium citrate 완충액으로 평행시킨 BabyBio S 칼럼(1x5 cm, 0.5 mL, Bio-Works, Sweden)에 loading하여 AKTA prime(GE Health care, Korea)으로 하기 표 2의 조건에 따라 분당 1 mL의 속도로 용출하였다.

Steps	sodium citrate, pH 3.2	sodium citrate, pH 4.25	sodium citrate, pH 6.45	NaOH
Elution	5 min	10 min	20 min	-
Washing	-	-	-	3 min
regeneration	30 min	-	-	-
flow rate: 1 mL/min detection: 254 nm fraction volume: 1 mL gradient: step wise

그 결과, sodium citrate 완충액 pH 3.2, pH 4.25, pH 6.25에서 얻은 분획물을 40 ℃ 이하에서 회전증발 농축기로 농축한 건조물의 무게는 각각 0.1613, 0.2913, 및 0.0942 g으로서 pH 4.25 분획물의 함량이 가장 많은 것을 알 수 있었다.

다음으로, 건조 분획물을 2 mL의 아미노산 분석 loading 완충액에 녹인 후, 아미노산 분석을 통해 GPN/PGN의 검출 여부를 확인하기 위해 아미노산 분석을 실시하였다.

그 결과, 도 2 내지 4에 나타낸 바와 같이, 아미노산 분석 크로마토그램의 Isoleucine의 RT에서 검출되는 GPN/PGN peak는 sodium citrate pH 4.2의 분획물에서만 검출되는 것을 확인할 수 있었다.

이에, GPN/PGN의 분획 공정을 단순화하기 위하여, 추가적으로 sodium citrate 완충액 pH 4.25(0.3981 g) 및 pH 6.2 용출액(1.4415 g)의 두 분획물의 아미노산 분석 크로마토그램을 실시하였다.

그 결과, 도 5 및 6에 나타낸 바와 같이, pH 6.2 분획물에 비하여 분획물의 양이 적음에도 불구하고 pH 4.2 분획물에서 GPN/PGN의 RT에 해당하는 Isoleucine과 대부분의 아미노산이 검출되었으며, pH 6.2 분획물에서는 흔적량으로 검출되었다. 이 같은 결과는 GPN/PGN의 대량생산을 위한 표준공정 설정 시 sodium citrate pH 4.2분획물이 가장 유리함을 시사한다.

3. GPN / PGN을 포함하는 분획물의 대량 생산 공정 확인

다음으로, GPN과 PGN이 다량 함유된 굴 효소 가수분해물을 분획하기 위하여, 강 양이온교환 수지(SO₃ ^-)인 WorkBeads 40S(Agarose bead, www.bio-works.net, Sweden)를 충진한 Screw Axial Comprssion 칼럼(9x27 cm, SAC-Bio-72-650G-20, LISUAE Science, China)을 이용하여 실험을 수행하였다.

즉, 굴 효소 가수분해물 80 g을 25 mM sodium citrate 완충액(pH 2.2)에 용해하고 5,000xg에서 30분 동안 원심분리하여 얻은 상층액을 여과지(Toyo No.2)로 감압 여과한 후, 여액을 분리용 시료로 사용하였다. 25 mM sodium citrate pH 3.2 용매로 평형된 양이온교환 수지에 페리스탈틱 펌프(MasterFlex, Cole-Parmer Instrument Co.)로 유속 20 mL/min의 속도로 시료를 loading하였다. 수지에 결합한 물질은 1 L 의 25 mM sodium citrate(pH 4.2)로 용출하였다. 용리되지 않은 물질은 0.1 N NaOH 용액으로 해착시킨 후 증류수로 pH 7.0까지 충분히 세척한 후, 25 mM sodium citrate (pH 3.2)로 평행화하였다.

단계	공정	공정 설명
1	굴 효소 가수분해물	굴 효소 가수분해물 입고
2	용해	25 mM sodium citrate, pH 2.2
3	원심분리	5,000g, 30 min
4	상층액 회수	여과 여포를 사용하여 상층액 회수
5	칼럼 loading	칼럼에 loading
6	용출	25 mM sodium citrate, pH 4.2로 용출
7	GPN/PGN 확인	용출부피, 지표물질 정량

굴 효소 가수분해물을 사용하여 GPN/PGN 분획물을 얻는 표준공정과 공정별 수율은 하기 표 4와 같다.

공정	부피 (mL)	중량 (g)	수율 (%)
굴 효소 가수분해물	206	80	100
원심분리 및 여과 후	302	-	-
수지 비결합성 물질	-	13.71	17.1
용리액 (수지 결합 물질)	1240	31.23	39.0
NaOH 세척액	670	9.05	11.3

실험예

1. GPN / PGN 분획물 ( OPF ) 평가

1-1. 콜라게나아제 활성 저해능 평가

1) GPN / PGN 분획물(OPF)의 콜라게나아제 활성 저해능 평가

상기 제조예 2에서 제조한 OPF를 20 mM CaCl₂가 포함된 0.1 M Tris buffer (pH 7.1)에 3.4 배로 희석하여 시험관에 0.5 mL 취하였다. 여기에 0.58 mM 4-phenylazobenzyloxycarbonyl-pro-leu-gly-pro-D-arg (PZ-peptide) 1 mL를 가해 잘 혼합한 후 collagenase (sigma type H, 0.85 unit/mL) 0.2 mL를 넣고, 37 ℃에서 30분 동안 반응시킨 후 25 mM citric acid 1 mL를 넣어 반응을 종료시켰다. ethylacetate 5 mL를 넣고 혼합한 후 상층부만 스포이드로 취해서 320 nm에서 흡광도를 측정하였다. 콜라게나제 활성 저해능은 하기 식으로 측정하였다.

[수학식 1]

콜라게나제 저해 활성 (%) = (1-(B-B₀)/(A-A₀)×100

A: 효소 첨가 증류수의 흡광도, A₀: 효소 무첨가 증류수의 흡광도

B: 효소 첨가 시료의 흡광도, B₀: 효소 무첨가 시료의 흡광도

2) 다른 시료와의 콜라게나아제 활성 저해능 비교

굴 가수분해 추출물(HOE, Hydrolyzed oyster extract), 아데노신, 및 Cu-peptide을 시료로 한 것을 제외하고는, 1-1의 방법으로 콜라게나제 활성 저해능을 측정하였다.

그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, OPF는 10 mg/mL의 농도에서 27.1%, 25 mg/ml의 농도에서 100%의 효소활성 저해능을 보여주어, 높은 콜라게나제 저해 활성을 나타내었다.

반면, HOE은 25 mg/mL의 농도에서 34%, 50 mg/mL의 농도에서 100%의 효소 활성 저해능을 보여주었으며, 또한 주름개선 기능성 화장품으로 식품의약청에 등재되어 있는 원료 중 하나인 아데노신은 물에 대한 최대 용해 농도인 10 mg/ml의 농도에서 최고 저해활성인 27.6%의 활성 저해능을 나타내었고, 화장품원료로 많이 사용되고 있는 Cu-peptide의 경우에도 10 mg/ml의 농도에서 26.1%의 활성 저해능을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

1-2. 세포독성 평가

1) 섬유아세포

인간 피부 섬유아세포주인 LFF를 (주)지에프씨로부터 분양받아 DMEM/HIGH 배지에서 배양하였다. 각 세포주는 10 cm plate에서 배양되어 1주일에 2-3회 계대하였으며, 배지는 10% FBS 배지를 함유한 성장배지를 이용하였다. 세포주는 95% humidity, 5% CO₂ 온도는 35℃로 조절된 incubator에서 배양하였으며, 배지는 2일에 한번씩 교환해 주었다. 섬유아세포에 대한 독성여부를 알아보기 위하여 세포를 96 well plate에 1×10⁴ cells/plate의 농도로 분주하고 24시간동안 안정화시켰다. 시료의 최종 농도가 10, 50, 100 및 200 μg/ml이 되도록 제조하여 24시간동안 세포에 처리하였다. 여기에 MTS(3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-5-carboxy-methoxyphenyl)-2-4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) 시약을 가해 1시간 동안 처리한 후 microplate reader (Perkin Elmer 1420 Multilabel Counter VICTOR3TM, USA)로 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 10a에 나타낸 바와 같이, 굴 가수분해 추출물(HOE), PGN/GPN 분획물(OPF), 및 합성 펩타이드 PGN 및 GPN에서 300 μg/ml의 농도에서도 독성은 없었으며, 오히려 매우 높은 세포 증식능을 확인할 수 있었다. 그러나 Cu-peptide의 경우에는 50 μg/ml 이상의 농도에서 독성을 나타내었고, 주름개선 기능성 고시원료인 레티놀은 50 μg/ml 이상의 농도에서 독성을 나타내었다.

2) 피부 표피세포

시료의 세포독성을 확인하기 위하여 HACAT 세포주에 대한 독성을 측정하였다. 그 결과, 도 10b에 나타낸 바와 같이, 본 실험에 사용한 HOE, OPF 및 합성 펩타이드 모든 시료에서 본 실험에서 측정한 최고 농도인 300 μg/mL에서도 독성을 보인 물질은 없는 것을 확인할 수 있었다. 아데노신과 레티놀의 경우, 아데노신은 독성이 없었으나, 레티놀의 경우에는 50 μg/mL 이상의 농도에서 세포독성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

따라서 본 발명의 펩타이드 분획물은 세포에 유해작용 없이 안전하게 사용할 수 있음을 알 수 있었다. 이에, 하기 실험은 독성을 나타내지 않는 농도의 범위에서 사용하였고, 굴 펩타이드 분획물의 사용량 한계 등을 고려하여 100 μg/ml 이하의 농도에서 실험을 실시하였다.

1-3. 콜라겐 생성능 평가

LFF 는 48 well plate에 10% FBS를 함유한 배지에서 배양한 후, well당 5x10⁴ cell이 되도록 분주하였다. 24시간 동안 같은 조건으로 배양한 후, FBS free 배지에 시료를 녹여 세포에 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 배양 상등액을 취해 procollagen type 1 C-peptide EIA kit로 생성량을 측정하여 콜라겐의 생성 정도를 비교하였다(Krupsky et al., 1994). 피부를 이루는 주 단백질인 콜라겐은 피부조직의 진피에 존재하는 섬유아세포에서 합성되는데, 먼저 procollagen이 합성되고 활성 collagen은 procollagen에 결합된 C-peptide가 분해되어 형성된다. 피부 균질물을 가수분해하여 C-peptide의 함량을 측정하면 활성화된 콜라겐 함량을 측정할 수가 있다. 측정된 콜라겐 생성량은 배양액 내의 총 단백질 함양을 로우리법(Lowry assay)에 따라 측정하여, 콜라겐의 생성량을 보정하였다.

그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, OPF의 농도가 증가함에 따라 생성량이 크게 증가함을 확인할 수 있었다. 1 μg/ml의 농도에서는 9.2%의 증가를, 10 μg/ml의 농도에서는 23.1%의, 50 에서는 51.4%, 100에서는 79.1%의 높은 생성량의 증가를 보여주었다. 반면, HOE 는 10 μg/ml의 농도에서 5.8%의 증가를 50 μg/ml의 농도에서는 26.6%의 증가를, 100 μg/ml의 농도에서는 61.6%의 콜라겐 생성효능을 나타내어, 같은 농도에서 비교하였을 때, 본 발명의 펩타이드 분획물의 높은 활성을 확인할 수 있었다. 또한 아데노신 및 레티놀의 독성이 없는 범위에서 콜라겐 생성 효능을 실시한 결과 1 μg/mL 농도에서 유의적인 활성 증가를 나타냈으나, 본 발명의 펩타이드 분획물보다 활성은 높지 않은 것을 확인할 수 있었다.

1-4. 표피세포 재생활성 평가

세포의 재생활성은 96 well에 세포를 1일, 2일, 3일 동안 배양한 다음 세포 생존률을 측정하여 시료를 처리하지 않은 대조군과 세포 생존률을 비교하였다.

그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, HOE, OPF, 합성 펩타이드 모두에서 증식 효능을 확인할 수 있었다. 보다 자세하게는, HOE 및 OPF는 2일까지 모두 높은 재생활성을 증가활성을 확인할 수 있었으나, 3일 이후에는 약간 감소하는 경향을 보여주었으나, 두 합성 펩타이드는 약간의 세포증식능을 보여주어, HOE 및 OPF 보다 증식효능은 좋지 않은 것을 알 수 있었다. 또한, 아데노신, 레티놀, 및 Cu-peptide의 경우, Cu-peptide에서만 1일 배양시 세포증식 활성을 보여주었으나, 2일 3일 배양시에는 세포 증식에 영향을 주지 못하였으며, 아데노신과 레티놀은 세포증식활성을 나타내지 않았고, 고농도에서는 세포 배양기간이 증가할수록 세포에 대한 독성을 나타냄을 알 수 있었다.

2. GPN / PGN 분획물 리포좀 (OPT liposome ) 평가

2-1. 안정성 평가

개발한 원료의 안정도 평가를 위하여 상기 제조예 3-2에서 제조한 GPN/PGN 분획물 리포좀을 저온(4 ℃), 실온, 고온(45 ℃), cyclic chamber에서 각각 1개월간 보관하며 외관성상, 향, pH, 평균 입경, 평균 제타전위, 미생물 오염도 등을 관찰하였고, 모두 이상 없음을 확인 하였다.

* N.D.: Not Detected

2-2. 경피 흡수능 평가

다음으로, 상기 제조예 3-2에서 제조한 GPN/PGN 분획물 리포좀의 피부 흡수 개선 효과를 확인하기 위하여, 식품의약품안전처의 생체 외 피부흡수시험 가이드라인에 따라 Franz diffusion cell 시험법을 통해, 유효물질인 GPN/PGN 분획물을 리포좀 내 포집했을 때(시험군)와 포집하지 않았을 때(대조군)의 피부 흡수 개선 정도를 비교 분석하였다. 이때, 시험 지표 물질로는 굴 펩타이드 내 GPN, PGN을 선정하였고, 주관기업에서 독자적으로 확보한 HPLC 분석법에 따라 정량 분석하였다. 또한 보다 명확한 결과 확인을 위하여 GPN/PGN 분획물의 함량은 2%로 하여, 시험군은 GPN/PGN 분획물 2%를 리포좀 내 포집한 것(lipoosome), 대조군은 GPN/PGN 분획물 2%를 증류수에 녹인 것(solution)으로 시험을 진행하였다.

보다 구체적으로, 시험 중 수용액의 온도는 32 ± 1 ℃, 습도는 30~50 %로 일정하게 유지시켰다. 수용액으로는 PBS(phosphate bufferde saline)를 사용하였고, 경피 흡수 시험용 멤브레인으로는 Strat-MTM Membrane(Transdermal Diffusion Test Model, 25mm Discs)을 사용하였다. 도 13의 방법으로 경피 흡수 시험을 진행하였고, 시료 채취는 1, 3, 6, 10, 24 hr 후 실시하여 HPLC를 이용해 정량하였다. 멤브레인 내 흡수되어 있는 성분 측정을 위해서는 멤브레인을 세절 한 후 수용액과 동일한 용매로 vortexing mixing 및 sonication으로 2 시간 추출 후 동일하게 HPLC를 이용해 정량하였다. 또한 시험 종료 후 멤브레인에 남아있는 시료 및 기구들을 세척하여 회수율을 측정하였다. 시험은 총 4회에 걸쳐 반복 실시되었다.

그 결과, 도 14에 나타낸 바와 같이, 그 결과 모든 군에서 리포좀을 적용한 시험군이 적용하지 않는 대조군보다 피부 흡수율이 높은 것으로 나타났으며, 도 15에 나타낸 바와 같이, 리포좀에 포집 했을 때 대조군 대비 평균 36.09 %의 피부 흡수 개선도를 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 회수율 측정 시 92~99 % 사이의 회수율을 나타내어, 식약처 가이드라인 기준인 100 ± 10 % 내에 부합하므로 실험의 유효성을 입증할 수 있었다.

2-3. 주름 개선 효과 확인

마지막으로, 본 발명에 따른 GPN/PGN 분획물 리포좀을 함유하는 화장료에 대한 피부 주름 개선 임상효과를 확인하기 위하여, 다음과 같이 평가하였다.

30세~59세의 여성 24명을 대상으로 제조예 4의 시료를 각각 주름이 있는 눈가를 중심으로 8주간 도포(2회/일, 0.2g/회)하게 한 후, 각 0, 2, 4, 및 8주차에 미세주름측정기인 Visiometer를 이용한 주름 분석, 숙련자에 의한 육안 평가, 및 안정성 평가를 실시하고, 8주차에 피검자의 주관적 평가를 실시함으로써 피부주름의 개선 정도를 측정하였다. 시험은 이중맹검법을 이용하여 진행하였으며, 시험종료일까지 시험자와 피험자 모두 A 및 B로 표기된 시료의 내용물을 봉인 제거 이전까지 알 수 없도록 하였다.

그 결과, 도 16에 나타낸 바와 같이, 시험 부위의 주름지수 R4(D)를 제외한 R1, R2, R3, 및 R5(A,B,C, 및 E)는 시험기간 중 통계학적으로 유의한 수준 (P<0.05)으로 감소하였으며, 대조시료를 도포한 부위(대조부위)에 비해 시험시료를 도포한 부위(시험부위)의 주름지수가 더 감소함을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는, 본 발명에 따른 GPN/PGN 분획물 리포좀이 함유된 화장료가 피부 주름을 개선하는 효능을 가지는 것을 시사한다.

Claims (11)

1. 굴에 트랜스글루타미나제(Transglutaminase), 프로타맥스(Protamex), 및 뉴트라제(Neutrase)를 순차적으로 처리하여 굴의 효소가수분해물을 얻는 단계;
   상기 굴의 효소가수분해물을 pH 1 내지 3의 제1 완충액에 용해시키는 단계; 상기 용해액을 양이온 교환 수지에 로딩하는 단계; 및 상기 양이온 교환 수지에 결합된 물질을 pH 3.5 내지 5의 제2 완충액으로 용출하는 단계를 포함하는 굴의 효소 가수분해 분획물의 생산 방법.
   
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4. 청구항 1에 있어서, 상기 제1완충액의 pH가 2 내지 2.5인, 방법.
   
5. 청구항 1에 있어서, 상기 양이온 교환 수지는 pH 3.1 내지 3.5의 완충액으로 평형된 것인, 방법.
   
6. 청구항 1에 있어서, 상기 제2 완충액의 pH가 4 내지 5 인, 방법.
   
7. 청구항 1에 있어서, 상기 제1 및 제2 완충액은 소듐 시트레이트 완충액(Sodium citrate buffer)인, 방법.
   
8. 청구항 1 및 4 내지 7 중 어느 한 항의 방법으로 생산된 굴의 효소가수분해 분획물을 포함하는 화장료 조성물.
   
9. 청구항 8에 있어서, 상기 분획물은 주름 개선 효과를 갖는 것인, 화장료 조성물.
   
10. 청구항 8에 있어서, 상기 분획물은 리포좀에 포집되어 포함된 것인, 화장료 조성물.
    
11. 청구항 10에 있어서, 상기 조성물은 경피흡수능이 개선된 것인, 화장료 조성물.
    

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