KR101817824B1

KR101817824B1 - Lc-ms/ms와 전자코 분석기기를 병용한 시판 홍삼 농축액의 원산지 판별방법

Info

Publication number: KR101817824B1
Application number: KR1020140149563A
Authority: KR
Inventors: 노봉수; 방경환; 문지영; 김현정; 한현정; 박수원; 동혜민; 최진영
Original assignee: 서울여자대학교 산학협력단; 대한민국(농촌진흥청장)
Priority date: 2014-10-30
Filing date: 2014-10-30
Publication date: 2018-01-12
Also published as: KR20160053101A

Abstract

본 발명은 국내산과 중국산 시판 홍삼 농축액의 원산지 판별을 위하여 LC-MS/MS 와 자동시료채취기 및 질량분석기가 연결된 전자코 분석기기를 사용하여 분석하는 방법으로 국내산 시판 홍삼 농축액과 중국산 시판 홍삼 농축액을 LC-MS/MS로 분석한 결과 원산지에 맞는 지표물질 선정이 가능하였고 자동시료채취기와 질량분석기가 연결된 전자코 분석기기를 사용하여 분석한 결과 향기성분 패턴으로 중국산, 한국산 의심시료가 확실하게 분리되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 전자코를 사용하여 DF1값이 감소할수록 중국산 홍삼 농축액의 양이 증가하는 것을 볼 수 있었고 판별함수분석(DFA)을 실시하여 혼합비율까지 추측할 수 있음으로 원산지 판별이 어려운 시판 홍삼 농축액의 원산지를 정확하게 판별할 수 있는 방법을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

Description

LC-MS/MS와 전자코 분석기기를 병용한 시판 홍삼 농축액의 원산지 판별방법{Discrimination Method of Geographical Origin for Commercial Red Ginseng concentrate Using combined Liquid Chromatography-tandem mass spectrometer/MS and Electronic Nose based on mass spectrometry}

본 발명은 LC-MS/MS와 전자코 분석기기를 병용한 시판 홍삼 농축액의 원산지 판별방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 국내산과 중국산 시판 홍삼 농축액의 원산지 판별을 위하여 LC-MS/MS를 이용해 원산지에 맞는 지표물질을 선정하고 자동시료채취기와 질량분석기가 연결된 전자코 분석기를 사용하여 향기성분 패턴에 따라 분리하고 판별함수분석(DFA)을 실시하여 중국산, 한국산 의심시료의 혼합비율을 분석해 시판되는 홍삼 농축액의 원산지를 판별하는 방법에 관한 것이다.

세계적으로 인기있는 약초인 인삼은 수천 년 동안 아시아의 전통 의학에 다양한 용도로 사용되어지고 있으며(Attele AS, Wu JA, Yuan CS. Ginseng pharmacology: multiple constituents and multiple actions. Biochem Pharmac. 58: 1685?1693, 1999) 세계 인구의 65-80%가 건강을 유지하는 전통적인 약제로 사용하고 있다(Akerele O. WHO guidelines for the assessment of herbal medicines. Fitoterapia. 63: 99-104, 1992). 인삼에 있는 ginsenoside는 면역, 동맥경화, 고지혈증 예방, 항 당뇨 및 항암에 효과가 있는 주요 구성 성분으로 알려져 있다(Block KI, Mead MN. Immune system effects of echinacea, ginseng, and astragalus: a review. Integr Cancer Ther. 2: 247-267, 2003).

인삼의 품질은 국가 또는 지역마다 차이가 있으며 이는 환경적인 조건이나 재배 방법 등의 차이에서 기인한다. 중국삼인 전칠삼은 고려인삼과 비교 했을 때 특정 사포닌에 편중되어 있거나 사포닌 조성이 모두 다르고 페놀화합물, 폴리아세틸렌, 산성다당체와 같은 비 사포닌 성분들의 함량이나 조성 비율에도 차이가 있다는 연구 결과가 있었다(한국인삼연초연구원 : 고려인삼, 천일인쇄사, 대전, p.103, 1994). 또한 인삼은 종류에 따라 약효의 차이를 보이며 그 중 고려인삼은 자양강장, 당뇨 개선 및 치료, 심신안정 등 다양한 분야에 효과가 있는 반면에 미국삼은 신경계, 호흡기계 및 혈액 관련 질환의 개선에 국한되어 있으며 전칠삼은 혈액관련 치료에만 효과가 있는 것으로 밝혀졌다(Korea ginseng & tobacco research experiment station Korean Ginseng. Chunil Press, Daejon, Korea, p.98-110, 1994).

최근 우리나라의 인삼관련 신제품은 홍삼을 주제로 개발되고 있는 추세이며 홍삼에서 항암효과가 있는 ginsenoside 성분들이 정제되었고 홍삼가공품에 대한 선호도가 크게 높아지고 있다(Sung Kwon Ko. Analysis of Ginsenosides of White and Red Ginseng Concentrates. Korean J. Food Sci. Technol. 35(3): 536-539, 2003). 하지만 홍삼은 수삼을 찌고 건조하는 2단계를 반복적으로 거쳐 제조되기 때문에 뿌리의 원형이 손실되고 처리 단계에서의 조건이 품질에 영향을 크게 미칠 수 있다. 따라서 인삼에 비해 원산지를 식별하는 것이 어려우며 정확한 과학적 판별방법 또한 개발되어 있지 않아 부정유통이 만연하고 있는 실정이다(Ki Hwa Kim, Hyemin Dong, Hyun Jung Han, Young Hyun Lee, Ji Yong Moon, Kyong-Hwan Bang, Bong Soo Noh. Analysis of Geographical Origin of Red Ginseng Extract Using Mass Spectrometer-based Electronic Nose. Korean J. Food Sci. Technol. 45: 652-656, 2013).

기존의 원산지 판별에는 GC(gas chromatography)나 LC/MS(liquid chromatograph-mass spectrometer)및 적외선 분광분석법이나 전자코 등의 기기분석 방법 등이 주를 이루고 있다. Cho 등(Cho IH, Lee HJ, Kim YS. Difference in the volatile compositions of ginseng species. J Agri Food Chem. 60: 7616-7622, 2012)은 인삼을 GC/MS 분석하여 향기성분의 조성을 토대로 인삼의 종 간의 원산지를 구분한 바 있으며 Jeong 등(Myeong Sil Jeong, Soo Bok Lee. Discrimination of Geographical Origin for Herbal Medicine by Mineral Content Analysis with Energy Dispersive X-Ray Fluorescence Spectromete. Korean J. Food Sci. Technol. 40(2): 135-140, 2008)은 X-Ray Fluorescence Spectrometer를 사용하여 무기질을 분석하여 한약재의 원산지를 판별하였고 Chan 등(Chan TWD, But PPH, Cheng SW, Kwon IMY, Lau FW, Xu HX. Differentiation and authentication of Panax ginseng, Panax quinquefolius, and ginseng products by using HPLC/MS. Anal. Chem. 72: 1281-1287, 2000)은 HPLC/MS를 사용하여 동양삼에서는 Rf, 서양삼에서는 F11이 발견됨을 확인하였다. 또한 Son 등(Hee-Jin Son, Jin-Hee Kang, Eun-Jeung Hong, Chae-Lan Lim, Jin Young Choi, Bong Soo Noh. Authentication of Sesame Oil with Addition of Perilla Oil Using Electronic Nose Based on Mass Spectrometry. Korean J. Food Sci. Technol. 41(6): 609-614, 2009)은 MS-전자코를 사용하여 들기름이 혼합된 참기름을 판별하는 분석을 진행하였다.

GC나 LC/MS의 경우 특정 성분을 정량적으로 검출할 수 있으며 각각 성분의 차이를 비교가 가능하지만 분석 소요시간과 비용의 손실이 크고 실험오류가 발생하기 쉽다는 단점이 있는 반면 분광분석법이나 전자코의 경우 분석 소요시간과 비용의 손실이 적고 실험방법이 간단하기 때문에 실험오류의 가능성이 낮지만 특정 성분을 정량적으로 확인하기가 어려워 어떤 성분에 의해 분리되는지는 알 수 없다는 단점이 존재한다(Choi JY, Bang KH, Han KY, Noh BS. Discrimination analysis of the geographical origin of food. Korean J. Food Sci. Technol. 44: 503-525, 2012).

인삼, 홍삼 및 홍삼 농축액의 원산지 판별에 관한 선행 연구도 진행된 바 있으며 Song(Ho-Joon Song. A Comparative study on Characteristic of Ginseng Radix in Korea and China. Kor. J. Herbology. 25(3): 61-64, 2010)은 한국삼과 중국삼 구분 연구에서 전자코 분석에 의해 향의 차이가 나타남을 확인하였다. 그러나 외부형태나 내부형태 및 ginsenoside의 검색에 있어서는 뚜렷한 차이가 나타나지 않았다. 또한 Jeon(Young-Jae Jeon. Development for Discrimination Technology of Red Ginseng Concentrate Original. MS thesis, Joongbu Univ, Korea., 2011)은 홍삼 가공품의 원산지 판별법 기술 개발을 위하여 관능평가와 GC/MS 및 전자코 분석을 시행해 국내산과 중국산의 향기성분 차이를 확인하고 원산지를 판별하였다. 상기 발명에서는 향기성분 차이에 의해 국내산과 중국산을 구분해 내었지만 향기성분 차이에 의한 분리에 그쳤다는 한계점이 존재한다.

본 발명의 선행특허기술은 가공인삼의 원산지 또는 연령 판별용 표준 마커, 이의 확립방법 또는 이를 이용한 원산지 또는 연령 판별방법이 제10-1409848호에 공지된 바 있으나 이는 LC-MS를 이용해 홍삼으로부터 대사체를 추출하고 이를 다변량 분석법으로 분석하여 그룹간의 차이를 보이는 성분을 검출하고 이를 표준마커로서 확립하여 가공인삼의 산지 또는 연령 판별하는 방법에 관한 것이다. 또 전자코를 이용한 한국산 김치와 중국산 김치의 판별방법이 대한민국 등록특허 제10-1273429호에 공지된 바 있으나 이는 김치의 휘발성 향기성분으로부터 생성되는 이온 프레그먼트의 특정 범위의 질량을 전자코로 측정하여 한국산 김치와 중국산 김치를 판별하는 방법에 관한 것이다. 그리고 전자코를 이용한 한국산 배추와 중국산 배추의 판별방법이 대한민국 등록특허 제10-1268086호에 공지되어 있으나 이는 배추의 휘발성 향기성분으로부터 생성되는 이온 프레그먼트(ion fragment)의 특정 범위의 질량을 측정하여 얻어진 스펙트럼의 세기와 분포양상을 판별분석하여 한국산 배추와 중국산 배추의 판별이 가능한 정준판별함수의 계수를 생성하고 생성된 정준판별함수의 계수로부터 한국산 배추와 중국산 배추를 판별하는 방법에 관한 것이다.

또, 본원 발명자들은 MS-전자코를 이용하여 휘발성 성분 함량 분석 데이터를 판별함수분석(DFA)하여 국내산과 중국산 홍삼 농축액을 판별한 바 있다.(한국식품영양과확회 vol(11), 2013.)
그러나, 본 발명자들은 상기 발명의 한계점을 극복하기 위하여 LC-MS/MS와 전자코 분석기를 병용하여 향기 성분의 차이 외에도 인삼의 ginsenoside 성분 함량 차이를 기초한 데이터를 분석하여 시판 홍삼 농축액의 원산지를 정확히 판별하는 방법을 개발하였고 이는 상기 문헌 어디에도 고시되거나 암시된 바 없다.

따라서, 본 발명의 목적은 정확한 원산지 판별을 위하여 LC-MS/MS와 전자코 분석기기를 병용 사용하여 종래의 향기성분 차이에 의한 분리에 그쳤다는 기술적 한계점을 보완하기 위해 국내산과 중국산 시판 홍삼 농축액을 LC-MS/MS로 ginsenoside의 성분 함량 차이를 확인한 후 기초로 전자코 분석을 진행하여 향기성분의 차이를 검증하고 판별함수분석(DFA)을 실시하여 원산지가 의심되는 시료의 국내산과 중국산의 혼합 비율까지를 분석해 시판 홍삼 농축액의 원산지를 판별하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명은 국내산 54종과 중국산 47종 시판 홍삼 농축액을 원산지가 의심되는 시료를 제외하고 국내산과 중국산 홍삼 농축액 국내산 51종, 중국산 47종을 5배 희석한 후 국내산과 중국산의 혼합 비율을 각각 10:0, 8:2, 6:4, 4:6, 2:8 및 0:10으로 총 6개의 혼합 시료를 지표로 선정하는 단계와; 상기 단계에서 얻은 홍삼 농축액 혼합 시료를 LC-MS/MS로 분석하여 지표물질을 선택하는 단계와; 상기 단계에서 선택한 지표물질과 홍삼 농축액 시료를 자동시료채취기와 질량분석기가 연결된 전자코로 분석하는 단계와; 상기 단계에서 분석된 시료중 차별성이 높은 fragment를 독립변수로 선택하고 판별함수분석(DFA)를 실시하여 국내산과 중국산의 혼합비를 분석하는 단계를 통하여 달성하였다.

본 발명은 원산지 판별이 어려운 시판 홍삼 농축액을 LC-MS/MS와 자동시료채취기와 질량분석기가 연결된 전자코 분석기기를 사용하여 단지 기존의 단순한 향기성분 차이에 의한 원산지의 판별뿐만 아니라 상호간 혼합된 비율까지도 구분하여 홍삼 농축액의 원산지를 판별할 수 있는 뛰어난 효과가 있다.

도 1는 시판되는 홍삼 추출물에 기초한 국내산, 중국산 및 의심시료를 질량분석기가 연결된 전자코를 사용하여 판별 함수 분석을 보인 분석도이다.
도 2은 시판되는 홍삼 추출물의 지리적으로 다른 기원의 혼합비율에 따른 질량분석기가 연결된 전자코 사용에 의한 판별 함수 분석 패턴을 보인 분석도이다.
도 3은 K30을 제외한 시판 홍삼 추출물의 지리적으로 다른 기원의 혼합비율에 따른 질량분석기가 연결된 전자코 사용에 의한 판별 함수 분석 패턴을 보인 분석도이다.
도 4는 도 3의 DF1과 상업 홍삼 추출물의 지리적으로 다른 기원의 혼합 비율 사이의 관계를 나타낸 그래프이다.

본 발명의 구체적인 내용을 실시예를 들어 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 홍삼시료 준비 및 LC - MS / MS 분석

본 발명에 따른 홍삼시료는 농촌진흥청 국립원예특작과학원 인삼특작부와 국립농산물 품질관리원에서 수집한 국내산 54종과 중국산 47종 시판 홍삼 농축액을 제공받아 사용하였다. 원산지가 의심되는 시료를 제외하고 국내산과 중국산 홍삼 농축액 국내산 51종, 중국산 47종을 5배 희석한 후 국내산과 중국산의 비율을 각각 10:0, 8:2, 6:4, 4:6, 2:8, 0:10으로 총 6개의 혼합 시료를 지표로 선정했다.

Ginsenosides F11, 25OHRg3, Rg1, Re, Rf, Rh1, Rg2, Rc, Rd, Rh2, Rb2, Rb1, Rg3, Rk1, Rg5, Compound K, Ra1, F2, Ro, F1, Rg6, F4, Rk3, Rh4 표준물질은 엠보 연구소(Daejeon, Korea)에서 구매하였고 질량분석기는 Agilent HPLC 1200 series(Agilent, Santa Clara, CA, USA)가 연결된 Q Trap 3200(Applied Biosystem, Foster City, CA, United States)을 사용하였으며 Column은 YMC C18 Column(reversed-phased column, I.D. 4.6x150mm, particle size 3um, Allentown, PA, USA)을 사용하였다. 이동상은 5mM Ammonium acetate/DW와 5mM Ammonium acetate/CAN을 사용하였고 표준용액은 메탄올에 녹인 후 희석하여 사용하였다. 샘플 주입방식은 Infusion 방식을 사용하였으며, 각각의 성분에 대한 최적의 compound parameter를 선택하였다. 분석 조건은 표 1에 나타내었다.

홍삼농축액에 함유된 진세노사이드의 분석조건

Q1	Q3	DT	NAME	DP	EP	CEP	CE	CXP
801.144	493.3	80	25OH-Rg2	-110	-10.5	-34	-54	-6
801.2	801.2	80	25OH-Rg2_3(pseudo)	-125	-9	-38	-20	-36
801.248	477.3	80	25OH-Rg3	-95	-11	-34	-58	-6
681.231	621.3	80	Rh2_C-K (+OAC)	-55	-7	-26	-24	-8
681.231	161	80	Rh2_C-K (+OAC)	-55	-7	-26	-34	-2
779.401	649.4	80	digoxin	-100	-10	-34	-44	-8
634.329	604.2	80	Ra1 (-H+OAC)-2	-35	-8	-28	-18	-8
634.329	538.4	80	Ra1 (-H+OAC)-2	-35	-8	-28	-26	-6
583.213	553.2	80	Rb1 (-H+OAC)-2	-35	-7	-26	-16	-8
583.213	160.9	80	Rb1 (-H+OAC)-2	-35	-7	-26	-30	-2
568.298	538.4	80	Rc_Rb2 (-H+OAC)-2	-35	-7	-26	-16	-8
568.298	160.9	80	Rc_Rb2 (-H+OAC)-2	-35	-7	-26	-36	0
945.4	945.4	80	Rd_d(pseudo)	-100	-10.5	-34	-22	-38
945.45	161.2	80	Re_d	-100	-10	-42	-58	-2
859.292	799.4	80	Rg1_Rf (+OAC)	-40	-7.5	-38	-32	-10
799.4	799.4	80	Rg1_Rf(pseudo)	-115	-9	-38	-16	-36
843.307	783.4	80	Rg2_Rg3 (+OAC)	-30	-7.5	-44	-28	-10
783.4	783.4	80	Rg2_Rg3(pseudo)	-70	-5.5	-36	-6	-36
765.37	619.4	80	Rg6_F4	-85	-7.5	-28	-36	-8
765.37	161.1	80	Rg6_F4_Rk1+Rg5	-85	-7.5	-28	-44	-2
765.37	603.4	80	Rk1_Rg5	-50	-12	-40	-48	-2
697.3	637.3	80	Rh1_F1 (+OAC)	-60	-6	-26	-22	-26
697.3	160.8	80	Rh1_F1 (+OAC)	-60	-6.5	-26	-22	-26
619.276	161	80	Rk3_Rh4	-70	-8	-28	-28	-2
619.276	159	80	Rk3_Rh5	-70	-8	-28	-34	-2
955.412	793.3	80	Ro	-95	-10.5	-44	-54	-34
955.4	955.4	80	Ro(pseudo)	-95	-9.5	-36	-24	-42
843.3	783.4	80	F2	-70	-7.5	-46	-26	-32
783.4	783.4	80	F2(pseudo)	-105	-12	-46	-26	-32
DP(Declustering Potential), EP(Entrance Potential), CEP(Collision Cell Entrance Potential), CE(Collision Energy), CXP(Collision Cell Exit Potential)

실험예 1. 국내산과 중국산 시판 홍삼 농축액의 LC-MS/MS 결과 분석

본 발명에 따른 결과로 국내산 홍삼 농축액과 중국산 홍삼 농축액 간의 구성성분 함량에 차이가 나타났다(표 2).

국내 및 중국산 시판 홍삼농축액의 진세노사이드 함량(mmole)

Ginsenoside	K10	K21	K25	K30	Domestic average	Chinese average
Ro	7.674±0.460^d	0.257±0.014^a	3.294±0.194^b	10.202±0.582^f	8.895±0.551^e	5.061±0.258^c
Ra1	5.332±0.437^b	0.120±0.008^a	5.689±0.398^b	7.365±0.383^b	6.618±0.338^c	0.033±0.002^a
Rb1	18.785±1.371^c	0.891±0.061^a	17.767±0.959^c	25.877±1.889^d	26.904±1.641^d	6.661±0.460^b
Rc	11.660±0.944^b	0.337±0.020^a	14.523±1.104^c	17.616±0.969^d	15.438±1.050^c	25.786±1.418^e
Rb2	0.000±0.000^a	0.536±0.031^a	19.015±1.464^b	24.434±2.223^c	20.489±1.332^b	22.344±0.004^a
Rd	2.452±0.177^b	0.137±0.008^a	5.640±0.491^d	6.420±0.488e	4.387±0.237^c	4.767±0.248^c
Rg1	6.129±0.601^c	0.260±0.018^a	4.417±0.252^b	8.161±0.588^d	8.913±0.784^d	12.791±0.934^e
Rf	2.481±0.139^b	0.191±0.019^a	2.431±0.126^b	3.284±0.194^c	3.488±0.209^c	8.098±0.599^d
Re	3.333±0.293^b	0.044±0.002^a	3.194±0.185^b	4.971±0.373^c	4.883±0.264^c	30.044±1.773^d
Rg2	5.381±0.522^b	0.496±0.037^a	9.333±0.476^d	10.749±0.742^d	7.430±0.528^c	28.756±1.754^e
25OH-Rg3	0.279±0.025^b	0.302±0.019^bc	0.339±0.019^c	0.527±0.038^d	0.342±0.022^c	0.103±0.008^a
Rg3	5.730±0.338^b	0.905±0.052^a	8.185±0.409^c	16.422±1.429e	7.625±0.465^c	11.812±1.087^d
Rg5	10.813±0.887^b	2.318±0.141^a	13.575±0.774^c	24.285±2.259^d	11.689±0.631^bc	11.860±0.795^bc
Rg6	0.345±0.027^ab	0.044±0.004^a	1.008±0.051^c	1.169±0.069^c	0.790±0.066^bc	11.830±0.781^d
Rh1	1.221±0.082^b	0.151±0.013^a	1.427±0.088^b	1.727±0.162^c	1.866±0.147^c	4.004±0.244^d
Rh2	0.000±0.000^a	0.000±0.000^a	0.000±0.000^a	0.46±70.028^c	0.009±0.000^a	0.109±0.008^b
Rh4	2.755±0.223^b	0.332±0.022^a	3.688±0.258^c	4.593±0.390d	3.561±0.203^c	3.638±0.240^c
Rk1	4.196±0.222^b	1.246±0.083^a	7.686±0.407^d	14.033±1.305e	6.186±0.439^c	7.624±0.442^d
Rk3	0.453±0.039^b	0.000±0.000^a	0.604±0.037^b	2.065±0.163^d	1.160±0.064^c	1.935±0.114^d
F1	0.487±0.036^b	0.146±0.012^a	0.928±0.050^c	1.597±0.150^e	1.235±0.080^d	2.435±0.183^f
F2	3.488±0.317^b	0.000±0.000^a	0.412±0.025^a	0.000±0.000^a	0.072±0.004^a	10.434±0.678^c
F4	2.158±0.142^b	0.395±0.028^a	4.157±0.403^d	5.175±0.264e	2.821±0.144^c	1.788±0.157^b
C-K		0.000±0.000^a		0.000±0.000^a	0.000±0.000^a	0.000±0.000^a	0.000±0.000^a	0.210±0.011^b
Small alphabets mean with different superscripts within the same row are significantly different by Duncans multiple range test at p<0.05

LC-MS/MS 분석기기를 사용하여 인삼에서 검출되는 ginsenoside 항목인 Ro, Ra1, Rb1, Rc, Rb2, Rd, Rg1, Rf, Re, Rg2 데이터를 비교하고 원산지에 따른 데이터 분석결과로부터 각 성분의 평균을 비교했을 때 가장 많은 차이를 보이는 시료를 선별하였다. ginsenoside Ra1과 ginsenoside Rb1 및 ginsenoside Rg2 등은 국내산 홍삼 농축액과 중국산 홍삼 농축액의 값의 차이가 매우 커 지표로 사용하였다. 반면 인삼에서 검출되지 않은 ginsenoside 항목인 25OH-Rg3, Rg3, Rg5, Rg6, Rh1, Rh2, Rh4, Rk1, Rk3, F1, F2, F4, Compound K의 경우 국내산 홍삼 농축액에서는 ginsenoside F2가 거의 대부분 검출되지 않은 반면에 중국산 홍삼 농축액에서는 ginsenoside F2가 검출되었으며 ginsenoside Rh2 경우에도 ginsenoside F2와 동일한 결과 값을 나타내었다. 상기 결과로 보아 이들 물질은 홍삼 농축액 제조 과정에서 생성되어진 것으로, ginsenoside F2와 Rh2는 국내산과 중국산의 원산지 판별에 있어서 강력한 지표역할을 하는 것을 볼 수 있었다.

상기 결과를 토대로 LC-MS/MS 데이터를 분석하여 국내산 시판 홍삼 농축액에서 중국산이 혼합되었다고 여겨지는 K10, K21, K25 및 K30의 4개의 시료를 선별하였다. K10의 경우 국내산에서는 검출되지 않는 ginsenoside F2가 3.488mmol 존재하였고 K21은 ginsenoside Ra1과 ginsenoside Rb1의 값이 국내산의 평균값에 미치지 못하는 것을 확인하였다. K25 역시 국내산에서 검출되지 않는 ginsenoside F2가 0.412mmol 존재함을 볼 수 있었으며, K30은 국내산에서 검출되지 않는 ginsenoside Rh2가 0.467mmol만큼 존재하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 2. 전자코 분석

본 발명에 따른 전자코 분석은 1 g의 시료를 10 mL vial(La-Pha-Pack^®GmbH, Langerwehe, Germany)에 넣고 PTFE/silicone cap(Pharma-Fix, Chemmea, Slovakia)으로 밀봉한 후 90에서 10분간 350 rpm으로 교반하고 130℃의 주입구 온도를 유지하여 주입하였다. Headspace 분석 시 syringe purge는 3초를 유지하여 thermostatted tray holder에 놓고 2.5 mL를 취하였으며 headspace system을 이용해 시료의 기체성분을 분석하였다. 시료의 분석은 자동시료채취기(CombiPAL, CTC analytics, Zwingen, Switzerland)와 질량분석기(Quadrupole Mass Spectrometer, Balzers Instruments, Masin-Epagniger, Switzerland)가 연결된 전자코(SMart Nose300, SMart Nose, Marin-Epagnier, Switzerland)로 분석하였고 휘발성 물질들은 70eV에서 이온화시켜 180초 동안 생성된 이온물질을 사중극자(quadrupole) 질량 필터링을 거친 후 특정 질량 범위(10-200 amu)의 물질을 정수단위로 측정하여 channel수에 따라 사용하였다. 상기 분석 초기에 공기 시료를 대조구로 사용하였고 모든 시료는 3회 반복을 실시하였다. 이 때 각기 다른 channel의 감응도는 matrix형태로 기록하였다.

실험예 2. 국내산과 중국산 시판 홍삼 농축액의 전자코 분석

본 발명에 따른 국내산 54종과 중국산 홍삼 농축액 47종의 시료 중 상기 실험예 1의 LC-MS/MS 분석에서 원산지가 의심된다고 선정된 4가지 K10, K21, K25, K30 시료와 의심시료를 제외한 나머지를 무작위로 선별하여 국내산 및 중국산 홍삼 농축액을 각각 6가지씩 선택하였다. 상기 시료를 자동시료채취기와 질량분석기가 연결된 전자코로 분석하여 얻은 ion fragment의 감응도 값을 통계처리 한 결과를 도 1에 나타내었다. DF1의 F값은 4783.70(r2=0.9967)이고 DF2의 F값은 892.88(r2=0.9928)으로 DF1과 DF2의 값이 약 5:1 비율로 구분이 되었다. 향기 성분을 가지지 않는 공기를 대조구로 놓았을 때 DF1을 기준으로 시판 홍삼 농축액이 상대적으로 공기의 왼쪽에 위치하는 것으로 보아 DF1의 오른쪽에서 왼쪽방향으로 이동할수록 향기성분이 더 많이 검출되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 DF2를 기준으로 중국산, 원산지 의심시료, 국내산 순으로 뚜렷하게 패턴이 분리되는 것을 분석하였다.

의심시료는 중국산 시료와 국내산 시료의 중간에 위치하여 LC-MS/MS의 분석 결과 의심시료로 분리한 4가지의 국내산 시판 홍삼 농축액이 전자코 에서도 국내산과 중국산이 혼합되었을 가능성이 있다는 것을 보여줌으로써 두 결과가 일치함을 보였다.

실시예 3. 판별함수분석( Discriminant Function Analysis ; DFA )

상기 판별함수분석의 소프트웨어는 SMart Nose^® statistical analysis software (Version1.51, THOPAS Soft Creation, Marin-Epagnier, Switzerland)를 사용하였다. 전자코 분석에서 사용된 판별함수 분석은 휘발성 향기성분으로부터 생성되는 10-200 amu의 이온 물질 중 각 시료 간에 감응도가 높은 30개 미만의 fragment(m/z)를 독립변수로 선택하였다. 선택된 독립변수의 해당 감응도 값을 이용하여 다음 수학식 1에 따라 판별함수분석(DFA)을 실시하였으며 종속변수에 영향을 주는 독립변수를 검정하였다.

B₀는 constant값을 나타내며 B₁…B_n은 coefficients를 나타내고 X₁…X_n은 각각의 amu값에서의 감응도를 나타낸다. 판별함수 값은 독립변수 중에서 response 값에 해당되는 종속변수에 영향을 많이 준 DF1(first score from discriminant function analysis) 및 DF2(second score from discriminant function analysis)를 대상으로 x 축에는 DF1을 y 축에는 DF2를 나타내 2차원의 패턴형식으로 나타내었다.

실험예 3. 국내산과 중국산 시판 홍삼 농축액의 판별함수 분석

국내산의 시판 홍삼 농축액 중에서 중국산 시판 홍삼 농축액과 혼합되었다고 판별한 4가지의 시료가 국내산과 중국산이 어느 정도의 비율로 혼합되었는지 판별하기 위해 일정 비율로 혼합한 표준 시료를 통하여 판별분석을 하였다. 표준 시료는 원산지가 의심된다고 생각되는 시료를 제외한 시료는 국내산과 중국산을 각각 10:0(A), 8:2(B), 6:4(C), 4:6(D), 2:8(E) 및 0:10(F)으로 혼합한 총 6개의 혼합 시료를 지표로 사용했다.

원산지 의심시료와 국내산과 중국산을 일정비율로 섞은 시료를 분석한 결과(도 2) DF2의 위쪽 방향부터 중국산 시판 홍삼 농축액의 혼합량이 증가함에 따라 아래쪽 방향으로 이동하는 패턴을 나타내었고 DF1의 F값은 630.29 (r²=0.9965),DF2의 F값은 188.99 (r²=0.9885)으로 나타났다. 의심시료 K10, K21, K25는 혼합비율 사이에 위치한 반면 K30의 시료는 DF1의 왼쪽 방향으로 멀리 떨어져 있는 것을 확인하였다. 이는 중국산이 아닌 캐나다산이나 미국산이 혼합되었을 가능성이 있는 것으로 분석 되었다. 도 2에서 시료의 영향력이 강한 K30을 제거하고 판별함수를 다시 분석한 결과를 도 3에 나타내었다. DF1의 오른쪽 방향부터 중국산 시판 홍삼 농축액의 혼합비 양이 증가함에 따라 왼쪽 방향으로 이동하는 패턴을 나타내었으며 DF1으로 분리되는 것을 도 3에서 확인할 수 있었다. 이 때 DF1의 F값은 2056.90(r²= 0.9989)이고 DF2의 F값은 504.57(r²= 0.9956)으로 나타나 DF1 : DF2에 의한 영향력이 4:1의 비율로 구분이 됨을 확인하였다.

상기 결과 값을 토대로 x축을 혼합비율, y축을 DF2로 하여 도 4에 이차원 막대그래프로 나타낸 결과 국내산 홍삼 농축액이 많이 혼합된 혼합비(A)부터 DF1이 일정하게 감소하는 그래프를 나타내었다(도 4). 혼합 비율에 따른 DF1 값의 반응식은 y=-0.0676x+0.1763으로 나타났으며 상관계수(R²)는 0.9723로 1에 가까운 값을 보여주어 높은 정확도를 나타내었다. K10은 국내산의 혼합비율에 가깝지만 미량이 섞였다고 보아지며 K21은 1:9의 비율로 혼합이 되었고 K25은 9:1의 비율로 혼합이 된 것으로 평가되었다.

실시예 4. 통계처리

모든 실험은 3회 반복하였고, 통계처리한 결과는 평균과 표준편차로 표시하였다. 실험 데이터는 통계처리 프로그램인 SPSS(Statistical Package for the Social Sciences, version 20.0, Chicago, IL, USA)를 이용하여 5% 유의 수준에서 Duncan’s multiple range test로 평균 간의 유의성을 검증하였다.

이상 설명한 바와 같이 본 발명은 MC-MS/MS와 자동시료채취기와 질량분석기가 연결된 전자코 분석기기를 사용하여 원산지 판별이 어려운 시판 홍삼 농축액의 원산지를 정확하게 구분하는 판별 방법을 제공하는 뛰어난 효과가 있으므로 식품산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

LC/MS와 전자코 분석기를 병용한 홍삼 농축액의 원산지 판별방법에 있어서,
국내산과 중국산 시판 홍삼 농축액을 5배 희석한 후 국내산과 중국산의 혼합 비율을 각각 10:0, 8:2, 6:4, 4:6, 2:8 및 0:10으로 총 6개의 혼합 시료를 지표로 선정하는 단계와; 상기 단계에서 얻은 홍삼 농축액 혼합 시료를 LC-MS/MS로 분석하여 진세노사이드 성분함량 차이가 큰 지표물질을 선택하는 단계와; 상기 단계에서 선택한 진세노사이드 성분 Ra1, Rb1, Rg2, F2, 및 Rh2 의 지표물질과 홍삼 농축액 시료를 자동시료채취기와 질량분석기가 연결된 전자코로 분석하는 단계와; 상기 단계에서 분석된 시료 중 감응도가 높은 fragment를 독립변수로 선택하여 판별함수분석(DFA)을 실시하여 국내산과 중국산의 혼합비를 분석하는 단계로 이루어진 것이 특징인 홍삼 농축액의 원산지 판별방법
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