KR101813406B1

KR101813406B1 - Composition for preventing, improving or treating obesity comprising methyl benzoate derivative

Info

Publication number: KR101813406B1
Application number: KR1020160144230A
Authority: KR
Inventors: 곽종환; 표석능; 정윤주
Original assignee: 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2016-11-01
Filing date: 2016-11-01
Publication date: 2017-12-29

Abstract

According to the present invention, compounds which are contained as effective components and represented by chemical formula 1 (methylbenzoate derivatives) show the effects of efficiently preventing, alleviating, or treating obesity, and in particular, obesity caused by macrophage-mediated inflammation in adipocytes while ameliorating various adverse side effects of pre-existing therapeutic agents for obesity, and thus the compounds may be beneficially used in pharmaceutical compositions or food compositions for the above purposes. Specifically, the methylbenzoate derivatives according to the present invention exhibit the effects of suppressing expressions of TNF-, IL-6, IL-1, MCP-1, and Rantes in lipopolysaccharide (LPS)-induced macrophages and in adipocytes treated with the macrophages.

Description

[0001] The present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing, ameliorating or treating obesity comprising a methylbenzoate derivative,

본 발명은 메틸 벤조에이트 유도체를 유효성분으로 포함하는 비만 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing, ameliorating or treating obesity comprising a methylbenzoate derivative as an active ingredient.

최근 경제발전에 따른 생활수준의 향상으로 인하여 식습관이 점차 서구화되고 있는데, 구체적으로 인스턴트 음식물을 자주 접하게 되고, 육식위주로 생활양식이 변화되는 등, 과다한 열량의 섭취가 유발되도록 식생활이 변화한 것이다. 게다가 현대인들은 이러한 식생활에도 불구하고 운동량은 턱없이 부족하기 때문에, 빠르게 비만 문제가 확산되었다.Recently, the eating habits have been gradually westernized due to the improvement of living standards due to the economic development. The eating habits have changed in order to induce excessive calorie consumption, for example, the instant food is frequently encountered and the lifestyle is changed mainly by the meat. In addition, modern people, despite this diet, lack of exercise in a short time, the problem quickly spread to obesity.

비만은 암, 뇌혈관질환, 심장질환 등 각종 성인병을 비롯하여 유방암, 자궁암 및 대장암 등을 야기하기 때문에, 현재 비만을 치명적인 질병 중 하나로 여기고 있다.Obesity is now considered to be one of the deadly diseases because it causes various adult diseases such as cancer, cerebrovascular disease, heart disease, and breast cancer, uterine cancer and colon cancer.

이에 지방 증가에 의한 비만을 해결하기 위하여, 다양한 치료방안들이 개발되어 왔는데, 일예로 식사 제한, 운동 및 마사지 등과 같은 외적 자극 방법이 시도되고 있고, 항비만 식품 및 비만 분해 약제들을 섭취하는 방법 등 각종 방법에 의해 비만을 개선, 예방 또는 치료하려는 노력들이 시도되고 있다.In order to solve the obesity caused by fat increase, various treatment methods have been developed. For example, extreme stimulation methods such as diet restriction, exercise and massage have been tried, and various methods such as an anti-obesity food, Efforts to improve, prevent or treat obesity by methods have been attempted.

이들 중에서 비만을 치료하기 위한 치료제로, 중추 신경계에 작용하여 식욕에 영향을 주는 약제와 위장관에 작용하여 흡수를 저해하는 약물이 개발되었으나, 이 역시 원발성 폐고혈압이나 심장 판막병변과 같은 부작용을 일으키기도 하기 때문에, 심부전, 심장질환 등의 환자에는 사용하지 못한다는 문제점이 존재한다.Among them, a therapeutic agent for treating obesity has been developed that acts on the central nervous system and affects the appetite and acts on the gastrointestinal tract to inhibit absorption, but it also causes side effects such as primary pulmonary hypertension or heart valve lesion Therefore, there is a problem that it can not be used for patients suffering from heart failure or heart disease.

따라서 비만을 위한 치료약의 부작용(약물에 의한 원발성 폐고혈압, 심장 판막병변, 구토 및 복통 등, 근육 단백질의 소실에 의한 요요현상)을 해결하면서도, 동시에 체지방의 감소효과가 우수한 새로운 제형의 비만 예방, 개선 또는 치료를 위한 제품들의 개발이 시급한 실정이다.Thus, while solving the side effects of therapeutic drugs for obesity (primary pulmonary hypertension due to drugs, heart valve lesions, vomiting and abdominal pain, loss of muscle protein), at the same time, It is urgent to develop products for improvement or treatment.

특허문헌 1. 대한민국 등록특허 10-1601843Patent Document 1. Korean Patent Registration No. 10-1601843

본 발명은 상기와 같은 문제점을 감안하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 메틸 벤조에이트 유도체를 이용한 비만 예방 또는 치료용 약학 조성물과 이를 이용하여 비만을 예방 또는 개선할 수 있는 건강기능식품 조성물을 제공하고자 하는 것이다.The present invention has been made in view of the above-mentioned problems, and an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating obesity using methylbenzoate derivatives and a health functional food composition capable of preventing or improving obesity using the composition I would like to.

본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, 하기 화학식 1의 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating obesity, which comprises a compound of the following formula 1 and a pharmaceutically acceptable salt thereof:

[화학식 1][Chemical Formula 1]

상기 화합물은 대식세포(Raw 264.7)와 지방세포(3T3-L1)에서 LPS(리포다당류)에 유도된 염증유발 사이토카인 TNF-α, IL-6, IL-1β, MCP-1, Rantes 발현을 억제시키는 것일 수 있다.These compounds inhibit the expression of inflammatory cytokines TNF-α, IL-6, IL-1β, MCP-1 and Rantes induced in LPS (lipopolysaccharide) in macrophages (Raw 264.7) and adipocytes (3T3-L1) It can be done.

상기 화합물은 대식세포(Raw 264.7)의 PI3k/Akt 신호 전달 경로는 억제하고, AMPK/SIRT1 신호 전달 기전을 활성화하여, p65의 활성을 억제함으로써, 지방세포의 염증을 억제시켜 비만을 예방 또는 치료하는 것일 수 있다.The compound inhibits the PI3k / Akt signaling pathway of macrophages (Raw 264.7), activates the AMPK / SIRT1 signaling pathway, inhibits the activity of p65, thereby preventing or treating obesity by inhibiting inflammation of adipocytes Lt; / RTI >

상기 비만은 대식세포 매개 지방세포의 염증에 의한 것일 수 있다.The obesity may be due to inflammation of macrophage-mediated adipocytes.

상기 비만 예방 또는 치료용 약학 조성물은 경구투여용일 수 있다.The pharmaceutical composition for preventing or treating obesity may be for oral administration.

본 발명의 다른 목적을 이루기 위하여, 하기 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.Another object of the present invention is to provide a food composition for preventing or improving obesity, which comprises a compound of formula (1) as an active ingredient.

[화학식 1][Chemical Formula 1]

본 발명에 따르면, 유효성분으로 포함되는 화학식 1로 표시되는 화합물(메틸 벤조에이트 유도체)은 기존의 비만 치료제가 가지고 있던 다양한 부작용 문제를 해결하면서, 비만 특히 대식세포 매개 지방세포의 염증에 의한 비만을 효율적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 효과를 나타내기 때문에, 이를 위한 약학 조성물 또는 식품 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.According to the present invention, the compound represented by Chemical Formula (1) (methylbenzoate derivative), which is included as an active ingredient, can solve the various side effects problems of existing obesity treatment drugs and can prevent obesity, particularly obesity caused by inflammation of macrophage- Can be effectively used as a pharmaceutical composition or food composition for preventing, improving or treating the disease.

구체적으로 본 발명에 따른 메틸 벤조에이트 유도체는 리포다당류(LPS)로 유도된 대식세포와 상기 대식세포로 처리한 지방세포로부터 TNF-α, IL-6, IL-1β, MCP-1, Rantes의 발현이 억제되는 효능을 나타낸다.Specifically, the methylbenzoate derivatives according to the present invention can be used for the expression of TNF-α, IL-6, IL-1β, MCP-1 and Rantes from lipopolysaccharide (LPS) -mediated macrophages and adipocyte- &Lt; / RTI >

이러한 효능을 통해 본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약학 조성물은 비만 특히 대식세포 매개의 지방세포 염증에 의해 유도된 비만을 예방하고 개선하며, 치료하는데 현저한 효과를 나타낸다.The pharmaceutical composition for preventing or treating obesity, which comprises the compound represented by the formula (1) of the present invention as an active ingredient through such an effect, is useful for preventing, ameliorating and treating obesity induced by obesity, especially macrophage-mediated adipocyte inflammation Effect.

도 1은 본 발명의 실시예 1로부터 제조된 화학식 1로 표시되는 화합물의 농도(0, 0.1, 1, 10, 50, 100 ㎍/㎖)에 따라, Raw 264.7 세포의 세포 증식율을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 Raw 264.7 세포에서 화학식 1의 화합물(실시예 1)을 농도별로 처리하였을 때의 TNF-α(a), IL-6(b) 및 IL-1β(c)의 발현을 나타낸 결과이다.
도 3은 Raw 264.7 세포에서 화학식 1의 화합물(실시예 1)을 농도별로 처리하였을 때의 TNF-α(a), IL-6(b) 및 IL-1β(c)의 mRNA 발현을 나타낸 결과 그래프이다.
도 4는 Raw 264.7 세포에서 화학식 1의 화합물(실시예 1)을 농도별로 처리하였을 때의 MCP-1(a), Rantes(b)의 mRNA 발현을 나타낸 결과 그래프이다.
도 5는 본 발명의 실시예 1의 화합물(화학식 1) 농도에 따라, Raw 264.7 세포에서 PI3k, β-actin, p-Akt, Akt 발현 수준을 분석하여 나타낸 웨스턴 블롯 사진이고, 하단의 그래프는 PI3K/β-actin 과 p-Akt/Akt의 발현 수준을 수치적으로 비교 분석하여 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 실시예 1의 화합물(화학식 1) 농도에 따라, Raw 264.7 세포에서 p-AMPK, AMPK, SIRT1, β-Actin 발현 수준을 분석하여 나타낸 웨스턴 블롯 사진이고, 하단의 그래프는 p-AMPK/AMPK과 SIRT1/β-Actin의 발현 수준을 수치적으로 비교 분석하여 나타낸 것이다.
도 7은 화학식 1의 화합물을 처리하지 않고 LPS만 처리한 Raw 264.7 세포에서 Iκb-α, β-Actin 발현 수준(사진 상단 'LPS(1㎍/㎖)' 표시)과 본 발명의 실시예 1의 화합물(화학식 1)과 LPS 처리한 Raw 264.7 세포에서 Iκb-α, β-Actin 발현 수준(사진 상단 'compound1+LPS' 표시)을 분석하여 나타낸 웨스턴 블롯 사진이고, 하단의 그래프는 Iκb-α/β-Actin의 발현 수준을 수치적으로 비교 분석하여 나타낸 것이다.
도 8은 p65의 핵이동(nuclear translocation) 및 p65의 활성을 확인하고자, 본 발명의 실시예 1의 화합물(화학식 1)과 LPS 처리한 Raw 264.7 세포의 각 부위에서 p65의 발현수준을 분석하여 나타낸 웨스턴 블롯 사진이고, 하단의 그래프는 핵 내 p-65/lamin A의 발현 수준과 전체 세포에서 p-p65/p65의 발현 수준을 수치적으로 비교 분석하여 나타낸 것이다.
도 9는 화학식 1의 화합물(실시예 1)을 농도별로 처리한 세포조정배지로 배양된 3T3-L1 세포에서 TNF-α(a), IL-6(b) 및 IL-1β(c)의 mRNA 발현을 나타낸 결과 그래프이다.
도 10은 화학식 1의 화합물(실시예 1)을 농도별로 처리한 세포조정배지로 배양된 3T3-L1 세포에서 MCP-1(a), Rantes(b) 및 Adioponectin(c)의 mRNA 발현을 나타낸 결과 그래프이다.
도 11은 화학식 1의 화합물(실시예 1)을 농도별로 처리한 세포조정배지로 배양된 3T3-L1 세포에서 p38, ERK, JNK의 발현수준을 분석하여 나타낸 웨스턴 블롯 사진이고, 측면의 그래프는 p-p38/p38, p-Erk/Erk, p-JNK/JNK의 발현 수준을 수치적으로 비교 분석하여 나타낸 것이다.
도 12는 화학식 1의 화합물(실시예 1)을 농도별로 처리한 세포조정배지로 배양된 3T3-L1 세포에서 p65의 발현수준을 분석하여 나타낸 웨스턴 블롯 사진이고, 하단의 그래프는 p-p65/p65의 발현 수준을 수치적으로 비교 분석하여 나타낸 것이다.1 is a graph showing the cell proliferation rate of Raw 264.7 cells according to the concentration (0, 0.1, 1, 10, 50, 100 쨉 g / ml) of the compound represented by Chemical Formula 1 prepared in Example 1 of the present invention to be.
FIG. 2 shows the results of expression of TNF-α (a), IL-6 (b) and IL-1β (c) when Raw 264.7 cells were treated with the compound of Formula 1 (Example 1)
FIG. 3 shows mRNA expression of TNF-α (a), IL-6 (b), and IL-1β (c) when Raw 264.7 cells were treated with the compound of formula 1 (Example 1) to be.
FIG. 4 is a graph showing mRNA expression of MCP-1 (a) and Rantes (b) when Raw 264.7 cells were treated with the compound of Formula 1 (Example 1) by concentration.
FIG. 5 is a Western blot photograph showing the expression level of PI3k,? -Actin, p-Akt and Akt in Raw 264.7 cells according to the concentration of the compound (Formula 1) of Example 1 of the present invention, / β-actin and p-Akt / Akt in the culture medium.
FIG. 6 is a Western blot photograph showing the expression levels of p-AMPK, AMPK, SIRT1, and β-Actin in Raw 264.7 cells according to the concentration of the compound (Formula 1) of Example 1 of the present invention, -AMPK / AMPK and SIRT1 / [beta] -Actin, respectively, by numerical comparison.
FIG. 7 shows the expression level of Iκb-α, β-Actin (shown in the upper part 'LPS (1 μg / ml)' in Raw 264.7 cells treated with LPS only without treating the compound of formula 1) Western blot analysis of the expression levels of Iκb-α, β-Actin (expressed as 'compound 1 + LPS' at the top of the photograph) in the Raw 264.7 cells treated with the compound (Formula 1) and the Iκb-α / β -Actin expression level of the cells.
FIG. 8 shows the expression levels of p65 in the respective regions of the compound (Formula 1) of the present invention and Raw 264.7 cells treated with LPS in order to confirm the nuclear translocation of p65 and the activity of p65 Western blot photograph, and the graph at the bottom shows numerical comparative analysis of the expression level of p-65 / lamin A in the nucleus and the expression level of p-p65 / p65 in whole cells.
FIG. 9 is a graph showing the mRNAs of TNF-α (a), IL-6 (b) and IL-1β (c) in 3T3-L1 cells cultured with the cell- The results are shown graphically.
FIG. 10 shows mRNA expression of MCP-1 (a), Rantes (b) and Adioponectin (c) in 3T3-L1 cells cultured on a cell-conditioned medium treated with the compound of Formula 1 (Example 1) Graph.
FIG. 11 is a Western blot photograph showing the expression levels of p38, ERK and JNK in 3T3-L1 cells cultured on a cell-conditioned medium treated with the compound of formula (1) (Example 1) p38 / p38, p-Erk / Erk, p-JNK / JNK.
FIG. 12 is a Western blot photograph showing the expression level of p65 in 3T3-L1 cells cultured with a cell-regulated medium treated with the compound of formula (1) (Example 1) at a concentration, and the graph at the bottom shows p-p65 / p65 And the level of expression of these genes is shown by numerical comparison and analysis.

이하, 본 발명의 여러 측면 및 다양한 구현예에 대해 더욱 구체적으로 살펴보도록 한다.
Hereinafter, various aspects and various embodiments of the present invention will be described in more detail.

본 발명의 일 측면은, 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 비만 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.An aspect of the present invention relates to a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of obesity comprising a compound of the following general formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

[화학식 1][Chemical Formula 1]

본 발명의 비만을 예방 또는 치료할 수 있는 조성물은 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유한다.The composition for preventing or treating obesity according to the present invention contains the compound of formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.

본 발명의 메틸 벤조에이트 유도체는 비만을 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 물질로, 구체적으로 메틸 2-(4'-메톡시-4'-옥소부탄아미도)벤조에이트[methyl 2-(4′-methoxy-4′-oxobutanamido)benzoate]일 수 있다.The methylbenzoate derivative of the present invention is a substance capable of preventing, ameliorating or treating obesity, and more specifically, methyl 2- (4'-methoxy-4'-oxobutanamido) benzoate [methyl 2- methoxy-4'-oxobutanamido) benzoate].

즉, 상기 화합물은 대식세포 매개 지방세포의 염증에 의한 비만을 예방, 개선 또는 치료하는 것일 수 있다.That is, the compound may be to prevent, ameliorate, or treat obesity by inflammation of macrophage-mediated adipocytes.

한편 상기 메틸 벤조에이트 유도체 즉, 화학식 1의 화합물의 염은 약학적으로 허용 가능한 염으로, 상기 화학식 1의 화합물 용해도를 증가시키기 위한 것이라면 특별히 한정되지 않으며, 바람직하게는 산부가염일 수 있다.On the other hand, the methylbenzoate derivative, that is, the salt of the compound of Chemical Formula 1 is a pharmaceutically acceptable salt, and is not particularly limited as long as it increases the solubility of the compound of Chemical Formula 1, and preferably the acid part is a salt.

상기 약학적으로 허용 가능한 염은 인체에 독성이 낮고 모화합물의 생물학적 활성과 물리화학적 성질에 악영향을 주지 않아야 한다. 또한 상기 약학적으로 허용 가능한 염의 제조에 사용될 수 있는 유리산은 무기산과 유기산으로 나눌 수 있다. 무기산은 염산, 황산, 질산, 인산, 과염소산, 브롬산 등이 사용될 수 있다. 유기산은 초산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 푸마린산, 말레산, 말론산, 프탈산, 숙신산, 젖산, 구연산, 시트르산, 글루콘산, 타타르산, 살리실산, 말산, 옥살산, 벤조산, 엠본산, 아스파르트산, 글루탐산 등이 사용될 수 있다. 유기염기부가염 제조에 사용될 수 있는 유기염기는 트리스(히드록시메틸)메틸아민, 디시클로헥실아민 등이다. 아미노산부가염기 제조에 사용될 수 있는 아미노산은 알라닌, 글라이신 등의 천연아미노산이다. 또한 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염뿐만 아니라 모든 수화물 그리고 용매화물도 포함할 수 있다. 상기 수화물 또는 용매화물은 화학식 1의 화합물을 메탄올, 에탄올, 아세톤, 1,4-디옥산과 같은 물과 섞일 수 있는 용매에 녹인 다음에 유리산 또는 유리염기를 가한 후에 결정화되거나 또는 재결정화될 수 있다. 그러한 경우, 용매화물(특히 수화물)이 형성될 수 있다. 따라서, 본 발명의 화합물로서 동결건조와 같은 방법으로 제조 가능한 다양한 양의 물 함유 화합물 이외에 수화물을 비롯한 화학 양론적 용매화물도 포함할 수 있다.The pharmaceutically acceptable salts should be low in toxicity to humans and should not adversely affect the biological activity and physicochemical properties of the parent compound. The free acids that can be used in the preparation of the pharmaceutically acceptable salts can also be divided into inorganic acids and organic acids. As the inorganic acid, hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, perchloric acid, bromic acid and the like can be used. The organic acid may be selected from the group consisting of acetic acid, methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, fumaric acid, maleic acid, malonic acid, phthalic acid, succinic acid, lactic acid, citric acid, citric acid, gluconic acid, tartaric acid, Benzoic acid, embonic acid, aspartic acid, glutamic acid and the like can be used. Organic bases that can be used to prepare organic base addition salts include tris (hydroxymethyl) methylamine, dicyclohexylamine, and the like. Amino acids that can be used in the production of amino acid addition bases are natural amino acids such as alanine and glycine. The compounds of formula (I) according to the present invention may include not only pharmaceutically acceptable salts, but also all hydrates and solvates. The hydrate or solvate can be crystallized or recrystallized after dissolving the compound of formula 1 in a solvent which can be mixed with water, such as methanol, ethanol, acetone, 1,4-dioxane, followed by addition of the free acid or free base have. In such cases, solvates (especially hydrates) may be formed. Thus, compounds of the present invention may also include stoichiometric solvates, including hydrates, in addition to varying amounts of water-containing compounds that can be prepared by methods such as lyophilization.

한편, 본 명세서에서 용어 '유효성분으로 포함하는'이란 본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을, 비만 특히 리포다당류로 유도된 대식세포 매개 지방세포의 염증 반응에 의한 비만을 억제하는데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다.As used herein, the term " comprising as an active ingredient " refers to a compound of the present invention represented by the formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof by an inflammatory reaction of macrophage-mediated adipocytes induced by obesity, Quot; is meant to include an amount sufficient to inhibit obesity.

본 발명의 비만 예방 또는 치료용 약학 조성물은, 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 염을 0.1 내지 2000 ㎍/㎖, 바람직하게는 1 내지 1000 ㎍/㎖의 농도로 사용되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 화학식 1의 화합물 또는 그의 염은 천연물로서 과량 투여하여도 인체에 부작용이 없으므로 본 발명의 조성물 내에 포함되는 화학식 1의 화합물 또는 그의 염의 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.The pharmaceutical composition for preventing or treating obesity of the present invention is preferably used in a concentration of 0.1 to 2000 μg / ml, preferably 1 to 1000 μg / ml, of the compound of Formula 1 or a salt thereof, but is not limited thereto. Since the compound of the formula (I) or its salt has no adverse effect on the human body even when it is administered in an excessive amount as a natural product, the quantitative upper limit of the compound of the formula (I) or its salt contained in the composition of the present invention can be selected by a person skilled in the art within a suitable range.

또 다른 구현예에 따르면, 상기 비만 예방 또는 치료용 약학 조성물은 경구투여용으로 사용될 수도 있고, 피부외용으로 사용될 수도 있다. 다만 바람직하게는 경구투여용일 수 있다.According to another embodiment, the pharmaceutical composition for preventing or treating obesity may be used for oral administration or for external use. But may be preferably for oral administration.

본 발명에 따른 약학 조성물은 약제의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있으며, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화 하여 사용될 수 있다.The pharmaceutical composition according to the present invention may further comprise suitable carriers, excipients and diluents conventionally used in the manufacture of medicaments, and may be formulated into powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols Or the like, an external preparation, a suppository, and a sterile injection solution.

본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.Examples of carriers, excipients and diluents that can be included in the composition of the present invention include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, Cellulose, methylcellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 약학 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘(calcium carbonate), 슈크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤젤라틴 등이 사용될 수 있다.In the case of formulation, a diluent or excipient such as a filler, an extender, a binder, a wetting agent, a disintegrant, or a surfactant is usually used. Solid formulations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules and the like. Such solid preparations can be prepared by mixing the pharmaceutical composition of the present invention with at least one excipient such as starch, calcium carbonate, Sucrose, lactose, gelatin and the like. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc are also used. Examples of the liquid preparation for oral administration include suspensions, solutions, emulsions, and syrups. In addition to water and liquid paraffin, simple diluents commonly used, various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives and the like may be included . Formulations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories. Examples of the suspending agent include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like. As a suppository base, witepsol, macrogol, tween 61, cacao paper, laurin, glycerol gelatin and the like can be used.

본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여법이라면 어느 것이나 사용 가능하고, 전신 투여 또는 국소 투여가 가능하나, 전신 투여가 더 바람직하며, 정맥 내 투여가 가장 바람직하다.The composition of the present invention may be administered orally or parenterally, and any parenteral administration method may be used, and systemic administration or topical administration is possible, but systemic administration is more preferable, and intravenous administration is most preferable.

본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 1일 0.0001 내지 10 g/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 8 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.The preferred dosage of the composition of the present invention varies depending on the condition and the weight of the patient, the degree of disease, the type of drug, the route of administration and the period of time, but can be appropriately selected by those skilled in the art. However, for the desired effect, the composition of the present invention is preferably administered at a daily dose of 0.0001 to 10 g / kg, preferably 0.001 to 8 mg / kg. The administration may be carried out once a day or divided into several times. The dose is not intended to limit the scope of the invention in any way.

본 발명에서, 용어 "예방"이란 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여에 의해 비만을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"란 상기 약학 조성물의 투여에 의해 비만의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.In the present invention, the term "prevention" means all actions that inhibit or delay obesity by the administration of the pharmaceutical composition according to the present invention. By "treatment" Means any act that improves or beneficially modifies.

본 명세서에서 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그의 염은 감압 증류 및 동결건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.In the present specification, the compound represented by the formula (1) or a salt thereof may be produced in a powder state by an additional process such as vacuum distillation and freeze-drying or spray-drying.

또한, 본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그의 염은 광의로는 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그의 염을 동물에게 투여할 수 있도록 제형화된 가공물, 예컨대, 분말도 포함하는 의미를 갖는다. 비록 본 발명에서 화학식 1로 표시되는 화합물로 실험을 진행하긴 하였으나, 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그의 염의 가공물과 같은 형태로도 목적하는 효과를 달성할 수 있음은 당업자라면 예상 가능할 것이다.
In addition, the compound represented by the formula (1) of the present invention or its salt has a meaning including a formulated product, for example, a powder, such that the compound represented by the formula (1) or a salt thereof can be administered to an animal. Although the present invention has been carried out with the compound represented by the general formula (1), it can be expected that a desired effect can be achieved in the form of a compound represented by the general formula (1) or a salt thereof.

본 발명의 또 다른 측면은 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 비만 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.Another aspect of the present invention provides a food composition for preventing or improving obesity comprising a compound of the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof:

[화학식 1][Chemical Formula 1]

본 발명에 따른 식품 조성물은 상기 약학 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 알코올 음료류, 과자류, 다이어트바, 유제품, 육류, 초코렛, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류, 비타민 복합제, 건강보조식품류 등이 있다.The food composition according to the present invention can be formulated in the same manner as the above-mentioned pharmaceutical composition and used as a functional food or added to various foods. Foods to which the composition of the present invention can be added include, for example, beverages, alcoholic beverages, confectioneries, diet bars, dairy products, meat, chocolates, pizza, ram noodles, other noodles, gums, ice cream, .

본 발명의 식품 조성물은 유효성분으로서 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 염뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제와 음료류로 제조되는 경우에는 본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 염 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 및 각종 식물 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.The food composition of the present invention may contain, as an active ingredient, a compound of the following general formula (1) or a salt thereof, as well as a component that is ordinarily added during the manufacture of a food product, for example, a protein, a carbohydrate, a fat, a nutrient, And flavoring agents. Examples of the above-mentioned carbohydrates are monosaccharides such as glucose, fructose, and the like; Disaccharides such as maltose, sucrose, oligosaccharides and the like; And polysaccharides such as dextrin, cyclodextrin and the like, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol and erythritol. Natural flavorings such as tau martin and stevia extract (e.g., rebaudioside A and glycyrrhizin) and synthetic flavorings (saccharine, aspartame, etc.) can be used as flavorings. For example, when the food composition of the present invention is prepared from a drink and a beverage, it may contain citric acid, liquid fructose, sugar, glucose, acetic acid, malic acid, fruit juice, various plant extracts, etc. in addition to the compound represented by the formula (1) Can be added.

본 발명은 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 개선용 식품 조성물을 포함하는 건강기능식품을 제공한다. 건강기능식품이란, 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 본 발명의 건강기능식품은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 매우 유용하다. 이와 같은 건강기능식품에 있어서의 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 첨가량은, 대상인 건강기능식품의 종류에 따라 달라 일률적으로 규정할 수 없지만, 식품 본래의 맛을 손상시키지 않는 범위에서 첨가하면 되며, 대상 식품에 대하여 통상 0.01 내지 50 중량%, 바람직하기로는 0.1 내지 20 중량%의 범위이다. 또한, 환제, 과립제, 정제 또는 캡슐제 형태의 건강기능식품의 경우에는 통상 0.1 내지 100 중량% 바람직하기로는 0.5 내지 80 중량%의 범위에서 첨가하면 된다. 한 구체예에서, 본 발명의 건강기능식품은 환제, 정제, 캡슐제 또는 음료의 형태일 수 있다.The present invention provides a health functional food comprising a food composition for preventing or improving obesity comprising the compound of formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient. The health functional food refers to a food prepared by adding a compound of the formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof to a food material such as a beverage, a tea, a spice, a gum or confectionery, or by encapsulating, pulverizing or suspending, However, unlike general medicines, it has the advantage that there are no side effects that can occur when a drug is taken for a long time by using the food as a raw material. The health functional food of the present invention thus obtained is very useful because it can be ingested routinely. The amount of the compound of the formula (I) or the pharmaceutically acceptable salt thereof added in such a health functional food can not be uniformly determined depending on the kind of the health functional food to which it is added. However, And is usually in the range of 0.01 to 50% by weight, preferably 0.1 to 20% by weight based on the target food. In the case of health functional foods in the form of pills, granules, tablets or capsules, they may be added usually in the range of 0.1 to 100% by weight, preferably 0.5 to 80% by weight. In one embodiment, the health functional food of the present invention may be in the form of a pill, tablet, capsule or beverage.

또한, 본 발명은 비만 특히 대식세포 매개 지방세포의 염증에 의한 비만 예방 또는 개선용 의약 또는 식품의 제조를 위한 화학식 1의 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공한다. 상기한 바와 같이 화학식 1의 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염은 비만 예방 또는 개선을 위한 용도로 이용될 수 있다.
The present invention also provides the use of a compound of formula (I) and a pharmaceutically acceptable salt thereof for the manufacture of a medicament or food for the prevention or amelioration of obesity, particularly obesity caused by inflammation of macrophage-mediated adipocytes. As described above, the compound of formula (I) and a pharmaceutically acceptable salt thereof can be used for prevention or improvement of obesity.

또한, 본 발명은 포유동물에게 유효량의 화학식 1의 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염을 투여하는 것을 포함하는 비만 치료 또는 예방방법을 제공한다.The invention also provides a method of treating or preventing obesity comprising administering to a mammal an effective amount of a compound of formula I and a pharmaceutically acceptable salt thereof.

여기에서 사용된 용어 "포유동물"은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 제외한 포유동물일 수 있다.The term "mammal " as used herein refers to a mammal that is the subject of treatment, observation or experimentation, preferably a mammal other than a human.

여기에서 사용된 용어 "유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상의에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 해당 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에 대한 유효량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 수 있다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 예방, 치료 또는 개선 방법에 있어서, 성인의 경우, 화학식 1의 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염을 1일 1회 내지 수회 투여시, 0.0001 내지 10 g/kg 바람직하게는 0.001 내지 8 mg/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.As used herein, the term "effective amount" refers to the amount of active ingredient or pharmaceutical composition that elicits a biological or medical response in a tissue system, animal, or human, as contemplated by a researcher, veterinarian, physician or other clinician, &Lt; / RTI > inducing a reduction of the symptoms of the disease or disorder. The effective amount and the administration frequency for the active ingredient of the present invention can be changed according to the desired effect. Thus, the optimal dosage to be administered can be readily determined by those skilled in the art and will vary with the nature of the disease, the severity of the disease, the amount of active and other ingredients contained in the composition, the type of formulation, and the age, The age, body weight, sex, diet, time of administration, route of administration and fraction of the composition, duration of treatment, concurrent medication, and the like. In the prevention, treatment or improvement method of the present invention, in the case of an adult, the compound of the formula (I) and the pharmaceutically acceptable salt thereof is administered at a dose of 0.0001 to 10 g / kg, preferably 0.001 to 8 mg / kg < / RTI >

본 발명의 치료방법에서 화학식 1의 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조성물은 경구, 직장, 질내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.
In the therapeutic method of the present invention, the composition comprising the compound of Chemical Formula 1 and a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient can be administered orally, rectally, vaginally, intravenously, intraarterially, intraperitoneally, intramuscularly, , Intraocularly or intradermally, in a conventional manner.

이하에서 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하며, 다만 이하에 실시예 등에 의해 본 발명의 범위와 내용이 축소되거나 제한되어 해석될 수 없다. 또한, 이하의 실시예를 포함한 본 발명의 개시 내용에 기초한다면, 구체적으로 실험 결과가 제시되지 않은 본 발명을 통상의 기술자가 용이하게 실시할 수 있음은 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연하다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples and the like, but the scope and content of the present invention can not be construed to be limited or limited by the following Examples. It will be apparent to those skilled in the art that various modifications and variations can be made in the present invention without departing from the spirit and scope of the present invention as set forth in the following claims. It is natural that it belongs to the claims.

또한 이하에서 제시되는 실험 결과는 상기 실시예 및 비교예의 대표적인 실험 결과만을 기재한 것이며, 아래에서 명시적으로 제시하지 않은 본 발명의 여러 구현예의 각각의 효과는 해당 부분에서 구체적으로 기재하도록 한다.
In addition, the experimental results presented below only show representative experimental results of the embodiments and the comparative examples, and the respective effects of various embodiments of the present invention which are not explicitly described below will be specifically described in the corresponding part.

실시예Example 1. One. 메틸methyl 벤조에이트Benzoate 유도체(화학식 1)의 확인 Identification of derivatives (Formula 1)

본 발명의 실시예 1로, 메틸 2-(4'-메톡시-4'-옥소부탄아미도)벤조에이트(methyl 2-(4′-methoxy-4′-oxobutanamido)benzoate, 화학식 1) 화합물을 이용하였다.In Example 1 of the present invention, methyl 2- (4'-methoxy-4'-oxobutanamido) benzoate, compound of formula (1) Respectively.

[화학식 1][Chemical Formula 1]

상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 DART-MS와 ¹H-NMR, ¹³C-NMR 을 분석한 결과 다음과 같다.The results of ¹ H-NMR and ¹³ C-NMR analysis of the compound represented by the above formula (1) with DART-MS are as follows.

Colorless amorphous powder; DART-MS m/z 266 [M+H]⁺; ¹H-NMR (700MHz, CDCl₃)δ 11.15 (1H, br s, NH), 8.68 (1H, dd, J = 8.5, 0.9 Hz, H-3), 8.02 (1H, dd, J = 8.0, 1.6 Hz, H-6), 7.53 (1H, td, J = 8.5, 1.6 Hz, H-4), 7.08 (1H, td, J = 7.6, 1.1 Hz, H-5), 3.93 (3H, s, 7-OCH₃), 3.71 (3H,s,4-OCH₃), 2.77 (4H, m, H-2' and 3'); ¹³C-NMR (176MHz, CDCl₃)δ 173.1 (C-4'), 170.3 (C-1'), 168.7 (C-7), 141.4 (C-2), 134.7 (C-4), 130.8 (C-6), 122.5 (C-5), 120.4 (C-3), 114.9 (C-1), 52.4 (OCH₃), 51.9 (OCH₃), 32.7 (C-2'or C-3'), 29.0 (C-3'or C-2').
Colorless amorphous powder; DART-MS m / z 266 [M + H] < ⁺ >; ^{1 H-NMR (700MHz, CDCl} 3) δ 11.15 (1H, br s, NH), 8.68 (1H, dd, J = 8.5, 0.9 Hz, H-3), 8.02 (1H, dd, J = 8.0, 1.6 Hz, H-6), 7.53 (1H, td, J = 8.5, 1.6 Hz, H-4), 7.08 (1H, td, J = 7.6, 1.1 Hz, H-5), 3.93 (3H, s, 7 _{-OCH 3), 3.71 (3H,} s, 4-OCH 3), 2.77 (4H, m, H-2 'and 3'); ^{13 C-NMR (176MHz, CDCl} 3) δ 173.1 (C-4 '), 170.3 (C-1'), 168.7 (C-7), 141.4 (C-2), 134.7 (C-4), 130.8 ( C-6), 122.5 (C -5), 120.4 (C-3), 114.9 (C-1), 52.4 (OCH 3), 51.9 (OCH 3), 32.7 (C-2'or C-3 ') , 29.0 (C-3'or C-2 ').

실험예 1. 대식세포의 세포독성 분석Experimental Example 1. Cytotoxicity analysis of macrophages

Raw 264.7 세포에 실시예 1의 화학식 1로 표시되는 화합물을 처리한 후, MTT 분석을 수행하여, 독성 유무를 분석하였다.Raw 264.7 cells were treated with the compound of formula 1 of Example 1, and MTT assay was performed to analyze the toxicity.

쥐의 대식세포 Raw 264.7 세포를 10%의 가열을 통해 비활성화된 FBS(ThermoFisher scientific, USA)와 5%의 항생제(ThermoFisher scientific, USA)가 포함된 Dulbecco's modified Eagles medium(DMEM, Corning Life Sciences, USA) 배지로 5% CO2, 37 ℃ 조건에서 배양하였다. 세포독성을 측정하기 위해, Raw 264.7 세포를 2 x 10⁴ cell/ml로 96-well 배양 플레이트에 접종 후, 다양한 농도(0, 0.1, 1, 10, 50, 100 μg/ml 농도)의 실시예 1의 화학식 1로 표시되는 화합물을 각각 처리한 후 24 시간 동안 배양하였다.Mouse macrophage Raw 264.7 cells were cultured in Dulbecco's modified Eagles medium (DMEM, Corning Life Sciences, USA) containing 10% heat inactivated FBS (ThermoFisher scientific, USA) and 5% antibiotics (ThermoFisher scientific, USA) And cultured in medium at 5% CO 2 and 37 ° C. To measure cytotoxicity, Raw 264.7 cells were inoculated into 96-well culture plates at 2 x 10 ⁴ cells / ml and cultured in various concentrations (0, 0.1, 1, 10, 50, 100 μg / ml concentration) 1 were each treated and then cultured for 24 hours.

세포 생존능은 살아있는 세포의 미토콘드리아 활성을 나타내는 MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] 분석으로 확인하였다. 미토콘드리아의 효소에 의해 포마잔(formazan)으로 환원되는 MTT를 Molecular Device microplate reader를 이용하여 550nm 흡광도로 측정하였다.Cell viability was confirmed by MTT [3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide] assay, which indicates the mitochondrial activity of living cells. MTT reduced by mitochondrial enzyme to formazan was measured by absorbance at 550 nm using a Molecular Device microplate reader.

모든 데이터는 평균 ± 표준오차로 나타내었고, 대조군과 처리군과의 통계학적인 차이는 Student's t-test 분석법을 이용하여 유의성을 결정하였다. P 값이 5% 미만일 때, 통계적으로 유의성이 있다고 판정하였다.
All data were expressed as mean ± standard error, and statistical differences between the control and treatment groups were determined using Student's t-test. When the P value was less than 5%, it was judged statistically significant.

도 1은 본 발명의 실시예 1로부터 제조된 화학식 1로 표시되는 화합물의 농도(0, 0.1, 1, 10, 50, 100 ㎍/㎖)에 따라, Raw 264.7 세포의 세포 증식율을 측정하여 나타낸 그래프이다.1 is a graph showing the cell proliferation rate of Raw 264.7 cells according to the concentration (0, 0.1, 1, 10, 50, 100 쨉 g / ml) of the compound represented by Chemical Formula 1 prepared in Example 1 of the present invention to be.

도 1에 나타낸 바와 같이 실시예 1로부터 제조된 화학식 1로 표시되는 화합물에 의한 세포독성은 Raw 264.7 세포에서 관찰되지 않았다. 특히, 100 ㎍/㎖ 이상의 고농도로 실시예 1로부터 제조된 화학식 1의 화합물을 처리하여도 세포 생존능이 전혀 변화가 없는 것을 확인하였다.As shown in Fig. 1, the cytotoxicity by the compound represented by the formula (1) prepared in Example 1 was not observed in Raw 264.7 cells. In particular, it was confirmed that the cell viability was not changed at all even when the compound of Chemical Formula 1 prepared in Example 1 was treated at a high concentration of 100 ㎍ / ml or more.

즉 본 발명의 실시예 1로부터 제조된 화학식 1의 화합물은 고농도에서도 세포에 대해 독성을 나타내지 않는다는 것을 확인할 수 있다.
That is, it can be confirmed that the compound of Chemical Formula 1 prepared from Example 1 of the present invention does not show toxicity to cells even at a high concentration.

실험예 2. 화학식 1의 화합물에 의한 IL-1β, IL-6, TNF-α의 발현 분석EXPERIMENTAL EXAMPLE 2 Expression Analysis of IL-1β, IL-6 and TNF-α by the Compound of Chemical Formula 1

Raw 264.7 세포에 실시예 1의 화학식 1로 표시되는 화합물을 처리한 후, ELISA 분석을 수행하여, IL-1β, IL-6, TNF-α의 발현 정도를 측정하였다.Raw 264.7 cells were treated with the compound represented by Chemical Formula 1 of Example 1 and subjected to ELISA analysis to measure the expression level of IL-1β, IL-6 and TNF-α.

96 well plate에 쥐의 대식세포 Raw 264.7 세포를 배양한다. 이때 배양조건은 10%의 가열을 통해 비활성화된 FBS(ThermoFisher scientific, USA)와 5%의 항생제(ThermoFisher scientific, USA)가 포함된 Dulbecco's modified Eagles medium(DMEM, Corning Life Sciences, USA) 배지로 5% CO2, 37 ℃ 조건에서 수행된다.Raw mouse macrophage Raw 264.7 cells are cultured in 96 well plates. The culture conditions were 5% with Dulbecco's modified Eagles medium (DMEM, Corning Life Sciences, USA) containing 5% of inactivated FBS (ThermoFisher scientific, USA) and 5% CO2, 37 < 0 > C.

상기 세포에, 다양한 농도(0, 0.1, 1, 10, 50, 100 μg/ml 농도)의 실시예 1의 화학식 1로 표시되는 화합물을 각각 처리한 후 2 시간 동안 전처리하고, 1 ㎍/㎖의 LPS로 처리하지 않거나, 4 시간 또는 24 시간동안 활성화(타켓 단백질에 따라 활성화 시간 조절)한 후, 배양된 세포를 회수하여 d-PBS를 이용하여 세척하고 blocking buffer 200 ㎕ 넣어 상온에서 30분 동안 비 특이적 결합을 시킨다. 세척용 완충용액으로 3 회 세척하고, IL-1β, IL-6, TNF-α의 생성함량을 측정하기 위하여, mouse enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) kit(R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 IL-1β, IL-6, TNF-α의 각각에 대한 생성함량을 정량하였다. 모든 데이터는 평균 ± 표준오차로 나타내었고, 대조군과 처리군과의 통계학적인 차이는 Student's t-test 분석법을 이용하여 유의성을 결정하였다. P 값이 5% 미만일 때, 통계적으로 유의성이 있다고 판정하였고, 그래프 상에 *로 표기하였다.
The cells were treated with compounds of the formula 1 of Example 1 at various concentrations (0, 0.1, 1, 10, 50, 100 μg / ml concentration) and then pretreated for 2 hours to give 1 μg / ml After incubation for 4 or 24 hours, the incubated cells were harvested, washed with d-PBS, and 200 μl of blocking buffer was added and incubated at room temperature for 30 min. Specific binding. (R & D Systems Inc., Minneapolis, Minn., USA) to determine the amount of IL-1β, IL-6 and TNF- ) Was used to quantify the production of IL-1β, IL-6, and TNF-α, respectively. All data were expressed as mean ± standard error, and statistical differences between the control and treatment groups were determined using Student's t-test. When the P value was less than 5%, it was determined to be statistically significant and marked with * on the graph.

도 2는 Raw 264.7 세포에서 화학식 1의 화합물(실시예 1)을 농도별로 처리하였을 때의 TNF-α(a), IL-6(b) 및 IL-1β(c)의 발현을 나타낸 결과이다.FIG. 2 shows the results of expression of TNF-α (a), IL-6 (b) and IL-1β (c) when Raw 264.7 cells were treated with the compound of Formula 1 (Example 1)

도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명의 화학식 1의 화합물은 LPS로 활성화시킨 대식세포 Raw 264.7 세포에서 TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 생성이 억제되는 것을 확인하였다.
As shown in FIG. 2, the compound of Chemical Formula 1 of the present invention was found to inhibit the production of TNF-α, IL-6 and IL-1β in LPS-activated macrophage Raw 264.7 cells.

실험예 3. 화학식 1의 화합물에 의한 TNF-α, IL-6, IL-1β, Rantes 및 MCP-1의 mRNA 발현 분석Experimental Example 3. Analysis of mRNA Expression of TNF-α, IL-6, IL-1β, Rantes and MCP-1 by the Compound of Chemical Formula 1

실시예 1의 화학식 1로 표시되는 화합물에 의해 TNF-α, IL-6, IL-1β와 케모마인인 Rantes, MCP-1의 생성 억제가 전사 수준에서 일어나는지 확인하기 위하여, 화학식 1의 화합물이 LPS로 활성화된 Raw 264.7 세포에서 TNF-α, IL-6, IL-1β와 케모마인인 Rantes, MCP-1의 mRNA 발현에 미치는 영향을 확인하고자, 이를 실시간 RT-PCR로 분석하였다.In order to confirm whether the inhibition of the production of TNF-α, IL-6, IL-1β and chemomaines Rantes and MCP-1 by the compound of formula 1 of Example 1 occurs at the transcription level, RT-PCR was performed to investigate the effect of TNF-α, IL-6, IL-1β and chemotherapeutic agents, Rantes and MCP-1 on mRNA expression in Raw 264.7 cells.

우선 TNF-α, IL-6, IL-1β 및 케모마인인 Rantes, MCP-1의 mRNA 발현 수준을 측정하기 위하여, 먼저 Raw 264.7 세포(5 × 106 cells/㎖)에 화합물 1을 0.1, 1, 10 μg/ml 농도로 2시간의 전처리과정을 거친 후, 여기에 1 μg/ml의 LPS를 처리하지 않거나 4시간동안 활성화시켰다. 그 다음 제조사의 지시에 따라 trizol 시약(Gibco BRL)으로 LPS-처리한 Raw 264.7 세포로부터 총 RNA를 분리하고, 사용전까지 -70 ℃에 보관하였다.First, in order to measure mRNA expression levels of TNF-α, IL-6, IL-1β and chemotherapeutic agents, Rantes and MCP-1, Raw 264.7 cells (5 × 10 6 cells / After pretreatment for 2 hours at a concentration of 10 μg / ml, 1 μg / ml of LPS was not treated or activated for 4 hours. Total RNA was then isolated from LPS-treated Raw 264.7 cells with the trizol reagent (Gibco BRL) according to the manufacturer's instructions and stored at -70 ° C until use.

RNA를 Reverse Transcription kit (Promega, USA)를 사용하여 역전사시켜서 cDNA를 수득하였다. 이어, 상기 cDNA를 주형으로 사용한 정량적 실시간 PCR(qPCR)을 CFX96TM 및 Chromo4TM real-time PCR detector (Bio-Rad)를 포함하는 KAPATM SYBR FAST qPCR (KAPABIOSYSTEMS)를 사용하여 수행함으로써, TNF-α, IL-6, IL-1β, Rantes 및 MCP-1의 mRNA 수준을 측정하고 이를 비교하였다. 결과는 도 3, 도 4에 나타내었다.RNA was reverse transcribed using Reverse Transcription kit (Promega, USA) to obtain cDNA. Next, quantitative real-time PCR (qPCR) using the cDNA as a template was performed using KAPATM SYBR FAST qPCR (KAPABIOSYSTEMS) containing CFX96TM and Chromo4TM real-time PCR detector (Bio-Rad) 6, IL-1β, Rantes and MCP-1 mRNA levels were measured and compared. The results are shown in FIG. 3 and FIG.

모든 데이터는 평균 ± 표준오차로 나타내었고, 대조군과 처리군과의 통계학적인 차이는 Student's t-test 분석법을 이용하여 유의성을 결정하였다. P 값이 5% 미만일 때, 통계적으로 유의성이 있다고 판정하였고, 그래프 상에 *로 표기하였다.
All data were expressed as mean ± standard error, and statistical differences between the control and treatment groups were determined using Student's t-test. When the P value was less than 5%, it was determined to be statistically significant and marked with * on the graph.

도 3은 Raw 264.7 세포에서 화학식 1의 화합물(실시예 1)을 농도별로 처리하였을 때의 TNF-α(a), IL-6(b) 및 IL-1β(c)의 mRNA 발현을 나타낸 결과 그래프이고, 도 4는 Raw 264.7 세포에서 화학식 1의 화합물(실시예 1)을 농도별로 처리하였을 때의 MCP-1(a), Rantes(b)의 mRNA 발현을 나타낸 결과 그래프이다.FIG. 3 shows mRNA expression of TNF-α (a), IL-6 (b), and IL-1β (c) when Raw 264.7 cells were treated with the compound of formula 1 (Example 1) FIG. 4 is a graph showing mRNA expression of MCP-1 (a) and Rantes (b) when Raw 264.7 cells were treated with the compound of Formula 1 (Example 1) at different concentrations.

도 3 및 도 4에 나타난 바와 같이 본 발명의 화학식 1의 화합물은 LPS로 활성화시킨 대식세포 Raw 264.7 세포에서 TNF-α, IL-6, IL-1β 및 MCP-1, Rantes 전사인자 mRNA의 생성이 억제되는 것을 확인하였다.
As shown in FIG. 3 and FIG. 4, the compound of Chemical Formula 1 of the present invention inhibits the production of TNF-α, IL-6, IL-1β and MCP-1 and Rantes transcription factor mRNA in LPS-activated macrophage Raw 264.7 cells Respectively.

실험예 4. 화학식 1의 화합물에 의한 PI3k, β-actin, p-Akt, Akt 발현 분석.EXPERIMENTAL EXAMPLE 4. Analysis of PI3k,? -Actin, p-Akt and Akt Expression by the Compound of Chemical Formula 1.

PI3k, β-actin, p-Akt, Akt의 발현 정도를 알아보기 위하여, 웨스턴 블롯분석을 수행하였다.Western blot analysis was performed to determine the expression level of PI3k, β-actin, p-Akt and Akt.

이를 위해 우선 6 well plate에 Raw 264.7 세포를 배양하고, 여기에 실시예 1의 화학식 1로 표시되는 화학물을 농도별(0, 0.1, 1, 10 ㎍/㎖)로 2시간 전처리한 후, 1 ㎍/㎖의 LPS를 처리하지 않거나 처리하여 타겟 단백질에 따라 10 분, 20 분, 30 분 또는 2 시간 동안 활성화시킨 후, 배양된 세포를 homogenization buffer를 이용해 회수하고, 단백질을 분리하였다. 얻어낸 단백질로 웨스턴 블랏 방법을 이용하여 PI3k, β-actin, p-Akt, Akt의 발현량을 측정하였다. For this purpose, Raw 264.7 cells were cultured on a 6-well plate, and the chemicals represented by Chemical Formula 1 of Example 1 were pretreated for 2 hours with concentration (0, 0.1, 1, 10 / / After incubation for 10, 20, 30 or 2 hours depending on the target protein, the cells were recovered using homogenization buffer and the proteins were separated. The amount of PI3k, β-actin, p-Akt and Akt was determined by Western blotting using the obtained protein.

이때, 일반적인 조성의 homogenization buffer이면 사용가능하나, 바람직하게는 각 타겟 단백질의 웨스턴 블랏 kit에 포함된 버퍼인 것이 좋고, 일예로 RIPA buffer가 있다. 또한, 상술한 세포로부터 단백질을 분리하기 위해 일반적인 웨스턴 블랏 kit 매뉴얼을 토대로 수행하였다.At this time, it is possible to use a homogenization buffer of a general composition, but preferably it is a buffer contained in a Western blot kit of each target protein, for example, a RIPA buffer. In order to separate proteins from the above-described cells, a general Western blot kit manual was also used.

도 5는 본 발명의 실시예 1의 화합물(화학식 1) 농도에 따라, Raw 264.7 세포에서 PI3k, β-actin, p-Akt, Akt 발현 수준을 분석하여 나타낸 웨스턴 블롯 사진이고, 하단의 그래프는 PI3K/β-actin 과 p-Akt/Akt의 발현 수준을 수치적으로 비교 분석하여 나타낸 것이다.FIG. 5 is a Western blot photograph showing the expression level of PI3k,? -Actin, p-Akt and Akt in Raw 264.7 cells according to the concentration of the compound (Formula 1) of Example 1 of the present invention, / β-actin and p-Akt / Akt in the culture medium.

도 5에 나타난 바와 같이, PI3K과 Akt 발현이 억제되고 있음을 알 수 있고, 이를 통해 본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물은 PI3k/Akt 신호 경로에 대해 저해 효과를 갖는다 여겨진다.
As shown in FIG. 5, it can be seen that the expression of PI3K and Akt is inhibited, and it is considered that the compound represented by formula 1 of the present invention has an inhibitory effect on the PI3k / Akt signal pathway.

실험예 5. 화학식 1의 화합물에 의한 p-AMPK, AMPK, SIRT1, β-Actin 발현 분석.EXPERIMENTAL EXAMPLE 5. Analysis of Expression of p-AMPK, AMPK, SIRT1, and β-Actin by the Compound of Chemical Formula 1.

p-AMPK, AMPK, SIRT1, β-Actin의 발현 정도를 알아보기 위하여, 웨스턴 블롯분석을 수행하였다. 웨스턴 블롯분석은 실험예 4과 동일한 방법으로 수행하였다.Western blot analysis was performed to examine the expression levels of p-AMPK, AMPK, SIRT1, and β-Actin. Western blot analysis was carried out in the same manner as in Experimental Example 4.

도 6은 본 발명의 실시예 1의 화합물(화학식 1) 농도에 따라, Raw 264.7 세포에서 p-AMPK, AMPK, SIRT1, β-Actin 발현 수준을 분석하여 나타낸 웨스턴 블롯 사진이고, 하단의 그래프는 p-AMPK/AMPK과 SIRT1/β-Actin의 발현 수준을 수치적으로 비교 분석하여 나타낸 것이다.FIG. 6 is a Western blot photograph showing the expression levels of p-AMPK, AMPK, SIRT1, and β-Actin in Raw 264.7 cells according to the concentration of the compound (Formula 1) of Example 1 of the present invention, -AMPK / AMPK and SIRT1 / [beta] -Actin, respectively, by numerical comparison.

도 6에 나타난 바와 같이, AMPK와 SIRT1 발현이 활성화 되고 있음을 알 수 있고, 이를 통해 본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물은 AMPK/SIRT1 신호 경로를 활성화하고 있다 여겨진다.As shown in FIG. 6, it can be seen that AMPK and SIRT1 expression are activated, and it is believed that the compound represented by formula 1 of the present invention activates the AMPK / SIRT1 signaling pathway.

즉, 상기 결과를 종합하면 LPS로 활성화 시킨 대식세포의 TNF-α, IL-6, IL-1β의 생성과 mRNA의 양, 케모카인인 MCP-1과 Rantes의 mRNA의 양을 억제시켰다. 이런 반응은 MAPK의 활성억제가 아닌 PI3k/Akt 신호기작의 억제와 동시에 AMPK/SIRT1의 활성야기를 통해서 일어난 것으로 예상된다.
That is, the above results showed that the amount of TNF-α, IL-6, IL-1β and mRNA levels of the macrophages activated by LPS and the amount of mRNAs of the chemokines MCP-1 and Rantes were suppressed. This reaction is expected to occur not only by the inhibition of MAPK activity, but also by the inhibition of the PI3k / Akt signaling mechanism and the activation of AMPK / SIRT1.

실험예 6. LPS만 처리한 세포에서의 Iκb-α, β-Actin 발현과 화학식 1의 화합물과 LPS를 처리한 세포에서의 Iκb-α, β-Actin 발현 분석.EXPERIMENTAL EXAMPLE 6 Expression of Iκb-α, β-Actin in LPS-Treated Cells and Expression of Iκb-α, β-Actin in Cells Treated with Compound 1 and LPS.

LPS만 처리한 세포에서의 Iκb-α, β-Actin 발현 정도와 화학식 1의 화합물과 LPS를 처리한 세포에서의 Iκb-α, β-Actin 발현 정도를 알아보기 위하여, 웨스턴 블롯분석을 수행하였다. 웨스턴 블롯 분석은 실험예 4과 동일한 방법으로 수행하였다.Western blot analysis was performed to examine the degree of expression of Iκb-α and β-Actin in cells treated with LPS alone and the degree of expression of Iκb-α and β-Actin in cells treated with the compound of formula (1) and LPS. Western blot analysis was carried out in the same manner as in Experimental Example 4.

도 7은 화학식 1의 화합물을 처리하지 않고 LPS만 처리한 Raw 264.7 세포에서 Iκb-α, β-Actin 발현 수준(사진 상단 'LPS(1㎍/㎖)' 표시)과 본 발명의 실시예 1의 화합물(화학식 1)과 LPS 처리한 Raw 264.7 세포에서 Iκb-α, β-Actin 발현 수준(사진 상단 'compound1+LPS' 표시)을 분석하여 나타낸 웨스턴 블롯 사진이고, 하단의 그래프는 Iκb-α/β-Actin의 발현 수준을 수치적으로 비교 분석하여 나타낸 것이다.FIG. 7 shows the expression level of Iκb-α, β-Actin (shown in the upper part of the picture, 'LPS (1 μg / ml)') in Raw 264.7 cells treated with LPS alone without treating the compound of formula Western blot analysis of the expression levels of Iκb-α, β-Actin (expressed as 'compound 1 + LPS' at the top of the photograph) in the Raw 264.7 cells treated with the compound (Formula 1) and the Iκb-α / β -Actin expression level of the cells.

도 7에 나타난 바와 같이, LPS만으로 처리한 세포에서는 Iκb-α 발현이 시간에 따라 감소하는데 반해, 실시예 1의 화합물(화학식 1)과 LPS 처리한 세포에서는 Iκb-α 발현이 증가하고 있음을 확인하였다.
As shown in FIG. 7, in the cells treated with LPS only, the expression of Iκb-α decreased with time, whereas the expression of Iκb-α was increased in the cells treated with the compound of formula (1) Respectively.

실험예 7. 화학식 1의 화합물에 의한 p65 발현 분석.EXPERIMENTAL EXAMPLE 7. Analysis of p65 expression by the compound of formula (1).

PI3k/Akt 신호기작(signaling)은 p65의 핵이동(nuclaer translocation)과 p65의 활성을 촉진하는데 반해, AMPK/SIRT1 신호기작(signaling)은 p65의 활성을 억제한다.PI3k / Akt signaling promotes p65 nuclide translocation and p65 activity, while AMPK / SIRT1 signaling inhibits p65 activity.

앞선 실험결과를 토대로, p65의 핵이동(nuclear translocation) 및 p65의 활성을 웨스턴 블랏(western blotting)을 통해 확인하고자 하였다. 웨스턴 블롯 분석은 실험예 4과 동일한 방법으로 수행하였다.Based on the results of previous experiments, we tried to confirm the nuclear translocation of p65 and the activity of p65 through western blotting. Western blot analysis was carried out in the same manner as in Experimental Example 4.

도 8은 p65의 핵이동(nuclear translocation) 및 p65의 활성을 확인하고자, 본 발명의 실시예 1의 화합물(화학식 1)과 LPS 처리한 Raw 264.7 세포의 각 부위에서 p65의 발현수준을 분석하여 나타낸 웨스턴 블롯 사진이고, 하단의 그래프는 핵 내 p-65/lamin A의 발현 수준과 전체 세포에서 p-p65/p65의 발현 수준을 수치적으로 비교 분석하여 나타낸 것이다.FIG. 8 shows the expression levels of p65 in the respective regions of the compound (Formula 1) of the present invention and Raw 264.7 cells treated with LPS in order to confirm the nuclear translocation of p65 and the activity of p65 Western blot photograph, and the graph at the bottom shows numerical comparative analysis of the expression level of p-65 / lamin A in the nucleus and the expression level of p-p65 / p65 in whole cells.

도 8에 나타난 바와 같이, p65의 핵이동(nuclaer translocation)이 억제되고, p65의 활성도 억제되고 있음을 확인하였다. 이를 통해 본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물은 PI3k/Akt 신호기작(signaling)은 억제되고, AMPK/SIRT1 신호기작(signaling)은 촉진하는 것을 알 수 있다.
As shown in FIG. 8, it was confirmed that nuclear translocation of p65 (nuclaer translocation) was suppressed and the activity of p65 was suppressed. Thus, it can be seen that the compound of formula (I) of the present invention inhibits PI3k / Akt signaling and promotes AMPK / SIRT1 signaling.

실험예 8. 리포다당류로 활성화한 대식세포 배지로 처리한 지방세포에서의, 화학식 1의 화합물에 의한 TNF-α, IL-6, IL-1β, Rantes, MCP-1 및 아디포넥틴(adioponectin)의 mRNA 발현 분석.EXPERIMENTAL EXAMPLE 8 The mRNA of TNF-α, IL-6, IL-1β, Rantes, MCP-1 and adiponectin by the compound of Chemical Formula 1 in adipocyte-treated adipocyte- Expression analysis.

1) 세포 준비(대식세포 Raw 264.7, 지방세포 3T3-L1)1) Cell preparation (macrophage Raw 264.7, adipocyte 3T3-L1)

10%의 가열을 통해 비활성화된(heat-inactivated) FBS와 5%의 항생제가 포함된 DMEM에서 배양된 Raw 264.7 세포에 실시예 1의 화학식 1로 표시되는 화합물(compound 1로 표기함)을 0.1, 1, 10 μg/ml의 농도로 2 시간 전 처리하였다. 그 후, 타겟 단백질의 발현시간에 따라 다른 시간동안 1μg/ml의 LPS로 세포를 활성화시켰다. 세포는 5%의 CO²가 공급되는 37℃ 조건에서 배양하였다.Raw 264.7 cells cultured in DMEM containing 5% heat-inactivated FBS and 5% antibiotics at 10% heat were added 0.1, 1 and 10 μg / ml for 2 hours. Thereafter, the cells were activated with 1 μg / ml of LPS for different times according to the expression time of the target protein. Cells were cultured at 37 ° C with 5% CO ² .

3T3-L1 지방세포는 10%의 가열을 통해 비활성화된(heat-inactivated) calf serum(ThermoFisher scientific, USA)와 5%의 항생제가 포함된 DMEM에서 배양하였고, 분화를 유도할 때에는 10%의 가열을 통해 비활성화된(heat-inactivated) FBS와 5%의 항생제가 포함된 DMEM에서 배양하였으며, 모든 배양조건은 5%의 CO² 가 공급되는 37℃ 조건에서 이루어졌다.3T3-L1 adipocytes were cultured in 10% heat-inactivated calf serum (ThermoFisher scientific, USA) and DMEM containing 5% antibiotics, and 10% heat was applied to induce differentiation The cells were cultured in DMEM containing 5% heat-inactivated FBS and 5% antibiotics. All culture conditions were at 37 ° C with 5% CO ² .

2) 세포조정배지(Conditioned media)준비2) Conditioned media preparation

상기 과정을 통해 배양된 Raw264.7 세포에 먼저 0.1, 1, 10 μg/ml 농도의 화합물 1로 2 시간동안 전처리하고, 여기에 1 μg/ml의 LPS을 추가하여 4시간 동안 활성화하였다. 그 후, 상기 배양액의 상층액을 거둬 불순물(cellular debris)을 0.2 μm의 실린지 필터(syringe filter)를 이용해 여과하여, 제거함으로써, 세포조정배지를 준비하였다.Raw 264.7 cells cultured through the above procedure were pretreated with Compound 1 at a concentration of 0.1, 1, and 10 μg / ml for 2 hours, followed by addition of 1 μg / ml of LPS and activation for 4 hours. Thereafter, cellular debris was filtered through a syringe filter of 0.2 mu m by taking the supernatant of the culture solution, and then removed to prepare a cell regulating medium.

3) 지방세포 3T3-L1세포3) adipocytes 3T3-L1 cells

3T3-L1세포를 접종(seeding)한 후, 전-컨플루언스(post-confluence) 상태가 될 때까지 이틀마다 송아지 혈청(calf serum)이 포함된 배양액을 바꾸어 주며 기다린 후, 전-컨플루언스(post-confluence) 상태가 되었을 때, 0.5 mM의 IBMX, 10 μg/ml의 인슐린, 그리고 1 μM의 덱사메서손(dexamethasone)과 FBS가 포함된 배양액을 세포에 처리하였다. 이틀 뒤에 상층액을 버리고 d-PBS로 세포를 세척하고, 10 μg/ml의 인슐린을 넣은 FBS-배지로 48 시간동안 처리하였다. 그 후, FBS가 포함된 배지를 이틀마다 바꿔주며 4~6일동안 처리하였다. After 3T3-L1 cells were seeded, the culture medium containing calf serum was changed every two days until it became a post-confluence state, and after waiting for the pre-confluence, cells were treated with 0.5 mM IBMX, 10 μg / ml insulin, and 1 μM dexamethasone and FBS at the time of post-confluence. Two days later, the supernatant was discarded and the cells were washed with d-PBS and treated with FBS-medium supplemented with 10 μg / ml insulin for 48 hours. Thereafter, the medium containing FBS was changed every 2 days and treated for 4 to 6 days.

4) 실험과정4) Experimental process

상기 과정을 통해 분화된 지방세포 3T3-L1 세포에 조정배지(실험예 6-2))를 24시간 동안 처리하였다. 그 후, 트리아졸(trizol)을 이용하여 세포를 회수한 후, 제조사의 지시에 따라 trizol 시약(Gibco BRL)으로 LPS-처리한 3T3-L1 세포로부터 총 RNA를 분리하고, 사용전까지 -70 ℃에 보관하였다.Adipogenic 3T3-L1 cells differentiated through the above procedure were treated with conditioned medium (Experimental Example 6-2) for 24 hours. Thereafter, the cells were recovered using trizol, and total RNA was isolated from 3T3-L1 cells treated with LPS-treated trizol reagent (Gibco BRL) according to the manufacturer's instructions. Respectively.

RNA를 Reverse Transcription kit (Promega, USA)를 사용하여 역전사시켜서 cDNA를 수득하였다. 이어, 상기 cDNA를 주형으로 사용한 정량적 실시간 PCR(qPCR)을 CFX96TM 및 Chromo4TM real-time PCR detector (Bio-Rad)를 포함하는 KAPATM SYBR FAST qPCR (KAPABIOSYSTEMS)를 사용하여 수행함으로써, TNF-α, IL-6, IL-1β, Rantes, MCP-1 및 아디포넥틴(adioponectin)의 mRNA 수준을 측정하고 이를 비교하였다. 결과는 도 9, 도 10에 나타내었다.RNA was reverse transcribed using Reverse Transcription kit (Promega, USA) to obtain cDNA. Next, quantitative real-time PCR (qPCR) using the cDNA as a template was carried out using KAPATM SYBR FAST qPCR (KAPABIOSYSTEMS) containing CFX96TM and Chromo4TM real-time PCR detector (Bio-Rad) MRNA levels of TNF-α, IL-6, IL-1β, Rantes, MCP-1 and adiponectin were measured and compared. The results are shown in FIG. 9 and FIG.

도 9는 화학식 1의 화합물(실시예 1)을 농도별로 처리한 세포조정배지로 배양된 3T3-L1 세포에서 TNF-α(a), IL-6(b) 및 IL-1β(c)의 mRNA 발현을 나타낸 결과 그래프이고, 도 10은 화학식 1의 화합물(실시예 1)을 농도별로 처리한 세포조정배지로 배양된 3T3-L1 세포에서 MCP-1(a), Rantes(b) 및 아디포넥틴(adioponectin)(c)의 mRNA 발현을 나타낸 결과 그래프이다.FIG. 9 is a graph showing the mRNAs of TNF-α (a), IL-6 (b) and IL-1β (c) in 3T3-L1 cells cultured with the cell- (A), Rantes (b) and adiponectin (b) in 3T3-L1 cells cultured with the cell-conditioned medium treated with the compound of the formula (1) ) < / RTI > (c).

도 9 및 도 10에 나타난 바와 같이 본 발명의 화학식 1의 화합물은 리포다당류로 활성화시키고, 화학식 1의 화합물(실시예 1)을 농도별로 처리하여 배양한 대식세포 Raw 264.7 세포의 배양액을 세포조정배지로 이용함으로써, 여기에 지방세포를 배양한 결과, 지방세포 3T3-L1에서 TNF-α, IL-6, IL-1β 및 MCP-1, Rantes 전사인자 mRNA의 생성이 억제되는 것을 확인하였다. 이에 반해 아디포넥틴(adioponectin)의 활성은 촉진하는 것을 확인하였다.
As shown in FIG. 9 and FIG. 10, the compound of Chemical Formula 1 of the present invention was activated with lipopolysaccharide, treated with the compound of Chemical Formula 1 (Example 1) at various concentrations, and the culture solution of macrophage Raw 264.7 cells was cultured in a cell- As a result, it was confirmed that the production of TNF-α, IL-6, IL-1β, MCP-1 and Rantes transcription factor mRNA was suppressed in adipocyte 3T3-L1. On the other hand, it was confirmed that the activity of adiponectin is promoted.

실험예 9. 화학식 1의 화합물에 의한 p38, ERK, JNK 및 p65 발현 분석.EXPERIMENTAL EXAMPLE 9. Analysis of expression of p38, ERK, JNK and p65 by the compound of formula (1).

실험예 8의 과정을 통해 분화된 지방세포 3T3-L1 세포에 조정배지를 24 시간동안 처리한 후, 상기 지방세포에서의 p38, ERK, JNK 및 p65의 발현 정도를 알아보기 위하여, 웨스턴 블롯분석을 수행하였다. 웨스턴 블롯분석은 실험예 4과 동일한 방법으로 수행하였다.In order to examine the expression level of p38, ERK, JNK and p65 in the adipocytes after treating the differentiated adipocytes 3T3-L1 cells with the conditioned media for 24 hours, Western blot analysis Respectively. Western blot analysis was carried out in the same manner as in Experimental Example 4.

도 11은 화학식 1의 화합물(실시예 1)을 농도별로 처리한 세포조정배지로 배양된 3T3-L1 세포에서 p38, ERK, JNK의 발현수준을 분석하여 나타낸 웨스턴 블롯 사진이고, 측면의 그래프는 p-p38/p38, p-Erk/Erk, p-JNK/JNK의 발현 수준을 수치적으로 비교 분석하여 나타낸 것이다.FIG. 11 is a Western blot photograph showing the expression levels of p38, ERK and JNK in 3T3-L1 cells cultured on a cell-conditioned medium treated with the compound of formula (1) (Example 1) p38 / p38, p-Erk / Erk, p-JNK / JNK.

도 12는 화학식 1의 화합물(실시예 1)을 농도별로 처리한 세포조정배지로 배양된 3T3-L1 세포에서 p65의 발현수준을 분석하여 나타낸 웨스턴 블롯 사진이고, 하단의 그래프는 p-p65/p65의 발현 수준을 수치적으로 비교 분석하여 나타낸 것이다. FIG. 12 is a Western blot photograph showing the expression level of p65 in 3T3-L1 cells cultured with a cell-regulated medium treated with the compound of formula (1) (Example 1) at a concentration, and the graph at the bottom shows p-p65 / p65 And the level of expression of these genes is shown by numerical comparison and analysis.

도 11 및 도 12에 나타난 바와 같이, 본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물은 p38, ERK, JNK 뿐만 아니라 p65의 활성도 줄어든 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 화학식 1로 표시되는 화합물이 지방세포의 염증을 효과적으로 억제를 시킴으로써 비만의 완화시킬 수 있는 역할을 할 수 있다는 것을 확인하였다.
As shown in FIG. 11 and FIG. 12, it was confirmed that the compound represented by the general formula (1) of the present invention had decreased p65 activity as well as p38, ERK and JNK. Therefore, it has been confirmed that the compound represented by the formula (1) can play a role of relieving obesity by effectively inhibiting inflammation of adipocytes.

하기에 본 발명의 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.Hereinafter, formulation examples of the composition of the present invention will be described, but the present invention is not intended to be limited thereto but is specifically described.

제제예 1. 산제의 제조Preparation Example 1. Preparation of powder

실시예 1의 화합물(화학식 1) 분말 500 mg500 mg of a powder of the compound of Example 1 (Formula 1)

유당 100 mgLactose 100 mg

탈크 10 mgTalc 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
The above components are mixed and filled in airtight bags to prepare powders.

제제예 2. 정제의 제조Formulation Example 2. Preparation of tablets

실시예 1의 화합물(화학식 1) 분말 300 mgThe compound of Example 1 (Formula 1) 300 mg

옥수수전분 100 mgCorn starch 100 mg

유당 100 mgLactose 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mgMagnesium stearate 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
After mixing the above components, tablets are prepared by tableting according to the usual preparation method of tablets.

제제예 3. 캅셀제의 제조Formulation Example 3. Preparation of capsules

실시예 1의 화합물(화학식 1) 분말 200 mg200 mg of the powder of the compound of Example 1 (Formula 1)

결정성 셀룰로오스 3 mgCrystalline cellulose 3 mg

락토오스 14.8 mgLactose 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mgMagnesium stearate 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
The above components are mixed according to a conventional capsule preparation method and filled in gelatin capsules to prepare capsules.

제제예 4. 주사제의 제조Formulation Example 4. Preparation of injection

실시예 1의 화합물(화학식 1) 분말 600 mg600 mg of a powder of the compound of Example 1 (Formula 1)

만니톨 180 mg180 mg mannitol

주사용 멸균 증류수 2974 mgSterile sterilized water for injection 2974 mg

Na2HPO4,12H2O 26 mgNa2HPO4, 12H2O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플 당 상기의 성분 함량으로 제조한다.
It is prepared by the above-mentioned component content per ampoule according to the usual injection preparation method.

제제예 5. 액제의 제조Formulation Example 5. Preparation of a liquid preparation

실시예 1의 화합물(화학식 1) 분말 4 g4 g of the powder of the compound of formula 1 (formula 1)

이성화당 10 g10 g per isomer

만니톨 5 g5 g mannitol

정제수 적량Purified water quantity

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100g으로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.
Each component was added and dissolved in purified water according to the usual liquid preparation method, and the lemon flavor was added in an appropriate amount. Then, the above components were mixed, and purified water was added thereto. The whole was adjusted to 100 g with purified water, To prepare a liquid agent.

제제예 6. 과립제의 제조Preparation Example 6 Preparation of Granules

실시예 1의 화합물(화학식 1) 분말 1,000 mgCompound of Example 1 (Formula 1) 1,000 mg of powder

비타민 혼합물 적량Vitamin mixture quantity

비타민 A 아세테이트 70 ug70 ug of vitamin A acetate

비타민 E 1.0 mgVitamin E 1.0 mg

비타민 B1 0.13 mgVitamin B1 0.13 mg

비타민 B2 0.15 mg0.15 mg of vitamin B2

비타민 B6 0.5 mgVitamin B6 0.5 mg

비타민 B12 0.2 ugVitamin B12 0.2 ug

비타민 C 10 mgVitamin C 10 mg

비오틴 10 ugBiotin 10 ug

니코틴산아미드 1.7 mgNicotinic acid amide 1.7 mg

엽산 50 ugFolic acid 50 ug

판토텐산 칼슘 0.5 mgCalcium pantothenate 0.5 mg

무기질 혼합물 적량Mineral mixture quantity

황산제1철 1.75 mg1.75 mg of ferrous sulfate

산화아연 0.82 mg0.82 mg of zinc oxide

탄산마그네슘 25.3 mgMagnesium carbonate 25.3 mg

제1인산칼륨 15 mgPotassium monophosphate 15 mg

제2인산칼슘 55 mgSecondary calcium phosphate 55 mg

구연산칼륨 90 mgPotassium citrate 90 mg

탄산칼슘 100 mgCalcium carbonate 100 mg

염화마그네슘 24.8 mgMagnesium chloride 24.8 mg

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 과립제에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 과립제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강기능식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
The composition ratio of the above-mentioned vitamins and minerals is comparatively comparatively mixed with the granules according to the preferred embodiment. However, the blending ratio may be arbitrarily changed, and the above components are mixed according to the ordinary granule preparation method, Can be prepared and used in the manufacture of a health functional food composition according to a conventional method.

제제예 7. 기능성 음료의 제조Preparation Example 7. Preparation of functional beverage

구연산 1,000 mgCitric acid 1,000 mg

올리고당 100 g100 g of oligosaccharide

매실농축액 2 gPlum concentrate 2 g

타우린 1 gTaurine 1 g

정제수를 가하여 전체 900 mLPurified water was added to the flask to obtain a total of 900 mL

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1 시간 동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 기능성 음료 조성물 제조에 사용한다.The above components were mixed according to a conventional health drink manufacturing method, and the mixture was stirred and heated at 85 DEG C for about 1 hour. The solution thus prepared was filtered and sterilized in a sterilized 2 L container, It is used in the production of the functional beverage composition of the invention.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.Although the composition ratio is a mixture of the components suitable for the preferred beverage as a preferred embodiment, the compounding ratio may be arbitrarily varied depending on the regional and national preferences such as the demand level, the demanding country, and the intended use.

Claims

Claims 1. A pharmaceutical composition for preventing or treating obesity, comprising a compound of the formula (1) and a pharmaceutically acceptable salt thereof.
[Chemical Formula 1]

The method according to claim 1,
These compounds inhibit the expression of inflammatory cytokines TNF-α, IL-6, IL-1β, MCP-1 and Rantes induced in LPS (lipopolysaccharide) in macrophages (Raw 264.7) and adipocytes (3T3-L1) Or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

The method according to claim 1,
The compound inhibits the PI3k / Akt signaling pathway of macrophages (Raw 264.7), activates the AMPK / SIRT1 signaling pathway, inhibits the activity of p65, thereby preventing or treating obesity by inhibiting inflammation of adipocytes Or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

The method according to claim 1,
Wherein said obesity is caused by inflammation of macrophage-mediated fat cells.

1. A food composition for preventing or improving obesity comprising a compound of the formula (1) and a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
[Chemical Formula 1]

6. The method of claim 5,
Wherein the obesity is caused by inflammation of macrophage-mediated fat cells.