KR101819567B1

KR101819567B1 - 혈관신생-매개된 질환의 치료용 화합물

Info

Publication number: KR101819567B1
Application number: KR1020157034766A
Authority: KR
Inventors: 티모시 더블유. 코슨; 할리사 디. 바사바라자파; 서승용; 이빛; 시앙 페이
Original assignee: 가천대학교 산학협력단; 인디애나 유니버시티 리서치 앤드 테크놀로지 코퍼레이션
Priority date: 2013-05-06
Filing date: 2014-05-06
Publication date: 2018-02-28
Also published as: CA2947838A1; US10738024B2; WO2014182695A1; EP2994460A1; EP2994460A4; KR20160006203A; AU2014262862A1; AU2014262862B2; US20160060241A1

Abstract

본 발명은 합성 크레마스트라논 및 크레마스트라논 유사체를 개시한다. 본 발명은 또한, 크레마스트라논 및 크레마스트라논 유사체의 합성 방법, 눈의 신생혈관형성 장애를 치료하고 혈관신생-매개된 질환을 치료하는 방법을 개시한다.

Description

혈관신생-매개된 질환의 치료용 화합물{COMPOUNDS FOR TREATMENT OF ANGIOGENESIS-MEDIATED DISEASES}

본 출원은 그 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된 2013년 5월 6일자 출원된 미국 가 특허 출원 제61/819,895호에 대한 우선권을 주장한다.

본 발명은 일반적으로 혈관신생-매개된 질환의 치료용 화합물에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 크레마스트라논(cremastranone) 유사체 및 크레마스트라논 유사체의 합성 방법에 관한 것이다.

혈관신생(angiogenesis)은 발생(development) 및 상처 회복 과정을 제외하고는 체내에서 일어나지 않는다. 그러나, 다수의 병리학적 병태 도중에 혈관신생은 특히 미숙아 망막증(ROP), 당뇨병성 망막증(DR), 및 "습성" 노인성 황반변성(AMD)과 같은 안질환에서 일어난다. 병리학적 혈관신생이 일어난 후에, 새로 형성된 혈관은 취약하고 다공성이며 충분히 분화되어 있지 않다. 눈에서 이와 같이 새로운 혈관의 형성은 신속하고 영구적인 시력 상실을 동반하는 출혈, 신속한 광수용기 변성, 및 궁극적인 섬유증 흉터를 유발할 수 있다.

DR의 임상적 증상은 75%의 당뇨 환자에서 나타나며, 이들중 10%는 결국 시력 손상으로 발전한다. DR은 현재 미국에서 노동 연령 성인 중 실명의 주된 원인이며 법적 실명의 8%를 차지한다. 또한, 거의 2백만명의 미국인이 AMD에 걸려 있다. AMD는 미국에서 연간 54억 달러의 생산성 부담의 추정 손실을 나타낸다. 심하게 걸린 환자들은 재앙적인 뇌졸중 희생자 또는 만성적인 통증의 진행성 암환자와 비교하여 매우 열등한 삶의 질을 갖는다.

AMD에 대해 확립된 치료 양식으로는 베르테포르핀(verteporfin)과 함께 열레이저 광응고법(thermal laser photocoagulation) 또는 광역학적 요법(photodynamic therapy)을 들 수 있다. 더욱 최근에는, 일부 노인성 황반변성 환자에서 시력 상실을 늦추거나 심지어 역전시키는데 페갑타닙, 라니비주맙, 아플리베르셉트 및 베바시주맙과 같은 항-혈관 내피 성장인자 요법이 성공적인 것으로 나타났다. 그러나, 상당한 급성의 전신 부작용(안구외 출혈, 심근경색 및 뇌졸중)은 이들 요법이 유리체강내로 전달되는 경우에도 안구 외부에 작용할 수 있음을 나타낸다. 눈을 멀게하는 안내 부작용도 가능하며 이들 약물의 장기 위험 부담도 여전히 불명확하다. 게다가, 이들은 생물의약품이므로, 이들 약물의 비용-편익비도 양호하지 않다. 예를 들어, 라니비주맙은 월 용량당 약 2,000 달러의 비용이 드는데, 이는 많은 환자의 경우 이러한 치료를 감당할 수 없게 만든다. 치료 중단 후 재발도 일어날 수 있으므로, 정말로 질환을 근절하는 상이한 경로를 표적으로 하는 약물 조합을 이용한 치료가 이 질환에 대한 미래의 요법으로서 선전되어 왔다.

미숙아 망막증(ROP)의 경우에도 유사한 상황이 존재한다. 미숙아 망막증(ROP)은 신생아 망막에서의 비정상적인 혈관 성장을 특징으로 한다. 질환은 2 단계로 진행된다. 제1의, 22 내지 30주 임신령의 산소과잉 단계에서는 고 산소 수준(자궁내와 비교하여 환기되는 자궁외 환경에서 경험되는 바와 같은)이 VEGF 생산의 감소 및 이에 따른 혈관형성(vascularization)의 중단을 유발한다. 제2 단계에서는, 광수용기가 성숙하고 무혈관 망막이 성장하여 저산소성으로 되어 VEGF 생산을 촉발한다. VEGF는 발생중에 정상적인 혈관 성장의 신호전달에 필수적이지만, 고수준으로 비정상적으로 발현되는 경우 부적절한 신생혈관 성장을 초래한다. 유리체 내로 뻗은 신생혈관은 망막벽에 산소를 공급하지 못하고 쉽게 파열되어 망막 신경절 세포 및 광수용기 손실, 망막 박리 및 실명에 이르게 된다.

2010년에, 미국에서 12%의 소아가 미숙아로 출생하고, 1.5%는 매우 적은 출생시 체중을 나타냈다(very low birth weight, VLBW; ≤1500 g). 이들 VLBW 유아 중의 거의 70%가 ROP로 발전하기 쉬우며, 이는 산후 산소과잉에의 노출 후 비정상적 혈관신생에 의해 유발된다. 이 질환은 미국에서 연간 1300 명의 소아에게 시력 상실을 유발하고 추가로 연간 500 명의 소아에게 심각한 시력 손상을 유발하는 것으로 추정된다. 전반적으로, 6% 내지 18%의 소아 실명이 ROP에 기인할 수 있다. 게다가, 신생아 집중 치료의 개선으로 인하여 중진국에서 더욱 많은 소아들이 조산으로부터 생존함에 따라, ROP는 전세계적으로 더욱 보편적으로 되고 있다. 실명의 급성 위험 이외에, 소아기 및 심지어 성인에서도, ROP 생존자들은 일반적인 개체군보다 더욱 후안부 병리, 망막 박리, 근시, 약시, 사시, 초기 백내장 및 녹내장에 걸리기 쉽다.

특히 이들 약물은 국소적으로 전달되는 경우에도 전신 작용을 나타낼 수 있으므로, 생물의약품 치료가 비록 미숙아 망막증에 효과적이며 외과적 치료에 비해 부작용이 적다 할지라도, 신생아에 있어서의 지속적인 독성 또는 발생 효과에 대한 상당한 염려가 남아 있다. 따라서, 기존의 접근법을 보완하고 저용량의 조합 요법을 허용하기 위하여, 안구내 신생혈관형성 장애뿐 아니라 기타 혈관신생-매개된 질환을 치료하기 위한 신규한 소분자에 대해 매우 중요하며 충족되지 않은 요구가 존재한다.

난초과 구성원인 Cremastra appendiculata(D. Don)의 구근은 동아시아의 전통적인 의약이며, 내부적으로는 여러 가지 암을 치료하는데 그리고 외부적으로는 피부 병변에 사용되어 왔다. 여러 천연 산물들이 이 식물로부터 추출되었으나, 아마도 이들 중 가장 흥미로운 것은 기존에 일반명 "호모이소플라바논"으로 공지된 크레마스트라논으로 알려진 화합물일 것이다(도 1). 크레마스트라논 1인 5,7-디하이드록시-3-(3-하이드록시-4-메톡시벤질)-6-메톡시크로만-4-온은 공지의 호모이소플라바논 소 그룹의 구성원이며, 또한 히아신스과의 구성원으로부터 분리되었다.

크레마스트라논은 G2/M 상 세포 주기 정지를 통해 매개되는 인간 탯줄 혈관 내피 세포(human umbilical vein endothelial cell; HUVEC) 증식 차단의 원인이 되는 C. appendiculata 구근의 성분으로 동정되었다. 크레마스트라논의 항-증식 메카니즘의 단서는 천연 공급원 화합물이 사이클린-의존성 키나제 Cdc2(CDK1)의 저해제인 p21^WAF1(CDKN1A)의 발현을 유도하고, 이는 결과적으로 크레마스트라논에 의해 다운-조절된다는 발견으로부터 나왔다. 크레마스트라논은 또한 정제된 효소들로서 사이클로옥시게나제 1 및 2의 작용에 대한 뚜렷한 효과 없이 마이크로좀 어세이에서 아라키돈산으로부터의 프로스타글란딘 합성을 차단하였다. 사이클로옥시게나제 2 발현에 대한 저해는 적어도 크레마스트라논이 항-염증 효과를 보이는 시스템인 UV 방사선에 노출된 각질세포에서 이러한 발견에 대한 설명이 될 수 있다. 이러한 맥락에서, 크레마스트라논은 또한 미토겐 활성화 단백질 키나제(MAPK), 준 N-말단 키나제(JNK), p38^MAPK, 및 세포외 시그널 조절 키나제(ERK)의 인산화를 감소시킨다. 이는 또한 NF-κB의 핵 전위, 및 TNF-α, IL-6 및 IL-8뿐 아니라 반응성 산소종(ROS)의 생성을 차단한다.

천연 크레마스트라논은 생체내 혈관신생도 저해하였다. 병아리의 융모요막 모델에서, 크레마스트라논은 bFGF에 의해 유도되는 신규 혈관 성장을 차단함에 있어 레티노산만큼 효과적이었다. 크레마스트라논은 또한, 미숙아 망막증의 산소-유도된 망막증 모델 및 맥락막 신생혈관형성의 레이저 광응고법 쥐과 모델에서의 병원성 신생혈관형성을 차단하는데 효능을 보였다. 이들 모델은 이러한 안구내 신생혈관성 장애에서 치료 평가에 광범위하게 사용된다. 부가적으로, 정상적인 성체 마우스의 유리체 내로 10 μM의 크레마스트라논을 주사하면 망막에 세포독성 또는 염증성 효과를 보이지 않을뿐 아니라 망막 세포의 세포자멸(apoptosis)도 유도하지 않았다.

전기 사실들을 기초로 할 때, 합성 크레마스트라논을 생산하고, 안구내 및 기타 신생혈관성 장애를 치료하기 위한 기존의 접근법들을 보완하기 위해 부가적인 소 분자 항-혈관신생 요법을 개발하는 것은 매우 유리할 것이다. 이들 분자가 천연 크레마스트라논 못지 않게 또는 더욱 양호하게 작용한다면 이는 더욱 유리할 것이다.

본 발명은 일반적으로 합성 화합물, 및 특히 유기적으로 합성된 크레마스트라논 및 크레마스트라논 유사체에 관한 것이다. 부가적으로, 본 발명은 화합물을 유기적으로 합성하는 방법에 관한 것이다. 호모이소플라바논의 구조는 C 환의 C-3 위치에 치환된 벤질기를 동반하는 크로마논을 포함한다. 이들 중에서, C. appendiculata에서 추출된 크레마스트라논 1은 각각 C-5 및 C-7 위치에 디하이드록시 및 C-6 위치에 메톡시를 포함하고, 크로마논의 C-3 위치에 3'-하이드록시-4'-메톡시벤질기를 동반하는 독특한 호모이소플라바논이다. 이제 본 발명자들은 놀랍게도 크레마스트라논 1, 크레마스트라논 이성체 SH-11052(2) 및 그의 추출된 천연 형태의 크레마스트라논 1과 비교하여 유사하고 일부 실시양태에서는 훨씬 뛰어난 효능을 나타내는 기타 크레마스트라논 유사체들과 같은 화합물을 유기적으로 합성하는 방법을 발견하였다. 본 명세서에서 사용된 "합성된" 또는 "유기적으로 합성된" 또는 "화학적으로 합성된" 또는 "유기적으로 합성하는" 또는 "화학적으로 합성하는" 또는 "유기적 합성" 또는 "화학적 합성"은 일련의 화학적 반응을 통해 화합물을 제조함을 지칭하는데 사용되며; 이는 화합물, 예를 들어, 크레마스트라논을 천연 공급원으로부터 추출함을 포함하지 않는다.

일 측면에서, 본 발명은 화학식 (I)의 합성 화합물에 관한 것이다:

상기 식에서 R₁, R₂, R₃, R₄, 및 R₅는 수소, 하이드록실, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬 카보닐옥시, 치환된 알킬 카보닐옥시, 알킬 카보닐, 치환된 알킬 카보닐, 아릴 카보닐옥시, 치환된 아릴 카보닐옥시, 할로겐, 아미노, 니트로, 하이드로카빌 및 치환된 하이드로카빌로 구성된 그룹 중에서 독립적으로 선택되고; X, Y, 및 Z는 탄소, 질소, 및 산소로 구성된 그룹 중에서 독립적으로 선택된다.

다른 측면에서, 본 발명은 화학식 (II)의 합성 화합물에 관한 것이다:

상기 식에서 R₁, R₂, R₃, R₄, 및 R₅는 수소, 하이드록실, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬 카보닐옥시, 치환된 알킬 카보닐옥시, 알킬 카보닐, 치환된 알킬 카보닐, 아릴 카보닐옥시, 치환된 아릴 카보닐옥시, 할로겐, 아미노, 니트로, 하이드로카빌 및 치환된 하이드로카빌로 구성된 그룹 중에서 독립적으로 선택되고; X는 탄소 및 질소로 구성된 그룹 중에서 선택된다.

다른 측면에서, 본 발명은 화학식 (III)의 합성 화합물에 관한 것이다:

상기 식에서 R₁, R₂, R₃, R₄, 및 R₅는 수소, 하이드록실, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬 카보닐옥시, 치환된 알킬 카보닐옥시, 알킬 카보닐, 치환된 알킬 카보닐, 아릴 카보닐옥시, 치환된 아릴 카보닐옥시, 할로겐, 아미노, 니트로, 하이드로카빌 및 치환된 하이드로카빌로 구성된 그룹 중에서 독립적으로 선택된다.

다른 측면에서, 본 발명은 화학식 (IV)의 합성 화합물에 관한 것이다:

다른 측면에서, 본 발명은 화학식 (V)의 합성 화합물에 관한 것이다:

다른 측면에서, 본 발명은 화학식 (VI)의 합성 화합물에 관한 것이다:

상기 식에서 R₁, R₂, R₃, R₄, 및 R₅는 수소, 하이드록실, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬 카보닐옥시, 치환된 알킬 카보닐옥시, 알킬 카보닐, 치환된 알킬 카보닐, 아릴 카보닐옥시, 치환된 아릴 카보닐옥시, 할로겐, 아미노, 니트로, 하이드로카빌 및 치환된 하이드로카빌로 구성된 그룹 중에서 독립적으로 선택되고; R₆는 수소 및 치환된 하이드로카빌로 구성된 그룹 중에서 선택된다.

다른 측면에서, 본 발명은 화학식 (VII)의 합성 화합물에 관한 것이다:

상기 식에서 R₁, R₂, R₃, R₄, 및 R₅는 수소, 하이드록실, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬 카보닐옥시, 치환된 알킬 카보닐옥시, 알킬 카보닐, 치환된 알킬 카보닐, 아릴 카보닐옥시, 치환된 아릴 카보닐옥시, 할로겐, 아미노, 니트로, 하이드로카빌 및 치환된 하이드로카빌로 구성된 그룹 중에서 독립적으로 선택되고; X는 탄소, 질소, 및 산소로 구성된 그룹 중에서 선택된다.

다른 측면에서, 본 발명은 화학식 (VIII)의 합성 화합물에 관한 것이다:

다른 측면에서, 본 발명은 화학식 (III)의 디하이드로칼콘을 합성하는 방법에 관한 것이다:

상기 식에서 R₁, R₂, R₃, R₄, 및 R₅는 수소, 하이드록실, 알콕시, 치환된 알콕시, 할로겐, 아미노, 니트로, 하이드로카빌 및 치환된 하이드로카빌로 구성된 그룹 중에서 독립적으로 선택된다. 방법은 6'-하이드록시-2',3',4'-삼치환된-아세토페논을 치환되거나 비치환된 벤즈알데히드와 축합시켜 칼콘을 형성하는 단계; 및 활성탄 위의 Pd 및 H₂하에 칼콘을 환원시켜 디하이드로칼콘을 형성하는 단계를 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명은 화학식 (I)의 화합물을 합성하는 방법에 관한 것이다:

상기 식에서 R₁, R₂, R₃, R₄, 및 R₅는 수소, 하이드록실, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬 카보닐옥시, 치환된 알킬 카보닐옥시, 알킬 카보닐, 치환된 알킬 카보닐, 아릴 카보닐옥시, 치환된 아릴 카보닐옥시, 할로겐, 아미노, 니트로, 하이드로카빌 및 치환된 하이드로카빌로 구성된 그룹 중에서 독립적으로 선택되고; X, Y, 및 Z는 탄소, 질소, 및 산소로 구성된 그룹 중에서 독립적으로 선택된다. 방법은 6'-하이드록시-2',3',4'-트리메톡시-아세토페논을 치환되거나 비치환된 벤즈알데히드와 축합시켜 칼콘을 형성하는 단계; 칼콘을 활성탄 위의 Pd 및 H₂하에 환원시켜 디하이드로칼콘을 형성하는 단계; 디하이드로칼콘을 포르말린 및 NaOH를 사용하여 하이드록시메틸화 및 폐환시켜 크로마논 혼합물을 형성하는 단계; 하이드록시메틸기를 제거하여 화학식 (IX)의 일치환된 크로마논을 형성하는 단계; 및 화학식 (IX)의 크로마논을 탈메틸화하는 단계를 포함한다:

상기 식에서 R은 수소 또는 하이드록시메틸이고, R₁및R₂는 수소, 하이드록실, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬 카보닐옥시, 치환된 알킬 카보닐옥시, 알킬 카보닐, 치환된 알킬 카보닐, 아릴 카보닐옥시, 치환된 아릴 카보닐옥시, 할로겐, 아미노, 니트로, 하이드로카빌 및 치환된 하이드로카빌로 구성된 그룹 중에서 독립적으로 선택된다. 일 특정 측면에서, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 화학식 (2)의 화합물(SH-11052)에 관한 것이다:

또 다른 측면에서, 본 발명은 화학식 (X)의 디하이드로칼콘을 합성하는 방법에 관한 것이다:

상기 식에서 R₄및R₅는 수소, 하이드록실, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬 카보닐옥시, 치환된 알킬 카보닐옥시, 알킬 카보닐, 치환된 알킬 카보닐, 아릴 카보닐옥시, 치환된 아릴 카보닐옥시, 할로겐, 아미노, 니트로, 하이드로카빌 및 치환된 하이드로카빌로 구성된 그룹 중에서 독립적으로 선택된다. 방법은 6'-하이드록시-2',3',4'-트리메톡시-아세토페논을 치환되거나 비치환된 벤즈알데히드와 축합시켜 칼콘을 형성하는 단계; 칼콘을 활성탄 위의 Pd 및 H₂하에 환원시켜 디하이드로칼콘을 형성하는 단계; 디하이드로칼콘을 N,N-디메틸포름아미드 및 루이스산과 축합시켜 화학식 (X)의 크로몬을 형성하는 단계; 및 화학식 (X)의 크로몬을 탈메틸화하는 단계를 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상의 신생혈관성 안질환(neovascular eye disease)을 치료하는 방법에 관한 것이다. 방법은 치료적 유효량의 화학식 (I)의 합성 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 투여하는 단계를 포함한다:

또 다른 측면에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상의 신생혈관성 안질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 방법은 치료적 유효량의 화학식 (II)의 합성 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 투여하는 단계를 포함한다:

또 다른 측면에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상의 신생혈관성 안질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 방법은 치료적 유효량의 화학식 (III)의 합성 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 투여하는 단계를 포함한다:

또 다른 측면에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상의 신생혈관성 안질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 방법은 치료적 유효량의 화학식 (IV)의 합성 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 투여하는 단계를 포함한다:

또 다른 측면에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상의 신생혈관성 안질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 방법은 치료적 유효량의 화학식 (V)의 합성 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 투여하는 단계를 포함한다:

또 다른 측면에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상의 신생혈관성 안질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 방법은 치료적 유효량의 화학식 (VI)의 합성 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 투여하는 단계를 포함한다:

또 다른 측면에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상의 신생혈관성 안질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 방법은 치료적 유효량의 화학식 (VII)의 합성 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 투여하는 단계를 포함한다:

또 다른 측면에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상의 신생혈관성 안질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 방법은 치료적 유효량의 화학식 (VIII)의 합성 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 투여하는 단계를 포함한다:

또 다른 측면에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상의 혈관신생-매개된 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 방법은 치료적 유효량의 화학식 (I)의 합성 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 투여하는 단계를 포함한다:

또 다른 측면에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상의 혈관신생-매개된 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 방법은 치료적 유효량의 화학식 (II)의 합성 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 투여하는 단계를 포함한다:

또 다른 측면에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상의 혈관신생-매개된 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 방법은 치료적 유효량의 화학식 (III)의 합성 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 투여하는 단계를 포함한다:

또 다른 측면에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상의 혈관신생-매개된 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 방법은 치료적 유효량의 화학식 (IV)의 합성 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 투여하는 단계를 포함한다:

또 다른 측면에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상의 혈관신생-매개된 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 방법은 치료적 유효량의 화학식 (V)의 합성 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 투여하는 단계를 포함한다:

또 다른 측면에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상의 혈관신생-매개된 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 방법은 치료적 유효량의 화학식 (VI)의 합성 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 투여하는 단계를 포함한다:

또 다른 측면에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상의 혈관신생-매개된 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 방법은 치료적 유효량의 화학식 (VII)의 합성 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 투여하는 단계를 포함한다:

또 다른 측면에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상의 혈관신생-매개된 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 방법은 치료적 유효량의 화학식 (VIII)의 합성 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 투여하는 단계를 포함한다:

또 다른 측면에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상의 염증-매개된 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 방법은 치료적 유효량의 화학식 (I)의 합성 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물의 투여 단계를 포함한다:

또 다른 측면에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상의 염증-매개된 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 방법은 치료적 유효량의 화학식 (II)의 합성 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 투여하는 단계를 포함한다:

또 다른 측면에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상의 염증-매개된 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 방법은 치료적 유효량의 화학식 (III)의 합성 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 투여하는 단계를 포함한다:

또 다른 측면에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상의 염증-매개된 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 방법은 치료적 유효량의 화학식 (IV)의 합성 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 투여하는 단계를 포함한다:

또 다른 측면에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상의 염증-매개된 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 방법은 치료적 유효량의 화학식 (V)의 합성 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 투여하는 단계를 포함한다:

또 다른 측면에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상의 염증-매개된 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 방법은 치료적 유효량의 화학식 (VI)의 합성 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 투여하는 단계를 포함한다:

또 다른 측면에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상의 염증-매개된 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 방법은 치료적 유효량의 화학식 (VII)의 합성 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 투여하는 단계를 포함한다:

또 다른 측면에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상의 염증-매개된 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 방법은 치료적 유효량의 화학식 (VIII)의 합성 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 투여하는 단계를 포함한다:

하기 상세한 설명을 고려하면, 본 발명이 더 잘 이해될 것이며 상기 설명된 것들 이외의 특징, 측면, 및 이점이 자명해질 것이다. 이러한 상세한 설명은 하기 도면을 참조한다.
도 1은 C. appendiculata로부터 추출되고 본 발명의 일 합성 방법을 사용하여 합성적으로 제조된 천연 크레마스트라논 1의 화학 구조를 도시한다.
도 2는, 실시예 1에 논의된 바와 같이, 크레마스트라논 1의 합성을 예시하는 도식이다.
도 3은, 실시예 2 내지 4에 논의된 바와 같이, 크레마스트라논 이성체 2 및 기타 유사체의 합성을 예시하는 도식이다.
도 4는, 실시예 5 내지 7에 논의된 바와 같이, 크레마스트라논 유사체의 합성을 예시하는 도식이다.
도 5는, 실시예 8에 논의된 바와 같이, 바이오티닐화 화합물의 합성을 예시하는 도식이다.
도 6a 내지 6d는, 실시예 9에 논의된 바와 같이, HUVEC(도 6a 및 도 6c) 및 HREC(human retinal microvascular endothelial cell)(도 6b 및 도 6d)의 증식에 대한 합성 크레마스트라논(1)(도 6a 및 도 6b) 및 SH-11052(2)(도 6c 및 도 6d)의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 7a 내지 7d는, 실시예 9에 논의된 바와 같이, 내피 세포에서의 DNA 합성에 대한 SH-11052(2)의 효과를 나타낸다. 구체적으로, 표시된 농도의 SH-11052(2) 및 EdU 펄스로 처리한 후에, HUVEC(도 7a, 도 7b) 및 HREC(도 7c, 도 7d)를 DAPI(핵에 대해)로 염색하고 클릭-iT(Click-iT) 키트를 사용하여 EdU를 혼입시켰다(증식하는 세포 내에). 커버슬립의 6개의 상이한 시야로부터 세포를 계수하고, 이미지J(ImageJ) 분석 소프트웨어를 사용하여 각각의 섹션 내의 EdU 염색된 세포 대 DAPI 염색된 세포(그래프 내의 점)의 비율로부터 증식하는 HUVEC(도 7b) 및 HREC(도 7d)의 퍼센트를 계산하였다. 선은 평균 ± SEM을 나타내고 ***는 p<0.0001(던넷 사후 검정을 이용하는 ANOVA)을 나타낸다. 3회의 독립적인 실험으로부터의 대표적인 데이터.
도 8a 내지 8d는, 실시예 10에 논의된 바와 같이, 세포자멸을 야기하지 않는, 시험관내 혈관신생에 대한 SH-11052(2)의 효과를 나타낸다. (도 8a) 표시된 농도의 SH-11052(2)의 존재 하의, HREC에 의한 마트리겔(Matrigel) 상의 관 형성. (도 8b) 형성된 다각형(개방된 공간)을 계수하였다. n=3 웰의 평균 ± SEM. DMSO 대조군과 비교하여, *, p<0.05; ***, p<0.001(던넷 사후 검정을 이용하는 ANOVA). (도 8c) HREC를 표시된 농도의 SH-11052(2) 또는 스타우로스포린(staurosporine; SP)으로 처리하고 DAPI(핵에 대해) 및 활성화된 캐스파제-3 항체로 염색하였다. (도 8d) 이미지J 소프트웨어를 사용하여, 총 세포와 비교한 캐스파제(도 8c에 원으로 표시) 염색된 세포의 계수에 의해 세포자멸을 겪는 HREC의 퍼센트를 계산하였다. 3개의 상이한 섹션으로부터의 세포의 평균 ± SEM; 2회의 독립적인 실험으로부터의 대표적인 데이터. DMSO 대조군과 비교하여, ***p<0.001(던넷 사후 검정을 이용하는 ANOVA).
도 9a 내지 9e는, 실시예 11에 논의된 바와 같이, TNF-α 매개된 NF-κB 신호전달에 대한 SH-11052(2)의 효과를 나타낸다. (도 9a) HREC를 표시된 농도의 SH-11052(2)로 처리한 후에, 면역형광에 의해 p65를 검출하고 DAPI로 핵을 염색하였다. 3회의 독립적인 실험으로부터의 대표적인 데이터. (도 9b) 표시된 농도의 SH-11052(2)의 존재 하의 TNF-α 처리 후에 면역블로팅에 의해 IκB-α의 단백질 수준을 측정하였다. (도 9c 및 도 9e) 퀀터티 원(Quantity One) 소프트웨어를 사용하여 밀도측정을 실행하고 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism)을 사용하여 분석하였다. 선은 3회의 생물학적 반복의 평균 ± SEM을 나타내고, *는 TNF-α 처리와 비교하여 p<0.05를 나타낸다(던넷 사후 검정을 이용하는 ANOVA).
도 10a 내지 10c는, 실시예 12에 논의된 바와 같이, NF-κB 표적 유전자의 발현에 대한 SH-11052(2)의 효과를 나타낸다. (도 10a) TNF-α ± SH-11052(2)에 노출된 HREC에서 면역형광에 의해 내피 세포 활성화 표지자 VCAM-1(원으로 표시)을 검출하였다. (도 10b) TNF-α 및 표시된 농도의 SH-11052(2)의 존재 하의 VCAM-1 염색의 메타모프(MetaMorph) 형광 강도 분석, n=5 시야의 평균 ± SEM; DMSO 대조군과 비교하여, *, p<0.05 **, p<0.01(던넷 사후 검정을 이용하는 ANOVA); 2회의 독립적인 실험으로부터의 대표적인 데이터. (도 10c) 택맨(TaqMan) 탐침을 사용하는 qRT-PCR은, 모두 TNF-α에 의해 유도된, NF-κB 표적 유전자 IL8(인터류킨-8)(상단 패널), CCL2(MCP-1), 및 PTGS2(COX2)(하단 패널)의 mRNA 수준이 SH-11052(2)의 존재 하에 용량 의존적 방식으로 감소하였음을 나타냈다. 상이한 y-축 눈금에 유의한다. n=3 반복의 평균 ± SEM을 나타냄; 2회의 독립적인 실험으로부터의 대표적인 데이터.
도 11a 내지 11d는, 실시예 13에 논의된 바와 같이, VEGF 매개된 Akt 신호전달에 대한 SH-11052(2)의 효과를 나타낸다. 변화하는 농도의 SH-11052(2) 존재 하의 VEGF 자극시에 HREC에서 VEGFR2(도 11a) 및 Akt(도 11c)의 인산화를 감시하였다. (도 11b 및 도 11d) 퀀터티 원 소프트웨어를 사용하여 밀도측정을 실행하고 그래프패드 프리즘을 사용하여 분석하였다. 선은 3회의 생물학적 반복의 평균 ± SEM을 나타내고, VEGF 단독 처리와 비교하여, *는 p<0.05를 나타내고 **는 p<0.01을 나타낸다(던넷 사후 검정을 이용하는 ANOVA).
도 12는, 실시예 14에 논의된 바와 같이, 크레마스트라논 친화성 시약 16 또는 대조군 화합물 17의 화학 구조를 도시한다.
도 13은, 실시예 14에 논의된 바와 같이, 크레마스트라논 친화성 풀다운의 은-염색 SDS-겔이다.
도 14는, 실시예 15에 논의된 바와 같이, 크레마스트라논 유사체, SH-11037(6c)에 의한 HREC의 증식 저해를 나타내는 그래프이다.
도 15a는, 실시예 15에 논의된 바와 같이, 크레마스트라논 유사체, SH-11037(6c)에 의해 HREC의 관 형성이 저해됨을 나타내는 현미경 사진의 몽타주이다(n = 3 웰로부터의 % 다각형이 표시됨).
도 15b는, 실시예 15에 논의된 바와 같이, 크레마스트라논 유사체, SH-11037(6c)에 의해 HREC의 관 형성이 저해됨을 나타내는 그래프이다(n = 3 웰로부터의 % 다각형이 표시됨).
도 16a 및 16b는, 실시예 15에 논의된 바와 같이, 크레마스트라논 유사체, SH-11037(6c)이 HREC의 세포자멸을 야기하지 않았음을 예시한다.
도 17은, 실시예 15에 논의된 바와 같이, 크레마스트라논 유사체, SH-11037(6c)이 NF-κB 신호전달을 저해하지 않았음을 나타내는 면역형광 현미경 사진이다.
도 18a는, 실시예 16에 논의된 바와 같이, 크레마스트라논 유사체, SH-11037(6c)이 생체내에서 신생혈관형성을 차단했음을 나타내는 현미경 사진이다.
도 18b는, 실시예 16에 논의된 바와 같이, SWIFT_NV 분석에 의해 결정할 때, 크레마스트라논 유사체, SH-11037(6c)이 신생혈관 면적을 감소시켰음을 나타내는 그래프이다.
본 발명은 다양한 개질 및 대안적 형태가 가능하지만, 그의 특정 실시양태를 도면에 예로서 나타냈으며 본 명세서에 상세하게 하기 기재한다. 그러나, 특정 실시양태의 기재는 첨부된 특허청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 사상 및 범위 내에 들어가는 모든 개질, 등가물, 및 대안을 본 발명이 커버하는 것을 제한하고자 하는 것이 아님을 이해해야 한다.

정의

달리 표시되지 않는 한, 본 명세서에 기재된 알킬기는 바람직하게 주쇄에 1 내지 8개의 탄소 원자 및 20개 이하의 탄소 원자를 함유하는 저급 알킬이다. 이들은 직쇄 또는 분지쇄 또는 환형일 수 있으며 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 펜틸, 헥실 등을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "아미노"는 단독으로 또는 다른 기의 일부로서 임의로 하이드로카빌, 치환된 하이드로카빌 또는 치환된 헤테로원자일 수 있는 1차, 2차 또는 3차 아민을 나타낸다.

본 명세서에서 사용된 용어 "아릴" 또는 "Ar"은 단독으로 또는 다른 기의 일부로서 임의로 치환된 호모사이클릭 방향족기, 바람직하게 환 부분에 6 내지 12개 탄소를 함유하는 모노사이클릭 또는 비사이클릭기, 예컨대 페닐, 비페닐, 나프틸, 치환된 페닐, 치환된 비페닐 또는 치환된 나프틸을 나타낸다. 페닐 및 치환된 페닐이 더욱 바람직한 아릴이다.

본 명세서에서 사용된 용어 "방향족"은 단독으로 또는 다른 기의 일부로서 임의로 치환된 호모- 또는 헤테로사이클릭 방향족기를 나타낸다. 이들 방향족기는 바람직하게 환 부분에 6 내지 14개 원자를 함유하는 모노사이클릭, 비사이클릭, 또는 트리사이클릭기이다. 용어 "방향족"은 하기 정의되는 "아릴" 및 "헤테로아릴"기를 포괄한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "할로겐" 또는 "할로"는 단독으로 또는 다른 기의 일부로서 염소, 브롬, 불소, 및 요오드를 지칭한다.

용어 "헤테로원자"는 탄소 및 수소 이외의 원자를 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "헤테로사이클로" 또는 "헤테로사이클릭"은 단독으로 또는 다른 기의 일부로서 적어도 하나의 환에 적어도 하나의 헤테로원자를 갖고 각각의 환에 바람직하게 5 또는 6개의 원자를 갖는 임의로 치환되고, 완전히 포화되거나 불포화되며, 모노사이클릭 또는 비사이클릭이고, 방향족이거나 비방향족인 기를 나타낸다. 헤테로사이클로기는 환에 바람직하게 1 또는 2개의 산소 원자, 1 또는 2개의 황 원자, 및/또는 1 내지 4개의 질소 원자를 가지며, 탄소 또는 헤테로원자를 통해 분자의 나머지에 결합될 수 있다. 예시적인 헤테로사이클로로는 헤테로방향족, 예컨대 푸릴, 티에닐, 피리딜, 옥사졸릴, 피롤릴, 인돌릴, 퀴놀리닐, 또는 이소퀴놀리닐 등을 들 수 있다. 예시적인 치환기로는 하나 이상의 하기 기를 들 수 있다: 하이드로카빌, 치환된 하이드로카빌, 케토, 하이드록시, 보호된 하이드록시, 아실, 아실옥시, 알콕시, 알켄옥시, 알킨옥시, 아릴옥시, 할로겐, 아미도, 아미노, 니트로, 시아노, 티올, 케탈, 아세탈, 에스테르 및 에테르.

본 명세서에서 사용된 용어 "헤테로방향족"은 단독으로 또는 다른 기의 일부로서 적어도 하나의 환에 적어도 하나의 헤테로원자를 가지며, 각각의 환에 바람직하게 5 또는 6개의 원자를 갖는 임의로 치환된 방향족기를 나타낸다. 헤테로방향족기는 환에 바람직하게 1 또는 2개의 산소 원자, 1 또는 2개의 황 원자, 및/또는 1 내지 4개의 질소 원자를 가지며, 탄소 또는 헤테로원자를 통해 분자의 나머지에 결합될 수 있다. 예시적인 헤테로방향족으로는 푸릴, 티에닐, 피리딜, 옥사졸릴, 피롤릴, 인돌릴, 퀴놀리닐, 또는 이소퀴놀리닐 등을 들 수 있다. 예시적인 치환기로는 하나 이상의 하기 기를 들 수 있다: 하이드로카빌, 치환된 하이드로카빌, 케토, 하이드록시, 보호된 하이드록시, 아실, 아실옥시, 알콕시, 알켄옥시, 알킨옥시, 아릴옥시, 할로겐, 아미도, 아미노, 니트로, 시아노, 티올, 케탈, 아세탈, 에스테르 및 에테르.

본 명세서에서 호환적으로 사용된 용어 "탄화수소" 및 "하이드로카빌"은 배타적으로 탄소 및 수소 원소로만 구성된 유기 화합물 또는 라디칼을 기술한다. 이들 모이어티로는 알킬, 알케닐, 알키닐, 및 아릴 모이어티를 들 수 있다. 이들 모이어티는 또한 다른 지방족 또는 사이클릭 탄화수소기, 예컨대 알크아릴, 알켄아릴 및 알킨아릴에 의해 치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 및 아릴 모이어티를 포함한다. 달리 표시되지 않는 한, 이들 모이어티는 바람직하게 1 내지 20개의 탄소 원자를 포함한다.

본 명세서에 기재된 "치환된 하이드로카빌" 모이어티는 적어도 하나의 탄소 이외의 원자에 의해 치환된 하이드로카빌 모이어티, 예컨대 탄소 쇄 원자가 질소, 산소, 규소, 인, 붕소, 황, 또는 할로겐 원자와 같은 헤테로원자에 의해 치환된 모이어티이다. 이들 치환기로는 할로겐, 헤테로사이클로, 알콕시, 알켄옥시, 알킨옥시, 아릴옥시, 하이드록시, 보호된 하이드록시, 아실, 아실옥시, 아미노, 아미도, 니트로, 시아노, 케탈, 아세탈, 에스테르 및 에테르를 들 수 있다.

본 명세서에서 호환적으로 사용된 용어 "혈관신생-매개된 질환", "혈관신생-매개된 장애" 또는 "혈관신생-매개된 병태"는 혈관신생에 영향을 미치는 질환, 장애 또는 병태를 지칭하며, 전형적으로 열등한 혈관형성 또는 비정상적인 혈관구조(vasculature)를 특징으로 한다. "혈관신생-매개된 질환의 치료"는 특정 질환의 증상을 방지하거나 경감시키거나 영향을 주기 위하여 체내 새로운 혈관의 생성을 저해하거나 유도하는 것을 지칭한다.

본 명세서에서 호환적으로 사용된 용어 "염증-매개된 질환", "염증-매개된 장애", 또는 "염증-매개된 병태"는 조직 및 기관의 비정상적인 염증을 초래하는 질환, 장애 또는 병태를 지칭한다. 염증-매개된 질환으로는 알레르기 반응 및 근육병증으로부터 유발된 질환, 장애, 또는 병태를 들 수 있다. "염증-매개된 질환의 치료"는 특정 질환의 염증성 증상을 저해하거나 경감시키거나 영향을 주는 것을 지칭한다.

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 보통으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 균등한 임의의 방법 및 물질들이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있기는 하지만, 바람직한 방법 및 물질들은 하기와 같다.

합성 크레마스트라논 및 크레마스트라논 유사체

본 발명에 따라, 합성 화합물, 및 특히 유기적으로 합성된 크레마스트라논의 라세미체 및 에난티오머뿐 아니라 크레마스트라논 유사체, 및 화합물을 유기적으로 합성하는 방법이 발견되었다. 본 명세서에서 크레마스트라논 1으로 표시된, 화학적으로 합성된 크레마스트라논은 라세미체이며, [α]_D = -16의 광학 회전을 나타내는 천연 공급원으로부터 추출된 크레마스트라논과 비교하여 [α]_D = 0의 광학 회전을 나타낸다. 크레마스트라논 1 및 그의 이성체 2는 하기 화학식을 나타낸다:

합성 화합물은 놀랍게도 천연 추출된 크레마스트라논과 유사한 시험관내 항증식 활성을 보이는 것으로 발견되었다(하기 표 1 참조). 하기 실시예에서 추가로 논의되는 바와 같이, 유기적으로 합성된 SH-11052(2)는 부가적으로 인간 탯줄 혈관 내피 세포(HUVEC) 및 인간 망막 미세혈관 내피 세포(HREC)에서의 DNA 합성 중 EdU 혼입을 차단하였고, 천연 추출된 크레마스트라논과 유사한 유전자 발현 변화를 유발하였으며(도 10a 내지 10c), HREC의 관 형성을 저해하였고(도 8a 내지 8b), HREC에서 NF-κB 신호전달을 차단하였다(도 9a 내지 9e).

부가적으로, 하기 실시예에서 더욱 구체적으로 논의된 바와 같이, 본 발명의 일부 크레마스트라논 유사체는 안 종양 세포주(ocular tumor cell line)에 비해 HREC에 대한 선택성을 100-배 초과로 증진하면서 효능을 증가시킬 수 있다(표 1).

따라서, 일 측면에서, 본 발명은 화학식 (I)의 합성 화합물, 및 그의 라세미체 및 에난티오머에 관한 것이다:

예시적인 알콕시기로는, 예를 들어, 메톡시, 에톡시 등을 들 수 있다. 알콕시기와 사용하기 위한 예시적인 치환으로는, 예를 들어, 알킬, 아릴(예: 페닐), 카복시, 및 카보닐을 들 수 있다.

전형적으로, R₁, R₂, R₃는 하이드록실 및 알콕시로 구성된 그룹 중에서 독립적으로 선택된다. 특히 적합한 일 실시양태에서, R₁및R₂는 각각 하이드록실이고 R₃는 메톡시이다. 적합한 다른 실시양태에서, R₁, R₂, 및 R₃는 독립적으로 메톡시이다. 또 다른 실시양태에서, R₁은 하이드록실이고 R₂및R₃는 각각 메톡시이다.

전형적으로, R₄및R₅는 하이드록실, 알콕시 및 치환된 알콕시로 구성된 그룹 중에서 독립적으로 선택된다. R₄ 및 R₅로서 사용하기 위한 알콕시기에 대한 예시적인 치환으로는 알킬(선형 및 분지형) 및 아릴을 들 수 있다. 특히 적합한 일 실시양태에서, 치환된 알콕시는 OBn이다. 적합한 다른 실시양태에서, 치환된 알콕시는 비닐 메톡시이다.

특히 적합한 실시양태에서, 화학적으로 합성된 화합물로는 크레마스트라논 1 및 그의 이성체 2를 들 수 있다:

적합하게, 화학적으로 합성된 크레마스트라논 1 및 그의 이성체 2는 적어도 60%, 예컨대 적어도 70%, 예컨대 적어도 80%, 예컨대 적어도 90% 또는 그 이상의 순도를 나타낸다.

특히 적합한 다른 실시양태에서, 유기적으로 합성된 화합물은 SH-11037(6c)이다.

다른 측면에서, 본 발명은 화학식 (II)의 합성 화합물, 및 그의 라세미체 및 에난티오머에 관한 것이다:

상기 식에서 R₁, R₂, R₃, R₄, 및 R₅는 수소, 하이드록실, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬 카보닐옥시, 치환된 알킬 카보닐옥시, 알킬 카보닐, 치환된 알킬 카보닐, 아릴 카보닐옥시, 치환된 아릴 카보닐옥시, 할로겐, 아미노, 니트로, 하이드로카빌 및 치환된 하이드로카빌로 구성된 그룹 중에서 독립적으로 선택되고; X는 탄소 또는 질소이다.

전형적으로, X는 탄소이고, 적어도 하나의 R₄및R₅는 알콕시, 치환된 알콕시, 및 치환된 하이드로카빌로 구성된 그룹 중에서 선택된다.

다른 측면에서, 본 발명은 화학식 (III)의 합성 화합물, 및 그의 라세미체 및 에난티오머에 관한 것이다:

전형적으로, R₁, R₂, R₃, R₄, 및 R₅는 수소, 하이드록실, 및 알콕시로 구성된 그룹 중에서 독립적으로 선택된다.

다른 측면에서, 본 발명은 화학식 (IV)의 합성 화합물, 및 그의 라세미체 및 에난티오머에 관한 것이다:

다른 측면에서, 본 발명은 화학식 (V)의 합성 화합물, 및 그의 라세미체 및 에난티오머에 관한 것이다:

특히 적합한 일 실시양태에서, R₁, R₂, R₃, 및 R₅는 각각 알콕시이고, R₄는 하이드록실이다.

상기 식에서 R₁, R₂, R₃, R₄, 및 R₅는 수소, 하이드록실, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬 카보닐옥시, 치환된 알킬 카보닐옥시, 알킬 카보닐, 치환된 알킬 카보닐, 아릴 카보닐옥시, 치환된 아릴 카보닐옥시, 할로겐, 아미노, 니트로, 하이드로카빌 및 치환된 하이드로카빌로 구성된 그룹 중에서 독립적으로 선택되고; R₆는 수소 및 치환된 하이드로카빌로 구성된 그룹 중에서 선택된다. 특히 적합한 실시양태에서, R₆는 수소 및 하이드록시메틸로 구성된 그룹 중에서 선택된다.

다른 측면에서, 본 발명은 화학식 (VII)의 합성 크레마스트라논 유사체, 및 그의 라세미체 및 에난티오머에 관한 것이다:

특히 적합한 일 실시양태에서, X는 탄소이고, R₁, R₂, R₃, 및 R₅는 각각 알콕시이며, R₄는 하이드록실이다.

다른 측면에서, 본 발명은 화학식 (VIII)의 합성 크레마스트라논 유사체, 및 그의 라세미체 및 에난티오머에 관한 것이다:

특히 적합한 일 실시양태에서, X는 산소이고, R₁, R₂, R₃, 및 R₅는 각각 알콕시이며, R₄는 하이드록실이다.

크레마스트라논 및 크레마스트라논 유사체를 합성하는 방법

다른 측면에서, 본 발명은 화합물, 특히, 크레마스트라논 1 및 크레마스트라논 유사체를 화학적으로 합성하는 방법에 관한 것이다. 크레마스트라논 1의 전체 합성과 관련된 실질적인 과제는 C-5, C-7(A 환 내) 및 C-3'(B 환 내) 위치 상의 3개 페놀성기를 벗기는(uncover) 것이었다. 크레마스트라논 1 및 그의 이성체 2에서 크로마논의 형성을 위해, 디하이드로칼콘을 포름알데히드 또는 포름아미드 디메틸아세탈로 처리한 다음 크로몬을 환원시켰다. 그리고 A 및 B 환의 메톡시기 중에서 위치선택적 탈메틸화를 수행하였다.

따라서, 일 실시양태에서, 본 발명은 일반적으로 화학식 (I)의 화합물을 합성하는 방법에 관한 것이다:

상기 식에서 R₁, R₂, R₃, R₄, 및 R₅는 수소, 하이드록실, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬 카보닐옥시, 치환된 알킬 카보닐옥시, 알킬 카보닐, 치환된 알킬 카보닐, 아릴 카보닐옥시, 치환된 아릴 카보닐옥시, 할로겐, 아미노, 니트로, 하이드로카빌 및 치환된 하이드로카빌로 구성된 그룹 중에서 독립적으로 선택되고; X, Y, 및 Z는 탄소, 질소, 및 산소로 구성된 그룹 중에서 독립적으로 선택된다. 방법은 일반적으로 4'-벤질옥시-6'-하이드록시-2',3'-디메톡시아세토페논 또는 6'-하이드록시-2',3',4'-트리메톡시-아세토페논을 치환되거나 비치환된 벤즈알데히드와 축합시켜 칼콘을 형성하는 단계 및 칼콘을 활성탄 위의 Pd 및 H₂하에 환원시켜 디하이드로칼콘을 형성하는 단계에 의해 개시된다. 디하이드로칼콘으로부터 크로마논을 작제하기 위하여, N,N-디메틸포름아미드 디메틸 아세탈을 톨루엔 중에서 사용한 다음 생성된 크로몬을 환원시켰다. 크로마논을 합성하기 위한 제2 방법에서, 디하이드로칼콘은 포르말린 및 NaOH와 함께 하이드록시메틸화된 다음 폐환되어 크로마논 혼합물을 형성한다. 전형적으로, 디하이드로칼콘은 약 3 당량의 포르말린 및 8 당량의 50% NaOH와 함께 하이드록시메틸화되고 폐환된다. EtOH 중에서 약 2 당량의 K₂CO₃를 사용하여 C3 하이드록시메틸기를 제거하여 화학식 (IX)의 일치환된 크로마논을 형성하며; 60 ℃에서 약 6 내지 8 당량의 TMSI를 사용하여 화학식 (IX)의 크로마논을 탈메틸화한다:

상기 식에서 R은 수소 또는 하이드록시메틸이고, R₁및R₂는 수소, 하이드록실, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬 카보닐옥시, 치환된 알킬 카보닐옥시, 알킬 카보닐, 치환된 알킬 카보닐, 아릴 카보닐옥시, 치환된 아릴 카보닐옥시, 할로겐, 아미노, 니트로, 하이드로카빌 및 치환된 하이드로카빌로 구성된 그룹 중에서 독립적으로 선택된다. 일 실시양태에서, 화학식 (I)의 화합물은 SH-11052(2)이다.

더욱 특히, 크레마스트라논 1 및 그의 이성체 2의 합성이 도 2 및 3에 각각 설명되어 있다. 크레마스트라논 1의 합성 방법은 4'-벤질옥시-6'-하이드록시-2',3'-디메톡시아세토페논과 이소바닐린의 알돌 축합, H₂및 Pd/C 하에 칼콘을 촉매적으로 수소화함에 따른 디하이드로칼콘의 형성, 디하이드로칼콘을 벤질 브로마이드로 처리함에 따른 디벤질 에테르의 형성을 포함한다. 디벤질 에테르를 동반하여, N,N-디메틸포름아미드 디메틸 아세탈을 사용하여 상응하는 크로몬을 생성한다. 촉매적 수소화 후에, 생성된 크로마논을 2 당량의 TMSI로 처리하여 크레마스트라논(1)을 얻는다.

크레마스트라논 이성체(2)의 합성 방법은 일반적으로 3',4',5'-트리메톡시페놀을약 3.3 당량의 아세트산 무수물 및 15 몰%의 BF₃-OEt₂와 반응시켜 6'-하이드록시-2',3',4'-트리메톡시-아세토페논을 생성하는 3',4',5'-트리메톡시페놀의 오르토-아세틸화를 포함한다. 0 ℃에서 6'-하이드록시-2',3',4'-트리메톡시-아세토페논을 약 1.2 당량의 3-벤질옥시-4-메톡시벤즈알데히드와 약 3.8 당량의 KOH 및 MeOH 중에서 반응시켜 6'-하이드록시-2',3',4'-트리메톡시-아세토페논을 알돌 축합시켜 칼콘 3a를 제조한다. 칼콘 3a를 60 ℃에서 HCO₂Na, Pd/C 및 HCO₂H 하에 촉매적 수소화하여 디하이드로칼콘 4a를 제조한다. 디하이드로칼콘 4a를 약 3 당량의 포르말린 및 8 당량의 NaOH와 60 ℃에서 반응시켜 하이드록시메틸화 및 폐환에 의해 크로마논 환을 작제함으로써 화합물 5 및 7을 제조한다. 화합물 5 및 7을 EtOH 중에서 약 2 당량의 K₂CO₃로 처리하여 화합물 6a를 생성한다. 그 후, 화합물 6a를 과량의 TMSI(6~8 당량)로 처리하여 SH-11052(2)를 얻는다:

본 발명은 추가로 화학식 (III)의 디하이드로칼콘을 합성하는 방법에 관한 것이다:

상기 식에서 R₁, R₂, R₃, R₄, 및 R₅는 수소, 하이드록실, 알콕시, 치환된 알콕시, 할로겐, 아미노, 니트로, 하이드로카빌 및 치환된 하이드로카빌로 구성된 그룹 중에서 독립적으로 선택된다. 방법은 6'-하이드록시-2',3',4'-삼치환된-아세토페논을 치환되거나 비치환된 벤즈알데히드와 축합시켜 칼콘을 형성하는 단계에 의해 개시된다. 더욱 특히, 일 실시양태에서, 6'-하이드록시-2',3',4'-삼치환된-아세토페논을 치환되거나 비치환된 벤즈알데히드와 1:1.2의 6'-하이드록시-2',3',4'-삼치환된-아세토페논:벤즈알데히드의 비로 3.8 당량의 KOH와 함께 35 ℃에서 72 시간 동안 반응시킨다. 일단 형성되면, 칼콘을 H₂대기 하에 활성탄 위의 약 5-10 몰%의 Pd로 환원시켜 디하이드로칼콘을 형성한다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 화학식 (X)의 디하이드로칼콘을 합성하는 방법에 관한 것이다:

상기 식에서 R₄및R₅는 수소, 하이드록실, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬 카보닐옥시, 치환된 알킬 카보닐옥시, 알킬 카보닐, 치환된 알킬 카보닐, 아릴 카보닐옥시, 치환된 아릴 카보닐옥시, 할로겐, 아미노, 니트로, 하이드로카빌 및 치환된 하이드로카빌로 구성된 그룹 중에서 독립적으로 선택된다. 본 실시양태에서, 방법은 6'-하이드록시-2',3',4'-트리메톡시-아세토페논을 치환되거나 비치환된 벤즈알데히드와 축합시켜 칼콘을 형성하는 단계 및 칼콘을 활성탄 위의 Pd 및 H₂ 하에 환원시켜 상기 기재된 바와 같이 디하이드로칼콘을 형성하는 단계를 포함하고, 추가로 디하이드로칼콘을 과량의 N,N-디메틸포름아미드(DMF) 및 루이스산과 축합시켜 화학식 (X)의 크로몬을 형성하고 화학식 (X)의 크로몬을 탈메틸화하는 단계를 필요로 한다. 일 실시양태에서, 디하이드로칼콘은 20 ℃에서 과량의 DMF, 1.5 당량의 PCl₅및3 당량의 BF₃-OEt₂ 용액 중에서 축합된다.

크레마스트라논 및 크레마스트라논 유사체를 포함하는 약제학적 조성물 및 그의 용도

본 발명은 추가로 다양한 질환, 장애 및 병태를 치료하기 위한 약제학적 조성물로 합성 화합물, 특히, 합성 크레마스트라논 1, SH-11052(2) 및 본 명세서에 기재된 기타 크레마스트라논 유사체를 투여하는 것에 관한 것이다. 일 실시양태에서, 합성 화합물은 이를 필요로 하는 대상의 신생혈관성 안질환을 치료하기 위하여 투여된다. 일반적으로, 치료적 유효량의 화학식 (I)의 합성 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 이를 필요로 하는 대상에게 투여한다:

상기 식에서 R₁, R₂, R₃, R₄, 및 R₅는 수소, 하이드록실, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬 카보닐옥시, 치환된 알킬 카보닐옥시, 알킬 카보닐, 치환된 알킬 카보닐, 아릴 카보닐옥시, 치환된 아릴 카보닐옥시, 할로겐, 아미노, 니트로, 하이드로카빌 및 치환된 하이드로카빌로 구성된 그룹 중에서 독립적으로 선택되고; X, Y, 및 Z는 탄소, 질소, 및 산소로 구성된 그룹 중에서 독립적으로 선택된다. 더욱 특히, 합성 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 미숙아 망막증, 신생혈관성 노인성 황반변성, 당뇨병성 망막증, 각막 이식 거부, 신생혈관성 녹내장, 피부 홍조 등과 같은 질환을 치료하기 위해 투여될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 합성 화합물은 이를 필요로 하는 대상의 혈관신생 및/또는 염증-매개된 질환을 치료하기 위하여 투여된다. 치료될 수 있는, 예시적인 혈관신생 및/또는 염증-매개된 질환으로는 안구외 출혈, 심근경색, 뇌졸중, 암, 죽상동맥경화증, 허혈성 심장 질환, 관상 동맥성 심장 질환, 하지 동맥 질환, 상처 치유 장애 등을 들 수 있다.

합성 화합물은 치료적 유효량으로 투여되어 상기 질환 및 장애의 치료를 제공한다. 본 발명 화합물의 "치료적 유효량"은 임의의 의학적 치료에 적용할 수 있는 합리적인 이익/위험비로 장애를 치료하는 화합물의 충분한 양을 의미한다. 그러나, 본 발명 화합물의 총 일일 사용량은 온전한 의학적 판단의 범주 내에서 주치의에 의해 결정될 수 있다. 임의의 특정 환자에 대한 특이적 치료 유효 용량 수준은 치료하고자 하는 장애 및 장애의 심각도; 채용되는 특이적 합성 화합물의 활성; 채용되는 특이적 약제학적 조성물; 환자의 연령, 체중, 일반 건강, 성별 및 식이; 투여 시간, 투여 경로, 및 채용되는 특이적 합성 화합물의 배설률; 치료 기간; 채용되는 특이적 합성 화합물과 조합하여 또는 동시에 사용되는 약물; 및 의학 분야에 주지된 유사 인자들을 포함하는 각종 인자들에 좌우될 수 있다. 예를 들어, 목적하는 치료 효과를 달성하는데 필요한 것보다 적은 수준으로 합성 화합물의 용량을 시작하고 목적하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 점차적으로 증가시키는 것이 당업계의 기술 범위 내에 있다.

본 발명의 약제학적 조성물에서 합성 화합물의 실제 투여량 수준은 특정 환자, 조성 및 투여 방식의 경우 목적하는 치료 반응을 달성하기에 효과적인 화합물(들)의 양을 얻도록 변화할 수 있다. 선택된 투여량 수준은 특정 합성 화합물의 활성, 투여 경로, 치료하고자 하는 병태의 심각도 및 치료하고자 하는 환자의 병태 및 이전 병력에 좌우될 수 있다. 그러나, 목적하는 치료 효과를 달성하는데 필요한 것보다 적은 수준으로 합성 화합물의 용량을 시작하고 목적하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 점차적으로 증가시키는 것이 당업계의 기술 범위 내에 있다.

본 발명의 합성 화합물은 관심의 대상인 합성 화합물을 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는 약제학적 조성물로서 투여될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 문구 "약제학적으로 허용되는"은 온전한 의학적 판단의 범주 내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제나 합병증 없이, 합리적인 이익/위험비와 잘 맞는, 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 이들 리간드, 물질, 제형, 및/또는 투여형을 지칭한다. 본 명세서에서 사용된 문구 "약제학적으로 허용되는 담체"는 신체의 한 기관 또는 부위로부터 신체의 다른 기관 또는 부위로 활성 화합물을 운반하거나 수송하는데 관여하는 약제학적으로 허용되는 물질, 제형 또는 비히클, 예컨대 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 물질을 지칭한다. 각각의 담체는 조성물의 다른 성분(예: 합성 화합물)과의 상용성의 의미에서 "허용가능"하여야 하며 대상에 해로워서는 안된다. 재구성되거나 투여될 수 있는 동결건조된 조성물도 본 발명의 범위 내에 있다.

약제학적으로 허용되는 담체는, 예를 들어, 부형제, 비히클, 희석제, 및 그의 조합일 수 있다. 예를 들어, 조성물을 경구로 투여하고자 하는 경우, 이들은 정제, 캡슐, 과립, 산제, 또는 시럽으로 제형화할 수 있거나, 비경구 투여의 경우에 이들은 주사(근육내, 피하, 골수내, 척추강내, 심실내, 정맥내, 유리체내, 망막하, 결막하), 점적 주입 제제, 또는 좌제로 제형화될 수 있다. 안 점막 경로에 의한 적용의 경우에, 이들은 점안액 또는 안연고로 제형화될 수 있다. 이들 조성물은 관용적인 수단에 의해 제조될 수 있으며, 경우에 따라 활성 화합물(즉, 합성 화합물)이 임의의 관용적인 첨가제, 예컨대 부형제, 결합제, 붕해제, 윤활제, 교정약, 가용화제, 현탁액 조제, 유화제, 코팅제, 또는 이들의 조합과 혼합될 수 있다.

본 명세서에 기재된 질환, 장애, 및 병태를 경감시키고, 영향을 주고, 예방하고, 치료하기 위하여 본 발명의 약제학적 조성물이 부가적인 공지의 치료제, 약물, 합성 화합물의 전구약물로의 개질물 등을 추가로 포함할 수 있음이 이해되어야 한다.

본 발명의 방법에서 사용된 합성 활성 화합물 및 약제학적 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 신생혈관성 안질환을 치료하고 혈관신생 및/또는 염증-매개된 질환을 치료할 필요가 있는 대상의 부분 집합에 투여할 수 있다. 신생혈관성 안질환의 치료 및/또는 혈관신생 및/또는 염증-매개된 질환의 치료에 대한 특이적 필요가 있는 일부 대상으로는 신생혈관성 안질환(예: 미숙아 망막증, 당뇨병성 망막증, "습성" 노인성 황반변성 등), 혈관신생 및/또는 염증-매개된 질환 등에 걸리기 쉽거나 걸릴 위험이 큰 대상을 들 수 있다. 가족력, 연령, 환경, 및/또는 생활양식으로 인하여 대상들은 신생혈관성 안질환 및/또는 혈관신생 및/또는 염증-매개된 질환에 걸리기 쉽거나 걸릴 위험이 클 수 있다. 전술한 바에 의거하여, 본 발명의 방법 실시양태의 일부는 동정된 대상의 특이적 부분 집합 또는 하위 분류(즉, 본 명세서에 언급된 하나 이상의 특이적 병태를 처리함에 있어 지원의 "필요가 있는" 대상의 부분 집합 또는 하위 분류)를 대상으로 하므로, 모든 대상이 특정 질환, 장애 또는 병태의 경우 본 명세서에 기재된 대상의 부분 집합 또는 하위 분류에 속하지는 않을 것이다.

본 발명은 하기 비제한적인 실시예를 고려하여 더욱 완전하게 이해될 것이다.

실시예

물질 및 방법

하기 실시예에서 사용되는 모든 출발 물질 및 시약은 상업적으로 얻었으며 추가의 정제 없이 사용하였다. 테트라하이드로푸란은 소듐 벤조페논 케틸로부터 증류하였다. 디클로로메탄 및 아세토니트릴은 수소화칼슘으로부터 신선하게 증류하였다. 관례적인 생성물 분리 및 크로마토그래피에 사용되는 모든 용매는 시약 등급이었으며 유리 증류되었다. 반응 플라스크를 사용 전에 100 ℃에서 건조시켰고, 공기- 및 습기-민감성 반응은 아르곤 하에 실행하였다. 표시된 용매를 동반하는 실리카 겔 60(230-400 메쉬, Merck)을 사용하여 플래쉬 칼럼 크로마토그래피를 실행하였다. 0.25 mm 실리카 겔 플레이트(Merck & Co., Whitehouse Station, New Jersey)를 사용하여 박막 크로마토그래피를 실행하였다. 워터스 오토 정제 기기(Waters Auto Purification instrument)를 사용하여 질량 스펙트럼을 얻고, JEOL JMS-AX 505WA 단위를 사용하여 고해상도 질량 스펙트럼을 얻었다. 중수소화클로로포름(CDCl₃) 및 메탄올-d4 중의 용액으로 Bruker AVANCE III 400MHz 또는 Bruker AVANCE III 600MHz 분광기에서 ¹H 및 ¹³C 스펙트럼을 기록하였다. 화학적 이동, 다중도(s, singlet; d, doublet; t, triplet; m, multiplet 및/또는 multiple resonances), 양성자 개수 및 헤르츠(Hz) 단위의 커플링 상수(J)의 순서로 ¹H NMR 데이터를 기록하였다.

HREC 및 부착 인자(Attachment Factor)를 셀 시스템즈(Cel Systems; Kirkland, Washington)로부터 구입하였다. CLONETICS® HUVEC을 론자(Lonza; Walkersville, Maryland)로부터 구입하였다. 모든 세포는 5 내지 7 계대 사이에 사용하였다. 내피 성장 배지(EGM-2)는 EGM-2 "Bullet Kit"(Cat no. CC-4176)와 내피 기초 배지(EBM)(Lonza)의 내용물을 혼합하여 제조하였다. EGM-2 "Bullet Kit"는 하이드로코르티손, 인간 섬유아세포 성장 인자(hFGF), VEGF, R3-인슐린 유사 성장 인자(R3-IGF-1), 아스코르브산, 인간 상피 성장 인자(hEGF), 겐타마이신 및 헤파린과 함께 2% 소 태자 혈청(FBS)을 함유한다. TNF-α 및 α-튜불린 항체를 시그마(Sigma; St. Louis, Missouri)로부터 얻고, 인간 VEGF-165를 바이오레겐드(BioLegend; San Diego, California)로부터 얻었다. p38 MAPK, NF-κB p65 및 VCAM-1에 대한 항체를 산타 크룩스(Santa Crux; Dallas, Texas)로부터 얻는 한편, 분해된 캐스파제-3, 포스포-p38 MAPK, Akt, 포스포-Akt, VEGFR2, 포스포-VEGFR2, 및 IκB-α 항체는 셀 시그널링(Cell Signaling; Danvers, Maine)으로부터 얻었다. 2차 항체는 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific; Pittsburgh, Pennsylvania)으로부터 얻었다. 택맨 탐침 및 5'-에티닐-2'-데옥시우리딘(EdU) 혼입 어세이 키트는 라이프 테크놀로지스(Life Technologies; Carlsbad, California)로부터 입수하였다. AbD Serotec(Kidlington, UK)은 alamarBlue의 공급처인 한편, BD 바이오사이언시즈(BD Biosciences; San Jose, California)는 마트리겔을 공급하였다. 단백질 정량을 위한 브래드포드 시약은 0.3 g의 쿠마시 G-250(Pierce, Thermo Scientific, Life Technologies)을 500 mL의 3% 퍼클로르산에 용해시켜 제조하였다.

실시예 1

본 실시예에서는 도 2에 도해된 바와 같이 크레마스트라논 1의 합성을 설명한다.

( E )-1-(4-(벤질옥시)-6-하이드록시-2,3-디메톡시페닐)-3-(3-하이드록시-4-메톡시페닐)프로프-2-엔-1-온. EtOH(6 mL) 중의 4'-벤질옥시-6'-하이드록시-2',3'-디메톡시아세토페논(104 mg, 0.34 mmol) 용액에 KOH(95 mg, 1.7 mmol) 및 이소바닐린(62 mg, 0.41 mmol)을 실온(rt)에서 가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 48 시간 동안 교반하였다. 에탄올을 증발시키고, 에틸 아세테이트로 추출하고, 2 N HCl 용액 및 브린으로 세척하고, MgSO₄상에서 건조시키고, 용매를 제거한 다음 헥산/에틸 아세테이트를 사용하여 실리카 겔 상에서 칼럼 크로마토그래피하여 황색 고체로 칼콘(67 mg, 53%)을 얻었다. ¹H-NMR (600 MHz, CDCl₃) δ 13.68 (s, 1H), 7.81 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 7.75 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 7.42 (d, J = 6.6 Hz, 2H), 7.38 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 7.33 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 7.26 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.11 (dd, J = 8.4 및 2.4 Hz, 1H), 6.85 (d, J =8.4 Hz, 1H), 6.32 (s, 1H), 5.12 (s, 2H), 3.92 (s, 3H), 3.91 (s, 3H), 3.83 (s, 3H); ¹³C-NMR (150 MHz, CDCl₃) δ192.8, 162.4, 159.1, 155.1, 148.7, 145.9, 143.5, 135.8, 135.5, 129.0, 128.7, 128.2, 127.3, 124.6, 122.8, 113.0, 110.5, 109.0, 97.7, 70.6, 61.9, 61.3, 56.0; LRMS (ESI) m/z 437 (M+H⁺).

1-(4,6-디하이드록시-2,3-디메톡시페닐)-3-(3-하이드록시-4-메톡시페닐)프로판-1-온. 무수 MeOH 중의 칼콘(40 mg, 0.11 mmol) 및 10% Pd/C(20 mg) 용액을 수소 대기하에 놓았다. 1 시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 셀라이트 패드를 통해 여과하고, 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 상에서 플래쉬 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트 : 헥산 = 1 : 2)로 정제하여 고체로 디하이드로칼콘(30 mg, 98%)을 얻었다. ¹H-NMR (600 MHz, CDCl₃) δ 13.23 (s, 1H), 6.81 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.77 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 6.71 (dd, J = 8.4 및 2.4 Hz, 1H), 6.27 (s, 1H), 5.60 (s, 1H), 3.90 (s, 3H), 3.85 (s, 3H), 3.80 (s, 3H), 3.3 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 2.92 (t, J = 7.8 Hz, 2H); ¹³C-NMR (150 MHz, CDCl₃) δ 207.6, 161.8, 156.2, 154.4, 145.5, 144.8, 134.7, 132.7, 119.8, 114.56, 110.7, 108.5, 99.1, 60.9, 60.6, 56.0, 44.9, 29.8 ; LRMS (ESI) m/z 371 (M+Na⁺).

3-(3-(벤질옥시)-4-메톡시페닐)-1-(4-(벤질옥시)-6-하이드록시-2,3 디메톡시페닐)프로판-1-온. 디하이드로칼콘(250 mg, 0.72 mmol)의 아세톤 용액(5 mL)에 벤질 브로마이드(270 mg, 1.6 mmol) 및 K₂CO₃(300 mg, 2.2 mmol)를 가하였다. 3 시간 동안 환류시킨 후, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고 유기상을 물 및 브린으로 세척하고, MgSO₄상에서 건조시키고 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 상에서 플래쉬 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트 / n-헥산 = 1 : 2)로 정제하여 디벤질화 화합물(118 mg, 35%)을 얻었다. ¹H-NMR (600 MHz, CDCl₃) δ 13.29 (s, 1H), 7.42 (m, 4H), 7.38 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 7.33 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 7.26 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 6.83 (d, J = 9 Hz, 1H), 6.78 (dd, J = 6.0 및 1.8 Hz, 2H), 6.27 (s, 1H), 5.12 (s, 2H), 5.10 (s, 2H), 3.87 (s, 3H), 3.84 (s, 3H), 3.76 (s, 3H), 3.25 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.89 (t, J =7.8 Hz, 2H); ¹³C-NMR (150 MHz, CDCl₃) δ 204.8, 159.0, 155.2, 148.0, 137.2, 135.7, 134.9, 134.0, 128.7, 128.5, 128.2, 127.7, 127.3, 127.2, 120.9, 114.7, 111.9, 108.4, 97.3, 71.0, 70.5, 6101, 61.0, 56.1, 45.0, 29.9 ; LRMS (ESI) m/z 527 (M-H⁺).

7-(벤질옥시)-3-(3-(벤질옥시)-4-메톡시벤질)-5,6-디메톡시-4H-크로멘-4-온. 톨루엔(5 mL) 중의 디벤질화 디하이드로칼콘(93 mg, 0.2 mmol) 용액에 N,N-디메틸포름아미드 디메틸 아세탈(43 mg, 0.36 mmol)을 가하였다. 6 시간 동안 환류시킨 후, 반응 혼합물을 냉각시키고 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 상에서 플래쉬 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트 / n-헥산 = 1 : 2)로 정제하여 고체로 크로몬(76 mg, 80%)을 얻었다. H-NMR (600 MHz, CDCl₃) δ 7.44(d, J = 8.4Hz, 2H), 7.40(t, J = 7.2 Hz, 4H), 7.34(t, J = 6 Hz, 1H), 7.29(t, J = 7.2 Hz, 2H), 7.22(m, 2H), 6.80(s, 2H), 6.77(s, 1H), 6.63(s, 1H), 5.16(s, 2H), 5.09(s, 2H), 3.95(s, 3H), 3.89(s, 3H), 3.93(s, 3H), 3.62(s, 2H); ¹³C-NMR (150 MHz, CDCl₃) δ 175.9, 156.6, 154.5, 152.8, 151.0, 148.3, 148.0, 140.6, 137.1, 135.6, 131.2, 128.7, 128.4, 128.3, 127.7, 127.4, 127.2, 125.0, 121.8, 115.3, 113.1, 112.0, 97.4, 71.0, 70.8, 62.1, 61.5, 56.1, 30.8 ; LRMS (ESI) m/z 561 (M+Na⁺).

7-하이드록시-3-(3-하이드록시-4-메톡시벤질)-5,6-디메톡시크로만-4-온. 무수 MeOH 중의 크로몬(35 mg, 0.07 mmol) 및 10% Pd/C(10 mg) 용액을 수소 대기하에 놓았다. 1 시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 셀라이트 패드를 통해 여과하고 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 상에서 플래쉬 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트 : 헥산 = 1 : 1)로 정제하여 고체로 크로마논(19 mg, 87%)을 얻었다. ¹H-NMR (600 MHz, CD₃OD) δ 6.82(d, J = 14.4 Hz, 1H), 6.67(d, J = 1.8 Hz, 1H), 6.63(dd, J = 8.4 및 2.4 Hz, 1H), 6.16(s, 1H), 4.21(dd, J = 11.4 및 4.2 Hz, 1H), 4.04(dd, J = 11.4 및 7.2 Hz, 1H), 3.82(s, 3H), 3.79(s, 3H), 3.75(s, 3H), 3.00(dd, J = 13.2 및 4.2 Hz, 1H), 2.66(m, 1H), 2.58(dd, J = 13.8 및 10.8 Hz, 1H); ¹³C-NMR (150 MHz, CD₃OD) δ 192.4, 160.0, 158.5, 154.4, 146.3, 146.2, 136.4, 131.2, 119.9, 115.6, 111.5, 107.3, 99.1, 68.6, 60.4, 60.1, 55.0, 48.2, 32.0 ; LRMS (ESI) m/z 383 (M+Na⁺).

크레마스트라논(1). 0 ℃에서 CHCl₃(2 mL) 중의 7-하이드록시-3-(3-하이드록시-4-메톡시벤질)-5,6-디메톡시크로만-4-온(17 mg, 0.047 mmol) 용액에 TMSI(15 ㎕)를 가하고 반응 혼합물을 4 시간 동안 60 ℃로 가열하였다. 혼합물을 진공하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 상에서 플래쉬 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트 / n-헥산 = 1 : 1)로 정제하여 크레마스트라논(1)(12 mg, 74%)을 얻었다. ¹H-NMR (600 MHz, CD₃OD) δ 6.85 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.70 (d, J =1.8 Hz, 1H), 6.68 (dd, J = 8.4 및 2.4 Hz, 1H), 5.91 (s, 1H), 4.23 (dd, J =11.4 및 4.2 Hz, 1H), 4.06 (dd, J = 11.4 및 7.2 Hz, 1H), 3.82 (s, 3H), 3.77 (s, 3H), 3.08 (dd, J = 13.8 및 4.8 Hz, 1H), 2.82 (m, 1H), 2.63 (dd, J = 13.8 및 4.2 Hz, 1H); ¹³C-NMR (150 MHz, CD₃OD) δ 200.1, 160.6, 160.1, 156.8, 147.8, 147.6, 132.2, 130.4, 121.3, 117.0, 112.9, 102.9, 95.7, 70.3, 60.9, 56.4, 47.9, 33.1 ; LRMS (ESI) m/z 345 (M-H⁺).

실시예 2

본 실시예에서는 SH-11052(2) 및 크레마스트라논 유사체 3a-b, 4a-c, 5, 6a-b, 7, 8a-d, 및 9a-b의 합성을 기재한다.

더욱 구체적으로, 도 3에 도식적으로 나타내어 설명하고 본 명세서에서 더욱 완전히 논의하는 바와 같이, SH-11052(2)의 합성은 3',4',5'-트리메톡시페놀로부터 오르토-아세틸화에 의해 제조된 6'-하이드록시-2',3',4'-트리메톡시-아세토페논의 알돌 축합으로 시작된다(하기 논의됨).

1-(6-하이드록시-2,3,4-트리메톡시페닐)에탄온. 0 ℃에서 3,4,5-트리메톡시페놀(1.2 g, 6.6 mmol)의 아세트산 무수물 용액(2 mL)에 BF₃-Et₂O(0.07 mL)를 가하였다. 60 ℃에서 3 시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 반응 혼합물을 2 시간 동안 약 0 ℃로 냉각시키고, 결정화된 케이크를 에틸 아세테이트를 사용하여 여과하였다. H₂O(10 mL) 및 Et₃N(1 mL)를 가하였다. 실온에서 1 시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고 유기상을 물 및 브린으로 세척하고, MgSO₄상에서 건조시키고 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 플래쉬 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트 / n-헥산 = 1 : 1)로 정제하여 메틸 케톤(1.4 g, 95%)을 얻었다.

6'-하이드록시-2',3',4'-트리메톡시-아세토페논의 알돌 축합은 3-벤질옥시-4-메톡시벤즈알데히드와 알돌 축합시켜 보통의 수율로 생성된 칼콘을 얻는 것을 포함한다.

(E)-3-(3'-벤질옥시-4'-메톡시페닐)-1-(6-하이드록시-2,3,4-트리메톡시페닐)프로프-2-엔-1-온(3a). MeOH(10 mL) 중의 메틸 케톤(1.5 g, 6.5 mmol) 용액에 3-벤질옥시-4-메톡시벤즈알데히드(2.0 g, 8.0 mmol) 및 KOH(1.5 g, 25 mmol)를 0 ℃에서 가한 다음, 실온까지 가온하였다. 반응 혼합물을 35 ℃에서 72 시간 동안 교반한 다음 물을 가하고 CH₂Cl₂로 희석하였다. 유기층을 물 및 브린으로 세척하고, MgSO₄ 상에서 건조시키고, 진공하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트 / n-헥산 = 1 : 3)로 정제하여 3'-벤질옥시-4'-메톡시칼콘(3a)(1.6 g, 56%)을 얻었다. ¹H-NMR (600 MHz, CDCl₃) δ 13.7 (s, 1H), 7.74 (s, 2H), 7.47 (d, 2H, J = 7.2 Hz); 7.40 (t, 2H, J = 7.2 Hz); 7.33 (d, 1H, J = 7.2 Hz); 7.24 (dd, 1H, J = 8.4 및 2.4 Hz); 7.17 (d, 1H, J = 1.2 Hz); 6.92 (d, 1H, J = 8.4 Hz); 6.28 (s, 1H), 5.22 (s, 2H), 3.94 (s, 3H), 3.89 (s, 3H), 3.84 (s, 3H), 3.83 (s, 3H); ¹³C-NMR (150 MHz, CDCl₃) δ 192.7, 162.6, 159.9, 154.9, 151.9, 148.3, 143.5, 136.7, 135.2, 128.7, 128.2, 128.0, 127.2, 124.2, 123.5, 113.0, 111.5, 108.7, 96.6, 71.12, 61.9, 61.32, 56.12, 29.7; LRMS (ESI) m/z 315 (M+H).

HCO₂Na 및 Pd/C 하에서 칼콘(3a)을 촉매적 수소화하여 디하이드로칼콘(4a)을 얻었다. 하이드록시메틸화 및 폐환에 의해 크로마논 환을 작제하였다. 이 목적을 위하여, 염기성 조건 하에 포름알데히드와 알돌 반응시키고, 계속하여 부수적인 화합물 5 및 7을 K₂CO₃로 처리하여 목적하는 크로마논 6a를 양호한 수율로 얻었다.

1-(6-하이드록시-2,3,4-트리메톡시페닐)-3-(3'-하이드록시-4'-메톡시페닐)프로판-1-온(4a). 0 ℃에서 이소프로판올(10 mL) 중의 3'-(벤질옥시)-4'-메톡시칼콘(3a)(850 mg, 1.9 mmol)에 HCO₂Na(513 mg, 7.5 mmol), Pd/C(195 mg, 1.8 mmol) 및 HCO₂H(1 mL)를 가하였다. 반응 혼합물을 60 ℃에서 6 시간 동안 교반하였다. 혼합물을 실리카 겔의 짧은 패드를 통해 여과하였다. 여액을 진공하에 농축시킨 후, 잔류물을 실리카 겔 상의 플래쉬 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트 / n-헥산 = 1 : 3)를 통해 정제하여 디하이드로칼콘(4a)(517 mg, 79%)을 얻었다. ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 13.38 (s, 1H), 6.82 (d, 1H, J = 8.28 Hz); 6.73 (s, 2H), 6.21 (s, 1H), 5.53 (s, 1H), 3.93 (s, 3H), 3.85 (d, 6H, J = 1.96 Hz); 3.74 (s, 3H), 3.31 (m, 2H), 2.94 (d, 2H, J = 7.8 Hz); ¹³C-NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 204.8, 161.7, 159.8, 155.0, 146.3, 143.7, 134.6, 133.3, 120.7, 114.2, 111.1, 108.1, 96.1, 61.0, 60.9, 55.9, 55.7, 45.1, 30.2; LRMS (ESI) m/z 317 (M+H).

3-(3'-하이드록시-4'-메톡시벤질)-3-(하이드록시메틸)-5,6,7-트리메톡시크로만-4-온(5) 및 1-(6-하이드록시-2,3,4-트리메톡시페닐)-2-(3'-하이드록시-4'-메톡시벤질)프로프-2-엔-1-온(7). 디하이드로칼콘(4a)(700 mg, 1.9 mmol)을 50% NaOH 수용액(0.96 mL), H₂O(3.8 mL)에 용해시키고 포르말린(0.16 mL, 5.8 mmol)과 함께 60 ℃에서 3 시간 동안 교반하였다. 3 시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고, NH₄Cl 및 브린으로 세척하고, MgSO₄상에서 건조시키고, 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 상에서 플래쉬 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트 / n-헥산 = 1 : 2)로 정제하여 각각 화합물(5)(383 mg, 54%), (6a)(71 mg, 10%) 및 (7)(106 mg, 15%)의 혼합물을 얻었다. 화합물 (5): ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 6.83-6.80 (m, 2H), 6.75-6.73 (m, 1H), 6.28 (s, 1H), 5.78 (bs, 1H), 4.04-4.03 (m, 2H), 3.91 (s, 3H), 3.88 (s, 3H), 3.84 (s, 3H), 3.79 (s, 2H), 3.58-3.50 (m, 2H), 3.21 (bs, 1H), 2.98 (d, 1H, J = 13 Hz); 2.85 (d, 1H, J = 14 Hz); ¹³C-NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 196.1, 159.7, 159.4, 154.5, 146.3, 144.5, 137.5, 126.7, 123.3, 114.1, 113.0, 107.8, 95.9, 69.6, 62.2, 61.4, 61.2, 56.0, 55.8, 49.9, 34.8. LRMS (ESI) m/z 405 (M+H); 화합물 (7): ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 11.7 (s, 1H), 7.29 (s, 1H), 7.18 (s, 1H), 6.79 (d, 1H, J = 7.8 Hz); 6.67-6.65 (m, 2H), 6.19 (s, 1H), 5.44 (s, 1H), 5.10 (s, 1H), 4.96 (s, 1H), 3.82 (s, 3H), 3.79 (s, 3H), 3.71 (s, 3H), 3.66 (s, 3H), 3.56 (s, 2H); ¹³C-NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 201.7, 160.6, 160.2, 151.8, 146.4, 144.1, 134.9, 129.7, 128.3, 122.2, 115.3, 114.2, 112.0, 108.3, 95.9, 61.4, 61.0, 56.1, 55.8, 38.6; LRMS (ESI) m/z 375 (M+H).

3-(3'-하이드록시-4'-메톡시벤질)-5,6,7-트리메톡시크로만-4-온(6a). 화합물(5)(100 mg, 0.25 mmol)를 에탄올(2 mL)에 용해시키고, 90 ℃에서 3 시간 동안 K₂CO₃(54 mg, 0.49 mmol)와 교반하였다. 3 시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 1 N HCl 및 브린으로 세척하고, MgSO₄상에서 건조시키고, 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 상에서 플래쉬 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트 / n-헥산 = 1 : 2)로 정제하여 5,6,7-트리메톡시크로마논(6a)(45 mg, 49%)을 얻었다. ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.24 (s, 1H), 6.83 (d, 1H, J = 7.8 Hz); 6.71 (d, 2H, J = 1.9 Hz); 6.23 (s, 1H), 5.53 (s, 1H), 4.23 (m, 1H), 4.10 (m, 1H), 3.91 (s, 3H), 3.85 (d, 6H, J = 1.9 Hz); 3.79 (s, 3H), 3.16 (m, 1H), 2.70 (m, 1H), 2.63 (m, 1H); ¹³C-NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 191.3, 159.6, 159.2, 154.4, 146.5, 144.2, 137.4, 130.2, 121.8, 114.3, 111.4, 108.6, 95.9, 69.0, 61.5, 61.2, 56.0, 55.9, 48.5, 32.5; LRMS (ESI) m/z 375 (M+H). 화합물(7)(100 mg, 0.27 mmol)로부터, 동일한 반응 조건으로 5,6,7-트리메톡시크로마논(6a)(72 mg, 72%)을 얻었다.

SH-11052(2). 0 ℃에서 CHCl₃(1 mL) 중의 5,6,7-트리메톡시크로마논(6a)(37 mg, 0.10 mmol) 용액에 TMSI(113 ㎕, 0.80 mmol)를 가하고, 반응 혼합물을 60 ℃에서 4 시간 동안 가열하였다. 혼합물을 진공하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 상에서 플래쉬 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트 / n-헥산 = 1 : 1)로 정제하여 SH-11052(2)(17 mg, 49%)를 얻었다. ¹H-NMR (600 MHz, CD₃OD) δ 6.85 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 6.70 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 6.67 (dd, 1H, J = 2.4 및 8.4 Hz), 6.13 (s, 1H), 4.25 (dd, 1H, J = 4.2 및 11.4 Hz), 4.09 (dd, 1H, J = 7.8 및 11.4 Hz), 3.87 (s, 3H), 3.82 (s, 3H), 3.08 (dd, 1H, J = 4.8 및 13.8 Hz), 2.84-2.79 (m, 1H), 2.64 (dd, 1H, J = 10.2 및 13.8 Hz); ¹H-NMR (600 MHz, CDCl₃) δ 11.7 (s, 1H), 6.78 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 6.78 (d, 1H, J = 9.6 Hz), 6.67 (dd, 1H, J = 2.4 및 8.4 Hz), 6.02 (s, 1H), 5.60 (s, 1H), 5.02 (s, 1H), 4.25 (dd, 1H, J = 4.2 및 11.4 Hz), 4.10 (dd, 1H, J = 7.8 및 11.4 Hz), 3.88 (s, 3H), 3.85 (s, 3H), 3.15 (dd, 1H, J = 4.8 및 13.8 Hz), 2.82-2.78 (m, 1H), 2.64 (dd, 1H, J = 10.8 및 14.4 Hz); ¹³C-NMR (150 MHz, CD₃OD) δ 200.7, 157.6, 157.6, 150.4, 148.0, 147.8, 132.4, 128.7, 121.4, 117.1, 113.0, 103.5, 92.25, 70.63, 56.82, 56.58, 33.26; ¹³C-NMR (150 MHz, CDCl₃) δ 200.7, 158.0, 156.6, 150.1, 147.7, 147.4, 133.0, 129.2, 122.6, 117.1, 112.8, 104.4, 93.0, 71.4, 58.3, 58.0, 48.8, 34.1; LRMS (EI) m/z 346 (M+); HRMS (EI) m/z 346.1057 (M+) [calc. C₁₈H₁₈O₇ 346.1053].

0 ℃에서 CHCl₃(1 mL) 중의 5,6,7-트리메톡시크로마논(6a)(37 mg, 0.1 mmol) 용액에 2 당량의 TMSI를 가하고, 반응 혼합물을 60 ℃에서 4 시간 동안 가열하여 C-5에서 메틸기를 선택적으로 제거하였다. 혼합물을 진공 하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 상에서 플래쉬 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트 / n-헥산 = 1 : 1)로 정제하여 화합물(8a)(R₁ = OH, R₂및R₃ = OMe)를 얻었다.

5,6,7-트리하이드록시-3-(3-하이드록시-4-메톡시벤질)크로만-4-온(8d). 0 ℃에서 5,6,7-트리메톡시크로마논(37 mg, 0.10 mmol)의 CHCl₃ 용액(2 mL)에 TMSI (1.1 mL)를 가하였다. 60 ℃에서 6 시간 동안 가열한 후, 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 상에서 플래쉬 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트 / n-헥산 = 1 : 1)로 정제하여 삼중탈메틸화 호모이소플라바논(8d)(12 mg, 36%)을 얻었다. ¹H-NMR (600 MHz, CD₃OD) δ 6.70 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 6.67 (d, 1H, J = 1.8 Hz), 6.55 (dd, 1H, J = 8.1 및 2.4 Hz), 6.13 (s, 1H), 4.25 (dd, 1H, J = 11 및 4.2 Hz), 4.08 (dd, 1H, J = 7.8 및 4.8 Hz), 3.87 (s, 3H), 3.05 (dd, 1H, J = 14 및 4.8 Hz), 2.78 (m, 1H), 2.61 (dd, 1H, J = 14 및 10 Hz).

실시예 3

본 실시예에서는 도 3에 도해된 바와 같이, 크레마스트라논 유사체(유사체 화합물 6b 및 8b)의 합성을 기재한다.

3-(3,4-디메톡시페닐)-1-(6-하이드록시-2,3,4-트리메톡시페닐)프로판-1-온(4b). 무수 EtOH(3 mL) 중의 칼콘(3b)(102 mg, 0.32 mmol) 및 10% Pd/C(16 mg) 용액을 수소 대기 하에 놓았다. 4 시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 실리카 겔의 짧은 패드를 통해 여과하고, 진공하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 상에서 플래쉬 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트 / n-헥산 = 1 : 1)로 정제하여 디하이드로칼콘(4b)(115 mg, 96%)을 얻었다. ¹ H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 13.33 (s, 1H), 7.21 (m, 4H), 7.18 (s, 1H), 6.17 (s, 1H), 3.88 (s, 3H), 3.81 (s, 3H), 3.69 (s, 3H), 3.31 (m, 2H), 2.97 (d, 2H, J = 7.8 Hz); ¹³C-NMR (100 MHz,CDCl₃) δ 204.7, 161.8_, 159.9, 155.0, 141.4, 134.7, 128.4, 125.9, 108.2, 96.1, 61.0, 60.9, 56.0, 44.7, 30.4. IR (neat) ν _max 2960, 2924, 2852 cm^-1; LRMS (ESI) m/z 317 (M+H).

3-벤질-5,6,7-트리메톡시크로만-4-온(6b). 디하이드로칼콘(4b)(100 mg, 0.31 mmol)을 50% NaOH 수용액(2 mL), H₂O(6 mL)에 용해시키고, 60 ℃에서 3 시간 동안 포르말린(0.04 mL, 1.61 mmol)과 교반하였다. 3 시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고, NH₄Cl 및 브린으로 세척하고, MgSO₄상에서건조시키고, 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 상에서 플래쉬 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트 / n-헥산 = 1 : 4)로 정제하여 화합물 6b(44 mg, 42%)를 얻었다. ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.31-7.28 (m, 2H), 7.22-7.20 (m, 3H), 6.23 (s, 1H), 4.27 (dd, 1H, J = 11 및 3.9 Hz), 4.09 (dd, 1H, J = 11 및 7.8 Hz), 3.91 (s, 3H), 3.86 (s, 3H), 3.79 (s, 3H), 3.28 (dd, 1H, J = 14 및 3.9 Hz), 2.80-2.73 (m, 1H), 2.68 (dd, 1H, J = 14 및 11 Hz); ¹³C-NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 191.1, 159.6, 159.2, 154.4, 138.5, 137.4, 129.1, 128.6, 126.5, 108.6, 95.9, 69.0, 61.5, 61.3, 56.0, 48.2, 32.7.

3-벤질-5-하이드록시-6,7-디메톡시크로만-4-온(8b). 0 ℃에서 AcOH(0.75 mL) 중의 3-벤질-5,6,7-메톡시크로마논(6b)(15 mg, 0.046 mmol) 용액에 HBr(0.5 mL)을 가하였다. 반응 혼합물을 2 시간 동안 환류시켰다. 실온으로 냉각시킨 후, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 유기상을 물 및 브린으로 세척하고, MgSO₄상에서 건조시키고, 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 상에서 플래쉬 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트 / n-헥산 = 1 : 2)로 정제하여 3-벤질-6,7-디메톡시크로마논(8b)(5 mg, 35%)을 얻었다. ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 11.96 (s, 1H), 7.35-7.31 (m, 2H), 7.27-7.22 (m, 3H), 6.02 (s, 1H), 4.29 (dd, 1H, J = 11 및 4.4 Hz), 4.13 (dd, 1H, J = 11 및 7.3 Hz), 3.88 (s, 3H), 3.83 (s, 3H), 3.29 (dd, 1H, J = 14 및 4.4 Hz), 2.90-2.83 (m, 1H), 2.76 (dd, 1H, J = 14 및 11 Hz); LRMS (ESI) m/z 315 (M+H).

실시예 4

본 실시예에서는 크레마스트라논 유사체(유사체 화합물 9a-b)의 합성을 기재한다. 하기에 기재하는 바와 같이, 유사체(9a)는 화합물(4a)로부터 제조하였고, 유사체(9b)는 화합물(4b)로부터 제조하였다.

3-(3'-하이드록시-4'-메톡시벤질)-5,6,7-트리메톡시-4 H -크로멘-4-온(9a). DMF(2.5 mL) 중의 PCl₅(180 mg, 0.86 mmol) 용액을 20 ℃에서 20 분간 교반하였다. 20 ℃에서 반응 혼합물에 BF₃-Et₂O(0.22 mL, 1.73 mmol) 및 디하이드로칼콘(4a)(상기한 바와 같이 제조됨)(200 mg, 0.58 mmol)를 가한 다음 4 시간 동안 교반하고 1 N HCl(2 mL)을 가하고 에틸 아세테이트로 희석하였다. 유기층을 물 및 브린으로 세척하고, MgSO₄상에서 건조시키고, 진공하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트 / n-헥산 = 1 : 4)로 정제하여 크로몬(9a)(110 mg, 51%)을 얻었다. ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.34 (s, 1H), 6.83-6.79 (m, 2H), 6.74-6.73 (m, 1H), 6.59 (s, 1H), 5.49 (s, 1H), 3.94 (s, 3H), 3.90 (s, 3H), 3.86 (s, 3H), 3.67 (s, 2H); ¹³C-NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 175.9, 157.5, 154.7, 152.6, 151.0, 146.5^,144.1, 140.2, 130.6,125.2, 121.6, 114.3, 112.9, 111.7, 95.9, 62.0, 61.4, 56.2, 55.9, 31.1. LRMS (ESI) m/z 373 (M+H).

3-벤질-5,6,7-트리메톡시-4 H -크로멘-4-온. DMF(1.2 mL) 중의 PCl₅(50 mg, 0.24 mmol) 용액을 20 ℃에서 20 분간 교반하였다. 20 ℃에서 반응 혼합물에 BF₃-Et₂O(0.06 mL, 0.48 mmol) 및 디하이드로칼콘(4b)(상기한 바와 같이 제조됨)(51 mg, 0.16 mmol)를 가한 다음 4 시간 동안 교반하고 1 N HCl(2 mL)을 가하고 에틸 아세테이트로 희석하였다. 유기층을 물 및 브린으로 세척하고, MgSO₄ 상에서 건조시키고, 진공하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트 / n-헥산 = 1 : 4)로 정제하여 크로몬(31 mg, 59%)을 얻었다. ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.38 (s, 1H), 7.26 (d, 5H, J = 10.72 Hz); 6.61 (s, 1H), 3.97 (s, 3H), 3.92 (s, 3H), 3.88 (s, 3H), 3.76 (s, 2H); ¹³C-NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 191.1, 159.6, 159.2, 154.4, 138.5, 137.4, 129.1, 128.6, 126.5, 108.6, 95.9, 69.0, 61.5, 61.3, 56.0, 48.2, 32.7.

3-벤질-5,7-디하이드록시-6-메톡시-4 H -크로멘-4-온(9b). 0 ℃에서 아세트산(1 mL) 중의 상기 제조된 크로몬(20 mg, 0.061 mmol) 용액에 47% HBr(0.5 mL)을 적가하였다. 반응 혼합물을 2 시간 동안 환류시킨 다음 MgSO₄상에서 건조시키고, 진공하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트 / n-헥산 = 1 : 2)로 정제하여 탈메틸화 크로몬(9b)(10 mg, 55%)을 얻었다. ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 12.42 (s, 1H), 7.51 (s, 1H), 7.30 (d, 4H, J = 10.72 Hz); 6.42 (s, 1H), 5.28 (s, 1H), 4.12 (dd, 1H, J = 6.84 및 7.32 Hz); 3.94 (s, 3H), 3.75 (s, 2H). LRMS (ESI) m/z 299 (M+H).

실시예 5

본 실시예에서는, 크레마스트라논 유사체(유사체 화합물 10b, 11a-k 및 6c)를 합성하는 방법이 기재된다.

5,7-디하이드록시-6-메톡시크로만-4-온(10b). 도 4에 도식적으로 나타내어 설명한 바와 같이, 0 ℃에서 5,6,7-트리메톡시크로마논 10a(Netchem, Inc.로부터 상업적으로 구입가능)(20 mg, 0.08 mmol)의 CHCl₃ 용액(2 mL)에 TMSI(97 ㎕, 0.48 mmol)를 가하였다. 60 ℃에서 3 시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 유기상을 물 및 브린으로 세척하고, MgSO₄상에서 건조시키고, 진공하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 상에서 플래쉬 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트 / n-헥산 = 1 : 1)로 정제하여 탈메틸화 크로마논(10b)(14 mg, 85%)을 얻었다. ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 11.69 (s, 1H), 6.03 (s, 1H), 5.01 (s, 1H), 4.43 (t, 2H, J = 6.3 Hz); 3.88 (s, 3H), 2.77 (t, 2H, J = 6.3 Hz); ¹³C-NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 196.6, 156.1, 154.6, 147.9, 127.1, 103.2, 91.1, 66.8, 56.2, 36.6; LRMS (ESI) m/z 211 (M+H).

( E )-3-(3'-하이드록시-4'-메톡시벤질리덴)-5,6,7-트리메톡시크로만-4-온(11a). 도 4에 도식적으로 나타내어 설명한 바와 같이, 0 ℃에서 벤젠(25 mL) 중의 5,6,7-트리메톡시크로마논(10a)(Netchem, Inc.으로부터 상업적으로 구입가능)(238 mg, 1 mmol) 용액에 이소바닐린(170 mg, 1.1 mmol) 및 PTSA(20 mg, 0.1 mmol)를 가하였다. 반응 혼합물을 12 시간 동안 환류시켰다. 실온으로 냉각시킨 후, 반응 혼합물을 진공하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 상에서 플래쉬 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트 / n-헥산 = 1 : 1)로 정제하여 4-벤질리덴-5,6,7-트리메톡시크로마논(11a)(215 mg, 58%)을 얻었다. ¹H-NMR (600 MHz, CDCl₃) δ 7.74 (s, 1H), 6.91-6.84 (m, 3H), 6.26 (s, 1H), 5.67 (s, 1H), 5.24 (d, 2H, J = 1.8 Hz); 3.98 (s, 3H), 3.94 (s, 3H), 3.88 (s, 3H), 3.83 (s, 3H); ¹³C-NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 179.5, 159.3, 159.1, 154.7, 147.5, 145.5, 137.8, 136.2, 130.1, 128.1, 123.2, 115.7, 110.5, 96.1, 67.6, 61.6, 61.3, 60.3, 60.3, 56.0, 55.9; LRMS (ESI) m/z 373 (M+H).

(E) -3-(3'- 벤질옥시 -4'- 메톡시벤질리덴 )-5,6,7- 트리메톡시크로만 -4- 온(11b). 도 4에 도식적으로 나타내어 설명한 바와 같이, 4-벤질리덴크로마논(11a)(124 mg, 0.33 mmol)의 아세톤 용액(5 mL)에 벤질 브로마이드(70 mg, 0.4 mmol) 및 K₂CO₃(144 mg, 0.80 mmol)를 가하였다. 실온에서 3 시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 유기상을 물 및 브린으로 세척하고, MgSO₄ 상에서 건조시키고, 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 상에서 플래쉬 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트 / n-헥산 = 1 : 1)로 정제하여 벤질화 크로마논(11b)(120 mg, 79%)을 얻었다. ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.67 (s, 1H), 7.42-7.24 (m, 5H), 6.93 (d, 1H, J = 8.3 Hz); 6.87 (dd, 1H, J = 8.3 및 2.0 Hz); 6.75 (d, 1H, J = 2.0 Hz); 6.22 (s, 1H), 5.17 (s, 2H), 5.03 (d, 2H, J = 1.5 Hz); 3.95 (s, 3H), 3.92 (s, 3H), 3.86 (s, 3H), 3.81 (s, 3H), ¹³C-NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 179.4, 159.3, 159.1, 154.7, 150.8, 147.8, 137.8, 136.7, 136.2, 129.9, 128.6, 128.0, 127.3, 127.1, 124.0, 115.9, 111.5, 110.5, 96.1, 71.1, 67.4, 61.6, 61.3, 56.1, 56.0; LRMS (ESI) m/z 463 (M+H).

(E) -3-(3'- 알릴옥시 -4'- 메톡시벤질리덴 )-5,6,7- 트리메톡시크로만 -4- 온(11c). 4-벤질리덴크로마논(11a)(9.9 mg, 0.02 mmol)의 아세톤 용액(2 mL)에 알릴 브로마이드(2.5 ㎕, 0.02 mmol) 및 K₂CO₃(18 mg, 0.10 mmol)를 가하였다. 실온에서 3 시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 유기상을 물 및 브린으로 세척하고, MgSO₄ 상에서 건조시키고, 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 플래쉬 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트 / 헥산 = 1 : 1)로 정제하여 알릴화 크로마논(11c)(6.8 mg, 83%)을 얻었다. ¹H-NMR (600 MHz, CDCl₃) δ 7.75 (s, 1H), 6.93 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 6.88 (dd, 1H, J = 8.4 및 1.8 Hz), 6.83 (d, 1H, J = 1.8 Hz), 6.25 (s, 1H), 6.11 - 6.04 (m, 1H), 5.43 - 5.40 (m, 1H), 5.33 - 5.31 (m, 1H), 5.23 (d, 1H, J = 1.8), 4.64 (m, 2H), 3.97 (s, 3H), 3.91(s, 3H), 3.88 (s, 3H), 3.83 (s, 3H); ¹³C-NMR (150 MHz, CDCl₃) δ 179.51, 159.32, 159.19, 154.78, 150.57, 147.82, 137.88, 136.36, 133.05, 130.01, 127.41, 123.76, 118.32, 115.26, 111.36, 110.64, 96.15, 69.99, 67.70, 61.66, 61.35, 56.13, 56.01; LRMS (ESI) m/z 413 (M+H).

( E )-5,6,7- 트리메톡시 -3-(4- 메톡시 -3-(2-( 피롤리딘 -1-일) 에톡시 ) 벤질리덴 ) 크로만 -4-온(11k). 4-벤질리덴크로마논(11a)(22 mg, 0.059 mmol)의 아세톤 용액(5 mL)에 1-(2-클로로에틸)피롤리딘 하이드로클로라이드(9.4 mg, 0.071 mmol) 및 K₂CO₃(41 mg, 0.30 mmol)를 가하였다. 3 시간 동안 환류시킨 후, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 유기상을 합하여 물 및 브린으로 세척하고, MgSO₄상에서 건조시키고, 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 상에서 플래쉬 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트 / n-헥산 = 1 : 1)로 정제하여 알킬화 4-벤질리덴크로마논(11k)(8 mg, 29% 및 BRSM 52%)을 얻었다. ¹H-NMR (600 MHz, CDCl₃) δ 7.75 (s, 1H), 6.92 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 6.89 (d, 1H, J = 1.8 Hz), 6.87 (d, 1H, J = 1.8 Hz), 6.25 (s, 1H), 5.24 (d, 2H, J = 1.8 Hz), 4.21 (bs, 2H), 3.98 (s, 3H), 3.90 (s, 3H), 3.88 (s, 3H), 3.83 (s, 3H), 3.03 (bs, 2H), 2.74 (bs, 2H), 1.85 (bs, 4H); ¹³C-NMR (150 MHz, CDCl₃) δ 179.4, 178.8, 163.4, 162.9, 162.8, 162.7, 158.0, 154.8, 152.5, 151.1, 150.9, 149.2, 145.5, 145.3, 142.6, 141.9, 140.2, 139.6, 134.1, 130.3, 129.4, 121.9, 109.7, 96.1, 67.6, 62.0, 61.6, 61.4, 61.3, 56.2, 56.1, 55.9; LRMS (ESI) m/z 470 (M+H).

(2S)-2-메톡시-5-((5,6,7-트리메톡시-4-옥소크로만-3-일)메틸)페닐 2-((tert-부톡시카보닐)아미노)-3-페닐프로파노에이트(6c, SH-11037). 5,6,7-트리메톡시호모이소플라바논(12 mg, 0.032 mmol)의 CH₂Cl₂ 용액(2 mL)에 Boc-Phe-OH(10 mg, 0.035 mmol), EDCI(6.7 mg, 0.035 mmol) 및 DMAP(0.8 mg, 0.006 mmol)를 가하였다. 3 시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 물 및 브린으로 세척하고, MgSO₄상에서 건조시키고, 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 상에서 플래쉬 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트 / n-헥산 = 1 : 2)로 정제하여 아실화 크로마논(6c)(12 mg, 60%)을 얻었다. ¹ H-NMR (600 MHz,CDCl₃) δ 7.34 (m, 2H₎, 7.29 (m, 3H), 7.08 (dd, 1H, J = 8.4 및 1.8 Hz), 6.92 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 6.83 (bs, 1H), 6.25 (s, 1H) 4.88 (m, 1H), 4.29 (dd, 1H, J = 14 및 4.2 Hz), 4.10 (m, 1H), 4.13_-4.07 (m, 2H), 3.93 (s, 3H), 3.88(s, 3H), 3.81 (s, 3H), 3.80 (s, 3H), 3.35 (m, 1H), 3.23 (m, 1H), 3.19 (m, 1H), 2.72 (m, 1H), 2.64 (m, 1H), 1.42 (s, 9H); ¹³C-NMR (150 MHz, CDCl₃) δ 191.0, 170.2, 159.7, 159.4, 154.4, 150.9, 137.5, 136.0, 131.0, 129.6, 128.5, 127.0, 122.6, 121.3, 113.1, 112.6, 108.6, 96.0, 79.9, 69.0, 61.6, 61.3, 56.1, 55.8, 54.3, 48.2, 38.2, 32.7, 31.8, 28.3; LRMS (ESI) m/z 644 (M+Na).

실시예 6

본 실시예에서는, 도 4에 도해된 바와 같이, 크레마스트라논 유사체 12의 합성 방법이 기재된다.

에틸 4-(3,4,5-트리메톡시페녹시)부타노에이트. 3,4,5-트리메톡시페놀(500 mg, 2.7 mmol)의 아세톤 용액(10 mL)에 K₂CO₃(1.5 g, 11 mmol) 및 에틸 4-브로모부티레이트(1.3 mL, 7.9 mmol)를 가하였다. 12 시간 동안 환류시킨 후, 반응 혼합물을 실온으로 냉각시킨 다음 실리카 겔의 짧은 패드를 통해 여과하여 과량의 K₂CO₃를 제거하였다. 여액을 감압하에 농축시키고 생성된 잔류물을 실리카 겔 상에서 플래쉬 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트 / n-헥산 = 1 : 3)로 정제하여 에틸 4-(3,4,5-트리메톡시페녹시)부타노에이트(829 mg, 92%)를 얻었다. ¹H-NMR (600 MHz, CDCl₃) δ 6.06 (q, 1H), 4.08-4.02 (m, 2H), 3.90-3.87 (m, 2H), 3.76-3.73 (m, 6H), 3.70-3.67 (m, 3H), 3.40-3.35 (m, 1H), 2.44-2.38 (m, 2H), 2.09-2.04 (m, 2H), 2.01-1.96 (m, 3H); ¹³C-NMR (150 MHz, CDCl₃) δ 173.1, 155.4, 153.5, 132.1, 92.0, 66.9, 60.8, 60.4, 60.3, 55.9, 30.5, 24.5, 14.1; LRMS: (ESI) m/z 321 (M+Na).

6,7,8-트리메톡시-3,4-디하이드로벤조[b]옥세핀-5(2 H )-온. 50 mL 둥근-바닥 플라스크에 에틸 4-(3,4,5-트리메톡시페녹시)부타노에이트(460 mg, 1.7 mmol) 및 폴리인산(6.0 g)을 가하였다. 2 시간 동안 130 ℃에서 교반한 후, 반응 혼합물을 250 mL의 얼음에 붓고 폴리인산이 용해될 때까지 교반하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(100 mL x 3)로 추출하고, 유기상을 합하여 무수 MgSO₄ 상에서 건조시키고 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 상에서 플래쉬 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트 / n-헥산 = 1 : 2)로 정제하여 6,7,8-트리메톡시-3,4-디하이드로벤조[b]옥세핀-5(2H)-온(188 mg, 44%)을 얻었다. ¹H-NMR (600 MHz, CDCl₃) δ 6.42 (s, 1H), 4.19 (t, 2H, J = 6.0 Hz), 3.94 (s, 3H), 3.89 (s, 3H), 3.85 (s, 3H), 2.81 (t, 2H, J = 6.6 Hz), 2.17-2.12 (m, 2H); ¹³C-NMR (150 MHz, CDCl₃) δ 200.3, 156.4, 156.2, 152.7, 138.7, 118.7, 100.0, 72.1, 62.4, 61.0, 56.0, 41.4, 25.9. LRMS: (ESI) m/z 253 (M+H).

( E )-4-(3-하이드록시-4-메톡시벤질리덴)-6,7,8-트리메톡시-3,4-디하이드로벤조[b]옥세핀-5(2 H )-온(12). 6,7,8-트리메톡시-3,4-디하이드로벤조[b]옥세핀-5(2H)-온(65 mg, 0.26 mmol)의 벤젠 용액(6.5 mL)에 이소바닐린(47 mg, 0.31 mmol) 및 p-톨루엔설폰산(71 mg, 0.41 mmol)을 가하였다. 1.5 시간 동안 딘-스탁 장치를 사용하여 환류시킨 후, 반응 혼합물을 냉각시키고 포화 NaHCO₃로 켄칭하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(30 mL x 3)로 희석하고, 물로 세척하고, 유기상을 합하여 MgSO₄ 상에서 건조시키고, 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 상에서 플래쉬 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트 : n-헥산 = 1 : 2)로 정제하여 벤질리덴(12)(16 mg, 16%)을 얻었다. ¹H-NMR (600 MHz, CDCl₃) δ 7.68 (s, 1H), 6.95-6.87 (m, 2H), 6.25 (d, 2H, J = 6.0 Hz), 5.65 (s, 1H), 4.26 (t, 2H, J = 6.6 Hz), 3.88-3.81 (m, 12H), 2.96 (t, 2H, J = 6.6 Hz); ¹³C-NMR (150 MHz, CDCl₃) δ 192.2, 156.4, 151.9, 147.1, 145.4, 137.6, 134.2, 129.0, 121.0, 115.0, 110.6, 101.3, 71.9, 61.0, 56.0, 55.9, 26.8; LRMS (ESI) m/z 387 (M+H).

실시예 7

본 실시예에서는 도 4에 도해된 바와 같이 크레마스트라논 유사체 13 및 14의 합성 방법이 기재된다.

( E )-에틸 3-(3,4,5-트리메톡시페닐)아크릴레이트. 0 ℃에서 3,4,5-트리메톡시벤즈알데히드(1.0 g, 5.1 mmol)의 CH₂Cl₂ 용액(6 mL)에 (에톡시카보닐메틸렌)트리페닐포스포란(2.1 g, 6.1 mmol)을 가하였다. 실온에서 밤새 교반한 후, 반응 혼합물을 감압하에 농축시키고 잔류물을 실리카 겔 상에서 플래쉬 칼럼 크로마토그래피(에틸아세테이트 / n-헥산 = 1 : 6)로 정제하여 (E)-에틸 3-(3,4,5-트리메톡시페닐)아크릴레이트(460 mg, 34%)를 얻었다. 화합물은 문헌(Kumar et al. Biochemistry 44, 15944-15952, (2005))에 보고되어 있다.

에틸 3-(3,4,5-트리메톡시페닐)프로파노에이트. (E)-에틸 3-(3,4,5-트리메톡시페닐)아크릴레이트(460 mg, 1.7 mmol)의 메탄올 용액(4 mL)에 10% 탄소상 팔라듐을 가하였다. 반응 혼합물을 24 시간 동안 풍선을 사용하여 H₂ 대기하에 교반하고, 셀라이트 패드를 통해 여과하였다. 여액을 감압하에 농축시키고, 잔류물을 실리카 겔 상에서 플래쉬 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 에틸 3-(3,4,5-트리메톡시페닐)프로파노에이트(460 mg, 82%)를 얻었다. ¹H-NMR (600 MHz, CDCl₃) δ 6.3 (s, 1H), 4.11 (q, 2H), 3.81-3.78 (m, 9H), 2.86 (t, 2H, J = 1.8 Hz), 2.58 (t, 2H, J = 1.8 Hz).

5,6,7-트리메톡시-2,3-디하이드로-1 H -인덴-1-온. 25 mL 둥근-바닥 플라스크에 에틸 3-(3,4,5-트리메톡시페닐)프로파노에이트(460 mg, 1.7 mmol) 및 폴리인산(5 g, 16 mmol)을 가하였다. 150 ℃에서 5 시간 동안 가열한 후, 반응 혼합물을 얼음에 붓고 포화 NaHCO₃ 용액을 사용하여 pH 7로 중화시켰다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(50 mL x 3)로 추출하고, 유기상을 합하여 MgSO₄ 상에서 건조시키고, 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 상에서 플래쉬 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트 / n-헥산 = 1 : 3)로 정제하여 황색 고체로 5,6,7-트리메톡시-2,3-디하이드로-1H-인덴-1-온(85 mg, 22%)을 얻었다. ¹H-NMR (600 MHz, CDCl₃) δ 6.60 (s, 1H), 3.97 (s, 3H), 3.86 (s, 3H), 3.78 (s, 3H), 2.95 (t, 2H, J = 6.0 Hz), 2.59 (t, 2H, J = 6.0 Hz); ¹³C-NMR (150 MHz, CDCl₃) δ 203.1, 159.6, 153.2, 151.5, 140.6, 122.9, 103.7, 61.9, 61.4, 56.2, 37.2, 25.7; LRMS (ESI) m/z 223 (M+H).

( E )-2-(3-하이드록시-4-메톡시벤질리덴)-5,6,7-트리메톡시-2,3-디하이드로-1 H -인덴-1-온(13). 5,6,7-트리메톡시-2,3-디하이드로-1H-인덴-1-온(40 mg, 0.2 mmol)의 벤젠 용액(6.0 mL)에 이소바닐린(61 mg, 0.4 mmol) 및 p-톨루엔설폰산(54 mg, 0.3 mmol)을 가하였다. 2.5 시간 동안 딘-스탁 장치를 사용하여 환류시킨 후, 반응 혼합물을 냉각시키고, 포화 NaHCO₃로 켄칭하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(30 mL x 3)로 희석하고, 물로 세척하고, 유기상을 합하여 MgSO₄ 상에서 건조시킨 다음 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 상에서 플래쉬 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트 / n-헥산 = 2 : 3)로 정제하여 (E)-2-(3-하이드록시-4-메톡시벤질리덴)-5,6,7-트리메톡시-2,3-디하이드로-1H-인덴-1-온(13)(39 mg, 54%)을 얻었다. ¹H-NMR (600 MHz, CDCl₃) δ 7.47 (t, 1H, J = 1.8 Hz), 7.26 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 7.15 (dd, 1H, J = 8.4 및 1.8 Hz), 6.91 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 6.76 (s, 1H), 5.71 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 4.10 (s, 3H), 3.96 (s, 3H), 3.94 (s, 3H), 3.92 (s, 2H), 3.88 (s, 3H); ¹³C-NMR (150 MHz, CDCl₃) δ 191.0, 159.4, 152.4, 147.6, 147.5, 145.7, 141.0, 133.6, 131.9, 129.2, 124.6, 124.2, 115.3, 110.6, 103.5, 62.2, 61.5, 56.3, 56.0, 32.4; LRMS (ESI) m/z 357 (M+H).

6,7,8-트리메톡시-3,4-디하이드로이소퀴놀린-1(2 H )-온. 0 ℃에서 5,6,7-트리메톡시-2,3-디하이드로-1H-인덴-1-온(37 mg, 0.16 mmol)의 CH₂Cl₂ 용액(1 mL)에 메탄설폰산(1 mL, 15 mmol) 및 소듐 아지드(25 mg, 0.38 mmol)를 가하였다. 0 ℃에서 2 시간 동안 그리고 실온에서 밤새 교반한 후, 반응 혼합물을 얼음에 붓고 CH₂Cl₂로 추출하였다. 유기상을 합하여 MgSO₄상에서 건조시키고 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 상에서 플래쉬 칼럼 크로마토그래피(MeOH / CH₂Cl₂ = 1 : 15)로 정제하여 6,7,8-트리메톡시-3,4-디하이드로이소퀴놀린-1(2H)-온(36 mg, 90%)을 얻었다. ¹H-NMR (600 MHz, CDCl₃) δ 6.50 (s, 1H), 5.74 (s, 1H), 3.95 (s, 3H), 3.89 (s, 3H), 3.87 (s, 3H), 3.44 (dt, 2H, J = 6.6 및 3.0 Hz), 2.88 (t, 2H, J = 6.6 Hz); LRMS (ESI) m/z 238 (M+H).

2 - (3-(벤질옥시)-4-메톡시벤질)-6,7,8-트리메톡시-3,4-디하이드로이소퀴놀린-1(2H)-온(14). 0 ℃에서 6,7,8-트리메톡시-3,4-디하이드로이소퀴놀린-1(2H)-온(10 mg, 0.04 mmol)의 DMF 용액(1 mL)에 수소화나트륨(26 mg, 0.4 mmol)을 가하였다. 실온에서 30 분간 교반한 후, 반응 혼합물을 0 ℃에서 2-(벤질옥시)-4-(브로모메틸)-1-메톡시벤젠(16 mg, 0.05 mmol)으로 처리하고 실온에서 16 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물로 켄칭하고 CH₂Cl₂로 추출하였다. 유기상을 합하여 MgSO₄ 상에서 건조시키고 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 상에서 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트 / n-헥산 = 1 : 1)로 정제하여 2-(3-(벤질옥시)-4-메톡시벤질)-6,7,8-트리메톡시-3,4-디하이드로이소퀴놀린-1(2H)-온(14)(17 mg, 87%)을 얻었다. ¹H-NMR (600 MHz, CDCl₃) δ 7.37 (d, 2H, J = 7.2 Hz), 7.18-7.16 (m, 3H), 6.87 (d,1H), 6.88-6.70 (m, 2H), 6.40 (s, 1H), 5.13 (s, 2H), 4.62 (s, 2H), 4.02 (s, 3H), 3.88 (t, 9H, J = 4.2 Hz), 3.21 (t, 2H, J = 6.6 Hz), 2.54 (t, 2H, J = 6.6 Hz); LRMS (ESI) m/z 464 (M+H).

실시예 8

본 실시예에서는 도 5에 도해된 바와 같이, 바이오티닐화 화합물(16 및 17)의 합성이 기재된다.

(E)- tert -부틸 2- (2-메톡시-5- ((5,6,7- 트리메톡시 -4- 옥소크로만 -3- 일리덴 ) 메틸 )페녹시)아세테이트. 4-벤질리덴크로마논(16 mg, 0.043 mmol)의 아세톤 용액(5 mL)에 tert-부틸 브로모아세테이트(17 mg, 0.086 mmol) 및 K₂CO₃(18 mg, 0.13 mmol)를 가하였다. 3 시간 동안 환류시킨 후, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 유기상을 합하여 물 및 브린으로 세척하고, MgSO₄상에서 건조시키고, 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 상에서 플래쉬 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트 / n-헥산 = 1 : 1)로 정제하여 tert-부톡시아세테이트(20 mg, 95%)를 얻었다. ¹H-NMR (600 MHz, CDCl₃) δ 7.72 (s, 1H), 6.94 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 6.92 (dd, 1H, J = 8.4 및 1.2 Hz), 6.75 (d, 1H, J = 1.8 Hz), 6.25 (s, 1H), 5.22 (d, 2H, J = 1.2 Hz), 4.59 (s, 2H), 3.98 (s, 3H), 3.92 (s, 3H), 3.88 (s, 3H), 3.83 (s, 3H), 1.48 (s, 9H); ¹³C-NMR (150 MHz, CDCl₃) δ 179.4, 167.6, 159.3, 159.2, 154.7, 150.6, 147.2, 137.8, 136.0, 127.3, 124.6, 115.5, 111.7, 110.5, 96.1, 82.5, 67.5, 66.5, 61.6, 61.3, 60.3, 56.1, 56.0, 28.0; LRMS (ESI) m/z 487 (M+H).

(E)-2-(2-메톡시-5-((5,6,7-트리메톡시-4-옥소크로만-3-일리덴)메틸)페녹시)아세트산(도 5의 a). tert-부톡시아세테이트(11 mg, 0.023 mmol)의 CH₂Cl₂ 용액(2 mL)에 TFA를 가하였다. 실온에서 2.5 시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 상에서 플래쉬 칼럼 크로마토그래피(MeOH / CH₂Cl₂= 1 : 10)로 정제하여 아릴옥시아세트산(A)(7 mg, 70%)을 얻었다. ¹H-NMR (600 MHz, CD₃OD) δ 7.65 (s, 1H), 7.08 (d, 1H, J = 6.6 Hz), 6.97 (m, 1H), 6.91 (s, 1H), 6.37 (d, 1H, J = 1.8 Hz), 5.22 (s, 2H), 4.57 (s, 2H), 3.92 (s, 3H), 3.89 (s, 3H), 3.87 (s, 3H), 3.76 (s, 3H); LRMS (ESI) m/z 429 (M-H).

(4-하이드록시페닐)(4-(프로프-2-인-1-일옥시)페닐)메탄온. 4,4'-디하이드록시벤조페논(512 mg, 2.4 mmol)의 아세톤 용액(5.0 mL)에 프로파길 브로마이드(0.21 mL, 2.4 mmol) 및 K₂CO₃(495 mg, 3.6 mmol)를 가하였다. 5 시간 동안 환류시킨 후, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 유기상을 합하여 물 및 브린으로 세척하고, MgSO₄상에서 건조시키고, 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 상에서 플래쉬 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트 / n-헥산 = 1 : 2)로 정제하여 프로파길화 벤조페논(197 mg, 33%)을 얻었다.

tert-부틸 (3-(4-(4-(프로프-2-인-1-일옥시)벤조일)페녹시)프로필)카바메이트(도 5의 b). 실온에서 N-Boc 3-아미노프로판올(117 mg, 0.76 mmol)의 THF 용액(2 mL)에 프로파길화 벤조페논(140 mg, 0.56 mmol), PPh₃(150 mg, 0.76 mmol), 및 DIAD(130 ㎕, 0.56 mmol)를 가하였다. 실온에서 3 시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 유기상을 합하여 물 및 브린으로 세척하고 MgSO₄상에서 건조시키고, 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 상에서 플래쉬 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트 / n-헥산 = 1 : 3)로 정제하여 디알킬화 디하이드록시벤조페논(B)(160 mg, 70%)을 얻었다. ¹H-NMR (600 MHz, CDCl₃) δ 7.77 (dd, 4H, J = 9.0 및 5.0 Hz), 7.03 (d, 2H, J = 9.0 Hz), 6.93 (d, 2H, J = 9.0 Hz), 4.82 (bs, 1H), 4.75 (d, 2H, J = 1.2 Hz), 4.09 (t , 2H, J = 6.0 Hz), 3.33 (m, 2H), 2.56 (t, 1H, J = 2.4 Hz), 2.01 (m, 1H), 1.42 (s, 9H), 1.25 (m, 1H); ¹³C-NMR (150 MHz, CDCl₃) δ 194.3, 162.1, 160.6, 156.0, 132.2, 132.1, 131.5, 130.6, 114.3, 113.9, 77.8, 76.1, 65.9, 55.8, 37.8, 29.5, 28.4, 14.2; LRMS (ESI) m/z 432 (M+H).

N-(2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에틸)-5-((3aS,4S,6aR)-2-옥소헥사하이드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일)펜탄아미드. 실온에서 바이오틴-ONp(50 mg, 0.14 mmol)의 THF 용액(1 mL)에 11-아지도-3,6,9-트리옥사운데칸-1-아민(27 ㎕, 0.14 mmol) 및 Et₃N(57 ㎕, 0.41 mmol)을 가하였다. 실온에서 12 시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 H₂O(1 mL)로 켄칭하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 3회 추출하고, 유기상을 합하여 브린으로 세척하고, MgSO₄상에서 건조시키고, 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 상에서 플래쉬 칼럼 크로마토그래피(MeOH / CH₂Cl₂ = 1 : 10)로 정제하여 아지드(30 mg, 49%)를 얻었다. ¹H-NMR (600 MHz, CDCl₃) δ 6.83 (m, 1H), 6.73 (m, 1H), 5.78 (m, 1H), 4.50 (m, 1H), 4.30 (m, 1H), 3.65 (m, 8H), 3.62 (m, 2H), 3.56 (m, 2H), 3.42-3.37 (m, 4H), 3.13 (m, 1H), 2.90 (m, 1H), 2.74 (d, 1H, J = 13 Hz), 2.22 (t, 2H, J = 7.8 Hz), 1.75-1.62 (m, 4H), 1.44-1.41 (m, 2H); LRMS (ESI) m/z 467 (M+H).

Boc-보호된 벤조페논-바이오틴. 실온에서 벤조페논(B)(35 mg, 0.086 mmol) 및 PEG-바이오틴(38 mg, 0.086 mmol)의 t-BuOH/H₂O 용액(2 mL, 1 : 1)에 CuSO₄·5H₂O(2 mg, 0.086 mmol) 및 아스코르브산나트륨(H₂O 중의 1.0 M, 2 방울)을 가하였다. 실온에서 24 시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 H₂O(1 mL)로 희석하고, 에틸 아세테이트로 추출하고, 유기상을 합하여 브린으로 세척하고, MgSO₄ 상에서 건조시키고, 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 상에서 플래쉬 칼럼 크로마토그래피(MeOH / CH₂Cl₂ = 1 : 10)로 정제하여 1,2,3-트리아졸(30 mg, 40%)을 얻었다. ¹H-NMR (600 MHz, CDCl₃) δ 7.86 (s, 1H), 7.77 (dd, 4H, J = 8.4 및 2.4 Hz), 7.06 (d, 2H, J = 9.0 Hz), 6.94 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 6.67 (bs, 1H), 6.45 (bs, 1H), 5.49 (bs, 1H), 5.28 (s, 2H), 4.82 (bs, 1H), 4.57 (t, 2H, J = 4.8 Hz), 4.47 (m, 1H), 4.28 (m, 1H), 4.10 (t, 2H, J = 6.0 Hz), 3.89 (t, 2H, J = 4.8 Hz), 3.65 (m, 2H), 3.60 (m, 2H), 3.56 (m, 6H), 3.52 (t, 2H, J = 4.8 Hz), 3.41-3.33 (m, 4H), 3.12 (m, 1H), 2.88 (m, 1H), 2.73 (m, 1H), 2.19 (t, 2H, J = 7.2 Hz), 2.03 (m, 2H), 1.75-1.58 (m, 6H), 1.43 (s, 9H), 1.41 (m, 2H); ¹³C-NMR (150 MHz, CDCl₃) δ 194.4, 173.2, 162.1, 161.4, 156.0, 143.2, 132.2, 132.2, 131.2, 130.5, 124.3, 114.3, 113.9, 70.67, 70.51, 70.48, 70.37, 70.34, 70.11, 70.04, 69.92, 69.39, 65.95, 62.05, 61.75, 60.15, 55.54, 50.67, 50.38, 40.53, 39.11, 37.83, 29.51, 28.42, 28.18, 28.09, 25.58; LRMS (ESI) m/z 854 (M+H).

벤조페논-바이오틴의 암모늄염(17). 0 ℃에서 Boc-보호된 벤조페논-바이오틴(20 mg, 0.028 mmol)의 CH₂Cl₂ 용액(2 mL)에 TFA(0.4 mL)를 가하였다. 실온에서 2.5 시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 감압하에 농축시켜 비정제 암모늄 트리플루오로아세테이트(17)(16 mg, 72%)를 얻었다. 비정제 암모늄염을 추가의 정제 없이 다음 반응에 사용하였다. ¹H-NMR (600 MHz, CD₃OD) δ 8.17 (s, 1H), 7.77 (d, 4H, J = 8.4 Hz), 7.16 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 7.08 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 5.28 (s, 2H), 4.62 (m, 4H), 4.23 (t, 2H, J = 6.0 Hz), 3.91 (t, 2H, J = 5.0 Hz), 3.65 (m, 2H), 3.59-3.55 (m, 8H), 3.48 (m, 2H), 3.18 (t, 2H, J = 7.2 Hz), 3.12-3.01 (m, 2H), 2.20 (m, 4H), 1.89 (m, 2H), 1.66 (m, 4H); LRMS (ESI) m/z 776 (M+Na).

크레마스트라논 유사체-벤조페논-바이오틴(16). 카복실산(A)(6.9 mg, 0.016 mmol)의 DMF 용액(1 mL)에 HBTU(10 mg, 0.026 mmol) 및 DIPEA(10 ㎕, 0.057 mmol)를 가하였다. 30 분간 교반한 후, 암모늄염(17)(12 mg, 0.016 mmol)의 DMF 용액(0.5 mL)을 반응 혼합물에 가하였다. 24 시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고, MgSO₄상에서 건조시키고, 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 상에서 플래쉬 칼럼 크로마토그래피(MeOH / CH₂Cl₂ = 1 : 10)로 정제하여 크레마스트라논-벤조페논-바이오틴(16)(5.6 mg, 30%)을 얻었다. ¹H-NMR (600 MHz, CDCl₃) δ 8.01 (s, 1H), 7.91 (s, 1H), 7.76-7.73 (m, 5H), 7.71 (s, 1H), 7.23 (m, 1H), 7.07 (d, 2H, J = 9 Hz), 6.96-6.92 (m, 4H), 6.84 (s, 1H), 6.44 (bs, 1H), 6.25 (s, 1H), 5.60 (bs, 1H), 5.29 (s, 2H), 5.28 (s, 2H), 5.20 (d, 2H, J = 1.8 Hz), 4.86 (bs, 1H), 4.60 (t, 2H, J = 4.8 Hz), 4.56 (s, 2H), 4.12-4.10 (m, 2H), 3.97 (s, 3H), 3.91 (t, 2H, J = 4.8 Hz), 3.88 (s, 3H), 3.87 (s, 3H), 3.83 (s, 3H), 3.72-3.67 (m, 8H), 3.54 (m, 2H), 3.17 (m, 6H), 2.95 (s, 2H), 2.88 (s, 2H), 2.20 (m, 2H), 2.11 (m, 2H), 1.48 (m, 8H); LRMS (ESI) m/z 1189 (M+Na).

실시예 9

본 실시예에서는, 인간 탯줄 혈관 내피 세포(human umbilical vascular endothelial cell; HUVEC) 및 인간 망막 미세혈관 내피 세포(HREC)의 증식에 대한, 실시예 1 및 2에서 제조된 합성 크레마스트라논(1) 및 SH-11052(2)의 효과를 분석하였다.

C. appendiculata로부터 분리된 화합물 1은 HUVEC 증식 어세이에서 낮은 마이크로몰 범위의 50% 성장 저해(GI₅₀) 농도 값을 동반하는 항-증식 효과를 나타낸 것으로 보고되었다. 합성 크레마스트라논(1) 및 SH-11052(2)가 유사한 효과를 나타내는지 시험하기 위하여, 완전 배지에 의해 유도된 HUVEC의 증식을 0.5 nM 내지 500 μM의 농도 범위의 합성 크레마스트라논(1) 및 SH-11052(2)의 존재 하에 감시하였다.

특히, 96-웰 투명 바닥 블랙 플레이트에, 세포(2,500 세포/웰)를 100 ㎕ EGM-2의 총 부피로 접종하였다. 37 ℃ 및 5% CO₂에서 플레이트를 24 시간 인큐베이션한 후에 합성 크레마스트라논(1) 또는 SH-11052(2)의 DMSO 용액을 0.5 nM 내지 500 μM(최종 DMSO 농도 = 1%)의 농도 범위로 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 48 시간 동안 추가로 인큐베이션한 후에 11.1 ㎕의 ALAMARBLUE® 시약을 각각의 웰에 첨가하였다. ALAMARBLUE®의 첨가로부터 4 시간 후에 각각 560 nm 및 590 nm의 여기 파장 및 방출 파장으로 형광 판독값을 취하고, 그래프패드 프리즘 소프트웨어(v. 6.0)에서 데이터를 분석하였다. 용량 반응 곡선을 생성시키고 하기 수학식을 사용하여 GI₅₀ 값을 계산하였다:

Y = 100/(1 + 10^(X - LogGI ₅₀ )).

도 6a 내지 6d에 나타낸 바와 같이, 합성 크레마스트라논(1) 및 SH-11052(2) 양자 모두는 HUVEC 및 더 질환-관련성인 HREC 양자 모두에서 시험관내 항-증식 활성을 나타냈다.

세포 증식의 저해를 확인하기 위하여, SH-11052(2)의 존재 하에 내피 세포 내로의 5-에티닐-2'-데옥시우리딘(EdU)의 혼입을 추가로 감시하였다. 특히, 6-웰 플레이트에 넣은 부착 인자(Cell Systems, Kirkland, WA, USA)로 코팅된 커버슬립 상에 세포(25,000/커버슬립)를 접종하고 EGM-2 중의 표시된 농도의 SH-11052(2)와 함께 37 ℃ 및 5% CO₂에서 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 8 시간 동안 세포를 혈청 기아 처리하고 10 μM EdU를 함유하는 EGM-2로 배지를 교체하였다. 추가의 8 시간 동안 플레이트를 추가로 인큐베이션한 후에 표지된 DNA의 검출을 위해 세포를 처리하였다(클릭-iT EdU 어세이 키트에 대한 제조자 지침에 따름). EVOS 형광 현미경(AMG, Mill Creek, WA, USA)을 사용하여 영상을 취하고 이미지J 소프트웨어를 사용하여 6개의 무작위 선택된 시야에서 DAPI 염색된 세포 및 EdU 염색된 세포의 수를 계수하였다. HREC 및 HUVEC 양자 모두에서 SH-11052(2)에 의해 용량 의존적 방식으로 DNA 합성이 유의적으로 저해되었다(도 7a 내지 7d).

실시예 10

본 실시예에서는, 인간 망막 미세혈관 내피 세포(HREC)의 혈관신생 능력에 대한, 실시예 2에서 제조된 SH-11052(2)의 효과를 평가하였다.

HREC의 사용을 위한 약간의 수정을 동반하여, 문헌[Ponce (2001) In vitro matrigel angiogenesis assays, Methods Mol Med 46: 205-209]에 기재된 바와 같이 마트리겔 어세이를 실행하였다. 약술하면, HREC를 EBM-2 중의 0.5% FBS에서 밤새 기아 처리하고 96-웰 플레이트 상에서 50 ㎕의 마트리겔 고농도 기저막(high concentration basement membrane) 위에 7,500 세포/웰의 밀도로 플레이팅하였다. EBM-2 + 1% FBS 중의 표시된 농도로 SH-11052(2)를 첨가하였다. 매 2 시간마다 명시야 현미경에 의해 40×배율로 관 형성(tube formation)에 대해 세포를 관찰하였다. 플레이팅 후 8 시간에 폐쇄 단위(closed unit)(다각형)를 수동으로 계수하고 DMSO 대조군에 대해 수를 정규화하였다. 어세이는 삼중실험으로 실행하였다.

SH-11052(2)로 처리된 HREC는 DMSO 처리 샘플과 비교하여 그들의 관 형성 능력에 있어서 유의적인 감소를 나타냈다(도 8a). GI₅₀ 값에서 SH-11052(2)의 존재 하에, 관 형성의 유의적인 감소가 있었고 관의 네트워크가 붕괴하였으며(도 8a의 다각형 공간) 140 μM에서는 관 형성 능력이 완전히 사라졌다(도 8b).

추가로, 부착 인자(Cell Systems, Kirkland, WA, USA)로 코팅된 커버슬립 상에 세포(25,000/커버슬립)를 접종하고 ~80% 컨플루언스가 달성되었을 때까지 EGM-2 중에 37 ℃ 및 5% CO₂에서 인큐베이션하였다. 이어서, 표시된 농도의 SH-11052(2)와 함께 4 시간 동안 세포를 인큐베이션하였다. 스타우로스포린(SP; 1 μM)을 양성 대조군으로 사용하였다. 인큐베이션 후에, 4% 파라포름알데히드 중에 20 분 동안 실온에서 세포를 고정시킨 후에 트리스 완충 식염수 pH 7.4(TBS) 중에 신속하게 3회 세척하였다. 0.5% 트리톤(Triton) X-100과 함께 10 분 동안 인큐베이션함으로써 세포를 투과화한 후에 TBS + 1% 소 혈청 알부민(BSA) 중의 10% 차단 용액(block solution)(DAKO, Glostrup, Denmark) 중에 1 시간 동안 차단하였다. 이어서, 분해된 캐스파제-3(D175) 항체(1:200 희석)와 함께 4 ℃에서 밤새 세포를 인큐베이션하였다. 다이라이트(Dylight) 555 접합된 염소 항-토끼 2차 항체(1:400)를 사용하여 분해된 캐스파제-3 항체를 탐색하였다. 핵 염색을 위해, DAPI를 함유하는 벡타쉴드 마운팅 배지(Vector Labs, Burlingame, CA, USA)를 사용하여 커버슬립을 마운팅하였다. LSM 700 공초점 현미경(Zeiss, Thornwood, NY, USA)을 사용하여 세포를 영상화하였다.

도 8c 및 8d에 나타낸 바와 같이, 분해된 캐스파제-3 염색에 의해 결정할 때, SH-11052(2)는 심지어 100 μM에서도 HREC의 무시할 만한 세포자멸을 야기하였다.

실시예 11

SH-11052(2)의 항-혈관신생 활성을 규명한 후에 HREC에서의 그의 활성의 기전적 상세사항을 분석하였다. 특히, 병리학적 혈관 신생에서 염증이 중대한 역할을 하므로, 본 실시예에서는 내피 세포에서의 염증성 신호전달에 대한 SH-11052(2)의 효과를 분석하였다.

부착 인자(Cell Systems, Kirkland, WA, USA)로 코팅된 커버슬립 상에 세포(25,000/커버슬립)를 접종하고 37 ℃ 및 5% CO₂에서 24 시간 동안 EGM-2 중에 인큐베이션하였다. 0.1% 혈청-EBM-2 중에 8 시간 동안에 이어서, 상이한 농도의 SH-11052(2)의 존재 하에 0.1% 혈청-EBM-2 배지 중에 1 시간 동안 세포를 기아 처리하였다. 공지된 전염증성 사이토카인이며 NF-κB의 인듀서인 10 ng/ml TNF-α로 20 분 동안 세포를 유도하고, 4% 파라포름알데히드 용액으로 20 분 동안 실온에서 고정시켰다. NF-κB는 그의 전사 활성을 핵 내에서 발휘하므로, NF-κB의 자극-유도 핵 전위의 차단은 NF-κB 경로 저해의 징후이다.

세포를 TBS 중에 신속하게 3회 세척하고 0.5% 트리톤 X-100과 함께 10 분 동안 인큐베이션함으로써 투과화하였다. TBS + 1% BSA 중의 10% 차단 용액(DAKO)에서 세포를 차단한 후에 NF-κB p65에 대한 항체(1:50 희석)와 함께 인큐베이션하였다. 다이라이트 488-접합된 염소 항-마우스 2차 항체(1:200 희석)를 사용하여 NF-κB p65 항체를 탐색하였다. 핵 염색을 위해, DAPI(Vector Labs)를 함유하는 벡타쉴드 마운팅 배지를 사용하여 커버슬립을 마운팅하였다. LSM 700 공초점 현미경(Zeiss)을 사용하여 세포를 영상화하였다.

6-웰 플레이트에 HREC를 10⁵ 세포/웰로 접종하고 37 ℃에서 24 시간의 인큐베이션 후에 0.1% 혈청-EBM-2 중에 8 시간 동안 세포를 혈청 기아 처리하였다. 이어서, 표시된 농도의 SH-11052(2)로 1 시간 동안 세포를 처리한 후에 20 ng/ml의 TNF-α를 첨가하였다. 20 분 후에, 25 mM HEPES pH 7.4, 1% NP-40, 150 mM NaCl, 10% 글리세롤, 1 mM 소듐 오르토바나데이트, 10 mM 소듐 플루오라이드, 1 mM 소듐 피로포스페이트, 1 mM PMSF, 2.5 mg/ml 아프로티닌, 1 mM 펩스타틴, 및 1 mM 류펩틴을 함유하는 NP-40 용해 완충액 중에 세포를 용해시켰다. 브래드포드 어세이에 의해 측정할 때 동일한 양의 단백질(80 ㎍)을 10% SDS-PAGE 상에 주행시키고, PVDF 막에 이전하고, TBS-0.05% 트윈-20 중의 5% BSA로 차단하고, 표시된 1차 항체(TBS-0.05% 트윈-20 중의 1% BSA 중에 1:1000)로 4 ℃에서 밤새 면역블로팅하였다. TBS-0.05% 트윈-20 중에 3회 세척한 후에, HRP-접합된 2차 항체(TBS-0.05% 트윈-20 중의 5% BSA 중에 1:5000)를 실온에서 1 시간 동안 적용하였다. 3회 세척 후에, ECL 프라임(Prime) 웨스턴 블롯 검출 시약(GE Life Sciences, Piscataway, NJ, USA) 및 퀀터티 원 소프트웨어(Bio-Rad)를 실행시키는 XRS 겔 다큐멘테이션 시스템(gel documentation system)을 사용하여 단백질 밴드를 검출하고 밀도측정하였다. 표적 단백질 밴드 강도를 하우스키핑 유전자 α-튜불린에 대해 정규화하였다. 인단백질 분석을 위해, 각각의 인단백질의 정규화된 신호를 그 단백질의 정규화된 총량에 대해 표현하였다.

면역형광에 의해 감시된 바와 같이, TNF-α 자극시의 NF-κB의 핵 전위는 SH-11052(2)에 의해 용량 의존적 방식으로 저해되었다(도 9a). IκB-α는 NF-κB에 결합하여 그의 핵 전위를 방지하는 저해 단백질이다. TNF-α 자극시에, IκB-α는 인산화되고 분해되어, 핵 전위를 위해 NF-κB를 유리시킨다. SH-11052(2)의 존재 하에서는, TNF-α-매개된 IκB-α 분해가 용량 의존적 방식으로 유의적으로 감소하였으며, 이는 SH-11052(2)가 NF-κB 신호전달을 저해했음을 추가로 나타낸다(도 9b 및 9c).

TNF-α 경로의 저해를 확인하기 위하여, 사이토카인 유도 세포 증식에 참여하는 TNF-α 경로의 중요한 다운스트림 표적인 p38 마이토겐 활성화 단백질 키나제(mitogen activated protein kinase; MAPK)의 활성화 인산화를 감시하였다. SH-11052(2)는 p38 MAPK의 인산화를 용량 의존적 방식으로 저해하였다(도 9d 및 9e).

실시예 12

본 실시예에서는, SH-11052(2)의 존재하에 NF-κB 유도 유전자의 발현을 분석하였다.

부착 인자(Cell Systems, Kirkland, WA, USA)로 코팅된 커버슬립 상에 세포(25,000/커버슬립)를 접종하고 37 ℃ 및 5% CO₂에서 24 시간 동안 EGM-2 중에 인큐베이션하였다. 0.1% 혈청-EBM-2 중에 8 시간 동안 세포를 기아 처리한 후, 상이한 농도의 SH-11052(2)의 존재 하에 0.1% 혈청-EBM-2 배지 중에 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 10 ng/ml의 TNF-α로 24 시간 동안 세포를 시험하고 4% 파라포름알데히드 용액으로 20 분 동안 실온에서 고정시켰다. 커버슬립을 TBS 중에 신속하게 3회 세척하고 1×TBS-1% BSA 완충액 중에 제조된 10% 차단 용액(DAKO)을 사용하여 차단하였다. VCAM-1(내피 세포 상에 특이적으로 발현되는 세포 부착 분자로서, 그의 발현은 TNF-α 신호전달시에 NF-κB에 의해 유도됨)에 대한 항체(1:100 희석)와 함께 커버슬립을 16 시간 동안 4 ℃에서 인큐베이션한 후, TBS-0.1% BSA 완충액 중에 3회 세척하였다. 다이라이트 555-접합된 2차 항체(1:200)를 사용하여 VCAM-1 항체에 대해 탐색하였다. TBS-0.1% BSA 중에 3회 세척한 후에, DAPI 핵 염료를 함유하는 벡타쉴드 마운팅 배지를 사용하여 커버슬립을 마운팅하였다. LSM 700 공초점 현미경을 사용하여 세포를 영상화하였다. 메타모프 소프트웨어(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 형광 신호 강도에 대해 영상을 분석하였다.

SH-11052(2)의 존재 하에 VCAM-1 단백질 발현에는 유의적인 용량-의존적 감소가 있었다(도 10a 및 10b).

마찬가지로, NF-κB에 의해 유도될 수 있는 전염증성 분자 IL8, PTGS2(COX2), 및 CCL2(MCP-1)의 mRNA 발현을 SH-11052(2)의 존재 하에 분석하였다. 세포(10⁵/웰)를 6-웰 플레이트에 접종하고 24 시간 동안 37 ℃ 및 5% CO₂에서 인큐베이션하였다. 이어서, 0.1% 혈청-EBM-2 중에 12 시간 동안 세포를 기아 처리한 후에 상이한 농도의 SH-11052(2)의 존재 하에 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 10 ng/ml TNF-α로 24 시간 동안 시험하였다. 인큐베이션 후에, 세포를 용해시키고 트리졸(Trizol) 시약(Life Technologies)을 사용하여 RNA를 분리하였다. 무작위 프라이머 및 M-MuLV 역전사 효소(New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)를 사용하여 80 ng의 총 RNA로부터 cDNA를 제조하였다. 택맨 패스트 진 익스프레션 어세이 키트(TaqMan Fast Gene Expression Assay Kit)를 사용하여 제조자 지침에 따라 RT-PCR 반응을 설정하였다. PTGS2(Hs00153133_m1), CCL2(Hs00234140_m1), IL8(Hs00174103_m1), 및 대조군, TBP(Hs99999910_m1), 유전자에 대한 FAM-표지 택맨 탐침을 사용하여 이들 유전자의 발현 수준을 감시하였다. ViiATM 7 qPCR 시스템(Life Technologies)에서 qRT-PCR 플레이트를 판독하고 ΔΔC_t 방법을 사용하여 데이터를 분석하였다. 유전자의 발현 수준을 TBP 유전자 발현에 대해 정규화하고, DMSO-처리된 비자극 샘플에 대해 보정하였다. SH-11052(2)는 이들 전염증성 분자의 발현을 감소시켰다(도 10c).

실시예 13

본 실시예에서는, VEGF 신호전달에 대한 SH-11052(2)의 효과를 감시하였다.

HREC를 10⁵ 세포/웰로 6-웰 플레이트에 접종하고 37 ℃에서 24 시간의 인큐베이션 후에 0.1% 혈청-EBM-2 중에 8 시간 동안 세포를 혈청 기아 처리하였다. 이어서, 세포를 표시된 농도의 SH-11052(2)로 1 시간 동안 처리한 후에 100 ng/ml VEGF를 첨가하였다. 20 분 후에, 25 mM HEPES pH 7.4, 1% NP-40, 150 mM NaCl, 10% 글리세롤, 1 mM 소듐 오르토바나데이트, 10 mM 소듐 플루오라이드, 1 mM 소듐 피로포스페이트, 1 mM PMSF, 2.5 mg/ml 아프로티닌, 1 mM 펩스타틴, 및 1 mM 류펩틴을 함유하는 NP-40 용해 완충액 중에 세포를 용해시켰다. 브래드포드 어세이에 의해 측정할 때 동일한 양의 단백질(80 ㎍)을 10% SDS-PAGE 상에 주행시키고, PVDF 막에 이전하고, TBS-0.05% 트윈-20 중의 5% BSA로 차단하고, 표시된 1차 항체(TBS-0.05% 트윈-20 중의 1% BSA 중에 1:1000)로 4 ℃에서 밤새 면역블로팅하였다. TBS-0.05% 트윈-20 중에 3회 세척한 후에, HRP-접합된 2차 항체(TBS-0.05% 트윈-20 중의 5% BSA 중에 1:5000)를 실온에서 1 시간 동안 적용하였다. 3회 세척 후에, ECL 프라임 웨스턴 블롯 검출 시약(GE Life Sciences, Piscataway, NJ, USA) 및 퀀터티 원 소프트웨어(Bio-Rad)를 실행시키는 XRS 겔 다큐멘테이션 시스템을 사용하여 단백질 밴드를 검출하고 밀도측정하였다. 표적 단백질 밴드 강도를 하우스키핑 유전자 α-튜불린에 대해 정규화하였다. 인단백질 분석을 위해, 각각의 인단백질의 정규화된 신호를 그 단백질의 정규화된 총량에 대해 표현하였다.

VEGF 신호전달은 혈관신생에 대한 주요 기여자이므로, 염증 유도 TNF-α 신호전달과 함께 VEGF 신호전달을 저해하는 SH-11052(2)의 능력을 분석하였다. VEGF 자극시에, VEGF 수용체 2(VEGFR2)가 자가인산화되어, PI3K/Akt 경로의 활성화를 유발한다. SH-11052(2)는 VEGFR2의 인산화를 저해하지 않았으나, HREC에서 다운스트림 Akt의 활성화를 저해했다(도 11a 내지 11d). TNF-α 신호전달은 또한 Akt를 통해 IKKα에 전달되므로, 이들 결과는 SH-11052(2)가 PI3K 또는 Akt의 수준에서 작용하여 VEGF 및 TNF-α 신호전달 양자 모두를 차단할 수 있다는 것을 제시한다.

실시예 14

본 실시예에서는, 실시예 8에서 제조된 바와 같은, 신규 광친화성 시약인 크레마스트라논 유사체 화합물 16 및 17을 풀-다운 어세이에 사용하여 크레마스트라논 표적 단백질을 탐색하였다.

다운스(dounce) 균질화(~50 회)에 의해 약 10⁸세포를 등장성 완충액(25 mM 트리스-Cl pH 7.4, 150 mM NaCl) 중에 용해시켰다. 용해물을 2000 x g에서 2 분 동안 원심분리하였다. 펠렛 및 상등액을 분리하고 펠렛(핵 분획)을 용해 완충액(25 mM 트리스-Cl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% 트리톤 X-100) 중에 재현탁하여 균질화하였다. 상등액을 100,000 x g에서 45 분 동안 원심분리하고 생성된 펠렛 P100 및 상등액 S100을 수집하였다. P100, S100, 및 핵 분획을 유사체 화합물 16 또는 17(도 12)에 접합된 뉴트라비딘 비드와 혼합하고 4 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션한 후에 4 ℃에서 30 분 동안 UV 광으로 조사하였다. 이어서, 비드를 용해 완충액으로 철저하게 세척하고 SDS-PAGE 로딩 염료 중에 비드를 90 ℃로 가열하여 결합된 단백질을 용출시켰다. 용출된 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분리하고 은-염색 기술에 의해 검출하였다. 도 13에 나타낸 바와 같이, 특이적 후보 50 kDa 밴드(화살표)가 뚜렷하였다(*는 비특이적 밴드를 나타냄).

실시예 15

본 실시예에서는, 실시예 2 내지 7에서와 같이 합성된 크레마스트라논의 합성 유사체를 HUVEC, HREC, 망막모세포종, 및 포도막 흑색종 세포주에서의 ALAMARBLUE® 증식 어세이에서 시험하고(비특이적 안 세포독소(ocular cytotoxin)를 탐색하기 위함) 관 형성에 대한 화합물 SH-11037(6c)의 효과를 분석하였다.

증식 어세이를 위하여, 96-웰 투명 바닥 블랙 폴리스티렌 플레이트에 100 ㎕의 총 부피로 세포(2500/웰)를 접종하였다. HUVEC 및 HREC는 각각 EGM-2 및 CSC+ 배지 중에 성장시킨 반면에, 92-1 및 Y79 세포는 각각 RPMI+10% FBS, 페니실린/스트렙토마이신 및 RB 배지(IMDM+10% FBS + 페니실린/스트렙토마이신 + 10 ㎍/mL 인슐린 + 55 μM β-머캅토에탄올) 중에 유지하였다. 플레이트를 37 ℃에서 24 시간 인큐베이션한 후에, 화합물을 DMSO에 용해시켜 500 μM 내지 0.5 nM의 농도 범위로 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 37 ℃ 및 5% CO₂ 조건에서 48 시간 동안 인큐베이션한 후에 각각의 웰에 11.1 ㎕의 ALAMARBLUE® 시약을 첨가하였다. ALAMARBLUE® 시약의 첨가로부터 4 시간 후에 각각 560 nm 및 590 nm의 여기 파장 및 방출 파장으로 형광 판독값을 취하고 그래프패드 프리즘 소프트웨어에서 데이터를 분석하였다. 용량 반응 곡선을 생성시키고 하기 수학식을 사용하여 GI₅₀ 값을 계산하였다:

Y=100/(1+10^(X -LogGI ₅₀ )) (표 1).

관 형성에 대한 유사체 화합물 SH-11037(6c)의 효과를 결정하기 위하여, 96-웰 마트리겔-코팅된 플레이트에서 DMSO에 용해된 SH-11037(6c)(0 nM, 50 nM, 및 200 nM)을 함유하는 100 ㎕의 EGM-2 중에 HREC를 1 시간 동안 플레이팅하였다. 8 시간 후에 웰을 촬영하고 다각형의 수(관에 의해 가장자리가 이루어진 폐쇄 형상)를 수동으로 계수하고 DMSO-단독 대조군의 퍼센트로서 표현하였다.

NF-κB 신호전달에 대한 SH-11037(6c)의 효과를 분석하기 위하여, 세포(25,000/커버슬립)를 커버슬립 상에 접종하고 37 ℃에서 24 시간 동안 EGM-2 배지 중에 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 0.1 % 혈청-EBM-2 배지 중에 8 시간 동안 기아 처리한 후 50 μM 및 200 μM의 SH-11037(6c)의 존재 하에 1 시간 동안 완전 EGM-2 배지 중에 처리하였다. 10 ng/ml의 TNF-α로 20 분 동안 세포를 유도하고 4% 파라포름알데히드 용액으로 20 분 동안 실온에서 고정시켰다. 세포를 1X 트리스 완충 식염수 pH 7.4(TBS) 중에 신속하게 3회 세척하고 0.5% 트리톤 X-100과 함께 10 분 동안 인큐베이션함으로써 투과화하였다. TBS + 1% BSA 중의 10% DAKO 차단 용액에서 세포를 차단한 후에 NF-κB p65에 대한 항체(1:50 희석)와 함께 인큐베이션하였다. 다이라이트 488-접합된 염소 항-마우스 2차 항체(1:200 희석)를 사용하여 NF-κB p65 항체를 탐색하였다. 핵 염색을 위해, DAPI를 함유하는 벡타쉴드 마운팅 배지를 사용하여 커버슬립을 마운팅하였다. 칼 자이스(Carl Zeiss)로부터의 LSM 700 공초점 현미경을 사용하여 세포를 영상화하였다. 세포를 DAPI로 염색하여 핵을 가시화하였다.

도 14에 나타낸 바와 같이, SH-11037(6c)은 HREC GI₅₀ = 150 nM 및 HUVEC GI₅₀ = 1 μM(나타내지 않음)로 성장을 차단하였다. 추가로, 500 nM SH-11037(6c)을 이용하는 처리는 HREC 관 형성을 완전히(88%) 차단하였으나(도 15a 내지 15b), 포도막 흑색종 세포주에 대해 비독성이었고 망막모세포종 세포주에 대해 단지 GI₅₀ =12 μM로 독성이었으며(표 1), 이는 내피 세포에 대한 특이적 항증식 효과를 제시한다. SH-11037(6c)이 HREC의 이동을 차단했지만, SH-11037(6c)이 이들 세포의 세포자멸을 촉진하지는 않았다(도 16a 내지 16b). 추가로, 놀랍게도, SH-11037(6c)은 p21, CDK1, IL-6, 및 IL-8에 대한 크레마스트라논의 유전자 발현 효과를 공유하지 않았으며(데이터는 나타내지 않음), 유효 농도에서 p65 전위를 차단하지도 않았다(도 17). 이들 결과는 SH-11037(6c) 및 기타 분자들, 예컨대 11k가 안 장애 및 기타 신생혈관성 장애의 치료를 위한 신규 항-혈관신생 화합물을 제공한다는 것을 나타냈다.

실시예 16

본 실시예에서는, 생체내에서 산소-유도 망막증(oxygen-induced retinopathy; OIR)을 차단하는 SH-11037(6c)의 효과를 분석하였다.

특히, 신생아 C57BL/6 마우스 (n = 3-4 마리(pup)/그룹)를 출생후 제7일(P7)로부터 P12까지 75% 산소에 노출시키고 실내 공기에 있게 하여 P17에 허혈 및 광범위한 신생혈관 형성을 야기하였다. 고산소혈증은 정상적인 망막 혈관구조를 말소하여, 일단 정상산소 상태로 복귀하면, 유리체내 혈관 집적상(intravitreal vascular tuft)을 포함하는 비정상적 과성장을 촉진한다. 추가로, P12에 실내 공기로 복귀한 시점에 이소플루란 마취 하에, 33G 바늘을 사용하여 마우스에 PBS 단독(비히클)을 주사하거나 1.0 μM의 추정 유리체내 농도를 제공하도록 SH-11037(6c)을 함유하는 PBS를 주사하였다. P17에 마우스를 안락사시키고, 눈을 고정하고, 망막 홀마운트(retinal wholemount)를 제조하였다.

홀마운트를 알렉사플루오르(AlexaFluor)488-이소렉틴 B4로 염색하고 자이스 LSM700 공초점 현미경 상에서 영상화하였다. SWIFT_NV 플러그인과 함께 이미지J를 사용하여 총 망막 면적의 퍼센트로서 신생혈관 면적을 계산하였다. 결과는 도 18a 및 18b에 나타낸다. 나타낸 바와 같이, 1 μM의 단일 유리체내 용량의 SH-11037(6c)는 OIR 마우스 모델에서 신생혈관 면적을 유의적으로 감소시켰다.

표 1에 나타낸 바와 같이, 몇몇 화합물은 성장-저해 활성을 나타내지 않았거나 매우 높은(500 μM) 농도에서만 세포독성을 나타내었지만, 다수는 0.087 내지 100 μM 범위의 GI₅₀ 값을 나타내었다. 이들 분석으로부터, 크레마스트라논 이성체 2 및 그의 유사체에서 융합 환 시스템이 중요할 가능성이 있고(3a 대 11b), 벤질기가 필수적이며(10a 대 11a; 10b 대 2), A 환 상의 작은 치환이 용인된다(2 대 1)는 것이 결정되었다(원자 및 환 번호매김에 대해서는 도 1 참조). C-3(9)에서의 불포화(11a)를 동반하는 활성의 개선과 더불어 C-환 크기(12, 13)의 제한된 효과, 및 헤테로원자의 도입(11f)을 포함하는 B-환 상의 개질(11b)에 대한 일부 용인성의 가능성과 같은 중요한 경향이 주목되었다. 특히, C-3'에서의 일부 합성적 개질(6c, 11k)은 안 종양 세포주에 비해 HREC에 대한 선택성을 >100-배 증진하면서 효능을 증가시켰다(표 1).

상기 사실을 고려하여, 본 발명의 몇몇 이점이 달성되고 다른 유리한 결과가 얻어진다는 것을 알 수 있다. 본 발명의 범위로부터 이탈하지 않으면서 상기 방법에 다양한 변화를 일으킬 수 있으므로, 상기 상세한 설명에 포함되고 첨부 도면에 나타낸 모든 사안은 제한적 의미가 아니라 예시적인 것으로 해석함이 의도된다.

본 발명 또는 그의 다양한 버전, 실시양태(들), 또는 측면의 요소를 소개할 때, 관사 "a", "an", "the", 및 "상기"는 하나 이상의 요소가 존재함을 의미하도록 의도된다. 용어 "포함하는", "포괄하는", 및 "갖는"은 포괄적이도록 의도되며, 열거된 요소 이외의 부가적 요소가 존재할 수 있음을 의미한다.

Claims

하기 화학식 6c 또는 15b로 표시되는 화합물.
하기 화학식 11a, 11c, 11j, 11k, 11o, 11q, 11r, 11u, 및 11x로 이루어진 군에서 선택되는 화합물.
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제1항 또는 제2항의 화합물을 유효성분으로 포함하는 신생혈관성 안질환(neovascular eye disease) 치료용 약학적 조성물.
제26항에 있어서, 상기 신생혈관성 안질환은 미숙아 망막증, 당뇨병성 망막증 또는 황반변성인 약학적 조성물.
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제1항 또는 제2항의 화합물을 유효성분으로 포함하는 안(eye) 종양 치료용 약학적 조성물.
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