KR101816100B1

KR101816100B1 - 변이 미생물을 이용한 4-하이드록시페닐젖산의 제조방법

Info

Publication number: KR101816100B1
Application number: KR1020150067345A
Authority: KR
Inventors: 이상엽; 양정은
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2015-05-14
Filing date: 2015-05-14
Publication date: 2018-01-08
Also published as: KR20160134003A

Abstract

본 발명은 DAHP 합성효소(3-deoxy-D-arabinoheptulosonate-7-phosphate synthetase)를 코딩하는 유전자와 코리스메이트 뮤테이즈/프리페네이트 디하이드로게나이제 (chorismate mutase / prephenate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자가 도입 또는 증폭되어 있고, 젖산디하이드로게나이제(lactate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 4-하이드록시페닐젖산 생성능을 가지는 변이 미생물 및 이를 이용하여 다양한 파생화합물의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 변이 미생물 및 4-하이드록시페닐젖산의 제조방법은 다양한 파생화합물 및 4-하이드록시페닐젖산을 고수율로 제조하는 데 유용하다.

Description

변이 미생물을 이용한 4-하이드록시페닐젖산의 제조방법{Preparing Method of 4-hydroxyphenyllactic Acid Using Variant Microorganism}

본 발명은 DAHP 합성효소(3-deoxy-D-arabinoheptulosonate-7-phosphate synthetase)를 코딩하는 유전자와 코리스메이트 뮤테이즈/프리페네이트 디하이드로게나이제 (chorismate mutase / prephenate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자가 도입 또는 증폭되어 있고, 젖산디하이드로게나이제(lactate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 4-하이드록시페닐젖산 생성능을 가지는 변이 미생물 및 상기 변이미생물을 이용한 4-하이드록시페닐젖산의 제조방법에 관한 것이다.

4-하이드록시페닐젖산은 향균 물질로서 그램 음성, 양성 세균에 대해서 폭넓은 향균성을 갖고 있다. 식품첨가물, 농약, 방향족 바이오폴리머, 다양한 화합물의 전구체로 이용할 수 있는 유용한 화합물이다.

이러한 화합물의 제조방법에 있어서는, 유기 화학 합성에 의해 제조가 이루어지고 있다(대한민국 특허공개 2013-0107355). 환경 문제나 비용의 관점에서 촉매나 유기 용매 등의 화학 물질을 사용하지 않고 4-하이드록시페닐젖산을 고효율로 대량 생산할 수 있는 미생물 제조가 필요하다.

그러나, 4-하이드록시페닐젖산의 생산에 관한 연구는 락토바실러스 (Lactobacillus sp. SK007)를 이용하여 생산한 것 (Wanmeng Mu et. al., Journal of Bioscience and Bioengineering., 109:369, 2010)과 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha) 유래의 재조합 젖산디하드로게나이제(lactate-dehydrogenase)를 도입하여 대장균을 이용하여 생산한 예가 있다(Koma D et. al., Appl Environ Microbiol., 78(17):6203, 2012). 또한, 3-페닐젖산 및 4-하이드록시페닐젖산을 페닐피루브산 (phenylpyruvic acid) 환원효소를 이용하여 대장균으로부터 4-하이드록시페닐젖산을 생산한 예가 있다 (대한민국 특허공개 2013-0107355). 하지만 이러한 예들은 4-하이드록시페닐젖산을 효율적으로 얻는 단계에는 이르지 못하였다.

이에, 본 발명자들은 미생물을 이용하여 4-하이드록시페닐젖산을 효율적으로 생산하는 방법을 개발하고자 노력한 결과, 4-하이드록시페닐피루브산을 기질로 이용하여, 4-하이드록시페닐젖산으로 효율적으로 전환하는 효소를 찾고, 상기 효소를 코딩하는 유전자가 도입된 변이 미생물을 배양하는 경우, 효율적으로 4-하이드록시페닐젖산을 생성할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 4-하이드록시페닐젖산의 고생성능을 가지는 변이 미생물 및 상기 변이 미생물을 이용한 4-하이드록시페닐젖산의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 4-하이드록시페닐젖산의 고생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 해당과정(glycolysis) 또는 펜토스포스페이트 경로를 가지는 미생물에, DAHP 합성효소(3-deoxy-D-arabinoheptulosonate-7-phosphate synthetase)를 코딩하는 유전자와 코리스메이트 뮤테이즈/프리페네이트 디하이드로게나이제 (chorismate mutase / prephenate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자가 도입 또는 증폭되어 있고, 젖산디하이드로게나이제(lactate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 4-하이드록시페닐젖산 생성능을 가지는 변이 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 상기 변이 미생물을 글루코오스 함유 배지에서 배양하여, 4-하이드록시페닐젖산을 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 4-하이드록시페닐젖산을 회수하는 단계를 포함하는 4-하이드록시페닐젖산의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 해당과정(glycolysis) 또는 펜토스포스페이트 경로를 가지는 미생물에, DAHP 합성효소(3-deoxy-D-arabinoheptulosonate-7-phosphate synthetase)를 코딩하는 유전자와 코리스메이트 뮤테이즈/프리페네이트 디하이드로게나이제(chorismate mutase/prephenate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자를 도입 또는 증폭시키고, 젖산디하이드로게나이제(lactate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자를 도입시키는 것을 특징으로 하는 4-하이드록시페닐젖산 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 4-하이드록시피루브산을 4-하이드록시페닐젖산으로 전환하는 효소를 이용하여 4-하이드록시페닐젖산 고생성능 변이 미생물을 제조하고, 이를 이용함으로써, 4-하이드록시페닐젖산을 고수율로 제조하는데 유용하다.

도 1은 포도당으로부터 4-하이드록시페닐젖산의 합성경로를 나타내는 모식도이다.
도 2는 pTac15K-AroG(D146G)의 플라스미드를 나타낸 것이다.
도 3은 pTac15K-AroF(N8K)의 플라스미드를 나타낸 것이다.
도 4는 pTac15K-AroG(D146G)TyrA(A354V/M53I)의 플라스미드를 나타낸 것이다.
도 5는 Clostridium botulinum ATCC 3502 유래의 4-하이드록시피루브산을 4-하이드록시페닐젖산으로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자 (fldH) 를 과발현 하기 위한 플라스미드 pTrc99A-FldH를 나타낸 것이다.
도 6은 상기 벡터가 도입된 변이 미생물을 배양하여 제조한 4-하이드록시페닐젖산의 분석결과를 나타낸 것이다(●:BL21(DE3)에 pTac15k-AroG(D146G) 및 pTrc99A-FldH가 형질전환 된 균주, ○:BL21(DE3)에 pTac15k-AroF(N8K) 및 pTrc99A-FldH가 형질전환 된 균주)
도 7은 BL21(DE3) 및 BL21(DE3)ΔtyrR에 상기 벡터가 도입된 변이 미생물을 배양하여 제조한 4-하이드록시페닐젖산의 분석결과를 나타낸 것이다. (●, TyrA:BL21(DE3)ΔtyrR에 pTac15k-AroG(D146G)TryA 및 pTrc99A-FldH가 형질전환된 균주 , ○,XTyrR:BL21(DE3)에 pTac15k-AroG(D146G)TryA 및 pTrc99A-FldH가 형질전환된 균주)

본 발명에서는 4-하이드록시피루브산을 4-하이드록시페닐젖산으로 전환하는 효소를 이용해 4-하이드록시페닐젖산이 생성됨을 확인하였다.

본 발명에서는 포도당으로부터 4-하이드록시피루브산으로의 전환을 위해 DAHP 합성효소 (3-deoxy-D-arabinoheptulosonate-7-phosphate synthetase)를 코딩하는 유전자 (aroG) 및 코리스메이트 뮤테이즈/ 프리페네이트 디하이드로게나이제 (chorismate mutase / prephenate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 (tyrA)를 증폭하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 해당과정(glycolysis) 또는 펜토스포스페이트 경로를 가지는 미생물에, DAHP 합성효소(3-deoxy-D-arabinoheptulosonate-7-phosphate synthetase)를 코딩하는 유전자와 코리스메이트 뮤테이즈/프리페네이트 디하이드로게나이제 (chorismate mutase / prephenate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자가 도입 또는 증폭되어 있고, 젖산디하이드로게나이제(lactate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 4-하이드록시페닐젖산 생성능을 가지는 변이 미생물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 DAHP 합성효소(3-deoxy-D-arabinoheptulosonate-7-phosphate synthetase)를 코딩하는 유전자는 aroG(D146G) 유전자이고, 상기 코리스메이트 뮤테이즈/프리페네이트 디하이드로게나이제(chorismate mutase/prephenate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자는 tyrA(A354V/M53I) 유전자인 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 젖산디하이드로게나이제(lactate-dehydrogenase)는 클로스트리듐 보틀리늄(Clostridium botulinum ATCC 3502) 유래의 fldH 유전자에 의해 코딩되는 효소인 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일양태에서 상기 aroG(D146G) 유전자와 tyrA(A354V/M53I) 유전자는 대장균 W3110(ATCC 39936) 유래의 유전자를 사용하였으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 변이 미생물은 타이로신 DNA-결합 전사 억제인자를 코딩하는 유전자가 추가적으로 결실되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 (a) 상기 변이 미생물을 글루코오스 함유 배지에서 배양하여, 4-하이드록시페닐젖산을 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 4-하이드록시페닐 젖산을 회수하는 단계를 포함하는 4-하이드록시페닐젖산의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에서, 변이 미생물의 배양 및 4-하이드록시페닐젖산의 회수공정은 종래 발효공정에서 통상적으로 알려진 배양방법(회분식 배양, 유가식 배양) 및 분리 및 정제방법을 사용하여 수행할 수 있다.

본 발명의 일양태에서는 aroG(D146G) 유전자와 tyrA(A354V/M53I) 유전자가 증폭되고, fldH 유전자가 도입된 재조합 대장균 BL21(DE3)/pTac15k-AroG(D146G)TryA(A354V/M53I) +pTrc99A-FldH를 37℃에서 24시간 배양하여, 1430mg/L의 4-하이드록시페닐젖산을 수득하였다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 해당과정(glycolysis) 또는 펜토스포스페이트 경로를 가지는 미생물에, DAHP 합성효소(3-deoxy-D-arabinoheptulosonate-7-phosphate synthetase)를 코딩하는 유전자와 코리스메이트 뮤테이즈/프리페네이트 디하이드로게나이제(chorismate mutase/prephenate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자를 도입 또는 증폭시키고, 젖산디하이드로게나이제(lactate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자를 도입시키는 것을 특징으로 하는 4-하이드록시페닐젖산 생성능을 가지는 변이 미생물의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 변이미생물에서 타이로신 DNA-결합 전사 억제인자를 코딩하는 유전자가 추가적으로 결실시키는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서, 상기 4-하이드록시페닐젖산의 생성능을 가지는 미생물은 박테리아, 효모, 곰팡이 등을 이용할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서, 용어 "벡터 (vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환 되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드 (plasmid)" 및 "벡터 (vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 그러나, 본 발명은 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태를 포함한다. 포유동물 세포 배양물 발현을 위한 전형적인 발현 벡터는 예를 들면 pRK5 (EP 307,247호), pSV16B (WO 91/08291호) 및 pVL1392 (Pharmingen)을 기초로 한다.

본 발명에서 "증폭"이란 해당 유전자의 일부 염기를 변이, 치환, 또는 삭제시키거나, 일부 염기를 도입시키거나, 또는 동일한 효소를 코딩하는 다른 미생물 유래의 유전자를 도입시켜 대응하는 효소의 활성을 증가시키는 것을 포괄하는 개념이다.

본 발명에서 “발현 조절 서열 (expression control sequence)”이라는 표현은 특정한 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서가 이에 포함된다. 플라스미드에서 유전자의 발현 양에 가장 영향을 미치는 인자는 프로모터이다. 고발현용의 프로모터로서 SRα 프로모터와 사이토메가로바이러스 (cytomegalovirus) 유래 프로모터 등이 바람직하게 사용된다.

본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열중 어느 것이라도 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 발현 조절서열의 예에는, 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어 Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 구성과 유도의 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함된다. T7 RNA 폴리메라아제 프로모터 Φ10은 이. 콜라이에서 단백질 NSP를 발현시키는데 유용하게 사용될 수 있다.

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 “작동가능하게 연결 (operably linked)”된다. 이것은 적절한 분자 (예를 들면, 전사 활성화 단백질)은 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, “작동가능하게 연결된”은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는것을 의미한다. 그러나, 인핸서 (enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.

본원 명세서에 사용된 용어 “발현 벡터”는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어 (recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 (이종) DNA가 생성될 수 있다.

당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가, 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점 (replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다. 발현 숙주가 진핵세포인 경우에는, 발현 벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.

상술한 발현 벡터에 의해 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 “형질전환”은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 본원 명세서에 사용된 용어 “형질감염”은 임의의 코딩 서열이 실제로 발현되든 아니든 발현 벡터가 숙주 세포에 의해 수용되는 것을 의미한다.

발명의 숙주 세포는 원핵 또는 진핵생물 세포일 수 있다. 또한, DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현효율이 높은 숙주가 통상 사용된다. 이. 콜라이, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들, 이 숙주 세포의 예이다.

물론 모든 벡터와 발현 조절 서열이 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다. 발현 조절 서열을 선정함에 있어서도, 여러 가지 인자들을 고려하여야만 한다. 예를 들어, 서열의 상대적 강도, 조절가능성 및 본 발명의 DNA 서열과의 상용성 등, 특히 가능성있는 이차 구조와 관련하여 고려하여야 한다. 단세포 숙주는 선정된 벡터, 본 발명의 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물의 독성, 분비 특성, 단백질을 정확하게 폴딩시킬 수 있는 능력, 배양 및 발효 요건들, 본 발명 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물을 숙주로부터 정제하는 것의 용이성 등의 인자를 고려하여 선정되어야만 한다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 4-하이드록시페닐젖산 생산을 위한 변이 미생물의 제조

1-1:플라스미드 pTac15K-AroG(D146G)의 제작

항시적, 생합성적 E. coli W3110(ATCC 39936) (derived from E. coli K-12, λ-, F-, prototrophic)의 DAHP 합성효소(3-deoxy-D-arabinoheptulosonate-7-phosphate synthetase)를 코딩하는 유전자 aroG의 피드백 저해가 해제된 돌연변이 aroG(D146G)(서열번호 1)를 strong 프로모터인 tac 프로모터에 의해 삽입되는 유전자를 발현하는 벡터인 pTac15K(p15A origin, low copies, KmR; KAISTMBELstock) 벡터에 클로닝하였다.

pTac15k의 제조방법은 다음과 같다:

pHCE IIB(NcoI) ((주)바이오리더스, 한국)를 제한효소 AatII와 NheI로 처리하여 절단하고, pACYC177(New England Biolabs, 영국)도 동일한 제한효소로 처리하여 절단한 후, pHCE IIB(NcoI)의 pHCD promoter를 포함하는 단편과, pACYC177의 p15A origin과 암피실린 항생제를 포함하는 단편을 라이게이션시켜, pHNC15 벡터를 제작하였다. 상기 pHNC15 벡터의 암피실린 저항성 유전자를 카나마이신 저항성 유전자로 치환하기 위하여, 상기 pHNC15 벡터에 제한효소 FspI를 처리하여 절단하고, pUC4K 벡터(GE Healthcare Life Sciences, 미국)를 pstI으로 처리한 후, Fill-in 하고, pHNC15 벡터와 중합시켜 카나마이신 저항성 유전자가 삽입된 pHNC15K 벡터를 제작하였다. 상기 pHNC15K 벡터의 pHCE 프로모터를 pTac으로 치환하기 위하여, 상기 pHNC15K 벡터에 NheI을 처리하고 filling in 한 후, EcoRI을 처리하였다. 이 때 생성된 단편은 상기 pHNC15K에서 pHCE부분이 제거된 단편이다. tac 프로모터 단편을 얻기 위하여, pKK223-3 (Pharmacia Biotech)를 sphI으로 처리하고 filling in 한 후 EcoRI을 처리하여 생성된 tac 프로모터를 포함하는 단편과 상기 pHNC15K에서 pHCE부분이 제거된 단편을 라이게이션하여 pTac15K 벡터를 제조하였다.

aroG(D146G) 유전자 함유 단편을 수득하기 위하여, pTyr-a(Metabolic engineering of Escherichia coli using synthetic small regulatory RNAs, Na D et. al.,Nat Biotechnol., 31(2):170, 2013)를 주형으로 하고, 서열번호 5 및 6의 프라이머를 이용하여, PCR을 수행하였다.

서열번호 5: 5'- CGCGGAATTCATGAATTATCAGAACGACGA-3'

서열번호 6: 5'- TATTCTGCAGTTACCCGCGACGCGCTTTTA-3'

PCR을 통하여 수득된 aroG(D146G) 절편 및 pTac15K 플라스미드에 제한효소 (EcoRI과 PstI)를 처리한 후, T4 DNA ligase를 처리하여, 제한효소로 절단된 aroG(D146G)절편 및 pTac15K 플라스미드를 중합시킴으로써, 재조합 플라스미드 벡터 pTac15K-AroG(D146G)를 제작하였다.

1-2:플라스미드 pTac15K-AroF(N8K)의 제작

항시적, 생합성적 E. coli W3110(ATCC 39936) (derived from E. coli K-12, λ-, F-, prototrophic)의 DAHP 합성효소(3-deoxy-D-arabinoheptulosonate-7-phosphate synthetase)를 코딩하는 유전자 aroF의 피드백 저해가 해제된 돌연변이 aroF(N8K) 유전자(서열번호 2)를 strong 프로모터인 tac 프로모터에 의해 삽입되는 유전자를 발현하는 벡터인 pTac15K(p15A origin, low copies, KmR; KAISTMBELstock) 벡터에 클로닝하였다.

aroF의 피드백 저해가 해제된 돌연변이 aroF(N8K) 유전자 함유 단편을 수득하기 위하여, W3110의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 7 및 9의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 overlap PCR을 수행하기 위한 하나의 단편을 수득하고, 서열번호 8와 10의 프라이머를 이용하여 overlap PCR을 수행하기 위한 다른 하나의 단편을 수득하였다. 최종적으로 수득한 단편들을 주형으로 서열번호 7 및 8의 프라이머를 이용하여 overlap PCR을 수행하였다.

서열번호 7: 5'- CGCGGAATTCATGCAAAAAGACGCGCTGAA-3'

서열번호 8: 5'- TATTGGTACCTTAAGCCACGCGAGCCGTCA-3'

서열번호 9: 5'- GCAGGGCTATAGTTCGGCGCTTTACCACCG-3'

서열번호 10: 5'- CGGTGGTAAAGCGCCGAACTATAGCCCTGC-3'

PCR을 통하여 수득된 aroF(N8K) 절편 및 pTac15K 플라스미드에 제한효소 (EcoRI과 KpnI)를 처리한 후, T4 DNA ligase를 처리하여, 제한효소로 절단된 aroF(N8K) 절편 및 pTac15K 플라스미드를 중합시킴으로써, 재조합 플라스미드 벡터 pTac15K-aroF(N8K) 를 제작하였다.

1-3:플라스미드 pTac15K-AroG(D146G)TyrA(A354V/M53I)의 제작

E. coli W3110(ATCC 39936) (derived from E. coli K-12, λ-, F-, prototrophic)의 코리스메이트 뮤테이즈/ 프리페네이트 디하이드로게나이제 (chorismate mutase / prephenate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자인 tyrA의 의 피드백 저해가 해제된 돌연변이 tyrA(A354V/M53I)를 상기 1-1에서 제조된 pTac15K-AroG(D146G)에 클로닝하였다. 제조된 재조합 벡터에서 유전자의 발현은 tyrA(A354V/M53I)(서열번호 3) 유전자 앞의 RBS(ribosome binding site)에 의해 aroG(D146G) 유전자 앞에 있는 tac promoter의 영향을 받는다.

pTyr-a(Metabolic engineering of Escherichia coli using synthetic small regulatory RNAs, Na D et. al.,Nat Biotechnol., 31(2):170, 2013)를 주형으로 하고, 합성된 서열번호 11 및 12의 프라이머를 이용하여, PCR을 수행하여, tyrA(A354V/M53I) 단편을 제조하였다.

서열번호 11: 5'- CTGCAGTTCACACAGGAAACAATGGTTGCTGAATTGACCGCATTAC-3'

서열번호 12: 5'- AAGCTTTTACTGGCGATTGTCATTCG-3'

상기 제조된 tyrA(A354V/M53I) 단편 및 pTac15K-AroG(D146G) 플라스미드에 제한효소 (PstI과 HindIII)를 처리한 후, T4 DNA ligase를 처리하여, 제한효소로 절단된 tyrA(A354V/M53I) 절편 및 pTac15K-AroG(D146G) 플라스미드를 중합시켜, 재조합 플라스미드 벡터 pTac15K-AroG(D146G)TyrA(A354V/M53I)를 제작하였다.

1-4:플라스미드 pTrc99A-FldH 의 제작

항시적, 생합성적 Clostridium botulinum ATCC 3502의 젖산디하이드로게나이제(lactate-dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 fldH(서열번호 4)를 trc 프로모터에 의하여 유전자를 강하게 발현시키는 벡터인 pTrc99a (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) 벡터에 클로닝하였다. 바이오니아를 통해 합성된 DNA를 주형으로 하고, 합성된 서열번호 13과 14의 프라이머를 이용하여, PCR을 수행함으로써, fldH 절편을 제조하였다.

서열번호 13: 5'- GGATCCATGAAAATCCTGGCGTATTGCGTGC-3'

서열번호 14: 5'- AAGCTT TTATTTACAAACGCGCTGGTTTTT-3'

다음으로 제조된 fldH 절편 및 pTrc99A 플라스미드에 제한효소 (BamHI)과 HindIII)를 처리한 후, T4 DNA ligase를 처리하여, 제한효소로 절단된 fldH 절편 및 pTrc99A 플라스미드를 중합시킴으로써, 재조합 플라스미드인 벡터 pTrc99A-FldH를 제작하였다.

1-5:4-하이드록시페닐젖산 생산을 위한 변이 미생물의 제조

상기 제작된 pTrc99A-FldH 벡터를 숙주 미생물 대장균 BL21(DE3)에 형질전환하여 변이 미생물을 제조하고, pTac15K-AroF(N8K)와 pTrc99A-FldH 벡터를 숙주 미생물 대장균 BL21(DE3)에 형질전환하여 변이 미생물을 제조하였다.

제조된 변이미생물을 암피실린 혹은 카나마이신이 각각 50㎍/㎖ 및 30㎍/㎖ 첨가된 LB 평판배지에서 선별하였다. 상기 형질전환 균주를 10㎖ LB 배지에 접종하여 37℃에서 12시간동안 전배양을 수행하였다. 그 후, 멸균 후 80℃ 이상에서 꺼낸 100㎖ MR 배지(1L 당 Glucose 10g, KH₂PO₄ 6.67 g, (NH₄)2HPO₄ 4 g, MgSO₄·7H₂O 0.8 g, citric acid 0.8 g 및 trace metal solution 5 mL; Trace metal solution의 조성:1 L 당 5M HCl 5 mL, FeSO₄·7H₂O 10 g, CaCl₂ 2 g, ZnSO₄·7H₂O 2.2 g, MnSO₄·4H₂O 0.5 g, CuSO₄·5H₂O 1 g, (NH₄)6Mo7O₂·4H₂O 0.1 g, 및 Na₂B₄O₂·10H₂O 0.02 g)를 함유한 250㎖ 플라스크에 글루코오스(20g/L)를 첨가하고 상기 전배양액 1㎖을 접종하여, 37℃에서 24시간 배양하였다.

Strain	4-하이드록시페닐젖산 (mg/L)
BL21(DE3)	ND¹
BL21(DE3)/pTrc99A-FldH	ND¹
BL21(DE3)/pTac15k-AroF(N8K)+pTrc99A-FldH	454

*ND : No Detection (검출되지 않음)

그 결과, 표 1에 나타난 바와 같이, 야생형 대장균 BL21(DE3) 및 pTrc99A-FldH가 형질전환된 균주에서는 4-하이드록시페닐젖산이 생성되지 않았고, 개량된 균주에서는 4-하이드록시페닐젖산이 생산됨이 확인되었다.

1-6:DAHP 합성효소(3-deoxy-D-arabinoheptulosonate-7-phosphate synthetase)의 선별을 위한 4-하이드록시페닐젖산 생산능 비교

상기 제작된 pTac15K-AroG(D146G)와 pTrc99A-FldH 벡터를 숙주 미생물 대장균 BL21(DE3)에 형질전환하여 변이 미생물을 제조하였다.

실시예 1-5에서 제조된 변이미생물 및 상기 변이 미생물을 암피실린 및 카나마이신이 각각 50㎍/㎖ 및 30㎍/㎖ 첨가된 LB 평판배지에서 선별하였다. 상기 형질전환 균주를 10㎖ LB 배지에 접종하여 37℃에서 12시간동안 전배양을 수행하였다. 그 후, 멸균 후 80℃ 이상에서 꺼낸 100㎖ MR 배지(1L 당 Glucose 10g, KH₂PO₄ 6.67 g, (NH₄)2HPO₄ 4 g, MgSO₄·7H₂O 0.8 g, citric acid 0.8 g 및 trace metal solution 5 mL; Trace metal solution의 조성:1 L 당 5M HCl 5 mL, FeSO₄·7H₂O 10 g, CaCl₂ 2 g, ZnSO₄·7H₂O 2.2 g, MnSO₄·4H₂O 0.5 g, CuSO₄·5H₂O 1 g, (NH₄)6Mo7O₂·4H₂O 0.1 g, 및 Na₂B₄O₂·10H₂O 0.02 g)를 함유한 250㎖ 플라스크에 글루코오스(20g/L)를 첨가하고 상기 전배양액 1㎖을 접종하여, 37℃에서 24시간 배양하였다.

그 결과, 도 6과 같이 pTac15K-AroF(N8K)와 pTrc99A-FldH 벡터를 숙주 미생물 대장균 BL21(DE3)에 형질전환하여 제조한 균주의 경우 0.454 g/L의 4-하이드록시페닐젖산 및 0.427 g/L의 페닐젖산을, pTac15K-AroG(D146G)와 pTrc99A-FldH 벡터를 숙주 미생물 대장균 BL21(DE3)에 형질전환하여 제조한 균주의 경우 0.64 g/L의 4-하이드록시페닐젖산 및 0.391 g/L의 페닐젖산이 생성되는 것을 화인하였다.

1-7: tyrR 유전자의 결실

BL21(DE3)에서 서열번호 15 및 16의 프라이머를 이용한 one step inactivation 방법(Warner et al., PNAS, 6;97(12):6640-6645, 2000) 및 이를 응용한 방법(Lee et al., Mol. Syst. Biol. 3:149, 2007)을 이용하여, Tyrosine DNA-binding transcriptional repressor를 암호화하는 tyrR 유전자를 결실시키고, 항생제 내성을 제거하였다.

서열번호 15: 5'- ATAGTGTCATATCATCATATTAATTGTTCTTTTTTCAGGTGAAGGTTCCCTAGGTGACACTATAGAACGCG-3'

서열번호 16: 5'-CGGCTGGTGATTTCGTCCAGCGAACCTTCCATCGCATCTTCGCCCACGGCTAGTGGATCTGATGGGTACC-3'

1-8:4-하이드록시페닐젖산 고효율 생산을 위한 변이 미생물의 제조

상기 제작된 pTac15K-AroG(D146G)TyrA(A354V/M53I)와 pTrc99A-FldH 벡터를 실시예 1-7에서 제작된 숙주 미생물 대장균 BL21(DE3) 및 BL21(DE3)ΔtyrR에 형질전환하여 변이 미생물을 제조하였다.

제조된 변이미생물을 암피실린 및 카나마이신이 각각 50㎍/㎖ 및 30㎍/㎖ 첨가된 LB 평판배지에서 선별하였다. 상기 형질전환 균주를 10㎖ LB 배지에 접종하여 37℃에서 12시간동안 전배양을 수행하였다. 그 후, 멸균 후 80℃ 이상에서 꺼낸 100㎖ MR 배지(1L 당 Glucose 10g, KH₂PO₄ 6.67 g, (NH₄)2HPO₄ 4 g, MgSO₄·7H₂O 0.8 g, citric acid 0.8 g 및 trace metal solution 5 mL; Trace metal solution의 조성:1 L 당 5M HCl 5 mL, FeSO₄·7H₂O 10 g, CaCl₂ 2 g, ZnSO₄·7H₂O 2.2 g, MnSO₄·4H₂O 0.5 g, CuSO₄·5H₂O 1 g, (NH₄)6Mo7O₂·4H₂O 0.1 g, 및 Na₂B₄O₂·10H₂O 0.02 g)를 함유한 250㎖ 플라스크에 글루코오스(20g/L)를 첨가하고 상기 전배양액 1㎖을 접종하여, 37℃에서 24시간 배양하였다.

그 결과 도 7과 같이, pTac15K-AroG(D146G)TyrA(A354V/M53I)와 pTrc99A-FldH를 BL21(DE3)에 형질전환한 균주의 경우 1.43 g/L의 4-하이드록시페닐젖산이 생성되는 것을, BL21(DE3)ΔtyrR에 형질전환한 균주의 경우 1.66 g/L(대당수율 0.117g/g)의 4-하이드록시페닐젖산이 생성되는 것을 확인하였다. 대당수율은 4-하이드록시페닐 젖산의 생성량(g)/글루코오스 첨가량(g/)으로 산출하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Preparing Method of 4-hydroxyphenyllactic Acid Using Variant Microorganism <130> P15-B124 <160> 16 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1053 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aroG(D146G) <400> 1 atgaattatc agaacgacga tttacgcatc aaagaaatca aagagttact tcctcctgtc 60 gcattgctgg aaaaattccc cgctactgaa aatgccgcga atacggttgc ccatgcccga 120 aaagcgatcc ataagatcct gaaaggtaat gatgatcgcc tgttggttgt gattggccca 180 tgctcaattc atgatcctgt cgcggcaaaa gagtatgcca ctcgcttgct ggcgctgcgt 240 gaagagctga aagatgagct ggaaatcgta atgcgcgtct attttgaaaa gccgcgtacc 300 acggtgggct ggaaagggct gattaacgat ccgcatatgg ataatagctt ccagatcaac 360 gacggtctgc gtatagcccg taaattgctg cttgatatta acgacagcgg tctgccagcg 420 gcaggtgagt ttctcaatat gatcacccca caatatctcg ctgacctgat gagctggggc 480 gcaattggcg cacgtaccac cgaatcgcag gtgcaccgcg aactggcatc agggctttct 540 tgtccggtcg gcttcaaaaa tggcaccgac ggtacgatta aagtggctat cgatgccatt 600 aatgccgccg gtgcgccgca ctgcttcctg tccgtaacga aatgggggca ttcggcgatt 660 gtgaatacca gcggtaacgg cgattgccat atcattctgc gcggcggtaa agagcctaac 720 tacagcgcga agcacgttgc tgaagtgaaa gaagggctga acaaagcagg cctgccagca 780 caggtgatga tcgatttcag ccatgctaac tcgtccaaac aattcaaaaa gcagatggat 840 gtttgtgctg acgtttgcca gcagattgcc ggtggcgaaa aggccattat tggcgtgatg 900 gtggaaagcc atctggtgga aggcaatcag agcctcgaga gcggggagcc gctggcctac 960 ggtaagagca tcaccgatgc ctgcatcggc tgggaagata ccgatgctct gttacgtcaa 1020 ctggcgaatg cagtaaaagc gcgtcgcggg taa 1053 <210> 2 <211> 1071 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aroF(N8K) <400> 2 atgcaaaaag acgcgctgaa taaagtacat attaccgacg aacaggtttt aatgactccg 60 gaacaactga aggccgcttt tccattgagc ctgcaacaag aagcccagat tgctgactcg 120 cgtaaaagca tttcagatat tatcgccggg cgcgatcctc gtctgctggt agtatgtggt 180 ccttgttcca ttcatgatcc ggaaactgct ctggaatatg ctcgtcgatt taaagccctt 240 gccgcagagg tcagcgatag cctctatctg gtaatgcgcg tctattttga aaaaccccgt 300 accactgtcg gctggaaagg gttaattaac gatccccata tggatggctc ttttgatgta 360 gaagccgggc tgcagatcgc gcgtaaattg ctgcttgagc tggtgaatat gggactgcca 420 ctggcgacgg aagcgttaga tccgaatagc ccgcaatacc tgggcgatct gtttagctgg 480 tcagcaattg gtgctcgtac aacggaatcg caaactcacc gtgaaatggc ctccgggctt 540 tccatgccgg ttggttttaa aaacggcacc gacggcagtc tggcaacagc aattaacgct 600 atgcgcgccg ccgcccagcc gcaccgtttt gttggcatta accaggcagg gcaggttgcg 660 ttgctacaaa ctcaggggaa tccggacggc catgtgatcc tgcgcggtgg taaagcgccg 720 aactatagcc ctgcggatgt tgcgcaatgt gaaaaagaga tggaacaggc gggactgcgc 780 ccgtctctga tggtagattg cagccacggt aattccaata aagattatcg ccgtcagcct 840 gcggtggcag aatccgtggt tgctcaaatc aaagatggca atcgctcaat tattggtctg 900 atgatcgaaa gtaatatcca cgagggcaat cagtcttccg agcaaccgcg cagtgaaatg 960 aaatacggtg tatccgtaac cgatgcctgc attagctggg aaatgaccga tgccttgctg 1020 cgtgaaattc atcaggatct gaacgggcag ctgacggctc gcgtggctta a 1071 <210> 3 <211> 1122 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tyrA(A354V/M53I) <400> 3 atggttgctg aattgaccgc attacgcgat caaattgatg aagtcgataa agcgctgctg 60 aatttattag cgaagcgtct ggaactggtt gctgaagtgg gcgaggtgaa aagccgcttt 120 ggactgccta tttatgttcc ggagcgcgag gcatctattt tggcctcgcg tcgtgcagag 180 gcggaagctc tgggtgtacc gccagatctg attgaggatg ttttgcgtcg ggtgatgcgt 240 gaatcttact ccagtgaaaa cgacaaagga tttaaaacac tttgtccgtc actgcgtccg 300 gtggttatcg tcggcggtgg cggtcagatg ggacgcctgt tcgagaagat gctgaccctc 360 tcgggttatc aggtgcggat tctggagcaa catgactggg atcgagcggc tgatattgtt 420 gccgatgccg gaatggtgat tgttagtgtg ccaatccacg ttactgagca agttattggc 480 aaattaccgc ctttaccgaa agattgtatt ctggtcgatc tggcatcagt gaaaaatggg 540 ccattacagg ccatgctggt ggcgcatgat ggtccggtgc tggggctaca cccgatgttc 600 ggtccggaca gcggtagcct ggcaaagcaa gttgtggtct ggtgtgatgg acgtaaaccg 660 gaagcatacc aatggtttct ggagcaaatt caggtctggg gcgctcggct gcatcgtatt 720 agcgccgtcg agcacgatca gaatatggcg tttattcagg cactgcgcca ctttgctact 780 tttgcttacg ggctgcacct ggcagaagaa aatgttcagc ttgagcaact tctggcgctc 840 tcttcgccga tttaccgcct tgagctggcg atggtcgggc gactgtttgc tcaggatccg 900 cagctttatg ccgacatcat tatgtcgtca gagcgtaatc tggcgttaat caaacgttac 960 tataagcgtt tcggcgaggc gattgagttg ctggagcagg gcgataagca ggcgtttatt 1020 gacagtttcc gcaaggtgga gcactggttc ggcgattacg tgcagcgttt tcagagtgaa 1080 agccgcgtgt tattgcgtca ggcgaatgac aatcgccagt aa 1122 <210> 4 <211> 996 <212> DNA <213> fldH of Clostridium botulinum <400> 4 atgaaaatcc tggcgtattg cgtgcgtccg gatgaagttg atagtttcaa aaaattcagc 60 gaaaaatacg gtcataccgt ggatctgatt ccggatagtt ttggcccgaa cgttgcgcac 120 ctggccaaag gctatgatgg tattagcatc ctgggtaacg atacctgcaa tcgtgaagcc 180 ctggaaaaaa tcaaagattg tggtatcaaa tacctggcaa cccgcacggc gggcgtgaac 240 aatatcgatt ttgatgcggc caaagaattt ggtattaacg tggccaatgt tccggcatat 300 agcccgaata gcgtgtctga atttaccatc ggcctggccc tgtctctgac gcgtaaaatt 360 ccgtttgcac tgaaacgcgt tgaactgaac aatttcgcgc tgggcggtct gatcggtgtg 420 gaactgcgta acctgaccct gggcgttatt ggcacgggtc gcatcggtct gaaagtgatt 480 gaaggcttta gcggcttcgg tatgaagaaa atgatcggtt acgatatctt tgaaaacgaa 540 gaagcgaaaa aatacatcga atacaaatct ctggatgaag tgttcaaaga agcagatatt 600 atcaccctgc atgcgccgct gacggatgat aactaccaca tgatcggcaa agaaagcatc 660 gccaaaatga aagatggtgt tttcatcatc aacgcagcgc gtggcgcgct gatcgattct 720 gaagccctga ttgaaggcct gaaaagtggt aaaattgcag gcgccgcact ggatagctat 780 gaatacgaac agggcgtgtt ccataacaac aaaatgaacg aaatcatgca ggatgatacc 840 ctggaacgtc tgaaatcttt tccgaatgtg gttattaccc cgcacctggg tttctatacg 900 gatgaagccg tgagtaacat ggttgaaatt accctgatga atctgcaaga atttgaactg 960 aaaggcacgt gcaaaaacca gcgcgtttgt aaataa 996 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 cgcggaattc atgaattatc agaacgacga 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 tattctgcag ttacccgcga cgcgctttta 30 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 cgcggaattc atgcaaaaag acgcgctgaa 30 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 tattggtacc ttaagccacg cgagccgtca 30 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 gcagggctat agttcggcgc tttaccaccg 30 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 cggtggtaaa gcgccgaact atagccctgc 30 <210> 11 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 ctgcagttca cacaggaaac aatggttgct gaattgaccg cattac 46 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 aagcttttac tggcgattgt cattcg 26 <210> 13 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 ggatccatga aaatcctggc gtattgcgtg c 31 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 aagcttttat ttacaaacgc gctggttttt 30 <210> 15 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 atagtgtcat atcatcatat taattgttct tttttcaggt gaaggttccc taggtgacac 60 tatagaacgc g 71 <210> 16 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 cggctggtga tttcgtccag cgaaccttcc atcgcatctt cgcccacggc tagtggatct 60 gatgggtacc 70

Claims

해당과정(glycolysis) 또는 펜토스포스페이트 경로를 가지는 대장균에, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열을 가지는 DAHP 합성효소(3-deoxy-D-arabinoheptulosonate-7-phosphate synthetase)를 코딩하는 유전자와 서열번호 3의 염기서열을 가지는 코리스메이트 뮤테이즈/프리페네이트 디하이드로게나이제 (chorismate mutase / prephenate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자가 도입 또는 증폭되어 있고, 서열번호 4의 염기서열을 가지는 클로스트리듐 보툴리늄 유래 fldH 유전자가 도입되어 있고, 타이로신 DNA-결합 전사 억제인자를 코딩하는 유전자가 추가적으로 결실되어 있는 4-하이드록시페닐젖산 생성능을 가지는 변이 대장균.
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다음 단계를 포함하는 4-하이드록시페닐젖산의 제조방법:
(a) 제1항의 변이 대장균을 글루코오스 함유 배지에서 배양하여, 4-하이드록시페닐젖산을 생성시키는 단계; 및
(b) 상기 생성된 4-하이드록시페닐 젖산을 회수하는 단계.
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