KR101813193B1 - 3차원 하이브리드 바이오 스캐폴드를 위한 박테리아 셀룰로오스를 가지는 탄소나노튜브의 인시츄 하이브리드화 - Google Patents

Abstract

본원은 개질된 탄소 구조체를 포함하는 in-situ 3차원 하이브리드 스캐폴드 및 상기 스캐폴드의 제조방법에 관한 것이다.

Description

3차원 하이브리드 바이오 스캐폴드를 위한 박테리아 셀룰로오스를 가지는 탄소나노튜브의 인시츄 하이브리드화{IN SITU HYBRIDIZATION OF CARBON NANOTUBES WITH BACTERIAL CELLULOSE FOR THREE-DIMENSIONAL HYBRID BIOSCAFFOLDS}

본원은 개질된 탄소 구조체를 포함하는 3차원 in-situ 하이브리드 스캐폴드 및 상기 스캐폴드의 제조방법을 제공하고자 한다.

셀룰로오스 자원을 활용하고자 하는 연구는 신소재 및 신에너지에 대한 인간의 요구를 충족시킬 수 있는 가장 중요한 분야 중 하나이다. 대부분의 셀룰로오스는 식물에서 유래되는 것으로 알려졌으나, 1886년 Brown에 의해서 박테리아에서도 특유의 멤브레인 형태의 셀룰로오스를 합성한다고 보고되었다. 식물체 셀룰로오스가 리그닌, 펙틴, 헤미셀룰로오스 및 기타 곁가지가 결합되어있는 이질 다당(heteropolysaccharide)인 것과 달리, 박테리아 셀룰로오스(bacterial cellulose, 이하 "BC"라고도 함)는 불순물을 포함하지 않는 순수한 글루코오스 결합으로 이루어진 동질 다당(homopolysaccharide)으로 수소결합에 의한 3차원적 망상구조를 이루고 있다.

대한민국 공개특허 제10-2016-0039006호에 따르면, 생체고분자 재질의 3D 열린 채널이 형성된 스캐폴드는 조직 공학을 위한 유망한 매트릭스 후보물질로 개시되어있다. 박테리아 셀룰로오스를 기질로 하여 이러한 기능성을 가진 스캐폴드를 생성하기 위해 종래에는 박테리아 셀룰로오스에 기능성을 부여하기 위하여 침지법을 주로 이용하고 있었다. 그러나 박테리아 셀룰로오스의 치밀한 구조로 인하여 침지법에 의해서는 박테리아 셀룰로오스 내부로 기능성 물질이 들어가기에는 많은 제한적 요소가 있었다.

탄소나노튜브는 생의학 분야에 있어서, 그 세포기능 향상 능력 및 직접 분화(direct differentiation)로 인해 커다란 관심을 받아왔다. 특히, 조골세포 기능, 뼈의 칼슘화, 및 간엽줄기세포의 골형성 촉진 등에 있어 촉망되는 기능성 나노 물질이다. 이와 같이, 탄소나노튜브는 생의학 분야에서 큰 잠재력을 가지고 있으나, 박테리아 셀룰로오스와 혼성화가 일어나기에는 소수성 탄소나노튜브와 친수성 박테리아 셀룰로오스간의 결합 에너지(binding energy)가 지나치게 작고, 탄소나노튜브간의 반데르발스 상호작용에 의해 서로 응집하려는 경향이 커 박테리아 셀룰로오스에 고르게 분포되지 못하는 문제점이 있었다.

본원은 개질된 탄소 구조체를 포함하는 3차원 하이브리드 스캐폴드 및 상기 스캐폴드의 제조방법을 제공한다.

그러나, 본원이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한 되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본원의 제 1 측면은, 3차원 미세다공성(microporous) 박테리아 셀룰로오스 (bacterial cellulose)에 분산된 개질된 탄소 구조체를 포함하며, 상기 개질된 탄소 구조체는 양친매성(amphiphilic) 고분자에 의하여 코팅된 것인, 3차원 하이브리드 스캐폴드를 제공한다.

본원의 제 2 측면은, 박테리아 셀룰로오스 배양용 세포를 예비 배양하는 단계; 탄소 구조체를 양친매성 고분자에 의하여 개질하여 개질된 탄소 구조체를 형성하는 단계; 및 상기 개질된 탄소 구조체를 배양 배지에 첨가한 후 상기 예비 배양된 박테리아 셀룰로오스 배양용 세포를 첨가하여 배양함으로써 상기 개질된 탄소 구조체를 상기 박테리아 셀룰로오스와 in-situ 혼성화하는 단계를 포함하는, 3차원 하이브리드 스캐폴드의 제조방법을 제공한다.

본원의 구현예들에 의하여, 개질된 탄소 구조체는 양친매성 고분자를 도입하여 상기 양친매성 고분자의 친수성 곁가지에 의해 상기 탄소 구조체의 콜로이드 분산용액의 안정성을 강화하고, 상기 양친매성 고분자가 상기 탄소 구조체와 박테리아 셀룰로오스간의 커플링제(coupling agent) 역할을 하기 때문에 상기 탄소 구조체 간에 입체장애(steric hinderance)를 형성할 수 있다. 따라서, 소수성의 탄소 구조체와 친수성의 박테리아 셀룰로오스간의 강한 상호작용을 가능하게 하여, 탄소 구조체와 박테리아 셀룰로오스가 안정적으로 in-situ 혼성화할 수 있다. 즉, 상기 양친매성 고분자가 고체/액체 계면에 흡착되어 계면에너지를 저하시켜 분산계의 고유한 열역학적 불안정도를 감소시키고, 분산 입자 간의 입체적 반발력을 증대시키고 응집을 저지하는 배향흡착 층을 형성하여 분산입자 주위에 용매층을 형성하는 것이라 설명할 수 있다. 이에 따라, 미세다공성 박테리아 셀룰로오스에 상기 개질된 탄소 구조체가 고르게 분산되어 있는 전도성을 나타내는 박테리아 셀룰로오스를 생산할 수 있으며, 침지방법에 의하여 생성된 스캐폴드보다 전도성이 높다. 또한, 배양 배지에 포함된 탄소 구조체의 농도를 조절함으로써 하이브리드 스캐폴드의 전도성을 조절할 수 있고, 보다 다양하고 수월한 제조기술로 발전할 가능성이 있다.

본원의 구현예에 따른 제조 방법에 의하여, 박테리아 셀룰로오스 생산 균주의 배양시, 배양액에 양친매성 고분자로 개질된 탄소 구조체를 첨가하여, 전도성을 나타내는 박테리아 셀룰로오스를 생산하는 간단한 방법으로서, 박테리아의 활성에 저해를 주지 않으면서, 장기간의 배양액 환경에 대한 분산 안정성을 획득할 수 있다. 따라서, 분산성이 우수한 개질된 탄소 구조체는 박테리아 셀룰로오스 내부 층상구조 나노섬유와 네트워크를 형성하며, 이를 통해 층상 구조의 전도성 탄소 구조체의 구조도 기대할 수 있다.

본원의 구현예들에 의하여, 조직 공학적 측면에서, 3차원 하이브리드 스캐폴드는 높은 뼈 재생 효능으로 이끄는 우수한 골전도성(osteoconductivity) 및 골형성 유도성(osteoinductivity)를 보여준다. 이는 결과적으로, in vivo 이식되었을 때, 높은 뼈 재생 효능을 야기할 수 있다. 특히, 그 구조는 뼈 이식재로서 유리하다. 본원의 구현예들에 따른 3차원 하이브리드 스캐폴드를 형성하는 나노-스케일의 박테리아 셀룰로오스 섬유들은 모두 뼈 재생에 필수적인 요소들인, 세포부착, 증식, 알칼리 포스파타제 합성, 및 세포 외 칼슘 축적에 유리하다. 상기 수득된 3차원 하이브리드 스캐폴드는 골형성 분화에 적절한 기계적 세기를 나타낸다. 또한, 개질된 탄소 구조체를 둘러싼 하이드로겔-유사 박테리아 셀룰로오스 층들은 미세다공성을 가짐으로써 다양한 성장 인자를 보유하기 위한 저장소로서 작용할 수 있을 것이며, 이것은 이후 뼈 재생을 촉진하는 세포 분화를 향상시킬 수 있다.

뿐만 아니라, 뼈 재생을 위한 in vivo 이식 후, 국부적 염증 반응을 최소화하고, 새롭게 형성된 뼈와 잘 융합된다. 유사하게, in vivo 이식될 때, 박테리아 셀룰로오스는 어떠한 염증 유발도 없이 호스트 조직내에 잘 융합된다. 박테리아 셀룰로오스는 어떠한 원치 않는 생화합물없이 셀룰로오스만으로 구성되며, 이것은 통상적으로 사용되는 스캐폴드 물질인 콜라겐과 비교하여, 덜 면역-자극적이다.

또한, 본원의 구현예들에 의한 3차원 하이브리드 스캐폴드의 이식은 높은 골밀도를 갖는 새로운 뼈 형성을 촉진한다. 본원 발명에 의한 상기 뼈 재생 효능은 Col-BMP-2 스캐폴드의 것과 비교할만하다. 임상적으로 사용되는, 콜라겐 스펀지와 BMP-2의 조합은, 콜라겐 스펀지가 세포 이동을 위한 골전도성 물질로서 작용하고 가장 강력한 골전도성 요소인 BMP-2를 전달할 수 있기 때문에 뼈 재생에 있어서 매우 효과적인 것이 증명되었다. 그러나, BMP-2가 뼈 재생 촉진에 있어서 효율적이라고 증명되었음에도 불구하고, in vivo에서 고비용, 큰 복용량의 요구, 및 짧은 반감기 등의 몇몇 문제점을 갖는다. 따라서, 본원에 있어서, 외인성 BMP-2없이 새로운 뼈 형성을 촉진하는 본원의 3차원 하이브리드 스캐폴드의 우수한 골전도성 주변 환경으로부터 (결합 부위로의 골형성 세포의 이동) 및 골형성 유도성(골형성 분화의 촉진)을 활용하였다.

본원의 구현예들에 있어서, 대뇌피질 구조적 특성을 모방한 본원 발명에 따라 제조된 3차원 하이브리드 스캐폴드는 대뇌피질이 손상된 동물 모델에 직접적으로 이식하여 적용함으로써, 뇌 조직 재생 촉진이 가능하다. 본원의 구현예들에 있어서, 3차원 하이브리드 스캐폴드는 실제 뇌조직의 기계적 물성과 매우 유사한 성질을 가지며 생체적합성 또한 우수하다. 성능평가를 위해 세포실험 및 동물실험을 진행시, 본원의 구현예들에 의한 3차원 하이브리드 스캐폴드에서 키운 신경줄기세포의 신경돌기가 일반 박테리아 셀룰로오스 스캐폴드에서 보다 더 활발히 성장하며, 뇌 조직이 손상된 동물모델에서도 본원의 3차원 하이브리드 스캐폴드가 이식된 그룹에서 뇌 조직의 재생이 가능함이 확인된다.

도 1a 내지 도 1e는, 탄소나노튜브의 분산에 있어 양친매성 고분자의 역할을 보여주는 도면이다.
도 2a 내지 도 2d는, 양친매성 고분자에 의한 탄소나노튜브-박테리아 셀룰로오스의 혼성화 유도를 보여주는 도면이다.
도 3a 내지 도 3c는, 탄소나노튜브와 박테리아 셀룰로오스의 혼성화에 대한 분석 이미지이다.
도 4는, CNT-BC-Syn의 TGA분석에 의한 온도에 따른 중량 손실의 그래프이다.
도 5a 내지 도 5d는, CNT-BC-Syn의 3D 하이브리드 스캐폴드에서 CNTs의 균일한 분포 및 CNT-BC-Imm 스캐폴드 표면의 CNTs 축적을 나타내는 분석 도면이다.
도 6a 내지 도 6c는, 쥐의 두개골에 대한 3차원 in-situ 하이브리드 스캐폴드의 뼈 재생 효능을 나타내는 도면이다.
도 7은, 양친매성 고분자의 그래핀 옥사이드(이하 "GO"라고도 함)코팅 과정 및 BC와의 in-situ 혼성화를 나타내는 도식도이다.
도 8a 및 도 8b는, GO-BC의 in-situ 하이브리드 스캐폴드의 제조 공정를 모식적으로 나타낸 도면 및 그 제조 결과물의 이미지이다.
도 9는, 그래핀 옥사이드 나노입자가 함유된 박테리아 셀룰로오스 복합 나노 섬유의 전자현미경 이미지이다.
도 10a 내지 도 10c는, 쥐에 이식된 BC 및 GO-BC in-situ 하이브리드 스캐폴드에서 성장된 F3-effluc 세포의 바이오 형광이미지 및 그 성장수치를 나타내는 도면이다.
도 11은, 쥐의 손상된 뇌조직에 F3-effluc 세포와 GO-BC 하이브리드 스캐폴드를 함께 이식한 그룹(GO-BC/cell), 세포와 BC 스캐폴드를 함께 이식한 그룹 (BC/cell), 세포만 넣은 그룹 (cell only)의 12일 후의 조직 H&E 염색 사진이다.

이하, 첨부한 도면을 참조하여 본원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본원을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 "연결"되어 있다고 할 때, 이는 "직접적으로 연결"되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 소자를 사이에 두고 "전기적으로 연결"되어 있는 경우도 포함한다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부재가 다른 부재 "상에" 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 부재가 다른 부재에 접해 있는 경우뿐 아니라 두 부재 사이에 또 다른 부재가 존재하는 경우도 포함한다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다.

본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "~(하는) 단계" 또는 "~의 단계"는 "~를 위한 단계"를 의미하지 않는다.

본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합(들)"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.

본원 명세서 전체에서, "A 및/또는 B"의 기재는, "A 또는 B, 또는 A 및 B"를 의미한다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본원의 구현예 및 실시예를 상세히 설명한다. 그러나, 본원이 이러한 구현예 및 실시예와 도면에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 제 1 측면은, 3차원 미세다공성(microporous) 박테리아 셀룰로오스 (bacterial cellulose)에 분산된 개질된 탄소 구조체를 포함하며, 상기 개질된 탄소 구조체는 양친매성(amphiphilic) 고분자에 의하여 코팅된 것인, 3차원 하이브리드 스캐폴드를 제공한다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 박테리아 셀룰로오스는 미세다공성 나노 섬유(nanofibril) 형태를 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 박테리아 셀룰로오스의 3D-미세다공성 구조는 스캐폴드에 세포 부착, 이동, 성장, 및 조직 형성에 충분한 표면적과 공간을 제공하기 위해 요구되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 탄소 구조체는 탄소나노튜브, 그래핀, 그래핀 옥사이드, 환원된 그래핀 옥사이드, 그래핀 양자점(graphene quantum dot), 플러렌(fullerene) 및 이들의 조합들로 이루어지는 군에서 선택되는 탄소 구조체를 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 상기 탄소 구조체는 전도성을 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 양친매성 고분자는 소수성 주사슬(backbone)과 친수성 곁사슬(side chains)을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 양친매성 고분자는 메틸 메타크릴레이트(methyl methacrylate, 이하, "MMA"라고도 함), 하이드록실-폴리(옥시에틸렌) 메타크릴레이트(hydroxyl-poly(oxyethylene) methacrylate, 이하, "HPOEM"라고도 함), 및 폴리(에틸렌 글라이콜) 메틸 에터 메타크릴레이트[poly(ethylene glycol) methyl ether methacrylate, 이하, "POEM"라고도 함]를 포함하는 터폴리머(terpolymer)를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 양친매성 고분자는 61%의 MMA, 21%의 HPOEM, 및 18%의 POEM의 비율로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 하이브리드 스캐폴드는 상기 탄소 구조체가 상기 양친매성 고분자에 의해 코팅되어 형성된 코어-쉘(core-shell) 구조를 포함하는 개질된 탄소 구조체를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 양친매성 고분자의 상기 소수성 주사슬이 소수성-소수성 상호작용에 의해 탄소나노튜브와 같은 탄소 구조체에 부착되었고, 상기 친수성 곁사슬은 탄소나노튜브와 같은 탄소 구조체의 주위를 랩핑(wrapping)하여 양친매성 표면을 형성하였음을 나타내었으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 3차원 하이브리드 스캐폴드는, 상기 개질된 탄소 구조체는 상기 탄소 구조체의 소수성 표면과 상기 양친매성 고분자에 포함된 상기 소수성 주사슬 사이의 소수성-소수성 상호작용에 의하여 의하여 상기 탄소 구조체의 표면에 상기 양친매성 고분자가 코팅된 것이고, 상기 박테리아 셀룰로오스의 친수성 작용기와 상기 개질된 탄소 구조체에 코팅된 상기 양친매성 고분자에 포함된 친수성 곁사슬 사이의 친수성-친수성 상호인력에 의하여 상기 개질된 탄소 구조체가 상기 3차원 미세다공성 박테리아 셀룰로오스 내에 분산되어 있는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 개질된 탄소 구조체에서 상기 양친매성 고분자는 그 친수성 곁가지에 의해 상기 탄소 구조체의 콜로이드 안정성을 강화하고, 소수성의 탄소 구조체와 친수성의 박테리아 셀룰로오스간의 강한 상호작용을 가능하게 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 개질된 탄소 구조체는 상기 3차원 미세다공성 구조의 박테리아 셀룰로오스에 분산되어 있는 것일 수 있다. 상기 박테리아 셀룰로오스가 미세다공성을 갖도록 함으로써 스캐폴드로서 적용시, 세포 배양을 위한 공간이 확보되도록 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 일 구현예에 있어서, 조직 공학적 측면에서, 본원 발명에 따라 제조된 3차원 in-situ 하이브리드 스캐폴드는 높은 뼈 재생 효능으로 이끄는 우수한 골전도성(osteoconductivity) 및 골형성 유도성(osteoinductivity)를 보여준다. 이는 결과적으로, in vivo 이식되었을 때, 높은 뼈 재생 효능을 야기할 수 있다. 특히, 그 구조는 뼈 이식재로서 유리하다. 뿐만 아니라, 뼈 재생을 위한 in vivo 이식 후, 국부적 염증 반응을 최소화하고, 새롭게 형성된 뼈와 잘 융합된다. 유사하게, in vivo 이식될 때, 박테리아 셀룰로오스는 어떠한 염증 유발도 없이 호스트 조직내에 잘 융합된다. 박테리아 셀룰로오스는 어떠한 원치 않는 생화합물없이 셀룰로오스만으로 구성되며, 이것은 통상적으로 사용되는 스캐폴드 물질인 콜라겐과 비교하여, 덜 면역-자극적이다. 또한, 본원의 3차원 하이브리드 스캐폴드의 이식은 높은 골밀도를 갖는 새로운 뼈 형성을 촉진한다. 다만, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 일 구현예에 있어서, 대뇌피질 구조적 특성을 모방한 본원 발명에 따라 제조된 3차원 in-situ 하이브리드 스캐폴드는 대뇌피질이 손상된 동물 모델에 직접적으로 이식하여 적용함으로써, 뇌 조직 재생 촉진이 가능하다. 본원의 3차원 하이브리드 스캐폴드는 실제 뇌조직의 기계적 물성과 매우 유사한 성질을 가지며 생체적합성 또한 우수하다. 성능평가를 위해 세포실험 및 동물실험을 진행시, 본원의 3차원 하이브리드 스캐폴드에서 키운 신경줄기세포의 신경돌기가 일반 박테리아 셀룰로오스 스캐폴드에서 보다 더 활발히 성장하며, 뇌 조직이 손상된 동물모델에서도 본원의 3차원 하이브리드 스캐폴드가 이식된 그룹에서 뇌 조직의 재생이 가능함이 확인된다. 다만, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 제 2 측면은, 박테리아 셀룰로오스 배양용 세포를 예비 배양하는 단계; 탄소 구조체를 양친매성 고분자에 의하여 개질하여 개질된 탄소 구조체를 형성하는 단계; 및 상기 개질된 탄소 구조체를 배양 배지에 첨가한 후 상기 예비 배양된 박테리아 셀룰로오스 배양용 세포를 첨가하여 배양함으로써 상기 개질된 탄소 구조체를 상기 박테리아 셀룰로오스와 in-situ 혼성화하는 단계를 포함하는, 3차원 하이브리드 스캐폴드의 제조방법을 제공한다.

본원의 제 1 측면과 중복되는 부분들에 대해서는 상세한 설명을 생략하였으나, 본원의 제 1 측면에 대해 설명한 내용은 본원의 제 2 측면에서 그 설명이 생략되었더라도 동일하게 적용될 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 박테리아 셀룰로오스 배양용 세포는 아세토박터(Acetobacter)속, 리조비움(Rhizobium)속, 및 아그로박테리움(Agrobacterium)속으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 균주 또는 글루콘아세토박터 자일리누스(G. xylinus)균주를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 탄소 구조체는 탄소나노튜브, 그래핀, 그래핀 옥사이드, 환원된 그래핀 옥사이드, 그래핀 양자점(graphene quantum dot), 플러렌(fullerene) 및 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택되는 탄소 구조체를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 양친매성 고분자는 소수성 주사슬(backbone)과 친수성 곁사슬(side chains)을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 양친매성 고분자는 메틸 메타크릴레이트(methyl methacrylate, MMA), 하이드록실-폴리(옥시에틸렌) 메타크릴레이트(hydroxyl-poly(oxyethylene) methacrylate, HPOEM), 및 폴리(에틸렌 글라이콜) 메틸 에터 메타크릴레이트[poly(ethylene glycol) methyl ether methacrylate, POEM]를 포함하는 터폴리머(terpolymer)를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 개질된 탄소 구조체는 상기 양친매성 고분자에 의해 코팅되 코어-쉘(core-shell) 구조를 형성하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 양친매성 고분자의 상기 소수성 주사슬이 소수성-소수성 상호작용에 의해 탄소나노튜브와 같은 탄소 구조체에 부착되었고, 상기 친수성 곁사슬은 탄소나노튜브와 같은 탄소 구조체의 주위를 랩핑(wrapping)하여 양친매성 표면을 형성하였음을 나타내었으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 개질된 탄소 구조체는 상기 탄소 구조체의 소수성 표면과 상기 양친매성 고분자에 포함된 상기 소수성 주사슬 사이의 소수성-소수성 상호작용에 의하여 의하여 상기 탄소 구조체의 표면에 상기 양친매성 고분자가 코팅된 것이고, 상기 박테리아 셀룰로오스의 친수성 작용기와 상기 개질된 탄소 구조체에 코팅된 상기 양친매성 고분자에 포함된 친수성 곁사슬 사이의 친수성-친수성 상호인력에 의하여 상기 개질된 탄소 구조체가 상기 3차원 미세다공성 박테리아 셀룰로오스 내에 분산되어 있는 3차원 하이브리드 스캐폴드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 개질된 탄소 구조체 형성 단계는 상기 양친매성 고분자와 상기 탄소 구조체의 혼합 용액을 초음파 처리하는 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 박테리아 셀룰로오스는 미세다공성 나노섬유(nanofibril) 형태를 갖는 것이고, 상기 개질된 탄소 구조체는 상기 박테리아 셀룰로오스 내에 분산되어 있는 것일 수 있다. 상기 박테리아 셀룰로오스가 미세다공성을 갖도록 함으로써 스캐폴드로서 적용시, 세포 배양을 위한 공간이 확보되도록 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이하, 본원에 대하여 실시예를 이용하여 좀더 구체적으로 설명하지만, 하기 실시예는 본원의 이해를 돕기 위하여 예시하는 것일 뿐, 본원의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

1. 탄소 구조체로서 탄소나노튜브(이하 " CNT "라고도 함)를 이용한 3차원 하이브리드 스캐폴드의 제조, 분석 방법 및 in vivo 적용 분석 방법

(1) 양친매성 빗모양 고분자(이하 " APCLP "라고도 함)의 제조 및 개질된 탄소나노튜브(이하 " CNT "라고도 함)의 제조

APCLP는 MMA(Aldrich), 폴리(에틸렌 글라이콜)메타크릴레이트(Aldrich, Mn 360 g/mol, 여기서 n = 6), 및 폴리(에틸렌 글라이콜)메틸에터메타크릴레이트(Aldrich, Mn 475 g/mol, 여기서 n = 9), 테트라하이드로퓨란에서 18시간 동안 자유 라디칼 폴리머화에 의해 합성되었다. CNT(순도>95%, 일진 나노테크㈜, 한국)는 화학기상 증착법에 의해 제조되었으며, 별도의 정제 또는 처리 없이 사용되었다. CNT는 외경이 약 10-20 nm이고, 길이가 약 150-200 μm로 측정되었다. 총 1 mg의 CNT가 10 mL의 APCLP 용액(30% 에탄올, 0.001% APCLP)에 첨가되었고, 이후에 샘플들은 혼(horn)-타입 초음파 발생기(Fischer Scientific Co., USA)를 이용하여 상온에서 진동수 23 kHz 및 30 W의 전력으로 20분 동안 초음파 처리되었다. 콜로이드 안정성은 UV-vis 분광기(UV-3600, Shimadzu, Japan)를 이용하여 측정되었다.

(2) G. xylinus 배양

G. xylinus(KCCM 40216)는 한국 미생물 배양 센터로부터 수득되었다. 박테리엄은 2.5% (w/w) 만니톨, 0.5% (w/w) 이스트 추출물, 및 0.3 % (w/w) 박토-펩톤(bacto-peptone)으로 구성된 배지에서 배양되었다. 상기 배양배지는 오토클레이브에서 120℃ 에서 20분간 살균되었고, 500 mL 플라스크에 부어졌다. 모든 실험을 위한 그 예비-접종물은 한천 배양 배지에서 성장된 단일의 G. xylinus 집단을 만니톨 배양 배지로 채워진 100 mL 삼각 플라스크로 이동시킴으로써 제조되었다. 최상의 배양 조건은 실험적으로 결정되었다.

(3) 컴퓨터를 사용한 분석

CNT, 폴리머, 및 셀룰로오스 간의 결합 메커니즘을 설명하기 위해, 우리는 Vienna ab initio simulation package(VASP)를 이용하여 일반화된 기울기 근사(generalized gradient approximation, GGA)내의 밀도 함수 이론(density functional theory, DFT) 계산을 하였다. VASP에서 시행된 projector augmented wave (PAW) 포텐셜은 원자 중심으로부터의 포텐셜을 설명하기 위해 사용되었다. 평면파 기준한 에너지 컷오프는 GGA에서 400 eV로 설정하였다. 기하학적 구조는 원자에 작용하는 Hell-man-Feynman 힘이 0.03 eV/Å보다 작아질 때까지 최적화되었다. 결합 메커니즘의 조사를 위해, 양친매성 빗(comb) 모양의 폴리머(MMA와 HPOEM)들은 셀룰로오스와 CNT의 사이에 있는 것으로 간주된다. 그것들간의 약한 반데르발스 상호작용을 포함하기 위해, 우리는 반실험적인 GGA-type 이론에 근거한 Grimme's DFT-D2 반데르발스 보정을 채택했다. 브릴루인 영역의 상호작용을 위해 우리는 3 x 1 x 1 grid inMonkhorst-Pack special k-point scheme을 사용했다. 광범위 동적 시스템의 CNT-BC 혼성체의 행동을 설명하기 위해 우리는 상온(300 K)에서 CNT-BC 혼성체 구조의 분자 동역학(MD) 시뮬레이션을 실행하였다. 우리는 12.5 ps의 a reactive force eld(ReaxFF) potential으로 광범위 원자/분자 대량병렬 시뮬레이터(Large-scale Atomic/Molecular Massively Parallel Simulator, LAMMPS)를 이용해 원자/분자 MVT-MD 시뮬레이션을 실행했다.

(4) CNT -박테리아 셀룰로오스(이하 "BC"라고도 함)혼성체(hybrid)의 제조

예비 배양된 배양세포 서스펜션이 1 x 10^-3% (w/v) 다중벽의 CNT가 분산된 배양 배지(pH 6.0)내에 1 : 10의 비율로 주입되었고, 28℃에서 2주 동안 배양되었다. 상기 배지에서 생합성된 BC를 포함한 CNT(CNT-BC) 멤브레인(membrane) 간단히 수집되었고, 1wt%의 수산화나트륨에서 2시간 동안 90℃로 가열하여 정제되었다. 이어서, 상기 멤브레인은 흐르는 증류수를 이용하여 전체적으로 세척되었고, 그리고 나서 세포 잔해와 배양액 성분을 제거하기 위해 1wt% 수산화나트륨 수용액에서 24시간 동안 상온에서 침지되었다. 이어서, 그 pH는 증류수에 의한 반복적 세척에 의해 7.0으로 감소되었다. 그 다음, 상기 멤브레인은 1wt%의 소듐 하이포아염소산 수용액에서 2시간 동안 침지하여 탈색(bleach)된 후, 흐르는 증류수를 이용하여 pH 7에 이를 때까지 세척되었다. 마지막으로, 상기 멤브레인은 12시간 동안 60℃에서 진공 건조 되었다. 통상의 BC 멤브레인은 CNT없이 단일의 G. xylinus 집단을 만니톨 배양배지에서 하베스팅하고, 상술한 바와 같은 정제와 탈색을 통해 제조되었다. 증류수에 저장된 상기 멤브레인은 28℃ 의 1 x 10^-3 % (w/v)의 CNT가 분산된 배양 배지(pH 6.0)에 12시간 동안 침지되었다. 상기 BC 멤브레인은 흐르는 물에 세척되었고 60℃ 에서 12시간 동안 진공 건조 되었다.

(5) 스캐폴드의 분석

상기 샘플들은 투과 전자 현미경(transmission electron microscopy, TEM), 열중량 분석기(thermogravimetric analysis, TGA), 광학 현미경, 주사 전자 현미경(scanning electron microscopy, SEM), 라만 분광기, 원자력간 현미경(atomic force microscopy, AFM)에 의해 특성분석되었다. TEM(JEOL 2100, Japan) 분석은 200 kV에서 수행되었다.

TGA는 TA 기기 Q-5000 IR을 이용하여 질소 흐름 하에 수행되었다. 광학 현미경 분석을 위해 스캐폴드, BC, CNT-BC-Imm(침지법에 의해 생성된 하이브리드 스캐폴드), 및 CNT-BC-syn(본원에 의한 3차원 in-situ 하이브리드 스캐폴드)은 OCT 화합물에 포매되었고, -70℃에서 냉동되었다. 상기 샘플들은 10 μm 섹션으로 분할되었고, 광학현미경 (Zeiss, Germany)을 이용해 시각화되었다. SEM 분석을 위해, BC, CNT-BC-Imm, 및 CNT-BC-syn은 -70℃에서 냉동되었고, 하루 동안 동결 건조되었다. 샘플의 표면 모폴로지는 SEM(JSM-6330F, JEOL)을 이용해 5 kV의 가속 전압에서 관찰되었다. 라만 분광은 상부, 중부, 및 하부층으로부터 수득되었다. 라만 맵은 G peak(1560-1620 cm^-1) 밴드이다. 라만 분광은 Renishaw inVia micro-Raman 분광기 (λ laser = 514 nm, ~500 nm spot size, 100 x objector)를 사용하여 기록되었다. AFM 관찰 및 측정은 Park systems XE-100 주사 탐침 현미경에 의해 대기 조건에서 수행되었다. 실리콘 캔틸레버 NSC-36 C(Mikromasch Inc)는 10 nm의 곡률 반경(R_c)을 갖는 피라미드모양의 팁을 캔틸레버의 스프링 상수는 0.60 Nm^-1이 사용되었다. 위상 데이터는 스캐닝동안 10 nN의 압축 하중을 사용하였다. 위상 이미지를 얻은 후, z-스캐너 이동거리 대 힘 커브가 기록되었다. 데이터 획득 동안, 전진, 후진의 속도는 0.3 μm/s이었고, 표면에 가해진 최대 압축 하중은 40 nN이었다. 샘플의 Young's 계수(Young's modules,E)는 헤르츠식(Hertzian) 모델 및 방정식을 이용해 계산되었다. 푸아송 비(Poisson's ratio, v)는 0.5로 설정되었고, 인덴터의 포물선 구조가 설정되었다.

(6) In vivo 이식 실험

6주된, 암컷 ICR 쥐(Koatech, Pyeongtaek, Korea)들을 복강내 자일라진(xylazine, 10 mg kg^{- 1})과 케타민(ketamine, 100 mg kg^-1)으로 마취시켰다. 두피의 털을 제모한 뒤, 두개골의 중앙부를 코뼈로부터 목덜미 후부 라인까지 세로방향으로 절개하고 골막을 정수리 뼈의 표면이 노출되도록 들어올렸다. 수술용 트리핀 버(trephine bur, Ace Surgical Supply Co., Brockton, MA, USA)와 저속 마이크로모터를 사용하여, 2개의 골관통 결함(4 mm 지름, 원형)을 두개골에 만들었다. 상기 결함의 크기는 쥐의 두개골 결함 모델의 임계 결함 크기에 맞추었다. 상기 뚫린 부위는 식염수에 의해 세척되었고, 출혈 부위는 전기 소작되었다. 골막은 제거되었고 절대 회복되지 않았다. 상기 결함은 아무것도 채우지 않거나, BC, CNT-BC-Imm, CNTBC-Syn, 또는 Col-BMP-2 (그룹별 n = 6 이식체)에 의해 채워졌다. 그리고 상기 골막과 피부는 재흡수가능한 6-0 Vicryl® 수쳐스 (Ethicon, Edinburgh, UK)를 이용하여 층층이 덮였다. 쥐들은 수술 후 개별적으로 수용되었다. 이 실험은 서울대학교 동물실험윤리위원회(SNU-110121-3)에 의해 승인되었다. 상기 이식받은 쥐들은 수술 뒤 8주차에 분석을 위하여 회수되었다.

(7) 뼈 재생 분석

상기 이식이 있은지 8주 후, 상기 동물들은 안락사 되었으며, 그 두개골은 분석을 위해 수집되었다. 골 형성은 마이크로-CT 스캔 (그룹별 n = 4)에 의해 평가되었다. 마이크로-CT 이미지는 마이크로-CT 스캐너(SkyScan-1172; Skyscan, Belgium)를 이용하여 수득되었다. 마이크로-CT 이미징 후, 샘플들은 4% 파라포름알데하이드 용액에 침지되었고, 증가된 농도의 알코올 용액에서 탈수되었고, 자일렌에서 투명화되었고, 파라핀에 포매되었다. 상기 샘플들은 4 μm의 두께로 가로 절개되었다. 이어서, 상기 절개부들은 자일렌에서 침지되었고 감소된 농도의 알코올 용액에서 수화되었으며, PBS 용액에 의해 세척되었다. 상기 조직 절개부는 Goldner의 트리크롬 스테이닝(Trichrome staining)을 이용하여 조직학적으로 염색되었고, 오스테오칼신(osteocalcin, Abcam, UK)에 대한 항체를 이용하여 면역조직학적으로 염색되었다. 상기 면역염색 신호는 로다민 이소싸이오싸이아네이트-컨쥬게이티드 2차 항체(Jackson ImmunoResearch Laboratories, USA)로 시각화되었다. 이들 슬라이스들은 세포의 핵을 염색하기 위해 DAPI (Vector Laboratories, USA)를 이용하여 대비염색되었다.

2. 탄소 구조체로서 탄소나노튜브를 이용한 3차원 하이브리드 스캐폴드의 분석 결과 및 in vivo 적용 분석 결과

(1) 양친매성 고분자가 코팅된 탄소나노튜브(개질된 탄소나노튜브)의 콜로이드 안정성

APCLP는 긴 소수성 메틸 메타크릴레이트(MMA) 주사슬과 하이드록실 폴리옥시에틸렌메타크릴레이트(HPOEM) 및 폴리에틸렌 글라이콜 메타크릴레이트(POEM)로 형성된 짧은 친수성 곁사슬을 포함한다 (도 1a). 분자 동역학(MD) 시뮬레이션은 상기 소수성 주사슬이 소수성-소수성 상호작용에 의해 CNT에 부착되었고, 상기 친수성 곁사슬은 CNT의 주위를 랩핑(wrapping)하여 양친매성 표면을 형성하였음을 나타내었다 (도 1a).

상기 APCLP의 코팅은 배양 배지에서 CNT의 분산을 가능하게 하였다 (도 1a). SEM과 TEM에 의해 수득된 이미지들은 CNT가 APCLP를 이용하여 처리된 후 균일하게 분산된 것을 나타내었다 (도 1b). 본 발명자들은 푸리에 변환 적외선 분광법에 의해 CNTs(APCLP-코팅된 CNT를 의미)상의 APCLP 코팅을 추가로 확인하였고(도 1c), 상기 결과들은 APCLP가 코팅된 CNTs가 APCLP 코팅 후 3개월 이상 배양배지에서 잘 분산되었음을 나타내었다(도 1d). 게다가, APCLP가 코팅된 CNTs의 콜로이드 안정성은 pH 변화에도 영향을 받지 않았다 (도 1e).

(2) 탄소나노튜브-박테리아 셀룰로오스 혼성화의 양친매성 고분자의 효과

APCLP 코팅은 CNTs의 분산을 가능하게 할 뿐만 아니라 CNT와 BC의 혼성화를 유도한다(도 2a). CNTs의 BC에 대한 APCLP-매개 결합을 명확히 이해하기 위해, 본 발명자들은 ab initio 계산 및 MD 시뮬레이션을 수행하였다. 첫째, CNT-BC 와 APCLP-코팅된 CNT-BC의 결합 에너지가 비교되었다 (도 2b). 결합 에너지(E_b)는 E_b = -[E_전체 - E_{성분 1} - E_{성분 2}]로서 정의되었고, E_전체, E_{성분 1}, 및 E_{성분 2}는 각각 전체 시스템(즉, CNT-BC), 성분 1(BC), 및 성분 2(CNT)의 에너지이다. BC 나노섬유들간의 결합 에너지가 0.68 eV인 반면, CNTs와 BC 나노섬유들의 결합 에너지는 -0.05 eV (주어진 단위당)이었다. 그러므로, BC 나노섬유는 CNTs와의 상호작용 없이 서로 얽혀있다. 반면, APCLP-코팅된 CNTs와 BC 나노섬유의 결합 에너지는 0.71 eV(도 2b)이었으며, 이것은 BC 나노섬유가 APCLP-코팅된 CNTs와 결합하고 랩핑하는 것을 야기한다. 이와 관련하여, MD 시뮬레이션이 CNT-BC 와 APCLP-코팅된 CNT-BC 형성 메커니즘을 조사하기 위해 수행되었다 (도 2c). CNT-BC의 경우에 있어서, BC는 CNT와 혼성화 없이 서로 집합되었다. 대조적으로, APCLP-코팅된 CNT-BC에 있어서, BC 나노섬유는 혼성체(hybrid)를 형성하기 위해 APCLP-코팅된 CNTs 주위를 랩핑하였으며, 이것은 CNT와 BC의 혼성화에 있어 ALCLP의 중요한 역할을 나타낸다.

순수의 CNT들은 응집되어 본 발명에서 사용하기에 부적합할 수 있기 때문에, 아래 실험에서 사용된 모든 CNTs는 APCLP-코팅된 CNTs 형태로 존재하였다. 따라서, 하기 내용 중 모든 경우에서 "CNTs"는 APCLP-코팅된 CNTs를 의미한다. (APCLP-코팅 없는) CNTs 사용의 비실용성 때문에, CNT-BC 혼성체(즉, CNT-BC-Syn)의 특성을 침지에 의해 형성된 CNT-BC(즉, CNT-BC-Imm)의 특성과 비교하였다. 상기 두 형성 과정은 모두 도 2d에 나타낸다.

(3) 개질된 탄소나노튜브와 박테리아 셀룰로오스간의 혼성화 분석

CNTs와 BC의 혼성화를 특성 분석하기 위해 TEM이 수행되었다. TEM 분석은 CNT-BC-Syn 가 CNTs가 코어쉘(core-shell) 구조를 나타내며, 여기에서 CNTs가 BC 나노섬유 뭉치(entanglements)에 의해 팩킹되었음을 나타내었다 (도 3a). 대조적으로, CNT-BC-Imm의 CNTs와 BC 나노섬유는 서로 분리되어 있다. CNT-BC-Syn에서 BC 나노섬유들이 CNTs의 전체 표면을 커버하지 않았으며, 이것은 주변 환경에 대한 CNTs의 부분적인 노출의 결과를 가져온다는 것이 주목할만하다 (도 3b). BC 나노섬유 뭉치의 평균 두께는 4.3 nm이었으며, 상기 CNT 표면의 약 3.9%가 덮히지 않았다(도 3b). CNTs의 노출과 얇은 BC 코팅은 CNT와 세포의 상호작용을 가능하게 할 것이다. BC로부터 수집된 전자 에너지 손실 분광(EELS) 스펙트럼은 탄소의 1s에서 2σ*로의 전이를 나타내는 291 eV에서 넓은 피크를 나타내었다 (도 3c). 반면, CNT-BC-Syn의 EELS 스펙트럼은 1s 에서 p-오비탈 anti-결합 2σ* 밴드(band) 전이로 인한 291 eV의 날카로운 피크를 나타내었며 (도 3c), 이것은 CNTs의 특성이다. EELS 스펙트럼에서의 이러한 차이는 CNT-BC-Syn의 얇은 BC층내에 포매된 CNTs를 나타낸다. 상기 스캐폴드에서 CNTs의 양을 측정하기 위해 TGA를 이용한 열분해를 조사하였다. 250-350℃에서 나타나는 열분해는 BC의 글리코사이드 결합의 탈중합(depolimerization) 분해에 기인된다 (도 4). 350-400℃에서의 두번째 분해는 BC의 6-원고리의 분해로부터 기인하였다 (도 4). BC의 분해 후, CNT-BC-Syn의 20 내지 25 wt%가 분해되지 않고 잔존하였으며, 이는 잔존 CNTs의 양이다(도 4).

(4) CNT -BC- Syn의 탄소나노튜브 분포 분석

검은 점(즉, CNTs)의 집중적인 축적은 고해상도의 광학적 이미지에서 CNT-BC-Imm의 가장자리(edge)에서 관찰되었다 (도 5a). 대조적으로, CNT-BC-Syn의 CNTs는 상기 스캐폴드의 전체에 걸쳐 균일하게 분포되었다. 상기 SEM 이미지는 상기 CNTs의 축적이 CNT-BC-Imm 표면에서 동공 막힘을 유발하는 것을 나타내었으며 (도 5b); 반면, CNT-BC-Syn에서는 CNT의 축적이 없기 때문에 동공의 막힘도 관찰되지 않았다 (도 5a 및 5b). 모든 스캐폴드들은 BC의 본래 층상 구조를 유지하였다 (도 5b). 라만 분광법에 의한 G-피크 세기 매핑이 CNTs의 분포를 명확하게 조사하기 위해 수행되었다 (도 5c). CNT-BC-Imm의 상부와 하부의 표면은 CNTs에 의해 완전히 덮혀진 것에도 불구하고, CNTs는 상기 스캐폴드의 내부에서는 거의 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 CNT-BC-Imm에서 CNTs가 상기 스캐폴드의 표면에 대부분 존재하며, 상기 스캐폴드의 내부에는 부재함을 나타낸다(도 5c). 반면, CNT-BC-Syn에서 CNTs는 상기 전체 스캐폴드에 균일하게 분포되어 있었다(도 5c). AFM에 의해 측정된 CNT-BC-Imm 표면의 높은 Young's 계수(Young's modulus)는 상기 스캐폴드의 표면이 CNT 응집체에 의해 완전히 덮혀 있었음을 의미한다(도 5d). 또한, BC 및 CNT-BC-Imm와 비교하여, CNT-BC-Syn에서 CNTs의 상기 균일한 분포는 감소된 비저항과 향상된 전기 전도성의 결과를 가져왔다(표 1).

[표 1] BC, CNT-BC-Imm, 및 CNT-BC-Syn의 3차원 스캐폴드의 성질

(5) CNT -BC- Syn의 뼈 재생 효능

CNT-BC-Syn의 in vivo 성능을 평가하기 위하여, CNT-BC-Syn가 뼈 재생 적용을 위한 뼈 이식재(graft)로서 적용되었고, 그 결과는 BC, CNT-BC-Imm, 및 임상적으로 사용되는 뼈 이식재인, 골 형태형성 단백질-2(Col-BMP-2)이 로딩된 콜라겐 스펀지를 이용하여 수득된 결과와 비교되었다. 쥐의 두개골에 임계 크기 결함내에 상기 스캐폴드들을 이식한 후, 8주 마다 수행된 미세 컴퓨터 단층촬영(마이크로-CT) 분석은 CNT-BC-Syn 및 Col-BMP-2는 비슷한 뼈 재생 효능을 나타내었으며, 이것은 BC 및 CNT-BC-Imm의 뼈 재생 효능보다 훨씬 높은 것이다. (도 6a). 조직학적 부분의 Goldner 트리크롬 염색의 분석 결과는 BC 및 CNT-BC-Imm에서 불충분한 뼈 재생을 나타낸 반면, CNT-BC-Syn의 사용은 Col-BMP-2에 의한 것과 유사한 면적을 갖는 광범위한 뼈 재생 결과를 야기하였다(도 6b). Col-BMP-2는 CNT-BC-Syn에 의해 형성된 것과 유사한 새로운 뼈를 형성할 수 있음에도 불구하고, 상기 재생된 뼈의 밀도는 CNT-BC-Syn에 의해 형성된 것보다 더 낮다는 것은 주목된다 (도 6b). 이것은 CNT-BC-Syn가 고밀도를 갖는 새로운 뼈를 형성할 수 있는 능력으로 인해 뼈 이식 물질로서 사용하기에 적합하다는 것을 의미한다. 또한, 4',6-다이아미디노-2-페닐인돌(4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI, 청색) 및 오스테오칼신 염색은 조직을 둘러싼 세포들이 상기 결함 부위로 이동하였고, 상기 결함 부위에서 CNT-BC-Syn 전체에 걸쳐 골형성 분화가 진행되었음을 나타내었다. 그러나, 세포 이동과 골형성은 CNT-BC-Imm는 표면에서만 발생하였다(도 6c).

3. 투명한 그래핀 /셀룰로오스 나노 섬유 하이브리드 스캐폴드를 이용한 손상된 뇌조직의 대뇌 피질 재생 연구(Favorable cortical reconstitution using transplantable nature-driven graphene / nanofibrillar cellulose hybrid scaffolds in brain injury)

(1) 투명한 그래핀 /셀룰로오스 나노 섬유 하이브리드 스캐폴드의 제조공정

도 7을 참고하여, 본원에 의한 그래핀/셀룰로오스 나노섬유 하이브리드 스캐폴드의 생성 과정을 도식적으로 이해할 수 있다. G. xylinus 박테리아는 2.5 wt% 마니톨 (mannitol), 0.5 wt% 효모추출물 (yeast extract), 0.3 wt% 박토-펩톤(bacto-peptone)이 포함된 마니톨 배양액 (mannitol medium)에서 배양하였다. 미리 배양된 박테리아 분산액을 1x10^{- 3}wt%로 그래핀옥사이드(이하 "GO"라고도 함)를 녹인 배양액에 1:10의 비율로 첨가하고, 28-30℃ 인큐베이터 안에서 2주 동안 배양하였다. 자연적으로 합성된 셀룰로오스 막은 1 wt% NaOH 용액에 넣고 90℃에서 2시간 동안 끓이고, 증류수로 세척하였다. 남은 박테리아 찌꺼기를 제거하기 위해서, 다시 1 wt% NaOH 용액에 24시간 동안 침지한 후, pH 7에 적정된 증류수에 넣어서 세척 후 보관하였다(도 8a). 도 8b에서 일반 박테리아와 그래핀 옥사이드-박테리아 셀룰로오스(GO-BC) 하이브리드 스캐폴드의 차이를 볼 수 있다. 도 9를 참고하여, GO-BC 하이브리드 스캐폴드의 전자현미경 관찰 결과, 약 30 내지 50 나노미터 정도 크기의 셀룰로오스 나노 섬유들이 관찰되며, 그래핀 옥사이드를 내부에 균일하게 함유하고 있는 모습을 확인할 수 있다.

(2) 투명한 그래핀 /셀룰로오스 나노 섬유 하이브리드 스캐폴드를 이용한 손상된 뇌조직의 대뇌피질 재생 연구

상기 제조한 대뇌피질 구조적 특성을 모방한 3차원 그래핀/천연소재 나노섬유 하이브리드 스캐폴드를 대뇌피질이 손상된 동물 모델에 직접적으로 이식하여 적용함으로써, 뇌 조직 재생 촉진 가능성을 확인하였다. 상기 제조한 그래핀 옥사이드(graphene oxide, GO)-박테리아 셀룰로오스 (bacterial cellulose, BC) in-situ 하이브리드 스캐폴드는 실제 뇌조직의 기계적 물성과 매우 유사한 성질을 가지며 생체적합성 또한 우수하다. 성능평가를 위해 세포실험 및 동물실험을 진행하였으며, 그 결과 GO-BC 하이브리드 스캐폴드에서 키운 신경줄기세포의 신경돌기가 일반 BC 스캐폴드에서 보다 더 활발히 성장하는 것을 확인하였으며, 뇌 조직이 손상된 동물모델에서도 GO-BC 하이브리드 스캐폴드가 이식된 그룹에서 뇌 조직의 재생이 가장 많이 이루어지는 것을 확인하였다.

도 10a 및 10b에서, 동물모델인 쥐에 이식된 BC 및 GO-BC 하이브리드 스캐폴드 (지름 8 mm, 두께 0.5 mm)에서 12일 동안 성장시킨 F3-effluc 세포의 바이오 형광이미지 및 단독으로 F3-effluc 세포만 이식한 그룹의 형광이미지 (n=5)를 볼 수 있다. 또한, 도 10c에서는, 동물실험을 통해 얻은 형광이미지 및 루시페라아제의 신호세기를 측정한 결과, GO-BC에서 성장한 신경세포의 수가 일반 BC 및 세포단독으로 주입된 그룹에 비해서 더 높은 성장 수치를 보이는 것을 확인할 수 있다.

또한, 도 11에서는, 쥐의 손상된 뇌 조직에 F3-effluc 세포와 GO-BC 하이브리드 스캐폴드를 함께 이식한 그룹(GO-BC/cell), 세포와 박테리아 셀룰로오스를 함께 이식한 그룹 (BC/cell), 세포만 넣은 그룹 (cell only)의 12일 후의 조직 H&E 염색 사진 (각각의 조직 두께 4μm)을 보여준다. H&E 면역염색 결과를 통해, 쥐의 손상된 뇌 조직에 F3-effluc 세포와 GO-BC 하이브리드 스캐폴드를 함께 이식한 그룹 (GO-BC/cell)이 세포단독 (cell only) 및 세포/BC 스캐폴드 (BC/cell)가 이식된 대조군에 비해서 높은 조직 재생을 보였으며, 신경세포가 스캐폴드 내부까지 잘 침투하여 성장한 것을 확인하였다. F3-effluc 세포만 이식된 그룹에서는 조직내부에서 세포사멸이 일어나는 것이 관찰되었다.

전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (15)

1. 3차원 미세다공성(microporous) 박테리아 셀룰로오스(bacterial cellulose); 및
   상기 3차원 미세다공성 박테리아 셀룰로오스에 결합되어 있는, 개질된 탄소 구조체
   를 포함하는, 3차원 다공성 하이브리드 스캐폴드로서,
   상기 개질된 탄소 구조체는 양친매성(amphiphilic) 고분자에 의하여 코팅된 것이고,
   상기 개질된 탄소 구조체가 상기 3차원 미세다공성 박테리아 셀룰로오스 내에 균일하게 분산되어 있는 것을 포함하는,
   3차원 다공성 하이브리드 스캐폴드.
   
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 박테리아 셀룰로오스는 미세다공성 나노섬유(nanofibril) 형태를 갖는 것인, 3차원 다공성 하이브리드 스캐폴드.
   
3. 제 1 항에 있어서,
   상기 탄소 구조체는 탄소나노튜브, 그래핀, 그래핀 옥사이드, 환원된 그래핀 옥사이드, 그래핀 양자점(graphene quantum dot), 플러렌(fullerene) 및 이들의 조합들으로 이루어지는 군에서 선택되는 탄소 구조체를 포함하는 것인, 3차원 다공성 하이브리드 스캐폴드.
   
4. 제 1 항에 있어서,
   상기 양친매성 고분자는 소수성 주사슬(backbone)과 친수성 곁사슬(side chains)을 포함하는 것인, 3차원 다공성 하이브리드 스캐폴드.
   
5. 제 4 항에 있어서,
   상기 양친매성 고분자는 메틸 메타크릴레이트, 하이드록실-폴리(옥시에틸렌) 메타크릴레이트, 및 폴리(에틸렌 글라이콜) 메틸 에터 메타크릴레이트를 포함하는 터폴리머(terpolymer)를 포함하는 것인, 3차원 다공성 하이브리드 스캐폴드.
   
6. 제 1 항에 있어서,
   상기 개질된 탄소 구조체는 상기 양친매성 고분자에 의해 코팅되어 형성된 코어-쉘(core-shell) 구조를 갖는 것인, 3차원 다공성 하이브리드 스캐폴드.
   
7. 제 4 항에 있어서,
   상기 개질된 탄소 구조체는 상기 탄소 구조체의 소수성 표면과 상기 양친매성 고분자에 포함된 상기 소수성 주사슬 사이의 소수성-소수성 상호작용에 의하여 의하여 상기 탄소 구조체의 표면에 상기 양친매성 고분자가 코팅된 것이고,
   상기 박테리아 셀룰로오스의 친수성 작용기와 상기 개질된 탄소 구조체에 코팅된 상기 양친매성 고분자에 포함된 친수성 곁사슬 사이의 친수성-친수성 상호인력에 의하여 상기 개질된 탄소 구조체가 상기 3차원 미세다공성 박테리아 셀룰로오스 내에 분산되어 있는 것인, 3차원 다공성 하이브리드 스캐폴드.
   
8. 박테리아 셀룰로오스 배양용 세포를 예비 배양하는 단계;
   탄소 구조체를 양친매성 고분자에 의하여 개질하여 개질된 탄소 구조체를 형성하는 단계; 및
   상기 개질된 탄소 구조체를 배양 배지에 첨가한 후 상기 예비 배양된 박테리아 셀룰로오스 배양용 세포를 첨가하여 배양함으로써 상기 개질된 탄소 구조체를 상기 박테리아 셀룰로오스와 in-situ 혼성화하는 단계
   를 포함하는,
   3차원 하이브리드 스캐폴드의 제조방법.
   
9. 제 8 항에 있어서,
   상기 박테리아 셀룰로오스 배양용 세포는 아세토박터(Acetobacter)속, 리조비움(Rhizobium)속, 및 아그로박테리움(Agrobacterium)속으로 이루어지는 군에서 선택되는 균주 또는 글루콘아세토박터 자일리누스(G. xylinus)균주를 포함하는 것인, 3차원 하이브리드 스캐폴드의 제조방법.
   
10. 제 8 항에 있어서,
    상기 탄소 구조체는 탄소나노튜브, 그래핀, 그래핀 옥사이드, 환원된 그래핀 옥사이드, 그래핀 양자점, 플러렌, 및 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택되는 탄소 구조체를 포함하는 것인, 3차원 하이브리드 스캐폴드의 제조방법.
    
11. 제 8 항에 있어서,
    상기 양친매성 고분자는 소수성 주사슬(backbone)과 친수성 곁사슬(side chains)을 포함하는 것인, 3차원 하이브리드 스캐폴드의 제조방법.
    
12. 제 8 항에 있어서,
    상기 양친매성 고분자는 메틸 메타크릴레이트, 하이드록실-폴리(옥시에틸렌) 메타크릴레이트, 및 폴리(에틸렌 글라이콜) 메틸 에터 메타크릴레이트를 포함하는 터폴리머(terpolymer)를 포함하는 것인, 3차원 하이브리드 스캐폴드의 제조방법.
    
13. 제 8 항에 있어서,
    상기 개질된 탄소 구조체는 상기 양친매성 고분자에 의해 코팅되어 코어-쉘(core-shell) 구조를 형성하는 것인, 3차원 하이브리드 스캐폴드의 제조방법.
    
14. 제 8 항에 있어서,
    상기 개질된 탄소 구조체 형성 단계는 상기 양친매성 고분자와 상기 탄소 구조체의 혼합 용액을 초음파 처리하는 것을 포함하는 것인, 3차원 하이브리드 스캐폴드의 제조방법.
    
15. 제 8 항에 있어서,
    상기 박테리아 셀룰로오스는 미세다공성 나노섬유(nanofibril) 형태를 갖는 것이고, 상기 개질된 탄소 구조체는 상기 박테리아 셀룰로오스 내에 분산되어 있는 것인, 3차원 하이브리드 스캐폴드의 제조방법.

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