KR101834862B1

KR101834862B1 - Ｊｍｊｄ３ 유전자를 인식하기 위한 가이드 RNA 및 이를 이용한 Ｊｍｊｄ３ 넉아웃 인간배아암세포주의 제조 방법

Info

Publication number: KR101834862B1
Application number: KR1020150174763A
Authority: KR
Inventors: 채영규; 정경화; 박경선; 김선화; 김세계
Original assignee: 한양대학교 에리카산학협력단
Priority date: 2015-12-09
Filing date: 2015-12-09
Publication date: 2018-03-07
Also published as: KR20170068651A

Abstract

본 발명은 Jmjd3(Jumonji domain containing-3) 유전자를 인식하기 위한 가이드 RNA, 이를 포함하는 가이드 RNA 벡터, 및 이를 이용한 Jmjd3 넉아웃 인간배아암세포주를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 가이드 RNA를 이용하면 인간배아암세포주에서 Jmjd3 유전자를 넉아웃시킬 수 있다. 따라서 제조된 Jmjd3 유전자 넉아웃 인간배아암세포주는 Jmjd3 유전자의 기능 연구에 유용하게 이용할 수 있다.

Description

Ｊｍｊｄ３ 유전자를 인식하기 위한 가이드 RNA 및 이를 이용한 Ｊｍｊｄ３ 넉아웃 인간배아암세포주의 제조 방법 {Guide RNA for recognizing Jmjd3 gene, and method for producing Jmjd3 knockout human embryoed carcinoma cell line use thereof}

본 발명은 Jmjd3(Jumonji domain containing-3) 유전자를 인식하기 위한 가이드 RNA, 이를 포함하는 가이드 RNA 벡터, 및 이를 이용한 Jmjd3 넉아웃 인간배아암세포주를 제조하는 방법에 관한 것이다.

유전자가위(engineered nuclease)란 인간 및 동식물 세포의 유전체를 교정하는 데 사용되는 유전자 교정(genome editing) 기술로 유전체에서 특정 염기 서열을 인식한 후 해당 부위의 DNA를 정교하게 잘라내는 시스템을 말한다. 현재까지 개발된 유전자가위로는 1세대 징크핑거 뉴클레이즈(ZFNs·Zinc Finger Nucleases), 2세대 탈렌(TALENs·Transcription Activator-Like Effector Nucleases), 3세대 크리스퍼(CRISPR-Cas9)가 있다.

가장 최근 기술인 크리스퍼 유전자가위는 인간이나 동식물의 세포에서 특정 유전자가 있는 DNA를 잘라내는 효소로, 교정하려는 DNA를 찾아내는 가이드 RNA와 DNA를 잘라내는 Cas9 단백질로 구성된다. 크리스퍼(CRISPR-Cas9) 기술을 이용하면 유전자를 잘라내고 새로 바꾸는 데 최장 수년씩 걸리던 것이 며칠로 줄어들며, 동시에 여러 군데의 유전자를 손볼 수도 있다. 이로 인해 유전자가위는 에이즈, 혈우병 등 유전 질환을 치료하고, 농작물 품질 개량이 용이해 유전자 변형 식물(GMO)의 대안으로 주목받고 있다(비특허문헌 1).

한편, 쥬몬지-C 도메인(JmjC)-포함 히스톤 탈메틸효소(demethylase) 패밀리 KMD6은 H3K27me3 탈메틸화에 관련이 있다. 3개의 KDM6 탈메틸효소, Jmjd3은, UTX 및 UTY는 H3K27me3 및 H3K27me2로부터 한 개의 메틸기를 제거할 수 있다. Jmjd3은 및 UTX는 닫힌 헤테로크로마틴 구조를 열린 상태로 바꾸는 것에 의하여 분화에 있어서 중요한 역할을 한다. 마우스 배아줄기세포에서, Jmjd3은 신경계 마커 발현을 조절하고, 이것에 의하여 신경계 커미트먼트(commitment)를 매개한다. Jmjd3 또는 UTX의 넉아웃 및 넉다운 연구는 이러한 탈메틸효소가 중추신경계, 호흡계, 심장혈관계의 발달에 중요한 역할을 함을 제시한다.

종래 연구들은 이러한 효소들의 효소 활성을 저해하는 몇몇 기술, 예를 들어 RNA 간섭(interference) 및 부위 특이적 돌연변이 등을 이용하여 생물학적 과정에서 Jmjd3 또는 UTX의 기능을 측정했다. 이러한 접근이 이 기술분야에서 쉽게 적용됨에도 불구하고, 이 기술들은 탈메틸효소의 무결성(integrity)에 영향을 미칠 수 있고, 의도하지 않게 다른 전사 조절 기능을 저해할 수 있다.

이에 본 발명자들은 Jmjd3 유전자를 인식할 수 있는 새로운 가이드 RNA 서열을 제작하였으며, 이를 이용하여 Jmjd3 유전자 넉아웃 인간배아암세포주를 제조하여 본 발명을 완성하였다.

SCIENCE, vol.345, issue.6213, pp.1077-1088 (2014)

본 발명의 목적은 서열번호 1 내지 4로 구성되는 군으로부터 선택된 염기서열로 이루어지는 가이드 RNA를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 가이드 RNA를 포함하는 Jmjd3 유전자를 인식하기 위한 가이드 RNA 벡터를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 가이드 RNA 벡터를 이용하여 Jmjd3 유전자 넉아웃 인간배아암세포주를 제조하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에 의해 제조된 Jmjd3 유전자 넉아웃 인간배아암세포주를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 일 구체예는 서열번호 1 내지 4로 구성되는 군으로부터 선택된 염기서열로 이루어지는 가이드 RNA를 제공한다.

본 명세서에서 사용된 용어, "가이드 RNA(guide RNA, gRNA)"란 RNA(ribonucleic acid)의 한 종류로, 인간이나 동식물의 특정 유전자를 교정하는 유전자 교정(genome editing)에서 교정하려는 DNA를 인식하여 찾아내는 RNA를 의미한다. 유전자 교정 기술로는 유전자가위(engineered nuclease)가 있으며, 유전자 가위의 종류로 CRISPR-Cas9이 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "CRISPR-Cas9"이란 미생물의 면역체계로 알려진 CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 시스템을 이용해 원하는 유전자 염기서열을 절단하도록 고안된 것으로서, 고정적 구성요소로서 Cas9 단백질을 포함하고, 가변적 구성요소로서 타겟 유전자에 특이적인 가이드RNA를 포함한다. 이때 타겟 유전자의 조건은 23 bp 길이이고 두 개의 구아닌 염기(GG)로 끝나기만 하면 된다. 가이드 RNA가 타겟 유전자를 인식하면 가이드 RNA에 Cas9 단백질이 결합하여 뉴클레아제로 작용하여 타겟 유전자의 하류 약 3 bp에 위치한 두 개의 구아닌 염기(GG)를 인식하여 절단함으로써 DNA 이중가닥 손상(DNA double strand break, DSB)을 유발한다. 상기 CRISPR-Cas9 시스템에는 tracr RNA를 더 포함할 수 있으며, 상기 tracr RNA는 gRNA와 복합체를 형성하여 Cas9이 인식할 수 있는 구조를 형성하는 역할을 할 수 있다.

상기 가이드 RNA는 Jmjd3(Jumonji domain containing-3) 유전자의 특정 서열을 표적으로 하며, 상기 Jmjd3 유전자는 인간 및 동물의 공지된 서열이라면 어느 것이나 포함될 수 있고, 예를 들어 인간 Jmjd3 유전자(NCBI GenBank Accession number: NM_001080424.1)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 인간 Jmjd3 유전자는 서열번호 5로 표시하였다.

상기 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 가이드 RNA는 인간의 17번 염색체의 7754993~7755015번째 염기 23bp에 상보적으로 결합하며, Jmjd3 유전자의 17번 엑손(exon)의 특정 서열을 타겟으로 할 수 있다.

상기 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 가이드 RNA는 인간의 17번 염색체의 7755022~7755044번째 염기 23bp에 상보적으로 결합하며, Jmjd3 유전자의 17번 엑손(exon)의 특정 서열을 타겟으로 할 수 있다.

상기 서열번호 3의 염기서열로 이루어지는 가이드 RNA는 인간의 17번 염색체의 7756396~7756418번째 염기 23bp에 상보적으로 결합하며, Jmjd3 유전자의 21번 엑손(exon)의 특정 서열을 타겟으로 할 수 있다.

상기 서열번호 4의 염기서열로 이루어지는 가이드 RNA는 인간의 17번 염색체의 7756644~775666번째 염기 23bp에 상보적으로 결합하며, Jmjd3 유전자의 22번 엑손(exon)의 특정 서열을 타겟으로 할 수 있다.

본 발명의 다른 구체예는 상기 가이드 RNA를 포함하는, 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 Jmjd3(Jumonji domain containing-3) 유전자를 인식하기 위한 가이드 RNA 벡터를 제공한다.

상기 가이드 RNA 벡터를 이용하여 세포를 형질주입하면 세포 내에 가이드 RNA 단편을 전달할 수 있고, 전달된 가이드 RNA 단편은 Jmjd3 유전자를 인식할 수 있다.

상기 가이드 RNA 벡터는 Tracr RNA를 더 포함할 수 있다. 따라서, 상기 가이드 RNA 벡터를 이용하여 세포를 형질주입하면 세포 내에 가이드 RNA 단편 및 Tracr RNA 단편을 전달할 수 있고, 전달된 Tracr RNA 단편은 gRNA와 복합체를 형성하여 Cas9이 인식할 수 있는 구조를 형성하는 역할을 할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "벡터"란 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "발현 벡터"는 흔히 "재조합 벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "재조합 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 재조합 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질주입된 세포를 비형질주입 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate), 글루포시네이트암모늄(glufosinate ammonium) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다.

본 발명의 또 다른 구체예는 Jmjd3 유전자 넉아웃(knock-out) 인간배아암세포주를 제조하는 방법을 제공하며, 구체적으로

1) 서열번호 1 내지 4로 구성되는 군으로부터 선택된 염기서열로 이루어지는 가이드 RNA를 제작하는 단계;

2) 상기 단계 1)에서 제작한 가이드 RNA를 포함하는 가이드 RNA 벡터를 제작하는 단계;

3) 상기 단계 2)에서 제작한 가이드 RNA 벡터 및 Cas9 단백질 발현 벡터를 인간배아암세포에 형질주입시켜 인간배아암세포에서 Jmjd3(Jumonji domain containing-3) 유전자의 표적 서열에 DNA 결실(deletion)을 유발하는 단계;를 포함하는, Jmjd3 유전자 넉아웃(knock-out) 인간배아암세포주를 제조하는 방법을 제공한다.

본 명세서에서 사용된 용어, "넉아웃(knock-out, KO)"이란 유전자가 작동하지 않게 하는 것을 의미하며, "Jmjd3 유전자 넉아웃"이란 Jmjd3 유전자의 발현을 억제하는 것을 의미한다. 따라서, 상기 "Jmjd3 유전자 넉아웃 인간배아암세포주"란 Jmjd3 유전자의 발현이 억제되거나 현저히 감소한 인간배아암세포주를 의미한다.

상기 구체예에서, 상기 단계 1)의 가이드 RNA 제작은 하기로 구성되는 군으로부터 선택된 어느 하나의 프라이머 세트를 이용하여 인간배아암세포에서 추출한 DNA를 시료로 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하는 단계;를 포함할 수 있다:

서열번호 6 및 7의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;

서열번호 8 및 9의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;

서열번호 10 및 11의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; 및

서열번호 12 및 13의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트.

상기 서열번호 6 및 7의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 가이드 RNA를 특이적으로 증폭할 수 있다.

상기 서열번호 8 및 9의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트는 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 가이드 RNA를 특이적으로 증폭할 수 있다.

상기 서열번호 10 및 11의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트는 서열번호 3의 염기서열로 이루어지는 가이드 RNA를 특이적으로 증폭할 수 있다.

상기 서열번호 12 및 13의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트는 서열번호 4의 염기서열로 이루어지는 가이드 RNA를 특이적으로 증폭할 수 있다.

상기 구체예에서, 상기 단계 3)의 형질주입은 단계 2)에서 제작한 가이드 RNA 벡터 중 1종 이상을 이용할 수 있다.

구체적으로, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 가이드 RNA를 포함하는 가이드 RNA 벡터; 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 가이드 RNA를 포함하는 가이드 RNA 벡터; 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 가이드 RNA를 포함하는 가이드 RNA 벡터; 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 가이드 RNA를 포함하는 가이드 RNA 벡터 중 1종 내지 4종을 이용하여 형질주입할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 가이드 RNA를 포함하는 가이드 RNA 벡터 Jmjd3 gRNA-1을 인간배아암종세포에 형질주입시켜 하나의 표적 서열을 인식하거나, 추가적으로 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 가이드 RNA를 포함하는 가이드 RNA 벡터 Jmjd3 gRNA-2, 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 가이드 RNA를 포함하는 가이드 RNA 벡터 Jmjd3 gRNA-3 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 가이드 RNA를 포함하는 가이드 RNA 벡터 Jmjd3 gRNA-4를 형질주입시켜 네 개의 표적 서열을 인식하였다.

상기 구체예에서, 상기 단계 3)에서 사용한 Cas9 단백질 발현 벡터란 Cas9 단백질을 세포 내에서 발현할 수 있는 운반체라면 그 종류를 제한하지 않으나, 예를 들어 시중에서 판매하는 공지의 벡터를 이용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 Cas9 단백질 발현 벡터는 Cas9 단백질에 GFP(green fluoresence protein)이 연결되어 함께 발현되는 pCas9-GFP 벡터를 구입하여 이용하였으나, 상기 벡터가 이러한 실시예에 제한되는 것은 아니다. 상기 GFP는 리포터 단백질일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "형질주입(transduction)"이란 동물세포에 DNA를 직접 도입하여 세포의 유전형질을 변이시키는 방법을 의미하며, 이는 당해 기술분야에 공지된 방법, 예를 들어, 칼슘 인산염 형질주입법(calcium phosphate transfection), 리포펙션법(lipofection), 전기천공(electroporation), 미량주사법(microinjection), 마이크로프로젝틸법(microprojectile)법을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 진핵생물의 경우 DNA인산칼슘침전법 또는 리포펙션 등의 상품화된 시약과 DNA를 혼합하여 세포를 처리하는 방법이 대표적이며, 유전자 도입한 리포터 유전자의 발현을 측정하여 발현세포의 동정 등을 할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "표적 서열"이란 가이드 RNA가 인식하는 유전자의 특정 염기서열을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어, "DNA 결실(deletion)"이란 유전자 염기서열의 일부 또는 전부가 제거된 것을 의미하며, 상기 구체예에서는 가이드 RNA가 인식하는 표적 서열 부위가 CRISPR-Cas9 시스템에 의해 제거된 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예는 상기 방법에 의해 제조된 Jmjd3 유전자 넉아웃(knock-out) 인간배아암세포주(수탁번호: KCLRFBP00353)를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에서, 한 개의 가이드 RNA를 형질주입하여 제조한 Jmjd3 유전자 넉아웃 인간배아암세포주 1-7 및 1-11과, 네 개의 가이드 RNA를 형질주입하여 제조한 Jmjd3 유전자 넉아웃 인간배아암세포주 8-23의 Jmjd3 유전자 발현량을 확인한 결과, 가이드 RNA가 형질주입되지 않은 대조군에 비해 Jmjd3 유전자 발현량이 현저히 감소함을 확인하였다.

본 발명의 가이드 RNA를 이용하면 인간배아암세포주에서 Jmjd3 유전자를 넉아웃시킬 수 있다. 따라서 제조된 Jmjd3 유전자 넉아웃 인간배아암세포주는 Jmjd3 유전자의 기능 연구에 유용하게 이용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 가이드 RNA의 타겟 부위를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 가이드 RNA 벡터의 모식도를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 Jmjd3 넉아웃 세포주의 제작 과정을 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 Jmjd3 넉아웃 세포주 1-7의 결실(deletion) 부위를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 Jmjd3 넉아웃 세포주 1-11의 결실(deletion) 부위를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 Jmjd3 넉아웃 세포주 8-23의 결실(deletion) 부위를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 Jmjd3 넉아웃 세포주(1-7, 1-11, 8-23)와 대조군(NCCIT)의 Jmjd3 유전자 발현량을 비교한 그래프이다.
도 8은 신경세포로 분화하는 동안에 Jmjd3 넉아웃 세포주 1-7의 Jmjd3 유전자 발현량을 비교한 그래프이다:
NCCIT control, NCCIT 세포 대조군;
NCCIT EB+RA, NCCIT 세포를 EB(embryonic body)로 배양한 후, RA(retinoic acid) 처리한 실험군;
NCCIT EB+RA+GSK, NCCIT 세포를 EB로 배양한 후, RA 처리 후, GSK-J4 처리한 실험군;
JMJD3 (1-7) control, Jmjd3 넉아웃 인간배아암세포주 1-7;
JMJD3 (1-7) EB+RA, Jmjd3 넉아웃 인간배아암세포주를 EB로 배양한 후, RA 처리한 실험군; 및
JMJD3 (1-7) EB+RA+GSK, Jmjd3 넉아웃 인간배아암세포주를 EB로 배양한 후, RA 처리 후, GSK-J4 처리한 실험군.
도 9는 신경세포로 분화하는 동안에 Jmjd3 넉아웃 세포주 1-11의 Jmjd3 유전자 발현량을 비교한 그래프이다:
NCCIT control, NCCIT 세포 대조군;
NCCIT EB+RA, NCCIT 세포를 EB로 배양한 후, RA처리한 실험군;
NCCIT EB+RA+GSK, NCCIT 세포를 EB로 배양한 후, RA 처리 후, GSK-J4 처리한 실험군;
JMJD3 (1-11) control, Jmjd3 넉아웃 인간배아암세포주 1-11;
JMJD3 (1-11) EB+RA, Jmjd3 넉아웃 인간배아암세포주 1-11을 EB로 배양한 후, RA 처리한 실험군; 및
JMJD3 (1-11) EB+RA+GSK, Jmjd3 넉아웃 인간배아암세포주 1-11을 EB로 배양한 후, RA 처리 후, GSK-J4 처리한 실험군.
도 10은 신경세포로 분화하는 동안에 Jmjd3 넉아웃 세포주 8-23의 Jmjd3 유전자 발현량을 비교한 그래프이다:
NCCIT control, NCCIT 세포 대조군;
NCCIT EB+RA, NCCIT 세포를 EB로 배양한 후, RA처리한 실험군;
NCCIT EB+RA+GSK, NCCIT 세포를 EB로 배양한 후, RA 처리 후, GSK-J4 처리한 실험군;
JMJD3 (8-23) control, Jmjd3 넉아웃 인간배아암세포주 8-23;
JMJD3 (8-23) EB+RA, Jmjd3 넉아웃 인간배아암세포주 8-23을 EB로 배양한 후, RA 처리한 실험군; 및
JMJD3 (8-23) EB+RA+GSK, Jmjd3 넉아웃 인간배아암세포주 8-23을 EB로 배양한 후, RA 처리 후, GSK-J4 처리한 실험군.
도 11은 신경세포로 분화하는 동안에 Jmjd3 넉아웃 세포주(1-7, 8-23)의 NES, PAX6, BMP4 유전자 발현량을 비교한 그래프이다:
NCCIT control, NCCIT 세포 대조군;
NCCIT EB+RA, NCCIT 세포를 EB로 배양한 후, RA처리한 실험군;
NCCIT EB+RA+GSK, NCCIT 세포를 EB로 배양한 후, RA 처리 후, GSK-J4 처리한 실험군;
1-7 CON, Jmjd3 넉아웃 인간배아암세포주 1-7;
1-7 EB+RA, Jmjd3 넉아웃 인간배아암세포주 1-7을 EB로 배양한 후, RA 처리한 실험군;
1-7 EB+RA+GSK, Jmjd3 넉아웃 인간배아암세포주 1-7을 EB로 배양한 후, RA 처리 후, GSK-J4 처리한 실험군;
8-23 CON, Jmjd3 넉아웃 인간배아암세포주 8-23;
8-23 EB+RA, Jmjd3 넉아웃 인간배아암세포주 8-23을 EB로 배양한 후, RA 처리한 실험군; 및
8-23 EB+RA+GSK, Jmjd3 넉아웃 인간배아암세포주 8-23을 EB로 배양한 후, RA 처리 후, GSK-J4 처리한 실험군.
도 12는 신경세포로 분화하는 동안에 Jmjd3 넉아웃 세포주(1-7, 8-23)의 POU5F1, NANOG, SOX2 유전자 발현량을 비교한 그래프이다:
NCCIT control, NCCIT 세포 대조군;
NCCIT EB+RA, NCCIT 세포를 EB로 배양한 후, RA처리한 실험군;
NCCIT EB+RA+GSK, NCCIT 세포를 EB로 배양한 후, RA 처리 후, GSK-J4 처리한 실험군;
1-7 CON, Jmjd3 넉아웃 인간배아암세포주 1-7;
1-7 EB+RA, Jmjd3 넉아웃 인간배아암세포주 1-7을 EB로 배양한 후, RA 처리한 실험군;
1-7 EB+RA+GSK, Jmjd3 넉아웃 인간배아암세포주 1-7을 EB로 배양한 후, RA 처리 후, GSK-J4 처리한 실험군;
8-23 CON, Jmjd3 넉아웃 인간배아암세포주 8-23;
8-23 EB+RA, Jmjd3 넉아웃 인간배아암세포주 8-23을 EB로 배양한 후, RA 처리한 실험군; 및
8-23 EB+RA+GSK, Jmjd3 넉아웃 인간배아암세포주 8-23을 EB로 배양한 후, RA 처리 후, GSK-J4 처리한 실험군.
도 13은 신경세포로 분화하는 동안에 Jmjd3 넉아웃 세포주(1-7, 8-23)의 RBP1, CRABP1, CRABP2, CYP26A1 유전자 발현량을 비교한 그래프이다:
NCCIT control, NCCIT 세포 대조군;
NCCIT EB+RA, NCCIT 세포를 EB로 배양한 후, RA처리한 실험군;
NCCIT EB+RA+GSK, NCCIT 세포를 EB로 배양한 후, RA 처리 후, GSK-J4 처리한 실험군;
1-7 CON, Jmjd3 넉아웃 인간배아암세포주 1-7;
1-7 EB+RA, Jmjd3 넉아웃 인간배아암세포주 1-7을 EB로 배양한 후, RA 처리한 실험군;
1-7 EB+RA+GSK, Jmjd3 넉아웃 인간배아암세포주 1-7을 EB로 배양한 후, RA 처리 후, GSK-J4 처리한 실험군;
8-23 CON, Jmjd3 넉아웃 인간배아암세포주 8-23;
8-23 EB+RA, Jmjd3 넉아웃 인간배아암세포주 8-23을 EB로 배양한 후, RA 처리한 실험군; 및
8-23 EB+RA+GSK, Jmjd3 넉아웃 인간배아암세포주 8-23을 EB로 배양한 후, RA 처리 후, GSK-J4 처리한 실험군.
도 14는 신경세포로 분화하는 동안에 Jmjd3 넉아웃 세포주(1-7, 8-23)의 HOXB1 유전자 발현량을 비교한 그래프이다:
NCCIT control, NCCIT 세포 대조군;
NCCIT EB+RA, NCCIT 세포를 EB로 배양한 후, RA처리한 실험군;
NCCIT EB+RA+GSK, NCCIT 세포를 EB로 배양한 후, RA 처리 후, GSK-J4 처리한 실험군;
1-7 CON, Jmjd3 넉아웃 인간배아암세포주 1-7;
1-7 EB+RA, Jmjd3 넉아웃 인간배아암세포주 1-7을 EB로 배양한 후, RA 처리한 실험군;
1-7 EB+RA+GSK, Jmjd3 넉아웃 인간배아암세포주 1-7을 EB로 배양한 후, RA 처리 후, GSK-J4 처리한 실험군;
8-23 CON, Jmjd3 넉아웃 인간배아암세포주 8-23;
8-23 EB+RA, Jmjd3 넉아웃 인간배아암세포주 8-23을 EB로 배양한 후, RA 처리한 실험군; 및
8-23 EB+RA+GSK, Jmjd3 넉아웃 인간배아암세포주 8-23을 EB로 배양한 후, RA 처리 후, GSK-J4 처리한 실험군.

이하 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.

< 실시예 1> Jmjd3 유전자 넉아웃 인간배아암세포주의 제작

Mali 등의 논문(Science. 2013; 339(6121):823-6)에서 디자인한 방법을 변형하여 CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9(CRISPR-associated 9) 시스템을 이용하여 Jmjd3 유전자 넉아웃(knock-out) 인간배아암종세포주를 제작하였다. 구체적인 제작 방법은 다음과 같다.

<1-1> 인간배아암종세포 NCCIT의 배양

인간배아암종세포는 미국 ATCC에서 분양받았다. 인간배아암종세포 NCCIT는 RPMI 1640배지에 10% FBS (소 태아 혈청), 100 U/ml 페니실린(penicillin) 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신(streptomycin)을 첨가한 성장배지에서 37℃, 5% CO₂를 공급하는 배양기에서 배양하였다.

<1-2> Jmjd3 유전자를 타겟으로 하는 가이드(guide) RNA 및 gRNA 벡터의 제작

Jmjd3 유전자를 타겟으로 하는 가이드(guide) RNA를 제작하였다. Jmjd3 유전자는 NCBI GenBank Accession number NM_001080424.1로 등록되어 있다. Jmjd3 유전자 서열은 서열번호 5로 표시하였다.

4개의 Jmjd3 가이드 RNA(gRNA) 단편(Jmjd3 gRNA-1, -2, -3, -4)을 준비하기 위하여, Jmjd3 코딩 영역에서 4쌍의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하였고, 이를 통해 4개의 사이트를 증폭하였다. PCR 조건은 98℃ 2분 후, 98℃ 10초, 53℃ 20초, 72℃ 30초씩 3 사이클 수행 후, 72℃ 5분 수행하였다. 증폭된 각각의 가이드 RNA 정보는 하기 표 1에 나타내었으며, 가이드 RNA 증폭에 사용한 프라이머 정보는 하기 표 2에 나타내었다. 가이드 RNA의 타겟 부분은 도 1에 나타내었다.

그 다음, 각각의 가이드 RNA를 삽입한 gRNA 벡터를 제작하였다. 먼저 AflII(New England Biolabs, Ipswich, MA)를 이용해 gRNA 클로닝 벡터 (Addgene plasmid ID 41824, Cambridge, MA)를 선형으로 만들고, 각각의 gRNA를 라이게이션(ligation)하였으며, 이는 Gibson Assembly Master Mix(New England Biolabs)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 Gibson Assembly 방법에 의해 수행하였다. 제조된 gRNA 벡터의 모식도는 도 2에 나타내었다. 이렇게 하여 제조된 gRNA 벡터를 NEB 5-α 컴피턴트(competent) 세포(New England Biolabs)에 형질전환시켰다. 그 후, gRNA 벡터를 분리하고 염기서열을 분석한 결과, 클로닝되었음을 확인하였다.

서열번호	gRNA 명칭	서열	Jmjd3 타겟 부위	Jmjd 3 타 겟 엑손	방향	Jmjd3 타겟 서열
1	Jmjd3 gRNA-1	CCCGCATGAAGGCGGGCAGCTTC	chr17: 7754993-7755015	17	+	GAAGCTGCCCGCCTTCATGCGGG
2	Jmjd3 gRNA-2	CCACGGGCAACATGCTGAGCCAC	chr17: 7755022-7755044	17	_	GTGGCTCAGCATGTTGCCCGTGG
3	Jmjd3 gRNA-3	CCAGGGCCGTGTCAAGGACGAGC	chr17: 7756396-7756418	21	_	GCTCGTCCTTGACACGGCCCTGG
4	Jmjd3 gRNA-4	CCTCAGTGCGGTACTGCTCCAGC	chr17: 7756644-7756666	22	+	GCTGGAGCAGTACCGCACTGAGG

서열번호	명칭	방향	서열(5'→3')
6	Jmjd3 gRNA-1-F	정방향	TTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGAAGCTGCCCGCCTTCATGC
7	Jmjd3 gRNA-1-R	역방향	GACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACGCATGAAGGCGGGCAGCTTC
8	Jmjd3 gRNA-2-F	정방향	TTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGTGGCTCAGCATGTTGCCCG
9	Jmjd3 gRNA-2-R	역방향	GACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACCGGGCAACATGCTGAGCCAC
10	Jmjd3 gRNA-3-F	정방향	TTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGCTCGTCCTTGACACGGCCC
11	Jmjd3 gRNA-3-R	역방향	GACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACGGGCCGTGTCAAGGACGAGC
12	Jmjd3 gRNA-4-F	정방향	TTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGCTGGAGCAGTACCGCACTG
13	Jmjd3 gRNA-4-R	역방향	GACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACCAGTGCGGTACTGCTCCAGC

<1-3> CRISPR - Cas9을 이용한 Jmjd3 넉아웃 세포주의 제작

상기 실시예 1-2에서 제작한 gRNA 벡터와 pCas9-GFP 벡터를 인간배아암세포 NCCIT 세포에 형질주입(transfection)시키는 방법으로 Jmjd3 유전자의 타겟 부분을 결실(deletion)시켜 Jmjd3 넉아웃 세포주를 제작하였다. Jmjd3 넉아웃 세포주의 제작 과정을 도 3에 나타내었다.

구체적으로, gRNA 벡터 및 pCas9-GFP 벡터(Addgene plasmid ID 44719)를 20:1의 몰비(molar ratio)로 혼합하고, 리포펙타민 LTX 및 PLUS 시약(Invitrogen)을 이용하여 제조사의 지시에 따라 실시예 1-1에서 배양한 NCCIT 세포에 형질주입하였다. 가이드 RNA-1을 형질주입한 Jmjd3 1-7 및 Jmjd3 1-11, 가이드 RNA-1, -2, -3 및 -4를 모두 형질주입한 Jmjd3 8-23을 제작하였다. 이 중 Jmjd3 8-23 세포주는 한국세포주연구재단에 기탁하였다(수탁번호: KCLRFBP00353). Jmjd3 8-23 세포주는 4개의 가이드 RNA가 모두 도입되어 긴 서열의 DNA가 결실(Deletion)되므로, 넉아웃(knock-out) 효과가 가장 우수할 것으로 판단하였다.

형질주입 48시간 후에 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하는 세포를 FACS(형광이용세포분류기)를 이용하여 분리하고, 디쉬(dish) 당 3000-5000 세포의 밀도를 갖는 RPMI-함유 디쉬에 옮기고, 2주 동안 배양하였다. 콜로니를 24-웰 플레이트에 옮기고, genomic DNA 분리를 위해 배양하였다. 가이드 RNA의 타겟 부분이 각각 다르므로, Jmjd3 유전자에서 타겟 부분을 각각 포함하는 프라이머 세트 4쌍을 제작하여 표 3에 나타내었다. 배양 2주 후에 genomic DNA를 분리하여 하기 표 3의 프라이머 세트를 이용하여 Jmjd3 유전자 부위를 PCR 증폭시켰다. PCR은 95℃ 1분, 60℃ 1분, 72℃ 1분, 30사이클을 수행하였다. 그 후, TA 클로닝을 수행하여 염기서열을 분석하였다. 분석한 염기서열을 NCBI의 Jmjd3 genomic DNA 염기서열 (NCBI Accession no. NM_001080424.1)과 비교하여 결실(deletion)된 부분을 결정하였다(도 4 내지 6).

서열번호	명칭	방향	서열(5'→3')
14	Jmjd3-(1-2)_1_F	정방향	GTTCCTGCTTCCTTCCCCTC
15	Jmjd3-(1-2)_1_R	역방향	TCACAGAAAGCGCTGATGGT
16	Jmjd3-(1-2)_2_F	정방향	TGATGCTAAGCGGTCAGTGG
17	Jmjd3-(1-2)_2_R	역방향	GTCTCCCAGTAGTGCTCGTG
18	Jmjd3-(3-4)_1_F	정방향	CCTCTGCCCTTGCTCCAG
19	Jmjd3-(3-4)_1_R	역방향	TAGGTCCAGCCCAGGCAT
20	Jmjd3-(3-4)_2_F	정방향	TGGTCTCAACACAACCCCAC
21	Jmjd3-(3-4)_2_R	역방향	CCTCATCGCGACGTGCT

< 실시예 2> Jmjd3 유전자 넉아웃 인간배아암세포주의 유전자 발현 양상 분석

상기 실시예 1에서 제작한 Jmjd3 유전자 넉아웃 인간배아암세포주에서 Jmjd3 mRNA 발현을 qRT-PCR을 이용하여 확인하였다.

<2-1> 실시간 역전사 중합효소연쇄반응 (real-time RT- PCR )

인간배아암종세포에서 추출한 total RNA로 실시간 역전사 중합효소연쇄반응을 수행하였다. SYBR® Green을 이용한 중합효소연쇄반응액은 SYBR® Premix Ex Taq™ II (Takara BIO, Shiga, Japan)를 이용하여 ABI 7500 (Applied Biosystems, Carlsbad, CA)으로 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하였다. 최종 농도 2 pmol의 각 프라이머 (즉, 하기 실시예 2-2의 표 4에 해당하는 프라이머, 또는 하기 실시예 3-2의 표 5에 해당하는 프라이머)와 최종 농도 0.01 μg의 cDNA를 첨가하였다. DNA의 변성은 95 ℃에서 30초, 어닐링(annealing)은 60℃에서 30초, 합성은 72℃에서 30초간 40회 반복하였다. 모든 증폭과 검출은 optical caps (Applied Biosystems, Carlsbad, CA)로 덮은 96 웰-플레이트에서 수행하였다. 각 사이클의 생성물은 두 가닥 DNA에 결합하는 SYBR® Green의 특성을 이용하여 증가되는 양을 측정하였다. 중합효소연쇄반응 후 95 ℃에서 1분간 변성을 시키고, 60 ℃에서 어닐링(annealing) 시킨 후 60 ℃에서 95 ℃로 1분에 2 ℃ 씩 증가 시켜 dissociation curve (melting curve)를 분석하였다 (Lyondagger 등, 1998). 모든 실험은 3회 이상 반복하였으며, Gapdh(glyceraldehydes 3-phosphate dehydrogenase)로 표준화하였다. 결과 분석은 Applied Biosystems (Carlsbad, CA)사로부터 제공된 프로그램을 이용하였다. 실험으로부터 얻어진 CT값은 2^-CT 법을 사용하였다 (Livak과 Schmittgen, 2001). 인간배아암종 세포에서 각각의 유전자들과 Gapdh의 CT값을 얻은 후, 각각 유전자들의 CT값에서 Gapdh의 CT값을 빼서 ΔCT값을 얻었다. 얻어진 ΔCT값에서 ΔΔCT값을 얻기 위해 Jmjd3 넉아웃 인간배아암종세포에서 얻은 각각의 유전자의 ΔCT값을 인간배아암종 세포에서 얻은 유전자의 ΔCT값으로 빼주었다. 얻어진 ΔΔCT값을 2^- ^ΔΔCT에 넣어 계산하여 나온 값으로 인간배아암종 세포에 비해 Jmjd3 넉아웃 인간배아암종 세포에서 유전자 발현의 증감을 결정하였다. 최종 계산한 값이 ‘1’ 보다 높으면 발현이 증가한 것이고 ‘1’ 보다 낮으면 발현이 감소한 것이다.

<2-2> Jmjd3 넉아웃 NCCIT 세포의 유전자 발현 양상 분석

Jmjd3 넉아웃 NCCIT 세포인 Jmjd3 1-7, 1-11, 8-23 세포의 RNA를 분리한 후 cDNA를 만들었다. 그 다음, 하기 표 4의 프라이머 세트를 이용하여 상기 실시예 2-1에 기재된 방법에 따라 real time RT PCR을 수행하였다. Real time RT PCR 수행결과 NCCIT 에 비해 Jmjd3 KO NCCIT 세포에서 Jmjd3 유전자의 발현이 현저하게 감소하였음을 확인하였다(도 7).

서열번호	명칭	방향	서열(5'→3')
22	JMJD3-F	정방향	TTGGGCAACTGTACGAGTCAG
23	JMJD3-R	역방향	CCATAGTTCCGTTTGTGCTCAAG

< 실시예 3> Jmjd3 유전자 넉아웃 인간배아암세포주의 신경세포로의 분화 동안의 Jmjd3 유전자의 발현 변화 분석

<3-1> 신경세포로의 분화

인간배아암종세포를 신경세포로 분화시키기 위해 인간배아암종세포의 배지를 제거하고 0.25 % 트립신(trypsin)-EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid) (Invitrogen^TM, Carlsbad, CA)를 처리하여 37℃에서 5분 반응하였다. 반응 후 동일양의 성장배지를 첨가해주어 트립신(trypsin)의 활성을 저해하였다. 세포 용액을 1,000 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 상층액을 제거하여 트립신(trypsin)을 제거 한 후, 세포만 모아서 성장배지를 첨가하고 4 X 10⁶ ~ 5 X 10⁶ 세포를 미생물 배양접시로 옮겨 37℃, 5% CO₂를 공급하는 배양기에서 배양하였다. 배양 24시간 후 10 μM의 RA를 첨가해주며 48시간 동안 배양하였다.

<3-2> 신경세포로의 분화 동안의 Jmjd3 유전자의 발현 변화

NCCIT 세포와 실시예 1에서 제작한 Jmjd3 넉아웃 NCCIT 세포를 미생물 배양접시로 옮겨 37 ℃, 5% CO₂를 공급하는 배양기에서 EB(embryonic body)로 배양하였다(EB 실험군). 배양 24시간 후 10 μM의 RA(retinoic acid)를 첨가하여 48시간 배양하였다. EB로 배양하면서 RA를 처리함으로써 신경세포 분화 초기 상태와 유사하게 만들었다(EB+RA 실험군). 또한, EB로 배양하면서 RA를 처리하여 신경세포 분화 초기와 유사한 상태의 세포에 Jmjd3 억제제인 GSK-J4를 처리하였다(EB+RA+GSK 실험군). 배양 48시간 후 각 세포에서 RNA를 분리하여 하기 표 5의 프라이머를 이용해 상기 실시예 2-1에 기재된 방법에 따라 real time RT PCR을 수행하였다. PCR을 통해 cDNA를 합성하여 Jmjd3 유전자 및 Jmjd3 유전자와 관련 있는 여러 유전자(NES, PAX6, BMP4, POU5F1, NANOG, SOX, RBP, CRABP1, CRABP2, CYP26A, HOXB1)의 발현 양상을 분석하였다.

서열번호	명칭	방향	서열(5'→3')
24	NES-F	정방향	TGGCGCACCTCAAGATGTC
25	NES-R	역방향	GGTCCTAGAATTGCAGCTC
26	PAX6-F	정방향	AGATTCAGATGAGGCTCAAA
27	PAX6-R	역방향	AATTGGTTGGTAGACACTGG
28	BMP4-F	정방향	GCTGAGGTTAAAGAGGAAACGA
29	BMP4-R	역방향	TGGTCTTGAGTATCCTGAGCG
30	POU5F1-F	정방향	TCTATTTGGGAAGGATT
31	POU5F1-R	역방향	ATTGTTGTCAGCTTCCTCCA
32	NANOG-F	정방향	AGCTACAACAGGYGAAGAC
33	NANOG-R	역방향	GGTGGTAGGAAGAGTAAAGG
34	SOX2-F	정방향	TCCCATCACCCACAGCAAATGA
35	SOX2-R	역방향	TTTCTTGTCGGCATCGCGGTTT
36	RBP1-F	정방향	CAACTGGCTCCAGTCACTCC
37	RBP1-R	역방향	TGCACGATCTCTTTGTCTGG
38	CRABP1-F	정방향	CAGGACGGGGATCAGTTCTA
39	CRABP1-R	역방향	CGCCAAACGTCAGGATAAGT
40	CRABP2-F	정방향	ATCGGAAAACTTCGAGGAATTGC
41	CARBP2-R	역방향	AGGCTCTTACAGGGCCTCC
42	CYP26A1-F	정방향	CATGTTCTCCAGAAAGTGCG
43	CYP26A1-R	역방향	GGGATTCAGTCGAAGGGTCT
44	HOXB1-F	정방향	AGGAGACGGAGGCTATTTTCA
45	HOXB1-R	역방향	GTCTGCTCGTTCCCATAAGGG

도 8 내지 도 10에서 나타난 바와 같이, NCCIT 세포의 초기 분화 동안 Jmjd3 억제제인 GSK-J4를 처리하면 Jmjd3 유전자의 발현이 증가하는데, Jmjd3 유전자가 넉아웃(Knock-out)된 세포의 경우, GSK-J4를 처리하여도 Jmjd3 유전자의 발현이 증가하지 않았음을 확인할 수 있었다.

도 11 내지 도 14에서 나타난 바와 같이, NCCIT 세포의 초기 분화 동안 Jmjd3 억제제인 GSK-J4를 처리하면 Jmjd3에 의해 변화하는 유전자인 NES, Pax6 등의 유전자들의 발현이 변화하는데, Jmjd3 유전자가 넉아웃(Knock-out)된 세포의 경우 GSK-J4를 처리하면 NES, Pax6 등의 유전자 발현 양상이 대조군(control) 세포와 차이가 있음을 확인할 수 있었다.

이와 같이, Jmjd3 유전자 넉아웃(knock-out) 세포주를 이용하여 Jmjd3 유전자의 기능 연구에 이용할 수 있음을 알 수 있었다.

한국세포주연구재단

KCLRFBP00353

20151029

<110> Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University ERICA Campus <120> Guide RNA for recognizing Jmjd3 gene, and method for producing Jmjd3 knockout human embryoed carcinoma cell line use thereof <130> P15U22D1117 <160> 45 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Jmjd3 gRNA-1 <220> <223> Artificial sequence <400> 1 cccgcatgaa ggcgggcagc ttc 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Jmjd3 gRNA-2 <220> <223> Artificial sequence <400> 2 ccacgggcaa catgctgagc cac 23 <210> 3 <211> 23 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Jmjd3 gRNA-3 <220> <223> Artificial sequence <400> 3 ccagggccgt gtcaaggacg agc 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA_RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Jmjd3 gRNA-4 <220> <223> Artificial sequence <400> 4 cctcagtgcg gtactgctcc agc 23 <210> 5 <211> 6704 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 ggcaacatgc cagccccgta gcactgccca ccccacccac tgtggtctgt tgtaccccac 60 tgctggggtg 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ttgagcacaa acggaactat ggagccaagc ggggaggtcc 960 cccggtgaag cgagctgctg aacccccagt ggtgcagcct gtgcctcctg cagcactctc 1020 aggcccctca ggggaggagg gcctcagccc tggaggcaag cgaaggagag gctgcaactc 1080 tgaacagact ggccttcccc cagggctgcc actgcctcca ccaccattac caccaccacc 1140 accaccacca ccaccaccac caccacccct gcctggcctg gctaccagcc ccccatttca 1200 gctaaccaag ccagggctgt ggagtaccct gcatggagat gcctggggcc cagagcgcaa 1260 gggttcagca cccccagagc gccaggagca gcggcactcg ctgcctcacc catatccata 1320 cccagctcca gcgtacaccg cgcacccccc tggccaccgg ctggtcccgg ctgctccccc 1380 aggcccaggc ccccgccccc caggagcaga gagccatggc tgcctgcctg ccacccgtcc 1440 ccccggaagt gaccttagag agagcagagt tcagaggtcg cggatggact ccagcgtttc 1500 accagcagca accaccgcct gcgtgcctta cgccccttcc cggccccctg gcctccccgg 1560 caccaccacc agcagcagca gtagcagcag cagcaacact ggtctccggg gcgtggagcc 1620 gaacccaggc attcccggcg ctgaccatta ccaaactccc gcgctggagg tctctcacca 1680 tggccgcctg gggccctcgg cacacagcag tcggaaaccg ttcttggggg ctcccgctgc 1740 cactccccac ctatccctgc cacctggacc ttcctcaccc cctccacccc cctgtccccg 1800 cctcttacgc cccccaccac cccctgcctg gttgaagggt ccggcctgcc gggcagcccg 1860 agaggatgga gagatcttag aagagctctt ctttgggact gagggacccc cccgccctgc 1920 cccaccaccc ctcccccatc gcgagggctt cttggggcct ccggcctccc gcttttctgt 1980 gggcactcag gattctcaca cccctcccac tcccccaacc ccaaccacca gcagtagcaa 2040 cagcaacagt ggcagccaca gcagcagccc tgctgggcct gtgtcctttc ccccaccacc 2100 ctatctggcc agaagtatag acccccttcc ccggcctccc agcccagcac agaaccccca 2160 ggacccacct cttgtacccc tgactcttgc cctgcctcca gcccctcctt cctcctgcca 2220 ccaaaatacc tcaggaagct tcaggcgccc ggagagcccc cggcccaggg tctccttccc 2280 aaagaccccc gaggtggggc cggggccacc cccaggcccc ctgagtaaag ccccccagcc 2340 tgtgccgccc ggggttgggg agctgcctgc ccgaggccct cgactctttg attttccccc 2400 cactccgctg gaggaccagt ttgaggagcc agccgaattc aagatcctac ctgatgggct 2460 ggccaacatc atgaagatgc tggacgaatc cattcgcaag gaagaggaac agcaacaaca 2520 cgaagcaggc gtggcccccc aacccccgct gaaggagccc tttgcatctc tgcagtctcc 2580 tttccccacc gacacagccc ccaccactac tgctcctgct gtcgccgtca ccaccaccac 2640 caccaccacc accaccacca cggccaccca ggaagaggag aagaagccac caccagccct 2700 accaccacca ccgcctctag ccaagttccc tccaccctct cagccacagc caccaccacc 2760 cccacccccc agcccggcca gcctgctcaa atccttggcc tccgtgctgg agggacaaaa 2820 gtactgttat cgggggactg gagcagctgt ttccacccgg cctgggccct tgcccaccac 2880 tcagtattcc cctggccccc catcaggtgc taccgccctg ccgcccacct cagcggcccc 2940 tagcgcccag ggctccccac agccctctgc ttcctcgtca tctcagttct ctacctcagg 3000 cgggccctgg gcccgggagc gcagggcggg cgaagagcca gtcccgggcc ccatgacccc 3060 cacccaaccg cccccacccc tatctctgcc ccctgctcgc tctgagtctg aggtgctaga 3120 agagatcagc cgggcttgcg agacccttgt ggagcgggtg ggccggagtg ccactgaccc 3180 agccgaccca gtggacacag cagagccagc ggacagtggg actgagcgac tgctgccccc 3240 cgcacaggcc aaggaggagg ctggcggggt ggcggcagtg tcaggcagct gtaagcggcg 3300 acagaaggag catcagaagg agcatcggcg gcacaggcgg gcctgtaagg acagtgtggg 3360 tcgtcggccc cgtgagggca gggcaaaggc caaggccaag gtccccaaag aaaagagccg 3420 ccgggtgctg gggaacctgg acctgcagag cgaggagatc cagggtcgtg agaagtcccg 3480 gcccgatctt ggcggggcct ccaaggccaa gccacccaca gctccagccc ctccatcagc 3540 tcctgcacct tctgcccagc ccacaccccc gtcagcctct gtccctggaa agaaggctcg 3600 ggaggaagcc ccagggccac cgggtgtcag ccgggccgac atgctgaagc tgcgctcact 3660 tagtgagggg ccccccaagg agctgaagat ccggctcatc aaggtagaga gtggtgacaa 3720 ggagaccttt atcgcctctg aggtggaaga gcggcggctg cgcatggcag acctcaccat 3780 cagccactgt gctgctgacg tcgtgcgcgc cagcaggaat gccaaggtga aagggaagtt 3840 tcgagagtcc tacctttccc ctgcccagtc tgtgaaaccg aagatcaaca ctgaggagaa 3900 gctgccccgg gaaaaactca acccccctac acccagcatc tatctggaga gcaaacggga 3960 tgccttctca cctgtcctgc tgcagttctg tacagaccct cgaaatccca tcacagtgat 4020 ccggggcctg gcgggctccc tgcggctcaa cttgggcctc ttctccacca agaccctggt 4080 ggaagcgagt ggcgaacaca ccgtggaagt tcgcacccag gtgcagcagc cctcagatga 4140 gaactgggat ctgacaggca ctcggcagat ctggccttgt gagagctccc gttcccacac 4200 caccattgcc aagtacgcac agtaccaggc ctcatccttc caggagtctc tgcaggagga 4260 gaaggagagt gaggatgagg agtcagagga gccagacagc accactggaa cccctcctag 4320 cagcgcacca gacccgaaga accatcacat catcaagttt ggcaccaaca tcgacttgtc 4380 tgatgctaag cggtggaagc cccagctgca ggagctgctg aagctgcccg ccttcatgcg 4440 ggtaacatcc acgggcaaca tgctgagcca cgtgggccac accatcctgg gcatgaacac 4500 ggtgcagctg tacatgaagg tgcccggcag ccgaacgcca ggccaccagg agaataacaa 4560 cttctgctcc gtcaacatca acattggccc aggcgactgc gagtggttcg cggtgcacga 4620 gcactactgg gagaccatca gcgctttctg tgatcggcac ggcgtggact acttgacggg 4680 ttcctggtgg ccaatcctgg atgatctcta tgcatccaat attcctgtgt accgcttcgt 4740 gcagcgaccc ggagacctcg tgtggattaa tgcggggact gtgcactggg tgcaggccac 4800 cggctggtgc aacaacattg cctggaacgt ggggcccctc accgcctatc agtaccagct 4860 ggccctggaa cgatacgagt ggaatgaggt gaagaacgtc aaatccatcg tgcccatgat 4920 tcacgtgtca tggaacgtgg ctcgcacggt caaaatcagc gaccccgact tgttcaagat 4980 gatcaagttc tgcctgctgc agtccatgaa gcactgccag gtgcaacgcg agagcctggt 5040 gcgggcaggg aagaaaatcg cttaccaggg ccgtgtcaag gacgagccag cctactactg 5100 caacgagtgc gatgtggagg tgtttaacat cctgttcgtg acaagtgaga atggcagccg 5160 caacacgtac ctggtacact gcgagggctg tgcccggcgc cgcagcgcag gcctgcaggg 5220 cgtggtggtg ctggagcagt accgcactga ggagctggct caggcctacg acgccttcac 5280 gctggtgagg gcccggcggg cgcgcgggca gcggaggagg gcactggggc aggctgcagg 5340 gacgggcttc gggagcccgg ccgcgccttt ccctgagccc ccgccggctt tctcccccca 5400 ggccccagcc agcacgtcgc gatgaggccg gacgccccgc ccgcctgcct gcccgcgcaa 5460 ggcgccgcgg ggccaccagc acatgcctgg gctggaccta ggtcccgcct gtggccgaga 5520 agggggtcgg gcccagccct tccaccccat tggcagctcc cctcacttaa tttattaaga 5580 aaaacttttt tttttttttt agcaaatatg aggaaaaaag gaaaaaaaat gggagacggg 5640 ggagggggct ggcagcccct cgcccaccag cgcctcccct caccgacttt ggccttttta 5700 gcaacagaca caaggaccag gctccggcgg cggcgggggt cacatacggg ttccctcacc 5760 ctgccagccg cccgcccgcc cggcgcagat gcacgcggct cgtgtatgta catagacgtt 5820 acggcagccg aggtttttaa tgagattctt tctatgggct ttacccctcc cccggaacct 5880 ccttttttac ttccaatgct agctgtgacc cctgtacatg tctctttatt cacttggtta 5940 tgatttgtat tttttgttct tttcttgttt ttttgttttt aatttataac agtcccactc 6000 acctctattt attcattttt gggaaaaccc gacctcccac acccccaagc catcctgccc 6060 gcccctccag ggaccgcccg tcgccgggct ctccccgcgc cccagtgtgt gtccgggccc 6120 ggcccgaccg tctccacccg tccgcccgcg gctccagccg ggttctcatg gtgctcaaac 6180 ccgctcccct cccctacgtc ctgcactttc tcggaccagt ccccccactc ccgacccgac 6240 cccagcccca cctgagggtg agcaactcct gtactgtagg ggaagaagtg ggaactgaaa 6300 tggtattttg taaaaaaaat aaataaaata aaaaaattaa aggttttaaa gaaagaacta 6360 tgaggaaaag gaaccccgtc cttcccagcc ccggccaact ttaaaaaaca cagaccttca 6420 cccccacccc cttttctttt taagtgtgaa acaacccagg gccagggcct cactggggca 6480 gggacacccc ggggtgagtt tctctggggc tttattttcg ttttgttggt tgttttttct 6540 ccacgctggg gctgcggagg ggtggggggt ttacagtccc gcaccctcgc actgcactgt 6600 ctctctgccc caggggcaga ggggtcttcc caaccctacc cctattttcg gtgatttttg 6660 tgtgagaata ttaatattaa aaataaacgg agaaaaaaaa tcct 6704 <210> 6 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Jmjd3 gRNA-1-F <400> 6 tttcttggct ttatatatct tgtggaaagg acgaaacacc gaagctgccc gccttcatgc 60 60 <210> 7 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Jmjd3 gRNA-1-R <400> 7 gactagcctt attttaactt gctatttcta gctctaaaac gcatgaaggc gggcagcttc 60 60 <210> 8 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Jmjd3 gRNA-2-F <400> 8 tttcttggct ttatatatct tgtggaaagg acgaaacacc gtggctcagc atgttgcccg 60 60 <210> 9 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Jmjd3 gRNA-2-R <400> 9 gactagcctt attttaactt gctatttcta gctctaaaac cgggcaacat gctgagccac 60 60 <210> 10 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Jmjd3 gRNA-3-F <400> 10 tttcttggct ttatatatct tgtggaaagg acgaaacacc gctcgtcctt gacacggccc 60 60 <210> 11 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Jmjd3 gRNA-3-R <400> 11 gactagcctt attttaactt gctatttcta gctctaaaac gggccgtgtc aaggacgagc 60 60 <210> 12 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Jmjd3 gRNA-4-F <400> 12 tttcttggct ttatatatct tgtggaaagg acgaaacacc gctggagcag 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<211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Jmjd3-(3-4)_2_R <400> 21 cctcatcgcg acgtgct 17 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JMJD3-F <400> 22 ttgggcaact gtacgagtca g 21 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JMJD3-R <400> 23 ccatagttcc gtttgtgctc aag 23 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NES-F <400> 24 tggcgcacct caagatgtc 19 <210> 25 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NES-R <400> 25 ggtcctagaa ttgcagctc 19 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PAX6-F <400> 26 agattcagat gaggctcaaa 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PAX6-R <400> 27 aattggttgg tagacactgg 20 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BMP4-F <400> 28 gctgaggtta aagaggaaac ga 22 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BMP4-R <400> 29 tggtcttgag tatcctgagc g 21 <210> 30 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> POU5F1-F <400> 30 tctatttggg aaggatt 17 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> POU5F1-R <400> 31 attgttgtca gcttcctcca 20 <210> 32 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NANOG-F <400> 32 agctacaaca ggygaagac 19 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NANOG-R <400> 33 ggtggtagga agagtaaagg 20 <210> 34 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX2-F <400> 34 tcccatcacc cacagcaaat ga 22 <210> 35 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX2-R <400> 35 tttcttgtcg gcatcgcggt tt 22 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBP1-F <400> 36 caactggctc cagtcactcc 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RBP1-R <400> 37 tgcacgatct ctttgtctgg 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRABP1-F <400> 38 caggacgggg atcagttcta 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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Claims

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1) 서열번호 1 내지 4의 염기서열로 이루어지는 가이드 RNA를 각각 제작하는 단계;
2) 상기 단계 1)에서 제작한 가이드 RNA를 각각 포함하는 4종의 가이드 RNA 벡터를 제작하는 단계;
3) 상기 단계 2)에서 제작한 4종의 가이드 RNA 벡터 및 Cas9 단백질 발현 벡터를 분리된 인간배아암세포에 형질주입시켜 인간배아암세포에서 Jmjd3(Jumonji domain containing-3) 유전자의 표적 서열에 DNA 결실(deletion)을 유발하는 단계;를 포함하는, 수탁번호 KCLRFBP0053으로 기탁된 Jmjd3 유전자 넉아웃(knock-out) 인간배아암세포주를 제조하는 방법.
제 3항에 있어서, 상기 단계 1)의 가이드 RNA 제작은 하기로 구성되는 군을 모두 포함하는 프라이머 세트를 이용하여 인간배아암세포에서 추출한 DNA를 시료로 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는, Jmjd3 유전자 넉아웃 인간배아암세포주를 제조하는 방법:
서열번호 6 및 7의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
서열번호 8 및 9의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트;
서열번호 10 및 11의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트; 및
서열번호 12 및 13의 염기서열로 이루어지는 프라이머 세트.
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수탁번호 KCLRFBP00353으로 기탁된 Jmjd3 유전자 넉아웃(knock-out) 인간배아암세포주.