KR101839064B1 - Food compositions for improving atopic dermatitis skin condition using an extract of Stichopus japonicas red - Google Patents
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Abstract
본 발명은 홍해삼 추출물을 이용한 아토피성 피부 개선용 식품조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 아토피성 피부 개선용 식품조성물을 홍해삼을 분쇄하고 이를 용매를 통하여 추출하여 농축된 홍해삼 추출물을 포함한다.The present invention relates to a food composition for improving atopic skin using an extract of red sea ginseng. The composition for improving atopic skin according to the present invention includes red sea ginseng extract, which is obtained by pulverizing red sea germ and extracting it through a solvent.
Description
본 발명은 홍해삼 추출물을 이용한 식품조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 아토피성 피부를 개선할 수 있는 식품조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a food composition using red sea ginseng extract, and more particularly, to a food composition capable of improving atopic skin.
아토피 피부염은 주로 유아기 또는 소아기에 시작되는 만성적이고 재발성의 염증성 피부질환으로 소양증(가려움증)과 피부건조증, 특징적인 습진을 동반한다. 유아기에는 얼굴과 팔다리의 펼쳐진 쪽 부분에 습진으로 시작되지만, 성장하면서 특징적으로 팔이 굽혀지는 부분과 무릎 뒤의 굽혀지는 부위에 습진의 형태로 나타나게 되며, 많은 경우에 성장하면서 자연히 호전되는 경향을 보인다. 어른의 경우 접히는 부위 피부가 두꺼워지는 태선화가 나타나고, 유소아기에 비해 얼굴에 습진이 생기는 경우가 많다. 아토피 피부염은 세계적으로 증가하는 추세이며 유병률이 인구의 20％라는 보고도 있다.Atopic dermatitis is a chronic, recurrent inflammatory skin disease that starts in infancy or childhood and is accompanied by pruritus (itching), dry skin, and characteristic eczema. In infancy, it begins with eczema on the unfolded side of the face and limbs, but it appears as a form of eczema on the part where the arm is bent and on the bending part behind the knee in growth, and in many cases it tends to improve naturally . In adults, a thickening of the folding skin appears, and eczema often occurs on the face compared to the pediatric period. Atopic dermatitis is a worldwide increasing trend and its prevalence is reported to be 20% of the population.
아토피 피부염의 발병 원인은 아직 확실하게 알려져 있지 않은 상태이다. 임상 증상도 피부건조증, 습진 등으로 다양하게 나타나기 때문에 발병 원인이 어느 한 가지로만 설명될 수는 없지만, 환경적인 요인과 유전적인 소인, 면역학적 반응 및 피부보호막의 이상 등이 주요 원인으로 여겨지고 있다. 환경적인 요인으로는 산업화로 인한 매연 등 환경 공해, 식품첨가물 사용의 증가, 서구식 주거 형태로 인한 카펫, 침대, 소파의 사용 증가, 실내 온도 상승으로 인한 집 먼지 진드기 등의 알레르기를 일으키는 원인 물질(알레르겐)의 증가 등이 있다. 또한 실내 에서 애완동물을 키우는 일이 많아지면서 원인 물질에 노출되는 것도 원인이 된다. 한편 아토피 피부염이 유전적인 영향을 받는 점은 많은 아토피 피부염 환자들이 가족력이 있다는 사실에서 알 수 있다.The cause of atopic dermatitis has not been known yet. Clinical symptoms vary widely from dry skin to eczema. Therefore, the cause of the disease can not be explained by any single cause, but environmental factors, genetic predisposition, immunological response, and skin barrier abnormalities are considered to be the main causes. Environmental factors include environmental pollution caused by industrialization, increase in the use of food additives, increase in the use of carpet, bed, sofa due to western type of residence, and allergenic substances such as dust mite caused by room temperature rise Allergens). Also, it is caused by exposure to the causative substances as the number of pets is increased in the room. The fact that atopic dermatitis is genetically affected can be seen in the fact that many patients with atopic dermatitis have family history.
피부건조는 가려움증을 유발하고 악화시킨다. 낮 동안에는 간헐적으로 가렵다가 대개 초저녁이나 한밤중에 심해진다. 가려워서 긁게 되면 습진성 피부 병변(병리적 변화)이 생기고 이러한 병변이 진행되면서 다시 더 심한 가려움이 유발되는 악순환이 반복된다. 피부 병변의 분포와 반응 양상은 환자의 연령에 따라 다소 다르게 나타난다. 유아의 경우 병변이 주로 진물이나 딱지가 지는 급성 습진이 나타나며 주로 얼굴, 머리에 잘 생기고 몸통이 거칠고 건조하며, 팔다리의 바깥쪽에 생기는 경우가 많다. 2세 이상 10세 이하의 소아기에는 얼굴보다는 오히려 팔다리의 접히는 부분, 목의 접히는 부위에 생기며 건조한 습진 형태로 나타나는 경우가 많다. 한편 동양인에게는 십대 이후에 잘 낫지 않는 심한 유두 부위 습진이 나타나는 경우가 있다.Skin dryness causes itching and worsens it. It is intermittently itchy during the day, but usually gets worse in the early evening or at midnight. Itching and scratching results in eczematous skin lesions (pathologic changes) and a vicious cycle in which these lesions develop again causing more severe itching. The distribution and response patterns of skin lesions are somewhat different depending on the patient 's age. In infants, acute eczema with lesions mainly of dirt or scabs is seen, and it usually occurs on the face and head, handsome on the head, rough on the body, dry, and often on the outside of the limbs. In childhood from 2 to 10 years of age, it often occurs on the folds of the limbs rather than on the face, on the collapsed part of the neck, and in the form of dry eczema. On the other hand, there are cases of severe papillary eczema that does not heal well after the teenage years.
아토피 피부염은 나이가 들면서 호전되거나 없어지는 경우가 많지만 호전된 후에도 특정 물질이나 자극에 의해 쉽게 가렵거나 염증 반응이 나타나는 경향이 있고, 성인기에 손 습진이 나타나는 경우가 많다. 성인기까지 아토피 피부염이 남는 경우에는 몸의 피부 증상은 호전되는 반면 얼굴에 홍반과 홍조 및 습진이 나타나는 경향이 있고, 접히는 부위는 오랫동안 긁어 피부가 두껍게 보이는 태선화 피부가 나타난다. 성인기라도 만성 습진만 나타나는 것이 아니라 만성 습진 위에 진물과 딱지가 앉는 급성 병변이 얼마 동안의 시간 간격을 두고 되풀이하여 일어난다. 아토피 피부염을 진단하기 위한 검사가 따로 존재하지는 않지만 아토피 피부염을 악화시키는 원인을 찾기 위한 검사를 한다.Atopic dermatitis often resolves or disappears with age, but it tends to be easily itchy or inflamed by specific substances or stimuli even after it has improved, and hand eczema often appears in adulthood. If atopic dermatitis persists until adulthood, the skin symptoms of the body improve, while the face tends to show erythema, redness and eczema, and the folded area appears to be a long-scratched, thick-skinned skin. Adults do not only develop chronic eczema, but acute lesions in which dirt and scabs sit on chronic eczema occur repeatedly over a period of time. Although there is no test for the diagnosis of atopic dermatitis, a test is conducted to find the cause of worsening atopic dermatitis.
원인 알레르겐(allergen)을 찾기 위한 검사로는 피부단자검사, 혈청 내 특이 면역글로불린 E 검사가 있으며, 혈청 내 총 면역 글로불린 E 검사, 혈액 내의 호산구 수의 측정, 음식물 경구유발검사, 첩포검사(과민성 반응의 원인을 시험하기 위한 검사. 원인으로 추정되는 물질을 등에 붙여 반응을 확인함), 세균 배양검사 등이 있다. 아토피 피부염을 치료하기 위해서는 건조한 피부의 보습, 피부염 치료를 위한 부신피질호르몬제, 면역조절제, 국소 면역조절제와 가려움증을 치료하기 위한 항히스타민제가 사용된다. 또한 피부 증상을 악화시키거나 유발하는 알레르겐, 자극 물질, 스트레스를 피하도록 하는 다각적이고 체계적인 치료가 필요하며, 환자의 특성에 따라 개별화된 치료를 시행해야 한다. The cause of allergen is skin terminal test and serum specific immunoglobulin E test. Total immunoglobulin E test in serum, eosinophil count in blood, food oral test, patch test (hypersensitive reaction A test for examining the cause of the disease, a test for confirming the reaction by attaching a substance presumed to be a cause), and a culture test for bacteria. To treat atopic dermatitis, moisturizing dry skin, corticosteroids to treat dermatitis, immunomodulators, topical immunomodulators and antihistamines to treat itching are used. In addition, multilevel and systematic treatment to avoid allergens, stimulants, and stresses that exacerbate or induce skin symptoms is necessary and individualized treatment should be performed according to the characteristics of the patient.
한편, 해삼은 극피 동물에 속하며 전 세계적으로 1.500 여종 정도가 있으며 우리나라에는 4과 14종이 서식하고 있는 것으로 알려져 있다. 해삼은 우리나라 전 연안에 넓게 분포하고 있으며 이들 중 주로 식용으로 사용되는 돌기해삼은 색깔에 따라 청해삼, 홍해삼, 흑해삼으로 다르게 불리고 있다. 해삼은 예로부터 "바다의 인삼"이라 하여 최고의 한약재로 사용되어 왔으며 최근 전세계적으로 건강, 웰빙에 대한 관심이 높아지면서 자양강장효과, 향암효과, 비만예방, 고혈압 예방 등의 성분이 함유된 해삼의 소비가 중국, 일본을 비롯한 우리나라에서도 급증하고 있는 실정이다. 특히 홍해삼의 경우 비용효과가 탁월하여 비누와 피부상태 조성물 등이 개발되어 있으며, 홍해삼의 경우 다양한 효능으로 인하여 이를 적용한 여러 가지 제품 개발이 필요한 실정이다.On the other hand, sea cucumber belongs to the echinoderms, has about 1,500 species in the world, and 4 and 14 species are known to live in Korea. Sea cucumbers are widely distributed throughout the Korean coast. Among them, the sea cucumbers mainly used for edible purposes are differently called blue sea cucumber, red sea cucumber and black sea cucumber depending on their color. Sea cucumber has been used as the best herb medicine since ancient times as "Sea ginseng." With the recent interest in health and wellness around the world, sea cucumbers contain ingredients such as nourishing tonic effect, anti-cancer effect, prevention of obesity and prevention of hypertension Consumption is increasing in Korea, including China and Japan. In particular, red sea ginseng has excellent cost effectiveness, soap and skin condition compositions have been developed. In addition, red sea gins are in need of development of various products using various effects due to their various effects.
상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 이미 알려진 종래기술에 해당함을 인정하는 것으로 받아들여져서는 안 될 것이다.It should be understood that the foregoing description of the background art is merely for the purpose of promoting an understanding of the background of the present invention and is not to be construed as adhering to the prior art already known to those skilled in the art.
본 발명은 이러한 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 홍해삼으로부터 유효성분을 분리하여 아토피성 피부 개선용 식품조성물 및 이를 이용한 건강기능식품을 제공하는 데 있다.DISCLOSURE OF THE INVENTION The present invention has been conceived to solve such problems, and an object of the present invention is to provide a food composition for improving atopic skin by separating an active ingredient from red sea ginseng and a health functional food using the same.
위 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 일 실시예에 따른 아토피성 피부 개선용 식품 조성물은 홍해삼 추출물을 포함한다.In order to attain the above object, the atopic food composition for improving skin according to an embodiment of the present invention includes red sea ginseng extract.
상기 홍해삼 추출물은, (a) 홍해삼을 분쇄하는 과정, (b) 상기 분쇄된 홍해삼과 용매를 혼합하고 끓이는 과정, (c) 상기 끓임 과정을 거친 홍해삼 용매 혼합물을 여과하여 유효성분을 추출하는 과정 및 (d) 상기 추출용액을 농축하는 과정에 따라 추출된 것일 수 있다.The red sea ginseng extract may be prepared by: (a) pulverizing red sea gins; (b) mixing and boiling the pulverized red ginseng and a solvent; (c) filtering the red ginseng solvent mixture through boiling to extract an active ingredient; (d) extracting the extract solution by concentrating the extract solution.
상기 용매는 물 또는 에탄올일 수 있다.The solvent may be water or ethanol.
상기 홍해삼 추출물은 HPLC 크로마토그램의 위치가 5분 및 21분에 나타나는 것일 수 있다.The red ginseng extract may be such that the HPLC chromatogram shows the positions at 5 minutes and 21 minutes.
상기 용매는 65~75 vol%의 에탄올이며, 상기 홍해삼 추출물은 아토피성 피부염증 표지인자인 CCL17과 CCL27의 발현량을 감소시키는 것일 수 있다.The solvent may be ethanol of 65 to 75 vol%, and the extract of Red Sea Ginseng may decrease the expression level of CCL17 and CCL27, which are markers of atopic skin inflammation.
상기 용매는 65~75 vol%의 에탄올이며, 상기 홍해삼 추출물은 아토피성 표지인자인 IL-1β, IL-6, IL-8 유전자의 발현양을 감소시키는 것일 수 있다.The solvent may be ethanol of 65-75 vol%, and the extract of Red Sea Ginseng may reduce the expression level of IL-1β, IL-6, and IL-8 gene which are atopic markers.
본 발명에 의한 아토피성 피부 개선용 식품조성물에 따르면 홍해삼의 유효성분에 의해 섭취 시에 아토피성 피부 개선효과가 향상될 수 있다. 특히 세포독성이 없으며 아토피성 피부염증 표지인자의 발현이 크게 감소될 수 있다.According to the composition for improving atopic skin according to the present invention, the effect of improving the atopic skin upon ingestion by the active ingredient of red sea ginseng can be improved. Particularly cytotoxicity, and the expression of atopic skin inflammatory markers can be greatly reduced.
도 1은 70% 에탄올을 용매로 하여 추출한 홍해삼 추출물의 희석 정도에 따른 변화를 나타낸 도면이다.
도2 는 70% 에탄올을 이용하여 추출한 홍해삼의 HPLC 분석결과를 나타낸 그래프이다. ((a) 0.5, (b) 0.2로 희석)
도 3은 70% 에탄올을 이용하여 추출한 홍해삼의 HPLC 분석결과를 나타낸 그래프이다. ((c) 0.1, (d) 0.05로 희석)
도 4는 홍해삼 추출물의 Prep-LC 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 홍해삼 추출물을 정제용 칼럼을 통하여 5개의 분획으로 구분하여 수행한 Prep-LC 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 6는 홍해삼 추출물을 정제용 칼럼을 통하여 5개의 분획으로 구분하여 수행 얻은 샘플을 나타낸 사진이다.
도 7은 홍해삼 추출물을 활용한 젤리형 식품의 (a) 성상과 (b) 포장을 나타낸 도면이다.
도 8은 세포 독성 검사 결과를 나타낸 그래프이다. (용매를 물(a), 20% 에탄올(b)을 사용한 홍해삼 추출물)
도 9는 세포 독성 검사 결과를 나타낸 그래프이다. (용매를 50% 에탄올(c), 70% 에탄올(d) 을 사용한 홍해삼 추출물)
도 10은 인간 피부 각질세포에 각 용매를 사용하여 추출한 홍해삼 추출물을 이용하여 염증 인자의 발현 변화를 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 11은 인간 피부 각질세포에 70% 에탄올을 용매로 사용하여 추출한 홍해삼 추출물을 이용하여 염증 인자의 발현 변화를 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 12는 인간 피부 각질세포에 시중제품(ATO AI)와 홍해삼 추출물을 이용하여 염증 인자의 발현 변화를 분석한 결과를 나타낸 도면이다.FIG. 1 is a graph showing changes in the dilution of red sea ginseng extract extracted with 70% ethanol as a solvent. FIG.
2 is a graph showing the results of HPLC analysis of red sea gins extracted with 70% ethanol. ((a) 0.5, (b) 0.2)
3 is a graph showing the results of HPLC analysis of red sea gins extracted with 70% ethanol. ((c) 0.1, (d) 0.05)
4 is a graph showing the results of Prep-LC analysis of Red Sea Ginseng Extract.
5 is a graph showing the results of Prep-LC analysis in which red sea ginseng extract was divided into five fractions through a purification column.
6 is a photograph showing a sample obtained by dividing red sea ginseng extract into five fractions through a purification column.
Fig. 7 is a diagram showing (a) constellations and (b) packaging of a jelly-type food utilizing Red Sea Ginseng Extract.
8 is a graph showing the results of the cytotoxicity test. (The solvent is water (a), red sea ginseng extract using 20% ethanol (b)),
9 is a graph showing the results of the cytotoxicity test. (The solvent was extracted with 50% ethanol (c), 70% ethanol (d)
FIG. 10 is a graph showing the results of analysis of changes in the expression of inflammatory factors using Red Sea Ginseng Extract extracted from human keratinocytes using each solvent.
FIG. 11 is a graph showing the results of analysis of changes in the expression of inflammatory factors using red sea ginseng extract obtained by using 70% ethanol as a solvent in human dermal keratinocytes.
12 is a graph showing the results of analysis of changes in the expression of inflammatory factors using commercially available products (ATO AI) and red sea ginseng extract on human keratinocytes.
여기서 사용되는 전문용어는 단지 특정 실시예를 언급하기 위한 것이며, 본 발명을 한정하는 것을 의도하지 않는다. 여기서 사용되는 단수 형태들은 문구들이 이와 명백히 반대의 의미를 나타내지 않는 한 복수 형태들도 포함한다. 명세서에서 사용되는 "포함하는"의 의미는 특정 특성, 영역, 정수, 단계, 동작, 요소 및/또는 성분을 구체화하며, 다른 특정 특성, 영역, 정수, 단계, 동작, 요소, 성분 및/또는 군의 존재나 부가를 제외시키는 것은 아니다.The terminology used herein is for the purpose of describing particular embodiments only and is not intended to limit the invention. The singular forms as used herein include plural forms as long as the phrases do not expressly express the opposite meaning thereto. Means that a particular feature, region, integer, step, operation, element and / or component is specified, and that other specific features, regions, integers, steps, operations, elements, components, and / And the like.
다르게 정의하지는 않았지만, 여기에 사용되는 기술용어 및 과학용어를 포함하는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 의미와 동일한 의미를 가진다. 보통 사용되는 사전에 정의된 용어들은 관련기술문헌과 현재 개시된 내용에 부합하는 의미를 가지는 것으로 추가 해석되고, 정의되지 않는 한 이상적이거나 매우 공식적인 의미로 해석되지 않는다.Unless otherwise defined, all terms including technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Commonly used predefined terms are further interpreted as having a meaning consistent with the relevant technical literature and the present disclosure, and are not to be construed as ideal or very formal meanings unless defined otherwise.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예에 의한 아토피성 피부 개선용 식품조성물에 대하여 설명하기로 한다.Hereinafter, a food composition for improving atopic skin according to a preferred embodiment of the present invention will be described with reference to the accompanying drawings.
1. One. 홍해삼으로부터From red sea ginseng 유효성분 추출 Extraction of active ingredient
홍해삼 원료의 효율적인 추출물을 확보하기 위해 홍해삼 원료의 가공 및 추출의 총 4종의 추출용매를 사용하여 진행하였다. 사용된 용매는 증류수, 20 vol%, 50 vol%, 75 vol% 에탄올을 사용하여 가열추출, 농축, 살균 등의 조건을 기반으로 홍해삼 원료의 추출물 확보를 최적화하기 위한 연구를 수행하였다.In order to obtain an effective extract of red sea ginseng raw materials, four kinds of extraction solvents such as processing and extraction of raw materials of red sea gins were used. The ethanol extracts from 20%, 50%, and 75 vol% of distilled water were used to optimize the extraction of red sea ginseng extracts by heat extraction, concentration and sterilization.
우선 원료인 홍해삼을 세척한 후 내장을 제거하였다. 그 후 초파기를 통하여 분쇄한 후에 분쇄된 홍해삼과 용매를 혼합하여 혼합액을 제조하였다. 이 때 혼합비는 홍해삼 20 wt%와 용매 80wt% 이다. 혼합물을 약 3시간동안 가열하여 끓인 후에 여과지를 통하여 추출되지 않고 남아있는 부유물을 제거한다. 이때 사용되는 여과지는 ADVANTEC 2 여과지를 사용하였고, 여과보조제인 규조토를 약 0.1%를 첨가하였다. 여과된 추출용액은 60℃에서 rotary evaporator를 이용하여 실험상 핸들링이 용이한 정도의 농도(고형분 40% 정도)로 농축하고, 95℃에서 5분간 살균 후, 냉동 저장하여 분석시료로 사용하였다. 각 용매에 따른 홍해삼 추출물에 대한 결과는 하기 표 1과 같다.First, red sea ginseng was washed and then the viscera was removed. Thereafter, the mixture was pulverized through a pulverizer, and then pulverized red sea gums and a solvent were mixed to prepare a mixed solution. At this time, the mixing ratio is 20 wt% of red sea ginseng and 80 wt% of solvent. The mixture is heated for about 3 hours, boiled and then filtered to remove any undissolved suspended solids. The filter paper used was
(Brix)Solids content
(Brix)
(%)yield
(%)
2. 고성능 액체 크로마토그래피법 (High Performance Liquid 2. High Performance Liquid Chromatography ChromatograhyChromatograhy )에 의한 분석) Analysis by
4종의 추출시료 중, 검색 결과 기능성을 나타내는 70 vol% 에탄올 추출물을 이용하여 동일한 용매로 희석배율을 설정하여 HPLC 분석을 시행하였다. 도 1은 70% 에탄올을 용매로 하여 추출한 홍해삼 추출물의 희석 정도에 따른 변화를 나타낸 도면이다. 각 샘플을 4개로 (a) 0.5, (b) 0.2, (c) 0.1, (d) 0.05로 희석하였다. 홍해삼 원료의 에탄올추출물은 Water사의 HPLC(Waters 2695)와 Xbridge의 C18(5㎛, 4.6 X 250 mm)컬럼을 이용하여 분석하였다. 이때 HPLC의 검출기 파장은 254 nm와 280 nm 파장을 이용하였다. HPLC의 이동상의 용매로는 0.1% 삼불소 아세트산(Trifluoroacetic acid, TFA)이 포함된 아세토니트릴(Acetonitrile, ACN)을 이용하였으며, 시간에 따라 ACN의 농도를 변화시킴으로써 홍해삼 추출물을 관찰하였다. 홍해삼 추출물에 함유된 물질 분석에 필요한 자세한 구동조건은 아래와 같다.Among the four extracted samples, the dilution magnification was set with the same solvent using the 70 vol% ethanol extract showing the functionality of the search results, and HPLC analysis was performed. FIG. 1 is a graph showing changes in the dilution of red sea ginseng extract extracted with 70% ethanol as a solvent. FIG. Each sample was diluted to 4 (a) 0.5, (b) 0.2, (c) 0.1, (d) 0.05. The ethanol extracts of red sea germ extract were analyzed by HPLC (Waters 2695) and Xbridge C18 (5 ㎛, 4.6 × 250 mm) columns from Water. The detector wavelength of HPLC was 254 nm and 280 nm wavelength. Acetonitrile (ACN) containing 0.1% Trifluoroacetic acid (TFA) was used as a mobile phase solvent of HPLC and red sea ginseng extract was observed by changing ACN concentration with time. Detailed driving conditions necessary for the analysis of the substances contained in the red sea ginseng extract are as follows.
- Flow rate : 1ml/min
- Column temperature : Room temperature
- Solvent A : Acetonitrile
- Solvent B : 0.1% TFA in HPLC water
- Injection volume : 10 μl- C18 analytical column (4.6 mm x 250 mm, 5 m)
- Flow rate: 1 ml / min
- Column temperature: Room temperature
Solvent A: Acetonitrile
- Solvent B: 0.1% TFA in HPLC water
- Injection volume: 10 μl
도 2 및 도 3은 70% 에탄올을 이용하여 추출한 홍해삼의 HPLC 분석결과를 나타낸 그래프이다. 도 2 및 도 3에 도시한 바와 같이 샘플의 희석비율이 낮아짐에 따라 y scale이 점점 낮아지며 피크 패턴이 같은 경향을 보였으며 정확한 분석을 위해 전처리를 70% 에탄올로 0.05로 희석하였다. 홍해삼 추출물을 경우 크로마토그램상의 2분~5분, 21분~30분 사이에 주로 피크들이 관찰되었으며, 5분~21분 사이의 위치에서는 피크들은 관찰되지 않았다. 원료표준화 작업을 위해 홍해삼 원료의 70% 에탄올 추출물의 HPLC 분석결과를 활용하여 두 물질을 지표성분으로 선정하였다. 홍해삼 원료의 지표물질도 선정된 두 물질의 HPLC 크로마토그램의 위치는 5분과 21분에 나타난다. 2 and 3 are graphs showing the results of HPLC analysis of red sea ginseng extracted with 70% ethanol. As shown in FIG. 2 and FIG. 3, as the dilution ratio of the sample was lowered, the y scale gradually decreased and the peak pattern tended to be the same, and the pretreatment was diluted to 0.05 with 70% ethanol for accurate analysis. In the case of red sea ginseng extract, peaks were observed mainly in the range of 2 to 5 minutes and 21 to 30 minutes on the chromatogram, but no peaks were observed in the range of 5 to 21 minutes. For the standardization of the raw materials, two substances were selected as index components by using HPLC analysis of 70% ethanol extract of red sea ginseng raw material. The HPLC chromatograms of the selected two substances in the indicator material of red sea gins are shown at 5 minutes and 21 minutes.
3. 추출물의 대량 분리 정제3. Bulk separation of the extract
70% 에탄올을 이용한 홍해삼 추출물의 대량 분리 및 정제를 위한 조건을 Xbride Prep C18(5 ㎛, 19 X 250 mm) 정제용 컬럼을 이용하여 수행하였으며, 이동상 용매는 분당 4ml의 유량으로 흘려주었다. 정제용 컬럼에 의해 분리, 정제되는 홍해삼 추출물은 농축 후 냉장 보관된 상태에서 동일 용매에 0.05 함량비율로 희석시킨 후, 10분과 초음파 파쇄를 진행하였으며 0.2 ㎛ 필터(PTFE)를 이용하여 불순물을 제거한 후 컬럼에 주사하였다. 홍해삼 70% 에탄올 추출물의 지표물질은 정제용 컬럼을 통해 수행되었으며, 유효물질 검증을 위해 5개의 분획으로 구분하여 추출하였다. 구체적인 조건에 하기와 같다.Conditions for massive isolation and purification of Red Sea Ginseng Extract using 70% ethanol were performed using Xbride Prep C18 (5 ㎛, 19 X 250 mm) purification column, and the mobile phase solvent was flowed at a flow rate of 4 ml per minute. The Red Sea Ginseng Extract, which was separated and purified by the column for purification, was diluted with the same solvent at a concentration of 0.05 in the same solvent in the refrigerated state after concentration, and then subjected to ultrasonic disruption for 10 minutes. After removing impurities using a 0.2 μm filter (PTFE) Lt; / RTI > The indicator material of 70% ethanol extract of red sea ginseng was carried out through the column for purification. Five fractions were extracted for the validation of the active substance. Specific conditions are as follows.
- Flow rate : 4ml/min
- Column temperature : roomtemperature
- Solvent A : Acetonitrile
- Solvent B : 0.1% TFA in HPLC water
- Injection volume : 250 μlColumn (5 [mu] m C18 (2) 100 A, LC Column 250 x 10 mm)
- Flow rate: 4 ml / min
- Column temperature: roomtemperature
Solvent A: Acetonitrile
- Solvent B: 0.1% TFA in HPLC water
- Injection volume: 250 μl
도 4는 홍해삼 추출물의 Prep-LC 분석결과를 나타낸 그래프이다. 도 5는 홍해삼 추출물을 정제용 칼럼을 통하여 5개의 분획으로 구분하여 수행한 Prep-LC 분석결과를 나타낸 그래프이다. 분석구간 7분 동안의 부피는 29ml이며, 칼럼은 다르지만 기존 HPLC 분석조건과 동일하고 Flow rate만 4 ml/min로 바꾸었을 때 HPLC peak pattern 보다 5~7분 밀려 나왔던 경우와는 다르게 거의 동일한 시간대의 pattern을 나타냈다. 분획 샘플을 HPLC로 분획물을 확인하고 앞으로 분획물의 용매를 감압농축 및 동결건조로 제거하고 파우더 형태로 무게를 정량하여 시료를 사용하였다. (도 6참조)4 is a graph showing the results of Prep-LC analysis of Red Sea Ginseng Extract. 5 is a graph showing the results of Prep-LC analysis in which red sea ginseng extract was divided into five fractions through a purification column. The volume during the 7 min analysis period is 29 ml. The column is the same as the existing HPLC analysis conditions except that the HPLC peak pattern is shifted by 5 to 7 minutes when the flow rate is changed to 4 ml / min. pattern. The fractions were identified by HPLC and the fractions were removed by vacuum filtration and freeze drying. The fractions were weighed in powder form and the samples were used. (See Fig. 6)
4. 건강기능식품 제조4. Health functional food manufacturing
도 7은 홍해삼 추출물을 활용한 젤리형 식품의 (a) 성상과 (b) 포장을 나타낸 도면이다. 본 발명에 따른 홍해삼 추출물을 포함하는 젤리형 식품은 에탄올 추출물 중 비수용성 물질을 흡착하여 분산시킴으로서 비수용성 물질의 분리를 억제하는 것이 가능하다. 또한 젤리형 식품으로 제조하는 경우에는 다양한 원료들을 활용하여 맛과 텍스쳐를 개발할 수 있으므로 다양한 소비자 기호를 충족시키는 것이 가능하다. 기존의 건강기능식품의 유형인 정제나 캡슐 및 드링크 타입에 비하여, 젤리형 식품은 대체로 촉촉하며, 부드럽고, 삼키기 쉬워서 잘 삼키지 못하여 어려움을 겪는 사람들도 쉽게 섭취할 수 있는 장점이 있다. 또한 젤리형 식품은 휴대성이 뛰어나고, 언제든지 시간에 맞추어서 먹을 수 있도록 간편한 젤 팩으로 포장할 수 있으며, 별도의 물이 없어도 섭취가 간편하여 섭취장소 및 시간의 제약을 받지 않는다는 장점이 있다.Fig. 7 is a diagram showing (a) constellations and (b) packaging of a jelly-type food utilizing Red Sea Ginseng Extract. The jelly-type food containing the Red Sea Ginseng extract according to the present invention can inhibit the separation of the water-insoluble substance by adsorbing and dispersing the non-water-soluble substance in the ethanol extract. In case of jelly-type foods, various flavors and textures can be developed by using various raw materials, so that it is possible to satisfy various consumer preferences. Jelly-type foods are generally moist, soft, and easy to swallow because they are difficult to swallow because they are difficult to swallow. Jelly-type foods have advantages over conventional tablets, capsules, and drinks. In addition, the jelly-type food is excellent in portability and can be packed in a gel pack which can be easily eaten at any time according to time, and it is easy to ingest without any water, which is advantageous in that it is not limited by the place and time of ingestion.
5. 5. 홍해삼Red sea ginseng 추출물의 피부 자극 (세포 독성 검사) ( Skin irritation of extracts (cytotoxicity test) MTTMTT assay) assay)
홍해삼 추출물 유효 농도에서의 피부 자극(세포 독성) 정도를 확인하기 위하여 인간 피부 각질 세포주인 HaCaT cell을 이용하여 유효 농도에서의 세포 독성을 정량적을 확인하였다. 세포배양용 12 well plate에 피부 각질세포(HaCaT)를 1 X 104 개/ml로 분주하고 24시간동안 배양하여 세포단층을 얻을 후에 PBS로 1회 세척하고 각 홍해삼 추출물 샘플을 각 well에 접종하여 5% CO2, 37℃ 배양기에서 48시간동안 배양하였다. 그 후 MTT 용액 20 ㎕ 씩을 각 well에 가하여 5% CO2, 37℃ 배양기에서 1시간 동안 정치한 후에 MTT 용액을 완전히 제거하여 배양 plate를 건조시킨 후 150㎕ DMSO로 세포 내에 형성된 formazan 결정체를 용해하여 ELISA plate reader로 595 nm에서 흡광도를 측정하여 세포독성비율을 계산하였다. TNF-α와 IFN-γ처리를 통하여 아토피성 피부 염증 환경을 조성한 후 각각 물질에 처리하여 세포독성을 확인하였다.To confirm the degree of skin irritation (cytotoxicity) at the effective concentration of Red Sea Ginseng Extract, cytotoxicity at the effective concentration was quantitatively confirmed using human skin keratinocyte HaCaT cell. The cells were cultured for 24 hours at a density of 1 × 10 4 cells / ml in a 12-well plate for cell culture. Cells were washed once with PBS, and each red ginseng extract sample was inoculated into each well And cultured in a 5% CO 2 , 37 ° C incubator for 48 hours. Then, 20 μl of MTT solution was added to each well and allowed to stand in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C for 1 hour. After the MTT solution was completely removed, the culture plate was dried, and then the formazan crystals formed in the cells were dissolved with 150 μl DMSO The cytotoxicity ratio was calculated by measuring the absorbance at 595 nm with an ELISA plate reader. TNF-α and IFN-γ treatment were used to establish atopic skin inflammatory conditions, and then cytotoxicity was confirmed by treatment with each substance.
도 8및 도 9는 세포 독성 검사 결과를 나타낸 그래프이다. 인간 피부 각질세포(HaCaT)에 대한 홍해삼의 세포독성 검사를 실시한 결과, 용매를 물(a), 20% 에탄올(b), 50% 에탄올(c), 70% 에탄올(d) 을 사용한 홍해삼 추출물을 24, 48 시간 처리한 군에서 세포독성이 없는 것을 확인하였다. 하지만 TNF-α와 IFN-γ 처리를 통하여 아토피성 피부 염증 환경을 조성한 후 각각의 물질을 처리한 결과 70% 에탄올 추출물에서는 세포 독성이 없는 것은 물론 세포 성장 유도 효과를 보인 반면, 그 외의 추출물 에서는 농도가 높아질수록 세포 독성이 증가하는 것으로 확인하였다.8 and 9 are graphs showing the results of the cytotoxicity test. As a result of the cytotoxicity test on red sea ginseng against human skin keratinocyte (HaCaT), the extracts of red sea ginseng using water (a), 20% ethanol (b), 50% ethanol (c) and 70
6. 6. 홍해삼Red sea ginseng 추출물 처리에 따른 아토피성 피부 염증 표지 인자 발현 분석(PCR) Expression Analysis of Atopic Skin Inflammatory Markers by Extract Treatment (PCR)
홍해삼 추출물 처리에 따른 인간상피세포가 분비하는 염증 관련 유전자 발현 차이를 PCR (Polymer chain reaction)을 통하여 정량적으로 확인하였다. 아토피성 피부염증 표지인자로는 CCL17과 CCL27이 있으며, 이 외에도 피부염증반응과 관련된 사이토카인으로는 IL-1β, IL-6, IL-8이 있다. 1인 동안 배양된 인간상피세포주에 IFN-γ와 TNF-α를 처리하여 아토피성 피부 염증 환경을 조성하고 제품을 일정 시간만큼 처리하였다. 세포에 RiboEX RNA purification solution을 첨가하여 nucleotide를 분리하고 Chloroforme 및 isoprophanol을 첨가하여 냉장원심 분리기를 통해 원심 분리한 후, RNA 만을 분리하였다. 추출한 RNA는 정량 후 reverse transcription PCR 과정을 통해 cDNA를 합성한 후 specific primer(표 4)를 이용하여 아토피성 피부염과 관련된 특정 유전자를 증폭시킨 후 2% agarose gel을 이용하여 분리하였다. 유전자 발현 여부는 분리한 gel를 EtBR 염색하여 UV illuminator를 통해 확인하였다. 이를 시중에 판매되는 제품(ATO AI)과 비교하였다.The differences in expression of inflammation - related genes secreted by human epithelial cells following treatment with Red Sea Ginseng Extract were quantitatively confirmed by PCR (Polymer Chain Reaction). Atopic skin inflammation markers include CCL17 and CCL27. In addition, IL-1β, IL-6, and IL-8 are cytokines associated with skin inflammation. The human epithelial cell line cultured for 1 day was treated with IFN-? And TNF-? To create an atopic skin inflammatory environment and the product was treated for a certain period of time. The nucleotides were separated by adding RiboEX RNA purification solution to the cells. Chloroforme and isoprophanol were added to the cells, followed by centrifugation through a refrigerated centrifuge. After quantification, cDNA was synthesized by reverse transcription PCR and specific genes related to atopic dermatitis were amplified using specific primers (Table 4), followed by separation using 2% agarose gel. Gene expression was confirmed by UV illuminator by staining the isolated gel with EtBR. This was compared with commercially available products (ATO AI).
((
CCL17CCL17
))
((
CCL27CCL27
))
도 10은 인간 피부 각질세포에 각 용매를 사용하여 추출한 홍해삼 추출물을 이용하여 염증 인자의 발현 변화를 분석한 결과를 나타낸 도면이다. 인간 피부 각질세포(HaCaT)에 홍해삼 H2O 추출물과 20%, 50%, 70% 에탄올 추출물을 처리한 뒤, 염증 인자의 발현 변화를 분석한 결과, 홍해삼 H2O 추출물과 20%, 50% 에탄올 추출물을 처리했을 때에는 TNF-α와 IFN-γ 처리에 의해 유도된 염증 인자의 발현이 변화하지 않았으나, 70% 에탄올 추출물 처리군에서는 발현이 감소함을 확인함 따라서, 세포 독성이 없으면서도 아토피성 피부염에 대해 효과가 가장 확실한 실험물질로 홍해삼 70% 에탄올 추출물을 주요 유효 물질로 선정하여 다음 실험을 진행하였다. 도 11은 인간 피부 각질세포에 70% 에탄올을 용매로 사용하여 추출한 홍해삼 추출물을 이용하여 염증 인자의 발현 변화를 분석한 결과를 나타낸 도면이다. 홍해삼 추출물에 따른 아토피성 피부염증 표지인자 발현 변화를 분석한 결과, CCL17, CCL27 및 IL-1β, IL-6, IL-8 유전자의 발현양이 양성대조군(TNF-α+IFN-γ)과 비교하여 크게 감소하는 것을 확인하였다. 즉, 홍해삼 추출물이 TNF-α와 IFN-γ처리에 의해 유도된 사이토카인의 발현을 억제함으로써 항염증 효과를 나타낸다고 볼 수 있다. 도 12는 인간 피부 각질세포에 시중제품(ATO AI)와 홍해삼 추출물을 이용하여 염증 인자의 발현 변화를 분석한 결과를 나타낸 도면이다. 인간 피부 각질세포(HaCaT)에 IFN-γ와 TNF-α로 아토피 피부염을 유도한 뒤 시중 제품(ATO AI)과 홍해삼 추출물을 처리한 결과, CCL17, CCL27 및 IL-1β, IL-6, IL-8 유전자의 발현양이 양성대조군 (TNF-α+IFN-γ)과 비교하여 크게 감소하는 것을 확인했으며, CCL17과 IL-6, IL-8 유전자의 경우에는 시중제품(ATO AI) 처리군보다 홍해삼 추출물 처리군에서 더 뛰어난 감소효과를 보이는 것을 알 수 있었다.FIG. 10 is a graph showing the results of analysis of changes in the expression of inflammatory factors using Red Sea Ginseng Extract extracted from human keratinocytes using each solvent. After treatment with 20%, 50%, and 70% ethanol extracts of red sea ginseng H2O extract and human skin keratinocyte (HaCaT), the expression of the inflammatory factors was analyzed. The extracts of red sea ginseng H2O and 20% and 50% , The expression of TNF-α and IFN-γ-induced inflammatory factors did not change, but the expression was decreased in the 70% ethanol extract-treated group. Thus, The 70% ethanol extract of red sea ginseng was selected as the most effective substance and the following experiment was conducted. FIG. 11 is a graph showing the results of analysis of changes in the expression of inflammatory factors using red sea ginseng extract obtained by using 70% ethanol as a solvent in human keratinocytes. FIG. The expression levels of CCL17, CCL27 and IL-1β, IL-6 and IL-8 genes were compared with the positive control (TNF-α + IFN-γ) by the expression of atorvastatin skin inflammatory markers , Respectively. In other words, red sea ginseng extract showed anti-inflammatory effects by inhibiting the expression of cytokines induced by TNF-α and IFN-γ treatment. 12 is a graph showing the results of analysis of changes in the expression of inflammatory factors using commercially available products (ATO AI) and red sea ginseng extract on human keratinocytes. CCL17, CCL27 and IL-1β, IL-6, IL-6, and IL-6, respectively, were obtained by induction of atopic dermatitis with IFN-γ and TNF-α in human dermal keratinocytes (HaCaT) 8 gene was significantly reduced compared to the positive control (TNF-α + IFN-γ). In the case of CCL17, IL-6 and IL-8 genes, The extracts treated group showed more excellent reduction effect.
7. ELISA를 이용한 추출물 처리에 따른 아토피성 피부염 관련 단백질 분비 유도 확인7. Induction of atopic dermatitis-related protein secretion by treatment with extracts using ELISA
인간각질세포에서 아토피성 피부 염증 증상을 유발 시 분비되는 단백질로 CCL17, CCL27이 있다. 따라서 제품의 처리가 해당 사이토카인의 분비를 억제하여 아토피성 피부 염증의 증상적인 부분을 치료할 수 있는지를 정량적으로 확인하기 위해 CCL17, CCL27의 발현 변화 여부를 정량적으로 분석하였다.In human keratinocytes, CCL17 and CCL27 are secreted proteins that cause atopic skin inflammation symptoms. Therefore, we quantitatively analyzed the changes of CCL17 and CCL27 expression in order to quantitatively determine whether the treatment of the product inhibits the secretion of the cytokine and treat the symptomatic part of atopic skin inflammation.
anti-human CCL17, CCL27 단클론 항체를 96 웰 플레이트에 1 μg/ml로 코팅하고 4에서 12시간 방치하고 코팅 후 비특이적 결합부위를 막기 위해 2% BSA를 함유한 PBS로 구성된 blocking buffer를 첨가하여 37에서 2시간 동안 방치하였다. 0.05% tween 20을 함유한 PBS로 4회 세척 후, 재조합 human CCL17, CCL27,IgE 표준액과 control, 제품 처리군, 양성대조군 배양액을 각 웰에 100 μl 씩 분주하여 37에서 2시간 동안 반응시켰다. 0.05% tween 20을 함유한 PBS로 4회 세척 후, biotinylated anti-human CCL17, CCL27, IgE 표준물질과 BSA을 함유한 PBS로 0.05 μg/ml 농도로 희석 하여 각 웰에 처리하여 37에서 2시간 동안 반응시켰다. 0.05% tween 20을 함유한 PBS로 7회 세척 후, avidin-conjugated enzyme을 2.5 μg/ml 농도로 각 웰에 처리한 다음 37에서 2시간 동안 반응. ABTS 기질액을 각 웰에 100 μl 씩 가하여 10분간 발색을 유도한 다음, 멀티 플레이트 리더기를 통해 405 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 인간 피부 각질세포(HaCaT)에 염증 반응을 유도 시 분비되는 단백질인 CCL17과 CCL27을 ELISA로 측정한 결과, TNF-α와 IFN-γ에 의해 분비됐던 CCL17과 CCL27이 홍해삼 추출물에 의해 감소된 것을 확인하였다. 특히 홍해삼 H2O, 20% 에탄올, 50% 에탄올, 70% 에탄올 추출물을 각각 처리하여 CCL17과 CCL27의 발현량을 정량적으로 분석한 결과 70% 에탄올 추출물에서 유의한 값으로 발현량이 감소하는 것을 확인하였다.Anti-human CCL17, CCL27 monoclonal antibody was coated at 1 μg / ml in a 96-well plate and allowed to stand for 4 to 12 hours. After blocking, blocking buffer consisting of PBS containing 2% BSA was added at 37 And allowed to stand for 2 hours. After washing four times with PBS containing 0.05
이상 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예를 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다.While the present invention has been described in connection with what is presently considered to be practical exemplary embodiments, it is to be understood that the invention is not limited to the disclosed embodiments, but, on the contrary, You will understand.
그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변경된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.It is therefore to be understood that the above-described embodiments are illustrative in all aspects and not restrictive. The scope of the present invention is defined by the appended claims rather than the detailed description, and all changes or modifications derived from the meaning and scope of the claims and their equivalents should be interpreted as being included in the scope of the present invention .
Claims (8)
상기 홍해삼 추출물은,
(a) 홍해삼을 분쇄하는 과정,
(b) 상기 분쇄된 홍해삼과 용매를 혼합하고 끓이는 과정,
(c) 상기 끓임 과정을 거친 홍해삼 용매 혼합물을 여과하여 유효성분을 추출하는 과정 및
(d) 상기 추출용액을 농축하는 과정에 따라 추출된 것이며,
상기 홍해삼 추출물은 HPLC 크로마토그램의 피크의 위치가 2분 ~ 5분 및 21분 ~ 30분에 나타나며, 상기 홍해삼 추출물은 아토피성 피부염증 표지인자인 CCL17과 CCL27의 발현량을 감소시키고, 상기 홍해삼 추출물은 아토피성 표지인자인 IL-1β, IL-6, IL-8 유전자의 발현양을 감소시키는 것이며,
상기 HPLC 크로마토그램은 Water사의 HPLC(Waters 2695)와 Xbridge의 C18(5㎛ , 4.6 X 250 mm)컬럼을 사용하여 검출기 파장은 254 nm와 280 nm이며, 이동상의 용매로는 0.1% 삼불소 아세트산(Trifluoroacetic acid, TFA)이 포함된 아세토니트릴(Acetonitrile, ACN)인 것을 특징으로 하는 아토피성 피부 개선용 식품조성물.
Red sea ginseng extract,
The red sea ginseng extract,
(a) a process of crushing red sea ginseng,
(b) mixing and boiling the pulverized red ginseng and the solvent,
(c) extracting the active ingredient by filtering the red sea germ solvent mixture obtained through the boiling process; and
(d) a step of concentrating the extract solution,
The red ginseng extract showed peak positions of 2 to 5 minutes and 21 to 30 minutes in HPLC chromatogram. The red ginseng extract reduced the expression levels of CCL17 and CCL27, which are atopic skin inflammation markers, IL-8, IL-8, and IL-8, which are atopic inflammatory markers,
The HPLC chromatogram was carried out using a HPLC (Waters 2695) manufactured by Water and a C18 (5 μm, 4.6 × 250 mm) column of Xbridge. The detector wavelengths were 254 nm and 280 nm. As the mobile phase solvent, 0.1% (Acetonitrile, ACN), which contains Trifluoroacetic acid (TFA).
A health functional food comprising the food composition of claim 1 as an active ingredient.
상기 건강기능식품 성상은 젤리형인 것을 특징으로 하는 아토피성 피부 개선용 건강기능식품.
The method of claim 7,
Wherein said health functional food composition is a jelly type health functional food for improving atopic skin.
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| KR102016077B1 (en) | 2018-08-29 | 2019-08-29 | 전민준 | Food compositions for improving and preventing atopic dematitis skin condition |
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