KR101811876B1 - 박테리아성 병원체 검출을 위한 광학 지시자 - Google Patents

박테리아성 병원체 검출을 위한 광학 지시자 Download PDF

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Abstract

바이러스성 감염과 박테리아성 감염을 분별할 수 있는 임상적 시험 분석 장치가 설명된다. 본 분석 장치는 시험 샘플이 그 위에 침착되는 흡수 패드를 가진 샘플 접촉 구역 및 박테리아 세포에 감응성인 착색제 지시자를 가진 검출 구역을 가진다. 착색제 지시자는 박테리아 샘플에 노출되는 경우 색이 변화한다. 색 변화 신호는 상대적으로 빠르게, 대체로 수 분 안에, 시험 샘플 내의 박테리아의 농도에 연관된 강도로 표시될 수 있다. 사용의 방법 역시 제공된다.

Description

박테리아성 병원체 검출을 위한 광학 지시자{OPTICAL INDICATOR FOR DETECTING BACTERIAL PATHOGENS}
본 발명은 진단 도구의 일부로서 솔바토크로믹(solvatochromic) 착색제를 사용하여 감염을 유발하는 바이러스성 및 박테리아성 병원체를 분별하는 광학 지시 장치에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 박테리아와 착색제 또는 염료-계 지시자 사이의 화학 반응을 포함한다.
환자를 처음 진찰하는 경우 종종, 임상의들은 감염을 유발한 박테리아성 대 바이러스성 사이를 분별하기 하기 어렵다는 것을 발견할 수 있다. 약 3천만 케이스의 편도인두염이 매해 진단되며, 바이러스가 감염의 주요 원인이다. 리노바이러스, 아데노바이러스, 콕사키바이러스, 에코바이러스, 코로나바이러스 및 엡스타인-바르 바이러스가 바이러스성 편도인두염의 가장 흔한 원인이다. 그러나, 오진은 종종 항생제의 과잉-처방을 야기하고, 이는 항생물질-내성 미생물의 발생으로 인해 증가하는 공중 건강 관심사이다. 사실상, 임상의들은 약 50 %의 경우에서, 인후의 바이러스성 감염 및 박테리아성 감염을 구별해내지 못한다. 매년 670만으로 추정되는 인두(咽頭)-관련 성인들이 1차 치료 제공자를 방문하고, 그 경우의 70-75 %에서 항생제가 처방된다.
인후 배양은 진단을 위한 "금본위제"로 남아 있으나, 결과는 최대 48 시간까지 입수할 수 없을 수 있다. 비록 비교적 빠르지만, 속성 연쇄상구균(strep) 스크리닝 시험의 사용은 5-40 %에 달하는 오차율 때문에 문제가 있을 수 있다. 추가로, 이용가능한 속성 시험은 다른 박테리아(예컨대, 나이세리아 고노레아(Neisseria gonorrhoeae), 코리네박테리움 디프테리애(Corynebacterium diphtheriae), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhalis) 및 C 군 및 G 군 스트렙토코커스)가 연관되었을 수 있음에도 불구하고, A 군 베타 용혈성 스트렙토코커스만을 진단하도록 의도된다. C 군 스트렙토코커스는 특히, 대학생들 및 젊은이들에게 더 흔할 수 있으며 속성 연쇄상구균 시험에 의해 검출되지 않는다. 통상적으로, 음성 시험 결과는 감염이 거의 대부분 바이러스성이라는 것을 의미하나, 배양도 또한 행해지고 결과는 원래의 속성 시험 결과와 대치될 수 있다. 환자들은 배양 결과를 기다리는 동안, 예방책으로서 항생제를 처방받을 수 있거나, 만약 배양 결과가 양성으로 나오면 그들은 수 일 후에 불려가서 그들이 항생제를 받을 필요가 있다고 안내받을 수 있다. 그 시간 동안, 그들은 모르는 사이에 타인들도 감염에 노출시켰을 수 있다. 따라서, 임상의들이 신속하고 정확하게 박테리아성 및 바이러스성 인후 감염을 구별하도록 하는 시험에 대한 필요가 존재한다.
임상의의 사무실 밖에서도, 소비자에게 추가적인 정보를 제공하는 장치에 대한 더 큰 필요가 존재한다. 질병에 의한 잦은 결석이 평균적으로, 급여 총액 지출의 15 %에 해당하게 경제적으로 업무에 계속적으로 부담을 준다. 근로자가 아프면, 휴식하고 회복하기 위해서 그들의 직업에서 떠나는 시간이 들 뿐만 아니라 종종 진단 및 치료를 위해 의사에게 가기 위해서도 시간이 든다. 게다가, 근로자들은 그들의 스케줄에서 그 시간을 빼서 그들의 아픈 아이들을 의사에게 데리고 가야할 수도 있다.
인후염을 유발할 수 있는 일반적인 바이러스성 감염들은 대체로 심각하지 않거나 항생제에 의해 치료되기 때문에, 소비자들은 의사에게 가기 전에 만약 그들이 그들의 질병에 대해 더 많은 정보를 가진다면 다르게 반응할 수도 있다. 그들의 증상이 아마도 성질상 바이러스성일 것이라는 것을 미리 앎으로써 소비자들은 의사를 방문하는데 드는 돈 및 시간을 절약하고 그들 자신을 휴식, 액체 및 처방전 없이 살 수 있는 약으로 알맞게 치료할 수 있다. 유사하게, 감염이 아마도 성질상 박테리아성이라는 것을 안내받는 것 또한 소비자 행동을 안내할 수 있다. 개인들은 그들이 의사를 언제 볼 필요가 있는지에 대해 더 많이 알 수 있으며, 또한 그들의 상태를 도울 수 있는 치료의 종류(예컨대, 처방전 없이 살 수 있는 약 대 처방 항생제)에 대해 더 합리적인 기대를 가질 수 있다. 따라서, 소비자들은 그들의 증상 및 치료 옵션에 대한 추가적인 정보를 제공하는 장치로부터 크게 이익을 얻을 수 있다.
따라서, 박테리아성 및 바이러스성 병원체를 분별할 수 있는 광학 지시자에 대한 필요가 존재한다. 더구나, 임상적으로 또는 가정에서의 설정에 의해 쉽게 사용될 수 있는 지시 장치는 건강관리 제공자 및 일반 소비자 모두를 위해 빠르고, 정확하고 일관된 진단 또는 검출 정보를 제공하는 것을 도울 수 있다.
본 발명은 사용자에게 정보를 전달하기 위해 색 변화 성분을 사용하는 간단한 검출기 또는 지시 장치에 관련된다. 본 장치는 시각적 또는 광학적 감응성 착색제를 가진다. 일반적으로, 본 장치는 단일 포장 안에 소장된 흡수 패드, 착색제 또는 염료-함침 막(반응 패드) 막 및 결과를 보여주는 창을 가진다. 검출 장치는 건강관리 근무자 또는 소비자가 환자로부터 시험 샘플을 면봉에 묻히고(swabbing), 샘플-함유 면봉을 흡수 패드에 접촉시키고, 염료-함침된 막(반응 패드) 및 흡수 패드 사이의 접촉이 일어나도록 지시에 따라 장치를 폐쇄하거나 봉쇄함(예컨대, 절첩 및 밀봉)으로써 사용할 수 있는 작용이 빠른 임상적 진단 보조기구일 수 있다. 그 후, 사람은 장치를 뒤집어서 샘플 결과 관찰 창을 통해 결과를 읽을 수 있다. 비교를 위해 기준 색이 샘플 결과 관찰 창 옆에 제공될 수 있다. 결과 자료 해석 안내가 또한 시험 기판의 뒷면 위에 제공될 수 있다. 착색제는 박테리아 세포에 대해 감응성이며, 바이러스에 대해 비감응성이고, 따라서 진단 장치는 박테리아성 및 바이러스성 병원체를 분별할 수 있다.
본 발명은 또한 박테리아성 감염을 분석하기 위한 지시 장치를 사용하는 방법에 연관된다. 본 방법은 본원에 설명된 것과 같은 시험 장치를 제공하는 것, 시험 샘플을 상기 샘플 접촉 구역에 적용하는 것; 상기 흡수 패드가 상기 착색제 반응 구역에 접촉하도록 제1 페이지를 제2 페이지에 대항하여 폐쇄하는 것; 및 결과 창 내에 표시되는 색 변화를 관찰하는 것을 포함한다. 본 장치는 적어도 제1 및 제2 대향하는 페이지를 가지고, 상기 제1 및 제2 페이지는 각각 내부 및 외부 표면을 가지고, 상기 제1 페이지가 상기 제1 페이지 내부 표면 위에 위치한 흡수 패드를 갖는 샘플 접촉 구역을 가지고, 상기 제2 페이지가 상기 샘플 접촉 구역에 대향되는 상기 제2 페이지 내부 표면 위에 위치한 착색제 반응 구역을 가지고, 시각적 소통이 표시되는 상기 제2 페이지 외부 표면 위의 결과 창을 가지는 기판을 가진다. 임의로, 임상의 또는 소비자는 시험 장치를 시험 과정 제공자에게 보내거나 돌려받아서 결과의 해석을 얻을 수 있다.
앞선 요약 및 하기의 상세한 설명 및 실시예들은 오직 본 발명의 대표적인 것일 뿐이며, 본 발명의 이해를 위한 개요를 제공하도록 의도된다는 것이 이해된다. 본 진단 지시 장치 및 관련된 제조 물품들 및 방법들의 추가적인 특징들 및 이점들이 하기의 상세한 설명에서 개시될 것이다.
도 1a 및 1b들은 제1 패널(100) 및 제2 패널(200)을 가지는 본 지시 장치의 일 실시태양의 평면 도시이다. 도 1a는 패널들(100a, 200a)의 외부 표면의 모습을 나타내며, 도 1b는 평평하게 펼쳐진 반대쪽 측면의 패널들(100b, 200b)의 내부의 모습을 나타낸다.
도 1c는 도 1a 및 1b에 나타난 실시태양의, 카드와 유사한, 두 개의 페이지의 시험 포맷을 보이는 3 차원적 대표도이다.
도 2a 및 2b는 사용시에 제1 및 제2 패널들 사이에 위치하여 위로 절첩되는(fold-over) 제3 패널(300)을 가지는 본 발명의 제2 실시태양의 평면적 도시이다. 도 2a는 절첩되지 않은 평면인 경우의 세 개의 패널의 외부(100a, 200a, 300a)를 보여주는 것이고, 도 2b는 반대쪽의 내부(100b, 200b, 300b)를 보여주는 것이다.
도 2c는 3 개의 패널 또는 페이지를 가지는 도 2a 및 2b에 나타난 실시태양의 3-차원적 대표도이다.
도 3은 일단 샘플이 접촉 구역에 가해지고 광학적 활성 솔바토크로믹 착색제와 반응하면, 시험 샘플 안에 박테리아성 병원체가 존재하는지 여부를 전달해주는 수개의 가능한 시각 표시의 개략도이다. 도 3A는 기준 점에 대하여 색의 변화가 없는 것을 나타내며, 따라서 "음성" 결과인 반면, 도 3D는 "양성" 결과를 나타낸다. 착색제는 도 3B 및 3C의 과도기에 의해 도시된 바와 같이, 원래의 염료 색깔에서 연한 노락색에서 흰색으로 약 5-10 분의 기간에 걸쳐서 변색된다. 도 3D는 "강한" 양성 신호이고, 도 3F 및 3E는 부분적인 또는 상대적인 변색 강도에 의해 분별되는 바와 같이 "약한" 양성 결과의 각종 표시의 예를 도시한다.
도 4는 존재하는 박테리아의 단위 농도에 대하여 색 변화의 광학적 측정(ΔE 값)을 비교한 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus)에 대한 표준 곡선이다.
도 5는 지시 염료 농도에 대한 박테리아성 세포-벽 성분의 적정 곡선이다.
도 6은 본 발명을 반복(iteration) 사용하는 프로토콜 또는 방법을 나타내는 개략적인 흐름도의 예이다.
- A. -
I 절. - 장치 구조
본 발명은 구강, 이도 및 상기도의 각종 감염을 유발할 수 있는 박테리아성 및 바이러스성 병원체를 신뢰도 있게 구별할 수 있는, 빠른-반응 분석을 제공할 수 있는 임상적 검출 장치에 관련된다. 일반적으로, 본 검출 장치는 시험 샘플을 수용하기 위한 흡수 패드, 솔바토크로믹 염료-함유 막 및 결과 관찰 영역을 가진다. 그 위에 관련된 시험 샘플을 가지는 상기 흡수 패드가 솔바토크로믹 염료와 접촉하는 경우, 시각 신호가 결과 관찰 면적에 표시된다. 솔바토크로믹 염료의 색 변화는 박테리아성 병원체의 존재를 지시한다. 실험실 증거가 색 변화가 박테리아성 세포의 표면 산성 잔류물과 솔바토크로믹 염료의 반응으로부터 야기되었다는 가설을 뒷받침한다. 시각 신호는 현재 상업적으로 입수가능한 것과 같은 광학 스캐닝 장치로 판독 및 정량화될 수 있다. 더구나, 우리는 박테리아성 세포 벽이 이 색 변화의 주요 원인이 된다고 믿는다. 따라서, 본 발명은 박테리아의 전체 세포 또는 용해된 박테리아 세포 벽의 거대한 단편을 검출하는 방법을 제공한다. 이러한 속성에 의해 본 발명이 측방 유동 검사에 관련된 현재의 기술로부터 구별된다.
본 발명에 따르면, 진단 또는 시험 장치는 샘플 접촉 구역 안에 흡수 패드를 가지고, 솔바토크로믹 염료를 가지는 대향하는 검출 구역 및 결과 시각화 창을 가져서, 상기 흡수 패드에 적용된 시험 샘플이 대향하는 검출 구역에 접촉하고, 검출 구역 내의 솔바토크로믹 염료와 반응하고, 결과 시각화 창을 통해 시각 신호를 표시한다. 진단 장치는 적어도 제1 및 제2 대향하는 패널 또는 페이지를 가지도록 절첩될 수 있는 기판을 가진다. 제1 및 제2 페이지들은 각각 내부 및 외부 표면을 가진다. 흡수 패드를 갖는 샘플 접촉 구역은 제1 페이지의 내부 표면 위에 위치한다. 착색제 지시 구역은 샘플 접촉 구역에 대향하는 제2 페이지의 내부 표면 위에 위치한다. 시각적 소통이 표시되는 결과 창은 제2 페이지의 외부 표면 위에 위치한다. 특정 실시태양에서, 기판은 반경질(semi-rigid)이고 구부러질 수 있다. 기판은 추가적으로 제1 및 제2 페이지 사이에 그 위로 절첩되는 제3 페이지를 포함할 수 있다. 제3 페이지는 샘플 접촉 구역에 대향하게 위치된 반응 개구부를 가진다. 세 개의 페이지들이 알맞게 상호절첩(interfold)되면, 샘플 접촉 구역 내의 흡수 패드, 반응 개구부, 착색제 지시 구역 및 결과 관찰 창은 각각 서로에 대해 축을 따라 모두 정렬된다.
일 실시태양에 따르면, 시험 지시 장치(10)는 적어도 두 개의 대향하는 잎 또는 페이지를 가지는 절첩된 팜플렛 또는 카드와 유사한 기판(11)을 닮을 수 있다. 도 1a, 1b 및 1c에 도시된 바와 같이, 일 실시태양에 따르면, 두 개의 패널들(100, 200) 또는 페이지들(12, 14)은 두-겹의 카드 또는 책처럼 서로에 대해 멀어지게 열린다. 또 다른 실시태양에서, 도 2a, 2b 및 2c에 도시된 것과 같이 두 개의 페이지 중 하나는 세-겹 구조의 제3 플랩(16)을 생성하도록 그 위로 절첩되는 제3 패널(300)을 가지도록 구성된다. 기판의 각각의 페이지는 제1 또는 내부 표면(12a, 14a) 및 제2 또는 외부 표면(12b, 14b)을 가지고, 전체적인 구조(10, 11)는 닫힌 경우 앞면 및 뒷면을 가진다. 도 1c에 나타난 바와 같이 페이지 두 개의 팜플렛은 열려서 내부 표면(12a) 위의 시험-샘플-침착 구역(18) 또는 창을 드러낸다. 샘플 침착 구역은 샘플-함유 면봉이 생물학적 샘플을 전달하기 위해 접촉되는 흡수 샘플 패드(20)을 가진다. 일 측면 위의 흡수 패드(예, 흰색)(20) 및 대향 측면 위의 착색된 막(예, 청색)(19, 22)(도 1b에 도시된 바와 같이, 각각 좌측 및 우측). 양성 농도의 병원체를 함유하는 시험 샘플을 염료-함침 막(즉, 반응 패드)(22)에 접촉시키는 것은 색 변화(예컨대, 청색에서 흰색 또는 노란빛을 띄는 흰색)를 야기할 것이다. 시험 기판 또는 장치의 후방 패널(13) 위에 시험 결과 창(24)이 위치한다. 샘플 결과 창(24)의 옆에는 도 1a에 보인 바와 같이 대조군(25)이, 또는 도 2a에 도시된 바와 같이 색 기준(15) 및 자료 해석 가이드(17)가 있어서 사용자가 시험 결과를 읽을 때 색을 비교하는 것을 도울 수 있다. 상업적인 실시 태양에서, 전체 장치는 깨끗한 또는 살균 상태를 유지하기 위해, 본 분석 장치를 꺼내기 위해서는 개방해야만 하는 광-보호 파우치 안에 포장되어 나올 수 있다.
패널들이 알맞게 절첩된 경우, 결과 시각화 창(24)은 샘플 접촉 구역(18) 및 검출 구역(22)과 함께 시야축(axis of sight)을 따라 정렬되어서 사용자에게 시험 결과를 전달해준다. 흡수 패드(20) 및 샘플 접촉 구역(18)은 제1 패널 또는 기판의 일부분에 위치하고 솔바토크로믹 염료(19) 및 검출 구역(22)은 동일한 기판의 대향하는 부분에 위치될 수 있다. 이와 같이, 제1 기판 및 대향하는 기판은 두 개의 페이지들(12, 14) 또는 자체 절첩되는 동일한 기판의 일부일 수 있다. 다른 실시태양에서, 흡수 패드 및 지시 염료는 별개의 분리된 제1 및 제2 기판 위에 위치할 수 있다. 특정 구성에서, 이를테면 도 2a 내지 도2c의 실시 태양에서, (제1 또는 제2 기판와) 동일한 기판의 제3 페이지 또는 플랩(26)이, 자체 절첩된 경우에 샘플 접촉 구역 및 검출 구역 사이에 위치할 수 있다. 제3 페이지가 존재하는 경우, 제3 페이지(26)는 두 구역 각각이 흡수 패드(20) 및 지시 염료(19) 영역 각각 위에 맞는, 샘플 접촉 구역(18) 및 검출 구역(22)과 정렬하는 잘라낸(cut-out) 반응 창(23)을 가지고; 따라서, 제3 페이지(26)가 반응 검출 구역(22) 위로 절첩된 경우에, 열린 반응 창(23)이 검출 구역 위에 있게 된다. 솔바토크로믹 염료는 아마도 시험 샘플 내의 박테리아성 병원체로부터의 산성 잔류물과 반응하여 솔바토크로믹 염료의 색 변화를 야기한다. 솔바토크로믹 염료는 시험 샘플 내의 바이러스성 병원체와는 반응하지 않고 색 변화를 일으키지 않는다.
특정 상업적인 실시 태양에 따르면, 진단 장치는 샘플 결과 관찰 창이 위치된 후면 및 전면 위의 프린팅을 갖는 특정 표지 및 생성물 확인 마크와 두 개의 내부 패널을 가지는 것으로 구현된다. 진단 도구가 책처럼 열리는 경우에, 분석을 사용하기 위한 안내 및 흡수 패드는 왼쪽 내부 패널 위에 있을 것이고, 염료-함침 막(반응 패드) 및 개구부 또는 막("반응 창"으로 표지)은 오른쪽 내부 패널 위에 있을 것이다. 반응 패드 막은 샘플을 흡수 패드에 적용하기 전에 제거되어야 하는 보호 필름 또는 시트로 덮힐 수 있다. 보호 커버가 박리되는 경우, 접착제가 뒤에 남아서 장치로 하여금 책과 같이 "닫히고" 밀봉되게 한다. 이것은 흡수 패드가 염료-함침 반응 패드 막과 밀착되게 한다. 염료가 시험 샘플과 일단 반응하면, 연구 장치를 뒤집어서 관찰 창 내의 샘플 결과를 관찰할 수 있다.
색 기준은 자료의 해석을 돕기 위해 시험의 뒷면에 제공된다. 결과 창의 탈색은 반응 패드의 청색이 색 기준의 청색에 얼마나 가깝게 닯았는지에 대해 판단되어야 한다. 만약 둘 다 청색으로 남아있으면, 결과는 음성이다. 만약 결과 창의 청색이 흰색 또는 노란빛을 띄는 흰색으로 변해서 완전히 또는 거의 완전히 사라졌다면, 이는 양성 결과로 해석되어야 한다. 만약 청색이 약간만 사라졌다면 (흰색 또는 노란빛을 띄는 흰색에 반대되게 연한 청색), 이는 약한 양성으로 해석되어야 한다 (결과 및 그의 제안된 해석의 일부 예에 대해서는 도 3 참조).
기판은 사용자가 검출 장치를 사용하기 위한 작동 순서를 수행하도록 하는 안내 사항을 전달하는 단어, 숫자, 개략도 또는 기호를 가진다. 일반적으로, 사용을 위한 안내 사항은 사용자에게 (1) 인후 면봉 샘플을 흡수 패드에 적용하는 것, (2) 반응 패드 위의 보호 커버 시트를 제거하는 것, (3) 흡수 패드를 압착해서 반응 패드에 접촉시키는 것, 및 (4) 창을 통해 결과를 관찰하는 것을 제공할 수 있다. 시각적 표시의 비교를 제공하는 많은 도식 또는 기호들이 결과 창에 근접한 제2 페이지 외부 표면 위에 위치한다. 도식 또는 기호는 음성 또는 양성(예, 약하거나 강한) 결과의 상대적인 수준을 나타낼 수 있다. 다른 반복에서, 도식 또는 기호들은 "+" 또는 "-" 부호로 표시될 수 있다(도 1a). 상대적인 색 변화 및/또는 신호 전개의 명확성은, 도 1a (17), 도 2a (17) 및 도 3 (E 및 F)의 비교용 박테리아성 감염 구획 내에 도시된 바와 같이, 샘플 내의 세균 농도의 상대적인 수준을 반영하기 위해 사용될 수 있다. 용이한 시각적 비교를 위한 대조군 색 기준은 결과 관찰 창에 가까이 위치될 수 있다.
본 장치는 각종 물질로부터 만들어질 수 있다. 샘플 접촉 및 반응 구역을 지지하는 기판은 반경질 물질, 예컨대, 가벼운 또는 중간 중량의 카드보드 스톡(stock) 또는 종이, 킴두라TM(KIMDURATM)(플라스틱 종이), 플라스틱 필름(예, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리에스테르, 폴리부틸렌, 폴리락톤 또는 폴리스티렌) 또는 니트릴 또는 고무 라텍스로부터 구성될 수 있다. 다른 물질로는 폴리프로필렌 또는 폴리에틸렌으로부터의 부직포 물질, 예컨대, 스펀본드 (SB), 멜트블로운 (MB), 스펀본드-멜트블로운-스펀본드 (SMS) 또는 스펀본드-필름 적층물 (SFL)을 들 수 있다. 유기 기판 물질로는 면 또는 실크 섬유, 목재 또는 니트로셀룰로오스를 들 수 있다. 무기 기판 물질로는 유리 또는 세라믹 및 금속 호일 또는 시트를 들 수 있다. 기판은 부분적으로, 적층물 또는 두 종류 이상의 상기에 언급한 물질의 조합을 포함할 수 있다. 결과 관찰 창은 열리거나 투명한 플라스틱 필름을 가질 수 있다.
흡수 패드(20)는 친수성 물질의 다공성 막(28)으로부터 구성될 수 있다. 다공성 막은, 예컨대, 합성 또는 천연 발생 물질, 예컨대 폴리사카라이드(예, 종이같은 셀룰로오스 물질 및 셀룰로오스 유도체, 예컨대, 셀룰로오스 아세테이트 및 니트로셀룰로오스); 폴리에테르 술폰; 폴리에틸렌; 나일론; 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF); 폴리에스테르; 폴리프로필렌; 실리카; 무기 물질; 예컨대 불활성화 알루미나, 유리, 규조토, MgSO4, 또는 중합체, 예컨대, 비닐 클로라이드, 비닐 클로라이드-프로필렌 공중합체 및 비닐 클로라이드-비닐 아세테이트 공중합체와 함께 다공성 중합체 매트릭스에 분산된 다른 무기 미분 물질; 자연 발생하는(예컨대, 면) 및 합성 (예컨대, 나일론 또는 레이온) 천; 다공성 겔, 예컨대, 실리카 겔, 아가로스, 덱스트란 및 겔라틴; 중합성 필름, 예컨대, 폴리아크릴아미드 등으로부터 형성될 수 있다. 특정 실시태양에서, 다공성 막(28)은 니트로셀룰로오스 및/또는 폴리에테르 술폰 물질로부터 형성된다. 용어 "니트로셀룰로오스"는 니트로셀룰로오스 단독일 수도 있고 또는 질산 및 다른 산, 예컨대, 1 내지 7 탄소수를 가지는 지방족 카르복실산의 혼합된 에스테르일 수도 있는 셀룰로오스의 질산 에스테르를 지칭한다는 것이 이해되어야 한다.
막(23)의 미공(pore)들은 약 1 미크론 내지 약 50 미크론, 일부 실시태양에서, 약 5 미크론 내지 약 30 미크론 및 일부 실시태양에서 약 5 미크론 내지 약 15 미크론의 평균 크기를 가질 수 있다. 다공성 막(23)의 크기 및 형태 또한 당업자에게 쉽게 인식될 바와 같이 다양할 수 있다. 예컨대, 다공성 막 스트립은 약 10 내지 약 100 밀리미터, 일부 실시태양에서 약 20 내지 약 80 밀리미터 및 일부 실시태양에서, 약 40 내지 약 60 밀리미터의 길이를 가질 수 있다. 막 스트립의 너비도 또한 약 0.5 내지 약 20 밀리미터, 일부 실시태양에서 약 1 내지 약 15 밀리미터 및 일부 실시태양에서, 약 2 내지 약 10 밀리미터 범위일 수 있다. 유사하게, 막 스트립의 두께는 일반적으로 투과-기반 검출을 허용하기에 충분하게 작다. 예컨대, 막 스트립은 약 500 마이크로미터 미만, 일부 실시태양에서 약 250 마이크로미터 미만 및 일부 실시태양에서, 약 150 마이크로미터 미만의 두께를 가질 수 있다.
지지하는 기판(11)는 도 1에 나타난 바와 같이 다공성 막(21)에 직접 인접하게 위치할 수 있거나, 다공성 막(20)과 지지하는 기판(11) 사이에 하나 이상의 중간 층들이 위치할 수 있다. 만약 원한다면, 지지체(11)는 빛에 투과성인 물질, 예컨대, 투명하거나 광학적으로 분산시키는(예, 반투명) 물질로부터 형성될 수 있다. 또한, 지지체(11)가 액체-불투과성이어서 막(23)을 통해 흐르는 유체가 지지체(11)를 통해 누출되지 않는 것이 일반적으로 요망된다. 지지체를 위한 적합한 물질의 예로는 유리; 중합성 물질, 예컨대, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르(예, 마일러®(Mylar®) 필름), 폴리부타디엔, 폴리비닐클로라이드, 폴리아미드, 폴리카르보네이트, 에폭사이드, 메타크릴레이트 및 폴리멜라민 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 다공성 막(21)의 충분한 구조적 배킹을 제공하기 위해서, 지지체(11)는 일반적으로 특정 최소 두께를 가지도록 선택된다. 유사하게, 지지체(11)의 두께는 통상적으로 그의 광학적 성질에 부정적인 영향을 끼칠만큼 너무 크지는 않다. 따라서, 예컨대, 지지체(11)는 약 100 내지 약 5,000 마이크로미터, 일부 실시태양에서, 약 150 내지 약 2,000 마이크로미터 및 일부 실시태양에서, 약 250 내지 약 1,000 마이크로미터 범위의 두께를 가질 수 있다. 예를 들어, 약 125 마이크로미터의 두께를 가지는 적합한 막 스트립 하나는 명칭 "SHF180UB25" 하에 메사츄세츠주, 베드폴드의 밀리포어 코퍼레이션(Millipore Corp.)으로부터 얻을 수 있다.
당업계에 잘 공지된 바와 같이, 다공성 막(21)은 지지체(11) 위에 설치될 수 있으며, 여기에서 생성된 적층물은 원하는 크기 및 형태로 다이-컷(die-cut)될 수 있다. 다르게는, 다공성 막(21)은 지지체(11)에, 예컨대, 접착제로 단순히 적층될 수 있다. 일부 실시태양에서, 니트로셀룰로오스 또는 나일론 다공성 막은 마일러® 필름에 접착된다. 접착제, 예컨대, 감압 접착제는 다공성 막을 마일러® 필름에 결합시키기 위해 사용된다. 이러한 타입의 적층 구조는 메사츄세츠주, 베드폴드의 밀리포어 코퍼레이션으로부터 상업적으로 입수가능하다고 여겨진다. 적합한 적층 장치 구조의 또 다른 예들이 다목적으로 본원에 그 전체로서 참고문헌으로 도입된 덜리, III(Durley, III) 등의 미국 특허 제5,075,077호에 설명된다.
II 절. - 착색제
착색제 또는 지시 염료가 본 검출 장치에 사용된다. 착색제 또는 염료는 바이러스에 대한 이의 반응과는 다른 박테리아 또는 다른 미생물에 대해 넓은 스펙트럼 반응을 제공할 수 있다. 착색제 지시자 구역 내의 솔바토크로믹 염료는 박테리아성 세포 표면 위의 특정 산성 잔류물에 대해 감응성인 것으로 여겨지고, 양성 시험 샘플이 솔바토크로믹 염료와 접촉한 경우 색이 변화한다. 예를 들어, 효과적인 솔바토크로믹 염료-기반 진단은 박테리아성 및 바이러스성 인두 감염을 분별하기 위해 레이차르트 염료(Reichardt's dye)를 포함할 수 있다.
솔바토크로믹 지시자들은 광범위한 박테리아 또는 다른 미생물의 존재 시에 뚜렷한 색 변화를 일으키는데 있어 특히 효과적이나, 만약 상기도 상태에 관련된 바이러스의 존재 시에 어떠한 변화가 있더라도 거의 없다. 본 발명에 사용될 수 있는 솔바토크로믹 지시자 유형의 예시로는 메로시아닌 지시자(예컨대, 모노-, 디- 및 트리-메로시아닌)이 있다. 메로시아닌 지시자, 예컨대, 메로시아닌 540은 문헌["Colour and Constitution of Organic Molecules" Academic Press, London (1976)]에 논의된 바와 같이 그리피스(Griffiths)의 공여자-단순 수용자 지시자 분류에 속한다. 더욱 구체적으로, 메로시아닌 지시자는 짝수 개의 메틴 탄소를 가지는 공액된 쇄에 의해 분리되는 염기성 핵 및 산성 핵을 가진다. 이러한 지시자는 전자 수용자 부분으로 작용하는 카르보닐 기를 가진다. 전자 수용자는 전자 공여 기, 예컨대, 히드록실 또는 아미노기에 공액된다. 메로시아닌 지시자는 환형 또는 비환형일 수 있다(예, 환형 메로시아닌 지시자의 비닐알로고스 아미드). 예컨대, 환형 메로시아닌 지시자는 일반적으로 하기의 구조식을 가진다:
Figure 112010049473046-pct00001
(식 중, n은 0을 포함하는 임의의 정수이다). 일반적인 구조식 1 및 1' 에 의해 상기에 나타난 바와 같이, 메로시아닌 지시자는 통상적으로 전하 분리 (즉, "쯔비터이온성") 공명 형태를 가진다. 쯔비터이온성 지시자는 양성 및 음성 전하를 모두 함유하고, 합쳐서 중성이나 고도로 하전된 것들이다. 이론에 얽매임을 의도하지 않으면서, 쯔비터이온성 형태는 지시자의 바닥 상태에 현저하게 기여한다고 믿어진다. 이러한 지시자에 의해 생산된 색은 따라서, 지시자의 바닥 및 흥분 상태 사이의 분자 극성 차이에 의존한다. 흥분 상태보다 더 극성인 바닥 상태를 가지는 메로시아닌 지시자의 하나의 구체적인 예가 하기에 구조식 2로 제시된다.
Figure 112010049473046-pct00002
전하-분리된 왼쪽 정규형(canonical) 2는 바닥 상태의 주된 기여체이며, 오른쪽 정규형 2'는 제1 흥분 상태의 주된 기여체이다. 적합한 메로시아닌 지시자의 또 다른 예들이 하기의 구조식 3-13에 제시된다.
Figure 112010049473046-pct00003
Figure 112010049473046-pct00004
Figure 112010049473046-pct00005
(식 중, "R"은 기, 예컨대, 메틸, 알킬, 아릴, 페닐 등이다).
인디고는 연구 용품에 사용하기에 적합한 솔바토크로마틱 지시자의 또 다른 예이다. 인디고는 흥분 상태보다 현저하게 덜 극성인 바닥 상태를 가진다. 예컨대, 인디고는 일반적으로 하기의 구조식 14를 가진다:
Figure 112010049473046-pct00006
왼쪽 정규형 14는 지시자의 바닥 상태의 주된 기여체이며, 오른쪽 정규형 14'는 흥분 상태의 주된 기여체이다.
검출 장치에서 사용할 수 있는 기타 적합한 솔바토크로마틱 지시자로는 영구 쯔비터이온성 형태를 가지는 것들을 포함한다. 즉, 이들 지시자들은 인접 π-전자 시스템 내에 함유된 양의 형식 전하 및 음의 형식 전하를 가진다. 상기에 참조된 메로시아닌 지시자와는 대조적으로, 그러한 영구 쯔비터이온성 지시자의 경우에는 중성 공명 구조가 그려질 수 없다. 이러한 부류의 예시적인 지시자는 N-페놀레이트 베타인 지시자, 예컨대, 하기의 일반 구조식을 가지는 것들을 포함한다:
Figure 112010049473046-pct00007
(식 중에서, R1-R5는 수소, 니트로기(예, 질소), 할로겐, 또는 포화되거나 비포화될 수 있고 비치환되거나 동일하거나 상이한 탄소 원자에 하나, 둘 이상의 할로겐, 니트로, 시아노, 히드록시, 알콕시, 아미노, 페닐, 아릴, 피리디닐 또는 알킬아미노 기로 임의로 치환된, 선형, 분지형, 또는 환형 C1 내지 C20기 (예, 알킬, 페닐, 아릴, 피리디닐 등)으로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택된다). 예컨대, N-페놀레이트 베타인 지시자는 하기의 일반 구조식 15를 가지는 4-(2,4,6-트리페닐피리디늄-1-일)-2,6-디페닐페놀레이트(레이차르트 염료)일 수 있다.
Figure 112010049473046-pct00008
레이차르트 염료는 강한 음성 솔바토크로미즘을 나타내고 따라서, 박테리아의 존재에서 청색에서 무색으로의 현저한 색 변화를 할 수 있다. 즉, 레이차르트 염료는 흡광도에서의 단파장으로의 이동을 나타내며 따라서, 용매 용리력(극성)이 증가함에 따라 가시적인 색 변화를 가진다. 적합한 음성적 솔바토크로마틱 피리디늄 N-페놀레이트 베타인 지시자의 또 다른 예는 하기의 구조식 16-23에 제시된다:
Figure 112010049473046-pct00009
(식 중, R은 수소, -C(CH3)3, -CF3, 또는 C6F13이다).
Figure 112010049473046-pct00010
Figure 112010049473046-pct00011
Figure 112010049473046-pct00012
영구 쯔비터이온성 형태를 가지는 지시자의 또 추가적인 예는 하기의 일반 구조식 24를 가지는 지시자를 포함한다:
Figure 112010049473046-pct00013
(식 중, n은 0 이상 및 X는 산소, 탄소, 질소, 황 등이다). 구조식 24에 나타난 영구 쯔비터이온성 지시자의 구체적인 예들은 하기의 구조식 25-33을 포함한다.
Figure 112010049473046-pct00014
Figure 112010049473046-pct00015
또 다른 적합한 솔바토크로마틱 지시자들로 4-디시안메틸렌-2-메틸-6-(p-디메틸아미노스티릴)-4H-피란 (DCM); 6-프로피오닐-2-(디메틸아미노)나프탈렌 (PRODAN); 9-(디에틸아미노)-5H-벤조[a]페녹스-아진-5-온 (나일 레드(Nile Red)); 4-(디시아노비닐)줄로리딘 (DCVJ); 페놀 블루; 스틸바졸륨 지시자; 코우마린 지시자; 케토시아닌 지시자; N,N-디메틸-4-니트로아닐린 (NDMNA) 및 N-메틸-2-니트로아닐린 (NM2NA); 나일 블루; 1-아닐리노나프탈렌-8-술폰산 (1,8-ANS) 및 다폭실부틸술폰아미드 (DBS) 및 기타 다폭실 유사체를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 언급한 지시자들 외에도, 본 발명에서 사용될 수 있는 또 다른 적합한 지시자들은 4-[2-N-치환-1,4-히드로피리딘-4-일리딘)에틸리덴]시클로헥사-2,5-디엔-1-온, 레드 피라졸론 지시자, 아조메틴 지시자, 인도아닐린 지시자 및 이들의 혼합물을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
반응 패드 기반 물질은 아노디스크TM 막 필터(ANODISC™ Membrane Filter)(왓맨® 인크.(Whatman® Inc.), 뉴저지주, 플로햄 파크)이다. 흡수 패드 물질은 밀리포어(메사츄세츠주, 빌레리카)에 의해 제공되는 하이-플로우TM 플러스(Hi-Flow™ Plus) HF120 막이다. 레이차르트 염료는 타이거 사이언티픽, 인크.(Tyger Scientific, Inc.)(뉴저지주, 에윙)에 의해 제조된다.
본 발명의 다른 반복에서, 우리는 흡수 막 위에 줄 그어진(striped) 지방 또는 건조 산과 같은 대조군, 또는 반응 구역의 상류 막 위에 줄 그어진 실제 박테리아 대조군을 포함하도록 구현한다. 샘플은 스트립으로 흡상될 수 있고(wick up) 동반된 유체는 산 또는 미생물을 방출하여 솔바토크로믹 착색제(예, 레이차르트 염료)와 반응시킬 것이다.
본 진단 도구의 이점은 비교적 빠른 반응 시간 및 색 변화 신호의 진단의 명확성이다. 색 변화는 일반적으로 시험 샘플을 착색제 반응 구역 안의 솔바토크로믹 염료와 접촉시키고 약 30 분 안에 일어난다. 통상적으로, 반응은 약 20-25 분 미만, 이상적으로 10-15 분 미만, 그리고 가장 원하는 바로는 약 5-10 분 안에 일어난다. 특정 실시태양에서, 반응 시간은 1-3 분 만큼 빠를 수 있다. 반응 시간은 박테리아성 감염의 범위 또는 상대적 중증도에 연관될 수 있다. 색 변화는 시험 샘플 내의 박테리아의 농도 (CFU/mL 단위)에 의존하여 전개 시간이 변할 수 있다.
최종 결과의 검출은 육안에 의해 또는 전자적 또는 디지털 판독기, 스캐너, 웹 캠 또는 예컨대, 현재 이용가능한 기타 광학적 영상화 시스템의 도움으로 시각적으로 일어날 수 있다. 육안과는 별도로, 솔바토크로믹 염료의 상대적 강도 및 색 범위는 광학적 판독기를 사용하여 더욱 잘 또는 더욱 정확하게 모니터링될 수 있다. 더구나, 결과는 막 위의 색 변화를 통해서 또는 2차 지시자, 예컨대, 미생물과 접촉됨에 의해 생긴 염료의 전자화학의 변화에 기인하여 켜지는 LCD 광을 통해서 해석될 수 있다. 결과는 염료의 탈-색에 있어서의 변화 속도에서의 비교 차이에 의해 해석될 수 있다. 결과의 해석은 또한 디폴트 설정으로서의 "-" 부호에 비교하여 양성 시험으로의 "+" 부호의 생성에 의해 일어날 수 있다.
- B. -
III 절. - 실험적인 예들
실험실 시험은 솔바토크로믹 염료, 예컨대, 레이차르트 염료가 광범위한 각종 박테리아를 검출하고, 바이러스성 감염으로부터 박테리아성 감염을 분별하는데 촉망되는 방법이라는 점을 보였다. 레이차르트 염료를 지시자 착색제로서 사용하는 경우, 박테리아가 존재하면 이것은 완전히 어두운 청록색/청색에서 무색으로 변색되나, 바이러스에서는 그렇지 않다 (또는 뚜렷이 관찰가능한 정도로 훨씬 적은 범위로 변색).
본 진단 장치의 특정한 설계는 환자 또는 의사가 지시 염료와 접촉하는 것을 필요로 하지 않는다. 대신, 시험 샘플이 면봉 전달자를 통해서 흡수 패드에 접촉되거나 침착되는 것이 요망된다. 예컨대, 살균 면봉이 배양을 위한 표본 수집과 같은 방식으로 샘플을 획득하기 위해 환자의 인두 및 편도선(존재한다면)에 적용될 수 있다. 샘플-함유 면봉을 그 후 시험 샘플 구역과 접촉하고, 따라서 환자 또는 건강관리 시술자와 반응 패드의 어떠한 직접적인 접촉도 회피된다.
다르게는, 샘플은 면봉 또는 어떤 직접 샘플링 방법, 예컨대, 침, 혈액, 눈물 등을 통해 장치에 가해질 수 있다. 면봉 그 자체는 또한 끝을 통해 유체가 흡상되었을 때 면봉의 일부에서 색 변화가 일어나도록 장치를 소장하게 사용될 수 있다. 면봉 또는 샘플링 메카니즘은 또한 임의의 수의 공지된 마이크로유체성 성분을 함유하여 임의의 샘플을 농축하고 채널링(channel)할 수 있다. 희석 팩은 흡상 목적을 위해 유체를 첨가하는데 또한 사용될 수 있다.
하기의 실시예들은 박테리아성 대 바이러스성 병원체를 분별하는 본 검출 메카니즘의 효능을 입증한다.
1. 스타필로코쿠스 아우레우스 (S. aureus ), 슈도모나스 애루기노사(P. aeruginosa) 및 대장균(E. coli )을 이용한 지시 염료의 최초 시험
레이차르트 염료(아세토니트릴 20 g 내의 염료 0.5 g)의 용액을 제조하고 전유(proprietary) 흡수 기판 위에 위치시키고 공기 건조하였다. 레이차르트 염료 코팅된 시트를 USP(미국 약전(藥典)) XXIV에 기회감염 병원체로 나열된 하기의 미생물을 사용하여 눈으로 보이는 색 변화에 대해 시험하였다: 스타필로코쿠스 아우레우스 (ATCC #6538), 대장균 (ATCC #8739) 및 슈도모나스 애루기노사 (ATCC #9027). 상기 나열된 미생물들의 동결건조법 배양(Lyophilized culture)을 벡톤 딕킨손(Becton Dickinson) 실험실(BBL)로부터 상업적으로 입수가능한 살균한 트립티카제 대두 브로스(trypticase soy broth)의 5 ml 튜브에서 시작하였다. 보존 배양액을 매일 동일한 박테리아성 세포 농도로 유지하기 위해, 각각의 보존 배양액으로부터 살균 TSB의 새로운 5 ml 튜브로 한(1) 방울(약 0.1 ml)를 살균 전달 피펫을 사용하여 무균적으로 전달하였다. 감응성 시험을 위해 어떠한 것이라도 사용되기 전에 각각의 생물에 대해 다섯(5) 번의 배양액 전달이 있었다.
109 내지 108 CFU(콜로니 형성 단위)/ml 보존 배양액 농도로 시작해서, 1:10 일련의 희석액들을 9 ml 부피의 살균한 탈-이온수를 사용해서 만들었다. 원하는 농도에 따라, 통상적으로 하기의 희석액들을 만들었다: 107, 106, 105, 104 및 103 CFU/ml. 감응성 시험을 시작하기 전에 모든 보존 배양액에 대해서 생육 플레이트 계수를 수행했다. 만들어진 일련의 희석액과 함께 이러한 계수는, 수행되는 시험에서 실제 박테리아성 농도를 계산하는데 사용되었다.
가장 높은 농도의 박테리아를 함유하는 액체의 100 ㎕ 분취액을 취하여 레이차르트 염료 코팅된 전유 흡수 기판을 시험하였다. 염료는 박테리아에 의해 젖은 영역에서 무색으로 변해서 박테리아의 존재를 지시하였다. 박테리아를 함유하지 않은 배지액(media liquid)의 유사한 크기의 점은 색이 변화하지 않았다. 점이 가시적인 변화를 보이지 않을 때까지 실험을 덜-농축된 박테리아 분취액으로 계속하였다. 그램-음성 박테리아를 나타내는 하한이 1000 CFU/ml로, 그램-양성 박테리아에서는 100 CFU/ml 만큼 낮은 것으로 밝혀졌다.
2. 살모넬라 박테리아( Salmonella Bacteria )를 이용한 시험
유사한 방법으로, 살모넬라-함유 액으로 레이차르트 염료 코팅된 전유 흡수 기판을 시험하였다. 지브랄터 실험실(Gibraltar Labs)(뉴저지주, 페어필드)에서 용액의 100 마이크로리터 분취액을 흡수 기판 위에 놓았다. 젖은 점은 흰색으로 변해서 살모넬라가 염료를 탈색시킨 것을 지시했다. 따라서, 염료는 살모넬라에 대해 감응성이다. 배지를 단독으로 또는 물을 또한 수건 위에 위치시켰으며, 코팅을 주목할만하게 탈색시키지 않았다.
3. 추가적인 미생물을 이용한 시험
우리는 레이차르트 염료의 용액이 반정량적으로 미생물 농도를 분석하는데 사용될 수 있다는 것을 시험하는 동안 발견했다. 그렇게 하기 위해서, 원하는 미생물 한 방울을 흡수 기판 위에 놓을 수 있었다. 레이차르트 염료 용액을 그 후 이 점에 청색이 빠르게 탈색되기보다는 유지될 때까지 적가할 수 있었다. 107 CFU/ml의 스타필로코쿠스 아우레우스, 칸디다 알비칸스, 지. 바기날리스(G. vaginalis), 대장균, 슈도모나스 애루기노사 및 락토바실러스 아시도필러스를 전유 흡수 기판 위에 피펫팅 (각각 100 ㎕)하였다. 추가로, 105 CFU/mL의 아스퍼질러스 니가(A. niger)를 또한 흡수 기판 위에 피펫팅하였다. 레이차르트 염료(10 g의 아세토니트릴 내의 160 mg)를 그 후 각각의 점에 10 ㎕ 분취액으로 첨가하고 지속적인 색을 달성하는데 필요한 방울의 수를 세었다.
각각의 생물에 대해 지속적인 자주색을 유지하는데 요구되는 염료의 양이 표 1에 제공된다. 가장 강한 반응이 락토바실러스 아시도필러스에서 관찰되었고, 그 다음 스타필로코쿠스 아우레우스, 지 바기날리스, 대장균, 슈도모나스 애루기노사, 칸디다 알비칸스, 그리고 마지막으로 아스퍼질러스 니가가 뒤를 이었다. 결과는 생물들의 염료를 탈색시키는 그들의 능력이 다양하며 일부가 다른 것들보다 더 빠르거나/더 강렬한 반응을 유발한다는 것을 시사한다.
Figure 112010049473046-pct00016
탄저균(Anthracis bacillus)과 같은 박테리아성 포자로 또한 시험을 수행하였다. 이들 시험으로부터의 데이타는 레이차르트 염료(시험된 바와 같은)가 박테리아성 포자에 충분히 감응성이지 않다는 것을 시사한다. 식물 생장성 생물체를 이용한 시험은, 그러나 탈색이 발생하는 것을 나타냈으며, 염료가 실제 생물체가 아닌, 포자 껍질(spore coat)에 비감응성임을 지시하였다. 따라서, 박테리아성 포자를 검출하려는 경우, 포자 껍질이 제거되도록 먼저 샘플을 화학적으로 전-처리하는 것이 필요할 수 있다.
4. 지시자-처리된 표면을 사용한 박테리아의 신속한 정량화
니나 브랜드 페이퍼(Neenah brand paper)를 레이차르트 염료 용액(80 mg/ 1O g 아세토니트릴)으로 코팅하고 걸어서 건조시켰다. 스타필로코쿠스 아우레우스의 분취액(100 ㎕)을 사용하여 표준 곡선을 생성했다. 소형(hand-held) 분광광도계를 사용하여 델타 E(Delta E)(CIELAB 방법을 사용한 분광광도계에 의해 획득한 L*, A*, 및 B* 값을 사용하여 계산)를 로그 CFU/mL 농도에 대해 도시함으로써 수치 표준 곡선을 생성했다.
표준 곡선으로부터 생성한 광학적 측정치(델타 E 값)들을 사용하여 도 4에 나타난 그래프를 생성하였다. "1"(y-축 위)은 "인지만 할 수 있는" 색-변화를 나타낸다. 결과는 앞서 눈으로 관찰한 색 변화가 사실은, 분광광도계를 사용하여 검출가능하고 서로로부터 구별가능 하다는 것을 확인시켜준다. 더욱이, 결과는 스타필로코쿠스 아우레우스 박테리아에 대한 염료의 반응성이 용량-의존적이고, 박테리아의 농도가 감소함에 따라 점점 줄어드는 것으로 나타난다는 것을 지시한다.
5. 추가적인 용매를 이용한 시험
레이차르트 염료를 이용하여 관찰한 탈색 반응을 면밀히 조사하였고, 각종 용매, 예컨대, 이소프로판올, 아세토니트릴, 에탄올, 디메틸포름아미드, 옥탄올 및 메탄올에 염료가 용해된 경우에 발생하는 것으로 밝혀졌다. 염료가 각종 세제, 예컨대, 트윈®(Tween®)에 용해될 수 있고, 특히, 운반자 용매, 예컨대, 이소프로판올이 이용되는 경우에도 여전히 그의 반응성을 보유한다는 것도 또한 발견되었다.
6. 박테리아성 세포-벽 성분을 이용한 시험
이러한 지시자 기술이 어떻게 작동하는지에 대한 통찰이 박테리아의 세포 벽에서 통상적으로 발견되는 분자를 이용함으로써 획득되었다. 비록 그램-양성 및 그램-음성 박테리아의 표면을 포함하는 화합물들에 어떤 공통성이 있긴 하지만, 그들의 배열 및 화학적 조성은 서로 다르다. 그램-음성 박테리아는 리포다당류(LPS)로 코팅된 외부 막을 가진다. LPS는 그램-음성 박테리아의 표면에 전체-음성 전하를 주고 그의 발병에 기여한다. 그램-양성 박테리아를 두꺼운 펩티도글리칸 또는 무레인(murein), 시트-유사 층으로 코팅하였다. 교호(交互)하는 N-아세틸글루코사민 및 N-아세틸무라민산 분자로부터 시트를 형성하였다. 테이코산(Teichoic acid)이 또한 그램-양성 박테리아에서 발견되었고, N-아세틸무라민산에 연결될 수 있었다. 그램-음성 박테리아가 또한 펩티도글리칸을 가졌으나, 그램-양성 박테리아 위의 층이 훨씬 더 두꺼웠다.
대장균-유래 해독된 리포다당류(지질 A 성분 제거됨), 스트렙토코커스 패칼리스(Streptococcus faecalis)로부터 유래된 리포테이코 산, 대장균-유래 리포다당류 및 무라민산의 용액(미조리주, 세인트 루이스, 시그마-알드리치)을 염료-코팅된 전유 흡수 기판 위에 위치시켰다. 순수 LPS를 예외로, 모든 용액들을 5 % (중량/중량), 1 % (중량/중량) 및 0.2 % (중량/중량) 농도로 제조하였다. 안전성의 이유로 순수 LPS를 0.1 % (중량/중량), 0.02 % (중량/중량) 및 0.004 % (중량/중량)으로 제조하였다.
추가적인 실험으로, 대장균-유래 해독된 리포다당류(지질 A 성분 제거됨), 스트렙토코커스 패칼리스로부터 유래된 리포테이코 산, 대장균-유래 리포다당류 및 무라민산의 용액을 전유 흡수 기판 위에 위치시켰다. 순수 LPS를 예외로, 모든 용액들을 5 % (중량/중량), 1 % (중량/중량) 및 0.2 % (중량/중량) 농도로 제조하였다. 안전성을 이유로 순수 LPS를 0.1% (중량/중량), 0.02% (중량/중량) 및 0.004% (중량/중량)으로 제조하였다. 레이차르트 염료(10 g 아세토니트릴 내 160 mg)를 각각의 점에 10 ㎕ 분취액으로 첨가하고, 지속적인 색을 만들기 위해 요구되는 염료의 양을 기록하였다.
무라민산이 가장 강한 반응을 나타냈으며, 두 실험 설정 모두에서 염료의 거의 즉각적인 탈색을 야기했다. 다른 화합물들도 최종에는 염료의 탈색을 유발했으나, 무라민산처럼 강하게 반응하는 것으로 나타나지 않았다. 무라민산은 그램-양성 박테리아에서 더 높은 농도로 발견되기 때문에, 이러한 결과들은 이 염료가 CFU/mL 데이타를 줄 뿐 아니라 반응의 강도 및 속도에 기초한 그램-양성 및 그램-음성 박테리아의 구별에 대한 잠재력도 있다는 것을 입증한다. 적정 실험으로부터의 결과는 도 5에 제공된다.
7. 가압멸균처리( Autoclaved )된 박테리아를 이용한 시험
박테리아 세포 벽이 이 반응에서 중요한 역할을 한다는 것을 입증하기 위해,지시자 스프레이(10 g 이소프로판올 안의 160 mg 레이차르트 염료)로 시험하기에 앞서 스타필로코쿠스 아우레우스(106 CFU/mL)의 바이알을 가압멸균처리하였다. 가압멸균 처리는 세포 벽들을 필수적으로 불어서 떨어지게 함으로써 박테리아를 죽인다. 가압멸균처리기로부터의 수증기는 박테리아에 침투하고 막을 찢어 떨어뜨린다. 가압멸균처리된 스타필로코쿠스 아우레우스 용액을 표면 위에 피펫팅하고 레이차르트 염료 지시자 스프레이(10 g 이소프로판올 내 160 mg)으로 분사한 경우, 탈색이 관찰되지 않았다. 이러한 자료는 박테리아에 의한 레이차르트 염료의 탈색을 위해 흠이 없는 세포 벽이 요구될 수 있다는 것을 시사한다.
8. 원형질을 이용한 시험
세포 벽과의 반응을 입증하기 위한 추가적인 시험을 박테리아성 세포 벽의 효소적 소화를 통해 원형질을 생성함으로써 수행하였다. 간략히, 1 mL의 스타필로코쿠스 아우레우스(108 CFU/mL)를 TM 완충액(0.05 M Tris-HCl, pH 7.4, 20 mM MgCl2)에 15 %(w/v)의 수크로오스(미조리주, 세인트 루이스, 시그마-알드리치)와 함께 현탁된 달걀 흰자 리소자임 200 μg/mL (미조리주, 세인트 루이스, 시그마-알드리치) 9 mL와 반응시켰다. 반응을 30 ℃에서 한 시간동안 수행하고, 그 후에 용액을 10,000 Xg에서 원심분리하고, 타쿠(Taku)와 팬(Fan)에 의해 문헌[(The Journal of Biological Chemistry, 1979)]에 설명된 방법에 따라 13 %(w/v) 수크로오스 함유 TM 완충액으로 두번 헹궜다.
원형질을 함유하는 용액(100 ㎕ 분취액)을 레이차르트 염료(80 mg/ 10 g 아세토니트릴)로 코팅된 애버리(Avery) 라벨과 반응시켰다. 처리되지 않은 박테리아를 TM/13 % 수크로오스 완충액(리소자임 없이)에서 10 배로 희석하고, 라벨 위에 양성 대조군으로서 놓았다. 약 5 분 후에, 박테리아성 용액들을 표면에서 빨아들였더니, 처리되지 않은 양성 대조군으로부터의 탈색, 그러나 원형질을 함유하는 것으로 생각되는 용액으로부터의 최소한의 탈색을 드러냈다.
원형질들이 사실상 생성되었다는 것을 확인하기 위해서, 그램 염색을 샘플 위에서 수행하였다. 그램-염색은 스타필로코쿠스 아우레우스 대조군에 의한 크리스탈 바이올렛 염색의 흡수를 나타낸 반면, 원형질-함유 샘플은 염료 흡수를 나타내지 않았다. 이것은 그램 양성 생물, 예컨대, 스타필로코쿠스 아우레우스는 그램 염색 과정의 일부에서 세포 벽 염색을 보여야 하기 때문에 세포 벽이 효과적으로 제거되었다는 것을 시사한다.
의심되는 원형질이 실제로 살아있는 생물체였으며, 실험적인 과정 동안 돌이킬 수 없게 손상된 것이 아님을 확인하기 위해, 원형질 용액의 분취액과 양성 대조군(TM /13 % 수크로오스 내)를 도말하고 다음날 세포 계수를 하였다. 원형질 및 대조군 용액에 대한 계수는 각각 7.9 X 108 CFU/ml 및 5.9 X 108 CFU/ml이었으며, 원형질들이 살아있었고 세포 수가 실험 과정 동안 줄어들지 않았다는 것을 지시하였다.
요약하면, 원형질과의 반응으로부터의 실험적 발견은 세포 벽의 존재가 박테리아에 의한 레이차르트 염료의 탈색에 매우 중요하다는 것을 시사한다. 따라서 세포 벽을 손상시키는 공정 또는 조건은 박테리아에 대한 레이차르트 염료의 감응성을 감소시킬 수 있다.
9. 상기도-관련 병원체를 이용한 시험
레이차르트 염료-처리된 샘플을 사용한 일부 실시예에서, 샘플들을 각각 100 마이크로리터의 하기의 박테리아와 반응시켰다: 헤모필루스 인플루엔자 (ATCC # 49247) (H. influenzae), 모락셀라 라쿠나타(ATCC # 17972) (M. lacunata), 스트렙토코커스 피오게네스(ATCC # 10782) (S. pyogenes), 스트렙토코커스 뉴모니애 (ATCC # 10015) (S. pneumoniae). 하기의 바이러스 종들도 또한 시험하였다: 리노 바이러스 42 형(호프만 라 로체(Hoffman La Roche)로부터 수용 5/13/82), 인플루엔자 A(ATCC # VR-544), 아데노바이러스 2 형(ATCC # VR-846), 아데노바이러스 5 형 (ATCC # VR-5).
연구들은 염료-처리된 샘플들이 이들 병원체성 생물체, 특히 스트렙토코커스 피오게네스 (S. pyogenes) 및 스트렙토코커스 뉴모니아(S. pneumonia)에 의해 탈색되었음을 나타냈다. 실험에 앞서, 그램 양성 박테리아가 다른 타입의 미생물들보다 더 강한 탈색 반응을 끌어내는 것이 관찰되었다.
리노바이러스, 인플루엔자 및 아데노바이러스를 이용한 시험은 유사한 농도에서의 살모넬라 박테리아 대조군으로부터 관찰된 것보다 현저하게 더 적은 염료의 탈색을 나타냈다. 배지 대조군에의 비교 또한 관찰된 탈색이 최소인 것으로 나타났다. 아데노바이러스는 특히, 염료를 탈색시키는 능력을 거의 나타내지 않았다.
또 다른 실시예에서, 수개의 본 분석 장치가 스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코커스 뉴모니아, MRSA, 리노바이러스 및 아데노바이러스 2를 이용하여 시험되었다. 모든 박테리아들을 트립티카제 대두 브로스(TSB) 내에서 107 CFU/ml의 농도로 준비하였고, 바이러스들을 5 % 태아 소 혈청(FBS)을 갖는 둘베코의 변형 이글 배지(DMEM: Dulbecco's Modified Eagle Medium)에서 대략 10-6.5의 TCID 50 값으로 준비하였다. 각각의 미생물에 대한 추가적인 용액들을 5 % 무친(및 박테리아성 샘플의 경우 5 % 태아 소 혈청(FBS))으로 만들었다. 면봉을 각각의 용액에 담갔다가 장치의 흡수 패드에 가했다. 분석을 차폐하고 국소 접착제로 밀봉하였다. 5 분 후에, 우리는 박테리아성 샘플이 육안으로 쉽게 보이는 막의 탈색을 유발하였고, 바이러스성 샘플은 그렇지 않은 것을 관찰했다.
본 발명은 예시에 의해 포괄적으로 그리고 상세하게 설명되었다. 본 지시 시험 장치에 구현된 기술이 환자 또는 임상의에게 무시할 정도의 합병증 또는 위험을 부여하면서, 가정에서 또는 임상적 설정에서 효율적이고, 비용 효과적이고 신속하게 작용하는 진단 도구를 제공할 수 있다고 여겨진다. 당업자는 본 발명이 반드시 구체적으로 개시된 실시태양으로 제한되지 않으며, 하기의 청구항 또는 본 발명의 범위 내에서 사용될 수 있는, 현재 공지된, 또는 개발될 다른 동등한 성분을 포함하는 그들의 동등물에 의해 규정되는 본 발명의 범위로부터 벗어남이 없이 변형 및 변경이 만들어질 수 있다는 것을 이해한다. 따라서, 다르게 본 발명의 범위를 벗어나는 변화가 아닌 한, 변화는 본원에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (20)

  1. 적어도 제1 패널 및 제1 패널에 대향하는 제2 패널을 가지도록 절첩될 수 있는 기판을 포함하며, 상기 제1 및 제2 패널이 각각 내부 표면 및 외부 표면을 가지고, 상기 제1 패널이 상기 제1 패널 내부 표면 위에 위치한 흡수 패드를 갖는 샘플 접촉 구역을 가지고, 상기 제2 패널이 상기 샘플 접촉 구역에 대향되는 상기 제2 패널 내부 표면 위에 위치한 솔바토크로믹(solvatochromic) 염료 지시자 구역, 및 시각적 소통이 표시되는 상기 제2 패널 외부 표면 위의 결과 창을 갖고,
    상기 결과 창을 통해 시각적 소통이 표시되도록 상기 기판이 절첩될 때 상기 샘플 접촉 구역에 적용된 시험 샘플이 상기 솔바토크로믹 염료 지시자 구역에 접촉하도록, 상기 결과 창은 상기 샘플 접촉 구역 및 상기 솔바토크로믹 염료 지시자 구역과 광학축을 따라 정렬되는, 박테리아성 병원체 검출을 위한 임상적 검출 장치.
  2. 제1항에 있어서, 상기 기판이 반경질(semi-rigid)이고 구부릴 수 있는, 박테리아성 병원체 검출을 위한 임상적 검출 장치.
  3. 제1항에 있어서, 상기 기판은 상기 제2 패널의 내부 위로 절첩되는 제3 패널을 추가적으로 포함하고, 상기 제3 패널이 상기 제2 패널 내부 위로 절첩된 경우에 상기 샘플 접촉 구역에 대향되게 위치된 반응 개구부를 가지는, 박테리아성 병원체 검출을 위한 임상적 검출 장치.
  4. 제3항에 있어서, 상기 제1, 제2 및 제3 패널들이 서로에 대하여 상호 절첩되었을 때, 상기 샘플 접촉 구역, 상기 반응 개구부, 상기 솔바토크로믹 염료 지시자 구역 및 상기 결과 창이 각각 서로 정렬되는, 박테리아성 병원체 검출을 위한 임상적 검출 장치.
  5. 제1항에 있어서, 양성 시험 샘플이 솔바토크로믹 염료 지시자 구역과 접촉된 경우 솔바토크로믹 염료 지시자 구역의 색이 변화하는, 박테리아성 병원체 검출을 위한 임상적 검출 장치.
  6. 제1항에 있어서, 상기 기판이 사용자가 상기 검출 장치를 사용하기 위한 작동 순서를 수행하도록 하는 설명을 전달하는 단어, 숫자, 도식 또는 기호를 가지는, 박테리아성 병원체 검출을 위한 임상적 검출 장치.
  7. 제1항에 있어서, 시각적 표시의 비교를 제공하는 다수의 도식 또는 기호가 상기 결과 창 부근의 제2 패널 외부 표면 위에 위치하는, 박테리아성 병원체 검출을 위한 임상적 검출 장치.
  8. 제1항에 있어서, 대조군 색 기준이 상기 결과 창 근처에 존재하는, 박테리아성 병원체 검출을 위한 임상적 검출 장치.
  9. a) 적어도 제1 패널 및 제1 패널에 대향하는 제2 패널을 가지고, 상기 제1 및 제2 패널이 각각 내부 표면 및 외부 표면을 가지고, 상기 제1 패널이 상기 제1 패널 내부 표면 위에 위치한 흡수 패드를 갖는 샘플 접촉 구역을 가지고, 상기 제2 패널이 상기 샘플 접촉 구역에 대향되는 상기 제2 패널 내부 표면 위에 위치한 솔바토크로믹(solvatochromic) 염료 반응 구역, 및 시각적 소통이 표시되는 상기 제2 패널 외부 표면 위의 결과 창을 가지는 기판을 가지는 시험 장치를 제공하는 단계;
    b) 시험 샘플을 상기 샘플 접촉 구역에 적용하는 단계;
    c) 상기 흡수 패드가 상기 솔바토크로믹 염료 반응 구역에 접촉하고 상기 결과 창이 상기 흡수 패드 및 상기 솔바토크로믹 염료 반응 구역과 광학축을 따라 정렬되도록, 상기 제1 패널을 상기 제2 패널에 대하여 접어서 닫는 단계; 및
    d) 상기 결과 창 내에 표시되는 색 변화를 관찰하는 단계를 포함하는 박테리아성 감염을 분석하기 위한 지시 장치의 사용 방법.
  10. 제9항에 있어서, 양성 또는 음성 시각 신호를 포함하는 도식 또는 대조군 기준과 상기 표시된 색 변화를 비교하는 단계를 추가적으로 포함하는 방법.
  11. 샘플 접촉 구역 내의 흡수 패드, 솔바토크로믹 염료를 갖고 샘플 접촉 구역에 대향하는 검출 구역, 및 결과 시각화 창을 포함하여, 흡수 패드 위에 관련된 시험 샘플을 가지는 상기 흡수 패드가 상기 솔바토크로믹 염료와 접촉한 경우, 시각 신호가 상기 결과 시각화 창에 표시되고,
    상기 흡수 패드 및 샘플 접촉 구역이 적어도 제1 기판의 일부이고, 상기 검출 구역 및 솔바토크로믹 염료가 제1 기판에 대향하는 제2 기판 위에 위치하고, 상기 결과 시각화 창이 광학축을 따라 상기 샘플 접촉 구역 및 검출 구역과 정렬되고,
    상기 제1 기판 및 제2 기판은 하나의 동일한 기판을 자체 절첩하여 형성된 두 개의 패널인, 박테리아성 병원체 검출을 위한 검출 장치.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 제11항에 있어서, 동일한 기판의 제3 패널을 추가적으로 포함하고, 이는 자체 절첩되는 경우 상기 샘플 접촉 구역 및 검출 구역 사이에 위치하고, 상기 제3 패널이 상기 샘플 접촉 구역 및 검출 구역과 정렬되고 이에 맞는 잘라낸 반응 창을 가지는, 박테리아성 병원체 검출을 위한 검출 장치.
  15. 제11항 또는 제14항에 있어서, 상기 솔바토크로믹 염료의 색의 변화가 박테리아성 병원체의 존재를 지시하는, 박테리아성 병원체 검출을 위한 검출 장치.
  16. 제15항에 있어서, 상기 색 변화가 상기 솔바토크로믹 염료와 박테리아 세포성 잔류물 사이의 반응으로부터 야기되는, 박테리아성 병원체 검출을 위한 검출 장치.
  17. 제15항에 있어서, 상기 색 변화가 상기 시험 샘플 내의 박테리아의 상대 농도(CFU/mL 단위)에 따라 전개 시간이 변화하는, 박테리아성 병원체 검출을 위한 검출 장치.
  18. 제15항에 있어서, 상기 솔바토크로믹 염료가 반응의 10 분 후에 색 변화를 일으키지 않는 경우, 상기 시험 샘플 내에 박테리아성 병원체의 부재를 지시하는, 박테리아성 병원체 검출을 위한 검출 장치.
  19. 제15항에 있어서, 상기 솔바토크로믹 염료가 영구적인 양쪽이온성 형태의 지시자 또는 메로시아닌 지시자 중 하나 이상을 포함하는, 박테리아성 병원체 검출을 위한 검출 장치.
  20. 제15항에 있어서, 상기 시각 신호가 육안에 의해 관찰가능하거나, 또는 전자적 또는 디지털 광학 영상화 시스템에 의해 정량화가능한, 박테리아성 병원체 검출을 위한 검출 장치.

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