KR101820026B1 - 결핵을 치료하거나 예방하는데 적합한 리포솜 제형 - Google Patents

결핵을 치료하거나 예방하는데 적합한 리포솜 제형 Download PDF

Info

Publication number
KR101820026B1
KR101820026B1 KR1020137020385A KR20137020385A KR101820026B1 KR 101820026 B1 KR101820026 B1 KR 101820026B1 KR 1020137020385 A KR1020137020385 A KR 1020137020385A KR 20137020385 A KR20137020385 A KR 20137020385A KR 101820026 B1 KR101820026 B1 KR 101820026B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
tuberculosis
fragments
formulation
mycobacterium
liposome
Prior art date
Application number
KR1020137020385A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20140021538A (ko
Inventor
페레 존 카르도나 이글레시아스
이사벨 아마트 리에라
블랑카 레예스
아리아드나 셀가
메르세 아마트
Original Assignee
알치벨 팔마, 에스.엘.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from EP11150072A external-priority patent/EP2471511A1/en
Application filed by 알치벨 팔마, 에스.엘. filed Critical 알치벨 팔마, 에스.엘.
Publication of KR20140021538A publication Critical patent/KR20140021538A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101820026B1 publication Critical patent/KR101820026B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/045—Hydroxy compounds, e.g. alcohols; Salts thereof, e.g. alcoholates
    • A61K31/05—Phenols
    • A61K31/06—Phenols the aromatic ring being substituted by nitro groups
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/04—Mycobacterium, e.g. Mycobacterium tuberculosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A61P31/06—Antibacterial agents for tuberculosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/32—Mycobacterium

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

본 발명은 결핵균-복합체 균주로부터의 단편들을 포함하는 리포솜 제형을 제공하며, 또한 단편들이 리포솜 제형의 선택된 실시 예들에 통합될 수 있는 결핵균-복합체 균주를 제공한다. 본 발명은 리포솜 제형들을 포함하는 현탁액, 및 약학 조성물을 더 제공한다. 게다가, 본 발명은 치료에 의한 인간 또는 동물체의 치료 방법, 특히, 잠복기 결핵의 예방에서 또는 결핵 예방에서, 선택적으로 병용 치료에서와 같은, 결핵을 치료하거나 예방하는 방법에서의 사용을 위한 리포솜 제형들의 사용을 개시한다. 본 발명의 제제는 수크로오스를 포함하거나 및/또는 종래의 결핵 치료의 리포솜 기반 제제들보다 작은 평균 입자 크기를 가지며, 이는 높은 생물학적 이용가능성을 갖는다.

Description

결핵을 치료하거나 예방하는데 적합한 리포솜 제형{LIPOSOME FORMULATION SUITABLE FOR TREATING OR PREVENTING TUBERCULOSIS}
본 발명은 결핵균-복합체(Mycobacterium tuberculusis-complex) 균주로부터의 단편들을 포함하는 리포솜 제형(liposone formulation)뿐만 아니라, 이러한 제형들을 포함하는 현탁액(suspension)과 약학 조성물(pharmaceutical composition) 들 및 특히 결핵을 치료하거나 예방하기 위한, 치료 방법에서의 그것들 각각의 사용에 관한 것이다. 본 발명의 제형은 수크로오스(sucrose)를 포함하거나 및/또는 종래의 결핵 치료의 리포솜 기반 제형보다 적은 평균 입자 크기를 갖는데, 이는 더 높은 생물학적 이용가능성 및 효율을 야기한다.
결핵은 마이코박테리움(Mycobacterium) 종인 결핵균(M. tuberculosis), 소결핵균(M. bovis), 마이코박테리움 미크로티(M. microti) 및 마이코박테리움 아프리카눔(M. africanum)을 포함하는, 결핵균-복합체(MTB-C)에 의해 야기되는 만성 감염 질환이다. 결핵균 세포 엔벨로프(cellular envelope)의 주요 독특한 특성은 두껍고 왁스 같은(waxy) 세포 벽이다. 세포 벽 장벽의 특성들은 또한 숙주 및 결핵균-복합제 세균 사이의 면역학적 반응에서의 직접적인 조절자(modulator)로서 작용함으로써 생물체의 세포간 생존에 기여한다. 엔벨로프는 두 개의 독특한 부분, 플라스마 막(plasma membrane) 및 그 주위의 세포 벽으로 구성된다. 세포 벽은 인산이에스테르(phosphodiester) 결합들에 의해 부착되는, 분기 사슬 다당류, 아라비노갈락탄(arabinogalactan)을 갖는, 펩티도글리칸(peptidoglycan)의 공유 결합 구조에 의해 형성되는 골격이다. 아라비노갈락탄 말단 단부는 고분자 중량 지방산, 마이코박테리아에 독특한 크기와 구조의 미콜산(mycolic acid)으로 에스테르화된다.
세계 보건 기구(WHO)에 따르면, 세계적으로 질환을 나타내는 9,000,000명의 새로운 사례가 기록되고 약 2,000,000명이 사망한다. 세계적으로 2,700,000,000명 이상의 감염 환자가 존재하고 매년 9천만∼1억 명 이상의 새로운 감염 환자가 발생되는 것으로 여겨진다.
독성(virulent) 또는 비독성 균주의 세포 벽 단편들을 기초로 하는 결핵에 대한 다양한 백신들이 최신 기술에서 설명된다. 결핵에 대한 예방 치료에서 현재 사용되는 백신은 소결핵균의 약독 변형체(attenuated variant)인, 칼메트-게랭 균(Bacillus Calmette-Guerin, BCG)이라 불리는 박테리아 균주를 기초로 한다. 또한 백신의 조성물에서 사용되는 보조제(adjuvant)가 그것들의 효과에 크게 영향을 미칠 수 있는 것으로 알려진다.
트레할로오스 미콜레이트(trehalose mycolate)들, 특히 트레할로오스 디미콜레이트는 육아종(granuloma) 형성에 영향을 미치는 전염증성 캐스케이드(proinflammatory cascade)를 포함하는, 결핵균 추출액들 내의 가장 생물활성적인 지질들이다. 결핵균의 세포 벽 내에 존재하는 이러한 조성물들의 양에 대한 어떠한 문헌상의 데이터도 존재하지 않는다는 것을 이해하여야 한다. 이러한 종으로부터 유래하는 어떠한 샘플도 높은 생물학적 복잡성을 갖는다. 따라서, 정량 분석을 실행하기 위하여, 적극적이고, 복잡하고, 긴 정제 단계들이 필요할 것인데, 이는 그 다음의 구조 분석들을 실행하기에는 너무 적은 양의 정제된 조성물을 야기한다. 이것이 결핵균의 세포 벽 내의 각각의 조성물의 추출 비율에 대한 공개된 데이터가 존재하지 않는 이유이다. 일부 당지질들은 리포아라비노만난 (lipoarabinomannan)과 같은, 결핵-복합체 세포들의 일반적인 구성 조성물이다. 리포아라비노만난은 결핵-복합체 독성과 관련된다.
E. Ribi 등(Nature 1963, 1214-1215 페이지)은 비독성 칼메트-게랭 균 균주의 세포 벽 단편들 및 미네랄 오일(mineral oil)을 포함하는 조성물로 실행된 면역 분석법을 설명한다. 상기 단편들은 미네랄 오일 내의 상기 균주의 배양액의 균질화(homogenization)에 의해 획득된다. 조성물은 종래의 백신(칼메트-게랭 균)보다 더 효율적이다. 그럼에도 불구하고, 본 논문에서 그것들이 물에서 그리고 미네랄 오일이 존재하지 않는 상태에서 균질화에 의해 획득될 때 세포 벽 단편들은 어떠한 면역 반응도 유도하지 않는다는 것을 설명한다.
D.P. Pal 등(Indian J. Med. Res. 340-345 페이지)은 독성 H37Rw 균주의 세포 벽 단편들 및 미네랄 오일로 제조된 백신을 설명한다. 이 경우에 있어서 세포 벽 단편들은 수상(aqueous phase)에서 죽은 세포들의 균질화에 의해 획득되고, 미네랄 오일은 그 뒤에 조성물에 첨가된다. 또한 수상에서 균질화된 세포 벽 단편들은 면역성이 아니며 효율적인 백신을 위하여 미네랄 오일의 존재가 필요하다는 것을 설명한다.
G.K. Khuller 등(Folia Microbiol., 1992, 37, 407-412 페이지)은 프로인트 불완전 보조제(Freund's incomplete adjuvant)로 제조된 결핵균의 비독성 H37Ra 균주의 세포 벽 단편들의 서로 다른 부분의 예방 효율을 설명하는데, 여기에도 또한 미네랄 오일을 포함한다.
E.M. Agger 등(Scand. J. Immunol., 2002, 443-447 페이지)은 보조제로서 양이온 계면활성제 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드(dimethyldioctadecylammonium bromide)을 포함할 때 효과적인, 독성 H37Rv 균주의 세포 벽 단편들을 포함하는 백신들을 설명한다. 또한 언급된 보조제를 포함하지 않는 균질화된 결핵균 세균으로 수행된 분석법은 마우스(mouse) 모델에서 결핵에 대한 저항성의 레벨들을 발생하지 않는다는 것을 설명한다.
결핵에 대한 백신들의 재검토 논문에서, L.M. Orme(Vaccine, 2006, 24, 2-19 페이지)등은 종래의 칼메트-게랭 균 기반 백신은 본질적으로 결핵에 대하여 성인을 보호하는데 비효율적이라는 것을 설명한다.
결핵과 관련된 치료 또는 예방에 도움이 받을 수 있는 개인들은 다음의 4개의 서브 그룹으로 분류될 수 있다.:
(Ⅰ) 질환에 노출되지 않은 개인. 예방 백신접종은 그러한 개인의 감염을 예방할 수 있다.
(Ⅱ) 질환에 노출되었으나 아직 감염되지 않은 개인. 피부 튜베르쿨린 검사(Skin Tuberculin Test, TST)는 음성이다. 주 예방은 그러한 개인의 감염을 예방할 수 있다.
(Ⅲ) 병들지 않은 잠복기 폐결핵을 갖는 개인. 화학요법의 적용에 의해 질환발생의 위험이 낮아질 수 있다. 화학요법은 또한 이러한 개인들이 기본적으로 감염의 고위험 소스인 것을 중단시키는 장점을 제공한다.
(Ⅳ) 정상적으로는 질환의 주요 형태를 가지나 거의 전염되지 않은, 병이 있는, 즉, 질환을 앓는 개인. 화학요법은 이러한 개인들이 전염되는 것을 방지한다.
일단 감염이 시작되면, 최신 기술은 감염된 개인들, 즉 잠복기 결핵을 갖는 개인들 내의 활성 결핵의 발생을 방어하기 위한 다양한 치료를 설명한다.
예를 들면, 특허출원 EP2196473 A1에서, 감염된 개인들, 질환이 아직 발생되지 않은 개인분만 아니라 이미 질환이 발생된 개인들 내의 결핵을 치료하기 위하여, 몇 개월 동안 확장하기 위한 시간을 위하여 이소니아지드(isozianid)를 포함한 다양한 약물이 투여될 수 있는 것으로 설명된다.
특허출원 ES 2231037 A1에서 이소니아지드 또는 리팜피신(rifampicin)과 같은, 다른 약물들과 함께, 감염된 개인들 내의 결핵의 치료를 위한 약물의 제조를 위하여 결핵균-복합체의 독성 균주의 세포 단편들을 포함하는 면역치료 제제(agent)의 사용이 설명된다. 본 특허출원서는 또한 결핵균-복합체의 균주의 세포 벽 단편들을 포함하는 면역치료 제제를 제조하기 위한 방법을 개시한다.
국제특허 WO 2010/031883 A1에서 설명된 것과 같이, 잠복기 결핵 감염의 전염은 주로 결핵균에 감염된 에어로졸(aerosol)의 호흡을 통하여 발생한다. 따라서, 폐결핵으로 고통받는 환자들과의 직접적인 접촉을 하는 사람들, 및 따라서 같이 생활하거나 또는 그들과 다른 형태로 강렬하거나 빈번한 접촉을 하는 사람들과 같은, 감염된 에어로졸들을 전파할 수 사람들이 위험 그룹으로 고려된다.
현재, 정상적으로 그룹 Ⅰ 개인들에 정상적으로 투여되는 감염의 일차 화학적 예방은 300 ㎎/일을 초과하지 않고 5 ㎎/㎏의 투여량으로 매일 이소니아지드의 투여를 기초로 하는 일차 화학적 예방이다. 이러한 치료는 감염된 개인들과 같이 생활하거나 및/또는 감염된 개안들과 다른 형태로 가깝게 접촉하는, 피부 튜베르쿨린 검사 음성인 모든 연령의 모든 개인에 나타난다. 이러한 경우에 있어서, 화학적 예방은 감염원과의 접촉이 중단된 후 또는 감염원이 감염성이 중단된 후 3개월 동안 유지되는 것이 필요하다. 그러나, 화학적 예방은 일부 경우에 있어서 Martinez 등, Arch. Bronchoneumol., 2005, 41(1), 27-33 페이지에 의해 설명된 것과 같이, 원치 않는 이차 효과에 이르게 한다.
독성 결핵균-복합체 균주의 단편들을 포함하는 약물들은 예를 들면 유럽특허 EP1690549 B1, EP2090318 A1 및 국제특허 PCT/ES2009/000436에서 설명되었다. 유럽특허 EP2090318 A1 및 국제특허 PCT/ES2009/000436은 선택적으로 다른 약물들과 함께, 결핵의 예방을 위하여 적합한 약제로서의 사용을 위한 독성 결핵균-복합체 균주의 단편들을 포함하는 약학 조성물들을 개시한다. 다른 한편으로, 유럽특허 EP1690549 B1은 선택적으로 다른 약물들과 함께, 결핵균-복합체 단편들을 포함하는, 결핵의 치료를 위하여 적합한 약학 조성물들을 개시한다.
특허출원 EP 2090318 A1에서 결핵균-복합체의 독성 균주의 세포 벽 단편들을 기초로 하는 제제를 포함하는 약물의 투여는 결핵균 특이 항원들에 대한 반응을 발생시키는 Th1형 인터페론-감마를 유도할 수 있다는 것을 보고하였다. 상기 항원들은 AG85B 및 Ag85A를 포함하는데, 이들은 세포벽의 생합성에 결정적인 역할을 하며 박테리아 배양이 대수 성장 단계일 때 상당한 양이 생산되는 낮은 분자량 단백질들의 군으로 구성되는, Ag85 복합물의 부분이다. 또한 EP 2090318 A1에서 종래의 칼메트-게랭 균 기반 백신이 복합 Ag85 복합물의 항원들에 대한 면역보호 반응을 발생시키지 않는다는 것이 보고되었다. 이는 감염된 대식세포(macrophage)가 세균의 성장을 멈출 수 있도록 한다(North & Young, Ann. Rev. Immunol., 2004, 22:599-623).
세계 보건 기구는 결핵의 발생 위험이 인간 면역결핍 바이러스 감염이 없는 사람 중에서보다 인간 면역결핍 바이러스 감염을 갖는 사람들에서 20-37배 더 큰 것으로 추정된다는 것을 인식하였다. "Guidelines for intensified tuberculosis case-finding and isoniazid preventive therapy for people living with HIV in resource-constrained settings" WHO Guidelines 2011, ISBN: 978 92 4 150070 8에서 개요가 주어진다. 그러나 이소니아지드 예방 치료는 인간 면역결핍 바이러스 양성 환자들에게 장기간 보호를 제공할 수 있는 예방접종은 아니다. 오히려, 이소니아지드가 정기적으로 투여되는 것이 필요하며, 이소니아지드 저항성이 이러한 치료를 제공한다. 따라서, 인체 면역결핍 바이러스 양성의 인간 대상을 위한 더 강력한 예방 및 치료법을 제공하기 위한 필요성이 여전히 존재한다.
본 발명의 목적은 인간 면역결핍 바이러스 양성 및 인간 면역결핍 바이러스 음성 인간 대상들 모두에서, 잠복기 결핵의 예방, 및/또는 잠복기 또는 활성 결핵의 치료에서와 같이, 결핵을 예방하거나 치료하기에 적합한 향상된 제제의 제공이다. 또 다른 목적은 제제의 제조에 적합한 결핵균-복합체 균주의 제공이다. 제제를 제조하기 위한 과정이 본 발명이 또 다른 목적이다.
정의들
'결핵균 세포들의 단편들(FCMtb)'은 결핵균-복합체 균주로부터의 단편들을 나타낸다.
"입자 크기"는 달리 명시되지 않는 한, 입자의 지름을 언급한다. 입자 크기가 정확하게 결정될 수 있는 경우에, 근사치인 입자 크기로 여겨진다.
"z-평균(z-average)"은 재료 및 방법에서 설명되는 것과 같은 확인가능한, 평균 입자 크기를 언급한다.
약어들
AIDS (Acquired immunodefiency syndrome) 후천성 면역결핍증
BCG (Bacillus Calmette-Guerin) 칼메트-게랭 균
CFU (Colony-forming unit) 콜로니 형성 유닛
DP (Drug product) 약물 제품
DS (Drug substance) 약물 물질
ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) 효소 면역 분석법
ELISPOT (Enzyme-linked immunospot assay) 효소 면역점 분석법
EMEA (European Medicines Agency) 유럽 의약품 기구
FCMtb (Fragments of M. tuberculosis cells) 결핵균 세포들의 단편들
FIM (First in man) 사람에서는 첫 번째
HIV (human immunodeficiency virus) 인간 면역결핍 바이러스
IFN-γ (Interferon gamma) 인터페론 감마
IGTIP (Institut per a la Recerca en Ciences de la Salut Germans Trias i Pujol)
IMP (Investigational medicinal product) 약용 제품
IPC (In process controls) 진행 중인 제어들
LCS (Liposome concentrate suspension) 리포솜 농축 현탁액
LTBI (Latent tuberculosis infection) 잠복기 결핵 감염
LPS (Lipopolysaccharide) 지질다당류
Mtb (Mycobacterium tuberculosis) 결핵균
Mtb-C (Mycobacterium tuberculosis-complex) 결핵균-복합체
NZB (New Zealand Black) 뉴질랜드 블랙
NZW (New Zealand White) 뉴질랜드 화이트
PPD (Protein-purified derivative) 단백질 정제 유도체
q.s. (Quantum sufficit) 충분한 양
TB (Tuberculosis) 결핵
TST (Tuberculosis skin test) 피부 튜베르쿨린 검사
WHO (World Health Organization) 세계 보건 기구
w/v (weight/volume) 중량/체적
w/w (weight/weight) 중량/중량
본 발명은 결핵균-복합체 균주로부터의 단편을 포함하는 리보솜 제제 및 리포솜 형성 제제를 제공한다.
특정 실시 예에서, 예를 들면 동역학 광 산란(dynamic light scattering)에 의해 결정할 수 있는 것과 같은, 입자의 z-평균 크기는 120 ㎚ 또는 그 이하, 바람직하게는 110 ㎚ 또는 그 이하, 더 바람직하게는 95 ㎚ 또는 그 이하, 및 가장 바람직하게는 80 ㎚ 또는 그 이하이다. 대안의 실시 예에서, 리포솜 제형은 1 내지 20 %(w/v) 수크로오스, 바람직하게는 2 내지 12 %(w/v) 수크로오스, 더 바람직하게는 3 내지 8 %(w/v) 수크로오스, 및 가장 바람직하게는 4 내지 6 %(w/v) 수크로오스를 포함한다. 이러한 두 가지 실시 예 각각은 개별적으로 실행될 수 있으나, 이러한 실시 예들은 상호 독점적으로 나타나는 것이 아니라 조합하여 발생할 수 있다는 것을 이해하는 것이 중요하다.
특정한 일 실시 예에서, 위에서 설명된 리포솜 제형은 40 내지 120 ㎚ 범위, 바람직하게는 50 내지 110 ㎚ 범위, 더 바람직하게는 55 내지 95 ㎚ 범위, 및 가장 바람직하게는 55 내지 80 ㎚ 범위의 z-평균 입자 크기를 갖는다.
대안의 특정 실시 예에서, 위에서 설명된 리포솜 제형의 평균 입자 크기는 더 작을 수 있는데, 따라서 리포솜 제형은 에멀전(emulsion)인데, 즉, 이러한 특정 실시 예에서 입자들의 z-평균 크기는 바람직하게는 40 ㎚이하이다.
위에서 설명된 하나 또는 그 이상의 실시 예 중 바람직한 실시 예에서, 리포솜 제형은 하나의 리포솜 제형이며, 입자들의 다분산도 지수(polydispersity index)는 0.4 또는 그 이하, 바람직하게는 0.3 또는 그 이하이다.
위에서 설명된 실시 예들 중 더 바람직한 실시 예에서, 결핵균-복합체 균주는 독성 결핵균-복합체 균주이다.
또한 위에서 설명된 실시 예들 중 어떠한 실시 예에서, (a) 결핵균-복합체 균주로부터의 단편들 및 (b) 리포솜 형성 제제의 비율은 0.01:1 및 1:1 사이, 바람직하게는 0.06:1 및 0.1:1 사이이다.
위에서 설명된 실시 예들 중 더 바람직한 실시 예에서, 리포솜 제형은 부가적으로 (d) 장력활성제(tensioactive 제제)를 포함한다. 훨씬 더 바람직한 실시 예에서, (d) 장력활성제를 포함하는 리포솜 제형은 하나의 리포솜 제형이며, (a) 및(d) 사이의 비율은 0.1:1 및 10:1 (w/w) 사이, 바람직하게는 0.5:1 및 2:1 (w/w) 사이, 및 더 바람직하게는 0.6:1 및 0.8:1 (w/w) 사이이다.
위에서 설명된 실시 예들 중 특정 실시 예에서, 리포솜 제형의 리포솜 형성 제제는 인지질, 바람직하게는 레시틴(lecithin), 더 바람직하게는 달걀 레시틴 또는 콩(soy) 레시틴으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것 중의 하나, 및 가장 바람직하게는 콩 레시틴이며, 이들 각각은 수소화될(hydrogenated) 수 있거나, 부분적으로 수소화되거나 또는 비수소화될 수 있다.
계면활성제 함유 리포솜 제형의 바람직한 실시 예에서, 장력활성제는 콜레이트, 데옥시콜레이트(deoxycholate), 콜레스테롤 및 콜레스테롤 헤미숙신산염(hemisuccinate)로부터 선택된다.
더 바람직한 실시 예에서, 위에서 설명된 리포솜 제형은 하나의 리포솜 제형이며, 결핵균-복합체 세포들의 단편들은 세포 벽 단편들이거나 또는 세포 벽 단편들을 포함한다.
또 다른 더 바람직한 실시 예에서, 위에서 설명된 리포솜 제형은 2010년 런던의 NCTC(National Collection of Type Cultures)에 수탁된, 결핵균-복합체 균주 NCTC 13536의 단편들을 포함한다. 이 균주는 동의어로 511로 불리는데, 따라서 NCTC 13536 및 511은 통용될 수 있다.
훨씬 더 바람직한 실시 예에서, 위에서 설명된 리포솜 제형은 적어도 두 개, 바람직하게는 세 개, 더 바람직하게는 네 개, 가장 바람직하게는 다음의 모든 것을 포람한다:
(ⅰ) 결핵균 HSP70 단백질(Rv0360)의 질량 지문(mass fingerprint)과 유사한, 약 70 kDa의 분자량을 갖는 제 1 폴리펩티드,
(ⅱ) 결핵균 38 kDa 단백질(Rv0934)의 질량 지문과 유사한, 약 38 kDa의 분자량을 갖는 제 2 폴리펩티드,
(ⅲ) 결핵균 Ag85B 단백질(Rv 1866c)의 질량 지문과 유사한, 약 30 kDa의 분자량을 갖는 제 3 폴리펩티드,
(ⅳ) 결핵균 CFP10 단백질(Rv3874)의 질량 지문과 유사한, 약 10 kDa의 분자량을 갖는 제 4 폴리펩티드, 및
(ⅴ) 결핵균 ESAT-6 단백질(Rv3875)의 질량 지문과 유사한, 약 6 kDa의 분자량을 갖는 제 5 폴리펩티드.
또한 더 바람직한 실시 예에서, 리포솜 제형은 결핵균 19 kDa 지질단백질 항원 전구체(precursor) LpqH (Rv 3763)의 질량 지문과 유사한, 약 19 kDa의 분자량을 갖는 리포폴리펩티드를 포함한다.
더 바람직한 실시 예에서, 위에서 설명된 리포솜 제형은 일반적으로 당 복합(sugar conjugated) 지질들과 같은 복합 산물들과 같은, 결핵균 또는 그것들의 유도체에서 발견되는 지질들을 포함한다. 바람직하게는 Ⅰ, Ⅲ, 또는 Ⅳ 타입 중의 어느 하나에 속하는, 하나 또는 그 이상의 미콜산이 포함되는 것이 또한 바람직하다. 대안으로서 또는 부가적으로, 당 복합 미콜레이트, 바람직하게는 트레할로오스 디미콜레이트가 제제 내에 포함될 수 있다. 대안으로서 또는 부가적으로, 본 발명에 따른 리포솜 제형 내에 적어도 하나의 결핵균-복합체 유래 당지질이 존재하는 것이 또한 바람직하며, 바람직한 당지질은 리포아라비노만난이다.
위에서 설명된 리포솜 제형은 부가적으로, 바람직하게는 비이온 계면활성제의 그룹으로부터 존재하는 하나 또는 그 이상의 계면활성제를 포함할 수 있다.
또 다른 바람직한 실시 예에서 위의 설명들에 따른 리포솜 제형은 부가적으로 하나 또는 그 이상의 염(salt) 또는 그 용액을 포함할 수 있으며, 바람직한 염은 염화나트륨(sodium chloride)이다.
위에서 설명된 것 중 훨씬 더 바람직한 실시 예에서 본 발명의 리포솜 제형은 동결 건조된다(freeze-dried).
본 발명은 또한 현탁액을 제공하는데, 위에서 설명된 것 중 어떠한 리포솜 제형은 용제(solvent)로 재구성된다. 바람직한 실시 예에서, 이러한 현탁액의 용제는 수용성이며, 바람직하게는 생리적 혈청(serum)이거나 이를 포함한다.
본 발명은 또한 위의 실시 예들 중 하나 또는 그 이상에서 설명된 것과 같은 리포솜 제형, 또는 위에서 설명된 실시 예들 중 하나 또는 그 이상에서 설명된 것과 같은 현탁액를 포함하는 약학 조성물, 및 약학적으로 수용가능한 캐리어(carrier) 또는 희석제(diluent) 또는 첨가제를 포함하는 약학 조성물을 제공하는데, 이에 의해 캐리어, 희석제 또는 첨가제로서 적절한 어떠한 물질도 사용될 수 있다. 바람직한 실시 예에서, 약학 조성물은 부가적으로 약학적으로 수용가능한 보조제를 포함한다.
본 발명은 또한 치료에 의한 인간 또는 동물체의 치료 방법에서의 사용을 위한 산물을 제공한다. 즉, 이는 치료에 의한 인간 또는 동물체의 치료 방법에서의 사용을 위하여, 위에서 설명된 하나 또는 그 이상의 실시 예들 중 어느 하나에 따른 리포솜 제형, 위에서 설명된 하나 또는 그 이상의 실시 예들 중 어느 하나에 따른 현탁액, 또는 위에서 설명된 하나 또는 그 이상의 실시 예들 중 어느 하나에 따른 약학 조성물을 제공한다. 특정 실시 예에서, 본 발명은 주입을 위한 리포솜 제형, 현탁액 또는 약학 조성물을 제공한다. 또 다른 특정 실시 예에서, 본 발명은 결핵을 치료하거나 예방하는 방법에서의 사용을 위한 이러한 리포솜 제형, 현탁액 또는 약학 조성물을 제공한다. 이러한 특정 실시 예들은 개별적으로 또는 조합하여 충족될 수 있다.
더 특별한 실시 예에서, 본 발명은 치료에 의한 인간 또는 동물체의 치료 방법에서 그것의 사용과 관련하여 위에서 설명된 것에 따른 리포솜 제형, 현탁액 또는 약학 조성물을 제공하는데, 또한 이는 1 내지 1000, 바람직하게는 3 내지 250, 더 바람직하게는 4 내지 80, 및 가장 바람직하게는 약 5, 약 25 또는 약 50 ㎍/투여량 결핵균 세포들의 단편들을 포함하는 투여량으로 인체에 투여하기 위한 것을 특징으로 한다.
(a) 내지 (c)의 세 가지 이상의 특정 실시 예들에서, 치료에 의한 인간 또는 동물체의 치료 방법에서 그것의 사용과 관련하여 위에서 설명된 것에 따른 리포솜 제형, 현탁액, 또는 약학 조성물은 (a) 잠복기 결핵 감염을 갖는 개인들에서 활성 결핵의 예방 방법에서의 사용을 위한 것이거나, (b) 질환에 노출되었으나 아직 감염되지 않은 개인들의 감염을 예방하기 위하여 결핵이 일차 예방 방법에서의 사용을 위한 것이거나, 또는 (c) 잠복기 결핵을 치료하거나 예방하는 방법에서의 사용을 위한 것이다.
위의 바람직한 실시 예에서 치료에 의한 인간 또는 동물체의 치료 방법에서 그것의 사용을 위한 리포솜 제형, 현탁액 또는 약학 조성물은 병용 치료 또는 보조 치료에서의 사용이다. 보조 치료는 상태를 치료하는데 효율성을 증가시키는 일차 치료와 결합된 부가적 또는 이차 치료이다. 병용 치료의 특정 실시 예는 병용 치료가 항생물질, 바람직하게는 하나 또는 그 이상의 이소니아지드 및 안사마이신(ansamycine)인 것이며, 안사마이신은 가장 바람직하게는 리팜피신이다. 본 발명의 특정 실시 예에서, 보조 치료는 인간 면역결핍 바이러스 양성 인간 대상에게 투여되며, 25 ㎍ 결핵균 세포들의 단편들의 단일 투여가 바람직하다.
본 발명은 또한 리포솜 제형, 현탁액 또는 약학 조성물인, 제제들 중 어떠한 것을 제조하기 위한 과정을 제공한다.
본 발명은 2010년 런던의 NCTC에 수탁된, 결핵균-복합체 균주 NCTC 13536을 더 포함한다.
도 1은 과정 및 진행 중인 제어들과 관련된 물질들 및 시약들을 포함하는, 약물 물질 결핵균 세포들의 단편들의 업스트림 과정을 도시한 플로차트이다.
도 2는 과정 및 진행 중인 제어들과 관련된 물질들 및 시약들을 포함하는, 약물 물질 결핵균 세포들의 단편들의 다운스트림 과정을 도시한 플로차트이다.
도 3은 단백질 특성의 플로차트이다.
도 4는 SDS-PAGE(황산도데실나트륨 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 이하 SDS-PAGE로 표기) 및 쿠마시 블루(Coomassie Blue) 염색 방법에 의한 항원들의 동정을 도시한다. 참조 항원들은 ESA6 (6 kDa) (7); CFP10 (10 kDa) (6); Ag55B (30 kDa) (1); 38 kDa (2); HSP70 (70 kDa) (4)일뿐만 아니라 분자량 마커 MW (5)가 도시된다.
도 5a는 SDA-PAGE 후에 쿠마시 염색에 의한, 15.6 ㎍ 결핵균 세포들의 단편들/㎖ (1, 2), 6.25 ㎍ 결핵균 세포들의 단편들/㎖ (3, 4), 및 1.56 ㎍ 결핵균 세포들의 단편들/㎖ (5, 6)의 최종 농도에서의 참조 표준 결핵균 세포들의 단편들-52.1 (1 내지 6)의 단백질 프로파일을 도시한다(MW in kDa).
도 5b는 SDA-PAGE 후에 쿠마시 염색에 의한, 19 kDa 대역의 동정을 도시한다.
도 5c는 Lionex로부터의 ESAT-6 표준과 병행하여 수행되는 SDS-PAGE 및 은 염색 방법에 의한 표시된 결핵균 세포들의 단편들 배치들 내의 대역들(10 kDa 및 6 kDa)의 동정을 도시한다. 서로 다른 결핵균 세포들의 단편들 배치들(1, 2, 3, 9, 10, 11, (레인 9에서의 배치 결핵균 세포들의 단편들-52.1)), 서로 다른 농도에서의 Lionex로부터의 ESAT-6 표준(4 내지 8).
도 5d는 결핵균 HSP70 표준과 병행하여 특이 항체들을 사용하여 웨스턴-블롯 에 의한 결핵균 세포들의 단편들 배치들에서의 항원 결핵균 HSP70 (Rv 0350)의 웨스턴-블롯 동정을 도시한다. 서로 다른 결핵균 세포들의 단편들 배치들(1, 2, 3, 4, 7, 8, 9), HSP70 표준(5, 6).
도 5e는 특정 항체를 사용하고 Lionex로부터의 결핵균 38 kDa 표준과 병행하여 수행되는 웨스턴-블롯 방법에 의한 결핵균 세포들의 단편들 배치들에서의 항원 결핵균 38 kDa (Rv 0934)의 동정을 도시한다. 형광 검출은 Odyssey System을 사용한다. 서로 다른 결핵균 세포들의 단편들 배치들(1, 2, 3, 6, 7), 38 kDa 표준(4, 5).
도 5f는 특정 항체를 사용하고 Lionex로부터의 결핵균 Ag85B 표준과 병행하여 수행되는 웨스턴-블롯 방법에 의한 결핵균 세포들의 단편들 배치들에서의 항원 Ag85B (Rv 1886c)의 동정을 도시한다. 형광 검출은 Odyssey System을 사용한다. 결핵균 세포들의 단편들 배치들(1, 2, 3, 5, 6, 7), Ag85B 표준(4).
도 6은 웨스턴 블롯 방법을 사용하여, 본 발명의 따른 리포솜 제형 기반 약학 백신 조성물로 2회 접종된 후에 감염된 마우스들로부터 획득된 1/8000 희석된 혈청을 갖는 서로 다른 결핵균 세포들의 단편들 배치들(50 ㎍/레인(lane))의 표시된 단백질 대역들의 상호작용을 도시한다.
도 7a는 박층 크로마토그래피(TLC) 방법에 의한 참조 균주들(H37Rc (2)와 NCTC 13536 및 서로 다른 결핵균 세포들의 단편들 배치들(3-9), 그리고 트레할로오스 6,6'-디미콜레이트(TDM) 표준(10)에서의 폴리아실트레할로오스(PT), 트레할로오스 6,6'-디미콜레이트 및 디아실트레할로오스(DAT)의 동정을 도시한다.
도 7b는 박층 크로마토그래피 방법에 의한 결핵균 세포들의 단편들에서의 트레할로오스 6,6'-디미콜레이트의 동정을 도시한다. 패널들 (A) 및 (B)는 두 가지 독립적인 분석법을 나타낸다. (A) 트레할로오스 6,6'-디미콜레이트 표준 (11)과 (12), 다른 레인들은 서로 다른 결핵균 세포들의 단편들 배치들. (B) (1) 트레할로오스 6,6'-디미콜레이트 표준, 다른 레인들은 서로 다른 결핵균 세포들의 단편들 배치들.
도 7c는 박층 크로마토그래피 방법에 의한 결핵균 세포들의 단편들에서의 미콜산 Ⅰ, Ⅲ 및 Ⅳ의 패턴을 도시한다. 패널 (A), (B) 및 (C)는 세 가지 독립적인 분석법을 나타낸다. (A) 결핵균 세포들의 단편들 배치들(1-6 (결핵균 세포들의 단편들-51.2 표준 6)), (B) 설명/참조를 위한, (C) 미콜산 표준(2)과 비교되는 배치 결핵균 세포들의 단편들(1).
도 7d는 당지질 리포아라비노만난(LAM)의 동정을 도시한다(왼쪽 레인은 표준, 나머지 레인들은 본 발명에 따른 리포솜들로부터 유래된 샘플들).
도 8은 동일한 투여량(50 ㎍/투여량)에서, 주입을 위한 물로 재현탁된 결핵균 세포들의 단편들 대 리포솜들로 제제화된 결핵균 세포들의 단편들(RUTI 백신으로 라벨링, 배치 10a)의 세포 면역성의 비교를 도시한다.
도 9는 리포솜 농축액 벌크의 동결 할단 제조를 도시한다(전자 현미경).
도 10은 a: 능력 테스트에서 백신의 두 가지 제제로 검사된 배치 당 세포 면역 반응(1회 백신), b: a에서와 같으나, 두 가지 백신, 테이블 1에 따른 5% (w/w) 수크로오스를 포함하는 "제제 Ⅱ", 수크로오스가 존재하지 않는 것을 제외하고 제제 Ⅱ와 같은 "제제 Ⅰ"를 도시한다. ㎍은 ㎍ 결핵균 세포들의 단편들/투여량을 언급한다.
도 11은 본 발명을 수행하는 바람직한 방식에 따른 과정의 플로차트이다.
도 12는 1 실시 예 12에 설명된 것과 같은 RUT1 25 ㎍의 접종의 면역 프로파일을 도시한다.
도 13은 실시 예 12에 설명된 것과 같은 면역성(인간 면역결핍 바이러스 음성 및 인간 면역결핍 바이러스 양성)을 도시한다.
본 발명은 결핵균-복합체 균주로부터의 단편들 및 리포솜 형성 제제를 포함하는 리포솜 제형들을 제공한다.
구체적으로 달리 명시되지 않은 한, 용어 "포함하는(comprising)"은 본 출원서의 맥락에서는 "포함하는"에 의해 소개된 목록의 구성원들에 더하여 다른 구성원들이 부가적으로 존재할 수 있는 것으로 나타내는 것으로 사용된다. 그러나, 본 발명의 특정 실시 예로서 용어 "포함하는"은 존재하는 이외의 다른 어떤 구성원의 가능성도 포함하지 않는 것으로 고려되는데, 즉, 이러한 실시 예의 목적을 위하여 "포함하는"은 "구성하는(consting of)"의 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다.
상세한 설명은 본 발명의 개별 특징들의 특정 변형 및/또는 바람직한 변형들을 개시한다. 본 발명은 또한 특히 바람직한 실시 예들로서 본 발명의 두 가지 또는 그 이상의 특징들을 위하여 설명되는 두 가지 또는 그 이상의 특정 변형 및/또는 바람직한 변형들을 조합하여 발생되는, 그러한 실시 예들을 고려한다.
일반적으로 리포솜화 과정은 지질 환경을 발생시키고, 용해성을 용이하게 하며 결핵균 세포들의 단편들과 같은, 물질들의 현탁에 이르게 하는 것으로 받아들여진다. 본 발명의 의미 내의 리포솜들은 단일라멜라(unilamellar), 다중라멜라 또는 그것들의 조합들이다.
결핵균 세포들의 단편들은 결핵균-복합체 균주로부터 유래하는 물질의 어떠한 형태일 수 있는데, 단백질 및/또는 지질로부터 유래하는 단편들이 바람직하다. 본 발명의 의미 내의 결핵균 세포들의 단편들은 일반적으로 서로 다른 단백질 항원들 및 결핵균-복합체 세포들로부터의 지질들의 혼합물이다.
세포 단편들은 특히 결핵균-복합체 세포들과 같은, 미생물 또는 박테리아 세포를 부수기에 적절한 통상의 지식을 가진 자들에게 알려진 어떠한 방법, 예를 들면 균질화에 의해 획득될 수 있다. 균질화는 초음파 분해(ultrasound sonication), 또는 기계적 균질기(homogenizer)와 함께 약 0.1 ㎜ 지름의 작은 비드(bead)들, 예를 들면, 실리카 또는 지르코니아(zircornia)/실리카 비드들의 사용에 의해 수행될 수 있다. 사용될 수 있는 기계적 균질기는 예를 들면, BioSpec BeadBeater
Figure 112013069688263-pct00001
모델이다. 결핵균-복합체 세포들은 이러한 균질 과정에 의해 깨지며, 따라서 일반적으로 작은 세포 벽 단편들을 포함하는, 작은 세포 단편들이 획득된다. 일반적으로 세포 단편들의 제조와 관련된 특징은 통상의 지식을 가진 자들에 잘 알려진, 탈지(delipidation), 내독소 유사 분자들을 제거하도록 허용하는 과정에 의한 세포 벽 단편들의 "해독화(detoxification)"이다. 결핵균 세포들의 단편들은 따라서 바람직하게 해독화되고 살균되며, 획득된 리포솜 제형은 그리고 나서 멸균되고 내독소들이 없어진다. 버퍼(buffer) 내의 세포 단편들의 분산은 그것들의 저장을 용이하도록 하기 위하여 선택적으로 친액성화될(lyophilised) 수 있다. 이를 위하여, 분산이 바이알(vial)들 내로 분포될 수 있고 예를 들면 -45℃와 같은 -15℃와 -120℃ 사이의 온도, 및 0.1과 0.5 밀리바(mbar) 사이와 같은 진공에서 친액성화될 수 있다.
본 발명에 따른 리포솜들은 일반적으로 적어도 99.9%(수에 의해)가 1 ㎛보다 적은 크기 분포를 갖는다. 특정 실시 예에서, 동역학 광 산란에 의해 결정될 수 있는 것과 같은, 입자들의 z-평균 크기는 120 ㎚ 또는 그 이하, 바람직하게는 110 ㎚ 또는 그 이하, 더 바람직하게는 95 ㎚ 또는 그 이하, 및 가장 바람직하게는 80 ㎚ 또는 그 이하이다. 동역학 광 산란에서 z-평균 파라미터는 기술에 의해 획득할 수 있는 안정적이고 중요한 수, 및 품질 제어 목적을 위하여 바람직하게 사용되는 크기 수로 고려된다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 제제의 리포솜들은 단정(monomodal)인데, 즉, 그것들은 동역학 광 산란 측정들에서 단지 하나의 피크만을 나타낸다. 더 바람직하게는, 본 발명에 따른 제제의 리포솜들은 실시 예 9에 도시된 것과 같이, 리포솜 제형의 동결 할단(freeze-fracturing) 제조의 전자 현미경에 의해 검사될 수 있는 것과 같이, 구형(spherical)이다. 구형은 리포솜 입자들이 적어도 90%(수에 의해)를 위하여, 개별 입자의 모든 표면 지점이 리포솜의 중심에 대하여 유사하거나 동일한 거리를 갖는데, 즉 그러한 입자의 최소 반경은 0.6 또는 그 이상, 0.7 또는 그 이상, 0.8 또는 그 이상 혹은 0.9 또는 그 이상의 비율로 동일한 입자의 최대 반경과 관련된다. 본 발명에 따른 리포솜 제형은 다중라멜라성 또는 단일라멜라성 리포솜, 또는 그것들의 조합을 포함할 수 있다. 통상의 지식을 가진 자들에 자명한 것과 같이, 적절한 버퍼, 즉, 자체로 리포솜의 붕괴, 분열 또는 융합을 야기하지 않거나 혹은 그것들을 물리적으로 다른 방법으로 상당히 불안정화하는 버퍼 내에서 동역학 광 산란 측정이 실행되어야 한다. 경험상으로, 이온 강도 및 pH 값이 리포솜이 형성된 버퍼와 비슷한 한 어떠한 버퍼도 적합할 수 있다. 바람직하게는 리포솜이 형성된 버퍼와 유사하거나 동일한 조성물의 버퍼가 사용된다.
대안의 실시 예에서, 리포솜 제형은 부가적으로 1 내지 20% (w/w) 수크로오스, 바람직하게는 2 내지 12% (w/w) 수크로오스, 더 바람직하게는 3 내지 8% (w/w) 수크로오스, 및 가장 바람직하게는 4 내지 6% (w/w) 수크로오스를 포함한다. 약 5% 수크로오스가 특히 바람직하다.
특정 입자 크기와 관련된 하나의 실시 예 및 수크로오스의 존재와 관련된 다른 실시 예와 관련된 이러한 실시 예들 각각은 개별적으로 충족될 수 있으나, 이러한 실시 예들이 상호 배타적인 것으로 여겨져서는 안 되며 결합하여 잘 발생할 수 있는 것으로 이해하는 것이 중요하다.
특정 실시 예에서, 위에서 설명된 리포솜 제형은 40 내지 120 ㎚ 범위, 바람직하게는 50 내지 100 ㎚ 범위, 더 바람직하게는 55 내지 95 ㎚ 범위, 및 더 바람직하게는 55 내지 80 ㎚ 범위의 z-평균 입자 크기를 갖는다. z-평균 입자 크기는 바람직하게는 일반적으로 위에서 그리고 "재료 및 방법" 섹션에서 상세히 설명되는 것과 같은, 동역학 광 산란에 의해 측정된다.
대안의 특정 실시 예에서, 위에서 설명된 리포솜 제형의 z-평균 입자 크기는 더 작을 수 있는데, 따라서 리포솜 제형은 에멀전인데, 즉, 본 실시 예에서 입자들의 z-평균 크기는 바람직하게는 40 ㎚ 이하이다.
위에서 설명된 하나 또는 그 이상의 실시 예들 중 어느 바람직한 실시 예에서, 본 발명에 따른 제제의 리포솜들은 게다가 단분산(monodisperse)인데, 이는 크기 분포의 어떠한 상당한 폭도 관찰되지 않는다는 것을 의미한다. 이는 0.4 또는 그 이하, 바람직하게는 0.3 또는 그 이하와 같은, 동역학 광 산란에 의해 결정될 수 있는 것과 같이 낮은 다분산도 지수(PDI)에 의해 기술적으로 검사된다. 따라서, 리포솜 제형은 하나의 리포솜 제형인데, 동역학 광 산란에 의해 결정될 수 있는 것과 같은 입자들의 다분산도 지수는 0.4 또는 그 이하, 바람직하게는 0.3 또는 그 이하, 및 가장 바람직하게는 0.25 또는 그 이하이다.
결핵균-복합체 균주로부터의 단편들은 업스트림(upstream) 과정 및 다운스트림 과정을 포함하는 과정에 의해 획득될 수 있다. 설명의 목적을 위하여, 여기서 5가지 주요 단계가 간단히 설명되고 과정을 수행하는 특정 방식들이 아래의 실시 예 2 및 3에 주어진다.
업스트림 과정 (실시 예 2):
단계 1: 결핵균의 배양
단계 2: 결핵균의 수확 및 조추출물의 동결
다운스트림 과정 (실시 예 3):
단계 3: 세포 파쇄 및 탈지
단계 4: 살균
단계 5: 동결 건조(선택적)
위에서 설명된 어떠한 실시 예들 중 더 바람직한 실시 예에서, 결핵균-복합체 균주는 독성 결핵균-복합체 균주이다. 독성은 사례에 의한 병원성(pathogecity) 및/또는 숙주의 조직들에 침입하기 위한 세균들의 능력을 언급한다. 독성 균주는 결핵균-복합체에 속하는 어떠한 종들의 어떠한 독성 균주일 수 있으나, 결핵균에 속하는 균주가 바람직하다. 본 발명에 따른 결핵균-복합체 균주는 예를 들면 Middlebrock 7H10 또는 7H11 한천배지(agar), Sauton 배지 또는 Proskauer-Beck 배지와 같은, 통상의 지식을 가진 자들에게 잘 알려진 배지에서의 접종에 의해 배양될 수 있다. 독성 균주의 배양은 바람직하게는 예를 들면, 3주와 동일하거나 그 이상의 기간, 바람직하게는 3주와 4주 사이에 포함되는 기간과 같은, 장기간에 걸쳐 실행된다. 배양 온도는 바람직하게는 34℃ 및 38℃ 사이에서 유지된다. 일단 배양이 끝나면, 세포들이 수확되고 특허출원 ES2231037-A1에 설명된 것과 같이, 종래에 잘 알려진 기법을 사용하여 분리된다.
리포솜 제형의 리포솜 제제는 바람직하게는 수소화되거나, 부분적으로 수소화되거나 또는 수소화되지 않은 인지질이다. 사용되는 인지질은 예를 들면 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), 포스파티딜세린(phosphatidylserine) 및 포스파티딜-이노시톨(phosphatidyl-inositol)일 수 있거나 또는 이를 포함할 수 있다. 가장 일반적인 것이 포스파티딜콜린인데, 이는 다양한 천연 자원으로부터 합성되거나 분리될 수 있다. 바람직하게는 리포솜 형성 제제는 달걀 레시틴 및 콩 레시틴으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는, 레시틴이거나 또는 이를 포함한다. 콩 레시틴은 그 중에서도 포스파티딜콜린을 포함하는 인지질들의 복합 혼합물이며, 이것이 특히 바람직하다. 또한 리포솜 형성 제제 자체로서, 또는 다른 성분으로서 제제 내에 포함될 수 있는 일반적인 지질들은 디세틸 포스페이트(dicetyl phosphate, DSP), 디미리스토일 포스파티딜콜린(dimyristoyl phosphatidylcholine, DMPC), 디미리스토일 포스파티딜글리세롤(dimyristoyl phosphatidylglycerol, DMPG), 디올레오일 포스파티딜콜린(dioleoyl phosphatidylcholine, DOPC), 디올레오일 포스파티딜에타놀아민(dioleoyl phosphatidylethanolamine, DOPE), 디올레오일 포스파티딜세린(dioleoyl phosphatidylserine, DOPS), 디팔미토일 포스파티딜콜린(dipalmitoyl phosphatidylcholine, DPPC), 디팔미토일 포스파티딜글리세롤(dipalmitoyl phosphatidylglycerol, DPPG), 포스파티딜콜린(PC) 및/또는 포스파티딜세린(PS)인데, 각각의 지질은 수소화되거나, 부분적으로 수소화되거나 또는 비수소화된다. 리포솜들은 특허출원 ES2231037-A1에 설명된 것과 같이, 종래의 보조 지질들, 및 통상의 지식을 가진 자들에 잘 알려진 기술들을 사용하여 형성될 수 있다.
또한 위에서 설명된 실시 예들 중 어떠한 실시 예에서, (a) 결핵균-복합체로부터의 단편들 및 (b) 리포솜 형성 제제의 비율은 0.01:1과 1:1 사이, 바람직하게는 0.06:1과 0.1:1 사이인 것이 바람직하다. 위에서 설명된 실시 예들 중 더 바람직한 어떠한 실시 예에서, 리포솜 제형은 부가적으로 (d) 장력활성제를 포함한다. 일반적으로, 표면 장력 값을 변경할 수 있는 모든 형태의 제제가 본 발명의 의미에서 장력활성제로서 사용될 수 있으나, 위에 주어진 리포솜 형성 제제의 정의에 벗어나지 않는 합성물이 포함될 수 있다. 다양한 종류의 장력활성제들이 통상의 지식을 가진 자들에 알려져 있으며 본 발명에 따른 리포솜 제형에 사용될 수 있다. 통상의 지식을 가진 자들에 알려진 것과 같이, 장력활성제들은 일반적으로 극성-비극성 구조를 갖는 화합물들이다. 어떠한 특정 이론에 한정되지 않고, 장력활성제는 일반적으로 입자들의 표면에 위치하는 성향을 갖는데, 그렇게 함으로써 표면 장력 값을 감소시키는 인터페이스상에 단분자 층을 생성한다. 장력활성제들은 또한 계면활성제 또는 활성 표면 제제들로서 언급된다. 계면활성제 함유 리포솜 제형의 바람직한 실시 예에서, 장력활성제는 스테롤(sterol)들 및 콜레스테롤과 같은, 그 유도체 및/또는 담즙산염(bile salt)들 또는 콜레이트와 같은, 그 유도체들로부터 선택된다. 특히 바람직한 실시 예들은 장력활성제가 콜레이트, 데옥시콜레이트(deoxycholate), 콜레스테롤 및 콜레스테롤 헤미숙신산염(hemisuccinate)으로부터 선택되는 그러한 실시 예이다. 본 발명을 수행하는 뛰어난, 그러나 이에 한정하지 않는 방식은 제제의 리포솜들이 콩 유래 레티신 및 나트륨 콜레이트 모두를 포함하는 방식이다.
훨씬 더 바람직한 실시 예에서, (d) 장력활성제를 포함하는 리포솜 제형은 하나의 리포솜 제형인데, 상기 (a) 및 (d) 사이의 비율은 0.05:1과 3:5(w/w) 사이이다. 통상의 지식을 가진 자들에 잘 알려진, 다양한 종류의 리포솜 형성 제제가 사용될 수 있다.
리포솜들은 선택적으로 그것들의 안정성을 향상시키는 첨가제, 예를 들면, 지질 항산화제로서 작용하는 것으로 알려진, 비타민 E를 포함할 수 있다.
더 바람직한 실시 예에서, 위에서 설명된 리포솜 제형은 하나의 리포솜 제형이며, 결핵균-복합체의 단편들은 세포 벽 단편들이거나 또는 이를 포함한다.
결핵균-복합체 균주에 속하는 어떠한 균주, 및 바람직하게는 결핵균에 속하는 어떠한 균주도 사용될 수 있다. 또 다른 더 바람직한 실시 예에서, 위에서 설명된 리포솜 제형은 런던의 NCTC에서 2010년에 수탁된, 결합균-복합체 균주 NCTC 13536의 단편들을 포함한다(실시 예 1). 따라서 단편들이 리포솜 제형에 포함될 수 있는 또 다른 균주는 예를 들면, 영국 런던의 NCTC로부터 획득될 수 있는(수탁 번호 NC007416), H37Rv로 불린다. 하나 이상의 균주가 사용되는 것이 가능한데, 즉, 리포솜 제형은 두 가지 세 가지, 또는 세 가지 이상의 다양한 균주의 단편들을 포함한다.
대략 4000으로 추정되는 결핵균의 항원을 고려하면, 이러한 모든 단백질을 위한 약물 물질을 분석하는 것은 불가능하다. 그럼에도 불구하고 특정 결핵균-복합체 단백질들은 원하는 면역 반응과 관련이 있는 것으로 나타났다. 이것들은 6, 10, 30, 38, 및 70 kDa의 대략적인 크기를 갖는 5가지 단백질 대역(protein band)이다(Renshow 등, 2005, EMBO Journal 24, 2491-2498; Singh 등, 2005, Clin . Diagn, Lab . Immunol. 12(2), 354-358). 따라서, 훨씬 더 바람직한 실시 예에서, 위에서 설명된 리포솜 제형은 다음 중에서 적어도 두 가지, 바람직하게는 세 가지, 더 바람직하게는 네 가지, 및 가장 바람직하게는 모두를 포함한다:
(ⅰ) 황산도데실나트륨(sodium dodecylsulfate, SDS) 폴리아크릴아미드(polyacrylamide) 겔 상의 전기영동 후에 측정된 것과 같이 약 70 kDa의 분자량을 갖는 제 1 폴리펩티드, 제 1 폴리펩티드는 결핵균 HSP70 단백질(Rv0350)의 질량 지문과 유사한 질량 지문을 가지며,
(ⅱ) 황산도데실나트륨 폴리아크릴아미드 겔 상의 전기영동 후에 측정된 것과 같이 약 38 kDa의 분자량을 갖는 제 2 폴리펩티드, 제 2 폴리펩티드는 결핵균 38 kDa 단백질(Rv0934)의 질량 지문과 유사한 질량 지문을 가지며,
(ⅲ) 황산도데실나트륨 폴리아크릴아미드 겔 상의 전기영동 후에 측정된 것과 같이 약 30 kDa의 분자량을 갖는 제 3 폴리펩티드, 제 3 폴리펩티드는 결핵균 Ag85B 단백질(Rv1866c)의 질량 지문과 유사한 질량 지문을 가지며,
(ⅳ) 황산도데실나트륨 폴리아크릴아미드 겔 상의 전기영동 후에 측정된 것과 같이 약 10 kDa의 분자량을 갖는 제 4 폴리펩티드, 제 4 폴리펩티드는 결핵균 CFP10 단백질(Rv3874)의 질량 지문과 유사한 질량 지문을 가지며, 및
(ⅴ) 황산도데실나트륨 폴리아크릴아미드 겔 상의 전기영동 후에 측정된 것과 같이 약 6 kDa의 분자량을 갖는 제 5 폴리펩티드, 제 5 폴리펩티드는 결핵균 ESAT-6 단백질(Rv3875)의 질량 지문과 유사한 질량 지문을 갖는다.
또한 더 바람직한 실시 예에서, 리포솜 제형은 황산도데실나트륨 폴리아크릴아미드 겔 상의 전기영동 후에 측정된 것과 같이 약 19 kDa의 분자량을 갖는 리포폴리펩티드를 더 포함하는데, 리포폴리펩티드는 결핵균 19 kDa 지질단백질 항원 전구체 LpqH (Rv3763)의 질량 지문과 유사한 질량 지문을 갖는다. 각각의 대역은 은 염색법과 같은, 종래에 알려진 방법들에 의해 시각화될 수 있다. 본 발명의 연구자들은 놀랍게도 이러한 폴리펩티드가 높은 전체 면역글로불린 G(IgG, 이하 IgG로 표기) 체액 반응(humoral response)을 유도한다는 것을 밝혔는데, 이는 제제 내의 모든 항원들 중에서 가장 높은 체액 반응일 수 있다.
폴리펩티드들 및 리포폴리펩티드들이 어떻게 확인될 수 있는가가 실시 예 4에 주어진다.
훨씬 더 바람직하게, 위에서 설명된 리포솜 제형은 또한 결핵균의 다음의 항원들, 또는 그것들의 단편 중 적어도 하나가 존재하는 것을 특징으로 한다: HSP70, 38 kDa 단백질, Ag85B, 및 가장 바람직하게는 HSP70, 38 kDa 단백질, Ag85B 중의 적어도 하나. 이러한 의미에서의 단편은 예를 들면 분해 산물과 같은, 이러한 폴리펩티드들 중의 어떠한 부분이다. 그러한 단편들을 획득하는 다양한 방법들, 예를 들면 화학적 또는 효소적 가수분해가 가능한데, 이는 단편들이 의도적으로 또는 그렇지 않게, 혹은 리포솜 제형 이전에 또는 그 후에 발생된 것과 관련이 없다. 각각의 단편은 예를 들면, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 20 연속 아미노산들과 같은, 아미노산 서열에서의 상당한 오버랩에 의한 것과 같은, 그것의 각각의 기원에 할당될 수 있는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 단편은 바람직하게는 기아(starvation), 낮은 산소 및 낮은 pH에 의한 스트레스 조건들 하에서 성장한 세균으로부터 획득된다. 낮은 산소는 예를 들면 미호기성 환경에 이르게 하는, 21일의 성장 기간 동안에 밀봉 백(hermetic bag)에 닫힌 플레이트들 상에서의 박테리아의 성장 때문이다. 낮은 pH는 다음과 같이 설명된다: 배양의 시작에서 pH 값은 7.0∼6.8이고, 일반적으로 21일 배양 후에, pH 값은 6.4∼6.5이다. 이러한 조건들 하에서, 박테리아의 신진대사는 느린데, 이는 고정상 성장(stationary growth)에 이르게 한다. 이는 세균들이 스트레스에 더 저항성이 되도록 한다. 그러한 조건들 하에서 배양된 세균들은 잠복기 결핵 감염에서의 체내 잠복기 세균들과 유사한 특성들을 발생시킨다. 잠복기 세균의 항원들, 즉, 이른바 "구조적" 항원들뿐만 아니라 스트레스 반응과 관련된 항원들에 대한 결핵균 세포들의 단편들 내에 존재하는 항원들은 따라서 새로운 면역학적 반응을 트리거링하는 것으로 기대된다.
마이코박테리아 당지질들은 오랜 기간 면역조절 활성, 특히 육아종성(granulomatous) 반응들의 유도를 가지며 잠재적인 보조제 유사 효과를 행하는 것으로 인식되어 왔다. 따라서, 더 바람직한 실시 예에서, 위에서 설명된 리포솜 제형은 일반적으로 당 복합 지질들 같은 결합 산물들과 같은, 결핵균, 또는 그것들의 유도체에서 발견되는 지질들을 포함한다. 일부 면역성 지질 성분은 결핵균 샘플들(Brennan, Tuberculosis (Edinburgh), 2003, 83(1-3), 91-97)에서 확인되었으며 그것들의 결정을 위한 분석 방법들이 개발되어 왔다(전기영동, SDS-PAGE, 박층 크로마토그래피). 비록 각각의 지질 성분의 분리가 결핵균-복합체 추출물 또는 리포솜 제형 내에서 검출될 수 있는 각각의 성분의 정량 데이터 또는 비율이 획득하는데 어려운 그러한 능동적인 처리를 필요로 할 수 있으나, 정성 특성은 본 발명의 또 다른 바람직한 실시 예를 특징화하는데 도움을 주어야 한다. 또 다른 바람직한 실시 예에 따라, 바람직하게는 타입 Ⅰ, Ⅲ 또는 Ⅳ 중 하나 또는 그 이상에 속하는, 하나 또는 그 이상의 미콜산이 포함된다. 대안으로서 또는 부가적으로, 당 복합 미콜레이트, 바람직하게는 트레할로오스 디미콜레이트가 제제 내에 포함될 수 있다. 대안으로서 또는 부가적으로, 당지질 리포아라비노만난이 제제 내에 포함될 수 있다. 게다가 단편들의 다가항원의(multiangenic) 본질(단독의 정제된 항원 대신에, 다가항원 단백질 혼합물과 지질들)이 하나의 장점으로 생각되며 따라서 최적 세포 항원 혼합물을 획득하기 위하여 통상의 지식을 가진 자들에 의해 세포 단편화 과정이 적용될 수 있다.
결핵균-복합체 세포들의 균질화는 하나 또는 그 이상의 계면활성제, 바람직하게는 비이온 계면활성제의 존재 하에서 수행된다. 따라서, 위에서 설명된 리포솜 제형은 부가적으로 하나 또는 그 이상의 그러한 계면활성제를 포함할 수 있다. 많은 수의 그러한 계면활성제가 통상의 지식을 가진 자들의 범위 내에 존재한다. 바람직하게는 사용되는 비이온 계면활성제는 알킬페놀 에톡실레이트(alkylphnol ethoxylate)들, 및 소르비탄 에스테르 에톡실레이트들(sorbital ester ethoxylate)로 구성되는 그룹으로부터 선택된다. 더 바람직하게는 비이온 계면활성제는 옥틸페놀 에톡실레이트(octylphenol ethoxylate)들의 그룹으로부터 선택된다. 훨씬 더 바람직하게는, Triton X-11
Figure 112013069688263-pct00002
라는 명칭으로 판매되는. 7과 8 몰(mole) 사이에 포함되는 산화에틸렌(ethylene oxide)을 갖는 옥틸페닐 에톡실레이트들이 사용된다. 세포 벽 단편들을 포함하는 균질화된 덩어리는 비단편화 세포들 및 용해된 성분들을 분리하고 제거하기 위하여 종래의 처리에 의해 처리된다. 특허출원 ES2231037-A1에서 설명된 것과 같이 서로 다른 속도에서의 원심분리 및 버퍼 용액으로의 세척이 사용될 수 있다. 언급된 정제 과정을 실행한 후에 세포 벽 단편들을 포함하는 침전물이 획득된다. 상기 침전물은 인산완충식염수(posphate buffered saline, PBS) 내에서 분산되고 분쇄 및 정제 과정 후에 독성으로 남을 수 있는 결핵균-복합체 세포들의 완전한 불활성을 보장하기 위하여 종래의 처리에 의해 처리된다. 언급된 처리는 예를 들면 포름알데히드가 없는 처리에 의한 화학 과정, 또는 예를 들면 멸균 또는 살균 처리에 의한 물리적 과정일 수 있다. 지질 특성의 예들이 아래의 실시 예 5에 주어진다.
또 다른 바람직한 실시 예에서, 위에서 설명된 리포솜 제형은 부가적으로 하나 또는 그 이상의 염 또는 그것들의 용액(들)을 포함하는데, 바람직한 염은 염화나트륨이다.
위에서 설명된 것 중의 훨씬 더 바람직한 실시 예에서, 리포솜 제형은 동결 건조된다. 리포솜들은 따라서 친액성화된 리포솜 형태의 면역치료 제제를 획득하기 위하여 친액성화의 대상이 될 수 있다. 이를 위하여, 분산이 바이알들 내로 분포될 수 있고 예를 들면 -45℃와 같은 -15℃와 -120℃ 사이의 온도와 같은 낮은 온도, 및 0.1과 0.5 밀리바 사이와 같은 진공에서 친액성화될 수 있다. 친액성화 후에 획득된 바이알들은 면역치료 제제로서 적합한 리포솜 제형를 포함하며 그것들은 바람직하게는 예를 들면 -70℃에서와 같은, 매우 낮은 온도에서 저장된다.
본 발명은 또한 현탁액을 제공하는데, 이전 실시 예들 중의 어떠한 실시 예의 리포솜 제형은 용제로 재구성된다. 바람직한 실시 예에서, 이러한 현탁액의 용제는 수용성이며, 더 바람직하게는 그리고 가장 바람직하게는 생리적 혈청이거나 이를 포함한다. 용제 내에서 리포솜 제형를 현탁하는 방법들은 종래에 통상의 지식을 가진 자들에 잘 알려져 있다. 결핵균-복합체 단편들을 포함하는 종래의 리포솜 제형들보다 더 빠르게 현탁될 수 있는 것이 본 발명에 따른 제제의 특히 바람직한 특성이다(실시 예 9 참조).
본 발명의 한 가지 목적은 약학 조성물의 제조를 위한 결핵균-복합체의 균주의 세포 벽 단편들을 포함하는 제제의 제공이며, 제제는 설명된 실시 예들 중 어느 하나에 대하여 설명된 리포솜 제형 또는 그것들의 조합이거나 이를 포함한다. 약물 물질의 약학 제제/갈레노스의(galemic) 제제의 주 범위는 세포들에 의해 잘 인식될 수 있도록 충분히 효율적이고 안정적이며 인간 또는 동물체에서 관련 세포 면역 반응을 트리거링하는 잠재력을 갖는 현탁액을 획득하는 것이다. 이를 위하여, 본 발명은 또한 위에서 설명된 하나 또는 그 이상의 실시 예에서 설명된 것과 같은 리포솜 제형, 또는 현탁액, 및 약학적으로 수용가능한 캐리어, 첨가제 또는 희석제를 제공한다. 그러한 다양한 캐리어, 첨가제와 희석제들은 통상의 지식을 가진 자들에 알려져 있으며, 본 발명에 의해 한정되지 않는다. 오히려, 캐리어, 첨가제 또는 희석제로 적합한 모든 물질이 사용될 수 있다. 바람직한 실시 예에서, 이러한 약학 조성물은 부가적으로 약학적으로 수용가능한 보조제를 포함한다. 보조제는 본 발명의 범위 내에 포함되는 물질로서 이해되어야 하며, 보조제는 표적 항원에 대한 반응으로 인간 또는 동물체에 적용될 때 면역 시스템을 자극할 수 있는 물질이며, 보조제는 자체로 면역성을 부여하지 않는다. 어떠한 특정 보조제 물질에 제한을 두지 않고, 바람직한 실시 예들은 보조제가 염화알루미늄과 같은 알루미늄 염, 혹은 불완전 프로인트 보조제(IFA) 또는 완전 프로인트 보조제(CFA)와 같은 미네랄 오일 또는 미네랄 오일을 포함하는 조성물, 혹은 디메틸디옥타데실-암모늄 브로마이드와 같은 알킬화 암모늄 브로마이드와 같은 암모늄 할로겐화물인 실시 예들이다.
본 발명은 또한 치료에 의한 인간 또는 동물체의 치료 방법에서의 사용을 위한 산물을 제공한다. 즉, 이는 위에서 설명된 하나 또는 그 이상의 실시 예에 따른 리포솜 제형, 위에서 설명된 하나 또는 그 이상의 실시 예에 따른 현탁액, 또는 치료에 의한 인간 또는 동물체의 치료 방법에서의 사용을 위하여 위에서 설명된 하나 또는 그 이상의 실시 예에 따른 약학 조성물을 제공한다.
약물은 점막, 예를 들면, 안구의(ocular), 비강내의, 구강의, 위장의, 질의(vaginal), 요로 점막 내로, 혹은, 비경구적으로, 예를 들면, 피하로, 피내로, 근욱내로, 혈관내로, 또는 복강내로 투여될 수 있다. 특정 실시 예에서, 본 발명은 주입을 위한 이러한 리포솜 제형, 현탁액 또는 약학 조성물을 제공한다.
또 다른 특정 실시 예에서, 본 발명은 결핵을 치료하거나 예방하는 방법으로의 사용을 위하여 이러한 리포솜 제형, 현탁액 또는 약학 조성물을 제공한다. 이러한 특정 실시 예들은 개별적으로 또는 결합하여 충족될 수 있다. 본 발명의 발명자들은 본 발명에 따른 제제가 세균 성장에 대한 면역성을 신장시키고 비복제 세균에 대한 면역성을 유도함으로써, 증가된 세포 면역 반응에 이르게 하고 또한 그렇지 않으면 잠복기 결핵 감염에서 발생할 수 있는 거듭되는 재감염 과정을 제어한다는 사실을 발견하였다.
치료에 의한 인체의 치료 방법과 관련하여 위에서 설명된 것에 따른 리포솜 제형, 현탁액 또는 약학 조성물의 적절한 투여량은 투여 방법 및 치료 대상을 포함하는, 일부 파라미터들에 의존한다. 바람직한 실시 예에서, 이는 인체에 투여하기 위한 것이다. 그것들의 바람직한 실시 예에서, 이는 1 내지 1000, 바람직하게는 3 내지 250, 더 바람직하게는 4 내지 80, 및 가장 바람직하게는 약, 5, 약, 25 또는 약 50 ㎍/투여량 결핵균 세포들의 단편들을 포함하는 투여량에서 발생한다. 25 ㎍의 투여량이 특히 바람직하다.
(a) 내지 (c)의 세 가지 이상의 더 특별한 실시 예에서, 치료에 의한 인간 또는 동물체의 치료 방법으로의 그것들의 사용과 관련하여 위에서 설명된 것에 따른 리포솜 제형, 현탁액 또는 약학 조성물은 (a) 잠복기 결핵 감염을 갖는 개인들에서 활성 결핵의 예방 방법으로의 사용을 위한 것이다. 대안의 더 특별한 실시 예에서, 이는 (b)질환에 노출되었으나 아직 감염되지 않은 개인들의 감염을 방지하기 위하여 결핵의 일차 예방의 방법으로의 사용을 위하거나 또는 (c) 잠복기 결핵을 치료하거나 예방하는 방법으로의 사용을 위한 것이다.
치료에 의한 인체 동물체의 치료 방법에서 그것들의 사용을 위한 리포솜 제형, 현탁액 또는 약학 조성물은 단일 투여 혹은 특정 시간 간격에서의 반복에 의한 2회, 3회, 4회, 5회 또는 5회 이상과 같은, 수회 투여 형태로 투여될 수 있다. 바람직하게는 2회 투여가 2주와 5주 사이, 바람직하게는 3주와 4주 사이에 포함되는 기간으로 사이를 두고 투여된다.
실시 예들 8, 10 및 12가 본 발명에 따른 리포솜 제형이 인간 또는 동물 대상에 어떻게 적용될 수 있는가를 나타내는 실시 예들이다.
위의 물질의 바람직한 실시 예는 범용 또는 보조 치료를 위한 리포솜 제형, 현탁액 또는 약학 조성물이다. 의사들은 더 나은 치료율 또는 일차 치료에 더 빠른 반응을 얻기 위하여 보조 치료를 자주 사용한다. 범용 치료 또는 보조 치료는 치료에 의한 인간 또는 동물체를 치료하기 위하여 하나 이상의 약물을 사용하는 것을 포함한다. 병용 치료의 첫 번째 특정 실시 예는 병용 치료가 항생제, 바람직하게는 하나 또는 그 이상의 이소니아지드 및 안사마이신을 포함하는 것이며, 안사마이신이 가장 바람직한 리팜피신이다. 병용 치료의 두 번째 특정 실시 예는 병용 치료가 S.H.E. Kaufmann의 "Nature Rev. Immunol., 2006, 6, 699-704 페이지"에서 언급된 것과 같은, 예를 들면, 칼메트-게랭 균 백신, 서브유닛 백신들 또는 재조합 칼메트-게랭 균 백신들과 같은, 결핵에 대한 다른 예방 백신들을 포함한다. 첫 번째 및 두 번째 특정 실시 예는 결합될 수 있다.
병용 치료 또는 보조 치료에 있어서, 이러한 두 가지(또는 그 이상) 물질의 투여는 동시일 수 있거나, 또는 시간 간격을 두는 2회(또는 그 이상의) 접종으로 행해질 수 있다. 병용 치료의 경우에 있어서, 시간 간격을 두는 접종, 우선 결핵에 대한 예방 백신이 바람직하게 투여되고, 초기에 접종된 백신의 재자극 제제로서 작용하는, 결핵균-복합체의 독성 균주의 세포 벽 단편들을 포함하는 약물이 그 뒤에 투여된다. 일 실시 예에서, 단일 투여량만이 투여되며, 이러한 투여량은 바람직하게는 25 ㎍ 결핵균 세포들의 단편들이다.
대안으로서, 보조 치료에서 일부 서로 다른 치료 전략 또는 종류 또는 치료가 동시에 사용된다. 본 발명의 특정 실시 예에서, 보조 치료는 인간 면역결핍 바이러스로 고통받는 개인, 또는 그렇지 않으면 결핵 감염이 되기 쉽거나 및/또는 그러한 치료가 필요한 어떠한 개인과 같은, 손상된 면역 시스템을 갖는 인간 대상에 투여될 수 있다. 이소니아지드가 또한 보조 치료에서 투여될 수 있다. 또한 보조 치료는 인간 면역결핍 바이러스 감염을 치료하는 것과 같이, 손상된 면역 시스템을 치료하기 위한 어떠한 약물 또는 약물들의 조합을 포함할 수 있다. 인간 면역결핍 바이러스 감염들을 치료하기 위한 일반적인 약물들은 항레트로바이러스 약물들이며, 비제한적 개요가 "Antiretroviral therapy for HIV infection in adulats and adolescents Recombinations for a public health approach: 2010 revision, 세계 보건 기구, ISBN: 9789241599764"에서 알 수 있다.
따라서, 본 발명에 인간 면역결핍 바이러스 양성 인간 대상에 백신접종과 같은, 효율적인 결핵 예방을 제공하는데 필요한 용액이 제공된다.
개인이 인간 면역결핍 바이러스 양성으로 고려되거나 또는 그렇지 않은지는(즉, 인간 면역결핍 바이러스 음성) 검사되려는 개인으로부터의 체액 내에 후천성 면역 결핍증(AIDS)을 야기하는 바이러스인, 인간 면역결핍 바이러스의 존재의 검출을 허용하는 어떠한 검사에 의해 검사될 수 있는데, 체액은 일반적으로 혈청, 타액, 또는 소변으로부터 선택되는 것 중의 하나이다. 그러한 검사는 항체들, 항원들, 또는 RNA를 검출할 수 있다. 적절한 스크리닝 검사의 개요가 Chou 등, Ann. Intern. Med. 2005 Jul 5;143(1) 55-73에 주어진다.
본 발명의 발명자들은 놀랍게도 인간 면역결핍 바이러스 양상 인간 대상에 투여되는 25 ㎍ 결핵균 세포들의 단편들의 단일 투여량이 강력한 반응을 제공한다는 사실을 발견하였다.
25 ㎍ 결핵균 세포들의 단편들의 단일 투여량은 또한 인간 면역결핍 바이러스 양상 인간 대상에 투여되었을 때 강력하였다. 본 발명의 발명자들은 이는 특히 잠복기 결핵으로 고통받는 대상들에 특히 유용하다는 것을 나타내었다(실시 예 12). 따라서, 인간 면역결핍 바이러스 양상 또는 인간 면역결핍 바이러스 음상 인간에 투여되는 25 ㎍ 결핵균 세포들의 단편들의 단일 투여량은 본 발명의 바람직한 실시 예이다.
본 발명은 또한 위에서 설명된 실시 예들 중 하나 또는 그 이상에 따른 리포솜 제형뿐만 아니라 현탁액, 또는 이를 포함하는 약학 조성물을 획득하는데 적합한 것을 특징으로 하는 제조 방법을 제공한다. 그것들의 하나의 비제한적 실시 예가 아래의 실시 예 11에 주어진다.
본 발명은 런던의 NCTC에 수탁된, 결핵균-복합체 균주 NCTC 13536을 더 제공한다. 균주는 낮은 유전적 다형성(polymorphism)을 갖는다. 따라서, NCTC 13536의 단편들을 포함하는 제제들은 낮은 유전적 다형성에 의한 매우 높은 복제능력의 장점을 갖는다.
본 발명을 수행하는 바람직한 방식
50 ㎍ 결핵균-복합체 균주/투여량, 또는 25 ㎍ 결핵균 세포들의 단편들/투여량 또는 5 ㎍ 결핵균 세포들의 단편들/투여량의 특정 투여량이 사용되는 것이 바람직하다. 예를 들면 투여량이 50 ㎍ 결핵균 세포들의 단편들/투여량일 때, 테이블 1에 주어진 양들/물질들이 제제의 하나의 바이알에 존재한다.
Figure 112013069688263-pct00003
테이블 1.
25 ㎍/투여량 또는 5 ㎍/투여량 적용을 위하여, 다른 바이알들이 준비되는데, 테이블 1에 도시된 모든 수의 값들(수크로오스 제외)은 각각 2 또는 10의 팩터로 나뉜다. 제제들(50 ㎍, 25 ㎍ 및 5 ㎍) 내의 수크로오스 함량은 항상 20,000 ㎍ 유닛/바이알이다.
포스파티딜콜린(94.0% (w/w))과 나트륨 콜레이트(장력활성제)가 매우 강화된 콩 레시틴으로 만들어진 리포솜 제형(리포솜 형성 제제)은 제조 동안에 뿐만 아니라 재구성된 현탁액 내의 약물 물질의 더 높은 안정성을 보장하는데 적합한 것으로 나타났다. 서로 다른 비율의 결핵균 세포들의 단편들/지질 성분을 검사한 후에, 매우 뛰어난 비율은 대략 0.03:0.2:0.7(결핵균 세포들의 단편들:나트륨 콜레이트: 콩 레시틴)이라는 것이 수립되었다. 또한 리포솜 제형은 수상에서 염들의 존재에 의해 향상된다는 것이 관찰되었다. 따라서, 이러한 특정 제제 내에 염화나트륨이 포함된다.
Figure 112013069688263-pct00004
테이블 2. 친액생화된 리포솜 조성물의 재구성 후에 측정된, 약물 제품(결핵균 세포들의 단편들)
바람직한 방식에서 본 발명은 본 발명에 따른 리포솜 제형이 테이블 2에 따른 특성들을 갖는 것과 같이 수행된다.
살아 있는 대상에 대한 투여를 위하여, 바이알은 166.7 ㎍/㎖의 결핵균 세포들의 단편들을 포함하는 현탁액을 제공하기 위한 주입을 위하여 0.4 ㎖의 물로 재구성될 수 있다.
테이블 3은 50 ㎍/투여량에서의 재구성 후에 바이알 당 각각의 성분의 농도를 나타낸다. 25 ㎍/투여량 또는 5 ㎍/투여량 적용을 위하여, 다른 바이알들이 준비되는데, 테이블 1에 도시된 모든 수의 값들(수크로오스제외)은 각각 2 또는 10의 팩터로 나뉜다. 제제들(50 ㎍, 25 ㎍ 및 5 ㎍) 내의 수크로오스의 함량은 항상 50,000 ㎍/㎖이다.
Figure 112013069688263-pct00005
테이블 3. 주입을 위한 0.4 ㎖ 물에서의 재구성 후에 성분들의 농도
재료 및 방법
참조 물질
a) 단일클론 항체들: 결핵균 세포들의 단편들 배치(bath)들의 단백질 프로파일의 동정을 위하여 특정 단일클론 항체들(항-HSP70, 항-38kDa, 항-Ag85B (Lionex Diagnostic GmbH, 브라운슈바이크, 독일로부터의))이 사용된다.
b) 알부민 표준: 단백질 함량의 결정을 위하여 사용되는, 이러한 표준은 아지드화나트륨(sodium azide)에서 보존된, 0.9%의 식염수(2 ㎎/㎖)에서의 소 알부민(bovine albumin, 제조사:Pierce)으로 구성된다.
c) 결핵균 표준으로부터의 트레할로오스 6,6'-디미콜레이트(TDM, 이하 TDM으로 표기): 결핵균 세포들의 단편들 배치들의 TDM의 동정을 위하여 상업적으로 이용가능한 TDM(Sigma사)이 사용된다.
d) 결핵균 표준으로부터의 미콜산
결핵균 세포들의 단편들 배치들의 미콜산의 동정을 위하여 상업적으로 이용가능한 미콜산(Sigma사)이 사용된다.
e) 분자량 마커: SeeBlue
Figure 112013069688263-pct00006
Plus pre-stained Standard" (Invitrogen사)인 상업적으로 이용가능한 분자량 마커가 사용된다.
파라미터들의 결정
a) pH
결핵균 세포들의 단편들의 재구성된 현탁액(20 ㎍/㎖)의 pH는 Ph. Eur. 2.2.3 및 USP〈791〉에 따른 전위차법(potentiometry)에 의해 결정된다.
b) 물 함량
친액성화된 결핵균 세포들의 단편들의 잔여 물의 결정을 위한 검사는 Coulometric Karl Fisher 장비를 사용하여 수행되고, Ph. Eur. 2.5.12 및 USP〈921〉Water determination의 일반적인 지침을 따른다.
c) 전체 단백질 함량의 결정
결핵균 세포들의 단편들의 전체 단백질 함량의 결정을 위한 검사는 상업용 키트(BCA 키트, Pierce)를 사용하며 Ph. Eur. 2.5.33, 방법 4(바이신코닉산(bicinchoninic acid) 또는 BCA 분석법) 및 USP〈1057〉을 따른다.
d) SDA-PAGE에 의한 단백질 프로파일의 동정
검사는 Ph. Eur. 방법 2.2.31 및 USP〈726〉에 따라 실행된다. 겔 내의 단백질들의 검출은 적용된 쿠마시 염색법 또는 은 염색법에 의해 실행된다. 검사 샘플들은 40 또는 20 ㎎/㎖ 농도에서 정제된 물 내의 재구성 결핵균 세포들의 단편들이다. 참조 용액들은 분자량 마커, 정제된 항원들, 결핵균 세포들의 단편들의 참조 표준이다.
Figure 112013069688263-pct00007
테이블 4. 참조 항원들.
쿠마시 염색을 위하여, Gel-code Blue Stain 시약(Pierce)이 제조사의 사양들에 따라 사용된다. 은 염색을 위하여, Invitrogen사의 PROTSIL1 Kit가 제조사의 사양들에 따라 사용된다. 웨스턴 블롯 분석을 위하여, 종래에 알려진 표준 방법들에 따라 SDS-PAGE에 의해 단백질이 분리되며 그 뒤에 특정 단일클론 항체들을 사용하여 면역검출을 위한 PVDF 막 상으로 전기영동으로 전달된다. 항원-항체 상호작용이 화학발광 반응을 트리거링하는 항-항체와 함께 배양함으로써 가시화된다. Lionex (브라운슈바이크, 독일)로부터의 항체들, 결핵균 HSP 단백질(70 kDa), 결핵균 38 kDa 단백질, 결핵균 Ag85B 단백질(30 kDa), 및 Lionex로부터의 특정 단일클론 항체들 항-HSP70, 항-38kDa, 및 항-Ag85B가 사용된다.
e) 미콜산들의 동정
결핵균 세포들의 단편들 내의 미콜산들은 1차원 박층 크로마토그래피, 그 뒤에 Ph. Eur, 방법 2.2.27에 의해 조사된다. 검사 샘플들은 친액성화된 결핵균 세포들의 단편들 40 ㎍이다. 참조 용액들은 미콜산 표준(Sigma)이다. 과정:
a) 추출 과정 : 클로로포름:메탄올(1:1)로 추출되고 그리고 나서 하룻밤 동안 배양된다. 상청액 부분은 제거된다.
b) 미콜산 에스테르화: 2 ㎖의 메탄올:톨루엔:황산(30:15:1)이 각각의 튜브에 첨가되고, 하룻밤 동안 에스테르화가 달성된다. 그리고 나서, 4 ㎖의 n-헥산이 첨가된다. 이는 질소 흐름 하에서 건조되고 500 ㎕ 헥산으로 재현탁된다.
c) 박층 크로마토그래피: 10 ㎕의 각각의 샘플이 플레이트(실리카 겔 60 (20×20 ㎝) Merck)의 모서리와 평행한 라인 상에 적용된다. 크로마토그래피 분리는 이동 상을 갖는 포화 탱크(에틸에테르:n-헥산(18:85, vol/vol) 내에서 3회 실행된다. 그리고 나서 플레이트는 대기에서 건조하도록 허용된다.
d) 미콜산들은 인몰리브덴산(phosphomolybdic acid) 용액을 갖는 플레이트들의 분무 및 120℃에서 10분 동안 가열에 의해 드러난다.
결핵균 세포들의 단편들 샘플들 내의 미콜산들은 미콜산 상업용 기준 스폿과의 비교에 의해 결정된다. 결과들은 평가된 미콜산의 정성 데이터(존재(양성)/비존재(음성))로서 표현된다.
f) TDM의 동정: 검사 샘플들은 친액성화된 결핵균 세포들의 단편들 40 ㎎이다. 참조 용액들은 TDM 표준(Sigma)이다. 과정:
(ⅰ) 추출 과정: 샘플은 클로로포름:메탄올(1:1; vol/vol)로 추출되고 그리고 나서 하룻밤 동안 배양된다. 상청액 부분이 질소 흐름 하에서 건조되고 계량된다. 최종적으로, 건조된 샘플들은 40 ㎎/㎖ 최종 농도에서 클로로포름 내에서 재현탁된다.
(ⅱ) 박층 크로마토그래피: 10 ㎕의 각각의 샘플이 플레이트(실리카 겔 60 (20×20 ㎝) Merck)의 모서리와 평행한 라인 상에 적용된다. 크로마토그래피 분리는 이동 상을 갖는 포화 탱크(클로포름:메탄올:물(60:12:1; vol/vol) 내에서 실행된다. 그리고 나서 플레이트는 대기에서 건조하도록 허용된다.
(ⅲ) 검출: TDM은 황산 내의 안트론(antrone) 1% 용액을 갖는 플레이트들의 분무 및 120℃에서 5분 동안 가열에 의해 드러난다.
(ⅳ) 동정: 결핵균 세포들의 단편들 샘플들 내의 TDM은 기준 스폿을 발생시키도록 사용되는 상업용 TDM과의 비교에 의해 결정된다. 결과들은 평가된 TDM의 정성 데이터, 즉, 존재(양성)/비존재(음성)로서 표현된다.
g) 리포아라비노만난의 동정: 리포아라비노만난의 웨스턴 블롯 분석을 위하여, 성분들은 표준 방법들에 따른 SDS-PAGE에 의해 단백질이 분리되며 그 뒤에 특정 항체 CS35를 사용하여 면역검출을 위한 PVDF 막 상으로 전기영동으로 전달된다. 항원-항체 상호작용이 화학발광 반응을 트리거링하는 항-항체(IgG Goat 항-마우스 IR Dye 800 CW)와 함께 배양함으로써 가시화된다.
h) 멸균
통상의 지식에 따라, 멸균을 필요로 하는 모든 과정은 멸균 조건 하에서 실행된다. 이는 또한 멸균을 필요로 하는 어떠한 주어진 단계를 위하여 언급되지 않을 때에도 적용된다. 멸균 검사는 Ph. Eur 2.6.1 (USP〈71〉)에 전술된 것과 같이 평가된다.
i) 마이코박테리아 불활성화
마이코박테리아 불활성화는 Ph. Eur. 2.6.2에 따라 평가된다.
j) 박테리아 내독소들
박테리아 내독소들을 위한 검사(투구게 용해물(Limulus Amoebocyte Lysate) 검사)는 Ph. Eur., 방법 2.6.14, 그 다음에 방법 D (색소성 동역학 방법(Chromogenic kinetic method)뿐만 아니라 USP〈85〉를 사용하여 실행된다.
세균의 단편화
세균의 단편화의 선택은 세포 항원들, 특히 세포 벽 항원들의 최적 표현을 허용하는 것이다. 결핵균 세포들의 단편들의 단편화는 동역학 광 산란(아래에 설명되는 것과 같은) 및 레이저 회절법들 모두에 의해 결정된다.
레이저 회절은 0.04 ㎛ 및 2000 ㎛ 사이의 범위에서 단편화를 측정하도록 허용한다. 분석법은 스페인 바르셀로나의 Servicios Cientifico-tecnicos de la Universitat에서 실행되었다. 장비는 Universal Liquide Module(ULM)이 구비된 Coulter LS 13320이었다. 용제는 정제된 물/미네랄 오일이었다. 결과들은 입자 지름(0.04 ㎛-2000 ㎛)의 앞에서 입자들의 수의 상대 빈도(%)를 나타내는, 히스토그램으로서 표시되었다.
z-평균 입자 크기 및 다분산도 지수의 결정
본 발명에 설명된 것과 같은 평균 입자 크기는 다음의 스토크-아인슈타인(Stokes-Einstein) 방정식에서 정의된, 입자의 브라운(Brown) 운동의 물리적 개념을 기초로 하는, 동역학 광 산란에 의해 결정된다:
Figure 112013069688263-pct00008
여기서, d(H)는 수화 지름(hydrodynamic diameter), D는 병진 확산 계수, k는 볼츠만 상수, T는 절대 온도, η은 점도를 나타낸다.
어떠한 특정 이론에 얽매이지 않고, 스토크-아인슈타인 방정식은 액체 배지에 현탁된 입자들이 그것들의 크기에 의존하는 속도로, 일정하고 임의의 운동을 한다는 것을 확립한다. 입자가 클수록 브라운 운동은 느려질 것이다.
동역학 광 산란 측정들에서, 측정되려는 입자들을 포함하는 샘플은 단색의 광원, 바람직하게는 레이저로 조명되며, 산란된 광의 강도가 시간에 따라 어떻게 변동하는지의 상관관계 함수로 분석된다. 만일, 예를 들어, 느리게 운동하는 것과 같은, 큰 입자들이 측정되면, 산란된 광의 강도는 느리게 변동하고, 상관관계는 소멸되는데 긴 기간이 걸린다. 다른 한편으로, 만일, 예를 들어, 빠르게 운동하는 것과 같은, 작은 입자들이 측정되면, 산란된 광의 강도는 빠르게 변동하고, 신호의 상관관계는 더 급속도로 소멸된다.
본 발명에 따라, 입자들은 바람직하게는 다음의 장비로 측정된다: 용제로서 정제된 물/미네랑 오일을 사용하는 Zetasizer nano zs (Malvern Instruments).
만일 반대되는 아무것도 나타나지 않으면, 장비는 제조사의 사양에 따라 사용되며, 적용가능하면, 조정 또는 보정이 제조사의 사양에 따라 사용된다.
크기는 다양한 알고리즘을 사용하여 상관관계 함수로부터 계산된다. 본 발명이 경우에 있어서, ISO13321 Part 6에 정의된 것과 같은, '수치 분석'이 적용된다. 상관관계 함수 맞춤은 다음의 파라미터들의 계산을 허용하는 단일 지수 곡선을 야기한다:
- 입자 분포의 평균 크기, 또는 z-평균 크기. 이러한 평균 크기는 강도 평균이다.
- 즉, 입자 크기 분포의 폭과 상응하는, 다분산도 지수.
결과들은 일반적으로 1 ㎚ 내지 3 ㎛ 범위 내에 포함되는 어떠한 지름일 수 있는 입자 지름에 대하여 입자들의 수의 상대 빈도(%)를 나타내는, 히스토그램으로서 표시된다.
역가 검사( Potency test )
특정 병원체 부재의, 6-7주 연령 암컷 C57BL/6 마우스들이 Harlan Iberica (스페인)에 의해 제공된다. 검사 샘플은 테이블 3의 제형 및 플라시보(활성 성분이 없는 백신 제형)이다.
a) 단일 투여로 백신접종된 체내 결핵균 감염 쥐류(murine) 모델: 실험 디자인은 다음을 포함한다: 0일째: 결핵균 균주 H37Rv Pasteur (4×104 CFUs)로 마우스들의 하복부 상에 피하 감염. 14일째: 리팜피신(25 ㎎/㎏) 및 이소니아지드(10 ㎎/㎏)의 단일 구강 투여를 갖는 동물들의 화학적 예방 치료, 따라서 1주일의 항생 효과에 이르게 한다. 21일째: 백신/플라시보 및/또는 물의 단일 투여를 목 내로 피하로 백신접종. 각각의 실험은 감염된 마우스와 플라시보의 기초 그룹 및 감염된 마우스와 백신접종의 실험 그룹을 포함한다. 그룹은 6-7 동물들로 구성되고, 실험들은 2중으로(in duplicate) 실행된다. 28일째: 동물들은 아이소플루레인(isoflurane)으로 마취된다.
b) 2회 투여로 백신접종된 체내 결핵균 감염 쥐류(murine) 모델: 실험 디자인은 다음을 포함한다: 0일째: 결핵균 균주 H37Rv Pasteur (4×104 CFUs)로 마우스들의 하복부 상에 피하 감염. 14일째: 리팜피신(25 ㎎/㎏) 및 이소니아지드(10 ㎎/㎏)의 단일 구강 투여를 갖는 동물들의 화학적 예방 치료, 따라서 1주일의 항생 효과에 이르게 한다. 21일째: 백신/플라시보 및/또는 물의 첫 번째 투여를 목 내로 피하로 백신접종. 36일째: 백신/플라시보 및/또는 물의 두 번째 투여를 목 내로 피하로 백신접종. 개별 마우스를 위하여 모든 샘플들이 획득되고 분석된다. 각각의 실험은 감염된 마우스와 플라시보의 기초 그룹 및 감염된 마우스와 백신접종의 실험 그룹을 포함한다. 그룹은 6-7 동물들로 구성되고, 실험들은 2중으로 실행된다. 42일째: 동물들은 아이소플루레인으로 마취된다.
위의 a) 및 b) 모두를 위하여, 희생 후에, 세포 면역 반응을 위하여 비장 세포 현탁액을 사용하여 실행되는 ELISPOT에 의한 인터페론-감마 스폿 형성 유닛 파라미터의 체내 분석이 실행된다.
결핵균 건강한(healthy) 쥐과 모델의 면역 능력의 결정:
특정 병원체 부재의, 6-7주 연령 암컷 C57BL/6 마우스들이 Harlan Iberica (스페인)에 의해 제공된다. 2회 투여로 백신접종된 체내 결핵균 감염 쥐류(murine) 모델: 실험 디자인은 다음을 포함한다: 0일째: 본 발명을 수행하는 바람직한 방식에 따른 첫 번째 투여 백신 또는 플라시보 및/또는 물의 단일 투여를 목 내로 피하로 백신접종. 21일째: 백신/플라시보 및/또는 물의 첫 번째 투여를 목 내로 피하로 백신접종. 개별 마우스를 위하여 모든 샘플들이 획득되고 분석된다. 각각의 실험은 감염된 마우스와 플라시보의 기초 그룹 및 감염된 마우스와 백신접종의 실험 그룹을 포함한다. 28일째: 동물들은 아이소플루레인(isoflurane)으로 마취된다. 희생 후에, 체액이 면역 반응을 위하여 ELISA에 의한 IgGs 항체들의 분석이 마우스 혈청을 사용하여 실행된다.
결핵의 진단
결핵의 진단 방법은 통상의 지식을 가진 자들에 잘 알려져 있다. 퀀티페론(QuantiFERON) 검사 및 피부 튜베르쿨린 검사가 신뢰할 수 있는 결과들을 전하는 것으로 알려져 있으며 본 발명의 제품으로 치료하려는 그것들의 적합성을 위한 대상들의 분류를 위하여 단독으로 또는 병행하여 사용될 수 있다. 호주 멜버른 소재의 Cellestis Limited에 의해 제조된, 또한 QFT로서 알려진, 퀀티페론이 결핵 감염 또는 잠복기 결핵을 위한 상업적으로 이용가능한 검사이다. QFT는 결핵 진단에 사용되는 인터페론-감마 방출 분석법(IGRA)이다. 이는 제조사의 사양에 따라 사용된다. 망투(Mantoux) 검사(또한 망투 스크리닝 검사로서 알려진), 피부 투베르쿨린 검사, 피르케(Pirquet) 검사 또는 정제된 단백질 유도체(PPD) 검사가 결핵을 위한 진단 도구이다. 두 검사 모두의 개요는 Franklin 등, Clin Vaccine Immunol. 2007, April; 14)4) 477-480에서 알 수 있다.
실시 예들:
통상의 지식을 가진 자들에게 본 발명의 일부 특정 실시 예들의 실행 방식 및 설명을 제공하기 위하여 아래의 실시 예들이 제공된다. 이러한 실시 예들은 설명의 목적을 위한 것이며 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 의도되어서는 안 된다.
실시 예 1: 균주 결핵균 NCTC 13536의 분리
결핵균 세포들의 단편들의 생산을 위한 개시 물질은 동의어로 511로 불리는, 균주 NCTC 13536 또는 스페인, 바르셀로나에서 폐결핵으로 진단된 면역능력이 있는 환자로부터 분리된 결핵균의 균주인 결핵균 NCTC 13536의 접종이다. 이는 2010년에 부다페스트 협약에 따른 공식 수탁 기관인, 런던의 NCTC에 수탁되었다. 균주는 부가적으로 스페인 바르셀로나의 Hospital de Sant Pau의 Service of Microbiology의 균주 수집에 의해 수탁되었다.
각각 1995년 및 1996년에 원 균주의 두 가지 통로가 실행되었다. MSL PB#1은 -70±8℃에서 저장된 100개 바이알(3 ㎖ 멸균 유리 바이알들)을 야기한 1996년 10월에 실행된, 결핵균 NCTC 13536의 원 균주의 두 번째 통로와 상응한다. 균주는 종래의 표준 방법들에 의해 확인된 것과 같이, 낮은 유전적 다형성을 갖는다.
실시 예 2: 결핵균-복합체 세포들의 생산을 위한 업스트림 과정
이러한 과정의 플로차트가 도 1에 주어진다. 결핵균 세포들의 단편들의 생산을 위한 개시 물질은 균주 결핵균 NCTC 13536의 접종이다(실시 예 1). 이러한 개시 물질의 지속적인 공급을 보장하기 위하여, 시드 로트 시스템(seed lot system)이 바람직하게 사용된다. 따라서, 마스터 시드 로트(master seed lot)로부터 유래된 제조용(working) 시드 로트가 결핵균 세포들의 단편들의 생산을 위하여 사용된다. 결핵균 NCTC 13536(실시 예 1)은 Lowenstein-Jensen 배지에서 3-5주 동안 배양된다. 박테리아 성장은 그리고 나서 100±5 rpm에서의 교반으로 37±2℃에서 Proskauer Beck 배지에 계대배양된다(subcultured). 일단 최대 박테리아 농도가 달성되면(외관 검사(visual inspection)에 의해), Proskauer Beck 배지 내의 계대배양이 시작되고 배양된다. 생(viable) 박테리아 수는 37±2℃에서 3-4주 동안의 배양 후에 Middlebrook 한천 배지 내에 획득된 콜로니 형성 유닛(CFUs)의 수에 의해 결정된다. 박테리아 수는 2-5×107 CFUs/㎖이어야만 한다.
(1) 결핵균의 배양
결핵균 세포들의 단편들의 생산은 7H11 한천 플레이트 내의 0.2 ㎖의 제조용 시드 로트의 접종 및 15±2일 동안 37±1℃에의 배양으로 시작한다. 그리고 나서, 콜로니들은 수개의 유리 비드를 포함하는 튜브 내로 전달된다. 혼합 후에, 박테리아 현택액을 획득하기 위하여 주입을 위한 약 5 ㎖의 물이 첨가된다. 이 시점에서, 생 플레이트 수 및 멸균 검사가 실행된다. 약 100개의 Middlebrock 7H11 한천 플레이트가 전면(confluent) 배양들을 획득하기 위하여 박테리아 현탁액으로 적셔진 면봉(swab)들을 사용하여 결핵균으로 접종된다. 플레이트들은 21±2일 동안 37±1℃에서 배양된다.
진행 중인 제어와 같은 멸균 검사는 다음과 같이 실행된다:
멸균 검사는 결핵균 외의 균류 및 박테리아가 없도록 보장하는 것을 목적으로 한다. 검사들은 직접 접종이 실행되고, 그 뒤에 멸균 테스트를 위하여 Ph. Eur 2.6.1에서 설명된 조건들이 실행된다. 검사된 샘플들은 멸균되어야만 한다. 배지 7H11이 7H10 대신에 사용된다(Ph. Eur 2.6.2에서 언급된 것과 같이). 7H11은 결핵균 균주의 성장을 향상시키기 위하여 1g의 카제인 분해물(pancreatic digest of casein)을 첨가한 배지 7H10을 기초로 한다.
(2) 결핵균의 수확 및 조추출물의 동결
접종 기간 후에, 박테리아 배양의 순도는 한천 플레이트의 외관 검사 및 멸균 검사의 실행에 의해 제어된다. 그리고 나서, 박테리아 성장은 한천 플레이트들로부터 수집되고 멸균 튜브 내로 전달된다. 획득된 조추출물이 계량된다(20-22g). 혼합물은 -80±5℃에서 유지된다.
실시 예 3: 조추출물로부터 획득된 리포솜의 생산을 위한 다운스트림 과정
이러한 과정의 플로차트가 도 2에 주어진다.
(3) 세포 단편화 및 탈지
동결된 조추출물(실시 예 2)은 37±1℃에서 용해되고 그리고 나서 4℃에서 4%(w/w) Triton-X114 (ph 7.0-7.5)를 갖는 멸균 PBS 버퍼가 첨가된다. 혼합 후에, 이는 그 뒤에 멸균 실리카/지르코니아 비드들을 포함하는 멸균 폴리카보네이트 컨테이너 내로 전달된다. 그리고 나서, 다음의 단편화 방법의 적용에 의해 비드비터(Beadbeater)에서 세포 단편화가 수행된다: 3 사이클, 각각 5 기간의 온/오프 및 10분의 휴식으로 구성. 일단 과정이 종료되면, 뒤따르는 4% Triton-X114 (ph 7.0-7.5)를 갖는 멸균 PBS 버퍼에서의 세척들(반복된 진탕과 침강)에 의해 세포 단편화된 부분이 비드들로부터 분리된다. 그리고 나서 pH 제어를 위하여 세포 단편화된 부분의 세척된 현탁액의 분액이 수집되고 4℃에서 30분 동안 845 g에서의 최종 원심분리가 진행된다.
세포질 부분을 제거하고 세포 단편들이 풍부한 현탁액을 획득하기 위하여 4℃에서 60분 동안 약 20000 g에서 고속 원심분리가 2회 실행된다. 첫 번째 원심 분리 후에, 황갈색(yellowish) 상청액(용해성 단백질과 지질들이 풍부한)이 버려지고 펠릿(pellet)은 PBS 내에 재현탁되고 위에서 설명된 조건들과 동일한 조건 하에서 더 원심분리된다. 그리고 나서, 버려진 상청액의 외형은 깨끗하고 무색이어야 한다. 최종적으로, 획득된 펠릿은 50-60 ㎖ PBS의 최종 체적(결핵균 세포들의 단편들 현탁액) 내에 재현탁된다.
(4) 살균
결핵균 세포들의 단편들 현탁액은 그리고 나서 65±2℃에서 60분 동안 살균된다. 일단 살균이 완료되면 살균된 결핵균 세포들의 단편들의 pH는 리트머스 종이에 의해 결정된다. pH 6.5∼7.5 범위가 수용가능한 것으로 고려된다. 멸균되고 탈발열된(depyrogenated) 바이알들은 0.5 ㎖의 제품 현탁액 및 멸균 상의 진행 중인 제어들로 채워지고 마이코박테리아 불활성화가 실행된다. 최종적으로, 채워진 바이알들은 -80±5℃에서 동결된다. 일단 물질이 살균되면, 미처리된 물질로부터 물리적으로 분리될 것인데, 즉, 살균 전에 사용된 공간들이 뒤따르는 충전 과정 동안에 사용되는 것으로부터 분명하게 분리된다.
(5) 동결 건조
동결된 산물을 포함하는 모든 바이알은 그리고 나서 약 -45℃ 내지 30℃ 온도 및 0.310 밀리바 압력에서 약 18시간 동안 친액상화된다(바이알 당 0.5 ㎖). 무균 기술들을 사용하고 N2 대기 하에서, 바이알들이 마개로 막아지고(stoppered) 라벨링된다. 패키징된 약물 물질은 그리고 나서 12달까지 -20±5℃에서 저장된다.
실시 예 4: 단백질 특성
도 3은 단백질 프로파일과 관련하여 특성 전략의 개요를 제공한다.
문헌(Anderson P., Scand J. Immunol.: 45(2)115-31; Geisel 등, 2005, J. Immunol.; 174(8)5007-15; Stewart 등, 2005, Infect. Immun., 73(10):6631-7; Wang 등, 2007, J. Mol. Biol., 366(2):373-81)을 기초로 하여, 단백질 프로파일 평가를 대표하는 것과 같은 6가지 단백질 대역이 선택되었다: HSP70 단백질(Rv0350), 38 kDa 단백질(Rv0934), (Rv 1866c), 19 kDa 단백질(Rv3763), CFP10 단백질(Rv3874), 및 ESAT-6 단백질 (Rv3875).
A. 전체 단백질 함량의 결정: 결핵균 세포들의 단편들 내의 전체 단백질 레벨들이 바이신코닉산 분석법에 의해 정량화된다. 전체 단백질은 약 10% (w/w)의 결핵균 세포들의 단편들 함량을 나타낸다. 참조 표준 결핵균 세포들의 단편들-0429-16 및 결핵균 세포들의 단편들-52.1은 각각 167 ㎍ 단백질/㎎ 결핵균 세포들의 단편들 및 115 ㎍ 단백질/㎎ 결핵균 세포들의 단편들을 포함한다.
B. SDS-PAGE에 의한 단백질 프로파일의 동정: 약물 물질 결핵균 세포들의 단편들의 단백질 프로파일은 ESAT6 (6 kDa) (7); CFP10 (10 kDa) (6); Ag55B (30 kDa) (1); 38 kDa (2); HSP70 (70 kDa) (4)와 상응하는 결핵균으로부터의 참조 항원들과의 비교에 의해 결정되었으며, 분자량 마커 MW (5)가 도시되었다(도 4). 약물 물질 결핵균 세포들의 단편들의 단백질 프로파일의 결정 및 대역들(약 70 kDa, 38 kDa, 30 kDa, 10 kDa 및 6 kDa)의 동정은 쿠마시 염색법에 의해 수행되었다. 19 kDa 대역(리포폴리펩티드)의 동정은 은 염색법에 의해 실행되었다.
C. 특정 단일클론 항체를 갖는 웨스턴 블롯에 의한 단백질 프로파일의 동정: 약물 물질 결핵균 세포들의 단편들의 단백질 프로파일은 단일클론 항체들: 항-HSP70 (70 kDa, 도 5c), 항-38kDa (도 5d), 항-Ag55B (30 kDa, 도 5e)을 갖는 웨스턴-블롯 분석들을 사용하여 획득된 패턴들에 의해 결정되었다.
결핵균 세포들의 단편들-52.1은 본 발명을 수행하는 바람직한 방식에 따른 결핵균 세포들의 단편들을 위한 참조 배치이다.
실시 예 6: 지질 특성
결핵균 세포들의 단편들의 지질 프로파일의 특성은 클로로포름:메탄올(1:1) 추출을 기초로 하는 분류 과정으로 구성된다. 본 발명에 수행된 분류 과정은 Delmas 등, 1997, Glycobiology 7)6), 811-7을 기초로 한다. 박층 크로마토그래피가 결핵균 세포들의 단편들 내에 존재하는 지질들 및 당지질들을 분석하기 위하여 사용된 방법이었다. 특히, 균주 H37Rv 및 NCTC 13536 모두에서뿐만 아니라 서로 다른 결핵균 세포들의 단편들 배치들 내에서 폴리아실트레할로오스, 트레할로오스 디미콜레이트, 디아실트레할로오스, 포스파티딜이노시톨만노시드들 및 다른 인지질들뿐만 아니라, 프티오세롤 디미코세로산(phthiocerol dimycocerosate, PDIM)들 및 미콜산들이 박층 크로마토그래피에 의해 동정되었다. 도 7a가 참조된다. TDM의 함량은 상청액에서의 박층 크로마토그래피에 의해 분석된다. 미콜산들 결정은 침전물, 그 뒤에 박층 크로마토그래피 방법으로 수행된다. 결핵균 세포들의 단편들의 지질 프로파일을 위한 어떠한 정량 데이터도 알려지지 않으나, 연구들에서 확립된 정량적 지질 프로파일은 현재 과학 지식과 일치하고 지금까지 알려진 면역성 지질들의 표준 특성을 허용한다. 결핵균 세포들의 단편들은 결핵균의 균주들 NCTC 13536과 H37Rv의 전체 세포 지질 부분 및 TDM 상업용 표준과 비교되어 왔다(도 7a 및 7b 참조). 전체적으로, 지질 함량은 본 발명에 따른 결핵균 세포들의 단편들 함유 리포솜들의 서로 다른 배치들에서 일정한 것으로 나타났다. 도 7d는 당지질 리포아라비노만난의 동정을 나타낸다.
실시 예 6: 단편화된 세포 물질의 특성
두 방법론을 사용한 예비 결과는 결핵균 세포들의 단편들의 단편 크기는 결핵균 세포들의 단편들 전자 현미경에 의해 제공되는, 주로 1 ㎛ 이하(99%〈 1 ㎛)인 것을 나타낸다. 단편 크기는 주로 100 내지 300 ㎚ 범위이다.
페놀/클로로포름 혼합물로의 추출 후에 잔여 DNA의 레벨들은 260 ㎚에서의 흡광도(검출 한계: 0.2 ㎍ DNA/㎎ 결핵균 세포들의 단편들)에 의해 조사되었다. 일반적인 지금까지 획득된 결과들은 15 DNA/㎎ 결핵균 세포들의 단편들 이하이다.
약물 물질의 생산 과정의 일관성이 서로 다른 결핵균 세포들의 단편들을 위하여 복제될 수 있는 지질과 단백질 프로파일에 의해 나타난다.
실시 예 7: 마우스들의 면역성 및 생물학적 활성의 시각화
마우스 면역혈청을 갖는 결핵균 세포들의 단편들의 단백질 대역들의 상호작용: 웨스턴-블롯 방법을 사용하여 본 발명에 따른 백신을 기초로 하는 리포솜 제형으로 2회 접종된 감염 마우스들로부터 획득된 혈청 내에 존재하는 IgG 항체들과 상호작용하는 결핵균 세포들의 단편들 단백질 대역들을 시각화하는 것이 가능하였다. 이는 생물학적 활성을 위한 지표인 것으로 고려된다.
실시 예 8: 결핵균 세포들의 단편들을 포함하는 리포솜 제형의 체내 활성
백신의 생물학적 활성이 리포솜들이 없는(주입을 위한 물(WFI)로 재구성된) 결핵균 세포들의 단편들 및 본 발명을 수행하는 최상의 방식에 따른 리포솜 제형을 갖는(5% 수크로오스) 결핵균 세포들의 단편들의 면역성 효능을 평가함으로써 체내 모델에서 연구된다(도 8). 이러한 결과들은 수크로오스를 갖는 리포솜 제형의 장점들을 나타낸다.
리포솜들의 집합(aggregation) 또는 융합 상태들은 백신의 생물학적 활성에 상당한 영향을 갖는 것으로 설명된 파라미터들이다. 따라서, 본 발명의 연구자들은 제조 동안에 그리고 백신들의 배치 방출에서 입자 크기 및 다분산도 지수의 철저한 제어를 실행한다.
실시 예 9: 수크로오스의 효과
초기 검사에서, 각각 다음 중 하나의 첨가제가 결핵균-복합체 균주 NCTC 13536의 단편들을 포함하는 리포솜 제형 내로 통합된다: (a) 1.5% 글리신(glysine) 및 (b) 5% 수크로오스. 그 뒤에, 두 제제와 관련된 생리화학적 특성들 및 생물학적 활성에 대한 비교 평가가 수행된다.
친액성화된 리포솜 조성물의 재구성 후에 그리고 현재 배치 방출 사양 파라미터들에 따른 검사 후에 획득된 결과들이 테이블 5에 나타난다.
Figure 112013069688263-pct00009
테이블 5. 친액성화된 리포솜 조성물의 재구성 후에 측정된, 세 가지 서로 다른 제제들을 위한 사양들의 결과들.
본 발명의 연구자들은 놀랍게도 5% 수크로오스 제제가 각각 재구성에 대한 물 함량 또는 시간과 같은, 더 나은 생리화학적 결과들의 장점을 제공한다는 사실을 발견하였다. 그러나 가장 중요한 사실은 다른 두 가지 제제와 비교하여 수크로오스 함유 제제와 함께 나타난 리포솜 집합(입자 크기, z-평균)의 중요한 감소이다. 동역학 광 산란에 의한 분석은 수크로오스 함유 리포솜들의 75±20 ㎚의 z-평균(다분산도 지수 ≤ 0.350)을 나타내었다. 수크로오스 함유 리포솜 제형의 동결 할단 제조들의 전자 현미경은 40 및 100 ㎚ 사이의 크기들을 갖는 다중 라멜라 및 단일 라멜라 리포솜들을 나타낸다.
5% 수크로오스 제제를 위하여 관찰된 더 적은 물 함량 레벨들(≤2%)과 함께 이러한 향상된 파라미터에 기인하여, 향상된 안정성 결과들이 이러한 제제를 위하여 기대된다. 이는 실제로 사실이다. 실온에서 3개월 동안 저장된 1.5% 글리신으로 제제화된 이러한 실험 배치들의 본 발명의 연구자들의 데이터는 단백질 정제 유도체(면역성 능력)를 위한 생물학적 활성의 급격한 손실을 나타내었다. 이와 대조적으로, 단백질 정제 유도체를 위한 생물학적 활성은 5% 수크로오스 함유 제제가 실온에서 3개월 동안의 저장 후에 연구될 때 기본적으로 변하지 않은 채로 남는다. 따라서, 수크로오스는 또한 생물학적 활성의 더 나은 유지의 장점을 제공한다.
실시 예 10: 수크로오스 함유 제제의 생물학적 특성들
테이블 3에 따른 제제가 생물학적 연구를 위하여 사용되었다. 결핵균이 감염된 쥐형(murine) 모델에서 본 발명을 수행하는 바람직한 방식에 따른 백신의 접종(단일 접종)에 의해 트리거링되는 세포 면역 반응이 ELISPOT에 의해 측정될 수 있는데, 결과들이 테이블 6에 나타난다.
Figure 112013069688263-pct00010
테이블 6. 마우스들 내의 접종 후의 세포 반응
백신을 기초로 하는 리포솜 제형의 접종은 반응 레벨들의 결정을 위하여 ELISPOT이 사용될 때 감염된 동물들의 기저 값(basal value)들과 비교하여 체내 세포 면역 반응의 상당한 증가에 이르게 한다. 기저 반응에 대한 비율은 단백질 정제 유도체에 대하여 4-8배이고 Ag85B에 대하여 8 내지 14배이다. 백신을 기초로 하는 리포솜 제형은 또한 특히 감염의 높은 전염성이 존재할 때 보호 교과를 갖는, 다발항원 체액성 반응을 유도할 수 있다(Guirado 등, 2006, Microbes Infect. 8, 1252-1259).
특히 주 첨가제로서 수크로오스가 없는 제제 대 수크로오스를 포함하는 제제로 획득된 면역 능력의 데이터 사이의 비교가 만들어졌다. 획득된 결과들은 이러한 높은 레벨들의 세포 면역 반응은 다음의 두 가지 능력 검사 모두에서 획득된다: 배치 방출 사양들을 위하여 수행된 테스트(단일 백신 모델) 및 비교 실험을 위하여 포함되는 추가 검사(2회 백신접종된 모델). 게다가, 두 가지 모두의 능력 검사에서, 수크로오스를 갖는 제제의 50 ㎍ 결핵균 세포들의 단편들 투여량에 의해 유도된 세포 면역 반응은 수크로오스가 없는 제제의 200 ㎍ 결핵균 세포들의 단편들로 획득된 것과 유사한 레벨들을 나타낸다. 친액성화된 리포솜 조성물의 재구성 후에 측정된, 결과들이 도 10a 및 10b에 도시된다. 수크로오스 함유 제제는 리포솜 집합의 상당한 감소를 나타낸다. 이는 면역성의 증가를 위한 이유로 생각된다. 새로운 제제의 50 ㎍ 투여량으로 달성된 세포 면역 반응은 수크로오스가 없는 제제로 획득된 200 ㎍ 투여량에서 보이는 것과 거의 유사하다. 세포 반응은 적절한 반응인 것으로 고려되는 것으로 알려진다(North R.J., Jung YJ (2004). Annu. Rev. Immunol. 22: 599-623).
실시 예 11: 친액성화된 리포솜 제형의 제조 과정
본 발명에 따른 리포솜 제형를 포함하는 약학 조성물의 제조 과정의 일 실시 예가 도 11a 및 11b에 도시된다. 간단히 설명하면, 이는 다음의 1 내지 5 단계를 포함한다.
(1) 리포솜 농축 현탁액 벌크 성분들의 제조
리포솜 농축 현탁액 벌크 콩 레시틴은 에탄올에서 용해되고(1:1; w/w) 나트륨 콜레이트가 물에 용해된다(1:5; w/w). 용액들은 여과에 의해 멸균된다. 나트륨 레시틴 용액 및 나트륨 콜레이트 용액의 혼합 후에, 친액성화된 결핵균 세포들의 단편들(실시 예 1)이 교반 상에 첨가된다. 성분들의 비율은 0.03:0.2:0.7(결핵균 세포들의 단편들:나트륨 콜레이트:콩 레시틴; w/w/w)이다.
(2) 리포솜 농축 현탁액 벌크 제조
수상의 성분들이 멸균된 스테인리스 강 믹서(mixer)로 전달된다. 콩 레시틴, 나트륨 콜레이트, 및 결핵균 세포들의 단편들을 포함하는, (1)의 지질 상이 0.7:03(수상:지질 상, w/w)의 비율로 첨가된다. 상들은 균질화를 위하여 3분 동안 2200 rads/s에서 혼합된다. 균질화 후에, 벌크 리포솜 농축 현탁액은 또 다른 용기로 전달되고 적어도 5분 동안 유지된다. 입자 크기 상의 진행 중인 제어들은 리포솜 농축 현탁액 벌크 상에서 실행된다.
(3) 리포솜 농축 현탁액 벌크의 희석, 리포솜 현탁액의 최종 제제
10%(w/w) 수크로오스 용액이 준비되고 멸균된다. 수크로오스 용액은 5% 수크로오스 용액 내의 21 ㎎ 리포솜 농축 현탁액/㎖로 구성되는 최종 리포솜 현탁액 벌크를 얻기 위하여 적절한 비율들로 물과 리포솜 농축 현탁액 벌크로 혼합된다. pH, 멸균도, 및 입자 크기가 진행 중인 제어들로서 검사된다.
(4) 충전
바이알들은 0.4 ㎖의 리포솜 현탁액으로 충전되고(연속적인 교반 하에서) 동결 및 친액성화를 위하여 부분적으로 닫는다.
(5) 친액성화, 패키징, 및 라벨링
바이알들은 친액성화가 진행될 때까지 -80℃±5℃에서 동결된다. 친액성화 과정은 -45℃ 내지 25℃ 온도 범위 및 0.150 밀리바에서 실행된다. 과정은 24시간 동안 지속된다. 친액성화의 끝에 바이알들은 N2 대기에서 완전히 마개로 막아지고, 밀봉되고, 라벨링되며, 5℃±3℃에서 저장된다.
실시 예 12: LTB1 에 대한 보조 치료는 25 ㎍의 결핵균 세포들의 단편들의 단일 처리만 필요할 것이다
이소니아지드의 1달 치료를 받은 후에 팔(arm) 당 n=12의 그룹들에서 무작위로 할당된 잠복기 결핵 감염(LTB1) (피부 튜베르쿨린 검사 양성 및 퀀티페론 양성)을 갖는 인간 면역결핍 양성과 인간 면역결핍 음성 대상들에서 결핵균 세포들의 단편들(각각 본 발명을 수행하는 바람직한 방식에서 설명된 것과 같이 제조된, 5, 25, 50 ㎍) 및 플라시보(placebo)의 3회 투여를 평가하기 위하여 상 Ⅱ 이중맹(double blind) 무작위 임상 시험이 설정되었다. 대상들은 결핵균-복합체 균주(각각 본 발명을 수행하는 바람직한 방식에서 설명된 것과 같이 제조된, 5, 25, 50 ㎍)로 2회 접종되었고, 그 다음에 즉시 이소니아지드 화학요법이 4주 떨어져 수행되었다.
면역 프로파일:
결핵균 세포들의 단편들(각각 본 발명을 수행하는 바람직한 방식에서 설명된 것과 같이 제조된, 5, 25, 50 ㎍)는 모든 투여량(도 12 및 13)에서 유도된 분비(ESAT-6, Ag85B) 및 구조적(16 kDa, 38 kDa) 항원들에 대한 종형(bell-shaped)의, 다발 항원 반응을 유도하였다. 결핵균 세포들의 단편들(각각 본 발명을 수행하는 바람직한 방식에서 설명된 것과 같이 제조된, 5, 25, 50 ㎍)는 또한 예방 효과와 일치하는, 더 높은 투여량에서 장기간 기억 반응을 유도하였다(세계 보건 기구 검사). 놀랍게도, 전체적으로 면역 반응들은 인간 면역결핍 양성보다 인간 면역결핍 음성에서 더 강력하였으나. 결핵균 세포들의 단편들(각각 본 발명을 수행하는 바람직한 방식에서 설명된 것과 같이 제조된, 5, 25, 50 ㎍)의 25 ㎍의 단일 접종이 두 개체군에서 최상의 면역 반응을 유도하였다(도 12 및 13).
결론: 인간 면역결핍 바이러스 양성 및 인간 면역결핍 바이러스 음성 대상들에서 잠복기 결핵 감염에 대한 보조 치료를 위하여 25 ㎍의 단일 접종이 최상의 선택이다.
Figure 112013069688263-pct00011
NATIONAL COLLECTION OF TYPE CULTURES NCTC13536 20101203

Claims (29)

  1. (a) 결핵균-복합체 균주로부터의 단편들;
    (b) 수소화되거나, 부분적으로 수소화되거나 또는 비수소화된 인지질;
    (c) 1 내지 20%(w/w) 수크로오스;를 포함하되,
    입자들의 z-평균 크기는 120㎚ 이하인 것을 특징으로 하는 리포솜 제형.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 입자들의 z-평균 크기는 40 내지 110㎚ 범위인 것을 특징으로 하는 리포솜 제형.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 리포솜 제형은 에멀전인 것을 특징으로 하는 리포솜 제형.
  4. 제1항에 있어서, 상기 입자들의 다분산도 지수는 0.4 이하인 것을 특징으로 하는 리포솜 제형.
  5. 제1항에 있어서, 상기 결핵균-복합체 균주는 독성 결핵균-복합체 균주인 것을 특징으로 하는 리포솜 제형.
  6. 제1항에 있어서, 부가적으로 (d) 장력활성제 또는 (e) 하나 이상의 계면활성제를 포함하는 것을 특징으로 하는 리포솜 제형.
  7. 제1항에 있어서, 상기 결핵균-복합체 균주의 단편들은 세포벽 단편들이거나 또는 상기 세포벽 단편들을 포함하는 것을 특징으로 하는 리포솜 제형.
  8. 제 6항에 있어서, 상기 (a) 및 상기 (d) 사이의 비율은 0.05:1 및 1:5(w/w) 사이인 것을 특징으로 하는 리포솜 제형.
  9. 삭제
  10. 제 6항에 있어서, 상기 장력활성제는 콜레이트, 데옥시콜레이트, 콜레스테롤 및 콜레스테롤 헤미숙신산염으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 리포솜 제형.
  11. 제5항에 있어서, 2010년에 런던의 NCTC에 수탁된, 결핵균-복합체 균주 NCTC 13536의 단편들을 포함하는 것을 특징으로 하는 리포솜 제형.
  12. 제1항에 있어서,
    (ⅰ) 황산도데실나트륨 폴리아크릴아미드 겔 상의 전기영동에 따라 측정했을 때 70 kDa의 분자량을 가지며, 결핵균 HSP70 단백질(Rv0350)의 질량 지문을 갖는 제1 폴리펩티드,
    (ⅱ) 황산도데실나트륨 폴리아크릴아미드 겔 상의 전기영동에 따라 측정했을 때 38 kDa의 분자량을 가지며, 결핵균 38 kDa 단백질(Rv0934)의 질량 지문을 갖는 제2 폴리펩티드,
    (ⅲ) 황산도데실나트륨 폴리아크릴아미드 겔 상의 전기영동에 따라 측정했을 때 30 kDa의 분자량을 가지며, 결핵균 Ag85B 단백질(Rv 1866c)의 질량 지문을 갖는 제3 폴리펩티드,
    (ⅳ) 황산도데실나트륨 폴리아크릴아미드 겔 상의 전기영동에 따라 측정했을 때 10 kDa의 분자량을 가지며, 결핵균 CFP10 단백질(Rv3874)의 질량 지문을 갖는 제4 폴리펩티드, 및
    (ⅴ) 황산도데실나트륨 폴리아크릴아미드 겔 상의 전기영동에 따라 측정했을 때 6 kDa의 분자량을 가지며, 결핵균 ESAT-6 단백질(Rv3875)의 질량 지문을 갖는 제 5 폴리펩티드,
    중에서 적어도 두 가지를 포함하는 것을 특징으로 하는 리포솜 제형.
  13. 제1항에 있어서, 다음의 결핵균의 항원들 중 적어도 하나, 또는 그것들의 단편이 존재하는 것을 특징으로 하는 리포솜 제형: HSP70, 38 kDa 단백질 및 Ag85B.
  14. 제1항에 있어서, 하나 또는 그 이상의 미콜산 또는 당-복합 미콜레이트를 포함하는 것을 특징으로 하는 리포솜 제형.
  15. 제6항에 있어서, 계면활성제는 비이온 계면활성제를 포함하는 것을 특징으로 하는 리포솜 제형.
  16. 제1항에 있어서, 부가적으로 하나 또는 그 이상의 염 또는 그것들의 용액을 포함하는 것을 특징으로 하는 리포솜 제형.
  17. 제1항에 있어서, 상기 리포솜 제형은 동결 건조되는 것을 특징으로 하는 리포솜 제형.
  18. 수성 용제에서 재구성된, 제1항 내지 제8항, 제10항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 리포솜 제형을 포함하는 현탁액.
  19. 제1항 내지 제8항, 제10항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 리포솜 제형, 및 약학적으로 수용가능한 캐리어, 희석제, 또는 약학적으로 수용가능한 보조제를 포함하는 약학 조성물
  20. 제1항 내지 제8항, 제10항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제형은 결핵을 치료하거나 예방하기 위한 것을 특징으로 하는 리포좀 제형.
  21. 제19항에 있어서, 상기 조성물은 결핵을 치료하거나 예방하기 위한 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 상기 조성물은
    (a) 잠복기 결핵 감염을 갖는 개인들에서 활성 결핵의 예방을 위한 것;
    (b) 질환에 노출되었으나 아직 감염되지 않은 개인들의 감염을 예방하기 위하여 결핵의 일차 예방을 위한 것; 또는
    (c) 잠복기 결핵을 치료하거나 예방을 위한 것;으로부터 선택되는, 약학 조성물.
  23. 제21항에 있어서, 인체에 투여되는 단일 투여량은 1 내지 1000㎍ 결핵균 세포들의 단편들인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 인체에 투여되는 단일 접종 투여량은 25㎍ 결핵균 세포들의 단편들인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  25. 제21항에 있어서, 항생물질과 병용 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  26. 제24항에 있어서, 보조 치료에서 사용되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 인간 면역결핍 바이러스 양성 환자에 대한 보조 치료에 투여되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  28. 제24항에 있어서, 인간 면역결핍 바이러스 음성 인간 대상에 투여되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  29. 삭제
KR1020137020385A 2011-01-04 2012-01-04 결핵을 치료하거나 예방하는데 적합한 리포솜 제형 KR101820026B1 (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP11150072A EP2471511A1 (en) 2011-01-04 2011-01-04 Liposome formulation suitable for treating or preventing tuberculosis
EP11150072.4 2011-01-04
EP11183487 2011-09-30
EP11183487.5 2011-09-30
PCT/EP2012/050080 WO2012093137A1 (en) 2011-01-04 2012-01-04 Liposome formulation suitable for treating or preventing tuberculosis

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20140021538A KR20140021538A (ko) 2014-02-20
KR101820026B1 true KR101820026B1 (ko) 2018-01-18

Family

ID=45509459

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020137020385A KR101820026B1 (ko) 2011-01-04 2012-01-04 결핵을 치료하거나 예방하는데 적합한 리포솜 제형

Country Status (18)

Country Link
US (1) US9877917B2 (ko)
EP (1) EP2661253B1 (ko)
JP (1) JP6096675B2 (ko)
KR (1) KR101820026B1 (ko)
CN (2) CN107296793A (ko)
BR (1) BR112013017267B1 (ko)
CA (1) CA2823747C (ko)
CO (1) CO6801728A2 (ko)
ES (1) ES2631556T3 (ko)
HU (1) HUE032409T2 (ko)
IL (1) IL227338B (ko)
LT (1) LT2661253T (ko)
MX (1) MX341918B (ko)
PL (1) PL2661253T3 (ko)
RU (1) RU2648842C2 (ko)
SI (1) SI2661253T1 (ko)
WO (1) WO2012093137A1 (ko)
ZA (1) ZA201305697B (ko)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103720657B (zh) * 2013-11-19 2017-01-04 广东丸美生物技术股份有限公司 一种可变形脂质体的制备方法，及其制备的可变性脂质体
JP2016163851A (ja) * 2015-03-06 2016-09-08 国立大学法人福井大学 コンポジット型可溶化ナノリポソーム及びその製造方法
RU2631607C1 (ru) * 2016-11-22 2017-09-25 Владислав Николаевич Ласкавый Средство для профилактики лейкоза крупного рогатого скота и способ его применения
GB201707700D0 (en) * 2017-05-12 2017-06-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Dried composition
CN109675059A (zh) * 2019-01-23 2019-04-26 青岛大学 一种类杆菌脂质体及其制备方法与应用
WO2020206307A1 (en) * 2019-04-05 2020-10-08 Northwestern University Multi-subunit vaccines to elicit both mhc- and cd1-restricted t cell responses
WO2023062066A1 (en) * 2021-10-14 2023-04-20 Archivel Farma, S.L. Liposome formulations for treatment of active tuberculosis

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0811075B1 (en) 1995-02-22 2008-05-14 Adcock Ingram Limited A method for the isolation and purification of lipid cell-wall components
GB9813100D0 (en) 1998-06-18 1998-08-19 Secr Defence Method of forming liposomes
US20030022854A1 (en) * 1998-06-25 2003-01-30 Dow Steven W. Vaccines using nucleic acid-lipid complexes
CA2453173C (en) 2001-07-04 2013-12-10 Health Protection Agency Mycobacterial antigens expressed during latency
BR0103887C1 (pt) 2001-07-17 2005-11-08 Univ Minas Gerais Composições imunogênicas contendo microesferas biodegradáveis encapsulando antìgenos, vetores gênicos e adjuvantes
ES2231037B1 (es) * 2003-10-31 2005-12-16 Archivel Technologies, Sl Agente inmunoterapico util para el tratamiento combinado de la tuberculosis en asociacion con otros farmacos.
WO2006088492A2 (en) 2004-07-01 2006-08-24 The Regents Of The University Of Califorrnia High throughput proteomics
CN101273055B (zh) * 2005-04-29 2016-03-16 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 用于预防或治疗结核分枝杆菌感染的新方法
CN101283085A (zh) * 2005-08-11 2008-10-08 哈佛大学的校长及成员们 用于干燥细胞形式的方法和组合物
US20070059318A1 (en) 2005-08-15 2007-03-15 Balu-Iyer Sathy V Lipid nano particulates containing antigens as cancer vaccines
US9393215B2 (en) * 2005-12-02 2016-07-19 Novartis Ag Nanoparticles for use in immunogenic compositions
TW200806317A (en) * 2006-03-20 2008-02-01 Wyeth Corp Methods for reducing protein aggregation
CA2649528A1 (en) 2006-04-20 2007-11-01 Tokai University Educational System Therapeutic agent for allergy containing liposome having oligosaccharide on its surface
WO2008127358A2 (en) 2006-10-10 2008-10-23 Jina Pharmaceuticals, Inc. Aqueous systems for the preparation of lipid-based pharmaceutical compounds; compositions, methods, and uses thereof
ES2307402B1 (es) * 2006-10-30 2009-09-30 Archivel Farma, S.L. Vacuna profilactica contra la tuberculosis.
BRPI0705630F8 (pt) * 2007-12-12 2022-01-18 Univ Estadual Campinas Unicamp Processo de produção de vacina gênica lipossomal, vacina gênica lipossomal e uso da mesma
EP2244720A4 (en) * 2008-01-11 2013-01-16 Us Gov Health & Human Serv POLYPEPTIDE VACCINE AND VACCINE STRATEGY AGAINST MYCOBACTERIUM
ES2335177B1 (es) 2008-09-19 2011-02-28 Archivel Farma, S.L. Agente inmunoterapeutico apropiado para la profilaxis primaria de la tuberculosis.
WO2010121618A1 (en) 2009-04-24 2010-10-28 Statens Serum Institut A tuberculosis tb vaccine to prevent reactivation
BR112013014598A2 (pt) * 2010-12-14 2017-09-19 Glaxosmithkline Biologicals Sa composição imunogênica, uso de uma composição imunogênica, processo para preparar uma composição imunogênica, método para a fabricação de uma composição imunogênica estável, e, kit

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AAPS PharmSciTech, June 2008, Volume 9, Issue 2, pp 335-341*
European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, Volume 76, Issue 3, November 2010, Pages 404-412*

Also Published As

Publication number Publication date
ZA201305697B (en) 2014-07-30
BR112013017267A2 (pt) 2018-01-09
SI2661253T1 (sl) 2017-07-31
CN103796640A (zh) 2014-05-14
CN107296793A (zh) 2017-10-27
PL2661253T3 (pl) 2017-08-31
RU2648842C2 (ru) 2018-03-28
CA2823747A1 (en) 2012-07-12
MX2013007855A (es) 2013-10-25
CO6801728A2 (es) 2013-11-29
LT2661253T (lt) 2017-05-25
ES2631556T3 (es) 2017-09-01
WO2012093137A9 (en) 2012-12-27
CA2823747C (en) 2019-07-23
US20150050327A1 (en) 2015-02-19
WO2012093137A1 (en) 2012-07-12
BR112013017267B1 (pt) 2021-06-22
JP2014501768A (ja) 2014-01-23
KR20140021538A (ko) 2014-02-20
IL227338B (en) 2019-01-31
EP2661253B1 (en) 2017-04-19
EP2661253A1 (en) 2013-11-13
HUE032409T2 (en) 2017-09-28
JP6096675B2 (ja) 2017-03-15
US9877917B2 (en) 2018-01-30
MX341918B (es) 2016-09-07
RU2013136379A (ru) 2015-02-10
IL227338A0 (en) 2013-09-30
BR112013017267A8 (pt) 2018-11-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101820026B1 (ko) 결핵을 치료하거나 예방하는데 적합한 리포솜 제형
US10441648B2 (en) Mycobacterium antigenic composition
US10688168B2 (en) Methods for inducing an immune response
US9682042B2 (en) MTB-C vaccine against asthma
EP2471511A1 (en) Liposome formulation suitable for treating or preventing tuberculosis
WO2023062066A1 (en) Liposome formulations for treatment of active tuberculosis

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right