KR101818086B1 - 증가된 라파마이신 생산능을 갖는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 변이 균주 - Google Patents

증가된 라파마이신 생산능을 갖는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 변이 균주 Download PDF

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Abstract

본 발명은 면역억제제 라파마이신을 고농도로 생산하는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 CKDBR 0807 균주 및 이를 이용하여 라파마이신을 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명의 균주는 면역억제제 라파마이신을 고농도로 생산할 수 있기 때문에 매우 경제적이다. 본 발명의 균주와 야생형 균주의 드래프트 지놈 시퀀싱 결과를 비교하여 수득한 라파마이신 생산성 향상에 영향을 미칠 수 있는 유전자의 염기서열 변이에 대한 정보를 제공한다. 따라서, 본 발명은 면역억제제 라파마이신의 산업적인 대량 생산을 위하여 유용하게 사용될 수 있다.

Description

증가된 라파마이신 생산능을 갖는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 변이 균주{Streptomyces hygroscopicus Mutant Strain with Increased Productivity of Rapamycin}
본 발명은 증가된 라파마이신 생산능을 갖는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 변이 균주에 관한 것이다.
라파마이신(Rapamycin, 도 1)은 1975년에 Easter Island의 토양에서 분리한 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus)의 배양액으로부터 발견된 이차대사산물로서 마크로사이클릭 폴리케타이드 계열의 화합물이다. 1974년에 Ayerst 사가 항생제로서 라파마이신을 물질특허 출원(미국등록특허 제3,929,992호)하였고, 이후 Wyeth(현재 Pfizer) 사가 1989년에 라파마이신을 면역억제제의 용도로 특허출원(미국등록특허 제5,100,899호)한 다음 1999년에 미국 FDA의 승인을 받아 ‘Rapamune’이라는 상품명으로 판매하고 있다.
라파마이신은 시로리무스(sirolimus)로도 알려져 있으며 장기 이식 시 면역거부반응을 억제하기 위하여 사용되는데 특히, 신장 이식에 주로 사용되고 있다. 그리고 라파마이신은 최근 면역억제제로서 효과가 우수하고 관상동맥 스텐트 코팅에도 적용되면서 급격한 성장세를 보이고 있는 에베로리무스(everolimus) 합성을 위한 전구체로 사용되기 때문에 그 유용성이 높이 평가되고 있다.
원 물질특허에 게시된 방법에 따르면 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스NRRL 5491 (ATCC 29253) 균주를 사용하여 250ℓ 발효조에서 배양한 결과 약 60 ㎎/ℓ의 라파마이신 생산성을 달성하였다(미국등록특허 제3,929,992호). 또한 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스를 사용하여 배양 조건 및 배지 조성 최적화를 통해 라파마이신의 생산성을 높이려는 연구가 진행되었으나, 그 생산성이 플라스크 수준에서 최대 147 ㎎/ℓ로 낮은 수준이다(J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 1997, 19:83-86).
최근, 5ℓ 발효조에서 pH 조절 방법을 달리하여 라파마이신 생산성을 537 ㎎/ℓ 수준으로 향상시킨 결과가 보고되었으며(Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers, 2013, 44:743-747), 배양 중 순수한 산소 공급을 통해 적절한 용존산소 농도를 유지하고 전단력(shear force)을 최소화하여 균체를 펠렛 형태로 유지함으로써 라파마이신 생산성을 780 ㎎/ℓ까지 향상시킨 연구결과도 보고되었다(J. Biosci. Bioeng., 2013, 116:366-70).
또한, 라파마이신 생산균주와 에리스로마이신(erythromycin) 생산균주 사이에 세포융합을 통하여 플라스크 수준에서 라파마이신 생산성이 445 ㎎/ℓ인 변이주를 선발하거나(Appl . Microbiol . Biotechnol. 2009, 83:507-512), 라파마이신 생산 균주에 자외선을 조사한 후 라파마이신 전구체(lysine, shikimic acid) 내성 및 영양요구성 돌연변이 균주를 획득하여 플라스크에서 450 ㎎/ℓ, 120ℓ 발효조에서 812 ㎎/ℓ의 생산성을 달성한 보고도 있다(Biotechnol. Bioeng., 2010, 107:506-515).
한편, 라파마이신 생합성 및 생합성 조절과 관련된 유전자를 살펴보면 26개의 유전자 클러스터로 구성되어 있고 이 중 3개의 클러스터(rapA, rapB, rapC)가 라파마이신의 주골격을 형성하는데 관여하는 유전자이다(Proc. Natl. Acad. Sci., 1995, 92:7839~7843). 이러한 유전자 클러스터 중 생합성에 영향을 줄 수 있는 양성 조절 유전자(positive regulator gene)인 rapH 또는 rapG를 과발현할 경우 라파마이신 생산성이 200 ㎎/ℓ내외로 모균주보다 40% 가량 증가됨이 보고되었으며(J. Bacteriol., 2007, 189:4756-4763), 음성 조절 유전자(negative regulator gene)인 rapS, rapY 유전자를 삭제할 경우 야생형 균주 생산성인 7.3 ㎎/ℓ보다 3.63배 증가한 26.5 ㎎/ℓ의 생산성 향상 결과가 보고되었다(대한민국등록특허 제10-1331491호).
이처럼 야생형 균주로부터 돌연변이를 유도하여 생산성이 향상되었으나 산업적으로는 경제적인 생산성에 한계가 있다. 또한 라파마이신 생합성 관련 유전자를 변형시키는 연구를 지속하고 있지만, 라파마이신 생합성 유전자 또는 조절유전자 일부만 생산성에 대한 영향이 파악되었으며 생산성에 영향을 줄 수 있는 수많은 유전자에 대한 체계적인 정보가 부족하여 산업적으로 적용하는데 한계가 있다. 따라서, 라파마이신의 산업적 대량 생산을 위하여 랜덤 뮤테이션(random mutation)으로 돌연변이 유발 후 고생산 균주를 선발한 다음, 선발된 라파마이신 고생산 균주의 유전자 변이부위에 대한 정보를 파악하여 고생산 균주를 안정적으로 유지하고, 추가적으로 생산성을 향상시킬 수 있는 유전자에 대한 정보를 파악하는 것이 경제적인 생산공정을 위해 절실히 필요한 상황이다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시 되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용을 보다 명확하게 설명하게 된다.
본 발명자들은 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus) B-NRRL 5491(ATCC 29253) 균주로부터 라파마이신 고생산능을 가지는 변이 균주를 개발하고자 예의 연구노력하였다. 그 결과, 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus) CKDBR 0807 균주가 야생형 균주와 비교하여 우수한 라파마이신 생산능을 갖는다는 것을 실험적으로 증명하였고, 이 균주의 야생형 균주 대비 변이된 유전자 염기서열을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 서열목록 제1서열 내지 제171서열의 뉴클레오타이드를 포함하는 지놈 DNA(genomic DNA)를 갖는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus) 변이 균주를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 서열목록 제1서열 내지 제171서열의 뉴클레오타이드를 포함하는 지놈 뉴클레오타이드 분자를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 변이 균주를 이용한 라파마이신 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열목록 제200서열 내지 제227서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 변이 단백질을 제공하는데 있다.
본 발명의 목적 및 이점은 하기 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열 내지 제171서열의 뉴클레오타이드를 포함하는 지놈 DNA(genomic DNA)를 갖는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus) 변이 균주를 제공한다.
본 발명자들은 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus) B-NRRL 5491(ATCC 29253) 균주로부터 라파마이신 고생산능을 가지는 변이 균주를 개발하고자 예의 연구노력하였다. 그 결과, 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus) CKDBR 0807 균주가 야생형 균주와 비교하여 우수한 라파마이신 생산능을 갖는다는 것을 실험적으로 증명하였고, 이 균주의 야생형 균주 대비 변이된 유전자 염기서열을 규명하였다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 야생형 균주인 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 B-NRRL 5491(ATCC 29253)에 돌연변이원을 처리한 후, 라파마이신 생합성 경로에 있는 전구체들 및 라파마이신을 최소억제농도로부터 점진적으로 증가시킨 배지에서 배양하여 생장이 우수한 균주를 선발하였다. 그 결과 라파마이신 생합성 전구체 및 라파마이신에 대해 내성이 증가된 변이주를 획득하였고, 상기 과정을 반복하여 최종적으로 배지에 포함된 라파마이신의 농도가 2,000 mg/ℓ 인 조건에서도 생장이 우수한 본 발명의 변이 균주를 선발하였다.
상기 야생형 균주로부터 돌연변이체를 제조하는 방법으로 자외선 또는 X-선 조사; 니트로소구아니딘(N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘), 니트로젠 머스타드, 메틸메탄설포네이트 등과 같은 화학적 돌연변이원의 처리; 또는 DNA 재조합이나 P1 박테리오파아지를 매개로 한 형질도입 등의 방법이 이용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 야생형 균주인 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 B-NRRL 5491(ATCC 29253)에 자외선을 조사하여 돌연변이를 유도한다.
상기 돌연변이체 유도 방법에 의해 제조된 본 발명의 라파마이신 고생산 변이 균주인 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 CKDBR 0807 균주와 야생형 균주에 대하여 드래프트 지놈 시퀀싱(draft genome sequencing)을 실시한 결과, 두 균주사이에 염기서열에 있어서 차이가 있는 유전자들을 확인하였으며 이들 중 라파마이신 고생산능과 관련이 있을 것으로 판단되는 다음의 유전자 변이 염기서열 정보를 수득하였다.
본 발명의 변이 균주는 서열목록 제172서열로 표시되는 야생형 리보오스 오페론 리프레서(ribose operon repressor) 유전자의 849번째 G염기가 A염기로 변이된 뉴클레오타이드; 서열목록 제173서열로 표시되는 야생형 라이실-tRNA 합성효소 유사 단백질에 결합하여 발견되는 추정 막단백질(Putative membrane protein found fused to lysyl-tRNA synthetase like protein) 유전자의 1600번째 C염기가 A염기로 변이되고, 1601번째 A염기가 G염기로 변이된 뉴클레오타이드; 서열목록 제174서열로 표시되는 야생형 가설 단백질(Hypothetical protein) 유전자의 631번째 T염기가 C염기로 변이된 뉴클레오타이드; 서열목록 제175서열로 표시되는 야생형 가설 단백질(Hypothetical protein) 유전자의 757번째 G염기가 A염기로 변이된 뉴클레오타이드; 서열목록 제176서열로 표시되는 야생형 가설 단백질(Hypothetical protein) 유전자의 601번째 G염기가 T염기로 변이된 뉴클레오타이드; 서열목록 제177서열로 표시되는 야생형 가설 단백질(Hypothetical protein) 유전자의 258번째 G염기가 T염기로 변이된 뉴클레오타이드; 서열목록 제178서열로 표시되는 야생형 가설 단백질(Hypothetical protein) 유전자의 270번째 C염기가 T염기로 변이된 뉴클레오타이드; 서열목록 제179서열로 표시되는 야생형 가설 단백질(Hypothetical protein) 유전자의 1549번째 G염기가 T염기로 변이된 뉴클레오타이드; 서열목록 제180서열로 표시되는 야생형 가설 단백질(Hypothetical protein) 유전자의 231번째 C염기가 T염기로 변이되고, 232번째 C염기가 T염기로 변이된 뉴클레오타이드; 서열목록 제181서열로 표시되는 야생형 말로닐 CoA-아실 캐리어 단백질 트랜스아실라아제(Malonyl CoA-acyl carrier protein transacylase (EC 2.3.1.39)) 유전자의 20925번째 C염기가 T염기로 변이된 뉴클레오타이드; 서열목록 제182서열로 표시되는 야생형 말로닐 CoA-캐리어 단백질 트랜스아실라아제(Malonyl CoA-acyl carrier protein transacylase (EC 2.3.1.39)) 유전자의 19082번째 G염기가 C염기로 변이되고, 22681번째 G염기가 C염기로 변이된 뉴클레오타이드; 서열목록 제183서열로 표시되는 야생형 말로닐 CoA-캐리어 단백질 트랜스아실라아제(Malonyl CoA-acyl carrier protein transacylase (EC 2.3.1.39)) 유전자의 6465번째 C염기가 T염기로 변이되고, 8420번째 T염기가 G염기로 변이된 뉴클레오타이드; 서열목록 제184서열로 표시되는 야생형 말로닐 CoA-캐리어 단백질 트랜스아실라아제(Malonyl CoA-acyl carrier protein transacylase (EC 2.3.1.39)) 유전자의 19180번째 G염기가 A염기로 변이된 뉴클레오타이드; 서열목록 제185서열로 표시되는 야생형 올리고펩타이드 ABC 트랜스포터2C 페리플라스믹 올리고펩타이드-결합 단백질 OppA(Oligopeptide ABC transporter2C periplasmic oligopeptide-binding protein OppA (TC 3.A.1.5.1)) 유전자의 33번째 C염기가 T염기로 변이된 뉴클레오타이드; 서열목록 제186서열로 표시되는 야생형 모바일 엘리먼트 단백질(Mobile element protein) 유전자의 164번째 G염기가 T염기로 변이된 뉴클레오타이드; 서열목록 제187서열로 표시되는 야생형 DNA-결합 단백질(DNA-binding protein) 유전자의 545번째 A염기가 G염기로 변이된 뉴클레오타이드; 서열목록 제188서열로 표시되는 야생형 알킬디하이드록시아세톤포스페이트 합성효소(Alkyldihydroxyacetonephosphate syntase (EC 2.5.1.26)) 유전자의 1446번째 C염기가 T염기로 변이되고, 1447번째 C염기가 G염기로 변이된 뉴클레오타이드; 서열목록 제189서열로 표시되는 야생형 아질산염-민감성 전사 억제제 NsrR(Nitrite-sensitive transcriptional repressor NsrR) 유전자의 26번째 C염기가 T염기로 변이된 뉴클레오타이드; 서열목록 제190서열로 표시되는 야생형 타가토오스 1,6-디포스페이트 알돌라아제(Tagatose 1,6-diphosphate aldolase (EC 4.1.2.40)) 유전자의 657번째 T염기가 G염기로 변이된 뉴클레오타이드; 서열목록 제191서열로 표시되는 야생형 GCN5-연관 N-아세틸트랜스퍼라아제(GCN5-related N-acetyltransferase) 유전자의 470번째 T염기가 C염기로 변이되고, 471번째 G염기가 T염기로 변이된 뉴클레오타이드; 서열목록 제192서열로 표시되는 야생형 추정 멤브레인 단백질 STY4873(Probable membrane protein STY4873) 유전자의 206번째 G염기가 A염기로 변이된 뉴클레오타이드; 서열목록 제193서열로 표시되는 야생형 NADPH-의존적 F420 환원효소(NADPH-dependent F420 reductase) 유전자의 440번째 T염기가 C염기로 변이되고, 441번째 C염기가 A염기로 변이된 뉴클레오타이드; 서열목록 제194서열로 표시되는 야생형 뉴라미니다아제 NanP(Neuraminidase NanP) 유전자의 708번째 G염기가 A염기로 변이된 뉴클레오타이드; 서열목록 제195서열로 표시되는 야생형 키틴(chitin) 결합 단백질 유전자의 514번째 G염기가 T염기로 변이된 뉴클레오타이드; 서열목록 제196서열로 표시되는 야생형 주요 촉진자 슈퍼패밀리의 퍼미아제/티미딜산 키나아제(Permeases of the major facilitator superfamily/Thymidylate kinase) 유전자의 2891번째 A염기가 C염기로 변이된 뉴클레오타이드; 서열목록 제197서열로 표시되는 야생형 항-시그마 F 인자 길항제(spoIIAA-2); 항-시그마 b 인자 길항제 RsbV(Anti-sigma F factor antagonist (spoIIAA-2); Anti-sigma b factor antagonist RsbV) 유전자의 260번째 G염기가 A염기로 변이된 뉴클레오타이드; 서열목록 제198서열로 표시되는 야생형 가설(Hypothetical) 단백질 유전자의 743번째에 GC염기가 삽입(insertion)된 뉴클레오타이드; 및 서열목록 제199서열로 표시되는 야생형 말로닐 CoA-아실 캐리어 단백질 트랜스아실라아제(Malonyl CoA-acyl carrier protein transacylase (EC 2.3.1.39)) 유전자의 19183번째 G염기가 결실(deletion)되고, 19186번째에 T염기가 삽입된 뉴클레오타이드를 포함한다.
본 발명의 변이 균주는 서열목록 제1서열 내지 제171서열의 뉴클레오타이드를 포함하는 지놈 DNA(genomic DNA)를 갖는다.
서열목록 제1서열 내지 제171서열로 표시되는 뉴클레오타이드는 본 발명의 변이 균주에 대한 드래프트 지놈 시퀀싱을 통해 수득한 콘티그(contig) 서열을 나타낸다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 변이 균주는 서열목록 제228서열로 표시되는 16S rRNA를 갖는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 변이 균주는 라파마이신(Rapamycin) 생산능을 가지며, 야생형 균주인 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 B-NRRL 5491(ATCC 29253)과 비교하여 증가된 라파마이신 생산능을 나타낸다.
하기 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 변이 균주를 사용하여 발효조 배양 시 야생형 균주인 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 B-NRRL 5491(ATCC 29253)보다 라파마이신 생산능이 8배 이상 증가되었다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열 내지 제171서열의 뉴클레오타이드를 포함하는 지놈 뉴클레오타이드 분자를 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 라파마이신 제조 방법을 제공한다:
(a) 상기 본 발명의 미생물 균주를 탄소원, 에너지원 및 질소원을 포함하는 배지에서 배양하는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)의 결과물로부터 라파마이신을 회수하는 단계.
본 발명의 제조 방법에 있어서, 상기 단계 (a)에서 이용되는 배지는 탄소원 및 질소원을 포함하며, 상기 탄소원은 총 배지에 대하여 0.5-40 %(w/v)이고, 상기 질소원은 총 배지에 대하여 0.01-10 %(w/v)일 수 있다.
본 발명의 방법에서 이용되는 탄소원은 다양한 탄수화물이 이용될 수 있으며, 바람직하게는 글루코오스, 수크로오스, 프럭토스, 갈락토오스, 아라비노스 및 락토오스이다. 본 발명의 방법에서 이용되는 질소원은 유기 질소원이 이용되며, 바람직하게는 효모 추출물, 펩톤, 트립톤 및 소이톤이다.
본 발명의 방법에 있어서, 배양 온도는 바람직하게는 20-35℃이고, 보다 바람직하게는 23-30℃이며, 가장 바람직하게는 25-28℃이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 미생물 균주를 배양하고 배양액으로부터 라파마이신을 회수한다. 라파마이신은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 회수할 수 있는데, 예를 들어, 배양액에 동량의 메탄올을 첨가하여 혼합한 후, 원심분리하여 수득한 상등액으로부터 라파마이신을 회수할 수 있다.
본 발명의 제조방법은 라파마이신 생성능이 매우 우수한 변이 균주를 이용하며, 상술한 바람직한 배양 조건 및 배지 조성을 따르는 경우에는 라파마이신을 저가로 대량 생산할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 미생물 균주를 이용하여 라파마이신을 생산하는 경우, L당 1,500 mg 내지 3,000 mg의 라파마이신을 생산할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제200서열 내지 제227서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 변이 단백질을 제공한다.
구체적으로는, 본 발명은 서열목록 제200서열의 뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 리보오스 오페론 리프레서(ribose operon repressor) 단백질; 서열목록 제201서열의 뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 라이실-tRNA 합성효소 유사 단백질에 결합하여 발견되는 추정 막단백질(Putative membrane protein found fused to lysyl-tRNA synthetase like protein); 서열목록 제202서열 내지 서열목록 제208서열 및 서열목록 제226서열의 뉴클레오타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 가설(Hypothetical) 단백질; 서열목록 제209서열 내지 서열목록 제212서열의 뉴클레오타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 말로닐 CoA-아실 캐리어 단백질 트랜스아실라아제(Malonyl CoA-acyl carrier protein transacylase); 서열목록 제213서열의 뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 올리고펩타이드 ABC 트랜스포터2C 페리플라스믹 올리고펩타이드-결합 단백질 OppA(Oligopeptide ABC transporter2C periplasmic oligopeptide-binding protein OppA (TC 3.A.1.5.1)); 서열목록 제214서열의 뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 모바일 엘리먼트(mobile element) 단백질; 서열목록 제215서열의 뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 DNA-결합 단백질; 서열목록 제216서열의 뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 알킬디하이드록시아세톤포스페이트 합성효소(Alkyldihydroxyacetonephosphate synthase); 서열목록 제217서열의 뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 아질산염-민감성 전사 억제제 NsrR(Nitrite-sensitive transcriptional repressor NsrR); 서열목록 제218서열의 뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 타가토오스 1,6-디포스페이트 알돌라아제(Tagatose 1,6-diphosphate aldolase); 서열목록 제219서열의 뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 GCN5-연관 N-아세틸트랜스퍼라아제(GCN5-related N-acetyltransferase); 서열목록 제220서열의 뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 추정 멤브레인 단백질 STY4873(Probable membrane protein STY4873); 서열목록 제221서열의 뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 NADPH-의존적 F420 환원효소(NADPH-dependent F420 reductase); 서열목록 제222서열의 뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 뉴라미니다아제 NanP(Neuraminidase NanP); 서열목록 제223서열의 뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 키틴(chitin) 결합 단백질; 서열목록 제224서열의 뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 주요 촉진자 슈퍼패밀리의 퍼미아제/티미딜산 키나아제(Permeases of the major facilitator superfamily/Thymidylate kinase); 서열목록 제225서열의 뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 항-시그마 F 인자 길항제(spoIIAA-2); 항-시그마 b 인자 길항제 RsbV(Anti-sigma F factor antagonist (spoIIAA-2); Anti-sigma b factor antagonist RsbV); 및 서열목록 제227서열의 뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 말로닐 CoA-아실 캐리어 단백질 트랜스아실라아제(Malonyl CoA-acyl carrier protein transacylase)를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 서열목록 제200서열 내지 제227서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 변이 단백질은 본 발명의 변이 균주로부터 생산된다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 변이 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 핵산 분자는 서열목록 제200서열 내지 제227서열로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 명세서에서 용어 “핵산 분자”는 DNA (gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).
본 발명의 변이 단백질은 첨부한 서열목록에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 것으로 한정되지 않는다는 것은 당업자에게 명확하다.
뉴클레오타이드에서의 변이는 단백질에서 변화를 가져오지 않는 것도 있다. 이러한 핵산은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈 (예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 핵산분자를 포함한다.
본 발명의 변이체 범위에 포함될 수 있는 생물학적 기능 균등물은 본 발명의 변이체와 균등한 생물학적 활성을 발휘하는 아미노산 서열의 변이에 한정될 것이라는 것은 당업자에게 명확하다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 변이 단백질 또는 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 98%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv . Appl . Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol . Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol . Biol . 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc . Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl . BioSci . 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth . Mol . Biol . 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol . Biol . 215:403-10(1990))은 NBCI (National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(ⅰ) 본 발명은 면역억제제 라파마이신을 고농도로 생산하는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 CKDBR 0807 균주 및 이를 이용하여 라파마이신을 생산하는 방법을 제공한다.
(ⅱ) 본 발명의 균주는 면역억제제 라파마이신을 고농도로 생산할 수 있기 때문에 매우 경제적이다.
(ⅲ) 본 발명의 균주와 야생형 균주의 드래프트 지놈 시퀀싱 결과를 비교하여 수득한 라파마이신 생산성 향상에 영향을 미칠 수 있는 유전자의 염기서열 변이에 대한 정보를 제공한다.
(ⅳ) 따라서, 본 발명은 면역억제제 라파마이신의 산업적인 대량 생산을 위하여 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 라파마이신의 화학식을 나타낸 것이다.
도 2는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 CKBDR 0807 균주로부터 생산된 라파마이신의 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)을 나타낸 것이다.
도 3은 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 CKBDR 0807 균주로부터 생산된 라파마이신의 핵자기공명 스펙트럼(NMR)을 나타낸 것이다.
도 4는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 CKBDR 0807 균주로부터 생산된 라파마이신의 질량분석기(MS) 분석을 통한 분자량을 나타낸 것이다.
도 5은 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 CKBDR 0807 균주의 계보(genealogy)를 나타낸 것이다.
도 6는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 CKBDR 0807 균주의 16S rRNA 유전자 분석을 통한 계통수(phylogenetic tree)를 나타낸 것이다.
도 7은 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 CKBDR 0807 균주의 돌연변이된 유전자들의 나열을 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 균주의 제조 및 배양을 통한 라파마이신 생산 확인
스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 B-NRRL 5491(ATCC 29253)로부터 아래와 같은 방법으로 라파마이신의 생산여부를 확인하였다.
구체적으로, 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 B-NRRL 5491(ATCC 29253) 균주를 30 ㎖의 효모-맥아 한천배지(전분 10 g/ℓ, 효모엑기스 4 g/ℓ, 맥아즙 10 g/ℓ, 한천 20 g/ℓ, 증류수 1 ℓ, 살균 후 pH 6.8-7.0)가 함유된 페트리디쉬에서 28℃의 온도조건으로, 7-14일간 단일 콜로니(monocolony)를 얻기 위해 배양하였다. 배양된 단일 콜로니는 1.5 ㎖의 생리식염수에 현탁한 후 상기 고체배지가 함유된 수 개의 페트리디쉬에 도말하고 다시 28℃에서 7-14일간 배양하였다. 그 다음 페트리디쉬 1개당 살균된 10%(w/v) 스킴밀크 용액(skim milk solution)을 6 ㎖씩 가한 후, 화염 살균된 스팻툴라(spatula)로 긁어서 포자 현탁액을 수확하였다. 그 후, 살균된 주사기를 이용하여 포자 현탁액을 코튼 울(cotton wool)에 통과시켜 균사체가 제거된 포자 현탁액을 제조하였다.
라파마이신 생산 확인을 위한 액체배양 조건은 아래와 같은 방법으로 실시하였다. 전배양을 위한 배지를 조제하기 위하여 100 ㎖ 삼각 플라스크에 표 1에 기재된 성분들을 첨가하고 121℃에서 20분 동안 살균하였다. 표 1과 같이 제조된 전배양 배지에 포자 현탁액을 2.5%(v/v)가 되도록 접종하고 28℃에서 200 rpm으로 48시간 동안 배양하였다. 그 다음, 본배양 배지를 조제하기 위하여 500 ㎖ 삼각 플라스크에 표 2에 기재된 성분들을 첨가하고 121℃에서 20분 동안 살균하였다. 상기와 같이 조제된 본배양 배지에 전배양액을 10%(v/v)되게 접종하고 25℃에서 220 rpm으로 9일 동안 배양하였다.
전배양 배지
조 성 농도(g/ℓ)
포도당 20
면실밀 30
효모 엑기스 10
암모늄설페이트 3
탄산칼슘 2
소포제(SAG-471) 1
살균 후 pH 6.8-7.0으로 조정
본배양 배지
조 성 농도(g/ℓ)
과당 40
옥수수 기름 20
면실밀 30
옥수수 침지액 10
효모 엑기스 6
소이 펩톤 6
디포타슘포스페이트 2
모노포타슘포스페이트 2
소금 3
소포제(SAG-471) 1
살균 후 pH 6.1-6.3으로 조정
본배양액의 라파마이신 생산성을 측정하기 위하여, 본배양액 2 g에 8 ㎖의 메탄올을 첨가하고 30-60분 동안 교반하여 추출한 다음, 12,000 rpm에서 10분 동안 원심 분리하였다. 원심 분리 후 상등액을 회수한 다음 표 3과 같은 조건하에서 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography ; HPLC)로 분석하여 라파마이신의 농도를 측정하였다.
HPLC 분석 결과, 본배양액의 추출액에서 라파마이신 표준물질과 용출시간(retention time)이 동일한 피크가 존재함을 확인하였다.
항목 조건
파장 277 ㎚
칼럼 ZORBAX Extend-C18, 5 ㎛ (4.6 X 250 mm) (Agilent)
칼럼 온도 40 ℃
유속 1.0 ㎖/분
이동상 메탄올(methanol) : 물 = 78 : 22
시료 주입량 10 ㎕
실시예 2: 라파마이신 생합성 경로 전구체를 이용한 랜덤 뮤테이션
라파마이신 고생산 우량 균주 선발을 위해, 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 B-NRRL 5491 (ATCC 29253) 균주에 UV(ultraviolet)를 가하여 랜덤 뮤테이션(random mutation)을 실시하였다. 30W UV 램프로부터 30 ㎝ 떨어진 거리에 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 B-NRRL 5491 (ATCC 29253)의 포자 현탁액을 위치하고 5분 동안 조사하여 돌연변이를 유발시켰다. 라파마이신 고생산 변이주를 효율적으로 선발하기 위하여 라파마이신 생합성 경로에 있는 전구체 중 말론산(malonic acid), 프로피온산(propionic acid), 시킴산(shikimic acid), L-라이신 HCL(L-lysine HCl)을 각각 0.2-5 g/ℓ의 농도로 배지에 첨가하여 전구체에 내성을 갖는 균주를 선발하였다.
상세하게는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 B-NRRL 5491 (ATCC 29253)의 포자 현탁액을 상기의 UV 조사 조건으로 처리 후 말론산이 0.2 g/ℓ, 0.4 g/ℓ, 0.6 g/ℓ, 0.8 g/ℓ, 1.0 g/ℓ가 되도록 첨가된 MYA 고체배지(맥아 추출물 20 g/ℓ, 이스트 추출물 4 g/ℓ, 아가 20 g/ℓ)에 배양하여 생장이 우수한 콜로니를 선발하였고, 프로피온산은 0.1 g/ℓ, 0.2 g/ℓ, 0.3 g/ℓ, 0.4 g/ℓ, 0.5 g/ℓ, 시킴산, L-라이신 HCl은 1 g/ℓ, 2 g/ℓ, 3 g/ℓ, 4 g/ℓ, 5 g/ℓ가 되도록 첨가된 MYA 고체배지(맥아 추출물 20 g/ℓ, 이스트 추출물 4 g/ℓ, 아가 20 g/ℓ)에 배양하여 생장이 우수한 콜로니를 선발하는 방식으로 실시하였다. 선발과정에서 이전보다 라파마이신 생산성이 높은 균주를 획득하면 그 균주를 모균주로 사용하여 상기의 랜덤 뮤테이션을 반복 실시하였다.
실시예 3: 고농도 라파마이신에 내성을 갖는 라파마이신 고생산 균주 CKDBR 0807 의 선발
상기 실시예2 에서 선발된 CKDBR 0803으로부터 라파마이신을 배지에 첨가하는 인리치먼트 배양 및 순차적응(sequential adaptation) 방법을 사용하여 라파마이신 내성이 증가하고 라파마이신 생산능이 향상된 균주 CKDBR 0807을 선발하였다(도 5).
상세하게는 먼저, 인리치먼트 배양을 위해 포자 현탁액을 UV로 조사한 다음 라파마이신이 500 ㎎/ℓ, 1,000 ㎎/ℓ, 1,500 ㎎/ℓ, 2,000 ㎎/ℓ의 농도로 포함된 YEME 액체배지(이스트 추출물 3 g/ℓ, 펩톤 5 g/ℓ, 맥아 추출물 3 g/ℓ, 글루코오스 10 g/ℓ)에 접종하여 28℃에서 200 rpm으로 24시간 동안 배양한 후, 배양액을 코튼 울로 여과하여 포자는 제거하고 발아된 균사(germinated mycelia)를 수득하였다. 발아된 균사를 생리식염수로 옮긴 다음 MYA 고체배지(맥아 추출물 20 g/ℓ, 이스트 추출물 4 g/ℓ, 아가 20 g/ℓ)에 도말하여 28℃에서 7-14일 동안 배양하여 생장이 우수한 콜로니를 선발하였다. 선발과정에서 이전보다 라파마이신 생산성이 높은 균주를 획득하면 그 균주를 모균주로 사용하여 YEME 액체배지 내에 라파마이신의 농도를 500 ㎎/ℓ씩 증가시키고 이때 형성된 콜로니 중 생장이 빠른 콜로니를 선발하였다. 그 결과, 라파마이신 생산성이 향상된 CKDBR 0805 균주를 선발하였다.
순차적응은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 포자 현탁액을 UV로 조사한 다음 라파마이신이 500 ㎎/ℓ의 농도로 포함된 YEME 액체배지(이스트 추출물 3 g/ℓ, 펩톤 5 g/ℓ, 맥아 추출물 3 g/ℓ, 글루코오스 10 g/ℓ)에 접종하여 28℃에서 200 rpm으로 24시간 동안 배양하였다. 그 다음 상기의 배양액 1 ㎖을 UV 조사없이 라파마이신이 1,000 ㎎/ℓ가 포함된 YEME 액체배지에 접종하여 동일한 조건에서 배양하였다. 다시 상기의 배양액 1 ㎖을 UV 조사없이 라파마이신이 1,500 ㎎/ℓ가 포함된 YEME 액체배지에 접종하여 라파마이신에 대한 내성을 점진적으로 갖도록 유도하였다. 이후 과정은 코튼 울 여과 및 MYA 고체배지 배양을 통해 콜로니를 선발하는 인리치먼트 배양 방법과 동일하게 실시하였다. 선발과정에서 이전보다 라파마이신 생산성이 높은 균주를 획득하면 그 균주를 모균주로 사용하여 YEME 액체배지에 첨가하는 라파마이신의 농도를 500 ㎎/ℓ씩 증가시켜 상기의 순차 적응을 반복 실시하였다.
상기의 인리치먼트 배양 및 순차 적응 방법으로부터 라파마이신 고생산 균주인 CKDBR 0807을 선발하였으며, 선발균주에 대한 플라스크(flask) 배양조건에서의 라파마이신 생산성은 표 4와 같았다.
균주명 라파마이신 생산성
(단위 : ㎎/ℓ )
스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 B-NRRL 5491 (ATCC 29253) 7
CKDBR 0801 98
CKDBR 0802 151
CKDBR 0803 183
CKDBR 0804 212
CKDBR 0805 274
CKDBR 0806 357
CKDBR 0807 453
실시예 4: 라파마이신 고생산 균주 CKDBR 0807의 면역억제물질의 동정
CKDBR 0807로부터 생성된 물질을 동정하기 위해 HPLC, 1H 핵자기공명 스펙트럼(NMR) 및 질량분석기(Mass spectroscopy) 분석을 실시하여 라파마이신 표준물질(Sigma, R0395)과 비교한 결과, HPLC 상의 주요 피크가 라파마이신임을 확인하였다(도 2 내지 도 4).
실시예 5: 16S rRNA 유전자 염기 서열 분석
본 발명의 균주를 동정하기 위해, 균주로부터 지노믹 DNA를 분리하고, 16S rRNA 유전자의 염기 서열을 분석하였다.
16S rRNA 유전자 동정은 ㈜SolGent에 의뢰하여 실시하였고, 유니버셜 프라이머인 27F; 5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′, 1492R; 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′을 이용하여 16S rRNA 유전자를 PCR로 증폭하여 염기서열을 분석하였다.
결정된 염기서열을 NCBI(National Center for Biological Information) BLAST로 분석한 결과, 본 발명의 균주는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus)의 야생형 균주[B-NRRL 5491 (ATCC 29253)]와 99.7 %의 상동성이 있음을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 균주는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus)로부터 변화가 없음이 확인되었다(도 6).
실시예 6: 발효조에서 야생형 균주(ATCC 29253)와 CKDBR 0807 균주의 라파마이신 생산성 비교
발효조(fermentor) 배양을 통하여, 본 발명의 균주인 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 CKDBR 0807과 모균주 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 B-NRRL 5491 (ATCC 29253)의 라파마이신 생산성을 비교하였다.
구체적으로, 5ℓ의 둥근 플라스크에 600 ㎖의 전배양 배지를 첨가하여 121℃에서 40분 동안 살균한 다음, 포자 현탁액을 0.5%(v/v) 되게 접종하였다. 그 후, 접종된 둥근 플라스크를 28℃에서 120 rpm으로 40-48시간 동안 배양하여, 전배양액을 제조하였다. 상기 전배양액을 4.5ℓ의 본배양액이 들어있는 7ℓ 발효조에 10%(v/v)되도록 접종하여 28℃, 500 rpm, 1 vvm, 0.5 kgf/cm2 조건으로 배양을 시작하였으며, 배양 중 DO(dissolved oxygen)는 30% 이상이 되도록 통기량 및 교반속도를 조절하였다. 또한, 암모니아 수(ammonia water)와 프룩토오스 피딩(fructose feeding)을 통하여 배양액의 pH를 4.8로 유지시키면서 12일 동안 배양하였다. 전배양 배지와 본배양 배지 조성은 각각 표 1, 2와 동일하게 사용하였다.
그 결과, 모균주인 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 B-NRRL 5491 (ATCC 29253)은 247 ㎎/ℓ의 라파마이신이 생산되었지만, 본 발명의 균주인 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 CKDBR 0807은 2,009 ㎎/ℓ의 라파마이신이 생산됨을 확인하였다(표 5).
균주 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스
CKDBR 0807		 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스
B-NRRL 5491 (ATCC 29253)
라파마이신 생산성
(단위 : ㎎/ℓ )		 2,009 247
실시예 7: 라파마이신 생합성 전구체 코엔자임 A 생성량 비교
라파마이신이 고생산되는 또 다른 원인을 확인하기 위해 라파마이신 생합성 전구체 중 중요한 역할을 하는 세 가지 전구체인 말로닐-CoA, 메틸말로닐-CoA, 프로피오닐-CoA에 대한 세포내 농도를 조사하였다. 이를 위하여 본 발명의 신균주 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 CKDBR 0807과 야생형 균주 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 B-NRRL 5491 (ATCC 29253)을 실시예 1과 동일한 방법으로 액체배양한 후 세포내에 존재하는 세 가지 A 전구체 농도를 LC/ESI-MS로 정량 분석하여 비교하였다.
구체적으로, 배양액 100 ㎕를 1.5 ㎖ 튜브에 넣고 15% TCA 용액을 500 ㎕ 첨가한 다음 실리콘 오일을 300 ㎕ 첨가하고 볼텍서(vortexer)로 혼합하였다. 그리고 4℃, 20,000 g에서 5분간 원심분리 후 TCA 층에 있는 300 ㎕를 취하여 Watersⓡ OASIS HLB(Hydrophilic-Lipophilic-Balanced) SPE에 로딩하고, 세척 단계를 거쳐 최종적으로 5% 암모니아가 함유된 메탄올 1 ㎖로 추출하였다. 그 추출물을 진공건조기로 건조하고 5 mM 암모늄 아세테이트 + 0.05% 아세트산으로 용해 후 LC/ESI-MS로 분석하여 코엔자임 A 전구체 농도를 정량하였다.
그 결과, 세 가지 전구체 말로닐-CoA, 메틸말로닐-CoA, 프로피오닐-CoA 모두 야생형 균주 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 B-NRRL 5491 (ATCC 29253)보다 본 발명의 신균주 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 CKDBR 0807에서 더 많은 양이 존재함을 확인하였다. 특히, 말로닐-CoA, 프로피오닐-CoA 농도는 본 발명의 신균주 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 CKDBR 0807에서 약 2배 이상 증가하였으며, 또 다른 전구체인 메틸말로닐-CoA는 야생형 균주 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 B-NRRL 5491 (ATCC 29253)에서는 LC/ESI-MS로 검출되지 않을 정도로 거의 존재하지 않았으나, 본 발명의 신균주 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 CKDBR 0807에서는 2.1 μM이 존재함을 확인하였다(표 6).
따라서, 본 발명의 신균주 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 CKDBR 0807은 라파마이신 생합성 전구체인 말로닐-CoA, 메틸말로닐-CoA, 프로피오닐-CoA의 생성량이 증가되어 라파마이신 생성능이 향상된 것으로 판단된다.
균주
전구체		 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스
CKDBR 0807		 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스
B-NRRL 5491 (ATCC 29253)
말로닐-CoA 38.9 15.2
메틸말로닐-CoA 2.1 0.0
프로피오닐-CoA 1.3 0.4
단위 : μM
실시예 8: 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 B- NRRL 5491( ATCC 29253)의 드래프트 지놈 시퀀싱(draft genome sequencing)
균주개량 시 모균주로 사용된 야생형 균주 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 B-NRRL 5491 (ATCC 29253)의 지놈 시퀀싱(genome sequencing)을 ㈜마크로젠에 의뢰하여 실시하였다. 1차로 Roche사의 454 GS_FLX 시퀀서를 사용하여 지놈 시퀀싱을 실시한 결과 콘티그의 개수는 366개, 평균 길이(average length)는 34,121 bp이며 총 길이(total length)는 12.5 Mbp임을 확인하였다. 또한, 각각의 콘티그를 연결한 스캐폴드를 분석한 결과 스캐폴드의 개수는 15개, 평균 길이는 840,300 bp이며 총 길이는 12.6 Mbp임을 확인하였다.
2차로 다른 시퀀서 장비인 일루미나-솔렉사 시퀀서(Illumina-solexa sequencer) HiSeq2000으로 지놈 시퀀싱을 실시하였다. 일루미나-솔렉사 시퀀서로 지놈 시퀀싱한 결과와 기존의 454 GS_FLX 시퀀서로 지놈 시퀀싱한 결과를 동시에 사용하여 CLC 프로그램으로 de novo 어셈블리를 수행한 결과 콘티그의 개수는 419개, 평균 길이는 29,983 bp이며 총 길이는 12.6 Mbp임을 확인하였다.
그 후, 각각의 콘티그를 연결하여 스캐폴드를 만드는 스캐폴딩은 SSPACE 프로그램을 사용하여 실시하였으며, 실험적으로는 옵티칼 맵핑(optical mapping)을 DisGene 사에 의뢰하여 스캐폴드를 완성하였다. 그리고 IMAGE, GAP CLOSER 프로그램을 사용하여 유전자 사이의 갭(gap)을 연결하여 최종적으로 171개의 콘티그를 확보하였고, 총 길이가 12,544,066 bp인 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 B-NRRL 5491(ATCC 29253)의 드래프트 지놈 시퀀스(draft genome sequence)를 완성하였다.
실시예 9: 라파마이신 고생산 균주 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 CKDBR 0807의 드래프트 지놈 시퀀싱(draft genome sequencing)
본 발명의 균주인 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 CKDBR 0807의 변이된 유전자 염기서열 정보를 파악하기 위해 지놈 시퀀싱(genome sequencing)을 ㈜마크로젠에 의뢰하여 실시하였다. 지놈 시퀀싱은 일루미나-솔렉사 시퀀서 HiSeq2000을 사용하여 실시하였다. 그 다음 야생형 균주 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 B-NRRL 5491 (ATCC 29253)의 지놈 시퀀싱 결과를 바탕으로 맵핑한 결과 콘티그의 개수는 171개, 평균 길이는 73,357 bp이며 총 길이는 12.5 Mbp임을 확인하였고 RAST 프로그램을 사용하여 유전자 어노테이션(gene annotation)을 실시하였다.
상기의 라파마이신 고생산 균주인 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 CKDBR 0807의 드래프트 지놈 시퀀싱 결과를 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 B-NRRL 5491 (ATCC 29253)의 드래프트 지놈 시퀀싱 결과와 비교한 결과 144개의 SNP(Single Nucleotide Polymorphism)와 21개의 DIP(Deletion-Insertion Polymorphism)를 확인하였다. 변이된 유전자들은 모두 포인트 뮤테이션(point mutation)되었으며, 이 중 결과의 신뢰도를 높이기 위해 프리퀀시 90%, 커버리지 100 이상의 기준으로 데이터를 컷-오프한 결과 변이된 SNP와 DIP의 리스트는 도 7과 같았다. 또한, 변이된 유전자 및 염기서열 정보는 표 7과 같다.
구분 균주
유전자		 Contig
No.		 바뀐 염기 위치 B-NRRL 5491
(ATCC 29253)		 CKDBR 0807
SNP Ribose operon repressor 154 52769 G A
Putative membrane protein found fused to lysyl-tRNA synthetase like protein 24-6 91146
91147		 C
A		 A
G
Hypothetical protein 32-0
35-3
77-0
11-2
17-4
49-0
6-1
6-1		 55535
14149
27493
34304
54008
56986
87539
87540		 T
G
G
G
C
G
C
C		 C
A
T
T
T
T
T
T
Malonyl CoA-acyl carrier protein transacylase (EC 2.3.1.39) 35-0
26
26
54
54
69		 31174
22782
26381
36882
38837
77295		 C
G
G
C
T
G		 T
C
C
T
G
A
Oligopeptide ABC transporter, periplasmic oligopeptide-binding protein OppA (TC 3.A.1.5.1) 74-1 324932 C T
Mobile element protein 18-3 41465 G T
DNA-binding protein 27-0 189118 A G
Alkyldihydroxyacetonephosphate synthase (EC 2.5.1.26) 79 42956
42957		 C
C		 T
G
Nitrite-sensitive transcriptional repressor NsrR 48 89780 C T
Tagatose 1,6-diphosphate aldolase
(EC 4.1.2.40)		 48 154813 T G
GCN5-related N-acetyltransferase 39-0
39-0		 42535
42536		 T
G		 C
T
Probable membrane protein STY4873 22-4 10020 G A
NADPH-dependent F420 reductase 6-1
6-1		 157123
157124		 T
C		 C
A
Neuraminidase NanP 74-1 183005 G A
Chitin binding protein 17-0 26482 G T
Permeases of the major facilitator superfamily / Thymidylate kinase
(EC 2.7.4.9)		 24-9 95654 A C
Anti-sigma F factor antagonist (spoIIAA-2); anti sigma b factor antagonist RsbV 24-9 106296 G A
DIP Hypothetical protein 17-4 27742 - - GC
Malonyl CoA-acyl carrier protein transacylase (EC 2.3.1.39) 69 77298
77301		 G
-		 -
T
이 중 말로닐 CoA-아실 캐리어 단백질 트랜스아실라아제는 라파마이신 생성 과정에 관여하는 단백질이며, 리보오스 오페론 리프레스(ribose operon repressor), 항-시그마 F 인자 길항제(anti-sigma F factor antagonist)(spoIIAA-2); 항-시그마 b 인자 길항제(anti sigma b factor antagonist) RsbV, 아질산염-민감성 전사 리프레서(Nitrite-sensitive transcriptional repressor) NsrR는 전사 조절인자(transcription regulator)로서 유전자로부터 메신저 RNA(mRNA)가 생성될 때 상기와 같은 전사 조절인자들[억제인자(repressor), 활성인자(activator, enhancer) 등]에 의해 mRNA의 발현량을 결정하는데 관여하는 단백질들이다. 그러므로 이들 유전자 변이 결과가 라파마이신 생성에 영향을 미칠 가능성이 높은 유전자로 추정되며, 표 7 유전자들의 변이 결과에 의해서 라파마이신이 고생산되는 것으로 사료된다.
따라서, 실시예 7의 결과를 토대로 표 7에 언급된 유전자들의 염기서열 변이가 라파마이신 생합성 전구체의 생성량 변화를 유발시켰으며, 이러한 변화에 의해 라파마이신 생성능이 향상된 것으로 판단된다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (6)

  1. 서열목록 제1서열 내지 제171서열의 뉴클레오타이드를 포함하는 지놈 DNA(genomic DNA)를 갖는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus) 변이 균주.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 변이 균주는 서열목록 제172서열로 표시되는 야생형 리보오스 오페론 리프레서(ribose operon repressor) 유전자의 849번째 G염기가 A염기로 변이된 뉴클레오타이드; 서열목록 제173서열로 표시되는 야생형 라이실-tRNA 합성효소 유사 단백질에 결합하여 발견되는 추정 막단백질(Putative membrane protein found fused to lysyl-tRNA synthetase like protein) 유전자의 1600번째 C염기가 A염기로 변이되고, 1601번째 A염기가 G염기로 변이된 뉴클레오타이드; 서열목록 제174서열로 표시되는 야생형 가설 단백질(Hypothetical protein) 유전자의 631번째 T염기가 C염기로 변이된 뉴클레오타이드; 서열목록 제175서열로 표시되는 야생형 가설 단백질(Hypothetical protein) 유전자의 757번째 G염기가 A염기로 변이된 뉴클레오타이드; 서열목록 제176서열로 표시되는 야생형 가설 단백질(Hypothetical protein) 유전자의 601번째 G염기가 T염기로 변이된 뉴클레오타이드; 서열목록 제177서열로 표시되는 야생형 가설 단백질(Hypothetical protein) 유전자의 258번째 G염기가 T염기로 변이된 뉴클레오타이드; 서열목록 제178서열로 표시되는 야생형 가설 단백질(Hypothetical protein) 유전자의 270번째 C염기가 T염기로 변이된 뉴클레오타이드; 서열목록 제179서열로 표시되는 야생형 가설 단백질(Hypothetical protein) 유전자의 1549번째 G염기가 T염기로 변이된 뉴클레오타이드; 서열목록 제180서열로 표시되는 야생형 가설 단백질(Hypothetical protein) 유전자의 231번째 C염기가 T염기로 변이되고, 232번째 C염기가 T염기로 변이된 뉴클레오타이드; 서열목록 제181서열로 표시되는 야생형 말로닐 CoA-아실 캐리어 단백질 트랜스아실라아제(Malonyl CoA-acyl carrier protein transacylase (EC 2.3.1.39)) 유전자의 20925번째 C염기가 T염기로 변이된 뉴클레오타이드; 서열목록 제182서열로 표시되는 야생형 말로닐 CoA-캐리어 단백질 트랜스아실라아제(Malonyl CoA-acyl carrier protein transacylase (EC 2.3.1.39)) 유전자의 19082번째 G염기가 C염기로 변이되고, 22681번째 G염기가 C염기로 변이된 뉴클레오타이드; 서열목록 제183서열로 표시되는 야생형 말로닐 CoA-캐리어 단백질 트랜스아실라아제(Malonyl CoA-acyl carrier protein transacylase (EC 2.3.1.39)) 유전자의 6465번째 C염기가 T염기로 변이되고, 8420번째 T염기가 G염기로 변이된 뉴클레오타이드; 서열목록 제184서열로 표시되는 야생형 말로닐 CoA-캐리어 단백질 트랜스아실라아제(Malonyl CoA-acyl carrier protein transacylase (EC 2.3.1.39)) 유전자의 19180번째 G염기가 A염기로 변이된 뉴클레오타이드; 서열목록 제185서열로 표시되는 야생형 올리고펩타이드 ABC 트랜스포터2C 페리플라스믹 올리고펩타이드-결합 단백질 OppA(Oligopeptide ABC transporter2C periplasmic oligopeptide-binding protein OppA (TC 3.A.1.5.1)) 유전자의 33번째 C염기가 T염기로 변이된 뉴클레오타이드; 서열목록 제186서열로 표시되는 야생형 모바일 엘리먼트 단백질(Mobile element protein) 유전자의 164번째 G염기가 T염기로 변이된 뉴클레오타이드; 서열목록 제187서열로 표시되는 야생형 DNA-결합 단백질(DNA-binding protein) 유전자의 545번째 A염기가 G염기로 변이된 뉴클레오타이드; 서열목록 제188서열로 표시되는 야생형 알킬디하이드록시아세톤포스페이트 합성효소(Alkyldihydroxyacetonephosphate syntase (EC 2.5.1.26)) 유전자의 1446번째 C염기가 T염기로 변이되고, 1447번째 C염기가 G염기로 변이된 뉴클레오타이드; 서열목록 제189서열로 표시되는 야생형 아질산염-민감성 전사 억제제 NsrR(Nitrite-sensitive transcriptional repressor NsrR) 유전자의 26번째 C염기가 T염기로 변이된 뉴클레오타이드; 서열목록 제190서열로 표시되는 야생형 타가토오스 1,6-디포스페이트 알돌라아제(Tagatose 1,6-diphosphate aldolase (EC 4.1.2.40)) 유전자의 657번째 T염기가 G염기로 변이된 뉴클레오타이드; 서열목록 제191서열로 표시되는 야생형 GCN5-연관 N-아세틸트랜스퍼라아제(GCN5-related N-acetyltransferase) 유전자의 470번째 T염기가 C염기로 변이되고, 471번째 G염기가 T염기로 변이된 뉴클레오타이드; 서열목록 제192서열로 표시되는 야생형 추정 멤브레인 단백질 STY4873(Probable membrane protein STY4873) 유전자의 206번째 G염기가 A염기로 변이된 뉴클레오타이드; 서열목록 제193서열로 표시되는 야생형 NADPH-의존적 F420 환원효소(NADPH-dependent F420 reductase) 유전자의 440번째 T염기가 C염기로 변이되고, 441번째 C염기가 A염기로 변이된 뉴클레오타이드; 서열목록 제194서열로 표시되는 야생형 뉴라미니다아제 NanP(Neuraminidase NanP) 유전자의 708번째 G염기가 A염기로 변이된 뉴클레오타이드; 서열목록 제195서열로 표시되는 야생형 키틴(chitin) 결합 단백질 유전자의 514번째 G염기가 T염기로 변이된 뉴클레오타이드; 서열목록 제196서열로 표시되는 야생형 주요 촉진자 슈퍼패밀리의 퍼미아제/티미딜산 키나아제(Permeases of the major facilitator superfamily/Thymidylate kinase) 유전자의 2891번째 A염기가 C염기로 변이된 뉴클레오타이드; 서열목록 제197서열로 표시되는 야생형 항-시그마 F 인자 길항제(spoIIAA-2) 유전자의 260번째 G염기가 A염기로 변이된 뉴클레오타이드; 서열목록 제198서열로 표시되는 야생형 가설(Hypothetical) 단백질 유전자의 743번째에 GC염기가 삽입(insertion)된 뉴클레오타이드; 및 서열목록 제199서열로 표시되는 야생형 말로닐 CoA-아실 캐리어 단백질 트랜스아실라아제(Malonyl CoA-acyl carrier protein transacylase (EC 2.3.1.39)) 유전자의 19183번째 G염기가 결실(deletion)되고, 19186번째에 T염기가 삽입된 뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 변이 균주.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 변이 균주는 라파마이신(Rapamycin) 생성능을 갖는 것을 특징으로 하는 변이 균주.

  4. 삭제
  5. 다음의 단계를 포함하는 라파마이신 제조 방법:
    (a) 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 미생물 균주를 탄소원, 에너지원 및 질소원을 포함하는 배지에서 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 단계 (a)의 결과물인 배양액으로부터 라파마이신을 회수하는 단계.
  6. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 변이 균주로부터 생산되는 변이 단백질로서, 상기 변이 단백질은 서열목록 제200서열의 뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 리보오스 오페론 리프레서(ribose operon repressor) 단백질, 서열목록 제201서열의 뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 라이실-tRNA 합성효소 유사 단백질에 결합하여 발견되는 추정 막단백질(Putative membrane protein found fused to lysyl-tRNA synthetase like protein), 서열목록 제202서열 내지 서열목록 제208서열 및 서열목록 제226서열의 뉴클레오타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 가설(Hypothetical) 단백질, 서열목록 제209서열 내지 서열목록 제212서열의 뉴클레오타이드로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 말로닐 CoA-아실 캐리어 단백질 트랜스아실라아제(Malonyl CoA-acyl carrier protein transacylase), 서열목록 제213서열의 뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 올리고펩타이드 ABC 트랜스포터2C 페리플라스믹 올리고펩타이드-결합 단백질 OppA(Oligopeptide ABC transporter2C periplasmic oligopeptide-binding protein OppA (TC 3.A.1.5.1)), 서열목록 제214서열의 뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 모바일 엘리먼트(mobile element) 단백질, 서열목록 제215서열의 뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 DNA-결합 단백질, 서열목록 제216서열의 뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 알킬디하이드록시아세톤포스페이트 합성효소(Alkyldihydroxyacetonephosphate synthase), 서열목록 제217서열의 뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 아질산염-민감성 전사 억제제 NsrR(Nitrite-sensitive transcriptional repressor NsrR), 서열목록 제218서열의 뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 타가토오스 1,6-디포스페이트 알돌라아제(Tagatose 1,6-diphosphate aldolase), 서열목록 제219서열의 뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 GCN5-연관 N-아세틸트랜스퍼라아제(GCN5-related N-acetyltransferase), 서열목록 제220서열의 뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 추정 멤브레인 단백질 STY4873(Probable membrane protein STY4873), 서열목록 제221서열의 뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 NADPH-의존적 F420 환원효소(NADPH-dependent F420 reductase), 서열목록 제222서열의 뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 뉴라미니다아제 NanP(Neuraminidase NanP), 서열목록 제223서열의 뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 키틴(chitin) 결합 단백질, 서열목록 제224서열의 뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 주요 촉진자 슈퍼패밀리의 퍼미아제/티미딜산 키나아제(Permeases of the major facilitator superfamily/Thymidylate kinase), 서열목록 제225서열의 뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 항-시그마 F 인자 길항제(spoIIAA-2) 및 서열목록 제227서열의 뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 말로닐 CoA-아실 캐리어 단백질 트랜스아실라아제(Malonyl CoA-acyl carrier protein transacylase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 변이 단백질.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024130198A3 (en) * 2022-12-15 2024-07-25 Conagen Inc. Novel tryptophanases from streptomyces with novel properties and the uses thereof

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102652139B1 (ko) * 2020-10-20 2024-04-01 고려대학교 산학협력단 증가된 라파마이신 생산능을 가지는 변이주 및 이를 이용한 라파마이신 생산방법
WO2024074637A1 (en) * 2022-10-07 2024-04-11 Syngenta Crop Protection Ag Means and methods for controlling pathogens and pests in plants
WO2024074628A1 (en) * 2022-10-07 2024-04-11 Syngenta Crop Protection Ag Fungicidal compound

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101331491B1 (ko) 2012-03-21 2013-11-20 이화여자대학교 산학협력단 증가된 라파마이신 생성능을 갖는 신규 미생물 균주

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101331491B1 (ko) 2012-03-21 2013-11-20 이화여자대학교 산학협력단 증가된 라파마이신 생성능을 갖는 신규 미생물 균주

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2024130198A3 (en) * 2022-12-15 2024-07-25 Conagen Inc. Novel tryptophanases from streptomyces with novel properties and the uses thereof

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