KR101796110B1 - 샘플 투입 및 결과 발생 처리를 제공하기 위한 단일한 바이오칩 및 이의 제조 방법 - Google Patents

샘플 투입 및 결과 발생 처리를 제공하기 위한 단일한 바이오칩 및 이의 제조 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101796110B1
KR101796110B1 KR1020127026428A KR20127026428A KR101796110B1 KR 101796110 B1 KR101796110 B1 KR 101796110B1 KR 1020127026428 A KR1020127026428 A KR 1020127026428A KR 20127026428 A KR20127026428 A KR 20127026428A KR 101796110 B1 KR101796110 B1 KR 101796110B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
fluid
pneumatic
biochip
plate
figures
Prior art date
Application number
KR1020127026428A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20130051439A (ko
Inventor
리차드 에프. 셀덴
유진 탄
Original Assignee
네트바이오, 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 네트바이오, 인코포레이티드 filed Critical 네트바이오, 인코포레이티드
Publication of KR20130051439A publication Critical patent/KR20130051439A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101796110B1 publication Critical patent/KR101796110B1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44704—Details; Accessories
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502715—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by interfacing components, e.g. fluidic, electrical, optical or mechanical interfaces
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/52—Containers specially adapted for storing or dispensing a reagent
    • B01L3/523—Containers specially adapted for storing or dispensing a reagent with means for closing or opening
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L7/00—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
    • B01L7/52—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44756—Apparatus specially adapted therefor
    • G01N27/44791—Microapparatus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/10—Devices for transferring samples or any liquids to, in, or from, the analysis apparatus, e.g. suction devices, injection devices
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/10—Integrating sample preparation and analysis in single entity, e.g. lab-on-a-chip concept
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/16—Reagents, handling or storing thereof
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/04—Closures and closing means
    • B01L2300/041—Connecting closures to device or container
    • B01L2300/044—Connecting closures to device or container pierceable, e.g. films, membranes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/0681—Filter
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B01L2300/0816—Cards, e.g. flat sample carriers usually with flow in two horizontal directions
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/12—Specific details about materials
    • B01L2300/123—Flexible; Elastomeric
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/18—Means for temperature control
    • B01L2300/1805—Conductive heating, heat from thermostatted solids is conducted to receptacles, e.g. heating plates, blocks
    • B01L2300/1822—Conductive heating, heat from thermostatted solids is conducted to receptacles, e.g. heating plates, blocks using Peltier elements
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/0415—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces electrical forces, e.g. electrokinetic
    • B01L2400/0421—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces electrical forces, e.g. electrokinetic electrophoretic flow
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0475—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure
    • B01L2400/0481—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure squeezing of channels or chambers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0475—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure
    • B01L2400/0487—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure fluid pressure, pneumatics
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/06—Valves, specific forms thereof
    • B01L2400/0633—Valves, specific forms thereof with moving parts
    • B01L2400/0655—Valves, specific forms thereof with moving parts pinch valves
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/06—Valves, specific forms thereof
    • B01L2400/0677—Valves, specific forms thereof phase change valves; Meltable, freezing, dissolvable plugs; Destructible barriers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/06—Valves, specific forms thereof
    • B01L2400/0688—Valves, specific forms thereof surface tension valves, capillary stop, capillary break
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/10—Devices for transferring samples or any liquids to, in, or from, the analysis apparatus, e.g. suction devices, injection devices
    • G01N2035/1027—General features of the devices
    • G01N2035/1034—Transferring microquantities of liquid
    • G01N2035/1044—Using pneumatic means

Abstract

본 발명은 작업자 개재 없이 수행되는 샘플의 삽입으로부터 결과의 발생까지의 복잡한 처리에서 모든 단계의 통합을 위한 바이오칩에 관한 것이다. 상기 바이오칩은 일련의 스크립트화 처리 단계로 전기영동 기계 서브시스템에 의해 작동되는 미세유체 처리 서브어셈블리(18, 27, 28, 29), 유체 서브어셈블리(1, 2,3), 공압 서브어셈블리(14, 15, 16) 및 분리 및 검출 서브어셈블리(32)를 포함한다. 본 발명은 사출 성형에 의한 높은 특징부 밀도의 상기 복잡한 바이오칩을 제작하는 방법을 또한 제공한다.

Description

샘플 투입 및 결과 발생 처리를 제공하기 위한 단일한 바이오칩 및 이의 제조 방법{UNITARY BIOCHIP PROVIDING SAMPLE-IN TO RESULTS-OUT PROCESSING AND METHODS OF MANUFACTURE}
발명의 배경
미세유체 분야는 적은 유체 부피, 통상적으로 1 밀리리터 미만인 유체 부피의 조작과 관련된 것으로 광범위하게 규정될 수 있다. 임상 검정에서 미세유체 부피를 이용하는 개념은 1960년대 후반 및 1970년대 초반까지 거슬러 올라가는 시대의 통상적인 방법에 비해 유의한 개선을 제공한다. 당업자는 적은 부피의 분석물이 더 적은 실험실 공간, 개선된 정밀함 및 정확도, 증가된 처리량, 감소된 비용, 및 진정한 자동화와의 양립성을 필요로 하는 휴대용 기계를 발생시키는 것을 인지하나, 당시 개발된 시스템은 간단하며, 미세유체의 요망되는 장점을 실현시키지 못했다. 하나의 초기 시스템은 작은 원심분리 로터로 옮겨지고 여기에서 혼합되는 1-10 μl의 샘플 및 70-110 μl의 시약의 분석을 기초로 하였다(Anderson, N. (1969). Computer interfaced fast analyzers. Science 166: 317-24; 및 Burtis, C et al. (1972). Development of a miniature fast analyzer. Clinical Chemistry 18:753-61). 상기 로터는 첫번째로 보고된 미세유체 바이오칩일 것이다.
1990년대에, 미세유체 분야의 이론적 기초는 용어 "소형화 전체 화학 분석 시스템" 또는 "μ-TAS"를 만들어낸 만츠(Manz)에 의해 추가로 특성규명되었으며, 상기 용어는 만츠가 고려한 것이 차세대 미세유체 장치인 것을 규정한다. 만츠는 상기 장치가 모든 필요한 샘플 취급 단계를 수행할 수 있는 것을 제시하였다. 만츠에 의해 정해진 목적은 작업자의 개재 없이 샘플의 삽입으로부터 결과의 발생까지 복잡한 일련의 처리 단계를 수행할 수 있는 총체적, 즉, 완전히 통합된 분석 시스템을 제공하기 위해 최신의 미세유체공학에서 주요 목표를 확립하는 돕는 것이었다. 구 "칩 상의 실험실(laboratory on a chip)"의 광범위한 채택을 발생시킨 복잡한 일련의 샘플 조작 및 처리 단계를 통합시키는 것이 유망하다.
최초의 초기 노력 후에 원심분리 시스템에서의 작업이 지속되었고, 미세유체 컴팩트 디스크 드라이브를 사용한 샌드위치 면역검정을 위한 시판되는 원심분리 시스템을 생성시켰다. 그러나, 상기 시스템은 완전히 통합되지 않았고, 더욱 정확하게는 시약이 컴팩트 디스크로부터 및 캠팩트 디스크로 로봇 방식으로 전달되는 워크스테이션으로 언급되어야 한다. 또한, 면역검정은 포획 컬럼을 통해 샘플을 통과시키는 것을 기초로 하는 매우 간단한 방법이었다. 상기 시스템은 시약 비용을 감소시키기 위해 미세유체 부피를 이용하였으나, 이는 완전히 통합된 시스템을 제공하거나 복잡한 일련의 샘플 조작 및 처리 단계를 통합시키는 미세유체의 가망성을 제공하지 않았다.
유사하게, 다른 작업자가 전혈로부터 혈장을 분별하는 연성 엠보싱(embossing)에 의한 폴리(메틸 메타크릴레이트)[PMMA]에서의 회전 바이오칩을 제작하였다. 혈액 샘플에서의 다양한 관심 분석물의 측정을 위한 회전 미세유체 바이오칩의 적용이 존재하였다. 그러나, 상기 장치는 간단한 분석물 시험, 예를 들어, 혈액 샘플 내의 관심 분석물의 양 확립에 대해 개발되었다. 상기 샘플은 복잡한 일련의 샘플 조작 및 처리 단계에 적용되지 않으며, 거의 20년의 개발 후에도, 확립된 통상적인 검정과 관련되는 유의한 신뢰성 문제를 여전히 가질 수 있다.
일반적으로, CD-기반 바이오칩은 주요한 결점 및 한계를 갖는다. 첫째로, 이들은 충분한 처리 복잡도(complexity)가 가능하지 않다. 이러한 바이오칩은 상대적으로 간단한 처리, 예를 들어, 특정 세포 분리(통상적인 원심분리 기계류에 대한 대체물 작용) 및 고 처리량 면역검정(통상적인 검정의 혼합 및 인큐베이션에 대한 대체로 작용)으로 제한된다. 둘째로, 유체 수송의 유도로서의 원심분리력의 사용이 제한된다. 예를 들어, 바이오칩을 회전시키기 위한 필요조건은 샘플 처리 방법에 큰 제한을 두게 하고 - 샘플은 간접적(수작업 개재 또는 추가 기계류를 필요로 함) 또는 직접적(예를 들어, 혈액 수집 튜브 또는 면봉은 원심분리에 또한 적용되는 것을 필요로 함)으로 도입되어야 한다. 더욱이, 회전 바이오칩에서의 처리 유동은 단일방향성으로 진행되고, 바이오칩의 반경은 샘플 처리 단계가 발생하는데 이용가능한 영역을 제한한다(처리 복잡도를 제한하는 요인 중 하나).
부수적으로, CD-기반 바이오칩에 대한 대안이 연구되었다. 다수의 그룹이 SBS(생체분자 스크리닝 학회(Society for Biomolecular Screening), 마이크로플레이트 표준 개발 위원회, ANSI/SBS1, Danbury, CT, 2004) 표준을 이용한 미세역가 플레이트를 기초로 하여 미세유체 바이오칩을 연구하였다. SBS는 풋프린트(footprint)(127.76 내지 85.48 mm, 10,920.9 mm2), 높이, 및 플랜지(flange) 치수 밖의 하부 및 웰(well) 위치를 포함하는 미세역가 플레이트에 대한 일련의 공개된 표준을 개발하였다. 이러한 표준은 이용되는 제작 처리와 상관 없이 시판 제조업체 및 학술 그룹에 의해 통합되었다. 미세유체 미세역가 플레이트가 DNA 정제 및 단백질 결정화를 포함하는 다수의 처리에 대해 개발되었다. 이러한 바이오칩은 도입 전의 샘플 예비-처리를 필요로 하고, 단지 2 단계의 DNA 정제 처리를 수행하며, 처리의 DNA 생성물의 어떠한 분석도 수행하지 않는다.
유사하게, 다른 그룹은 나노리터 부피 시약의 혼합, 살아 있는 세포 현미경검사 동안의 배지 교환, 및 세포 및 시약의 분배와 같은 작업을 위한 SBS 표준을 기초로 하여 직사각형의 미세유체 플레이트를 사용하였다. 또 다른 작업자는 웰로의 시약의 고-처리량 분배를 위한 로봇식 시스템에서 사용되는 직사각형 바이오칩을 적합화시켰다. 또 다른 그룹은 웰-내-웰(well-in-a-well) 장치에서의 생물학적 신호 증폭에 의한 단백질 검출을 위한 직사각형 바이오칩을 개발하였다.
바이오칩 개발의 진행에서, SBS 포맷의 미세유체 특징부의 사용을 기초로 하는 다수의 "통합된 유체 회로" 제품이 상품화되었다. 예를 들어, 바이오칩은 48개의 단일 누클레오티드 다형성(SNP)의 각각에 대해 48개의 샘플을 질의할 수 있는 어레이를 이용한 단일 누클레오티드 다형성(SNP) 유전형 분석을 수행한다. 상기 처리는 먼저 미세유체 플레이트 외부에서 정제된 DNA 및 반응 혼합물을 준비하고, 플레이트를 제어기에 두고, 플레이트를 프라이밍(priming)시키고, 플레이트에서 45분에 걸쳐 시약을 로딩하고 혼합하고, PCR을 위해 열 사이클러(thermal cycler)에 플레이트를 두고, 플레이트를 형광 검출 기계로 옮김으로써 수행된다. 이러한 바이오칩은 도입 전에 샘플 전-처리를 필요로 하고, 칩상(on-chip) 샘플 처리 동안 여러 수작업 단계를 필요로 하고, 시약을 통합시키지 않고, 상기 처리의 DNA 생성물의 임의의 분석을 수행하지 않는다.
유사한 상업적 방법은 마이크론 규모의 유동 세포 장치를 SBS-표준 웰 플레이트에 통합시키는 웰 플레이트 미세유체 기술을 이용하여 혈소판 부착을 측정한다. 상기 처리는 미세유체 채널을 코팅시키기 위해 관심 단백질을 수작업으로 도입시키고, 채널을 관류시키고, 세척하고, 관심 세포 샘플을 수작업으로 준비하고, 세포 샘플을 미세유체 채널에 첨가하고, 추가 처리 및 분석을 위해 플레이트를 워크스테이션에 두는 것을 포함하는 다수의 전-처리 단계를 필요로 한다. 다양한 화합물에 상피 세포를 노출시킴으로써 상처 치유를 연구하기 위해 유사한 방법이 적용되었다. 이러한 바이오칩은 도입 전에 광범위한 샘플 전-처리를 필요로 한다.
종래의 많은 미세유체 바이오칩은 바이오칩을 제작하기 위해 실리콘 또는 유리와 같은 물질의 사용을 기초로 한다. 그러나, 실리콘 및 유리 바이오칩은 높은 거래량의 상업적 적용으로 제작하기에는 매우 고비용(하나의 바이오칩에 대해 수천 달러까지 비용이 듬)이며, 따라서, 1회-사용의 일회용품에 대해 비실용적이다. 또한, 재사용의 필요성으로 인해, 상기 바이오칩은 가동간(run-to-run) 오염(인간 신원 및 임상 진단에 대한 문제)의 문제를 발생시키고, 바이오칩이 기계에서의 재사용 용으로 제조되는 경우 기계 복잡도와 관련된 문제를 발생시키고, 바이오칩이 기계 외부에서의 재사용 용으로 제조되는 경우 로지스틱(logistics)과 관련된 문제를 발생시킨다.
미세유체의 실현되지 못한 잠재적을 실현시키기 위해, 작업자 조작에 대한 필요조건이 존재하지 않는 완전히 통합된 샘플 투입 및 결과 발생(sample-in to results out) 시스템의 환경에서 하나 이상의 샘플에 대한 복잡한 일련의 처리 단계를 동시에 수행할 수 있는 미세유체 바이오칩 및 시스템이 필요하다. 그러나, 현재까지 개발된 바이오칩은 분석에 필요한 단계의 단지 서브셋만 수행하고, 복잡한 일련의 처리 단계를 수행할 수 없고, 단일 장치에서 분석 결과를 발생시킬 수 없다. 또한, 이러한 바이오칩 및 시스템은 대량 생산에 맞지 않는 물질 및 방법을 이용한다.
발명의 개요
일반적으로, 한 양태에서, 본원에 기재된 기술은 작업자 개재 없이 수행되는 샘플의 삽입으로부터 결과의 발생까지의 복잡한 처리에서 모든 단계의 통합을 갖는 바이오칩에 관한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명의 기술에 따른 바이오칩은 일련의 처리 단계에서 기계 서브시스템(subsystem)에 의해 작동되는 미세유체 및 대량유체 특징부(feature)를 포함한다.
또 다른 양태에서, 상기 기술은 높은 특징부 밀도를 포함시키기 위한 복잡한 바이오칩의 제작을 위한 방법에 관한 것이다. 한 구체예에서, 상기 방법은 바이오칩을 형성시키기 위한 플라스틱 물질의 사출성형을 포함한다.
또 다른 양태에서, 상기 기술은 공압(pneumatic), 열, 고전압, 및 광학 서브시스템, 및 처리 제어기를 갖는 전기영동 기계내로 삽입시 적어도 하나의 샘플로부터 핵산 시퀀싱(sequencing) 또는 사이징(sizing) 프로파일을 발생시키는 바이오칩에 관한 것이다. 바이오칩은 유체 서브어셈블리 및 공압 서브어셈블리와 연관된 대량유체 처리 서브어셈블리를 포함한다. 대량유체 처리 서브어셈블리는 샘플을 수용하도록 적합된 적어도 하나의 챔버를 포함한다. 유체 서브어셈블리는 유체 플레이트, 및 적어도 하나의 유체 수송 채널 및 열 서브시스템에 연결되도록 적합된 증폭 챔버를 포함한다. 공압 서브어셈블리는 기계의 공압 서브시스템, 및 바이오칩의 서브어셈블리들에 연결되도록 적합된다. 공압 서브어셈블리는 공압 플레이트, 및 상기 처리 제어기로부터의 명령시 공압으로 유체를 유도하는 하나 또는 다수의 유도 라인(drive line)을 포함한다. 바이오칩은 또한 기계 상의 고전압 및 광학 서브시스템 및 처리 제어기에 연결되도록 적합된 분리 및 검출 서브어셈블리를 포함한다. 분리 및 검출 서브어셈블리는 분리 채널, 및 기계 상에서 채널 각각으로부터 광학 서브시스템으로 신호를 보내도록 위치된 검출 영역을 포함한다. 바이오칩은 플라스틱의 단일한 고정 바이오칩이고, 유체 및/또는 공압 플레이트의 풋프린트(footprint)는 약 86 mm 내지 128 mm 또는 그 초과(예를 들어, 약 100 x 150 mm 또는 그 초과, 약 115 x 275 mm 또는 그 초과, 약 115 x 275 mm 또는 그 초과, 약 140 x 275 mm 또는 그 초과, 165 x 295 mm 또는 그 초과)이다.
또 다른 양태에서, 상기 기술은 공압, 열, 고전압, 및 광학 서브시스템, 및 처리 제어기를 갖는 전기영동 기계내로 삽입시 적어도 하나의 샘플로부터 핵산 시퀀싱 또는 사이징 프로파일을 발생시키는 바이오칩에 관한 것이다. 바이오칩은 유체 서브어셈블리 및 공압 서브어셈블리와 연관된 대량유체 처리 서브어셈블리를 포함한다. 대량유체 처리 서브어셈블리는 샘플을 수용하도록 적합된 적어도 하나의 챔버를 포함한다. 유체 서브어셈블리는 유체 플레이트, 및 적어도 하나의 유체 수송 채널 및 열 서브시스템에 연결되도록 적합된 증폭 챔버를 포함한다. 공압 서브어셈블리는 기계의 공압 서브시스템, 및 바이오칩의 서브어셈블리들에 연결되도록 적합된다. 공압 서브어셈블리는 공압 플레이트, 및 상기 처리 제어기로부터의 명령시 공압으로 유체를 유도하는 하나 또는 다수의 유도 라인을 포함한다. 바이오칩은 또한 기계 상의 고전압 및 광학 서브시스템 및 처리 제어기에 연결되도록 적합된 분리 및 검출 서브어셈블리를 포함한다. 분리 및 검출 서브어셈블리는 분리 채널, 및 기계 상에서 채널 각각으로부터 광학 서브시스템으로 신호를 보내도록 위치된 검출 영역을 포함한다. 바이오칩은 플라스틱의 단일한 고정 바이오칩이고, 유체 및/또는 공압 플레이트의 풋프린트는 10,920.0 mm2 미만이고, SBS 표준을 따르지 않는다.
또 다른 양태에서, 상기 기술은 공압, 열, 고전압, 및 광학 서브시스템, 및 처리 제어기를 갖는 전기영동 기계내로 삽입시 적어도 하나의 샘플로부터 핵산 시퀀싱 또는 사이징 프로파일을 발생시키는 바이오칩에 관한 것이다. 바이오칩은 유체 서브어셈블리 및 공압 서브어셈블리와 연관된 대량유체 처리 서브어셈블리를 포함한다. 대량유체 처리 서브어셈블리는 대량유체 처리 서브어셈블리 내 또는 상에 위치된 적어도 하나의 대량유체 특징부 및 샘플을 수용할 수 있는 챔버를 포함한다. 유체 서브어셈블리는 유체 플레이트, 및 유체 서브어셈블리 내 또는 상에 위치된 적어도 하나의 특징부를 포함한다. 유체 서브어셈블리는 적어도 하나의 유체 수송 채널 및 열 서브시스템에 연결되도록 적합된 증폭 챔버를 추가로 포함한다. 공압 서브어셈블리는 기계의 공압 서브시스템 및 바이오칩의 서브어셈블리들에 연결되도록 적합된다. 공압 서브어셈블리는 공압 플레이트 및 공압 서브어셈블리 내 또는 상에 위치된 적어도 하나의 특징부를 포함한다. 공압 서브어셈블리는 상기 처리 제어기로부터의 명령시 공압으로 유체를 유도하는 하나 또는 다수의 유도 라인을 추가로 포함한다. 바이오칩은 또한 기계 상의 고전압 및 광학 서브시스템 및 처리 제어기에 연결되도록 적합된 분리 및 검출 서브어셈블리를 포함한다. 분리 및 검출 서브어셈블리는 분리 및 검출 서브어셈블리 내 또는 상에 위치된 적어도 하나의 특징부를 포함한다. 분리 및 검출 서브어셈블리는 분리 채널, 및 기계 상에서 채널 각각으로부터 광학 서브시스템으로 신호를 보내도록 위치된 검출 영역을 추가로 포함한다. 바이오칩은 플라스틱의 단일한 고정 바이오칩이고, 유체, 공압, 및/또는 분리 및 검출 서브어셈블리의 하나 이상의 특징부의 물리적 상태는 25개 또는 그 초과(예를 들어, 50개 또는 그 초과, 100개 또는 그 초과, 200개 또는 그 초과)의 단계의 스크립트화 처리(scripted process)에서의 변화에 적합된다. 일부 구체예에서, 스크립트화 처리 단계는 2 이상의 결과적으로 발생하는 처리 단계가 바이오칩 내에서 발생하도록 한다.
또 다른 양태에서, 상기 기술은 공압, 열, 고전압, 및 광학 서브시스템, 및 처리 제어기를 갖는 전기영동 기계내로 삽입시 적어도 하나의 샘플로부터 핵산 시퀀싱 또는 사이징 프로파일을 발생시키는 바이오칩에 관한 것이다. 바이오칩은 유체 서브어셈블리 및 공압 서브어셈블리와 연관된 대량유체 처리 서브어셈블리를 포함한다. 대량유체 처리 서브어셈블리는 샘플을 수용하도록 접합된 적어도 하나의 챔버를 포함한다. 유체 서브어셈블리는 플레이트의 각 면 상에 적어도 하나의 유체 수송 채널을 형성하는 유체 플레이트 상에 결합된 상부 및 하부 패턴화된 열가소성 시트를 갖는 유체 플레이트 및 열 서브시스템에 연결되도록 적합된 증폭 챔버를 포함한다. 공압 서브어셈블리는 기계의 공압 서브시스템, 및 상기 바이오칩의 서브어셈블리들에 연결되도록 적합된다. 공압 서브어셈블리는 공압 플레이트 상에 결합된 상부 패턴화된 열가소성 시트를 갖는 공압 플레이트, 및 처리 제어기로부터의 명령시 공압으로 유체를 유도하는 하나 또는 다수의 유도 라인을 포함한다. 바이오칩은 또한 유체 서브어셈블리와 공압 서브어셈블리 사이에 위치되고 이에 연결된 밸브 서브어셈블리, 및 기계 상에서 고전압 및 광학 서브시스템 및 처리 제어기에 연결되도록 적합된 분리 및 검출 서브어셈블리를 포함한다. 분리 및 검출 서브어셈블리는 적어도 하나의 분리 채널을 포함하고, 상기 기계 상에서 적어도 하나의 분리 채널 각각으로부터 광학 서브시스템으로 신호를 보내도록 위치된 검출 영역을 추가로 포함한다.
상기 기술의 상기 양태의 구체예 중 일부는 하기 특징부 중 하나 이상을 포함한다. 대량유체, 공압, 유체, 및 분리 및 검출 서브시스템 중 하나 이상이 플라스틱으로 형성된다. 일부 구체예에서, 밸브 서브어셈블리는 적어도 하나의 엘라스토머 밸브를 포함한다. 일부 구체예에서, 밸브 서브어셈블리는 적어도 하나의 비-엘라스토머 밸브를 포함한다. 구체예에서, 분리 및 검출 서브어셈블리는, 분리 및 검출 어셈블리 내의 샘플의 전기영동이 유체 플레이트를 통한 샘플의 일반적인 유동과 반대 방향으로 수행되도록 배향된다. 구체예에서, 바이오칩은 적어도 하나의 샘플을 처리하기 위해 필요한 모든 시약을 바이오칩 내에 포함한다.
또 다른 양태에서, 상기 기술은 생물학적 샘플을 처리하기 위한 시스템에 관한 것이다. 상기 시스템은 바이오칩 및 처리 제어기를 포함한다. 바이오칩은 공압, 열, 고전압 및 광학 서브시스템, 및 처리 제어기를 갖는 전기영동 기계내로 삽입시 적어도 하나의 샘플로부터 핵산 시퀀싱 또는 사이징 프로파일을 발생시킨다. 바이오칩은 유체 서브어셈블리 및 공압 서브어셈블리와 연관된 대량유체 처리 서브어셈블리를 포함한다. 대량유체 처리 서브어셈블리는 샘플을 수용하도록 적합된 적어도 하나의 챔버를 포함한다. 유체 서브어셈블리는 플레이트의 각 면 상에 적어도 하나의 유체 수송 채널을 형성하는 유체 플레이트 상에 결합된 상부 및 하부 패턴화된 열가소성 시트를 갖는 유체 플레이트 및 열 서브시스템에 연결되도록 적합된 증폭 챔버를 포함한다. 상기 기계의 공압 서브시스템, 및 상기 바이오칩의 서브어셈블리들에 연결되도록 적합된 공압 서브어셈블리는 공압 플레이트 상에 결합된 상부 패턴화된 열가소성 시트를 갖는 공압 플레이트, 및 처리 제어기로부터의 명령시 공압으로 유체를 유도하는 하나 또는 다수의 유도 라인을 포함한다. 바이오칩은 또한 상기 유체 서브어셈블리와 공압 서브어셈블리 사이에 위치되고 이에 연결된 밸브 서브어셈블리 및 기계 상에서 고전압 및 광학 서브시스템 및 처리 제어기에 연결되도록 적합된 분리 및 검출 서브어셈블리를 포함한다. 분리 및 검출 서브어셈블리는 적어도 하나의 분리 채널, 및 기계 상에서 적어도 하나의 분리 채널 각각으로부터 광학 서브시스템으로 신호를 보내도록 위치된 검출 영역을 포함한다. 상기 기계의 처리 제어기는 25개 또는 그 초과의 자동화된 스크립트화 처리 단계를 수행하기 위한 명령을 포함한다.
또 다른 양태에서, 상기 기술은 바이오칩을 제조하는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 유체 상부면, 유체 하부면, 및 유체 상부면을 유체 하부면에 연결시키기 위한 유체 상부면으로부터 유체 하부면으로 연장된 적어도 하나의 스루 홀(through hole)을 포함하도록 유체 플레이트를 사출 성형시키는 것을 포함한다. 유체 상부면 및 하부면 각각은 다수의 미세유체 특징부를 포함한다. 상기 방법은 공압 상부면, 공압 하부면, 및 공압 상부면을 공압 하부면에 연결시키기 위한 공압 상부면으로부터 공압 하부면으로 연장된 적어도 하나의 스루 홀을 포함하도록 공압 플레이트를 사출 성형시키는 것을 추가로 포함한다. 공압 상부면 및 하부면 각각은 다수의 미세유체 특징부를 포함한다. 상기 방법은 또한 바이오칩을 형성시키기 위해 공압 및 유체 플레이트를 정렬시키는 것을 포함하며, 여기서 유체 및/또는 공압 플레이트의 풋프린트는 86 mm 내지 128 mm 또는 그 초과이고, 유체 플레이트 및/또는 공압 플레이트의 다수의 미세유체 특징부 중 적어도 하나는 2도 미만의 구배각(draft angle)을 포함한다.
또 다른 양태에서, 상기 기술은 유체 서브어셈블리 및 공압 서브어셈블리와 유체 소통하는 대량유체 처리 서브어셈블리를 갖는 단일한 바이오칩에서 적어도 하나의 처리되지 않은 샘플에 대해 샘플 투입 및 결과 발생(sample-in to results out)의 자동화된 전기영동을 수행하는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은, (a) 대량유체 처리 서브어셈블리 내의 챔버에 적어도 하나의 처리되지 않은 샘플을 삽입하는 단계; (b) 공압 서브시스템, 열 서브시스템, 고전압 서브시스템, 광학 서브시스템, 및 미리 정의된 처리 스크립트(script)를 수용할 수 있고, 처리 스크립트를 판독하고, 공압 서브시스템, 열 서브시스템, 고전압 서브시스템 및 광학 서브시스템을 제어함으로써 자동적으로 스크립트 처리를 이행할 수 있는 처리 제어기를 갖는 기계로 바이오칩을 삽입하는 단계; (c) (i) 공압 서브시스템으로부터 공압 서브어셈블리의 밸스 라인으로 압력을 적용시키거나 공압 서브어셈블리와 유체 소통함으로써 바이오칩을 초기화시키는 명령, (ii) 저장된 시약을 방출시키기 위해 공압 서브시스템으로부터 대량유체 처리 서브어셈블리로 압력을 적용시키고, 처리되지 않은 샘플로부터 세포 용해질을 형성시키기 위해 공압 서브시스템으로부터 방출된 시약으로 압력을 적용시키고, 용해질 내의 DNA를 결합시키기 위해 유체 서브어셈블리 내의 정제 필터를 통해 용해질을 홀딩 챔버로 끌어 당겨 공압 서브시스템으로부터 필터로 압력을 적용시키고, 대량유체 처리 서브어셈블리 내에 저장된 세척 용액을 방출시켜 정제 필터를 통해 유동시키기 위해 공압 서브시스템으로부터 압력을 적용시킴으로써 결합된 DNA로부터 오염물질을 제거시키고, 결합된 DNA를 건조시키기 위해 정제 필터를 통해 공기를 유동시키기 위해 압력을 적용시키고, 정제 필터로부터 결합된 DNA를 방출시키기 위해 대량유체 처리 서브어셈블리 내에 저장된 용리 용액을 방출시키기 위해 공압 서브시스템으로부터 압력을 적용시킴으로써 처리되지 않은 샘플로부터 DNA를 정제시켜 정제된 DNA를 함유하는 용리액을 생성시키는 명령, (iii) 공압 서브시스템으로부터 공압 서브어셈블리로 압력을 적용시킴으로써 동결건조된 PCR 반응 혼합물을 함유하는 재구성 챔버로 용리액을 수송시키는 명령, (iv) 유체 서브어셈블리 내의 열 사이클링 챔버로 재구성된 PCR 반응 혼합물을 수송시키는 명령, (v) PCR 혼합물로부터 표지된 앰플리콘을 생성시키기 위해 열 주기 프로토콜을 개시시킴으로써 열 사이클링 챔버에 열을 적용시키는 명령, (vi) 공압 서브시스템으로부터 공압 서브어셈블리로 압력을 적용시킴으로써 표지된 앰플리콘 및 대량유체 처리 서브어셈블리 내에 저장된 포름아미드 시약을 유체 서브어셈블리 내의 결합 챔버로 수송시키는 명령으로서, 상기 표지된 앰플리콘 및 포름아미드 시약이 포름아미드-PCR 생성물 혼합물을 형성시키는 명령, (vii) ILS 케이크(cake)와의 혼합을 위한 ILS 케이크 챔버로 포름알데히드-PCR 생성물 혼합물을 유동시키기 위해 공압 시스템으로부터 공압 서브어셈블리로 압력을 적용시킴으로써 포름아미드-PCR 생성물 혼합물을 수송시켜 분리 및 검출 샘플을 생성시키는 명령, (viii) 공압 서브시스템으로부터 공압 서브어셈블리로 압력을 적용시킴으로써 유체 서브어셈블리 내의 캐쏘드(cathode) 챔버로 분리 및 검출 샘플을 수송시키는 명령, (ix) 고전압 서브시스템으로부터 전압을 적용시킴으로써 분리 및 검출의 분리를 위한 유체 서브어셈블리의 캐쏘드 및 애노드를 준비시켜 캐쏘드 및 애노드(anode)를 편향(bias)시키는 명령, (x) 공압 서브시스템으로부터 공압 서브어셈블리로의 압력의 적용에 의해 유체 서브어셈블리 내의 겔 시약 저장소로부터 유체 서브어셈블리의 캐쏘드 챔버 및 소모 챔버로 겔을 수송시키는 명령, (xi) 고전압 서브시스템을 통해 캐쏘드 및 애노드로 전압을 적용시킴으로써 분리 채널 내의 분리 및 검출 샘플을 주입하고 분리시키는 명령, 및 (xii) 광학 서브시스템 내의 레이저를 활성화시킴으로써 분리 및 검출 샘플의 분리된 구성요소의 형광을 발생시키는 명령을 포함하는 처리 스크립트를 수행하기 위해 처리 제어기를 활성화시키는 것을 포함한다. 상기 방법은 또한 적어도 하나의 처리되지 않은 샘플로부터의 분리 및 검출 샘플 결과를 제공하기 위해 분리된 구성요소의 형광 신호를 자동적으로 검출하는 것을 포함한다.
또 다른 양태에서, 상기 기술은 적어도 하나의 생물학적 샘플에 대한 샘플 투입 및 결과 발생(sample-in to results out) 처리의 적어도 2개의 유형을 제공하는 시스템에 관한 것이다. 상기 시스템은 고정 바이오칩 및 바이오칩과의 인터페이싱(interfacing)을 위한 공압, 열, 고전압 및 광학 서브시스템을 포함하는 기계, 및 처리 제어기를 포함한다. 고정 바이오칩은 유체 서브어셈블리 및 공압 서브어셈블리와 연관된 대량유체 처리 서브어셈블리를 포함한다. 대량유체 처리 서브어셈블리는 샘플을 수용하도록 적합된 적어도 하나의 챔버를 포함한다. 유체 서브어셈블리는 유체 플레이트, 및 적어도 하나의 유체 수송 채널 및 열 서브시스템에 연결되도록 적합된 증폭 챔버를 포함한다. 상기 기계의 공압 서브시스템, 및 상기 바이오칩의 서브어셈블리들에 연결되도록 적합된 공압 서브어셈블리는 공압 플레이트 및 처리 제어기로부터의 명령시 공압으로 유체를 유도하는 하나 또는 다수의 유도 라인을 포함한다. 바이오칩은 또한 기계 상에서 고전압 및 광학 서브시스템 및 처리 제어기에 연결되도록 적합된 분리 및 검출 서브어셈블리를 포함한다. 분리 및 검출 서브어셈블리는 분리 채널, 및 기계 상에서 채널 각각으로부터 광학 서브시스템으로 신호를 보내도록 위치된 검출 영역을 포함한다. 바이오칩은 샘플 처리를 위한 적어도 2개의 별개의 경로를 추가로 포함한다. 적어도 2개의 독립된 경로 각각은 상이한 분석 처리에 대해 전용이다. 상기 기계의 처리 제어기는 상이한 분석 처리로 적어도 하나의 생물학적 샘플을 처리하기 위한 일련의 명령들을 포함한다. 일부 구체예에서, 상이한 분석 처리는 STR 분석 및 단일 누클레오티드 다형성(single nucleotide polymorphism) 분석이다. 일부 구체예에서, 상이한 분석 처리는 다중 증폭 및 DNA 시퀀싱이다. 일부 구체예에서, 상이한 분석 처리는 STR 분석 및 미토콘드리아 DNA 시퀀싱이다. 일부 구체예에서, 상이한 분석 처리는 역전사 PCR 및 통상적인 PCR이다. 일부 구체예에서, 상이한 분석 처리는 DNA 시퀀싱 및 단일 누클레오티드 다형성 분석이다.
또 다른 양태에서, 상기 기술은 대량유체 블록 및 덮개를 포함하는 바이오칩을 위한 시약 저장 용기에 관한 것이다. 대량유체 블록은 상단 및 하단을 갖는 시약 저장 챔버; 하단에 결합된 제 1 호일 밀봉부(seal); 및 상단에 결합된 제 2 호일 밀봉부를 포함한다. 시약은 호일-밀봉된 챔버에 저장되고, 시약은 덮개를 통한 공압의 적용에 의해 상부 및 하부 호일이 파열되어 시약 저장 챔버의 내용물이 방출되는 방식으로 방출된다.
상기 양태의 구체예는 하기 특징부 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 시약 저장 용기는 유체 서브어셈블리에 연결된다. 일부 구체예에서, 시약 저장 용기는 스페이서 플레이트가 파열 전에 제 1 호일의 팽창을 수용하기 위해 크기 조절되도록, 용기와 유체 서브어셈블리 사이에 배치되는 스페이서 플레이트를 추가로 포함한다.
최소의 작업자 개재 내지 작업자 개재 없음 및 감소된 제작 비용을 포함하나 이에 제한되지는 않는 본 발명의 기술의 장점이 다수 존재한다.
도면의 설명
상기 기재된 본 발명의 기술의 장점과 함께 추가 장점은 하기 수반되는 도면과 함께 하기 설명을 참조로 하여 보다 잘 이해될 수 있다. 도면은 반드시 일정한 비율은 아니며, 기술의 원리를 예시하는 경우 일반적인 비율 대신 강조되어 도시된다.
도 1은 단일 튜브 시약 저장 및 방출 장치의 구체예의 측면 개략도이다.
도 2는 시약 저장 방출 파열을 이용하는 5-샘플 바이오칩셋 구체예에 포함된 스페이서 플레이트의 구체예의 사진이다.
도 3은 스페이서 플레이트의 부분의 횡단면 개략도이다.
도 4는 다양한 두께의 알루미늄 호일에 대한 파열 압력 대 챔버 직경의 그래프이다.
도 5는 시약 저장의 6개의 챔버를 포함하는 시약 저장 방출 단위의 투시 개략도이다.
도 6은 각각의 챔버의 상단에 결합된 상부 호일을 나타내는 도 5의 시약 저장 방출 단위의 평면 개략도이다.
도 7은 파열 후의 시약 저장 방출 단위의 2개의 호일의 평면도 예시이다.
도 8은 공압으로 작동되는 엘라스토머 밸브 구조의 구체예의 평면 개략도이다.
도 9는 도 8의 공압으로 작동되는 밸브 구조의 횡단면 개략도이다.
도 10은 PSA 테입을 갖는 엘라스토머 막 밸브의 구체예의 평면 개략도이다.
도 11은 도 10의 밸브의 횡단면 개략도이다.
도 12는 단단한 밸브 막을 갖는 공압으로 작동되는 밸브의 구체예의 평면 개략도이다.
도 13은 도 12의 단단한 밸브 막을 갖는 공압으로 작동되는 밸브의 횡단면도이다.
도 14는 클램핑(clamping)된 엘라스토머 막 밸브의 구체예의 평면 개략도이다.
도 15는 도 12의 클램핑된 엘라스토머 막 밸브의 횡단면도이다.
도 16은 본 발명의 기술에 따른 바이오칩의 구체예에서 사용되는 벤트(vent) 막 형태의 횡단면 개략도이다.
도 17은 본 발명의 기술에 따른 바이오칩의 또 다른 구체예에서 사용되는 벤트 막 형태의 횡단면 개략도이다.
도 18은 본 발명의 기술에 따른 바이오칩의 구체예의 확대된 다기관(manifold) 및 주위 영역을 갖는 공압 플레이트의 평면 개략도이다.
도 19는 본 발명의 기술에 따른 바이오칩의 구체예의 확대된 다기관 및 주위 영역을 갖는 공압 플레이트의 저면 개략도(bottom view schematic)이다.
도 20은 본 발명의 기술에 따른 바이오칩의 구체예의 확대된 정제 영역 및 주위 영역을 갖는 유체 플레이트의 투시 개략도이다.
도 21은 바이오칩 상으로의 조절된 힘을 발휘하기 위해 사용되는 공압으로 활성화된 실린더의 사진이다.
도 22는 도 21의 공압으로 활성화된 실린더에 의해 바이오칩에 적용된 다양한 압력에 대한 각각의 STR 좌위에서의 신호 강도를 비교하는 막대 그래프이다. 그래프에서, 75, 112, 187, 224, 299, 및 336 psig의 압력이 적용되었고, 각각의 좌위에 대해, 신호 강도가 각각의 압력에 대해 기록된다(좌측으로부터 우측으로 압력 증가).
도 23은 본 발명의 기술에 따른 사출성형된 바이오칩의 구체예의 평면 개략도이다.
도 24는 본 발명의 기술에 따른 바이오칩의 유체 층 1의 구체예의 평면 개략도이다.
도 25는 본 발명의 기술에 따른 바이오칩의 유체 층 2의 구체예의 평면 개략도이다.
도 26은 본 발명의 기술에 따른 바이오칩의 공압 층 1의 구체예의 평면 개략도이다.
도 27은 본 발명의 기술에 따른 바이오칩의 공압 층 2의 구체예의 평면 개략도이다.
도 28은 도 25의 제 2 유체 플레이트에 결합된 도 24의 제 1 유체 플레이트를 포함하는 유체 서브어셈블리의 구체예의 투시 평면 개략도이다.
도 29는 도 27의 제 2 공압 플레이트에 결합된 도 26의 제 1 공압 플레이트를 포함하는 공압 서브어셈블리의 구체예의 투시 평면 개략도이다.
도 30은 도 28의 유체 서브어셈블리에 대한 도 29의 공압 서브어셈블리의 부착에 의해 형성된 바이오칩의 투시 평면 개략도이다.
도 31은 바이오칩과 연관되어 사용하기 위한 공압 및 열 사이클링 기계의 구체예의 사진이다.
도 32는 본 발명의 기술에 따른 바이오칩 내의 샘플의 PCR 분석을 위한 STR 프로파일이다.
도 33은 본 발명의 기술에 따른 유체 어셈블리의 구체예에 포함된 유체 플레이트의 구체예의 평면 개략도이다.
도 34는 도 33의 유체 플레이트의 저면 개략도이다.
도 35는 플레이트의 상부면 및 하부면의 특징부를 나타내는 유체 플레이트의 투시 개략도이다.
도 36은 유체 플레이트의 상부로의 부착을 위한 패턴화된 얇은 필름의 구체예의 평면 개략도이다.
도 37은 유체 플레이트의 하부로의 부착을 위한 패턴화된 얇은 필름의 구체예의 저면 개략도이다.
도 38은 유체 플레이트를 통해 채취된 단일 샘플의 경로를 나타내는 라인을 갖는 유체 플레이트의 구체예의 평면 개략도이다.
도 39는 정제 영역을 통한 경로의 일부를 나타내는 도 38의 유체 플레이트의 확대된 평면 개략도이다.
도 40은 증폭 영역을 통한 경로의 일부를 나타내는 도 38의 유체 플레이트의 확대된 평면 개략도이다.
도 41은 분리 및 검출 영역을 통한 경로의 일부를 나타내는 도 38의 유체 플레이트의 확대된 평면 개략도이다.
도 42는 본 발명의 기술에 따른 공압 어셈블리의 구체예에 포함된 공압 플레이트의 구체예의 평면 개략도이다.
도 43은 도 42의 공압 플레이트의 저면 개략도이다.
도 44는 공압 플레이트의 상부면 및 하부면 둘 모두의 특징부를 나타내는 도 42의 공압 플레이트의 투시도이다.
도 45는 공압 플레이트의 상부면으로의 부착을 위한 패턴화된 얇은 필름의 구체예의 평면 개략도이다.
도 46은 공압 플레이트의 하부면으로의 부착을 위한 패턴화된 얇은 필름의 구체예의 저면 개략도이다.
도 47은 대량유체 처리 서브어셈블리의 구체예에 포함된 대량유체 블록의 구체예의 투시 개략도이다.
도 48은 대량유체 블록에 대한 덮개의 상부층의 구체예의 평면 개략도이다.
도 49는 덮개의 상부층의 구체예의 저면 개략도이다.
도 50은 덮개의 상부층의 상부 투시 개략도이다.
도 51은 대량유체 블록에 대한 덮개의 제 2 층의 또 다른 구체예의 평면 개략도이다.
도 52는 대량유체 블록에 대한 덮개의 제 3 층의 또 다른 구체예의 평면 개략도이다.
도 53은 도 52의 덮개에 대한 제 3 층의 구체예의 저면 개략도이다.
도 54는 덮개에 대한 제 3 층의 투시 평면 개략도이다.
도 55는 압력 주입을 위한 분리 및 검출 바이오칩의 구체예의 평면 개략도이다.
도 56은 샘플의 동전기적(electrokinetic) 수송을 위한 교차 주입을 위한 분리 및 검출 바이오칩의 구체예의 평면 개략도이다.
도 57은 본 발명의 기술에 따른 바이오칩의 구체예의 평면 개략도 스택 업(stack up)이다.
도 58은 본 발명의 기술에 따른 바이오칩 어셈블리의 구체예의 사진이며, 이는 처리 흐름의 방향을 나타내는 화살표를 포함한다.
도 59는 도 58의 바이오칩 어셈블리의 사진이다. 바이오칩 어셈블리는 광학 서브시스템, 열 서브시스템, 고전압 서브시스템 및 공압 서브시스템, 및 처리 제어 서브시스템과 인터페이싱된다.
도 60은 본 발명의 기술에 따른 바이오칩의 구체예 내의 대조 ILS 샘플(ROX로 형광 표지된 단편)에 대해 생성된 대조 전기영동도이다.
도 61은 자동화된 스크립트 후의 하나의 구강 면봉(buccal swab) 샘플에 대해 생성된 STR 단편의 크기를 나타내는 전기영동도이다. PCR 반응 혼합물 및 ILS에서 STR 프라이머를 표지하는데 사용된 형광 염료 각각이 개별적 패널에 제시된다. 플루오레세인(Fluorescein)-표지된 단편은 상부 패널에 제시되고, JOE-표지된 단편은 상부로부터 두번째 패널에 제시되고, TAMRA-표지된 단편은 상부로부터 세번째 패널에 제시되고, ROX-표지된 ILS 단편은 하부 패널에 제시된다.
도 62는 본 발명의 기술에 따른 유체 서브어셈블리의 유체 플레이트의 구체예의 평면 개략도이다.
도 63은 도 62의 유체 플레이트의 저면 개략도이다.
도 64는 도 62의 상부면 특징부 및 도 63의 하부면 특징부 둘 모두를 나타내는 유체 플레이트의 투시 개략도이다.
도 65는 사출성형된 유체 플레이트의 구체예의 사진이다.
도 66은 도 65의 유체 플레이트의 상부면으로의 부착을 위한 상부의 패턴화된 얇은 필름의 구체예의 평면 개략도이다.
도 67은 도 65의 유체 플레이트의 하부면으로의 부착을 위한 하부의 패턴화된 얇은 필름의 구체예의 하부 개략도이다.
도 68은 유체 플레이트를 통해 채취된 단일 샘플의 경로를 나타내는 라인을 갖는 유체 플레이트의 구체예의 평면 개략도이다.
도 69는 정제 영역을 통한 경로의 일부를 나타내는 도 68의 유체 플레이트의 확대된 평면 개략도이다.
도 70은 PCR 섹션을 통한 경로의 일부를 나타내는 도 68의 유체 플레이트의 확대된 평면 개략도이다.
도 71은 분리 및 검출 영역을 통한 경로의 일부를 나타내는 도 68의 유체 플레이트의 확대된 평면 개략도이다.
도 72는 본 발명의 기술에 따른 공압 어셈블리의 공압 플레이트의 구체예의 평면 개략도이다.
도 73은 도 72의 공압 플레이트의 저면 개략도이다.
도 74는 도 72 및 73의 공압 플레이트의 상부면 및 하부면 둘 모두를 나타내는 공압 플레이트의 투시 평면도이다.
도 75는 사출성형된 공압 플레이트의 구체예의 사진이다.
도 76은 도 75의 사출성형된 공압 플레이트의 상부면으로의 부착을 위한 패턴화된 얇은 필름의 구체예의 평면 개략도이다.
도 77은 바이오칩 상에서 사용하기 위한 자동화된 처리의 일부를 위한 스크립트 처리 단계 및 결과로서 발생하는 처리 단계의 관계를 나타내는 표이다.
도 78은 샘플 분할 및 희석 미세유체 회로의 구체예의 순서도이다.
도 79는 다양한 두께의 여러 물질의 백그라운드 형광을 나타내는 그래프이다.
도 80은 노치 필터(notch filter)로 수집되거나 노치 필터 없이 수집된 형광 데이터의 결과를 요약한 표이다.
발명의 상세한 설명
본원에 기재된 바이오칩은 미세유체학 분야의 주요한 목표인, 작업자 개재 없이 단일한 기계에서 수행되는 샘플의 삽입으로부터 결과의 발생까지의 복잡한 처리에서의 모든 단계의 통합을 달성한다. 한 양태에서, 본 발명자는 완전히 통합되고, 법의학 샘플로부터의 단기 일렬 반복(short tandem repeat, STR) 프로파일을 생성시키기 위한 세포 용해, DNA 정제, 다중 증폭, 및 전기영동 분리 및 검출; 임상 샘플로부터 DNA 서열을 생성시키기 위한 세포 용해, DNA 정제, 다중 증폭, 생어 시퀀싱(Sanger sequencing), 초여과, 및 전기영동 분리 및 검출; 생물위협(biothreat) 샘플로부터의 DNA 서열을 생성시키기 위한 핵산 정제, 역전사, 다중 증폭, 생어 시퀀싱, 초여과, 및 전기영동 분리 및 검출; 및 인간, 박테리아, 및 바이러스 임상 및 연구 샘플로부터 유전체 DNA 서열을 생성시키기 위한 핵산 정제, 라이브러리 작제, 및 단일 분자 시퀀싱을 포함하는 샘플 투입 및 결과 발생(sample-in to results out) 분석을 수행할 수 있는 신규한 바이오칩을 본원에서 제공한다.
본 발명의 바이오칩에서 수행될 수 있는 샘플 조작은 핵산 추출; 세포 용해; 세포 분리; 차별적 세포 용해; 차별적 여과; 전체 핵산 정제; DNA 정제; RNA 정제; mRNA 정제; 단백질 정제; 핵산 증폭 전 정화; 핵산 증폭(예를 들어, 싱글플렉스(singleplex) 및 멀티플렉스(multiplex) 둘 모두의 종점 PCR(end-point PCR), 실시간 PCR, 역전사 PCR, 비대칭 PCR(asymmetric PCR), 네스티드 PCR(nested PCR), LATE PCR, 터치다운 PCR(touchdown PCR), 디지털 PCR(digital PCR), 회전환 증폭(rolling circle amplification), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification), 및 다중 치환 증폭(multiple displacement amplification)); Y-STR 증폭; 미니-STR 증폭; 단일 누클레오티드 다형성 분석; VNTR 분석; RFLP 분석; 핵산 증폭 후 정화; 핵산 시퀀싱 전 정화; 핵산 시퀀싱(예를 들어, 생어 시퀀싱, 피로시퀀싱(pyrosequencing), 및 단일 분자 시퀀싱); 핵산 시퀀싱 후 정화; 역전사; 역전사 전 정화; 역전사 후 정화; 핵산 라이게이션; SNP 분석; 핵산 하이브리드화; 전기영동 분리 및 검출; 면역검정; 결합 검정; 단백질 검정; 효소 검정; 질량분석법; 및 핵산 및 단백질 정량의 조합을 포함한다.
바이오칩의 구조 및 기능을 특성규명하는 경우, 적어도 2개 부류의 복잡도가 고려될 수 있다. 샘플 수 복잡도는 바이오칩에서 처리되는 독립적 샘플의 수를 의미한다. 처리 복잡도는 각각의 샘플(및 샘플 부산물)이 바이오칩에 적용되는 순차적 조작의 수를 의미한다. 본 발명의 바이오칩은 높은 수준의 샘플 수 및 처리 복잡도 둘 모두를 갖는다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 신규한 바이오칩은 완전히 통합된 샘플 투입 및 결과 발생 시스템을 달성하기 위해 매우 많은 수의 처리 단계를 통합시킨다. 본 발명자는 상기 바이오칩의 복잡도를 표현하기 위해 바이오칩 처리 단계의 2개의 부류를 규정한다. 스크립트화 처리 단계는 바이오칩 내 또는 상의 특징부에 대한 직접적인 작용을 야기시키고, 바이오칩과 인터페이스를 이루는 기계의 다양한 서브시스템을 포함하는 자동화된 컴퓨터-제어 스크립트의 결과로서 수행되는 작용이다. 상기 작용은 바이오칩 내의 특징부의 물리적 상태의 변화(예를 들어, 밸브 막이 밸브에 가깝게 이동됨) 또는 바이오칩 내의 샘플 또는 공기의 변화(예를 들어, 샘플 내의 형광 염료가 여기되고, 공기가 공압 유도를 통해 통과됨)를 야기시킨다. 또한, 상기 작용은 바이오칩 내의 특징부의 물리적 상태 및 바이오칩 내의 샘플에 대한 변화를 동시에 야기시킬 수 있다(예를 들어, 열 챔버가 가열되는 경우, 이들 내의 샘플이 또한 가열됨).
상기 기계 서브시스템은 스크립트화 작용을 수행하고, 이는 호일을 파열시키고, 밸브 상의 압력을 증가시키거나 감소시키고, 액체, 가스 및 고체를 밀기 위해 압력을 적용시키는 공압 서브시스템; 거대분자를 전기영동시키기 위해 전류를 적용시키는 고전압 서브시스템; 전기영동, 정량, 증폭, 면역검정, 및 화학적 검정에서 샘플을 여기시키고 검출하기 위해 광을 적용시키는 광학 서브시스템; 및 세포 용해, 핵산 변성, 전기영동 균일성, 열 주기, 및 주기 시퀀싱을 위해 열을 적용시키는 열 서브시스템을 포함한다. 즉, 모든 스크립트화 처리 단계는 자동화된 스크립트의 특정 명령이다.
스크립트화 처리 단계는 기계의 서브시스템과의 인터페이스를 통해 바이오칩 내 또는 상의 특징부에서 발생하는 직접적인 작용을 규정한다. 바이오칩 특징부는 미세유체, 대량유체, 또는 둘 모두의 조합일 수 있고, 스크립트는 소정의 순서로 소정의 위치에서 상기 특징부에서 작용한다. 예를 들어, 기계에 대한 여러 변화가 단일 단계를 실행하기 위한 선행조건으로서 필요한 경우에도(예를 들어, 밸브가 폐쇄되도록 하기 위해 펌프 및 유도 라인을 작동시킴), 바이오칩에서 제공된 밸브의 작동은 단일한 스크립트화 처리 단계로 간주된다.
스크립트화 처리 단계의 수의 정량에서, 직접적인 반복 단계, 예를 들어, PCR 증폭에서의 직접적인 반복 단계(예를 들어, 각각 온도의 변화를 특징으로 하는 변성, 어닐링, 및 신장의 많은 직접적인 방법 주기)가 단일 주기에서의 단계의 수로 간주된다. 즉, 20초 동안 핫스타트(Hotstart) 93℃(1 단계) 후, [4초 동안 93℃, 15초 동안 56℃, 및 7초 동안 70℃](3 단계)의 31 주기 후, 90초 동안 70℃의 최종 신장(1 단계)이 전체 5 스크립트화 처리 단계이다. 하나 이상의 스크립트화 처리 단계 동안 하나의 특징부가 작동할 수 있다. 이러한 경우, 각각은 독립적으로 하나의 단계로서 계산이 행해지고, 예를 들어, 제공된 밸브가 처리 동안 7회 작동하는 경우, 이는 7 단계로 계수된다. 개별적 샘플의 처리 동안 여러 특징부가 동시에 작용할 수 있다. 예를 들어, 바이오칩의 챔버가 가열되는 동안 3개의 밸브가 작동하는 경우, 이는 4개의 스크립트화 처리 단계로 계수된다(즉, 바이오칩 상 또는 내의 특징부에서 4개의 새로운 작용이 수행됨). 최종적으로, 처리로부터 가공되지 않은 데이터가 발생하는 경우, 임의의 데이터 처리(예를 들어, 색 보정) 또는 데이터 분석(예를 들어, 대립유전자 또는 염기 해독)은 스크립트화 처리 단계가 아니다. 본 발명의 바이오칩은 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 400, 500, 750, 1000, 및 1000개를 초과하는 스크립트화 처리 단계를 수행한다.
결과적으로 발생하는 처리 단계는 스크립트화 처리 단계의 결과이고, 이는 채널, 챔버, 및 필터 및 막 특징부를 통한 바이오칩 전체에 걸친 액체 샘플의 이동; 필터 및 막의 건조, 반응 혼합물의 열 사이클링; 동결건조된 시약의 재현탁, 다양한 액체의 결합, 액체의 혼합, 액체의 균질화, 다양한 매트릭스를 통한 샘플 거대분자의 전기영동 이동, 및 상기 거대분자의 여기를 포함한다. 따라서, 스크립트화 처리 단계의 수는 일반적으로 결과적으로 발생하는 처리 단계보다 클 것이다(절대로 결과적으로 발생하는 처리 단계보다 작지 않다). 예를 들어, 제공된 채널로부터 인접한 챔버로의 유체 플러그(plug)의 이동(결과적으로 발생하는 단일한 처리 단계)을 야기시키기 위해 여러 밸브를 근접시키고, 여러 유도 라인 공기 압력을 변화(다수의 스크립트화 처리 단계)시키는 것이 필요할 수 있다. 실시예 6 및 도 77에는 스크립트화 단계와 자동화된 스크립트화 단계의 일부에 대한 결과적으로 발생하는 처리 단계 사이의 관계가 기재되어 있다. 본 발명의 바이오칩은 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 및 250개를 초과하는 결과적으로 발생하는 처리 단계를 수행한다.
전체 처리 단계는 스크립트화 단계와 결과적으로 발생하는 처리 단계의 합계이다. 전체 처리 단계의 수가 클수록, 처리 복잡도가 커진다. 본 발명의 바이오칩은 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 400, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 및 2000개를 초과하는 전체 처리 단계를 수행한다. 스크립트화 단계, 결과로서 발생하는 단계, 및 전체 처리 단계는 단일 샘플의 처리를 의미한다. 다수의 샘플이 제공된 바이오칩에서 동시에 처리되는 경우, 처리 단계의 전체 수는 통상적으로 단지 하나의 샘플이 처리되는 것과 동일하다. 유사하게, 다수의 샘플이 연속하여 동일하게 처리되는 경우(예를 들어, 첫번째 샘플이 바이오칩을 통해 통과한 후, 두번째 샘플이 뒤이어 후속되어, 동일 처리되는 경우), 처리 단계의 전체 수는 단지 단일한 샘플이 처리되는 것과 동일하다. 상기 특성의 중요성은 본 발명의 복잡도 바이오칩이 비교적 적은 수의 처리 단계를 수행하나, 적거나 많은 수의 샘플에 대해 상기 처리 단계를 반복하는 바이오칩과 대조적으로 복잡한 일련의 단일 샘플의 조작을 기초로 한다는 점이다.
본 발명의 바이오칩은 상기 기재된 기능 중 둘 이상의 통합을 가능케 한다. 따라서, 무제한적인 수의 조합이 바이오칩에서 설계될 수 있고, 이는 바이오칩 상에 복잡한 세트의 조작이 완성되는 것을 가능케 한다. 처리 복잡도는 상기 기재된 미세유체 구성요소를 기초로 한 다수의 조작을 포함할 것이다. 예를 들어, 본 발명의 바이오칩은 샘플을 수용하고, 용해 시약의 혼합을 강화시키고, 혼잡한 버블링(bubbling)에 의해 샘플을 용해시키고, 용해질을 여과시키고, 용해질을 계량하고, 실리카 막에 용해질을 결합시키고, 막을 세척하고, 막으로부터 핵산을 용리시키고, 용리액을 균질화시켜 정제된 DNA 용액을 생성시키고, DNA 용액을 계량하고, 동결건조된 PCR 반응 혼합물을 재구성시켜 PCR 반응물을 생성시키고, 반응 혼합물을 혼합하고 균질화시키고, 반응 혼합물을 계량하고, 신속한 다중 증폭을 수행하고, 완료된 PCR 반응물의 일부를 계량하고, 계량된 PCR 반응물로 사이징 표준을 재구성시켜 전기영동을 위한 용액을 생성시키고, 용액을 혼합하고 균질화시키고, 용액과 전기영동을 위한 시약을 조합시키고, 전기영동 채널로 물질을 주입하고, 전기영동 분리를 수행하고, 형광을 기초로 하여 분리된 DNA 단편을 검출하고, 가공되지 않은 형광 데이터를 기초로 하여 전기영동도를 생성시키고, 가공되지 않은 데이터를 색 보정하고, 처리된 데이터에서 PCR 피크를 확인하고, 상기 언급된 피크를 분석(예를 들어, 인간 법의학 확인을 위해 STR 프로파일을 생성시키거나, 감염성 질병을 진단하기 위해 다중 프로파일을 생성시키거나, 생물위협 작용제를 확인하기 위해 다중 프로파일을 생성시키기 위함)한다. 당업자는 본 발명의 바이오칩이 본질적으로 무제한의 처리 복잡도와 함께 다수의 상이한 유형의 분석을 수행하도록 설계될 수 있음을 인지할 것이다.
바이오칩 설계의 개관
본 발명의 바이오칩은 단일한 바이오칩이며, 단일한 하나의 구조이다. 이러한 단일한 바이오칩은 많은 구성요소 부분으로 구성되나, 미세유체 또는 대량유체이건 간에 모든 부분은 바이오칩의 한 부분으로부터 또 다른 부분으로 액체, 고체, 또는 가스를 전달하기 위한 관류(tubing)의 사용 없이 직접적이고 영구적으로 부착된다. 단일한 바이오칩의 장점은 단일체로서 해당 기계에 배치될 수 있고, 작업자 입장에서 전문적 기술을 필요로 하지 않는다는 점이다. 더욱이, 연결 튜브의 부재는 누수를 최소화시킴으로써 견고함을 향상시킨다.
바람직하게는, 본 발명의 단일한 바이오칩의 주요 구성요소는 플라스틱이다. 유리, 석영, 및 실리콘 웨이퍼는 이들이 제작하는데 매우 고비용임에 따라 본 발명의 바이오칩에 존재하지 않거나, 최소로 존재한다. 모든 구성요소(시약, 필터, 막, 금속 호일, 전극 핀, 및 전극 스트립 및 어셈블리 물질, 예를 들어, 개스킷, 감압성 접착제(PSA) 및 테이프와 같은 삽입되는 구성요소 제외)가 플라스틱으로 제조되는 것이 바람직하다. 바이오칩 내의 각각의 샘플 경로가 단일 용도인 것이 또한 바람직하며, 이는 가동간(run-to-run) 오염을 예방하고, 설계를 간소화시키고, 사용 용이성을 향상시킨다. 따라서, 한 양태에서, 본 발명은 단일 용도의 1회용 플라스틱 바이오칩을 제공한다.
본 발명자는 미세유체 바이오칩 내의 용액을 전달하기 위해 사용되는 이동 메커니즘을 기초로 하여 2개의 광범위한 부류의 미세유체 바이오칩을 규정한다. 원심분리 미세유체 바이오칩은 원형 풋프린트를 가지며, 바이오칩 내의 위치로부터 다른 위치로 유체를 유도하는 원심분리력을 제공하기 위해 회전한다. 정지(또는 비-원심분리) 미세유체 바이오칩은 광범위한 풋프린트(직사각형 또는 실질적으로 직사각형의 풋프린트를 포함함)를 가지며, 바이오칩의 회전에 의해 제공되지 않는 유도를 특징으로 한다.
본 발명의 바이오칩은 정지 바이오칩이며, 이는 이들이 바이오칩을 통해 유체를 유도하는 원심분리력을 발생시키는 회전을 필요로 하지 않는 것을 의미한다(그러나, 바이오칩은 일반적으로 이동, 특히 활주 이동(translational movement)에 적용될 수 있다). 대신, 본 발명의 바이오칩은 공압, 기계, 자기, 및 유체를 포함하는 이동 메커니즘을 갖는다. 액체 수송 및 조절된 액체 유동에 대해 다양한 방법이 이용될 수 있다. 한 방법은, 액체 또는 사이에 삽입된 가스(interposing gas)와 접촉하는 플런저(plunger)가 이동 동안 플런저에 의해 옮겨진 부피를 기초로 하여 정확한 거리로 액체를 유도하는, 가변위 펌핑(positive-displacement pumping)이다. 상기 방법의 예는 주사기 펌프이다. 또 다른 방법은 공압, 자기적, 또는 달리 작동되는 통합된 엘라스토머 막의 사용이다. 유체를 유도하고, 유속을 조절하기 위한 바람직한 방법은 액체의 리딩(leading), 트레일링(trailing), 또는 둘 모두의 메니스커스(menisci)에서 압력을 변화시킴으로써 액체 자신에 직접적으로 진공 또는 압력을 적용시키는 공압 유도를 이용하는 것이다. 요망되는 유동 특징을 달성하기 위해 적절한 압력(통상적으로, 0.05-300 psig 범위, 및 보통 0.5-30 psig 범위)이 적용된다. 유속이 유체 전역의 압력차 및 네번째 동력에 대한 수력학적 직경에 비례하고, 채널의 길이 또는 액체 플러그 및 점도에 역비례함에 따라, 유동은 또한 적절한 크기의 유체 채널을 선택함으로써 조절될 수 있다. 더욱이, 유동은 조절될 수 있고, 유동 채널을 따라 벤트 막을 통합시킴으로써 병행 샘플이 배열될 수 있다.
본 발명의 바이오칩은 복잡한 화학적 분석을 수행하는 단일한 기계와 함께 작용한다. 본원에 기재된 본 발명의 바이오칩은 기계로부터 기계로의 샘플 이동을 배제시키고, 작업자 필요를 최소화시키거나 배제(적절한 스크립트 및 사용자 인터페이스를 이용함으로써 단일한 기계가 가능)시킴으로써 사용 용이성을 개선시키고, 작업자 행위에 대한 임의의 필요성을 배제시키고, 시스템을 러기드화(ruggedization)시키는 능력을 개선(모든 러기드화 서브시스템은 단일한 기계로 통합될 수 있음)시키고, 샘플을 처리하는데 필요한 기계사용 뿐만 아니라 실험실 기반의 비용을 감소시킴으로써 처리 효율 및 데이터 품질을 개선시킨다. 사실, 한 구체예에서, 단일 기계 내에서 바이오칩 기능을 갖는 것은 실험실 환경에 대한 필요를 제거할 수 있다.
상기 기계는 샘플 처리의 완료에 필요한 모든 서브시스템을 제공한다. 이러한 서브시스템은 고전압 및 저전압 동력 서브시스템, 열 사이클링 서브시스템, 공압 서브시스템, 자기 서브시스템, 기계 서브시스템, 초음파 서브시스템, 광학 서브시스템, 러기드화 서브시스템, 처리 제어 서브시스템, 및 컴퓨터 서브시스템을 포함한다. 바이오칩 인터페이스에 대한 기계는 미세유체 유도 및 바이오칩 내에서 수행되는 일련의 처리에 따라 상기 서브시스템 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 본원의 예의 경우, 바이오칩 및 기계의 인터페이스는 공압, 전기, 광학, 및 기계 인터페이스이다. 기계의 크기는 서브시스템 치수, 바이오칩 치수, 및 처리량에 의해 결정된다. 기계는 약 10 파운드, 25 파운드, 50 파운드, 100 파운드, 150 파운드, 200 파운드, 또는 200 파운드 초과의 무게일 수 있다. 유사하게, 기계의 부피는 0.5 입방 피트, 또는 1, 2, 4, 6, 10, 15, 20 또는 20 초과의 입방 피트일 수 있다.
더욱이, 본 발명의 바이오칩 및 기계사용은 통상적인 실험실 환경 외부에서 실시가능하도록 설계된다. 적용에 따라, 이들은 수송 및 극한의 온도, 습도, 및 공수 미립자에 저항하도록 러기드화될 수 있다. 사무실, 외부, 전장, 공항, 국경 및 항구, 및 현장에서 비전문 작업자에 의한 본 발명의 이용은 사회에서 유전공학의 훨씬 광범위한 적용을 가능케 할 것이다. 처리되지 않은 샘플의 이용은 본 발명의 교시의 광범위한 적용을 추가로 뒷받침한다.
본원에 기재된 본 발명의 미세유체 시스템, 기계 및 바이오칩은 단일-용도 또는 다용도일 수 있다. 단일-용도의 일회용 바이오칩의 장점은 하기를 포함한다:
·교차 오염의 최소화. 다용도 장치에서, 샘플 또는 샘플의 구성요소는 세척 후에 장치에 존재할 수 있고; 잔여물은 이후의 분석을 오염시킬 수 있다. 단일-용도의 일회용 장치는 본질적으로 잔여 샘플과 무관하다. 이는 부분적으로 샘플간 채널 소통이 존재하지 않는 신규한 샘플 처리 채널 및 이의 제조 방법에 의해 달성된다.
·기술 필요조건의 최소화. 다용도 장치는 소모된 장치를 청소하고, 이러한 장치를 이후의 재사용을 위해 준비하기 위한 장치를 필요로 한다. 본 발명의 단일-용도 일회용 장치는 상기 필요조건을 필요로 하지 않는다.
·작업자 필요조건의 최소화. 이후의 사용을 위해 소모된 장치를 신중히 청소하고 준비하는데 필요한 기술에 더하여, 장치 또는 기계로의 삽입에 의해 다용도 장치로 시약이 재장전되어야 한다. 모든 시약을 단일-용도의 일회용 미세유체 장치로 통합시킴으로써, 작업자는 시약을 다루거나 이에 노출될 필요가 전혀 없다. 작업자는 샘플을 장치에 삽입하고, 시작 버튼을 누르는 것만을 필요로 한다. 따라서, 본원에 기재된 본 발명의 바이오칩은 숙련되지 않은 작업자 또는 최소로 훈련된 작업자에 의해 수행될 수 있고, 통상적인 실험실 환경 외부에서 수행될 수 있다. 현장, 전장, 군 검문소, 대사관, 국가 안전에 중요한 지점, 및 세계의 개발도상 지역에서의 샘플의 분석이 상기 본 발명의 바이오칩을 이용하여 가능하다. 생물위협 검출을 포함하는 응용분야에 적용되는 바와 같은 샘플의 자율적 수거 및 분석이 작업자 필요조건의 최소화로부터 이득을 본다. 샘플 취급 필요조건을 본질적으로 제거하는 방법을 기재하고, 분석 방법에 대한 가능성을 추가로 간소화시키고 확장시키는 작업이, 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 "핵산 정제(Nucleic Acid Purification)"를 제목으로 하는 2010년 2월 3일에 출원된 미국 특허 출원 일련 번호 12/699,564호에 기재되어 있다.
·시스템 처리량의 증가. 기술 및 작업자 필요조건의 최소화는 단위 시간 당 분석되는 샘플의 수를 증가시키는 것을 가능케 한다. 특징부의 밀집한 패킹은 다수의 샘플을 동시에 처리하는 것을 가능케 하고, 거대한 바이오칩의 사용은 처리량의 증가를 추가로 가능케 한다. 더욱이, 처리 흐름 방향의 역전(예를 들어, 정제 및 증폭에 비한 전기영동)은 보다 작고 보다 밀집한 바이오칩 및 기계를 가능케 한다.
·비용의 최소화. 노동 필요조건의 최소화 및 간접비의 제거는 비용을 감소시킨다.
본원에 기재된 본 발명의 바이오칩은 SBS 표준 미세역가 플레이트의 치수보다 큰 치수를 가질 수 있다. 바이오칩 풋프린트의 치수는 86 내지 128 또는 그 초과, 100 x 150 mm 또는 그 초과, 115 x 275 mm 또는 그 초과, 140 x 275 또는 그 초과, 및 165 x 295 또는 그 초과이다. 또한, 본 발명의 바이오칩은 SBS 표준을 따르지 않는 10,920.0 mm2 미만의 풋프린트를 포함한다. 본 발명의 교시는 선례가 없는 정도의 샘플 수 복잡도 및 처리 복잡도를 갖는 바이오칩의 설계 및 제작을 가능케 한다. 바이오칩 풋프린트의 가능한 치수에는 제한이 없다. 풋프린트는 특정 사용자의 요구 및 제공된 응용분야의 필요조건에 따라 제작될 수 있다.
샘플 수 및 본 발명의 바이오칩의 처리 복잡도가 증가함에 따라, 바이오칩의 특징부 밀도가 증가한다. 이러한 상황에서, 미세유체 특징부는 CNC-기계가공에 의해 절단되거나 사출성형에 의해 주위에 성형되는 당해 층의 임의의 영역으로 정의된다. 특징부 밀도는 미세유체 특징부의 수 대 당해 층의 표면 영역의 비이다. 예를 들어, 실시예 5 및 6의 바이오칩은 다음과 같은 밀도를 갖는다: 유체 층의 상부 및 하부는 각각 미세유체 특징부에 의해 점유된 표면적의 약 20.2% 및 6.6%를 갖는다. 공압 층의 상부 및 하부는 미세유체 특징부에 의해 점유된 표면적의 7.5% 및 8.8%를 갖는다. 본질적으로 동일한 풋프린트에 의해 점유된 동일 바이오칩의 16-샘플 형태는 더 높은 밀도를 갖는다: 유체에 대해 19% 및 13.7% 및 공압에 대해 18.3% 및 25%. 층 상의 국소 밀도는 60% 또는 그 초과일 수 있다(실시예 4, 5, 및 6의 바이오칩의 특정 영역은 약 3 cm2의 영역에서 64%를 초과하는 국소 밀도를 갖는다). 본 발명의 공압 및 유체 바이오칩은 미세유체 특징부에 의해 점유된 표면적의 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 및 80% 초과를 갖는다. 대량유체 특징부가 또한 밀도에 기여한다.
본 발명의 바이오칩의 특징부
본 발명의 바이오칩은 미세유체 특징부, 예를 들어, 하나 이상의 유체 수송 채널(독립적이거나, 연결되거나, 네트워크화될 수 있음), 스루 홀, 배열 특징부, 액체 및 동결건조 시약 저장 챔버, 시약 방출 챔버, 펌프, 계수 챔버, 동결건조 케이트 재구성 챔버, 초음파 챔버, 결합 및 혼합 챔버, 혼합 구성요소, 막 영역, 여과 영역, 벤팅(venting) 구성요소, 가열 구성요소, 자기 구성요소, 반응 챔버, 소모 챔버, 막 영역, 열 전달 영역, 애노드, 캐쏘드, 및 검출 영역, 유도, 밸브 라인, 밸브 구조, 어셈블리 특징부, 기계 인터페이스 영역, 광학 윈도우, 열 윈도우, 및 검출 영역을 함유하는 열가소성 층을 포함한다. 바이오칩은 또한 대량유체 특징부, 즉, 상기 나열된 미세유체 특징부와 동일한 유형의 보다 큰 형태인 특징부를 함유할 수 있다. 예를 들어, 바이오칩은 30 마이크로리터의 액체를 수용하는 미세유체 시약 저장 챔버, 및 5 밀리리터의 액체를 수용하는 대량유체 시약 저장 챔버를 함유할 수 있다. 본 발명의 바이오칩 상의 미세유체 및 대량유체 특징부의 통합은 제공된 바이오칩이 대량유체 및 미세유체 처리 필요조건 둘 모두를 충족하는 것을 가능케 한다. 이는 비교적 큰 부피를 필요로 하는 샘플(예를 들어, 법의학적 면봉 샘플(forensic swab) 또는 임상 혈액 샘플)이 미세유체 규모로 처리되는 경우에 장점이다.
바이오칩은 또한 패턴화된 얇은 필름을 포함하는 얇은 필름, 스페이서 층, 접착 층, 탄성 및 비-탄성 층, 및 검출 영역을 통합시킬 수 있다. 바이오칩은 또한 특정 유도 메커니즘(예를 들어, 공압, 기계, 자기, 및 유체 유도를 위한 작동 라인)을 기초로 하는 특징부를 갖는 층을 통합시킬 수 있다. 미세유체 바이오칩이 또한 대량유체 영역, 특히, 법의학, 임상 진단, 및 생물위협 샘플을 처리하기 위한 대량유체 영역을 함유할 수 있음을 인지하라.
본 발명의 바이오칩은 처리되지 않은 생물학적 샘플로부터의 핵산 및 다른 생물학적 구성요소가 정제되고, 조작되고, 분석되는 것을 가능케 한다. 처리되지 않은 생물학적 샘플은 개인에 의해 수거된 후, 중간 처리 단계를 갖지 않는 바이오칩의 샘플 수용 챔버로 삽입되는 샘플이다(그러나, 상기 샘플 수거 장치는 처리 전에 표지되고/되거나 저장될 수 있다). 작업자는 샘플을 수거하거나 달리 수득하고, 샘플을 장치에 삽입하고, 장치를 기계에 삽입(장치가 기계에 미리 배치된 경우에는 필요치 않음)하고, 시작 버튼을 누르는 것만을 필요로 한다. 장치 내의 삽입 전에 샘플의 처리, 조작, 또는 변형이 필요하지 않고, 작업자는 면봉을 자르거나, 혈액 튜브를 열거나, 조직 또는 생물학적 유체를 수거하거나, 샘플을 또 다른 홀더로 옮기거나, 샘플을 시약 또는 조건(예를 들어, 열, 저온, 진동)에 노출시키지 않아도 된다. 따라서, 작업자는 생물 과학 또는 실험실 기술에 광범위한 훈련을 받을 필요가 없다. 임의로, 본 발명의 바이오칩은 처리된 생물학적 샘플(예를 들어, 이후의 정제를 위한 세포 용해질)을 수용할 수 있으나, 이러한 응용분야는 전문적 훈련을 받은 작업자를 필요로 할 수 있다.
실제로, 생물학적 샘플은 무수한 수거 장치를 이용하여 수거되고, 이들 모두는 본 발명의 바이오칩과 함께 사용될 수 있다. 수거 장치는 일반적으로 시판될 것이나, 또한 제공된 분야에 대해 특별히 설계되고 제조될 수 있다. 임상 샘플에 대해, 비부, 비인두, 협측, 구강액, 대변, 편도선, 질, 자궁경부, 및 상처 면봉을 포함하는 다양한 시판되는 면봉 유형이 이용가능하다. 샘플 수거 장치의 치수 및 물질은 다양하며, 장치는 특화된 핸들, 뚜겅, 파손을 촉진하고 유도하기 위한 스코어(score), 및 수집 매트릭스를 함유할 수 있다. 혈액 샘플은 다양한 부피의 매우 다양한 시판되는 튜브에 수거되며, 이 중 일부는 첨가제(항응고제, 예를 들어, 헤파린, 시트레이트, 및 EDTA를 포함함), 샘플 유입을 촉진하기 위한 진공, 바늘 삽입을 촉진하기 위한 마개, 및 샘플에 대한 노출로부터 작업자를 보호하기 위한 덮개를 함유한다. 조직 및 체액(예를 들어, 가래, 고름 물질, 흡인물)은 또한 일반적으로 혈액 튜브와 별개의 튜브에 수거된다. 이러한 임상 샘플 수거 장치는 일반적으로 시험을 위해 보다 정교한 병원 또는 민간 임상 연구소로 보내진다(그러나, 신속한 스트렙토코쿠스 시험을 위한 인후/편도선 면봉의 평가와 같은 특정 시험은 현장에서 수행될 수 있다). 환경 샘플은 필터 또는 필터 카트리지(예를 들어, 에어 브리더(air breather), 에어로졸 또는 물 여과 장치), 면봉, 분말, 또는 유체로 제공될 수 있다.
법의학 증거를 위한 통상적인 수거 기술은 면봉을 이용하여 수행된다. 면봉은 Bode(Lorton, VA), Puritan(Guilford, ME), Fitzco(Spring Park, MN), Boca(Coral Springs, FL), Copan(Murrieta, CA) 및 Starplex(Etobicoke, ON, Canada)에서 시판된다. 거즈-유사 물질, 일회용 솔, 또는 시판되는 생물학적 샘플링 키트를 이용하여 면봉법이 또한 수행될 수 있다. 법의학 샘플은 혈액, 정액, 상피 세포, 소변, 타액, 대변, 다양한 조직, 및 뼈를 함유할 수 있다. 사람에 존재하는 개인으로부터의 생물학적 증거는 종종 협측 면봉을 이용하여 수거된다. 광범위하게 사용되는 시판 협측 면봉은 SecurSwab(The Bode Technology Group, Lorton, VA)이다. 협측 샘플은 피실험자 또는 작업자가 뺨 내부면 상의 구강에 면봉을 두고, 면봉을 1회 이상 위아래로 이동시키도록 지시함으로써 수거된다.
본 발명의 바이오칩의 또 다른 주요 장점은 다수의 샘플에 대한 복잡한 처리를 동시에 수행하는 능력이다. 바이오칩의 유연성이 동일한 세트의 조작을 이용하여 다수의 샘플이 처리되거나, 맞춤화된 세트의 조작을 이용하여 각각의 샘플(또는 샘플의 서브셋)이 처리되는 것을 가능케 하는 것을 인식하는 것이 중요하다. 또한, 제공된 샘플에 대해 여러 독립적 분석이 수행될 수 있다. 예를 들어, 법의학 샘플은 DNA를 분리한 후, 정제된 물질에 대해 STR 분석, SNP 분석, 및 미토콘드리아 시퀀싱을 수행함으로써 분석될 수 있다. 유사하게, 임상 샘플은 핵산 및 단백질을 정제하고, 제공된 샘플이 많은 수의 병원체에 대해 질의(예를 들어)되는 것을 가능케 하는 PCR, 역전사 PCR, DNA 시퀀싱, 및 면역검정, 및 단일 바이오칩에서의 동시의 세포 처리를 수행함으로써 분석될 수 있다. 본 발명자는 다양한 요망되는 기능에 대한 다수의 해법 뿐만 아니라 다양한 통합 문제에 대한 해법을 본원에 기재한다. 이들은 예시를 위해 제공되고, 이로 제한되는 것이 아니며, 당업자는 다양한 용도를 위해 다양한 바이오칩 및 기계에 대해 상기 구성요소 및 통합 기술을 채택할 수 있을 것이다.
바이오칩 작업 및 데이터 분석에 일련의 소프트웨어 및 펌웨어가 필요하다. 기계 하드웨어는 구성요소 기능을 지시하고, 기계 자가-시험을 수행하는 소프트웨어 및 펌웨어에 의해 제어된다. 자동화된 스크립트는 모든 스크립트화 처리 단계의 적용을 포함하는 바이오칩을 갖는 기계의 모든 상호작용을 제어한다. 분석 소프트웨어는 미가공 데이터의 처리(예를 들어, 전기영동도의 색 보정), 및 검정의 결과의 경우 분석(예를 들어, 단편 크기조정, STR 대립유전자 콜링(calling), DNA 서열 분석) 둘 모두를 수행한다. 기계는 사용자가 처리를 개시하는 것을 가능케 하고, 사용자에게 처리 상태를 알려주는 그래픽 사용자 인터페이스를 함유할 수 있다. 최종적으로, 시스템은 관련 분석 비교기(예를 들어, 관심 개체로부터의 STR 프로파일 또는 병원체의 DNA 서열)를 저장할 수 있거나, 시스템은 외부 데이터베이스 매칭 및 추가 분석을 위해 결과를 내보낼 수 있다.
바이오칩 제작
본 발명은 완전히 통합되고, 처리전 샘플 제조를 필요로 하지 않고, SBS 크기 범위에 의해 제한되지 않고 유의하게 커질 수 있고, 미세역가 형태로 제한되지 않고, 샘플 수 복잡도 및 처리 복잡도를 통합시킨 바이오칩을 제작하는 방법을 제공한다.
바이오칩은 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리카르보네이트, 폴리스티렌, 폴리메틸 메타크릴레이트(PMMA), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 시클릭 올레핀 중합체(COP), 및 시클릭 올레핀 공중합체(COC), 및 본원에 청구된 신규한 방법에 따라 대량-생산에 적합한 다른 중합체를 포함하는 열가소성 중합체로부터 제작될 수 있다. 바이오칩은 큰 플레이트(SBS 표준 플레이트보다 큰 것을 포함함)의 CNC-기계가공에 의해 제작될 수 있고, CNC-기계가공을 위한 블랭크(blank) 플레이트 자체가 사출성형될 수 있다. 바이오칩은 또한 큰 플레이트(SBS 표준 플레이트보다 큰 것을 포함함)의 사출성형에 의해 제조될 수 있다. 임의로, 바이오칩은 성능을 향상시키기 위해 코팅(중간 단계 전, 중간 단계 동안, 또는 어셈블리 후)될 수 있다. 광범위한 코팅 및 처리가 적용될 수 있다. 예를 들어, 채널을 0.5% 소 혈청 알부민에 노출시키는 것은 채널 벽에 대한 샘플에 존재하는 단백질의 결합을 감소시킨다. 소수성 생성물, 예를 들어, PFC 502A(Cytonix, Beltsville, MD)가 기포 형성을 최소화시키기 위해 채널, 챔버, 및 밸브에 적용될 수 있다. 유사하게, 최적 밀봉 특성을 제공하기 위해 공압 및 기계 밸브 구조의 엘라스토머 또는 비-엘라스토머 막이 코팅되거나 달리 처리될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 다수의 샘플이 동일 바이오칩에서 동시에 처리되는 것을 가능케 하는 복잡한 일련의 처리 단계를 수행하기 위한 큰 바이오칩을 제작하는 문제를 해결하는 바이오칩 및 이를 제조하는 방법이다. 바이오칩이 CNC-기계가공에 의해 제작되거나 사출성형에 의해 제작되건 간에, 상기 복잡도는 미세한 특징부를 바이오칩의 특정 영역에 함께 조밀하게 패킹하고, 종횡비(aspect ratio)를 최대화시키면서 결합을 가능케 하기 위해 상기 특징부 사이에 공간을 남김으로써 달성된다. 사출성형된 바이오칩은, 이들이 편평하고, 최소의 휨(warpage)을 겪고, 제작 및 결합 동안 규정된 수축 특징을 갖고, 처리 단계 복잡도를 가능케 하는 특징부를 뒷받침하기 위해 적절한 배열 허용한계를 갖도록 설계되고 제작된다.
본 발명의 바이오칩은 유체 서브어셈블리, 공압 서브어셈블리, 밸브 서브어셈블리, 대량유체 처리 서브어셈블리, 및 분리 및 검출 서브어셈블리를 포함하는 여러 서브어셈블리를 포함한다. 제공된 바이오칩에 대해 모든 서브어셈블리가 필요한 것이 아님을 주의하라. 예를 들어, 대량유체 샘플 부피 및 칩상(on-chip) 시약이 필요하지 않은 경우, 대량유체 서브어셈블리가 필요하지 않다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 바이오칩은 일반적으로 적어도 하나의 CNC-기계가공되거나, 엠보싱(embossing)되거나, 압출되거나, 사출성형된 층을 가질 것이다. 단일 층이 바이오칩의 한 영역으로부터 또 다른 영역으로 유체를 이동시키는데 필요한 유체 특징부 및 제어 특징부 둘 모두를 함유할 것이다. 많은 경우에, 증가된 처리 복잡도를 가능케 하는, 독립된 유체 층 및 제어 층이 바람직하다. 층 또는 층들은 한면 또는 양면에 특징부를 가질 수 있고; 이중면 특징부의 장점은 증가된 처리 복잡도, 특징부 밀도, 및 샘플 수, 감소된 제작 비용, 및 어셈블리의 용이성이다. 다수의 층이 이용되는 경우, 이들은 열 결합, 용매 결합, 접착제 결합, 및 초음파 용접과 같은 당 분야에 공지된 다수의 기술을 이용하여 결합될 수 있다(Tsao. C.-W. (2009). Bonding of thermoplastic polymer microfluidics. Microfluidics and Nanofluidics 6:1-16에서 개관됨). 미세유체 바이오칩 내의 층의 수의 고려에서, 요망되는 복잡도가 달성되는 것을 가능케 하는 가장 적은 수의 층을 이용하는 것이 권장된다. 층 수를 최소화시키는 것이 제작 및 어셈블리의 복잡도, 및 궁극적으로 바이오칩 체조 비용을 감소시킨다.
본 발명의 바이오칩의 제작의 또 다른 양태는 다양한 서브어셈블리의 상부 및 하부에 위치된 층에 관한 것이다. "얇은 필름"으로 언급되는 상기 중간 층의 목적은 CNC-기계가공되거나 사출성형된 층을 서로 결합시키고, CNC-기계가공되거나 사출성형된 층을 외부적으로 밀봉시키고, 기계와 층 내의 챔버 사이의 열 커플링을 제공하고, 기계 내의 구성요소에 의한 효과적인 여기 및 검출을 가능케 하는 적절한 광학 특징을 제공하고, 층, 지지 막, 필터, 및 다른 구성요소 사이에 도관을 제공하고, 사출성형된 층과 세로로 일렬(in tandem)인 밸브에 대한 물질을 제공하는 것을 포함한다. 비-엘라스토머 얇은 필름 물질은 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리카르보네이트, 폴리스티렌, 시클릭 올레핀 중합체, 시클릭 올레핀 공중합체, 아크릴릭, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 알루미늄, 및 셀룰로오스 트리아세테이트를 포함한다. 엘라스토머의 얇은 필름 물질은 문헌[Plastics: Materials and Processing Third Edition (ibid)]에 기재된 바와 같은 광범위한 고무(실리콘을 포함함) 및 열가소성 엘라스토머를 포함한다. 이러한 필름은 1 마이크론 내지 500 마이크론의 두께 범위일 수 있다.
CNC-기계가공되거나 사출성형된 층 및 얇은 필름이 함께 결합되어 바이오칩을 형성함에 따라, 층 사이와 층을 가로지르는 유체 소통이 스루-홀(through-hole)에 의해 제공된다. 스루-홀은 액체가 한 층으로부터 또 다른 층으로 이동되도록 하는 제공된 층의 상부로부터 하부로 통과하는 특징부이다. 스루-홀은 본질적으로 임의의 형태를 취할 수 있고, 종종 원통형이다. 본 발명의 바이오칩은 샘플 수 복잡도 및 처리 복잡도를 가능케 하는 많은 수의 스루 홀을 제공한다. 예를 들어, 실시예 6의 사출성형된 6-샘플 바이오칩 및 이의 16-샘플 대응물은 하기 스루-홀을 함유한다:
6-샘플 16-샘플
상부 공압 필름 117 346
공압 플레이트 334 848
단단한 패턴화된 필름 131 346
유체 플레이트 299 1019
하부 유체 필름 14 94
엠보싱된 S&D 필름 34 94
S&D 덮개 필름 0 0
"S&D"가 "분리 및 주입"을 의미함을 인지하라. 종합하면, 6-샘플 바이오칩의 상기 부분(대량유체 처리 서브어셈블리를 제외함)은 929개의 스루-홀을 함유하고, 16-샘플 어셈블리는 2747개의 스루-홀을 함유한다. 본 발명의 바이오칩은 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 또는 2000개 초과의 스루-홀을 함유한다. 전체 미세유체 특징부(스루-홀을 포함함)가 고려되는 경우, 본 발명의 바이오칩은 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 7500, 10,000 개 이상의 특징부를 갖는다.
층 당 많은 수의 특징부를 갖는 경우, 본 발명의 바이오칩의 층은 모든 층 뿐만 아니라 기계 인터페이싱의 다양한 부위에 대해 적절하게 배열되어야 한다. 배열에서의 한 요인은 결합 동안, 특히 열 결합 동안 부품의 수축이 우려되며; 배열 문제는 부품의 차별적 수축에 의해 악화된다. 본 발명의 바이오칩은 차별적 수축을 고려하여 설계되고 어셈블리된다. 어셈블리의 용이성을 위해, 가장 많은 수의 특징부를 갖는 부품이 수축 표준으로 사용된다. 즉, 결합 후, 상기 부품의 크기가 기계와 인터페이싱하는데 필요하게 되도록 설계된다. 모든 다른 부품의 크기는, 결합 후, 이들이 표준 플레이트와 배열되도록 스케일링된다.
기계 인터페이싱의 부위에서의 배열은 인터페이스 특징부를 적절히 크기 조절하고 배치함으로써 달성된다. 예를 들어, 본 발명의 공압 인터페이스는 수많은 포트(port)로 구성된다. 바이오칩의 공압 층 전체에 걸쳐 퍼지는 대신, 이들은 중앙에 집중된다. 공압 층은 전체적으로 수축하지만, 훨씬 적은 공압 인터페이스 영역이 훨씬 덜 수축한다. 또한, 바이오칩은 유체 및 공압 층 내에 통합된 배열 홀을 포함하는 어셈블리를 위한 배열 특징부를 갖는다. 유체 층을 공압 층에 배열시키기 위해, 공압 층 및 유체 층의 해당 배열 홀에 도웰(dowel) 핀이 삽입된다. 기계 내에서 적절한 배치를 보장하기 위한 배열 특징부는 공압 층(유체 층은 아님)을 표시하는 기계 내의 유도장치를 포함하며, 여기서 공압 포트 특징부가 위치된다. 부품 수축이 평가될 수 있으나, 실제 어셈블리 처리 후의 수축을 측정하는 것이 현명하다. 예를 들어, 실시예 5의 공압 플레이트 및 유체 플레이트는 각각 (X 및 Y 방향에서 각각 -0.063%, 0.116%) 및 (0.151% 및 0.401%)까지 수축하였고, 공압 플레이트는 크기에 있어서 (0.214%, 0.285%)% 내지 상기 차별적 수축을 벌충하는 것까지 증가하였다.
층간 배열 및 기계에 대한 바이오칩의 배열 둘 모두는 정렬되는 부품의 수를 최소화시킴으로써 처리된다. 예를 들어, 본 발명의 바이오칩의 CNC-기계가공되거나 사출성형된 공압 및 유체 플레이트는 일반적으로 양면에 존재하는 특징부를 갖는다. 이는 어셈블리에 필요한 부품의 수를 반감시킨다.
배열 특징부와 세로로 일렬로, 또 다른 층의 특징부와 소통해야 하는 제공된 층의 특징부가 허용한계로 설계된다. 특히, 실시예 2에 기재된 바와 같은 밸브 특징부는 유체 챔버 및 밸브 시트와 배열시키기 위해 공압 특징부를 필요로 한다. 또한, 공압 층 내의 스루 홀은 유체 층 내의 해당 입구(input) 홀에 대량유체 처리 서브어셈블리 내의 챔버의 출구를 연결시킨다. 일반적으로, 2개의 스루 홀이 배열되는 것이 필요한 경우, 2개의 스루 홀의 배열이 달성되는 것을 보장하기 위해 스루 홀 중 하나는 직경이 0.5 mm 더 크기 제조된다.
본 발명의 바이오칩은 샘플이 바이오칩으로 삽입되고 밀봉되고, 바이오칩으로부터의 액체 누출이 없는 폐쇄된 시스템이다(즉, 샘플 처리의 개시에서 바이오칩 내에 함유되고, 샘플 처리의 종결에서 바이오칩 내에 함유되는 처리 시약은 바이오칩이 분리되는 경우에 기계로부터 분리된다). 공압 유도 라인으로부터의 공기가 바이오칩에 유입되고, 공기는 벤트 막을 통해 바이오칩을 나간다. 본 발명의 폐쇄된 시스템의 바이오칩은 작업자를 샘플 또는 화합물, 및 중요한 안전 특징부에 노출시키지 않으며, 쓰지 않거나 소모된 시약이 기계 내에 저장될 필요가 없는 점에서 기계를 간소화시킨다.
미세유체 특징부의 사출성형은 복잡한 완전히 통합된 바이오칩에 존재해야 하는 미세한 특징부의 많은 수로 인해 많은 어려움이 존재한다. 상기 미세유체 특징부는 종종 대량유체 특징부와 함께 제공된 부품 상에 존재하고, 이는 사출성형의 어려움을 추가로 증가시킨다. 본 발명자는 본원에서 바이오칩의 특정 유형에 대한 고려사항을 설계하기 위한 특정 해법을 본원에서 제시하나, 당업자는 특정 기능을 위한 다수의 유형의 바이오칩을 제작하기 위해 상기 특정 해법을 적용시킬 수 있을 것이다. 상기 예의 설계 고려사항은 다음과 같다: 기하학적 양태, 예를 들어, 정확한 사출성형에서의 수축 및 형태 안정성, 바이오칩의 편평함, 바이오칩의 휨, 최소 특징부 크기, 특징부 밀도, 및 적절한 종횡비. 본 발명의 바이오칩의 사출성형된 부품의 설계 특징은 사출성형 처리와 관련하여 기재될 것이다. 사출성형은, 주형이 용해된 플라스틱 사출 및 냉각 처리를 수용하기 위해 압력 하에서 클램핑되는 플라스틱 부품을 제작하기 위한 처리이다. 플라스틱 과립(작은 알갱이화된 수지)이 사출성형 기계에 공급된 후, 적절한 착색제가 공급된다. 수지는 사출 배럴로 공급되고, 여기서 이들은 융점까지 가열되고, 왕복 스크류 또는 래밍(ramming) 장치를 통해 주형으로 사출된다. 용융된 플라스틱이 주형 내에 함유되며, 주형 내의 모든 공동이 충전되는 것을 확실히 하기 위해 수력학적 또는 기계적 압력이 적용된다. 플라스틱은 주형 내에서 냉각되고, 주형이 개방되고, 플라스틱 부품이 배출 핀으로 배출된다. 전체 처리는 주기적이며, 주기 수는 요구되는 냉각 시간에 따라 10초 내지 100초 범위이다.
주형은 2개의 주요 구성요소인 사출 주형 및 배출 주형으로 구성된다. 플라스틱 수지는 사출 주형 내의 스프루(sprue)를 통해 주형에 유입되고; 스프루 축투(bushing)는 용융된 플라스틱이 배럴로부터 주형 공동으로 유동하도록 하는 사출 배럴의 노즐에 대해 단단히 밀봉된다. 스프루 축투는 플레이트의 면으로 기계 가공되는 채널(또는 런너(runner))를 통해 공동 이미지(image)로 용융된 플라스틱을 유도한다. 용융된 플라스틱 유동물은 하나 이상의 게이트 및 공동 기하구조로 유입되어 요망되는 부품을 형성한다. 주형은 보통 완성된 부품이 주형이 개방되는 경우 주형의 배출기 측에 확실히 남아있도록 설계된다. 이후, 부품은 배출되는 경우 자유롭게 떨어진다. 주형은 CNC 분쇄 및 방전가공(Electrical Discharge Machining)을 포함하는 기계가공 방법의 조합으로 제작될 수 있다.
사출성형을 위한 본 발명의 바이오칩의 설계의 전반적 방법은 하기를 포함한다:
·층 수의 감소. 사출성형된 층의 수가 층의 양면 상에서의 특징부 제작에 의해 하나의 유체 층 및 하나의 공압 층으로 감소되었다. 이는 서로 교차하는 채널을 층의 독립된 면으로 루팅(routing)시키는 방식으로 유체 및 공압 라인을 루팅함으로써 부분적으로 달성되었다. 일부 경우에, 상하 트랜지션(transition)이 필요하였다. 이는 수직 트랜지션이 많은 압력을 낮추고, 채널 컨덕턴스를 감소시킴에 따라 최소화되었다. 벤트 및 필터 막의 초음파 용접을 가능케 하는 특징부가 설계되었다. 용접된 특징부의 통합은 사출성형 층이 제거되는 것을 가능케 하였다.
·특징부 밀도의 증가. 채널 및 특징부의 패킹 밀도를 증가시키는 것은 사출성형되는 층의 수 및 크기를 감소시키고, 수축을 감소시키고, 배열성(alignability)을 개선시킨다. 실시예 5의 바이오칩의 공압 층의 도 44, 61의 공압 다기관 영역에서, 예를 들어, 채널의 피치(pitch)는 1.0 mm이고, 10개의 채널이 1 cm2 영역 내에 위치된다. 이러한 밀도는 채널 사이에 협소한(0.5 mm) 벽에도 불구하고 채널을 밀봉시키는 열 결합 절차를 발달시킴으로써 달성되었다. 미세한 피치 및 협소한 벽을 갖는 특징부의 열 결합은 편평함을 보장하기 위해 균일한 표면 및 낮은 표면 조도를 갖는 결합 정착물을 이용함으로써 달성된다. 더욱이, 2개의 결합 플래튼(platen)이 사용되고, 제공된 사출성형된 어셈블리 또는 서브어셈블리 전역에서 미세한 특징부의 일관적인 결합을 보장하기 위해 0.0005"의 오차 허용도를 갖고 병행되도록 설정된다. 최종적으로, 0.25℃ 내의 플래튼 전체에 걸친 온도 균일성은 또한 어셈블리 또는 서브어셈블리 전체에 걸친 일관적 결합을 보장한다.
·구배각의 최소화. 모든 특징부의 수직면은 주형으로부터 부품의 용이한 방출을 위해 드래프트와 약간 구부려졌다. 사출성형에서의 구배각은 통상적으로 2-7° 범위이다. 본 발명의 사출성형된 플레이트는 0.5%의 더욱 작은 구배각을 이용하였고; 구배각이 작을수록, 사출성형된 특징부는 더욱 조밀하게 패킹된다. 이러한 작은 구배각을 수용하기 위해, 배출기 핀이 성형 처리에서 통상적인 것보다 미세유체 특징부에 훨씬 가깝게 배치되었다.
·스루 홀. 니트(knit)/용접 라인의 수는 사출 주형 내의 게이트의 적절한 배치에 의해 감소되었다. 또한, 성형된 부품 상의 큰 개방 특징부는 특징부 치수 및 큰 특징부 주위의 수지 유동을 유지하기에 어려움에 따라 최소화되었다.
·벽 두께. 특징부 플로어에서의 1.0 mm 벽 두께 및 특징부 사이의 0.5 mm 벽 두께가 설계 전체에 걸쳐 유지되었다.
·편평함 및 휨. 두께를 최소화시키기 위해 특징부 사이의 적절한 측 두께 및 트랜지션을 채택하였다. 생성된 플레이트의 편평함이 특성규명되고, 부품 내부 스트레스를 최고화시키기 위한 사출성형 처리에 대한 조정이 수행된다. 휘어지는 성형된 플레이트의 영역은 배출기 핀의 배치를 변형시킴으로써 조정된다. 또한, 평탄하지 않은 영역의 미세한 기계가공은 편평함을 개선시킨다.
·특징부 종횡비. 높은 종횡비의 특징부가 최소화되었고, 종횡비는 2 미만으로 유지되었다. 높은 종횡비의 특징부는 성형된 부품이 주형 도구로부터 효과적으로 배출되는 것을 방지하는 경향이 있다.
·배출 특징부. 배출기 핀 위치는 최소화되었고, 주형의 배출기 절반 상에만 배치되었다. 배출기 핀은 이후에 불충분하게 결합하거나 전혀 결합하지 않는 영역을 발생시킬 수 있는 부품의 표면 상에 국소적 변형을 발생시킨다. 주형 내에서의 각각의 배출기 핀의 운동은 반복가능한 부품 배출에 필요한 운동을 최소화시키도록 조정되었다.
·사출성형 수축. 수지에 대한 사출 성형에 대한 수축이 수축을 수용하기 위해 철저히 특성규명되었다. 더욱이, 수축은 성형 온도 및 고정 시간을 조정시킴으로써 추가로 미세 조정되었다. 공기 및 유체 부품의 수축은, 사출성형된 플레이트 내의 모든 특징부가 규정된 허용한계 내에서 배열되도록 조정된다.
·블록 성형. 상기 기재된 방법은 둘 모두의 편평한 플레이트(예를 들어, 유체 플레이트, 공압 플레이트, 및 대량유체 처리 덮개 플레이트)의 성형에 적용가능하다. 대량유체 처리 블록과 같은 보다 큰 부피의 블록을 성형하기 위해, 상기 방법은 종횡비가 통상적으로 2를 초과하도록 변형된다. 블록 성형을 위해, 1℃ 미만의 구배각이 설계에 통합되고, 큰 챔버의 부피를 최대화시키면서 성형된 부품으로부터의 효과적인 핀 제거를 가능케 한다.
본 발명의 완전히 통합된 바이오칩은 작업자 개재 없이 단일한 기계에서 수행되는, 샘플의 삽입으로부터 결과의 생성까지의 복잡한 일련의 처리 단계를 수행할 수 있는 바이오칩을 제공함으로써 미세유체공학의 잠재성을 실현시킨다. 더욱이, 본 발명의 바이오칩은 일회용일 수 있고, 비용-효과적으로 제작될 수 있다.
실시예
실시예 1. 시약 저장 및 방출
본 발명의 바이오칩은 다양한 처리를 수행하기 위한 시약을 필요로 하고, 이들 시약은 바이오칩 재료 및 이들이 노출되는 작업 및 환경 조건과 양립되어야 한다.
본 발명의 시약은 여러 방식으로 바이오칩에 도입될 수 있다. 첫째로, 시약은 사용 직전에 수작업으로 바이오칩에 첨가될 수 있다. 수작업 첨가의 장점은 바이오칩이 연장된 기간 동안 시약을 유지할 필요가 없어, 바이오칩 상에서의 장기간의 안정화에 대한 필요가 최소화된다는 점이다. 수작업 로딩의 불리함은 작업자가 기술적 훈련 및 전문기술을 가져야 하고, 시약이 부적절하게 배치되어 적절한 처리를 방해할 수 있고, 시약 배치가 오염원일 수 있다는 점이다. 배치의 두번째 방법은 기계 내 또는 기계 근처의 용기에 시약을 저장하는 것이며; 이후, 관류 또는 다른 도관이 시약을 요망되는 처리 시간에 바이오칩으로 이동시킨다. 이러한 방법의 장점은 일단 시약을 용기에 배치하는 것이 시스템의 다수의 분석 작업을 가능케 할 수 있다는 점이다. 불이익은 기계 내에서의 충분한 이동 도관에 대한 필요성, 예를 들어, 도관 상에서의 잔여 시약 건조와 같은 도관을 통한 손상된 유동, 손상 또는 오염의 잠재성을 가능케 하는 기계 개방의 필요성, 다수의 분석 작업을 위한 시약 저장을 가능케 하는 기계의 크기에서의 상대적 증가, 및 기술적 훈련 및 전문기술을 갖는 작업자의 필요성이다.
한 바람직한 방법은 바이오칩 내에 시약을 저장하는 것이며, 미리 로딩된 시약은 바이오칩의 필수 부품이고, 본질적으로 작업자가 접근하기 어렵다. 이러한 방법의 장점은 작업자가 시약과 접촉할 필요가 없고, 기술적 훈련 또는 전문기술을 필요로 하지 않고, 바이오칩이 폐쇄된 시스템인 경우, 오염 잠재성이 최소화된다는 점이다. 더욱이, 기계는 바이오칩을 수용하나, 별개의 시약 튜브 또는 카트리지를 배치하기 위해 개방되지 않아야 한다. 칩상 시약이 기계와 접촉하지 않는 것을 보장하는 유도 시스템과 조합되는 경우, 바이오칩은 폐쇄 시스템이며, 이는 오염 가능성을 최소화시키면서 사용 용이성을 향상시킨다.
칩상에 시약을 저장하기 위해, 시약은 이들이 접촉하게 되는 모든 바이오칩 재료와 양립되어야 하며, 필요시 처리에 대해 접근가능하기 쉬워야 한다. 본 발명자는 상기 필요조건에 대한 한 방법을 "시약 저장 및 방출(Reagent Storage and Release (RSR)"로 명명하며, 이는 시약이 바이오칩 내에 저장되고 격리되고, 처리 동안 필요시 요구에 따라 방출되는 것을 나타낸다.
RSR에 대한 방법은 수포 패키지, 튜브-내-튜브(tube-in-tube) 구조(시약-함유 튜브가 바이오칩 시약 저장소에 삽입됨), 및 단일 튜브 구조(시약이 바이오칩 시약 저장소에 직접 충전됨)를 포함한다. 작동 방법은 압력-기반 방법(스코어링된 호일의 사용을 임의로 포함할 수 있음), 핀-기반 방법(기계적 또는 공압적으로 작동되는 핀이 호일 밀봉부에 구멍을 뚫음), 및 기계적 방법(기계 구성요소가 저장된 시약 상에서 압력을 발휘함)을 포함한다.
수포 패키지. 이러한 방법에서, 알루미늄 호일 밀봉된 수포 또는 스틱 패키지가 시약을 저장하는데 사용된다. 기계적 힘이 패키지에 적용되어 시약 저장소에 내용물이 방출된다.
튜브-내-튜브 구조. 이러한 방법에서, 시약 튜브가 열가소성 물질로 제작되고, 호일 밀봉부가 시약 충전 전에 튜브의 하부에 적용되고, 두번째 호일 밀봉부가 충전 후에 튜브의 상부에 적용된다. 밀봉된 시약 튜브는 이후 바이오칩의 적절한 시약 챔버에 삽입된다. 박판 알루미늄 밀봉 호일의 광범위한 선택이 열 밀봉에 이용가능하다. 이러한 호일은 얇은 알루미늄 필름에 박판화된 중합체 열 밀봉 표면을 특징으로 한다. 보호를 위해 알루미늄 호일에서 사용되는 코팅은 시약 자신, 열, 및 스커핑(scuffing)에 대한 내성에 대해 선택된다. 보호 코팅은 또한 열-밀봉 표면으로 작용할 수 있다.
단일 튜브 구조. 이러한 방법에서, 바이오칩 자체 내의 챔버는 저장 비히클이다. 이러한 방법에서, 장점은 바이오칩이 비교적 작고(튜브-내-튜브가 추가 벽을 필요로 함), 제작하기에 용이한 것이다. 도 1은 단일 튜브 RSR 방법을 예시한다. 호일 밀봉부(101)는 각각의 시약 저장 챔버(102)의 상부 및 하부에 결합(열적, 초음파 용접, 또는 접착제에 의함)된다. 하부 호일이 먼저 결합되고, 액체 시약이 충전되고(102의 음영으로 나타냄), 상부 호일이 이후에 결합되어, 시약 저장 챔버를 밀봉시킨다. 상부 덮개(103)는 호일을 파열시키는데 필요한 압력을 제공하는 공압 유도 라인을 함유한다. 동결건조된 시약(104)이 또한 호일 사이에 저장될 수 있다.
상부 및 하부 호일을 파열시키는데 필요한 압력은 시약이 시약 챔버의 외부로 신속하게 유동하도록 한다. 시약 유동을 감소시키기 위해, 유동-제어 구멍이 챔버의 하부에 제작된다. 구멍의 직경은 적용된 호일 파열 압력에서 요망되는 유동을 가능케 하도록 크기 조절된다. 밸브 및 벤트 막은 또한 실시예 2에 기재된 유체 유동 및 일렬(queue)의 액체를 제어하기 위해 이용될 수 있다. 또한, RSR 챔버가 공압 유도 압력에 적용되는 경우, 호일은 파열 전에 팽창하기 위한 충분한 공간을 가져야 한다. 이러한 공간 필요조건을 수용하기 위해(25 마이크론 두께 및 8 mm의 직경의 호일에 대해 약 1 mm), RSR 스페이서 플레이트가 파열을 위한 팽창 공간을 제공하도록 설계되었다. RSR 스페이서 플레이트는 또한 시약 챔버의 보다 큰 직경(본 예에서 8 mm)의 출구 및 바이오칩의 보다 작은 직경(0.5 내지 1 mm)의 입구 구멍을 커플링시키는 인터페이스, 및 테이퍼(taper)를 갖는 2개의 인터페이스 사이의 시약 유동을 위한 트랜지션(transition)을 제공한다. 입구 구멍은 유체 서브어셈블리 내의 특징부를 발생시키는 공압 서브어셈블리 내의 스루 홀일 수 있거나, 이는 유체 서브어셈블리 또는 분리 및 검출 서브어셈블리에 직접 커플링될 수 있다. 도 2는 RSR 파열을 필요로 하는 액체 시약 챔버를 커플링시키기 위한 RSR 트랜지션(106)을 나타내는 5-샘플 바이오칩에 사용되는 스페이서 플레이트(105)의 사진이다. 통상적 트랜지션(107)은 혼합 및 바이오칩의 입구 구멍으로의 홀딩(그러나, 이들은 팽창 공간을 필요로 하지 않음에 따라 시약 저장은 아님)에 사용되는 처리 챔버를 커플링시킨다. 도 3은 RSR 챔버 인터페이스(108), 원뿔형 테이퍼 섹션(109), 및 바이오칩 인터페이스(110)으로 구성되는 RSR 트랜지션(106)의 횡단면도이다. 또한, 처리 챔버와 또 다른 바이오칩 서브어셈블리 사이의 스루 홀 트랜지션인 통상적인 트랜지션(107)이 제시된다. 스페이서 플레이트가 감압식 접착제 및 기계적 파스너(fastener)에 의해 시약 챔버에 부착된다. 다른 형태의 부착은 접착제를 갖거나 갖지 않는 개스킷, 스크류, 열 스테이킹(heat staking), 및 리벳의 사용을 포함한다.
호일의 공압 파열이 바람직한 방법인데, 이는 작동을 위해 공압만을 필요로 하기 때문이다. 호일 밀봉부는 바이오칩 내의 공압 유도 라인을 통해 튜브의 상부로 전달되는 공압에 의해 파열된다. 이러한 형태에서, 시약 챔버에 적용되는 압력은 상부 호일에 부과되고, 이는 파열을 야기시킨다. 파열시, 압력이 튜브 내의 시약에 직접 적용된다. 이는 차례로 하부 호일이 파열되고, 처리를 위한 용액을 방출시킨다. 공기 파열을 위한 호일의 선택에서 여러 요인이 고려되어야 한다. 공기 파열과 양립되기 위해, 파열 압력은 바이오칩의 구조에 대해 적절해야 하며, 바이오칩에 의해 용인되어야 한다. 열 결합, 용매 결합, 및 접착제 결합에 의해 어셈블리된 본 발명의 바이오칩에 대해, 요망되는 파열 압력은 약 20-500 psig이다. 10-500 마이크론, 바람직하게는 10-30 마이크론의 얇은 호일 필름이 상기 목적에 적절하다.
도 4는 2-8 mm의 챔버 직경에 결합된 12(실선) 및 18(점선) 마이크론의 알루미늄 호일에 필요한 공기 파열 압력을 도시한다. 파열에 필요한 압력은 호일 두께가 증가함에 따라 증가하고, 챔버/호일 직경이 증가함에 따라 감소한다. 각각의 포인트는 파열에 필요한 평균 압력을 나타낸다(2 mm 직경에 대해, n=2, 3 mm 직경에 대해, n=6, 4 mm 직경에 대해, n= 10, 5 mm 직경에 대해, n=9, 6 mm 직경에 대해, n=10, 7 mm 직경에 대해, n=4, 및 8 mm 직경에 대해, n=4). 파열 압력은 또한 호일 물질의 유형에 의해 영향을 받을 수 있다.
임의로, 얇은 호일의 스코어링은 파열 압력에서 감소를 가능케 하며; 호일 상의 다양한 크기 및 형태의 스코어가 또한 이용될 수 있다. 예를 들어, 다양한 깊이로의 선, 십자, 및 원의 레이저 또는 기계적 다이 스코어링이 파열 압력을 추가로 조절하기 위해 이용될 수 있다. 도 5는 6개의 챔버(각각은 8 mm 직경 및 50 mm 높이를 가짐)를 갖는 RSR 단위를 도시한다. 25 마이크론의 알루미늄 호일이 레이저 스코어링(약 10 마이크론의 깊이의 교차된 4.5 mm의 중심으로 배치된 선)에 적용되었고, 열 스테이커를 이용하여 단위에 열적으로 결합되었다. 하부 호일이 처음에 배치되었고, 식품 착색제를 갖는 액체 시약이 각 챔버에 충전되었고, 상부 호일이 결합되었다(도 6).
시약 챔버의 2-면의 파열이 도 6의 챔버로의 2 ml 시약의 충전 및 밀봉에 의해 수행되었다. 챔버를 밀봉시키는데 사용되는 호일이 32 psig의 공칭(nominal) 파열 압력을 달성하기 위해 스코어링(약 10 마이크론의 깊이의 교차된 4.5 mm 중심으로 배치된 선)되었다. 각각의 챔버가 RSR 스페이서 플레이트에 부착되고, 차례로 미세유체 채널에 부착되었다. 미세유체 채널의 출구가 공기가 파열로부터 벤팅되도록 하나, 챔버로부터 방출되는 유체를 차단하지 않는 벤트 막으로 밀봉되었다. 덮개가 챔버의 상부에 고정되었다. 덮개는 6 챔버 각각을 공압 유도 라인에 커플링시킨다. 공압 시스템이 한번에 단지 하나의 챔버에 압력을 적용시키도록 형성되었다. 공압 유도 압력은 액체가 미세유체 채널로 유동하는 것이 관찰될때까지 점차 증가되었고, 이러한 압력이 기록되었다. 시험에 사용되는 24 호일 모두(4 RSR 단위)는 32 psig ± 3 psig의 압력으로 파열되었다. 도 7은 파열 후의 호일을 도시한다. 호일 재료, 스코어링 깊이 및 형태, 및 파열 압력은 호일의 단편이 파열 동안 분리되고, 시약에 대해 출구 채널을 잠재적으로 차단하는 것을 피하기 위해 세로로 일렬로 선택된다. 여기서 제시된 스코어링된 호일은 호일의 분리된 단편을 발생시키지 않았다.
두번째 실험에서, 시약 챔버를 충전시키고, 상기와 같이 스코어링된 호일로 밀봉시켰다. 챔버를 미세유체 채널에 부착된 RSR 스페이서 플레이트에 부착시켰다. 미세유체 채널 각각의 출구를 벤트 막으로 밀봉시켰다. 덮개를 챔버의 상부에 고정시키고, 45 psig의 압력을 1초 동안 모든 시약 챔버에 동시에 적용시켰다. 호일 모두가 파열되었고, 시약이 미세유체 채널로 유동하는 것이 관찰되었고, 벤트 막에서 정지하였다. 채널 내의 액체는 기포가 없는 단일한 플러그로 구성되었다.
종합하여, 상기 실험은 챔버 내에서의 시약 밀봉을 포함하는 RSR, 밀봉 호일의 공압 파열, 챔버 직경 및 스코어링을 이용한 파열 압력의 제어, 미세유체 채널로의 시약 이동, 및 벤트 막을 이용한 시약의 일렬화를 나타낸다.
RSR에 대한 한 관련 방법은 호일을 파열시키기 위해 공압이 아니라 기계적 압력을 이용한다. 이러한 방법에서, 각각의 호일-밀봉된 시약 튜브의 상부 및 하부에서 날카로운 핀이 플라스틱으로 제작된다(동일 목적을 위해 금속 핀이 삽입될 수 있다). 둘 모두의 호일이 핀에 의해 관통되어, 필요한 처리 시간에 시약이 방출된다.
실시예 2. 바이오칩에서의 유동 제어
본 발명의 바이오칩은 미세한 특징부를 함유하는 열가소성 층을 포함하며, 분석 결과를 발생시키는데 필요한 처리 단계 세트를 수행하기 위해 유체 유동의 제어를 필요로 한다. 유동 제어 구성요소의 사용을 필요로 하는 유체 기능은 하기를 포함한다:
- 바이오칩 내의 채널을 통한 하나의 특징부로부터 또 다른 특징부로의 유체 유동 유도. 유도 라인, 밸브, 및 벤트 막의 스크립트화된 사용은 바이오칩 내의 특정 채널 및 특징부를 통해 액체 및 공기 유동을 유도한다. 예를 들어, 필터의 정제(도 39, 12)는 유체 채널에 의해 시약 및 처리 챔버와 연결된다. 유체 유동의 순서 및 정제 필터 내외로의 유동을 제어하는 밸브가 실시예 5의 DNA 결합 단계, 세척, 건조, 용리 단계에 기재되어 있다. 이러한 단계에서, 상기 챔버를 통한 유체 유동을 유도하기 위해 여러 벤트 막, 밸브(도 39, 46, 47, 43, 42, 및 44) 및 공압 유도 라인이 사용된다.
- 챔버의 밀봉. 특정 반응, 예를 들어, 열 사이클링 및 주기 시퀀싱은 상승된 온도를 필요로 한다. 높은 온전성의 밀봉이 상기 환경에서 중요한데, 이는 반응이 가열됨에 따라 챔버 내의 유체의 압력이 증가하기 때문이다. 불량한 밀봉은 챔버 외부로의 유체 누출을 발생시킬 것이며, 반응에서의 가스가 기체 제거되고 기포가 생성되는 것을 가능케 할 것이다. 챔버를 밀봉하는 것은 상기 문제를 최소화시키고, 반응 효율을 개선시킨다. 예를 들어, 실시예 5 및 6의 열 사이클링 챔버는 밸브 V13 및 V14(도 40, 52 및 53)에 의해 열 사이클링 처리 동안 밀봉된다.
- 상호 혼합. 상호 혼합은 공기 밸러스트(ballast)에 대한 두 액체의 힘을 기반으로 하여 혼합하고, 압력을 방출시켜 역류되도록 하는 방법이다. 반복된 적용 및 적용된 압력의 감소는 용액이 "백 앤 포스(back and forth)"로 혼합되도록 운동시킴으로써 혼합을 달성한다. 이러한 방법은 유체가 스프링에 대해 밀리는 경우에 압력에 의해 유체에 의해 먼저 압축된 후, 압력이 방출되는 경우에 유체를 뒤로 밀어내는 스프링으로서의 공기 챔버(도 70, 610)를 이용하는 실시예 6의 바이오칩에 예시된다. 공기 챔버는 밸브 V13(도 69, 52)에 의해 상호 혼합 동안 밀봉되고, 여기서 0으로부터 15 psig로 선형으로 증가하는 압력, 및 이후에 15로부터 0 psig로의 압력이 적용된다. 혼합 후, V13은 개방되어, 혼합된 용액이 PCR 챔버를 통해 이로 유동되도록 한다.
- 일렬 벤트 막 - 제공된 바이오칩에서 동시에 처리되는 다수의 샘플의 유동 속도에서의 변화는 샘플 점도(예를 들어, DNA 함량)에서의 차이 및 채널 치수(및 이에 따라 컨덕턴스)의 변화를 포함하는 요인으로부터 발생할 수 있다. 일렬의 기능의 이용은 바이오칩 내의 병행 채널을 통한 다수의 샘플의 유체 유동에서의 변화를 수용한다. 이러한 방법에서, 제공된 단계에 필요한 최대로 가능한 시간이 단계 시간으로 사용된다. 벤트 막에 일찍 도달하는 샘플은, 더 느린 유동 속도를 갖는 다른 샘플이 일렬 포인트에 도달할때까지 정지하고 기다릴 것이다. 이러한 방법은 샘플이 동시화되는 것을 보장함으로써 다수의 샘플을 동시에 처리하는 것에 대한 용인성을 제공한다. 유체의 일렬화는 통상적인 위치에서 다수의 샘플에 대한 PCR 용액을 정지시키는 벤트 막(도 40 및 도 69, 100) 및 밸브(V29)(도 40 및 도 69, 99)를 이용함으로써 실시예 5 및 6의 "열 사이클링 챔버로의 이동(Transfer into thermal cycling chamber)"에서 실시된다. 다수의 샘플을 동시화시키는 대안적이나 보다 복잡한 방법은 각 샘플을 별개로 제어하고, 검출 특징부(예를 들어, 광학, 열, 화학, 기계)를 통합시켜, 스크립트가 바이오칩 상의 제공된 포인트에서 제공된 샘플이 도달하는 경우에 피드백을 수용하는 것을 가능케 한다.
- 계량 챔버 - 용액은 다수의 예에서 처리 유동 전체에 걸쳐 계량된다. 실시예 5 및 실시예 6에서의 계량의 예는 계량 챔버(도 40 및 70, 8), 밸브 V12(도 40 및 70, 51) 및 벤트 막 VM(도 40 및 70, 100)을 이용하는 "용리액 계량" 단계이다.
- 용액과 공기 플러그 사이의 결합. 샘플 처리 동안, 다양한 입구로부터 유래되고, 공기에 의해 분리된 2개의 별개의 유체 플러그가 조합될 필요가 있는 경우가 존재한다. 이의 예는 "PCR 생성물 및 포름아미드의 결합" 단계이다. 이러한 단계에서, 결합 챔버(도 41 및 71, 78), 벤트 막, 및 밸브(도 41, 구성요소 100, 56, 81)가 사용된다. 결합 기능은 유체 플러그 각각이 챔버로 수용되고, 유체 사이의 공기를 제거하고, 결합된 유체 플러그가 전진하는 것을 가능케 하는 상기 구성요소를 이용한다. 이러한 단계에서, 액체 및 공기 유동을 정지시키기 위해 밸브가 사용된다. 유체 플러그 사이의 공기를 벤팅시키기 위해 벤트 막이 이용된다.
- 소모 챔버의 충전. 바이오칩 내의 소모 챔버는 특히 계량 단계 동안 과량의 용액을 수용하도록 설계된다. 소모 처리의 예는 "계량 포름아미드" 단계이다. 이러한 단계에서, 소모 챔버(도 41 및 71, 77)는 전체 상부 표면을 밀봉시키기 위한 벤트 막 및 밸브 V15(도 41 및 71, 54)를 갖는 챔버로 구성된다. 밸브 및 소모 설계는 부피가 다양할 수 있고, 공기 기포를 함유할 수 있는 과량의 유체(따라서, 불연속의 유체 플러그가 존재하는 샘플)를 수용한다. 완전히 배출된 소모 챔버의 사용은 유체 플러그 내에 존재하는 공기가 배출되도록 하고, 밸브의 사용은 폐기물이 챔버로 향하게 하고 밀봉되도록 한다.
- 수동 샘플 분할. 공기에 의해 분리되는 2개의 유체의 유동을 2개의 경로로 분할시키는 수동의 차별적 컨덕턴스 특징부의 사용이 이로울 수 있다. 이러한 설계에서, 단일 유동 경로는 벤팅된 챔버로 끝나는 2개의 유동 경로로 분할된다. 첫번째 채널의 유동 컨덕턴스(flow conductance)는 이의 유체 경로를 따라 수동 유동 제한을 통합시킴으로써 두번째 채널의 유동 컨덕턴스에 비해 현저하게 감소된다. 유동 제한은 저항력을 발생시키고, 유동되어 분할되는 액체는 벤트 챔버가 충전되거나 벤트 막이 완전히 적셔질 때까지 보다 높은 컨덕턴스의 채널에서 유동할 것이다. 발생시, 상기 유동 채널의 제한은 높으며, 추가적인 액체가 (유동 제한 구성요소에도 불구하고) 두번째 채널로 유동한다. 이러한 설계가 컨덕턴스를 기초로 하여 2개의 경로 사이의 유체의 유동을 수동적으로 제어하는데 사용된다. 채널 내의 2개의 액체가 공기 플러그에 의해 분리되는 경우에 특히 유용하며; 첫번째 액체는 첫번째 경로로 유동하고, 두번째 액체는 두번째 경로로 전환된다.
- 대량유체 챔버의 벤팅. 실시예 5 및 6의 "무질서 기포형성(chaotic bubbling)" 단계는 많은 부피의 용액의 유의한 교반을 발생시킨다. 무질서 기포형성에서의 용해 용액은 시약이 바이오칩을 이탈는 것을 방지하고, 기계 내에 끝까지 존재하기 위해 챔버 내에 함유되어야 하는 반면, 많은 부피의 공기는 기포형성을 촉진하기 위해 적절한 공기가 유동되도록 하기 위해 배출되어야 한다. 이는 유체 유동에 대한 장벽으로 작용하지만, 무질서 기포형성으로부터 공기가 배출되도록 하는 덮개 내의 벤트 막을 이용함으로써 달성된다. 무질서 기포형성 또는 임의의 이유로 인한 실질적 공기 유동에 적용되는 임의의 챔버를 벤팅시키기 위해 유사한 설계가 이용된다.
- 유도 라인의 분리 - 벤트 막은 또한 바이오칩 내의 유체로부터 기계의 유도 라인을 분리시키기 위해 바이오칩의 덮개 및 다른 부분에 통합된다.
밸빙(valving) 구조
상기 기능은 2개의 유동 제어 구조인 밸브 및 벤트 막에 의존한다. 바이오칩은 유동 제어가 채널 내의 유체의 유동을 정지시키거나 가능케 하는 밸브를 이용한다. 밸브는 수동 또는 능동 밸브일 수 있고, 수동 밸브는 인-라인(in-line) 중합 겔, 수동 플러그, 및 소수성 밸브를 포함한다. 능동 밸브 구조는 기계적(열공압 및 형상 기억 합금), 비-기계적(하이드로겔, 졸-겔, 파라핀, 및 얼음), 및 외부(모듈 빌트-인(built-in), 공압, 및 비-공압) 밸브를 포함한다. 공압 및 기계 밸브 구조는 또한 엘라스토머 또는 비-엘라스토머 막을 이용할 수 있다. 어느 한 경우, 막은 최적의 밀봉 특성을 제공하기 위해 처리될 수 있다.
많은 유형의 밸브 구조가 본 발명의 바이오칩에서 이용될 수 있고, 여러 유형이 개별적 바이오칩에 통합될 수 있다. 밸브 구조의 선택은 주로 제작 용이성 및 기계사용에 대한 방법에 맞춘 어셈블리를 기초로 한다. 예를 들어, 바이오칩 특징부를 작동시키는 막대에 의해 제어되는 기계적 밸브가 복잡한 기계적 배열 및 제어 메커니즘을 갖는 기계에서 적절하다. 유사하게, 왁스의 국소화된 용융을 기초로 하는 밸브는 제어되는 특정 가열 메커니즘을 갖는 기계를 필요로 한다. 실시예 5 및 6에서, 기계는 복잡한 공압 제어가 가능하고, 통합 밸브 유형(하기 기재됨)은 공압 작동을 기초로 한다. 다른 공압 및 비-공압(예를 들어, 기계, 액체, 왁스, 전기) 작동 메커니즘 및 해당 밸브가 본 발명의 바이오칩에서 이용될 수 있다.
공압 작동되는 엘라스토머 밸브 구조의 평면도가 도 8에 제시된다. 상기 평면도는 감압식 접착제(PSA) 테이프 및 정상적인 개방 밸브를 위한 엘라스토머 막을 도시한다. 유체 및 공기의 제어를 위한 공압 작동 밸브의 횡단면도가 도 9에 제시된다. 상기 밸브 구조의 구성요소는 밸브 막(202), 밸브 시트(203), 공압 챔버(204), 유체 챔버(205), 이중면 PSA 테이프(206), 유체 스루 홀(208), 유체 채널(209), 및 공압 채널(210)을 포함한다. 이러한 밸브는 하기의 3개의 구성요소를 어셈블리시킴으로써 제작된다:
유체 서브어셈블리. 이러한 서브어셈블리는 유체(209)(액체 또는 공기) 유동을 위한 채널을 함유한다. 상기 채널은 표면으로 통과하는 스루 홀(208) 세트에 의해 중단된다. 표면에서, 상기 스루 홀은 밸브 어셈블리에 대한 밸브 시트(203)를 형성한다. 이는 열가소성 시트에서 채널 및 스루 홀을 CNC 기계가공하고(도 33), 양면을 얇은 플라스틱 필름으로 덮음으로써 제작된다. 이러한 경우, 얇은 필름 플라스틱은 결합되는 열가소성 필름이다. 필름 자체는 CNC 기계가공에 의해 패턴화되고, 유체 샌드위치 층으로의 접근을 제공하는 CNC 기계가공된 층 상의 해당 특징부에 배열되는 스루 홀을 포함하는 특징부를 갖는다. 유사하게, 유체 및 공압 층 내의 동일 특징부가 또한 사출성형에 의해 제작될 수 있다.
공압 서브어셈블리. 이러한 서브어셈블리는 유체 서브어셈블리 내의 유체를 공압 유도하고, 바이오칩 내의 밸브를 공압 작동시키기 위해 기계의 공압 유도를 유체 서브어셈블리에 커플링시킨다. 공압 채널(210)은 공압 유도를 밸브 챔버에 커플링시킨다. 이러한 서브어셈블리는 열가소성 시트의 양면 각각에 채널 및 챔버를 CNC 기계가공함으로써 제작된다(도 44). 얇은 플라스틱 필름 내의 특징부는 공압 샌드위치 층으로의 접근을 제공하기 위해 CNC 기계가공된 층 상의 해당 특징부에 배열된 스루 홀을 포함한다. 결합은 열적으로 달성되지만, 초음파, 용매 및 접착제를 이용하여 수행될 수 있다. 유사하게, 유체 및 공압 층 내의 동일 특징부가 또한 사출성형에 의해 제작될 수 있다.
밸브 서브어셈블리 - 이러한 서브어셈블리는 공압 서브어셈블리와 유체 서브어셈블리 사이에 위치된다. 이러한 작제물에서, 밸브 어셈블리는 0.005" 두께인 엘라스토머 막(202)으로 구성된다. 공압 작동되는 경우, 이러한 층은 유체 층 내의 유체(공기를 포함함)의 유동을 제어하도록 편향될 것이다. 상부 감압성 접착제 층(206)이 상부 공압 층에 막을 부착시키는데 사용된다. 하부 감압성 접착제 층이 유체 층에 막 층(206)을 부착시키는데 사용된다. 감압성 층은 레이저 절단에 의해 패턴화된다. 감압성 접착제 층은 또한 다이 절단 또는 천공(punching)을 포함하는 방법에 의해 패턴화될 수 있다. 엘라스토머 막은 0.005"-0.015" 두께이고, 물질은 고무, 예를 들어, 실리콘일 수 있다.
밸브를 3개의 서브어셈블리를 함께 어셈블리시킴으로써 작제하였다. 유체 어셈블리 및 공압 어셈블리가 열 결합에 의해 함께 고정된다. 유사하게, 공압 및 유체 플레이트는 스크류, 리벳, 열적 열 스테이킹 및 초음파 용접을 포함하는 다수의 기계적 파스너의 사용에 의해 함께 고정될 수 있다.
이러한 밸브는 일반적으로 개방된다. 유체는 유체 층 내의 채널을 통해 스루 홀을 통과하여 밸브 본체로 유동하고, 두번째 스루 홀로 배출되고, 다시 유체 층 내의 채널로 유동할 것이다. 압력이 공압 채널에 적용되는 경우, 압력은 밸브 막으로 편향되고, 밸브 유체 챔버의 밸브 시트 및 플로어에 대해 상기 막을 밀게 된다. 이는 스루 홀 사이의 경로를 밀봉시키고, 밸브를 통한 유동을 중지시킨다. 밸브 구조는 높은 정도의 순응성을 갖는 PSA 구성요소 및 막을 통합시켜, 어셈블리시 이들의 압축이 결합되는 두 부품의 편평함에서의 임의의 국소적 변화가 수용되도록 한다. 이러한 수용은 밸브 주위에 효과적인 밀봉을 형성하는 능력을 향상시킨다.
밸브 밀봉 압력을 평가하기 위한 실험을 수행하였다. 밸브의 공압 채널을 공압 유도부인 VD에 연결시켰다. 일정 부피의 염색된 액체(물)를 밸브에 커플링된 유체 채널의 일부에 로딩하였다. 유체 채널에 대한 입구를 또 다른 공압 유도부 FD에 연결시켰다. VD의 압력을 설정하고, 실험 전체에 걸쳐 일정하게 유지시켰다. FD의 압력은 채널 내에서의 유체 유동이 관찰될때까지 점차 증가하였다. 유체가 유동하기 시작한 압력이 제공된 밸브 밀봉 압력에 대한 밸브의 파열 압력이다. 5, 15, 및 22 psig의 밸브 밀봉 압력에 대한 밸브에 대한 파열 압력은 각각 3, 13.5 및 20 psig였다. 이러한 데이터는 유체 유도 압력보다 2 psig 더 큰 공압 밀봉 압력이 밀봉에 허용되는 것을 나타낸다. 실시예 5 및 6의 바이오칩에서, 밸브 밀봉 압력은 처리 단계 대부분에 대해 통상적인 압력(22 psig)으로 설정된다. 이는 다수의 밸브를 동시에 제어하고, 유동 채널을 18 psig 이하의 압력으로 제어하는데 효과적이다. 고정된 밸브 유도 압력이 대부분의 기능에 적절하나, 밸브 막이 작동되는 경우 유체의 임의의 진동을 최소화시키기 위해 다양한 시스템은 밸브 압력이 증가(유체 유도 압력 필요조건이 높은 경우)되고, 감소(밸브의 개방 전)되는 것을 허용한다.
밸브가 진공 처리 단계 동안 사용되고, 유체가 밸브를 통해 끌어당겨진 유체인 경우, 개방 위치의 밸브를 유지시키기 위해 유체 및 공압 라인 둘 모두에 진공이 적용되는 것이 또한 필요하다. 이러한 밸브를 폐쇄시키기 위해, 상기와 같이 압력이 적용된다.
실시예 4, 5, 및 6의 바이오칩 내의 밸브 모두는 보통 개방 형태이지만, 본 실시예의 밸브 및 여러 유형의 밸브는 보통 폐쇄 형태로 설계될 수 있다. 예를 들어, 도 10은 보통 폐쇄된 작업을 위한 PSA 테이프 및 엘라스토머 막 밸브의 평면도이다. 도 11은 보통 폐쇄된 형태를 위한 PSA 테이프 및 엘라스토머 막 밸브의 횡단면도이다. 이러한 밸브의 작제는 밸브 시트가 상승되어 이들이 작동되지 않은 상태의 밸브 막 층과 밀접하게 접촉된다는 점에서 도 8 및 9의 밸브의 작제보다 어렵다. 제작시 밸브 시트를 갖는 밸브 막이 제작 및 어셈블리 동안 장력 하에서 배치된다. 밸브를 개방하기 위해, 진공이 적용되어 밸브 시트로부터 밸브 막을 떼어놓는다. 본 실시예의 모든 밸브(도 10 및 11의 구조를 제외함)는 보통 개방됨을 인지하라. 일부 적용에 대해, 1회 사용 밸브, 즉, 검정 처리 동안 반복적으로 개방되고 폐쇄되지 않고, 예를 들어, 개방 상태로 처리가 시작되고, 검정 처리 동안 1회 폐쇄되는 밸브를 통합시키는 것이 유리할 수 있다.
보통 개방 형태의 단단한 밸브 막을 갖는 공압 작동 밸브의 평면도가 도 12에 제시된다. 유체 및 공기의 제어를 위한 단단한 밸브 막을 갖는 공압 작동 밸브의 횡단면도가 도 13에 제시된다. 밸브 구조의 구성요소는 밸브 막(202), 밸브 시트(203), 공압 챔버(204), 유체 챔버(205), 유체 스루 홀(208), 유체 채널(209), 및 공압 채널(210)을 포함한다. 이러한 밸브는 하기 3개의 구성요소를 어셈블리하여 제작된다:
유체 서브어셈블리. 이러한 서브어셈블리는 유체(액체 또는 공기) 유동을 위한 채널을 함유한다. 상기 채널은 표면으로 통과하는 스루 홀(208) 세트에 의해 중단된다. 상기 스루 홀은 밸브 어셈블리에 대한 밸브 시트(203)를 형성한다. 대안적으로, 채널은 유체 플레이트의 상부면을 따라 루팅될 수 있고, 밸브를 통해 통과함에 따라 중단될 수 있다. 채널 말단은 상기 어셈블리를 위한 밸브 시트를 형성한다. 이러한 어셈블리는 열가소성의 채널 및 스루 홀을 사출성형시킴으로써 제작된다. 이러한 경우, 밸브 막(202)은 결합되는 얇은 필름의 열가소성 필름이다. 이러한 구조의 유체 챔버(205)는 밀봉을 실행하기 위한 완전한 편향하에서 단단한 막의 형태로 형성된다.
공압 서브어셈블리. 이러한 서브어셈블리는 유체 서브어셈블리 내의 유체를 공압 유도하고, 바이오칩 내의 밸브를 공압 작동시키기 위해 기계의 공압 유도를 유체 서브어셈블리에 커플링시킨다. 공압 채널은 공압 유도를 밸브 챔버에 커플링시킨다. 이러한 서브어셈블리는 열가소성의 채널 및 챔버 특징부를 사출성형시킴으로써 제작된다(도 72 및 73). 얇은 플라스틱 필름 내의 특징부는 공압 서브어셈블리에 대한 접근을 제공하는 사출성형된 층 상의 해당 특징부에 배열되는 스루 홀을 포함한다. 결합은 열적으로 달성되지만, 초음파, 용매 및 접착제를 이용하여 수행될 수 있다.
밸브 서브어셈블리. 이러한 서브어셈블리는 공압 서브어셈블리와 유체 서브어셈블리 사이에 위치된다. 이러한 작제물에서, 밸브 어셈블리는 얇은 열가소성 필름으로 구성된다. 필름은 10 내지 250 마이크론 두께일 수 있다. 실시예 6에서, 40 마이크론, 50 마이크론 및 100 마이크론의 열가소성 필름을 사용하였다. 공압 작동되는 경우, 이러한 층은 유체 층 내의 유체(공기를 포함함)의 유동을 제어하기 위해 편향된다. 3개의 서브어셈블리를 함께 어셈블리하여 밸브를 작제하였다. 유체 어셈블리 및 공압 어셈블리를 열적으로 또는 용매에 의해 함께 결합시켰다. 대안적으로, 어셈블리의 상부 및 하부를 함께 부착시키는데 이중면의 접착제가 또한 사용될 수 있다. 얇은 열가소성의 단단한 밸브 막은 유체 층과 일체성형되고, 이는 바이오칩 어셈블리 동안 현저히 유리하다.
이러한 밸브는 일반적으로 개방된다. 유체는 유체 층 내의 채널을 통해 스루 홀을 통과하여 밸브 본체로 유동하고, 두번째 스루 홀로 배출되고, 다시 유체 층 내의 채널로 유동한다. 압력이 공압 채널에 적용되는 경우, 압력은 단단한 밸브 막으로 편향되고, 밸브 유체 챔버의 밸브 시트 및 플로어에 대해 상기 막을 밀어 스루 홀 사이의 경로를 밀봉시키고 밸브를 통한 유동을 중지시킨다.
상기 방법을 이용하여 100 마이크론 막을 갖는 밸브를 작제함으로써 밸브 밀봉 압력을 평가하기 위한 실험을 수행하였다. 밸브의 공압 채널을 공압 유도부인 VD에 연결시켰다. 일정 부피의 염색된 액체(물)를 밸브에 커플링된 유체 채널의 일부에 로딩하였다. 유체 채널에 대한 입구를 또 다른 공압 유도부인 FD에 연결시켰다. FD의 압력을 설정하고, 실험 전체에 걸쳐 일정하게 유지시켰다. VD의 압력은 채널 내에서의 유체 유동이 관찰될때까지 높은 수준의 80 psig로부터 점차 감소시켰다. 1, 2, 3, 4, 및 5 psig의 FD를 유지시키는데 필요한 밸브 밀봉 압력은 각각 14.6, 28, 54, 65.5, 및 81.5 psig였다. 이러한 밸브 작제에 사용되는 단단한 막은 유체 유동을 밀봉시키기 위해 보다 높은 압력의 적용을 필요로 한다. 밸브 막 두께를 100 마이크론으로부터 50 마이크론 및 40 마이크론으로 감소시키는 것은 유체 유동을 밀봉시키기 위한 압력에 대한 필요조건을 실질적으로 감소시켰다. 유체가 채널을 통해 끌어당겨지는 진공 작업에 대해, 밸브를 개방 위치로 유지시키기 위해 진공이 밸브에 적용된다.
도 14는 클램핑된 보통 개방된 엘라스토머 막 밸브의 평면도를 도시한다. 유체 및 공기의 제어를 위한 상기 공압 작동 밸브의 횡단면도가 도 15에 제시된다. 밸브 구조에 대한 구성요소는 밸브 막(202), 밸브 시트(203), 공압 챔버(204), 유체 챔버(205), 유체 스루 홀(208), 유체 채널(209), 공압 채널(210), 및 압축 링(212)을 포함한다. 이러한 밸브는 3개의 서브어셈블리를 어셈블리함으로써 제작된다. 이러한 구조의 장점은 매우 간단하고, PSA 테이프를 필요로 하지 않는다는 점이다.
유체 서브어셈블리 - 이러한 서브어셈블리는 유체(209)(액체 또는 공기) 유동을 위한 채널을 함유한다. 상기 채널은 표면으로 통과하는 스루 홀(208) 세트에 의해 중단된다. 표면에서, 상기 스루 홀은 밸브 어셈블리에 대한 밸브 시트(203)를 형성한다. 이는 열가소성 시트에서 채널 및 스루 홀을 CNC 기계가공하고(도 33), 양면을 얇은 플라스틱 필름으로 덮음(도 36 및 도 37)으로써 제작된다. 이러한 경우, 얇은 필름 플라스틱은 결합되는 열가소성 필름이다. 필름 자체는 CNC 기계가공에 의해 패턴화되고, 유체 샌드위치 층으로의 접근을 제공하는 CNC 기계가공된 층 상의 해당 특징부에 배열되는 스루 홀을 포함하는 특징부를 갖는다. 유사하게, 유체 및 공압 층 내의 동일 특징부가 또한 사출성형에 의해 제작될 수 있다. 밸브 막 압축 고리의 세트가 유체 챔버(212) 주위에 형성된다.
공압 서브어셈블리 - 이러한 서브어셈블리는 유체 서브어셈블리 내의 유체를 공압 유도하고, 바이오칩 내의 밸브를 공압 작동시키기 위해 기계의 공압 유도를 유체 서브어셈블리에 커플링시킨다. 공압 채널(210)은 공압 유도를 밸브 챔버에 커플링시킨다. 이러한 서브어셈블리는 열가소성 시트의 양면의 각각에 채널 및 챔버를 CNC 기계가공함으로써 제작된다(도 12). 얇은 플라스틱 필름 내의 특징부는 공압 샌드위치 층으로의 접근을 제공하기 위해 CNC 기계가공된 층 상의 해당 특징부에 배열된다. 결합은 열적으로 달성되지만, 초음파, 용매 및 접착제를 이용하여 수행될 수 있다. 유사하게, 유체 및 공압 층 내의 동일 특징부가 또한 사출성형에 의해 제작될 수 있다. 밸브 막 압축 고리의 세트가 공압 챔버(211) 주위에 형성된다. 유체 및 공압 챔버의 압축 고리는 서로 일치하며, 서로 배열될 것이다.
밸브 서브어셈블리 - 이러한 서브어셈블리는 공압 서브어셈블리와 유체 서브어셈블리 사이에 위치된다. 이러한 작제에서, 밸브 어셈블리는 0.005" 두께인 실리콘 막(202)으로 구성된다. 공압 작동되는 경우, 이러한 층은 유체 층 내의 유체(공기를 포함함)의 유동을 제어하도록 편향될 것이다.
밸브는 3개의 서브어셈블리를 함께 어셈블리시킴으로써 작제된다. 유체 어셈블리 및 공압 어셈블리가 열 결합에 의해 함께 고정된다. 유사하게, 공압 및 유체 플레이트는 스크류, 리벳, 열적 열 스테이킹 및 초음파 용접을 포함하는 다수의 기계적 파스너의 사용에 의해 함께 고정될 수 있다. 공압 및 유체 층은 압축 고리(212) 사이의 막 층이 압축되도록 결합된다. 압축의 정도는 5% 내지 60% 범위일 것이고, 이는 밸브 막의 경도(durometer) 및 두께의 함수이다. 압축 정도는 공압 유도부가 공압 챔버 내에서 밀봉되고, 유체가 유체 챔버로부터 누출되지 않는 경우에 충분하다.
벤팅 구조
상기 장치의 미세유체 구성요소는 공기를 벤팅시키고, 유체 유동에 대해 장벽으로 작용하는 벤팅 막을 이용한다. 실시예 5 및 6의 바이오칩에서 사용되는 벤팅 막을 전달되는 액체의 표면 장력 및 표면 자유 에너지를 기초로 하여 선택하였다. 상기 둘 사이에 유의한 차이가 존재하는 경우, 고체 표면과 액체 사이의 접촉각은 높고, 액체 비말은 막 표면으로부터 반발되고, 막과 얽히지 않을 것이다. 또 다른 고려사항은 막을 통한 공기-유동 속도이다. 이는 공기의 제한되지 않은 벤팅을 가능케 하기 위해 충분히 높아야 한다. 통상적으로, 제공된 물질에 대해, 표면 자유 에너지와 표면 장력 사이의 차이는 포어 크기가 감소할수록 증가하지만, 공기 유속은 포어 크기에 역비례된다. 예를 들어, 물의 표면 장력은 73 다인/cm이고, 이소프로필 알콜은 22 다인/cm이고, 오일은 30 다인/cm이다.
상기 바이오칩에 사용되는 벤팅 막은 의학적 벤팅 및 가스 여과에서 광범위하게 사용되는 물질인 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE)으로 제조된 것을 포함한다. 이는 우수한 유동 특성 및 높은 화학적 내성을 제공하는 비활성 물질이다. 상기 막 유형의 절단 형태의 공간적 불안정성은 과성형 작업에서 로봇을 이용한 취급에서 어려움을 야기시킬 수 있다. PTFE는 감마 또는 E-빔 멸균과 양립되지 않는데, 이는 상기 물질이 이온화 방사선에 노출되는 경우에 사슬 절단이 온전성의 상실을 야기시키기 때문이며; 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF)가 우수한 유동 특성 및 광범위한 화학적 내성을 제공하는 내구력이 있는 물질이다. 자연 및 초-소수성 형태 둘 모두가 이용가능하고; 초고분자량 폴리에틸렌(UPE)이 의학적 벤팅 및 가스 여과 시장에 보다 최근에 유입되었다. 이는 우수한 유동 특성 및 광범위한 화학적 내성을 제공하는 자연 소수성 물질이며; 소수성이 되도록 처리된 변형된 아크릴성 막이 벤팅 적용을 위한 경제적인 선택이다. 이는 올레포빅(oleophobic)이고, 소수성이며, 화학적으로 양립된다.
도 16은 실시예 5의 바이오칩에서 사용되는 벤트 막 형태의 횡단면도를 도시한다. 벤트 막(도 16, 213)은 구조에 통합되며, 상기 막은 열 결합에 의해 공압 및 유체 층 사이에 배치된다. 도 17은 실시예 6의 바이오칩에서 사용되는 벤트 막 형태(도 17, 213)의 횡단면도를 도시한다. 이러한 벤트 막 형태에서, 벤트 막은 용접 리지(ridge)를 이용하여 유체 층에 용접된다.
실시예 3. 바이오칩 인터페이스
본 발명의 바이오칩은 기계와 인터페이싱된다. 기계는 도 58에 도시된 바와 같이 고전압 및 저전압 동력 서브시스템, 열 사이클링 서브시스템, 공압 서브시스템, 자기 서브시스템, 기계 서브시스템, 광학 서브시스템, 러기드화 서브시스템, 처리 제어 서브시스템, 및 컴퓨터 서브시스템을 포함하는 샘플 분석의 완료에 필요한 모든 서브시스템을 제공한다. 바이오칩 인터페이스에 대한 기계는 미세유체 유도 및 바이오칩 내에서 수행되는 일련의 처리에 따라 상기 서브시스템 중 하나 이상을 포함할 것이다. 본원의 예의 경우, 바이오칩 및 기계의 인터페이스는 다음과 같이 공압, 전기, 광학, 및 기계 인터페이스이다:
공압 서브시스템 인터페이스.
공압 서브시스템은 공압 다기관을 통해 바이오칩에 커플링된다. 도 18은 실시예 5의 바이오칩에 대한 공압 다기관 영역을 도시하며, 이는 공압 플레이트의 상부면에 위치되는 일련의 공압 포트로 구성된다. 5개 유형의 포트가 공압 인터페이스에 통합된다:
저 유동 유도. 밸브의 작동 및 바이오칩을 통한 유체의 이동을 위한 공압을 공급하기 위해 저 유동 포트가 사용된다.
고 유동 유도. 19 SLPM 이하의 유동을 필요로 하는, 기포형성에 의한 교반 및 정제 막의 건조와 같은 처리에 필요한 공기를 공급하기 위해 고 유동 포트가 사용된다. 압력 저하를 최소화하기 위해 포트 크기가 확대된다.
고압 유도. 이러한 포트는 매트릭스 충전물을 체질하는데 필요한 400 psig 이하를 공급하기 위해 사용된다.
응축물 포트. 기계 내에서 기계적 펌프에 의해 발생된 응축물은 임의로 공압 인터페이스를 통해 바이오칩의 챔버로 유도될 수 있다.
기계 시험 포트. 기계 공압 시스템을 시험하고, 바이오칩의 공압 다기관에 대한 기계의 공압 다기관의 배열을 확인하기 위해 시험 포트가 공압 다기관에 통합될 수 있다.
공압 포트가 어레이에 배치되고, 이중 34개는 저 유동 포트이고, 7개는 고 유동 포트이다. 하기 고려사항을 부분적으로 기초로 하여 상기 공압 다기관의 위치를 선택하였다:
인터페이스 부위 표면적의 최소화. 공압 인터페이스 영역이 더욱 밀집될수록, 사출성형 동안 인터페이스를 방해하게 될 국소 수축 및 휨이 적어져, 개선된 배열을 가능케 한다.
단일 인터페이스 부위에서의 모든 공압 포트의 수집. 이러한 방법은 러기드화되고, 실험실 외부에서 사용되는 시스템에서의 장점인 기계를 간소화시킨다. 통상적으로, 단일 인터페이스가 바이오칩 풋프린트 내에 중심적으로 위치될 것이나, 이는 또한 바이오칩의 말단에 위치될 수 있다. 대안적으로, 다수의 인터페이스가 바이오칩 전체에 걸쳐 분포될 수 있다. 실시예 5 및 6의 바이오칩에서, 기계와 바이오칩 사이의 밀집한 커플링 지점을 가능케 하는 한 위치에 공압 포트가 집중된다. 이러한 다기관의 구성 및 위치결정은 분산된 포트를 갖거나 모든 포트가 바이오칩의 맨 끝에 위치되는 것에 비해 바이오칩 내의 공압 라인의 루팅을 간소화시킨다. 이는 또한 다기관과 공압 포트 사이의 배열의 오차 허용도를 증가시키고, 기계 내에서의 공압 관류의 루팅을 간소화시킨다.
특징부 밀도를 기초로 한 바이오칩 상의 포트의 위치 - 특징부 밀도가 낮은 유체 및 공압 플레이트 상의 영역이 존재한다. 가능한 경우 상기 영역 내에 공압 다기관을 위치시키는 것이 최적이다. 일반적으로, 바이오칩 상의 공간의 최적의 이용(즉, 모든 미세유체 및 대량유체 특징부의 합리적인 패킹)이 제공된 치수의 바이오칩의 특징부 밀도 및 처리 복잡도를 최대화시키는데 중요하다. 실시예 5 및 6의 바이오칩에서, 공압 포트는 공압 층의 상부면에 위치된다. 유사하게, 공압 포트는 또한 유체 층의 하부면에 위치될 수 있고, 칩 홀더를 통해 기계에 커플링될 수 있다. 포트의 절대 위치는 특징부 밀도, 기능적 용도, 및 설계의 용이성에 의해 결정된다. 실시예 5 및 6의 바이오칩에서, 열 사이클링 영역은 유체 서브어셈블리의 하부면에 위치되고, 이는 열 순환기(thermal cycler)와 효과적인 열 접촉을 확립하기 위해 상기로부터 클램핑(clamping) 압력을 필요로 한다. 따라서, 집중된 공압 포트가 공압 서브어셈블리의 상부면에 위치되어, 단일 클램핑 메커니즘이 바이오칩과 열적 및 공압식으로 동시에 인터페이싱 기능을 할 수 있다.
폐쇄된 시스템 - 상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 바이오칩은 폐쇄된 시스템이어서, 모든 액체가 처리 동안 및 처리 후에 바이오칩 내에 위치된다. 유체가 바이오칩으로부터 기계의 공압 다기관으로 부주의하게 유동하는 것을 차단하기 위해 벤트 막(실시예 2에 기재된 바와 같음)이 사용된다.
공압 유동 및 공압 다기관의 예시로서, 실시예 5의 "용해 단계"를 위한 대량유체 처리 서브시스템 내의 유체를 유도하는 방법이 제시될 것이다. 이러한 단계를 실시하기 위해, 용해 유도 라인 DL1(도 39, 68)을 작동시켜 용해 시약 챔버(도 39, 20)로부터 면봉(swab) 챔버(도 39, 19)로 용해 용액을 유도시켰다. 처리 제어기는 공압 인터페이스(도 39, 20) 상의 유도 라인 DL1 포트 상에 요망되는 압력을 적용시키는 기계 상의 솔레노이드 릴레이(solenoid relay)를 작동시켰다. 공기는 공압 다기관의 DL1 포트(도 18, 301)의 공압 인터페이스를 통해 공압 플레이트(도 18, 302)의 공압 채널을 따라 공압 플레이트 내의 미세유체 인터페이스 포트(도 19, 303)로 유도된다. 이러한 인터페이스 포트는 대량유체 처리 블록(도 47, 26) 내의 공압 채널을 통해 대량유체 처리 서브어셈블리(도 48, 27)의 덮개로 공압 유도 압력을 루팅시켰다. 덮개는 차례로 채널(도 48 및 53, 304)을 따라 용해 시약 챔버(도 47, 20)로 공압 유도 압력을 루팅시켰다. 종합하면, 결과로서 발생된 단계는 유체 서브어셈블리를 통한 용해 시약 챔버로부터의 궁극적으로 면봉 챔버(도 20, 20)로의 용해 시약의 이동이다.
유사하게, 챔버 내의 시약이 실시예 1에서와 같이 호일에 의해 밀봉되는 경우, 공압 유도가 2 단계 작용으로 적용되며, 여기서 첫번째 단계는 호일을 파열시키기 위해 펄스를 생성시키는 것이고, 두번째 단계는 상기 비-RSR 예시와 유사하다.
고전압 서브시스템 인터페이스
고전압 서브시스템이 전극 핀 및 와이어링 하네스(wiring harness)의 세트를 통해 바이오칩에 커플링된다. 대안적으로, 에칭된 얇은 금속 전극의 세트가 또한 제작될 수 있다. 이러한 환경에서, 전극 핀이 바이오칩으로의 압입(press fitting)에 의해 애노드 및 캐쏘드에 삽입된다. 전극 핀은 공압 서브어셈블리의 상부에 위치되고 또한 압입에 의해 삽입되는 전극 스트립과 접촉된다. 이러한 전극 스트립은 기계 상의 일련의 스프링 로딩된 전극에 의해 기계에 커플링된다. 전극 스트립은 매우 다양한 구성요소로 제작될 수 있는 고성능 금속인 베릴륨 구리(BeCu)로 제작된다. 이의 기계적 및 전기적 특성은 이를 EMI/RFI 차폐 제품에 대한 이상적인 물질로 만든다. 전극 스트립은 또한 다른 금속으로 제작될 수 있다.
광학 서브시스템 인터페이스
"핵산 및 단백질의 분석을 위한 러기드화된 장치(Ruggedized Apparatus for Analysis of Nucleic Acid and Proteins)"를 제목으로 하는 2009/00229983으로 공개된 특허 출원 일련 번호 12/396,110호, 및 "플라스틱 미세유체 분리 및 검출 플랫폼(Plastic Microfluidic Separation and Detection Platforms)"을 제목으로 하는 2009/0020427로 공개된 12/080,745호(둘 모두 참조로서 본원에 포함됨)에 기재된 바와 같이, 레이저가 칩 홀더 내의 구멍을 통해 공압-밸브-유체 스택의 분리 및 검출 윈도우에 커플링된다(실시예 5 및 6). 분리 및 검출 바이오칩 내의 레인(lane)의 레인 발견을 가능케 하기 위해 일련의 광다이오드가 사용된다.
열 서브시스템 인터페이스
참조로서 본원에 포함되는, "표적 핵산의 신속한 다중 증폭 방법(Methods for Rapid Multiplexed Amplification of Target Nucleic Acids)"을 제목으로 하는 2009/0023603으로 공개된 출원 일련 번호 12/080,746호에 기재된 바와 같이, 열 순환기 및 바이오칩이 열 싸이클링 챔버가 TEC 구성요소 내에 집중되도록 위치된다. 온도 싸이클링 프로파일을 정확히 발생시키기 위한 열 싸이클링 챔버와 TEC 사이의 우수한 접촉을 달성하는데 90 lbs의 클램핑 힘이 필요하다. 클램프 아암(arm) 및 실리콘 패드의 압축에 의해 클램핑 압력이 발생된다. 클램핑 아암은 실리콘 패드를 아래로 밀어내는데 필요한 압력을 발휘한다.
효과적인 열 전달에 필요한 클램핑 힘을 평가하기 위한 실험을 수행하였다. PCR 바이오칩(도 21, 401)으로의 제어된 힘을 발휘하도록 하기 위해 공압 구동 실린더(도 21, 305)를 이용하였다. 각 수준의 힘에서, 표준 프로토콜(참조로서 본원에 포함되는, 문헌[Giese, H., et al. (2009). "Fast multiplexed polymerase chain reaction for conventional and microfluidic short tandem repeat analysis." J Forensic Sci 54(6):1287-96] 참조)에 따라 PCR을 수행하고, STR 프로파일을 분석하였다. 데이터는 75 lbs 이하의 힘에서, 일치하지 않는 STR 프로파일이 생성된 것을 나타내었다. 75 lbs를 초과하는 힘이 적용되는 경우, 일치하고 효과적인 증폭이 관찰되었다(도 22).
50℃의 온도를 유지시키기 위해 분리 및 검출 서브시스템이 칩 홀더 상의 히터에 커플링된다. 온도 균일성은 중요하고, 히터 플레이트로의 바이오칩의 클램핑은 온도 균일성의 확립 및 유지에 기여한다.
기계적 배열
모든 바이오칩을 기계 인터페이스에 배열하기 위해, 바이오칩이 일련의 기계적 배열 유도장치를 함유하는 기계의 칩 홀더에 배치된다. 이러한 유도장치는 ± 0.020" 내의 기계에 대한 바이오칩의 인터페이스 특징부의 배열을 제공한다. 유도장치는 원점(origin) 및 배향의 위치를 정하기 위해 코너 근처에 공압 플레이트의 가장자리를 따라 3개의 위치에서 칩을 기록한다. 이러한 배열에서, 유도장치는 공압 층에 대해서만 위치시키기 위한 컷아웃(cutout)을 갖는다(이는 유체 플레이트 층과 공압 플레이트 층 사이의 약간의 오배열(misalignment)의 임의의 효과를 최소화시킨다).
실시예 4. DNA 및 PCR 시약을 수용하고 이를 혼합시키며, 16개의 샘플에 대해 17분 동안 동시에 16- 플렉스 증폭 반응을 수행하는, CNC -기계가공된 바이오칩.
도 23의 PCR 바이오칩(401)을 슬라이드 형태로 사출성형시키고, 신속한 다중 PCR에 대해 성공적으로 시험하였다. 이러한 바이오칩은 25 mm x 75 mm x 1.1 mm 두께이다. 상기 시스템은 문헌[Giese, H., et al. (2009). "Fast multiplexed polymerase chain reaction for conventional and microfluidic short tandem repeat analysis." J Forensic Sci 54(6): 1287-96]에 기재된 바와 같이 인간 DNA의 단일 유전체 당량(6 pg의 DNA, 본질적으로 검출의 단일-카피 한도)으로부터 STR 단편에 대한 다중 증폭을 가능케 한다.
상기 결과를 기초로 하여, 바이오칩(76.2 mm x 127 mm의 풋프린트)을 설계하고, CNC-기계가공에 의해 제작하였다. 유체 층 1(도 24, 403) 및 유체 층 2(도 25, 404), 공압 층 1(도 26, 405) 및 공압 층 2(도 27, 406)가 열가소성 시트로부터 CNC 기계가공에 의해 제작된다. 유체 서브어셈블리(도 28, 407)를 유체 층 1(도 24, 403), 유체 층 2(도 25, 404) 및 패턴화되지 않은 얇은 열가소성 필름을 어셈블리시키고, 열 결합시킴으로써 제작하였다. 공압 서브어셈블리(도 29, 408)를 공압 층 1(도 26, 405), 공압 층 2(도 27, 406)를 열 결합시킴으로써 제작하였다. 바이오칩 어셈블리(도 30, 409)를, 유체 서브어셈블리(도 28, 407)을 공압 서브어셈블리(도 30, 409)에 결합시키고, 실시예 2에 기재된 바와 같은 엘라스토머의 보통 개방된 밸브 서브어셈블리를 통합시킴으로써 제작하였다.
바이오칩을 시험하기 위해, 16개 샘플의 증폭에 충분한 160 마이크로리터의 PCR 시약 마스터 믹스(master mix)를 제조하고, CNC-기계가공된 바이오칩의 마스터 믹스 시약 저장소(도 28, 410)에 삽입하였다. 9.3 마이크로리터의 DNA(1 ng의 전체 주형)를 샘플 웰(도 28, 411) 각각에 삽입하였다. 바이오칩을 공압/열 사이클링 기계에 연결시켰다(도 31). 하기 단계로 자동화된 스크립트를 실시하였다:
·초기화. 모든 밸브를 폐쇄시켰다.
·샘플 및 시약 일렬화. 유도 라인 DR(도 28, 419)에 1 psig를 적용시킴으로써 바이오칩의 PCR 계수 챔버(도 28, 412)에 PCR 시약을 공압 유도시켰다. 9 마이크로리터 부피의 마스터 믹스를 계량하였다. 각각의 레인에 대한 샘플을 유도 라인 DS(도 28, 418)에 1 psig를 적용시킴으로써 벤트 막에서 일렬화시켰다.
·과량의 PCR 시약의 제거. 밸브 WV(도 28, 413)를 개방시켜 시약 소모 챔버(도 28, 414)로 유동시키고, 유도 라인 DR(도 28, 419)에 1 psig를 적용시킴으로써 과량의 PCR 마스터 믹스를 분배 채널로부터 제거하였다. 밸브 WV(도 28, 413)를 폐쇄시켜 시약 소모 챔버(도 28, 414)를 밀봉시키고, 유도 라인 DR(도 28, 419)을 불활성화시켰다.
·결합 챔버(JC)로의 시약 이동. 밸브 RV(도 28, 416)를 개방시키고, 30초 동안 1 psig의 공압 유도 압력을 DR(도 28, 418)에 적용시킴으로써 PCR 마스터 믹스를 결합 챔버(도 28, 415)로 공압 유도시켰다. 시약 밸브 RV(도 28, 416)를 폐쇄시키고, DR(도 28, 418)을 불활성화시켰다.
·결합 챔버(JC)로의 샘플 이동. 밸브 SV(도 28, 415)를 개방시키고, 30초 동안 1 psig의 공압 유도 압력을 DS(도 28, 419)로 적용시킴으로써 샘플을 결합 챔버(도 28, 415)로 공압 유도시켰다. 샘플 및 PCR 마스터 믹스를 결합 챔버에서 함께 결합시켜 PCR 용액을 형성시켰다. 밸브 SV(도 4.6, 415)를 폐쇄시키고, 유도 라인 DS(도 4.6, 419)를 불활성화시켰다.
·혼합 챔버(MC)로의 PCR 용액 이동. 밸브 JCV(도 28, 420) 및 RV(도 28, 416)를 개방시키고, 30초 동안 1 psig의 압력을 DR(도 28, 418)에 적용시킴으로써 PCR 용액을 혼합 챔버(도 28, 421) 공압 유도시켰다.
·샘플 및 시약의 혼합. 밸브 RV(도 28, 416; 밸브 JCV는 이미 개방되어 있음)를 개방시키고, 0으로부터 15 psig, 이후 15로부터 0 psig로 선형 증가(30초에 걸침)시키는 유도 압력을 DR(도 28 418)에 적용시킴으로써 PCR 용액을 공기 챔버 AC(도 28, 422)로 유도시켜 상호 혼합을 수행하였다. 이를 2회 반복하였다. 밸브 JCV(도 28, 420) 및 RV(도 28, 416)를 폐쇄시키고, DR(도 28, 418)을 불활성화시켰다.
·PCR 챔버(PC)로의 PCR 용액 이동. 밸브 PV1(도 28, 424), PV2(도 28, 425), JCV(도 28, 420) 및 RV(도 28, 416)를 개방시키고, 30초 동안 0.5 psig의 압력을 유도 라인 DR(도 28, 418)에 적용시킴으로써 PCR 용액을 PCR 챔버(도 28, 423)으로 이동시켰다. 밸브 PV1(도 28, 424), PV2(도 28, 425), JCV(도 28, 420) 및 RV(도 28, 416)를 폐쇄시켰다.
·열 주기. 밸브 PV1(도 28, 424) 및 PV2(도 28, 425)를 폐쇄시키고, 17분이 요구되는 28 주기의 프로토콜을 이용하여 열 사이클링을 수행하였다.
·PCR 생성물 회수. 밸브 OV1(도 4.6, 426), PV1(도 28, 424), PV2(도 28, 425), JCV(도 28, 420) 및 RV(도 28, 416)를 개방시켰다. 포트 OP(도 29, 427)로부터 PCR 생성물을 수작업으로 회수하기 위해 피펫 첨단을 이용하였다. 16개의 바이오칩 샘플로부터 PCR 생성물을 회수하였다.
결과. 스크립트의 실행 후, PCR 반응물을 각각의 채널로부터 제거하고, 분리시키고, Genebench에서 검출하였다. 반응에 대한 대표적 STR 프로파일이 도 32에 제시된다.
실시예 5. 자동화된 스크립트를 이용하여 핵산을 정제하고, 정제된 DNA 를 증폭시키고, 증폭된 DNA 를 전기영동 분리시키고, STR 프로파일을 발생시키는 완전히 통합된 바이오칩의 CNC 기계가공.
5개의 협측 면봉을 수용하고, STR 프로파일을 발생시키는 단일한 고정 플라스틱 바이오칩은 하기 부품으로 구성된다:
유체 서브어셈블리 - 이러한 서브어셈블리는 바이오칩 내에서 유체를 이동시키고, 처리하며, 공압 서브어셈블리, 대량유체 처리 서브어셈블리, 밸브 서브어셈블리, 및 분리 및 검출 서브어셈블리와 상호작용한다. COP 시트의 상부면 및 하부면 둘 모두 상에 채널 및 챔버의 서로 연결된 세트를 CNC 기계가공함으로써 유체 서브어셈블리의 유체 플레이트를 제작하였다. 유체 플레이트는 276 mm x 117 mm x 2.5 mm의 직경을 갖는다. 도 33은 유체 플레이트(1)의 평면도를 도시하고, 도 34는 유체 플레이트(1)의 저면도를 도시하고, 도 35는 유체 플레이트(1)의 투시도를 도시하며, 이는 양면으로부터의 특징부를 제시한다. 2.5 mm의 두께를 갖는 사출성형된 블랭크를 기계가공함으로써 CNC-기계가공된 유체 플레이트를 제작하였다. 플레이트의 상부면 및 하부면 둘 모두는 패턴화된 얇은 플라스틱 필름으로 덮여진다. 도 36은 상부 패턴화된 얇은 필름(2)를 도시하고, 도 37은 하부 패턴화된 얇은 필름(3)을 도시하며; 상기 얇은 필름은 100 마이크론의 두께를 갖는다. 유체 플레이트의 상부 및 하부 둘 모두 상에 존재하는 특징부를 갖는 것의 장점은, 어셈블리를 위해 단지 하나의 유체 플레이트가 필요하다는 점이다(2개의 플레이트는 달리 필요할 수 있다). 일반적으로, 어셈블리에서 플레이트의 수를 최소화시키는 것은 부품의 배열을 보다 간단하고 신뢰성 있게 만들고, 차별적 휨 및 수축의 효과를 최소화시킴으로써, 감소된 비용으로 더욱 효과적인 어셈블리를 가능케 하는 점이 주요 장점이다.
이러한 바이오칩 내의 채널은 하기를 특징으로 할 수 있다: 1) 샘플 처리 채널. 분석되는 각각의 협측 면봉은 DNA 정제, PCR 증폭, 분리 및 검출, 및 상기 핵산 조작을 수행하는데 필요한 모든 처리 단계를 수행하는 독특한 세트의 채널에 상응한다. 각각의 샘플에 대한 독특한 세트의 채널은 다른 샘플에 대한 채널의 세트와 소통하지 않는다. 즉, 채널은 샘플로부터 샘플로 소통하지 않고, 챔버(애노드 챔버는 아님), 필터 영역, 또는 다른 샘플과 관련된 막 영역을 공유하지 않음에 따라 각각의 샘플의 순도를 보존하고, 부주의한 샘플 혼합 또는 상호 오염을 피한다. 특정 공압 유도 라인은 다수의 샘플을 동시에 유도하기 위해 분할되나, 상기 유도는 공압식으로 달성되어, 각 샘플의 온전성이 보존된다. 더욱이, 각 샘플에 대한 독특한 세트의 채널은 폐쇄된 경로이며; 단지 공압 유도 라인으로부터의 공기가 바이오칩에 유입되고, 벤트 막을 통해 단지 공기가 바이오칩을 떠나고 - 액체 시약이 바이오칩에 의해 제공되고, 액체는 바이오칩을 떠나지 않는다. 도 38은 유체 플레이트를 통해 채취된 단일 샘플의 경로(4)를 도시한다. 도 39는 정제 영역(5)을 통한 상기 경로(4)의 확대도를 도시하고, 도 40은 증폭 영역(6)을 통해 포착된 상기 경로(4)의 확대도를 도시하고, 도 41은 분리 및 검출 영역(7)을 통해 포착된 상기 경로(4)의 확대도를 도시한다. 전기영동의 방향은 정제 및 증폭의 방향과 반대되는 것을 인지하는 것이 중요하다. 이러한 방향 변화는 샘플이 분리 및 검출 층 바로 아래로 통과하는 유체 층에서의 스루 홀에 의해 촉진된다. 2) 겔 처리 채널. 이러한 채널은 분리 및 검출을 위한 제조에서 분리 및 검출 서브어셈블리를 체(sieving) 매트릭스 및 완충액으로 충전시키는데 이용된다. 즉, 상기 채널은 통상적인 시약 저장소로부터 충전된다. 정제, 증폭, 및 예비-전기영동이 완료된 후, 각각의 분리 채널은 샘플-특이적 캐쏘드를 통해 독특한 샘플을 수용한다. 각각의 샘플은 독특한 캐쏘드 챔버 및 분리 채널을 갖고, 모든 샘플은 단일 애노드 챔버를 공유하며, 이를 통해 전기영동 시약이 로딩된다.
유체 플레이트는 특정 필터 영역, 정제 막 영역, 및 계량 챔버, 재구성 챔버, 혼합 챔버, 결합 챔버, 소모 챔버, 및 캐쏘드 및 애노드 챔버를 포함하는 여러 유형의 챔버를 함유한다. 이러한 챔버 및 영역은 상기 채널과 인 라인(in line)으로 존재하고, 필요한 기능에 의해 결정되는 형태 및 치수를 갖는다. 예를 들어, 시약 계량 챔버(도 40, 8)는 캐쏘드 챔버(도 41, 9) 또는 재구성 챔버(도 40, 10)과 상이한 치수 및 부피를 특징으로 한다.
채널, 챔버, 및 필터 및 막 영역은 이러한 경우 얇은 열가소성 필름을 결합시킴으로써 덮여진다(CNC-기계가공되거나 사출성형된 플레이트가 또한 덮개를 형성할 수 있다). 얇은 필름-유체 층-얇은 필름의 샌드위치가 "유체 서브어셈블리"로 언급된다.
필름 자체는 CNC 기계가공에 의해 패턴화되었으며, 본 발명의 얇은 필름은 또한 다이 절단 또는 천공 및 레이저 절단을 포함하는 다수의 처리에 의해 패턴화될 수 있다. 이러한 얇은 필름은 유체 층의 특징부에 대한 접근을 제공하는 CNC 기계가공된 유체 층 상의 해당 특징부에 배열되는 스루 홀을 포함하는 특징부를 갖는다. 예를 들어, 샘플은 하부 패턴화된 얇은 필름 내의 스루 홀을 통해 유체 층으로부터 분리 및 검출 서브어셈블리로 통과한다. 플레이트에 대한 상부 및 하부의 얇은 필름의 결합 전, 미립자 여과(도 39, 11), DNA 정제(도 39, 12), 및 벤팅(도 41, 13)을 포함하는 기능을 위한 추가 구성요소가 또한 통합된다. 유체 플레이트에 대한 패턴화된 얇은 필름의 결합을 열적으로 달성하였으나, 이는 또한 초음파, 용매, 및 접착제를 이용하여 수행될 수 있다. 플레이트 및 필름 상의 특징부는 결합 방법을 촉진하기 위해 첨가될 수 있고; 예를 들어, 에너지 디렉터 리지(director ridge)가 초음파 용접 부위 상에 배치될 수 있다.
공압 서브어셈블리 - 이러한 서브어셈블리는 바이오칩 내의 유체를 공압적으로 유도하고 밸브를 작동시키기 위해 기계의 공압 유도(실시예 3에 기재된 바와 같음)를 유체 서브어셈블리, 대량유체 처리 서브어셈블리, 밸브 서브어셈블리, 및 분리 및 검출 서브어셈블리에 커플링시킨다. 이러한 서브어셈블리는 COP 시트의 두면 각각에 서로 연결된 일련의 공압 유도 라인을 CNC 기계가공시킴으로써 제작된다. 유도 라인 중 일부는 샘플-특이적이고, 다른 유도 라인은 비-샘플 특이적 기능, 예를 들어, 겔 충전과 관련된다. 도 42는 공압 플레이트(14)의 상부면을 도시하며, 도 43은 공압 플레이트(14)의 하부면을 도시하며, 도 44는 공압 플레이트(14)의 투시도를 도시하며, 이는 양면으로부터의 특징부를 나타낸다. 공압 플레이트는 276.7 mm x 117.3 mm x 2.50 mm의 치수를 갖는다. CNC-기계가공된 공압 플레이트를 2.5 mm의 두께를 갖는 사출성형된 블랭크를 기계가공함으로써 제작하였다. 공압 플레이트의 상부면은 패턴화된 얇은 플라스틱 필름(15)으로 덮여진다(도 45). 공압 플레이트의 하부면은 온전한 얇은 필름(16)으로 덮여지고, 이러한 필름의 특정 영역은 결합 후에 절단(도 46)되어, 밸브 서브어셈블리로부터 플레이트로의 접근을 가능케 한다. 패턴화된 얇은 필름 및 패턴화되지 않은 얇은 필름 둘 모두는 100 마이크론의 두께를 갖는다. 패턴은 결합 전(상부 공압 필름의 경우) 또는 결합 후(하부 공압 필름을 갖는 경우)에 절단될 수 있다. 결합후 패턴화 단계를 선택하였는데, 이는 큰 컷-아웃 영역이 결합 후에 용이하게 제거되기 때문이다. 공압 플레이트에 대한 얇은 필름의 결합을 열적으로 달성하였으나, 이는 또한 초음파, 용매, 및 접착제를 이용하여 수행될 수 있다. 상기 결합 방법을 촉진하기 위해 플레이트 및 필름 상에 특징부가 첨가될 수 있고; 예를 들어, 에너지 디렉터 리지가 초음파 용접의 부위에 배치될 수 있다. 최종적으로, 공압 플레이트는 또한 유체 특징부를 가질 수 있고, 그 반대일 수 있다. 이는, 예를 들어, 유체 플레이트가 특징부로 포화되고, 공압 플레이트가 이용가능한 공간을 갖는 경우에 유용할 수 있다. 이러한 경우의 공압 플레이트는 여전히 공압 플레이트로 언급될 것인데, 이는 전체적인 바이오칩에서의 이의 위치 및 이의 특징부 대부분이 공압이라는 사실 때문이다. 이의 위치에도 불구하고, 공압 라인 및 채널은 공기만을 함유한다. 대조적으로, 유체 특징부는 액체 및 공기를 함유할 수 있다.
얇은 플라스틱 필름에서의 특징부는 공압 층에 대한 직접적 접근 또는 공압 층을 통한 유체 층에 대한 간접적 접근을 제공하는 CNC 기계가공된 공압 층상의 해당 특징부에 배열되는 스루 홀을 포함한다. 예를 들어, 대량유체 처리 서브어셈블리의 챔버 내의 시약은 유체 서브어셈블리로 가는 도중에 공압 서브어셈블리(얇은 필름 및 공압 플레이트)의 스루 홀을 통과한다. 공압 플레이트에 대한 패턴화된 얇은 필름의 결합을 열적으로 달성하였으나, 이는 또한 초음파, 용매, 클램핑, 및 접착제를 이용하여 수행될 수 있다.
밸브 서브어셈블리 - 이러한 서브어셈블리는 공압 서브어셈블리와 유체 서브어셈블리 사이에 위치된다. 이는 공압 작동되는 경우 변형됨으로써 유체 층 내에서 유체(공기를 포함함)의 유동을 정지시키는 엘라스토머 물질로 구성된다. 이러한 서브어셈블리는 편향될 수 있는 엘라스토머 필름으로 구성되나, 실시예 2에 기재된 밸브 어셈블리 중 임의의 밸브 어셈블리가 통합될 수 있다.
공압-밸브-유체 스택 - 이러한 서브어셈블리는 공압 서브어셈블리, 밸브 서브어셈블리, 및 유체 서브어셈블리를 어셈블리시키고, 이러한 스택을 함께 열 결합시킴으로써 제작된다. 벤트 막(도 44, 17)은 이들을 유체 서브어셈블리(도 35, 13)의 벤팅 특징부 및 공압 서브어셈블리 내의 상응하는 특징부 상에 배치함으로써 상기 서브어셈블리로 통합된다. 벤트 막은 다수의 샘플의 벤팅 특징부를 동시에 덮는데 사용되는 단일 스트립의 형태이다. 하나의 벤트 막 스트립이 많은 벤팅 영역을 덮기 위해 적용된다. 일반적으로, 부품 수의 감소는 수작업이거나 자동화된 작업이건 간에 어셈블리의 용이성을 가능케 한다. 2개의 서브어셈블리의 결합은 또한 열, 초음파, 용매, 클램핑, 및 접착제를 이용하여 수행될 수 있다. 플레이트 및 필름 상의 특징부는 결합 방법을 촉진하기 위해 첨가될 수 있고; 예를 들어, 에너지 디렉터 리지가 초음파 용접 부위에 배치될 수 있거나, 열 결합을 촉진하기 위해 추가 결합 층이 이용될 수 있다.
대량유체 처리 서브어셈블리 - 이러한 서브어셈블리는 2개의 주요 구성요소 대량유체 블록 및 덮개로 구성된다. 이러한 서브어셈블리는 참조로서 본원에 포함되는 "핵산 정제(Nucleic Acid Purification)"를 제목으로 하는 출원 일련 번호 12/699,564호에 추가로 기재되는 바와 같이 샘플을 수용하고, 바이오칩에 시약을 제공하고, 미세유체 및 대량유체 부피와 처리 사이의 인터페이스로 작용한다. 도 47은 면봉(19)을 갖는 대량유체 블록(18), 용해 용액(20), 에탄올(21), 세척 용액(22), 및 용리 용액(23) 시약 챔버, 및 용해질 홀딩을 위한 유체 처리 챔버(24), 용리액 균질화(25), 공기(58), TTE(59), 및 포름아미드(60) 챔버를 도시한다. 블록의 치수는 102.8 mm x 50.5 mm x 74.7 mm이다. 대량유체 블록은 0.15-3.0 ml의 부피를 이용하고, 공압 서브어셈블리 및 덮개와 인터페이싱한다. 블록의 면은 공압 유도 라인(26)을 함유하며; 이들은 공압 서브어셈블리의 공압 인터페이스에서 발생하여 이를 통해 블록으로 통과한다. 블록으로부터, 유도 라인은 덮개로 통과한다. 실시예 5에 기재된 구체예를 포함하는 일부 구체예는 대량처리 서브어셈블리를 포함하나, 본원에 기재된 기술에 따른 모든 바이오칩이 대량처리 서브어셈블리를 포함하지는 않는다. 예를 들어, DNA 또는 정제된 세포의 샘플은 밸브 어셈블리에 의해 연결된 공압 서브어셈블리 및 유체 서브어셈블리를 포함하는 바이오칩에 주입될 수 있다.
도 48 내지 54는 덮개를 도시한다. 덮개는 3개의 층으로 구성된다. 도 48은 덮개 층 1(27)의 상부를 도시하고, 도 49는 덮개 층 1(27)의 하부를 도시하고, 도 50은 덮개 층 1(27)의 투시도를 도시한다. 도 51은 덮개 층 2(28)를 도시한다. 도 52는 덮개 층 3(29)의 상부를 도시하고, 도 53은 덮개 층 3(29)의 하부를 도시하고, 도 54는 덮개 층 3(29)의 투시도를 도시한다. 어셈블리된 덮개의 치수는 50.8 mm x 118.4 x 4.5 mm이다. 덮개는 시약 이동, 기포 형성, 및 유체 처리를 촉진시키기 위해 블록의 면으로부터 대량유체 챔버의 상부로의 공압 유도 라인을 발생시키는 기능을 한다. 덮개는 또한 면봉 챔버(30) 및 용리액 홀딩 챔버(31)와 관련된 벤팅 특징부를 갖는다. 벤트 막은 챔버를 분리시켜, 이들은 공기가 압력 표준화에 대해 벗어나는 것을 가능케 하면서 유체가 벗어나는 것을 가능케 하지 않는다. 덮개는 또한 면봉을 적소에 유지시키는 작용을 한다. 임의로, 샘플을 적소에 유지시키기 위해 면봉 캡 또는 덮개는 로킹(locking) 메커니즘을 통합시킬 수 있다.
대량유체 블록 및 덮개 구성요소를 열가소성 물질을 CNC 기계가공시켜 제작하였다. 대안적으로, 이러한 부품은 사출성형 및 압축 사출성형 및 압출에 의해 제작될 수 있다. 대량유체 처리 블록을 성형시키기 위해, 종횡비는 2를 초과하며, 1℃ 미만의 구배각이 설계에 통합된다. 대량유체 블록을 개스킷 및 스크류를 이용한 클램핑에 의해 덮개에 부착시켰다. 블록은 이중면의 PSA를 이용하여 공압 서브어셈블리에 부착된다. 대안적으로, 블록 부착은 용매 및 열 결합에 의해 이루어질 수 있다.
대량유체 처리에 대한 추가 방법이 참조로서 본원에 포함되는, "핵산 정제(Nucleic Acid Purification)"를 제목으로 하는 계류 중인 출원 일련 번호 12/699,564호에 기재되어 있다. 대량유체 처리 어셈블리는 바이오칩의 적용을 위해 충분한 유연성을 제공한다. 액체 시약 및 이의 부피는 수행되는 샘플 조작 유형을 기초로 하여 용이하게 변형될 수 있다. 면봉 챔버는 다양한 유형의 면봉, 혈액 샘플, 및 환경 샘플을 포함하는 매우 다양한 샘플을 수용하기 위해 변형될 수 있다. 특정 환경에서, 이러한 변화는 공압-밸브-유체 스택에 대한 최소의 변화로 이루어질 수 있고; 예를 들어, 스택에서 동결건조된 케이크를 단순히 변화시키는 것은 완전히 다양한 증폭 검정이 다양한 샘플 유형에 대해 수행되는 것을 가능케 한다.
분리 및 검출 서브어셈블리 - 이러한 서브어셈블리는 핵산의 분리 및 검출에 사용되며, 이는 각각이 주입 및 분리 부분을 갖는 16개의 미세채널(microchannel)로 구성된다. 플라스틱 바이오칩에서의 분리 및 검출의 상세한 기재는 참조로서 본원에 포함되는, "플라스틱 미세유체 분리 및 검출 플랫폼(Plastic Microfluidic Separation and Detection Platforms)"을 제목으로 하는 2009/0020427로 공개된 출원 일련 번호 12/080,745호에서 발견된다. 샘플 주입을 위한 두 방법인 압력 로딩(pressure loading) 및 교차 주입(cross injection)이 이용된다. 도 55는 압력 주입을 위한 분리 및 검출 바이오칩(32)을 도시한다. 이는 동전기 주입용 분리 컬럼의 시작을 위해 분리 및 검출을 위한 샘플을 공압 유도시킴으로써 작용한다. 분리 채널의 횡단면 치수(90 마이크론 너비 및 40 마이크론 깊이) 및 애노드와 캐쏘드 사이의 채널의 길이(24 cm)는 모든 채널에 대해 동등하였다. 이러한 서브어셈블리를 얇은 열가소성 시트로의 엠보싱에 의해 제작하였다. 대안적으로, 서브어셈블리는 압출 또는 사출성형에 의해 제조될 수 있다. 미세유체 서브어셈블리로부터 채널로의 접근을 제공하기 위해 엠보싱된 시트 내에서 스루 홀을 제작하였다. 채널을 이들 상에 얇은 열가소성 시트를 결합시킴으로써 덮었다.
도 56은 동전기 주입용 분리 컬럼(33)의 시작을 위한 분리 및 검출용 샘플의 동전기 수송을 위한 교차 주입용 분리 및 검출 바이오칩을 도시한다. 바이오칩의 치수는 77.7 mm x 276 mm x 376 마이크론이다. 분리 채널의 횡단면 치수(90 마이크론 폭 및 40 마이크론 깊이) 및 애노드와 교차-주입기 사이의 채널의 길이(25 cm)는 모든 채널에 대해 동일하였다. 16개의 채널 중 6개가 상기 서브어셈블리에서 작동하였다. 채널 각각에 대한 분리 길이(교차점(intersection)과 여기/검출 윈도우 사이의 거리)는 16 내지 20 cm 길이 범위이다. 캐쏘드 웰과 주입기 사이의 채널의 횡단면적을, 모든 전기 저항, 이에 따라 캐쏘드 및 교차점 사이의 전기장이 편향 하에서 본질적으로 동일하도록 조정하였다. 이는 샘플이 겪는 전기장이 샘플이 로딩된 분리 채널과 상관 없이 동일한 것을 보장하였다. 모든 채널에 대한 교차점 전압은 본질적으로 동일하였다. 샘플 입구 및 샘플 주입을 위한 샘플 소모 아암은 둘 모두가 2.5 mm 길이였다. 둘 모두의 채널 사이의 오프셋(offset)은 500 마이크론이었다. 이러한 서브어셈블리를 얇은 열가소성 시트로의 엠보싱에 의해 제작하였다. 대안적으로, 서브어셈블리는 압출 또는 사출성형에 의해 제작될 수 있다. 미세유체 서브어셈블리로부터 채널로의 접근을 제공하기 위해 엠보싱된 시트 내에서 스루 홀을 제작하였다. 또 다른 얇은 열가소성 시트를 용매 결합시켜 채널을 덮었다. 대안적으로, 시트는 열 결합 또는 열-보조 용매 결합에 의해 부착될 수 있다.
분리 및 검출 서브어셈블리(압력 로딩 형태이거나 교차 주입 형태이건 간에)를 접착제 테이프를 이용하여 유체 서브어셈블리에 부착시키고, 분리 및 검출 바이오칩 내에서의 핵산 유동이 NA 정제 및 증폭과 반대 방향으로 수행되도록 서브어셈블리를 배향시켰다. 즉, 핵산은 정제 및 PCR 증폭 동안 유체의 일반적인 유동으로부터 역방향으로 분리 및 검출 서브어셈블리를 통해 이동하였다. 이러한 서브어셈블리의 반대측을 이용한 방향의 역전은 복합한 바이오칩이 실질적으로 감소된 길이를 갖도록 한다. 도 57은 모든 층 - 대량유체 덮개(27, 28, 및 29); 대량유체 블록(18), 상부 및 하부 필름을 갖는 공압 층(13, 15 및 16); 밸브 서브어셈블리 층; 상부 및 하부 필름을 갖는 유체 층(1, 2, 및 3); 및 분리 및 검출 바이오칩(32 또는 33)이 함께 스택킹(stacking)되어 바이오칩을 형성하는 방법을 예시한다. 도 58은 바이오칩 어셈블리(34)의 사진이고, 여기서 화살표는 처리 흐름의 방향을 나타낸다.
도 39 및 41을 참조로 하여, 바이오칩을 작업하기 위해, 시험 전에 하기 시약을 대량유체 처리 서브어셈블리에 로딩하였다:
·용해 용액(도 39, 20), 550 마이크로리터 - 세포를 용해시키고, 샘플로부터 DNA를 방출시키기 위한 무질서유발제 염(Chaotropic salt) 기반 시약.
·에탄올(도 39, 21), 550 마이크로리터 - 용해 용액과 함께 세포를 용해시키고, 실리카 기반 정제 필터에 대한 DNA 결합을 촉진한다.
·세척 용액(도 39, 22), 3 ml - 순수한 DNA를 생성시키기 위해 단백질 및 다른 생물학적 물질을 제거하기 위한 정제 필터를 세척하기 위한 에탄올 기반 시약.
·용리 용액(도 39, 23), 300 마이크로리터 - 정제 필터로부터 정제된 DNA를 방출하고, DNA를 안정화시키는 Tris-EDTA 기반 시약.
·TTE 완충액(도 41, 58), 1.6 ml - 전기영동을 위한 Tris-Taps-EDTA 기반 시약.
·포름아미드(도 41, 59) 150 마이크로리터 - 분리 및 검출을 위한 샘플을 제조하기 위해 PCR 생성물을 희석시키기 위한 변성 용액. 샘플 및 포름아미드를 약 1:4(1:50 내지 1 대 1.5의 범위)의 비로 혼합함으로써, 변성을 실행하기 위해 가열 또는 급속 냉각을 수행할 필요가 없다. 통상적인 열/냉각 단계의 회피는 기계를 간소화시킨다.
도 40 및 41을 참조로 하여, 시험 전에 하기 동결건조된 시약을 바이오칩의 유체 서브어셈블리에 로딩하였다:
·PCR 케이크, 도 40, 10, - 동결건조된 PCR 반응 믹스.
·내부 레인(사이징(sizing)) 표준(ILS) 케이크, 도 41, 35 - 분자량과 관련된 증폭된 단편의 전기영동 이동을 가능케 하기 위해 형광 표지되는 동결건조된 DNA 단편.
이러한 방법의 장점은 모든 동결건조된 시약이 하나의 서브어셈블리 내에 위치되는 것이다. 이는 동결건조된 케이크(저습 및 정지 상태)를 충전시키기 위한 조건이 액체를 충전시키기 위한 조건과 매우 상이하고, 상기 액체를 충전시키기 위한 조건보다 요구하는게 많음에 따라 개선된 공급 연쇄 관리를 가능케 한다. 따라서, 액체 및 동결건조된 시약은 별개로 및 동시에 충전될 수 있다. 임의로, 대립유전자 래더(ladder) 및 ILS 단편을 함유하는 동결건조된 케이크가 STR 분석 작업을 위해 상부 케이크 챔버(35)에 삽입될 수 있다.
하기 시약을 시험 전에 바이오칩의 분리 및 검출 섹션에 로딩시켰다:
·체 매트릭스(도 55, 36 및 도 56, 36) - DNA의 전기영동 체질(sieving)을 위한 고분자량 선형 폴리아크릴아미드 용액.
바이오칩을 2009/0229983로 공개된, 핵산 및 단백질의 분석을 위한 러기드화된 장치(Ruggedized Apparatus for Analysis of Nucleic Acid and Proteins)를 제목으로 하는 미국 특허 출원 일련 번호 12/396,110호(예를 들어, 단락 65-76 참조); 2009/0023602로 공개된, 표적 핵산의 신속한 다중 증폭을 위한 방법(Methods for Rapid Multiplexed Amplification of Target Nucleic Acids)을 제목으로 하는 미국 특허 출원 일련 번호 12/080,746호(예를 들어, 단락 54 및 56-67 참조); 2009/0059222로 공개된, 통합된 핵산 분석(Integrated Nucleic Acid Analysis)을 제목으로 하는 미국 특허 출원 일련 번호 12/080,751호(예를 들어, 단락 139-144 참조); 2009/0020427로 공개된, 플라스틱 미세유체 분리 및 검출 플랫폼(Plastic Microfluidic Separation and Detection Platforms)을 제목으로 하는 미국 특허 출원 일련 번호 12/080,745호(예를 들어, 단락 95 참조)에 기재된 바와 같은 하기 서브시스템(도 59)을 함유하는 단일한 완전히 통합된 기계에 삽입하였으며, 상기 특허 출원 모두는 전체내용이 참조로서 본원에 포함된다. 이러한 서브시스템은 하기를 포함한다:
공압 서브시스템 - 공압 및 진공 펌프는 탱크 및 솔레노이드 밸브의 세트를 통해 공압 다기관(실시예 4에 기재된 바와 같은 도 44, 61)에 연결된다. 이러한 다기관은 차례로 공압 인터페이스를 통해 바이오칩의 공압 포트에 연결된다. 솔레노이드 밸브는 처리 제어기에 의해 제어된다.
열 서브시스템 - 펠티에(peltier) 기반 열 사이클링 시스템은 상기 채널 내에서 반응을 신속하게 주기화시키기 위해 바이오칩의 열 사이클링 챔버(도 35, 62)에 커플링된다. 실시예 4에 기재된 바와 같이, 클램프는 증폭 영역에 압력을 적용시켜 열 순환기를 이용한 효과적인 열 전달을 가능케 한다. 반응 온도 및 드웰 시간(dwell time)은 처리 제어기에 의해 제어된다.
고전압 서브시스템 - 고전압 전원 공급장치가 분리 바이오칩의 애노드(도 55, 63) 및 캐쏘드(도 55, 64) 부분에 커플링된다. 애노드 전극이 애노드 부분(도 44, 65 및 도 35, 65)에서 공압 및 유체 플레이트를 통해 통과하고, 캐쏘드 전극이 유체 플레이트 및 공압 플레이트(도 44, 66 및 도 35, 66) 내의 캐쏘드 부분으로 통합되어 분리 및 검출 바이오칩으로의 접근을 획득함을 인지하라. 고전압의 적용은 채널을 따라 전기장을 발생시켜, 예비-전기영동, 샘플 주입, 및 분리 및 검출이 실행된다. 고전압 서브시스템은 처리 제어기에 의해 제어된다.
광학 서브시스템 - 광학 시스템은 바이오칩 내의 분리 및 검출 바이오칩의 여기 및 검출 윈도우(도 55, 67 및 56, 67)에 커플링된다. 광이 공압 및 유체 플레이트 상의 개방 윈도우를 통해 통과함을 인지하라(도 44, 38 및 도 35, 37 참조). 광학 시스템은 분리 채널 내의 표지된 DNA 단편으로부터 형광을 유도하는데 사용되는 레이저로 구성된다. 형광의 파장 구성요소를 분리시키기 위해 이색성 거울(dichroic mirror)의 세트가 사용된다. 형광 신호를 검출하기 위해 광전자증배기(photomultiplier) 튜브 세트가 사용된다. 레이저와 분리 및 검출 바이오칩 사이, 및 분리 및 검출 바이오칩과 검출기 사이에서 광(레이저 여기 및 방출된 형광)을 전달하는데 광학 구성요소 세트가 사용된다. 광학 서브시스템이 처리 제어기에 의해 제어된다.
처리 제어기 - 미리-규정된 처리 스크립트를 수용할 수 있고, 스크립트를 판독하고 이에 따라 서브시스템을 제어함으로써 자동적으로 스크립트를 이행할 수 있는 컴퓨터 기반 제어기. 컴퓨터는 또한 필요시 데이터 처리 및 데이터 분석을 수행함을 인지하라.
샘플 투입 및 결과 발생(sample-in to results out) 처리를 하기와 같이 수행하였다. 공여자로부터 5개의 면봉을 수집하였다. 보드 세커-스왑(Bode Secur-swab) 면봉의 머리 부분을 제조업체의 지시에 따라 뺨 안쪽에 누름으로써 면봉을 수집하였다. 5개의 면봉 각각을 바이오칩의 면봉 챔버 중 하나에 삽입하고, 바이오칩을 기계에 배치하고, 자동화된 처리 스크립트를 개시시켜 면봉 투입 및 결과 발생(swab-in to results-out) 분석을 수행하였다. 하기 단계로 자동화된 스크립트를 실행하였다:
·초기화. 밸브 라인에 압력을 적용시켜 바이오칩 상의 모든 밸브를 폐쇄시켰다. 실시예 5의 밸브를 20 psig의 압력으로 작동시켜 폐쇄시키고, 개방을 위해 대기에 대해 벤팅시켰다. 밸브 V3(도 39, 41)는 예외이며, 이는 -11 psig의 진공의 적용에 의해 개방 위치로 유지되었다. 간결함을 위해, (밸브가 실제 밸브 어셈블리 내에 위치되는 경우에도) 밸브 수는 공압 플레이트와 관련한 이의 위치를 기초로 하여 언급된다.
·용해. 550 마이크로리터의 용해 용액을, 밸브 V1(도 39, 39)를 개방시키고, 30초 동안 3 psig, 이후 60초 동안 5.5 psig의 압력을 유도 라인 DL1 (도 39, 68)에 적용시킴으로써 용해 시약 챔버(도 39, 20)로부터 면봉 챔버(도 39, 19)로 공압 로딩시켰다. 밸브 V1(도 39, 39)을 폐쇄시키고, 유도 라인 1(도 39, 68)을 불활성화시켰다. 에탄올 시약 챔버(도 39, 21)로부터의 550 마이크로리터의 에탄올을, 밸브 V2(도 39, 40)를 개방시키고, 30초 동안 5.5 psig의 유도 압력을 유도 라인 2(도 39, 69)에 적용시킴으로써 면봉 챔버(도 39, 19)에 공압 로딩시켰다.
·무질서 기포형성. 밸브 V2(도 39, 40)를 개방시키고, 30초 동안 5.5 psig의 공압 압력을 유도 라인 2(도 39, 69)에 적용시킴으로써 공기를 면봉 챔버(도 39, 19)로 공압 유도시켰다. 밸브 2(도 39, 40)를 폐쇄시키고, 유도 라인 2(도 39, 69)을 불활성화시켰다. 면봉 챔버로 유도된 공기는 용해 용액 전체에 걸쳐 무질서적으로 기포 형성시켰고, 이는 용해 시약 및 면봉 헤드 둘 모두를 교반시켰다. 이는 세포를 용해시켰고, DNA를 방출시켰다.
·일렬화. 용해질을 이동시키기 위해 30초 동안 -7 psig의 진공을 유도 라인 3(도 39, 70)에 적용시키면서 밸브 V3(도 39, 41)를 개방 위치로 유지시킴으로써 용해질을 미립자 필터(도 39, 11)를 통해 면봉 챔버(도 39, 19)로부터 홀딩 챔버(도 39, 24)로 끌어당겼다. 밸브 3(도 39, 41)를 폐쇄시키고, 유도 라인 3(도 39, 70)를 불활성화시켰다.
·DNA 결합. 밸브 V4(도 39, 42) 및 밸브 V5의 세트(도 39, 43)를 개방시키고, 60초 동안 5 psig의 압력을 유도 라인 DL3(도 39, 70)에 적용시킴으로써 홀딩 챔버(도 39, 24)로부터의 용해질을 정제 필터(도 39, 12)를 통해 면봉 챔버(도 39, 19)로 공압 유도시켰다. 밸브 V4(도 39, 42) 및 V5(도 39, 43)를 폐쇄시키고, DL3(도 39, 70)를 불활성화시켰다. 용해질 내의 DNA는 정제 필터(도 39, 12)에 결합하였다. 면봉 챔버가 또한 용해질의 생성 및 처리 후에 소모 챔버로 작용하고; 이러한 이중 용도가 대량유체 블록에 대한 또 다른 큰 부피의 챔버의 필요성을 배제시키는 것을 인지하라. 용해질의 보존이 요망되는 경우 각각의 샘플로부터의 독립된 소모 챔버가 임의로 포함될 수 있다.
·세척. 밸브 V5(도 39, 43) 및 V6(도 39, 46)을 개방시키고, 90초 동안 13 psig의 공압을 유도 라인 DL4(도 39, 71)에 적용시킴으로써 세척 용액을 정제 필터(도 39, 12)를 통해 세척 시약 챔버(도 39, 22)로부터 면봉 챔버(도 39, 19)로 공압 유도시켰다. 밸브 V5(도 39, 43) 및 V6(도 39, 46)를 폐쇄시키고, DL4(도 39, 71)를 불활성화시켰다. 3 ml의 세척액을 정제 필터를 통해 통과시켜 결합된 DNA로부터의 오염물질 및 미립자 부스러기를 제거하였다. 2회의 추가 세척으로 인접한 채널을 세정하였다.
·건조. 밸브 V5(도 39, 43) 및 V6(도 39, 46)를 개방시키고, 185초 동안 13 psig의 압력을 유도 라인 DL4(도 39, 46)에 적용시킴으로써 공기를 정제 필터(도 39, 12)를 통해 면봉 챔버(도 39, 19)로 공압 유도시켰다. 밸브 V5 및 V6를 폐쇄시키고, DL4(도 39, 71)를 불활성화시켰다. 공기로 정제 필터를 부분적 내지 완전히 건조시켰다.
·용리. 밸브 V6(도 39, 46), V7(도 39, 45) 및 V8(도 39, 47)을 개방시키고, 120초 동안 5 psig의 압력을 유도 라인 DL5(도 39, 72)에 적용시킴으로써 용리 완충액이 정제 필터(도 39, 12)를 통해 용리 시약 챔버(도 39, 23)로부터 용리액 홀딩 챔버(도 39, 25)로 공압 유도시켰다. 밸브 V6(도 39, 46), V7(도 39, 45) 및 V8(도 39, 47)을 폐쇄시키고, DL5(도 39, 72)를 불활성화시켰다. 300 마이크로리터의 용리 완충액을 정제 필터(도 39, 12)를 통해 통과시켜 정제 필터에 결합된 정제된 DNA를 방출시켰다.
·균질화. 밸브 V6(도 39, 46), 및 V8(도 39, 47)을 개방시키고, 60초 동안 5 psig의 압력을 유도 라인 DL4(도 39, 71)에 적용시킴으로써 공기를 용리액 홀딩 챔버로 공압 유도시켰다. 밸브 V6(도 39, 46), 및 V8(도 39, 47)을 폐쇄시키고, DL4(도 39, 71)를 불활성화시켰다. 공기를 용리액을 통해 용리액 홀딩 챔버 기포로 유도시켜 용리액 내의 DNA를 교반시키고 균질화시켰다. 임의로, 정제된 DNA의 보존 샘플이 요망되는 경우 용리액의 일부가 저장 챔버 또는 저장 필터에 루팅될 수 있다.
·용리액 계량. 밸브 V10(도 39, 48)을 개방시키고, 40초 동안 1 psig의 압력을 DL6(도 39, 73)에 적용시킴으로써 용리액을 용리액 홀딩 챔버(도 39, 25)로부터 용리액 계량 챔버(도 40, 8)로 공압 유도시켰다. 밸브 V10(도 39, 48)을 폐쇄시키고, DL6(도 39, 73)을 불활성화시켰다. 각각의 용리액을 계량 챔버에 충전시키고, 벤트 막에서 정지시켰다. 밸브 V10(도 39, 48) 및 V11(도 40, 50)을 개방시키고, 25초 동안 2 psig의 압력을 유도 라인 DL7(도 40, 49)에 적용시킴으로써 과량의 용리액을 용리액 홀딩 챔버로 다시 공압 유도시켰다. 밸브 V10(도 39, 48) 및 V11(도 40, 50)을 폐쇄시키고, DL7(도 40, 49)을 불활성화시켰다.
·PCR 케이크 재구성. 밸브 V11(도 40, 50) 및 V12(도 40, 51)를 개방시키고, 30초 동안 0.2 psig, 이후 30초 동안 0.4 psig, 이후 60초 동안 0.6 psig의 유도 순서를 유도 라인 DL7(도 41, 49)에 적용시킴으로써 용리액을 용리액 계량 챔버(도 40, 8)로부터 PCR 케이크 챔버(도 40, 10)로 공압 유도시켰다. 밸브 V11(도 40, 50) 및 V12(도 40, 51)를 폐쇄시키고, (도 41, 49)를 불활성화시켰다. 20.5 마이크로리터의 계량된 용리액을 이동시켜 동결건조된 PCR 반응 혼합물을 함유하는 케이크를 재구성시켜 증폭을 위한 PCR 혼합물을 생성시켰다.
·열 사이클링 챔버로의 이동. 밸브 V11(도 40, 50), V12(도 40, 51), V13(도 40, 52), 및 V14(도 40, 53)를 개방시키고, 30초 동안 0.2 psig, 이후 30초 동안 0.4 psig, 이후 30초 동안 0.6 psig의 연속적으로 증가하는 유도 압력 순서를 유도 라인 DL7(도 40, 49)에 적용시킴으로써 PCR 반응 혼합물을 케이크 챔버(도 40, 10)로부터 열 사이클링 챔버(도 40, 62)로 공압 유도시켰다. 밸브 V11(도 40, 50), V12(도 40, 51), V13(도 40, 52), 및 V14(도 40, 53)를 폐쇄시키고, DL7(도 40, 49)을 불활성화시켰다. PCR 반응 혼합물을 열 사이클링 챔버로 이동시키고, 일렬 벤트 막에서 정지시켰다.
·열 주기. 31회 주기의 프로토콜을 열 주기 챔버(도 40, 62) 내에서의 반응을 주기화시키는데 적용시켜 표지된 앰플리콘을 생성시켰다(모두 본원에 참조로서 포함되는, 문헌[Giese, H., et al. (2009). "Fast multiplexed polymerase chain reaction for conventional and microfluidic short tandem repeat analysis." J Forensic Sci 54(6): 1287-96], 및 "표적 핵산의 신속한 다중 증폭 방법(Methods for Rapid Multiplexed Amplification of Target Nucleic Acids)"을 제목으로 하는 2009/0023603으로 공개된 출원 일련 번호 12/080,746호 참조). 주기 조건은 다음과 같았다: 핫스타트(Hotstart) 93℃ x 20초 후, 31 주기의 (93℃ x 4초, 56℃ x 15초, 및 70℃ x 7초) 후, 70℃ x 90초의 최종 신장.
·PCR 생성물 계량. 밸브 V11(도 40, 50), V12(도 40, 51), V13(도 40, 52), V14(도 40, 53), 및 V30(도 41, 111)을 개방시키고, 30초 동안 0.2 psig, 이후 30초 동안 0.4 psig, 이후 45초 동안 0.6 psig의 연속적으로 증가하는 유도 압력 순서를 유도 라인 DL7(도 40, 49)에 적용시킴으로써 PCR 생성물을 열 사이클링 챔버(도 40, 62)로부터 PCR 계량 챔버(도 41, 74)로 공압 유도시켰다. 밸브 V11(도 40, 50), V12(도 40, 51), V13(도 40, 52), V14(도 40, 53) 및 V30(도 41, 111)을 폐쇄시키고, DL7(도 40, 49)을 불활성화시켰다. PCR 생성물을 계량 챔버로 유동시키고, 벤트 막에서 정지시켰다.
·포름아미드 계량. 50초 동안 1 psig의 압력을 유도 라인 DL8(도 41, 75)에 적용시킴으로써 포름아미드를 포름아미드 시약 챔버(도 41, 60)로부터 포름아미드 계량 챔버(도 41, 76)로 공압 유도시켰다. 유도 라인 DL8(도 41, 75)을 불활성화시켰다. 이러한 단계에서, 케이크를 재구성시켜 대조 샘플을 생성시키기 위해 포름아미드의 1/6 부피를 계량하였다(도 41, 77). 포름아미드는 계량 챔버로 유동하였고, 벤트 막에서 정지하였다. 밸브 V15(도 41, 54)를 개방시키고, 180초 동안 3 psig의 압력을 유도 라인 DL8(도 41, 75)에 적용시킴으로써 과량의 포름아미드를 포름아미드 챔버로부터 소모 챔버로 공압 유도시켰다. 밸브 V15(도 41, 54)를 폐쇄시키고, DL8(도 41, 75)을 불활성화시켰다. 과량의 포름아미드 시약 챔버 및 유도 라인 모두를 소모 챔버로 이동시켰다.
·PCR 생성물 및 포름아미드 결합. 밸브 V18(도 41, 57), V17(도 41, 80) 및 V20(도 41, 81)을 개방시키고, 각각 30, 30, 30, 및 30초 동안 0.2, 0.3, 0.4, 및 0.5 psig의 4단계 유도 프로파일을 유도 라인 DL9(도 41, 79)에 적용시킴으로써 계량된 PCR 생성물을 PCR 계량 챔버(도 41, 74)로부터 결합 챔버(도 41, 78)로 공압 유도시켰다. 밸브 V18(도 41, 57), V17(도 41, 80) 및 V20(도 41, 81)을 폐쇄시키고, DL9(도 41, 79)를 불활성화시켰다. 밸브 V16(도 41, 55) 및 V20(도 41, 81)을 개방시키고, 30, 30, 및 60초 동안 0.2, 0.4 및 0.6 psig의 증가하는 압력을 유도 라인 DL8(도 41, 75)에 적용시킴으로써 계량된 포름아미드를 포름아미드 계량 챔버(도 41, 76)로부터 결합 챔버(도 41, 78)로 공압 유도시켰다. 밸브 V16(도 41, 55) 및 V20(도 41, 81)을 폐쇄시키고, DL8(도 41, 75)을 불활성화시켰다. 결합 챔버는 2개의 독립적 유동으로부터 발생하는 계량된 PCR 및 계량된 포름아미드가 조합되어 분리 및 검출을 위한 샘플을 형성하는 것을 가능케 한다.
·ILS 케이크 재구성. 밸브 V16(도 41, 55) 및 V19(도 41, 56)를 개방시키고, 30, 30, 및 60초 동안 0.2, 0.4 및 0.6 psig의 증가하는 압력을 유도 라인 DL8(도 41, 75)에 적용시킴으로써, 분리 및 검출을 위한 샘플을 ILS 케이크 챔버(도 41, 35)에 공압 유도시켰다. V16(도 41, 55) 및 V19(도 41, 56)를 폐쇄시키고, DL8(도 41, 75)을 불활성화시켰다. 4.1 마이크로리터의 PCR 생성물 및 16.4 마이크로리터의 포름아미드로 구성된 분리 및 검출을 위한 샘플을 챔버 내에서 ILS 케이크와 재구성시켜 분리 및 검출 샘플을 생성시켰다.
·대조군+ILS 케이크 재구성. 밸브 V16 및 V20을 개방시키고, 30, 30, 및 60초 동안 0.2, 0.4 및 0.6 psig의 증가하는 압력을 유도 라인 DL9에 적용시킴으로써 1/6의 계량된 포름아미드 부피를 대조군+ILS 케이크 챔버로 공압 유도시켰다(도 41, 83). V16 및 V20을 폐쇄시키고, DL9를 불활성화시켰다. 20.5 마이크로리터의 포름아미드를 챔버 내에서 케이크와 재구성시켜 분리 및 검출 샘플을 생성시켰다.
·분리 채널로의 샘플 주입. 밸브 V21(도 41, 86) 및 V22(도 41, 87)를 개방시키고, 30, 30, 30, 30, 및 30초 동안 각각 0.4, 0.6, 1.0, 1.5 및 2.0 psig의 연속적으로 단계화된 프로파일로 유도 라인 DL8(도 41, 74)에 압력을 적용시킴으로써 6개의 분리 및 검출 샘플을 디버블링(debubbling) 챔버(도 41, 83)를 통해 케이크 챔버(도 41, 35 및 82)로부터 공압 유도시켜 캐쏘드 챔버(도 41, 84) 및 샘플 소모 챔버(도 41, 85)를 충전시켰다. (도 41, 86) 및 V22(도 41, 87)를 폐쇄시키고, DL8(도 41, 74)를 불활성화시켰다. 35초 동안 캐쏘드(도 55 및 56, 63) 및 애노드(도 55 및 56, 64)에 편향되도록 4400 V의 전압을 적용시킴으로써 샘플 내의 DNA를 캐쏘드 챔버(도 41, 84)로부터 바이오칩의 분리 부분(도 56 및 도 55, 88)로 주입시켰다.
· DNA 분리 및 검출. 밸브 V25(도 41, 91), V24(도 41, 90), V26(도 41, 95), V27(도 41, 96), 및 V28(도 41, 97)을 개방시키고, 240초 동안 2 psig의 압력을 유도 라인 DL10(도 41,98)에 적용시킴으로써 TTE를 TTE 시약 저장소(도 41, 59)로부터 공압 유도시켜 캐쏘드(도 41, 84)를 충전시키고, TTE 소모 챔버(도 41, 92, 93, 및 13)를 충전시켰다. 밸브 V25(도 41, 91), V24(도 41, 90), V26(도 41, 95), V27(도 41, 96), 및 V28(도 41, 97)을 폐쇄시키고, DL10(도 41,98)을 불활성화시켰다. 캐쏘드를 통한 TTE의 유동은 샘플을 캐쏘드 내에 배치시켰다. S&D 바이오칩의 분리 부분으로 주입된 DNA(도 55)는 30분 동안 캐쏘드(도 55 및 56, 63) 및 애노드(도 55 및 5.24, 64)를 편향시키기 위해 6400 V가 적용되는 경우 바이오칩의 분리 부분 아래로 이동하였다(도 56, 88). 광학 시스템을 또한 작동시켜 여기 및 검출 윈도우에서 레이저 유도 형광 여기 및 검출을 실행하였다. 레이저를 200 mW로 설정하고, 5 Hz의 데이터 수집 속도를 이행시켰다. 형광 신호는 검출 경로를 통해 광전자증배기 튜브로 이동하였다. 여기서, 형광은 시스템 소프트웨어에 의해 기록되는 신호로 전환된다.
상기 기재된 바와 같이 스크립트화 처리 단계에 따라 전기영동도(도 60 및 61)를 발생시켰다. 대조군 ILS 샘플(ROX로 형광 표지된 단편)에 대해 대조군 전기영동도(도 60)를 발생시켰다. x-축은 데이터 수집 계수를 나타내고, 각각의 계수는 표지된 단편이 검출 구역에 도달하는 시간을 나타낸다. 여러 크기 표준이 화살표에 의해 표시되며, 보다 낮은 분자량의 단편이 보다 높은 분자량의 단편보다 신속히 이동하고, 일찍 검출된다(즉, 그래프의 좌측). Y-축은 각각의 피크에 대한 상대 형광 단위(rfu)를 나타낸다. 도 61은 하나의 협측 면봉 샘플에 대해 생성된 STR 단편의 크기를 도시한다. PCR 반응 혼합물 및 ILS에서 STR 프라이머를 표지하는데 사용되는 형광 염료 각각은 개별적 패널로 제시된다. 플루오레세인-표지된 단편은 상부 패널에 제시되고, JOE-표지된 단편은 상부로부터 두번째 패널에 제시되고, TAMRA-표지된 단편은 상부로부터 세번째 패널에 제시되고, ROX-표지된 ILS 단편은 하부 패널에 제시된다. x-축 및 y-축은 도 60에 대해 기재된 것과 동일하다. 샘플의 삽입으로부터 전기영동도의 생성까지의 전체 처리는 약 90분 및 약 215개의 스크립트화 처리 단계를 필요로 하였다. 많은 처리 단계가 단축될 수 있고, 처리는 요망시 45분 미만으로 수행될 수 있다.
실시예 6. 핵산을 정제시키고, 정제된 DNA 를 증폭시키고, 증폭된 DNA 를 전기영동 분리시키고, 자동화된 스크립트를 이용하여 STR 프로파일을 발생시키는 완전히 통합된 바이오칩의 사출성형.
본 바이오칩은 사출성형에 의해 제작된 유체 및 공압 플레이트를 갖는 실시예 5의 바이오칩과 유사하다. 5개의 협측 면봉을 수용하고, STR 프로파일을 발생시키는 단일한 고정 플라스틱 바이오칩이 하기 부품으로 구성된다:
유체 서브어셈블리 - 이러한 서브어셈블리는 바이오칩 내에서 유체를 이동시키고 처리하며, 공압 서브어셈블리, 대량유체 처리 서브어셈블리, 밸브 서브어셈블리, 및 분리 및 검출 서브어셈블리와 상호작용한다. 이를 열가소성 시트의 상부면 및 하부면 둘 모두 상에 채널, 챔버, 및 막 및 필터 특징부의 상호연결된 세트를 갖는 COP의 사출성형에 의해 제작하였다. 도 62는 유체 플레이트(601)의 상부면을 도시하고, 도 63은 유체 플레이트(601)의 하부면을 도시하고, 도 64는 유체 플레이트(601)의 투시도를 도시하고, 이는 양면으로부터의 특징부를 나타낸다. 도 65는 사출성형된 유체 플레이트(601)의 사진을 도시한다. 사출성형된 유체 플레이트는 276 mm x 117 mm x 2.5 mm의 치수를 갖는다. 플레이트의 상부면 및 하부면 둘 모두는 패턴화된 얇은 플라스틱 필름으로 덮여진다. 도 66은 상부 패턴화된 얇은 필름(602)을 도시하고, 도 67은 하부 패턴화된 얇은 필름(603)을 도시한다.
사출성형된 유체 플레이트 내의 단일 샘플에 대한 유동 경로는 도 68에 제시된다. 샘플 유동 경로(4)는 정제 섹션(도 68, 5), PCR 섹션(도 68, 6) 및 분리 및 검출 섹션(도 68, 7)을 통해 통과한다. 정제 섹션, PCR 섹션 및 분리 및 검출 섹션의 확대도가 도 69, 70, 및 71에 각각 제시된다. 사출 성형된 유체 플레이트는 미립자 필터 영역(도 69, 11), 정제 막 영역(도 69, 12), 계량 챔버(도 69, 8), 재구성 챔버(도 69, 10), 결합 챔버(도 70, 78), 소모 챔버(도 70, 92, 93, 및 94), 및 캐쏘드(도 71, 84) 및 애노드(도 64, 65)를 포함하는 여러 유형의 챔버를 갖는다.
유체 플레이트의 상부면 및 하부면을 패턴화된 얇은 플라스틱 필름으로 덮고, 용매 결합에 의해 부착시켰다. 유체 플레이트에 대한 패턴화된 얇은 필름의 결합은 또한 초음파, 열, 및 접착제를 이용하여 수행될 수 있다. 플레이트 및 필름 상의 특징부가 결합 방법을 촉진하기 위해 첨가될 수 있고; 예를 들어, 에너지 디렉터 리지가 초음파 용접 부위에 배치될 수 있다. 얇은 필름은 100 마이크론의 두께를 가지며, CNC 기계가공에 의해 제작하였고; 임의로, 이들은 다이 절단, 또는 레이저 절단에 의해 제작될 수 있다. 얇은 플라스틱 필름 내의 특징부는 스루 홀을 포함하며, 유체 샌드위치 층에 대한 접근을 제공하기 위해 사출성형된 층 상에서 상응하는 특징부에 배열되었다. 정제 막(도 69, 12), 미립자 막(도 69, 11) 및 벤트 막을 얇은 필름의 결합 전에 열 용접에 의해 상기 어셈블리에 부착시켰다. 유사하게, 이러한 막 및 필터는 초음파 용접 및 열 스테이킹(staking)에 의해 부착될 수 있다.
공압 서브어셈블리 - 이러한 서브어셈블리는 유체 서브어셈블리 내의 유체를 공압 유도하고, 바이오칩 내의 밸브를 공압 작동시키기 위해 기계의 공압 유도를 유체 서브어셈블리(실시예 4에 기재된 바와 같음)에 커플링시킨다. 이러한 서브어셈블리를 열가소성 시트의 상부면 및 하부면 둘 모두 상의 채널, 챔버, 및 막 및 필터 특징부의 상호연결된 세트를 갖는 COP의 사출성형에 의해 제작하였다. 도 72는 공압 플레이트의 상부면을 도시하고, 도 73은 공압 플레이트의 하부면을 도시하고, 도 74는 공압 플레이트의 투시도를 도시하고, 이는 양면으로부터의 특징부를 나타낸다. 도 75는 사출성형된 공압 플레이트의 사진을 도시한다. 사출성형된 공압 플레이트는 277.6 mm x 117.7 mm x 2.50 mm의 치수를 갖는다. 결합 후, 모든 공압 서브어셈블리 특징부는 유체 서브어셈블리 특징부와 함께 배열된다. 플레이트의 상부면은 플레이트에 대한 접근을 가능케 하는 스루 홀을 갖는 패턴화된 얇은 플라스틱 필름으로 덮여진다. 도 76은 상부 패턴화된 얇은 필름을 도시한다. 플레이트의 하부면은, 밸브 서브어셈블리를 나타내는 패턴화된 얇은 필름이 용매 결합에 의해 부착되는 경우에 덮여지며; 얇은 필름은 CNC 기계가공에 의해 패턴화된다. 얇은 필름은 100 마이크론의 두께를 갖는다. 패턴은 결합 전 또는 결합 후에 절단될 수 있다. 공압 플레이트에 대한 상부 및 하부의 얇은 필름의 결합 전, 벤트 막이 통합된다(도 68, 17). 공압 플레이트에 대한 얇은 필름의 부착을 용매를 이용하여 달성하였으나, 이는 또한 초음파, 열, 및 접착제를 이용하여 수행될 수 있다.
대량유체 처리 서브어셈블리 및 분리 및 검출 서브어셈블리는 실시예 5에 기재된 것과 동일하다. 이러한 바이오칩에서, 밸브 어셈블리는 40 마이크론, 50 마이크론, 또는 100 마이크론 두께인 얇은 열가소성 필름이다. 공압 작동되는 단단한 밸브 층(실시예 2에 기재되어 있음)이 공압 및 유체 어셈블리를 분리시킨다. 공압 작동되는 경우, 이러한 층은 유체 층 내의 유체(공기를 포함함)의 유동을 제어하기 위해 편향된다.
유체 어셈블리에 공압 어셈블리를 용매 결합시켜 공압-밸브-유체 스택 서브어셈블리를 제작하였다. 공압 플레이트의 하부면 상의 챔버 및 채널은, 유체 층에 용매 결합되는 경우에 밀봉된다. 대량유체 블록을 개스킷 및 스크류를 이용하여 클램핑에 의해 덮개에 부착시켰다. 블록을 이중면의 PSA 테이프를 이용하여 공압 서브어셈블리에 부착시켰다. 대안적으로, 블록 부착은 용매 및 열 결합에 의해 제조될 수 있다. 최종적으로, 분리 및 검출 서브어셈블리를 PSA 테이프를 이용하여 유체 서브어셈블리에 부착시키고, 서브어셈블리를 분리 및 검출 바이오칩 내에서의 핵산 유동이 NA 정제 및 증폭과 반대 방향으로 수행되도록 배향시켰다.
바이오칩을 시험하기 위해, 액체 및 동결건조된 시약을 실시예 5에 기재된 바와 같이 로딩하고, 바이오칩을 실시예 5의 완전히 통합된 기계에 삽입하였다. 5개의 협측 면봉을 공여자로부터 수집하였고, 5개의 면봉 각각을 바이오칩의 면봉 챔버 중 하나에 삽입하였다. 하기 단계를 갖는 자동화된 스크립트가 실행되었다:
·초기화. 밸브 라인에 75 psig의 압력을 적용시켜 바이오칩 상의 모든 밸브를 폐쇄시켰다. 밸브 V3는 예외이며, 이는 -11 psig의 진공의 적용에 의해 개방 위치로 유지되었다. 간결함을 위해, (밸브가 실제 밸브 어셈블리 내에 위치되는 경우에도) 밸브 수는 공압 플레이트와 관련한 이의 위치를 기초로 하여 언급된다.
·용해. 550 마이크로리터의 용해 용액을, 밸브 V1(도 69, 39)를 개방시키고, 30초 동안 3 psig, 이후 60초 동안 5.5 psig의 압력을 유도 라인 DL1 (도 69, 68)에 적용시킴으로써 용해 시약 챔버(도 69, 20)로부터 면봉 챔버(도 69, 19)로 공압 로딩시켰다. 밸브 V1(도 69, 39)을 폐쇄시키고, 유도 라인 1(도 69, 68)을 불활성화시켰다. 에탄올 시약 챔버(도 69, 21)로부터의 550 마이크로리터의 에탄올을, 밸브 V2(도 69, 40)를 개방시키고, 30초 동안 5.5 psig의 유도 압력을 유도 라인 2(도 69, 69)에 적용시킴으로써 면봉 챔버(도 69, 19)에 공압 로딩시켰다.
·무질서 기포형성. 밸브 V2(도 69, 40)를 개방시키고, 30초 동안 5.5 psig의 공압 압력을 유도 라인 2(도 69, 69)에 적용시킴으로써 공기를 면봉 챔버(도 69, 19)로 공압 유도시켰다. 밸브 2(도 69, 40)를 폐쇄시키고, 유도 라인 2(도 69, 69)을 불활성화시켰다. 면봉 챔버로 유도된 공기는 용해 용액 전체에 걸쳐 무질서적으로 기포 형성시켰고, 이는 용해 시약 및 면봉 헤드 둘 모두를 무질서하게 교반시켰다. 이는 세포를 용해시켰고, DNA를 방출시켰다.
·일렬화. 30초 동안 -7 psig의 진공을 유도 라인 3(도 69, 70)에 적용시키면서 밸브 V3(도 69, 41)를 개방 위치로 유지시킴으로써 용해질을 미립자 필터(도 69, 11)를 통해 면봉 챔버(도 69, 19)로부터 홀딩 챔버(도 69, 24)로 끌어당겼다. 밸브 3(도 69, 41)를 폐쇄시키고, 유도 라인 3(도 69, 70)를 불활성화시켰다.
·DNA 결합. 밸브 V4(도 69, 42) 및 밸브 V5의 세트(도 69, 43)를 개방시키고, 60초 동안 5 psig의 압력을 유도 라인 DL3(도 69, 70)에 적용시킴으로써 홀딩 챔버(도 69, 24)로부터의 용해질을 정제 필터(도 69, 12)를 통해 면봉 챔버(도 69, 19)로 공압 유도시켰다. 밸브 V4(도 69, 42) 및 V5(도 69, 43)를 폐쇄시키고, DL3(도 69, 70)를 불활성화시켰다. 용해질 내의 DNA는 정제 필터(도 69, 12)에 결합하였다. 면봉 챔버가 또한 용해질의 생성 및 처리 후에 소모 챔버로 작용하고; 이러한 이중 용도가 대량유체 블록에 대한 또 다른 큰 부피의 챔버의 필요성을 배제시키는 것을 인지하라. 용해질의 보존이 요망되는 경우 각각의 샘플로부터의 별개의 소모 챔버가 임의로 포함될 수 있다.
·세척. 밸브 V5(도 69, 43) 및 V6(도 69, 46)을 개방시키고, 90초 동안 13 psig의 공압을 유도 라인 DL4(도 69, 71)에 적용시킴으로써 세척 용액을 정제 필터(도 69, 12)를 통해 세척 용액 챔버(도 69, 22)로부터 면봉 챔버(도 69, 19)로 공압 유도시켰다. 밸브 V5(도 69, 43) 및 V6(도 69, 46)를 폐쇄시키고, DL4(도 69, 71)를 불활성화시켰다. 3 ml의 세척액을 정제 필터를 통해 통과시켜 결합된 DNA로부터의 오염물질 및 미립자 부스러기를 제거하였다. 2회의 추가 세척으로 인접한 채널을 세정하였다.
·건조. 밸브 V5(도 69, 43) 및 V6(도 69, 46)를 개방시키고, 185초 동안 13 psig의 압력을 유도 라인 DL4(도 69, 46)에 적용시킴으로써 공기를 정제 필터(도 69, 12)를 통해 면봉 챔버(도 69, 19)로 공압 유도시켰다. 밸브 V5 및 V6를 폐쇄시키고, DL4(도 69, 71)를 불활성화시켰다. 공기로 정제 필터를 부분적 내지 완전히 건조시켰다.
·용리. 밸브 V6(도 69, 46), V7(도 69, 45) 및 V8(도 69, 47)을 개방시키고, 120초 동안 5 psig의 압력을 유도 라인 DL5(도 69, 72)에 적용시킴으로써 용리 완충액이 정제 필터(도 69, 12)를 통해 용리 시약 챔버(도 69, 23)로부터 용리액 홀딩 챔버(도 69, 25)로 공압 유도된다. 밸브 V6(도 69, 46), V7(도 69, 45) 및 V8(도 69, 47)을 폐쇄시키고, DL5(도 69, 72)를 불활성화시켰다. 300 마이크로리터의 용리 완충액을 정제 필터(도 69, 12)를 통해 통과시켜 정제 필터에 결합된 정제된 DNA를 방출시켰다. 임의로, 상기 용리액의 일부는 보존 샘플로서 저장하기 위해 필터에 루팅될 수 있다. 이러한 경우, 필터는 이러한 필터가 바이오칩으로부터 분리되는 것을 가능케 하는 메커니즘으로 통합된다.
·균질화. 밸브 V6(도 69, 46), 및 V8(도 69, 47)을 개방시키고, 60초 동안 5 psig의 압력을 유도 라인 DL4(도 69, 71)에 적용시킴으로써 공기를 용리액 홀딩 챔버로 공압 유도시켰다. 밸브 V6(도 69, 46), 및 V8(도 69, 47)을 폐쇄시키고, DL4(도 69, 71)를 불활성화시켰다. 공기를 용리액을 통해 용리액 홀딩 챔버 기포로 유도시켜 용리액 내의 DNA를 교반시키고 균질화시켰다.
·용리액 계량. 밸브 V10(도 69, 48)을 개방시키고, 40초 동안 1 psig의 압력을 DL6(도 69, 73)에 적용시킴으로써 용리액을 용리액 홀딩 챔버(도 69, 25)로부터 용리액 계량 챔버(도 70, 8)로 공압 유도시켰다. 밸브 V10(도 69, 48)을 폐쇄시키고, DL6(도 69, 73)을 불활성화시켰다. 각각의 용리액을 계량 챔버에 충전시키고, 벤트 막에서 정지시켰다. 밸브 V10(도 69, 48) 및 V11(도 70, 50)을 개방시키고, 25초 동안 2 psig의 압력을 유도 라인 DL7(도 70, 49)에 적용시킴으로써 과량의 용리액을 용리액 홀딩 챔버로 다시 공압 유도시켰다. 밸브 V10(도 69, 48) 및 V11(도 70, 50)을 폐쇄시키고, DL7(도 70, 49)을 불활성화시켰다.
·PCR 케이크 재구성. 밸브 V11(도 70, V11)을 개방시키고, 15초 동안 0으로부터 15 psig로 선형으로 증가하는 유도 압력을 DL7(도 71, 49)에 적용시킴으로써 용리액을 용리액 계량 챔버(도 70, 8)로부터 PCR 케이크 재구성 및 상호 챔버(도 70, 610)로 공압 유도시켰다. 챔버(도 70, 610)는 동결건조된 PCR 케이크를 유지하도록 설계되어, PCR 케이크의 재구성, 및 PCR 반응의 상호 혼합을 가능케 한다. 상기 챔버의 부피는 용리액 계량 챔버(도 70, 8)에 의해 규정되는 용리액의 부피의 약 2.2배이다. PCR 케이크는 챔버의 입구측에 배치되고 위치한다. 챔버의 출구는 밸브에 의해 밀봉된다. 용리액과 밸브 V13(도 71, 52) 사이의 공기는 압축되어 용리액이 챔버 내에서 이동하고, 동결건조된 PCR 케이크와 접촉되도록 한다. 케이크는 60초 동안 15 psig에서 DL7의 압력을 유지시킴으로써 재구성된다. 11.5 마이크로리터의 계량된 용리액을 이동시켜 동결건조된 PCR 반응 혼합물을 함유하는 케이크를 재구성시켜 증폭을 위한 PCR 혼합물을 생성시켰다.
·PCR 용액 상호 혼합 - 이후, 15초에 걸쳐 유도 라인 DL7의 압력을 15 psig로부터 0 psig로 선형으로 감소시킴으로써 PCR 용액(즉, 용리액으로 재구성된 PCR 케이크)을 PCR 재구성 및 상호교환 챔버(도 70, 10)로부터 다시 용리액 계량 챔버(도 70, 8)로 이동시켰다. 용리액과 밸브 V13(도 71, 52) 사이의 공기를 압축시키고 공기 스프링으로 작용시켜 PCR 혼합물을 밀어내어, 이를 계량 챔버(도 71, 8)로 이동시켰다. 15초에 걸쳐 0 psig로부터 15 psig로, 이후 15초에 걸쳐 15 psig로부터 0 psig로 DL7의 유도 압력을 선형으로 증가시킴으로써 PCR 혼합물을 상호 혼합시켰다. 밸브 V12(도 70, 49)를 폐쇄시키고, 유도 라인 DL7(도 70, 49)을 불활성화시켰다.
·열 사이클링 챔버로의 이동. 밸브 V11(도 70, 50), V13(도 70, 52), 및 V14(도 70, 53)를 개방시키고, 30초 동안 0.2 psig, 이후 30초 동안 0.4 psig, 이후 30초 동안 0.6 psig의 연속적으로 증가하는 유도 압력 순서를 유도 라인 DL7(도 70, 49)에 적용시킴으로써 PCR 반응 혼합물을 용리액 계량 챔버(도 70, 8)로부터 열 사이클링 챔버(도 70, 62)로 공압 유도시켰다. 밸브 V12(도 70, 51) 및 V14(도 70, 53)를 폐쇄시키고, DL7(도 70, 49)을 불활성화시켰다. PCR 반응 혼합물을 열 주기 챔버로 이동시키고, 일렬 벤트 막에서 정지시켰다.
·열 주기. 31회 주기의 프로토콜을 열 사이클링 챔버(도 70, 62) 내에서의 반응을 주기화시키는데 적용시켜 표지된 앰플리콘을 생성시켰다. 사이클링 조건은 다음과 같았다: 핫스타트(Hotstart) 93℃ x 20초 후, 31 주기의 (93℃ x 4초, 56℃ x 15초, 및 70℃ x 7초) 후, 70℃ x 90초의 최종 신장.
·PCR 생성물 계량. 밸브 V11(도 70, 50), V13(도 70, 52) 및 V14(도 70, 53) 및 V30(도 71, 111)을 개방시키고, 30초 동안 0.2 psig, 이후 30초 동안 0.4 psig, 이후 45초 동안 0.6 psig의 연속적으로 증가하는 유도 압력 순서를 유도 라인 DL7(도 70, 49)에 적용시킴으로써 PCR 생성물을 열 사이클링 챔버(도 70, 62)로부터 PCR 계량 챔버(도 71, 74)로 공압 유도시켰다. 밸브 V11(도 70, 50), V13(도 70, 52), V14(도 70, 53), 및 V30(도 71, 111)을 폐쇄시키고, DL7(도 70, 49)을 불활성화시켰다. PCR 생성물을 계량 챔버로 유동시키고, 벤트 막에서 정지시켰다.
·포름아미드 계량. 50초 동안 1 psig의 압력을 유도 라인 DL8(도 71, 75)에 적용시킴으로써 포름아미드를 포름아미드 시약 챔버(도 71, 60)로부터 포름아미드 계량 챔버(도 71, 76)로 공압 유도시켰다. 유도 라인 DL8(도 71, 75)을 불활성화시켰다. 이러한 단계에서, 케이크를 재구성시켜 대조 샘플을 생성시키기 위해 포름아미드의 1/6 부피를 계량하였다(도 71, 77). 포름아미드는 계량 챔버로 유동하였고, 벤트 막에서 정지하였다. 밸브 V15(도 71, 54)를 개방시키고, 180초 동안 3 psig의 압력을 유도 라인 DL8(도 71, 75)에 적용시킴으로써 과량의 포름아미드를 포름아미드 챔버로부터 소모 챔버로 공압 유도시켰다. 밸브 V15(도 71, 54)를 폐쇄시키고, DL8(도 71, 75)을 불활성화시켰다. 과량의 포름아미드 시약 챔버 및 유도 라인 모두를 소모 챔버로 이동시켰다.
·PCR 생성물 및 포름아미드 결합. 밸브 V18(도 71, 57), V17(도 71, 80) 및 V20(도 71, 81)을 개방시키고, 각각 30, 30, 30, 및 30초 동안 0.2, 0.3, 0.4, 및 0.5 psig의 4단계 유도 프로파일을 유도 라인 DL9(도 71, 79)에 적용시킴으로써 계량된 PCR 생성물을 PCR 계량 챔버(도 71, 74)로부터 결합 챔버(도 71, 78)로 공압 유도시켰다. 밸브 V18(도 71, 57), V17(도 71, 80) 및 V20(도 71, 81)을 폐쇄시키고, DL9(도 71, 79)를 불활성화시켰다. 30, 30, 및 60초 동안 0.2, 0.4 및 0.6 psig의 증가하는 압력을 유도 라인 DL8(도 71, 75)에 적용시킴으로써 계량된 포름아미드를 포름아미드 계량 챔버(도 71, 76)로부터 결합 챔버(도 71, 78)로 공압 유도시켰다. 밸브 V20(도 71, 81)을 폐쇄시키고, DL8(도 71, 75)을 불활성화시켰다. 결합 챔버는 2개의 독립적 유동으로부터 발생하는 계량된 PCR 및 계량된 포름아미드가 조합되어 분리 및 검출을 위한 샘플을 형성하는 것을 가능케 한다.
·ILS 케이크 재구성. 밸브 V20(도 71, 81)을 개방시키고, 15초 동안 DL8(도 71, 75)의 유도 압력을 0으로부터 15 psig로 선형으로 증가시킴으로써 분리 및 검출을 위한 샘플을 결합 챔버(도 71, 78)로부터 ILS 케이크 챔버(도 71, 635) 및 ILS+대조군 케이크 챔버(도 71, 682)로 공압 유도시켰다. 샘플과 밸브 V21(도 71, 86) 사이의 공기를 압축시켜 샘플이 챔버 내로 이동하고, 동결건조된 ILS 케이크와 접촉되도록 하였다. 60초 동안 15 psig에서 DL8(도 71, 75)의 압력을 유지시킴으로써 케이크를 재구성시켰다. 11.5 마이크로리터의 계량된 샘플을 이동시켜 동결건조된 내부 레인(lane) 표준을 함유하는 케이크를 재구성시켜 분리 및 검출 샘플을 생성시켰다.
·분리 및 검출 용액 상호 혼합 - 이후, 15초 동안 유도 라인 DL8(도 71, 75)의 압력을 15 psig로부터 0 psig로 선형으로 감소시킴으로써 PCR 용액(즉, 계량된 포름아미드 및 계량된 PCR 생성물로 재구성된 ILS)을 ILS 재구성 및 상호교환 챔버(도 71, 635)로부터 다시 결합 챔버(도 71, 78)로 이동시켰다. 용리액과 밸브 V13(도 71, 52) 사이의 공기를 압축시켰고, 이는 공기 스프링으로 작용하여 분리 및 검출 샘플을 밀어내어 혼합시키고, 이를 포름아미드 계량 챔버(도 71, 76)로 이동시킨다. 15초에 걸쳐 0 psig로부터 15 psig로 DL8(도 71, 75)의 유도 압력을 선형으로 증가시키고, 이후 15초에 걸쳐 15 psig로부터 0 psig로 감소시킴으로써 분리 및 검출 샘플을 상호 혼합시켰다. 유도 라인 DL8(도 71, 75)을 불활성화시켰다.
·분리 채널로의 샘플 주입. 밸브 V21(도 71, 86) 및 V22(도 71, 87)를 개방시키고, 30, 30, 30, 30, 및 30초 동안 각각 0.4, 0.6, 1.0, 1.5 및 2.0 psig의 연속적으로 단계화된 프로파일로 유도 라인 DL9(도 71, 79)에 압력을 적용시킴으로써 결합 챔버(71, 78)로부터의 5개의 분리 및 검출 샘플 및 포름아미드 계량 챔버(도 71, 76)로부터의 대조군 샘플을 이제 디버블링(debubbling) 챔버로 작용하는 ILS 케이크 챔버(도 71, 635, 및 682)를 통해 공압 유도시켜 캐쏘드 챔버(도 71, 84) 및 샘플 소모 챔버(도 71, 85)를 충전시켰다. 밸브 V21(도 71, 86) 및 V22(도 71, 87)를 폐쇄시키고, DL8(도 71, 74)를 불활성화시켰다. 35초 동안 캐쏘드(도 55 및 56, 63) 및 애노드(도 55 및 56, 64)에 편향되도록 4400 V의 전압을 적용시킴으로써 샘플 내의 DNA를 캐쏘드 챔버(도 71, 84)로부터 바이오칩의 분리 부분(도 55 및 도 56, 88)로 주입시켰다.
· DNA 분리 및 검출. 밸브 V25(도 71, 91), V24(도 71, 90), V26(도 71, 95), V27(도 71, 96), 및 V28(도 71, 97)을 개방시키고, 240초 동안 2 psig의 압력을 유도 라인 DL10(도 71,98)에 적용시킴으로써 TTE를 TTE 시약 저장소(도 71, 59)로부터 공압 유도시켜 캐쏘드(도 71, 84)를 충전시키고, TTE 소모 챔버(도 71, 92, 93, 및 13)를 충전시켰다. 밸브 V25(도 71, 91), V24(도 71, 90), V26(도71, 95), V27(도 71, 96), 및 V28(도 71, 97)을 폐쇄시키고, DL10(도 71,98)을 불활성화시켰다. 캐쏘드를 통한 TTE의 유동은 샘플을 캐쏘드 내에 배치시켰다. S&D 바이오칩의 분리 부분(도 55)으로 주입된 DNA는 30분 동안 캐쏘드(도 55 및 56, 63) 및 애노드(도 55 및 56, 64)를 편향시키기 위해 6400 V가 적용되는 경우 바이오칩의 분리 부분 아래로 이동하였다. 광학 시스템을 또한 작동시켜 여기 및 검출 윈도우에서 레이저 유도 형광 여기 및 검출을 실행하였다. 레이저를 200 mW로 설정하고, 5 Hz의 데이터 수집 속도를 이행시켰다. 형광 신호는 검출 경로를 통해 광전자증배기 튜브로 이동하였다. 여기서, 형광은 시스템 소프트웨어에 의해 기록되는 신호로 전환된다.
상기 기재된 바와 같은 스크립트화 처리 단계에 따라 샘플 및 대조군에 대해 전기영동도를 생성시켰다. 샘플의 삽입으로부터 전기영동도의 생성까지의 전체 처리는 약 90분을 필요로 하였다. 많은 처리 단계가 단축될 수 있고, 처리는 요망시 45분 미만으로 수행될 수 있다. 도 77은 처리의 한 부분에 대한 스크립트화 처리 단계 및 생성된 처리 단계의 상관관계를 예시한다. 용리액은 계량된 부피를 발생시키는 용리액 홀딩 챔버(도 39, 25)로부터 도 77의 10 단계 스크립트를 갖는 용리액 계량 챔버(도 39, 8)로 공압 유도된다. 스크립트 단계는 5개의 밸브 및 홀딩 챔버로부터 계량 챔버로 용리액을 이동시키기 위한 유도 라인 상태 변화로 이루어진다. 다음의 5개의 스크립트 단계는 과량의 용리액을 제거하고, 이러한 부피를 홀딩 챔버로 밀어낸다. 따라서, 10개의 스크립트화 처리 단계(밸브 및 유도 라인에 대한 압력 증가 및 감소)는 2개의 결과로서 발생한 처리 단계(용리액 홀딩 챔버로부터 용리액 계량 챔버로의 샘플의 이동 및 과량의 샘플의 다시 용리액 홀딩 챔버로의 이동)에 해당한다.
실시예 7. 핵산 정량의 필요를 배제시키는 샘플 분할
법의학 샘플이거나, 임상 샘플이거나, 생물위협 샘플이건 간에 제공된 샘플 내의 핵산의 양은 매우 가변적이다. 특정 핵산 조작에서, 반응 조건은 투입 핵산의 특정 범위가 효과적인 것을 필요로 한다. 실험실에서, 이러한 문제는 종종 제공된 조작 전에 핵산 정량 단계를 수행함으로써 해소된다. 참조로서 본원에 포함되는 "법의학 DNA 정량을 위한 개선된 방법(Improved Methods for Forensic DNA Quantitation)"을 제목으로 하는 미국 출원 일련 번호 12/816,370호에 기재된 바와 같은 미세유체 적용을 위한 핵산 정량이 개발되었다.
본 발명은 미세유체 바이오칩에서 특정 범위의 핵산을 필요로 하는 문제에 대한 또 다른 해법을 제공한다. 이러한 방법은 정량을 포함하지 않지만, 대신 분석을 위한 2개 이상의 핵산 농도를 제공하기 위해 제공된 샘플을, 바람직하게는 동시에 1회 이상 희석시키는 것을 기초로 한다. 본 발명은 접촉 샘플(touch sample)을 이용하여 예시된다. 접촉 샘플은 인체에 대한 노출 후에 표변에 남는 세포(주로 상피세포)로 이루어지는 법의학 샘플이다. 이들은 지문, 의류(예를 들어, 셔츠 칼라)에서 발견되는 피부 세포, 및 소다 캔의 개방부 또는 유리잔 테두리에서 발견되는 구강 상피 세포를 포함한다. 접촉 DNA 샘플로부터 회수되는 DNA의 양은 매우 가변적이다. 접촉 샘플은 일반적으로 100 ng 이하의 DNA를 함유하고, 대부분의 접촉 샘플은 0.5 - 10 ng의 DNA를 함유한다. 따라서, 접촉 샘플 시스템은 0.5 - 100 ng의 DNA를 함유하는 면봉을 처리할 것이다.
대부분의 접촉 샘플은 10 ng 미만의 DNA를 함유할 가능성이 있지만, 공지되지 않은 접촉 샘플은 충분한 200배 범위의 DNA가 정확하게 처리되어야 하는 예상과 함께 처리되어야 한다. 수작업 증폭 시스템에서, 0.5 ng을 증폭시키는 것이 적당할 것이며, 100 ng을 증폭시키는 것은 그렇지 않을 것이다. 따라서, 수작업 시스템에서, 접촉 샘플로부터 정제된 DNA는 일반적으로 증폭 전에 정량된다. 본 발명의 미세유체 바이오칩은 접촉 샘플 DNA가 유체 서브어셈블리 내에서 정제된 DNA를 2개의 분취량으로 분할시킴으로써 정량 없이 처리되는 것을 가능케 한다. 용리된 DNA의 한 분취량은 증폭된 순수물(neat)(10 ng 미만의 DNA가 증폭 혼합물에 존재하는 것으로 추정함)이고, 다른 분취량은 20배 희석된다(5-100 ng의 DNA가 반응 혼합물에 존재하는 것을 추정함). 순수물 및 희석된 분취량 둘 모두는 독립적이지만 동시에 증폭되고, 분리되고, 검출된다. 순수물 샘플은 정제된 DNA의 적어도 0.05 - 10 ng의 범위에 걸쳐 효과적인 증폭을 가능케 하고, 희석된 샘플은 정제된 DNA의 적어도 1 - 200 ng의 범위에 걸쳐 효과적인 증폭을 가능케 하며; 효과적으로 검정될 수 있는 DNA 함량의 전체 범위는 적어도 40,000배의 범위에 달한다.
샘플 분할 미세유체가 하기와 같이 실시예 5 및 6의 바이오칩에 통합된다. DNA는 동일 DNA 정제 프로토콜을 이용하여 20 마이크로리터의 부피로 용리된다. 이러한 부피에서, 용리액 홀딩 챔버는 대량유체 처리 서브시스템으로부터 분리되고, 20 마이크로리터의 용리액 홀딩 챔버가 유체 서브어셈블리의 유체 플레이트 상에 위치된다. 상기 플레이트에서, 20 마이크로리터의 정제된 DNA가 병행 경로로 루팅된다:
·순수물 경로에서, 12 마이크로리터의 DNA가 계량 챔버에서 계량되고, PCR 케이크 재구성 챔버로 이동되고, 증폭을 위해 PCR 챔버로 이동된다. 챔버는 약 10 마이크로리터의 재구성된 반응 혼합물을 수용하기 위해 약간 확장될 것이다.
·희석 경로에서, 약 2 마이크로리터의 DNA가 계량되고, 38 μL의 계량된 용리 용액과 결합된다. 이후, 희석된 용액은 케이크 재구성 챔버로 이동되고, 증폭을 위해 PCR 챔버로 이동된다.
·증폭 후, 2개의 용액은 분리 및 검출을 통해 동시에 처리된다.
샘플 분할 및 희석 미세유체 회로의 흐름도가 도 78에 제시된다. 임의로, 정제된 DNA 샘플은 이후의 처리를 위해 2개 이상의 분취량으로 분할될 수 있고, 희석된 샘플은 처리를 위한 추가 분취량을 발생시키기 위해 추가로 희석될 수 있다. 접촉 샘플에 대해, 상기 희석은 필요하지 않지만, 특정 법의학, 임상 진단, 및 생물위협 샘플은 훨씬 많은 DNA를 함유할 수 있고, 이의 분석은 3 이상의 분취의 처리에 의해 촉진된다.
실시예 8. 플라스틱 백그라운드 형광
분리 및 검출 바이오칩은 열가소성 물질로 제작된다. 열가소성 중합체는 레이저 여기 자가형광에 노출되는 경우 검출 시스템에 의해 검출되고 처리되는 백그라운드 노이즈를 발생시킨다. 이러한 자가형광은 실제 신호 피크의 신호-대-노이즈 비(signal-to-noise ratio)를 격하시켜 시스템의 검출 한계를 상승시킨다. 분리 및 검출을 위한 통상적인 S&D 바이오칩은 플라스틱 기판에 비해 단위 두께 당 더 적은 자가형광을 나타내는 유리 또는 석영 기판으로 제작된다. 플라스틱 기판과 함께 레이저 유도 형광 검출을 수행하는 경우 여러 고려가 이루어져야 한다:
(1) 낮은 자가형광을 나타내는 플라스틱 물질의 선택 - 실시예 5 및 6에서 사용되는 분리 및 검출 바이오칩을 제작하는데 사이클린 올레핀 공중합체(COC) 및 사이클릭 올레핀 중합체(COP) 열가소성 물질이 사용된다. 이러한 열가소성 물질은 다른 중합체에 비해 가시 파장 범위에서 고유의 낮은 자가형광을 나타낸다.
(2) 레이저에 의해 여기되는 플라스틱 기판 두께의 감소 - 사용되는 물질의 두께는 350 psig를 초과할 수 있는 겔 충전 압력에 견디는 상기 구조의 능력에 의해 제한된다. 실시예 5 및 6에서 사용되는 바이오칩은 188 마이크론 두께의 열가소성 시트로 채널 특징부를 엠보싱시킨 후, 상기 채널을 덮기 위해 또 다른 188 마이크론 두께의 열가소성 시트를 결합시킴으로써 제작된다. 진벤치(Genebench) 광학 검출 기계의 분리 및 검출 윈도우에 여러 기판(플라스틱 188 nm, 플라스틱 376 nm, 보로실리케이트 유리 0.7 nm, 및 보로실리케이트 유리 1.4 nm)을 배치시킴으로써 유리 및 플라스틱 기판 상에서 백그라운드 형광을 측정하기 위한 실험을 수행하였다(예를 들어, 일반적으로 "플라스틱 미세유체 분리 및 검출 플랫폼(Plastic Microfluidic Separation and Detection Platforms)"을 제목으로 하는 2009/0020427로 공개된 출원 일련 번호 12/080,745호 참조). 200 mW의 레이저 여기를 기판에 적용시키고, 신호를 수집하였다. 도 79는 저 형광 플라스틱(188 마이크론 및 376 마이크론 두께) 및 보로실리케이트 유리(0.7 mm 및 1.4 mm 두께)의 백그라운드 형광을 도시한다. 데이터는 얇은 필름의 플라스틱에 대한 백그라운드 형광이 0.7 mm 및 1.4 mm 두께의 보로실리케이트 유리의 백그라운드 형광보다 4 내지 7배 낮은 것을 나타낸다.
(3) 백그라운드 방출을 감소시키기 위한 필터의 통합 - 백그라운드 형광은 일반적으로 낮지만, 플라스틱은 약 569 nm에서 높은 자가형광을 나타낸다. 이러한 방출 피크는 플라스틱이 488 nm 레이저에 의해 여기되는 경우에 발생되는 라만 형광의 결과이다. 피크의 스펙트럼은 약 569 nm에 집중되고, 5 nm의 전폭을 갖는 것을 나타낸다. 라만 형광은 약 570 nm의 중심 파장 및 약 5 내지 10 nm의 거부 대역을 갖는 노치(notch) 필터를 이용함으로써 제거될 수 있다. 라만 플라스틱 형광을 제거하기 위한 노치 필터를 이용함으로써 신호 대 노이즈에서의 개선을 평가하기 위한 실험을 수행하였다. 3 분리 및 검출 세트를 노치 필터 없이 수행하고, 또 다른 세트를 PMT 박스에 대한 입구에 설치된 노치 필터로 수행하였다. 도 80에는 데이터의 결과가 요약되어 있다. 데이터는 필터가 황색 채널에 대한 피크-대-피크 노이즈를 67로부터 39의 상대 형광 단위(rfu)로 감소시키는 것을 나타낸다. 필터는 또한 절대 신호 강도를 1520에서 1236 rfu로 감소시키고, 신호 대 노이즈 비를 23으로부터 32로 전반적으로 개선시켰다. 노치 필터는 검출 한도가 특히 중요한 환경(예를 들어, 병원체 수가 낮은 경우의 제공된 질병의 과정의 초기에서의 법의학 접촉 샘플의 분석 및 감염성 작용제의 진단)에서 통합된 기계 및 통합되지 않은 기계 둘 모두의 광학 시스템에서 유용하다.
실시예 9. 자동화된 스크립트를 이용하여 임상 전혈 샘플로부터 핵산을 정제시키고, 정제된 DNA 를 증폭시키고, 증폭된 DNA 를 생어 ( Sanger ) 시퀀싱시키고 , 시퀀싱된 DNA 를 초여과시키고 , 초여 과된 DNA 를 전기영동 분리시키고, 다중 DNA 서열을 생성시키는 완전히 통합된 바이오칩의 설계.
스태필로코쿠스, 스트렙토코쿠스, 및 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica)와 같은 병원체가 혈액의 세포외 성분에 존재할 수 있다. 2개의 혈액 샘플을 수용하고, 제공된 병원체의 8개의 좌위로부터 DNA 서열을 발생시키는 단일한 고정 플라스틱 바이오칩은 공압-밸브-유체 스택, 대량유체 처리 서브어셈블리, 및 분리 및 검출 서브어셈블리로 구성된다. 바이오칩은 하기 기재되는 바와 같이 변형되고, 자동화된 스크립트를 기초로 하는 실시예 6의 사출성형된 바이오칩과 유사하고, 상기 처리는 하기와 같이 수행된다:
대량유체 서브어셈블리는 미리 로딩된 시약을 유지하거나 DNA 정제 처리 동안 홀딩/반응 챔버로 작용하는 12개의 챔버로 구성된다. 한 챔버가 혈액 수집 튜브를 수용하기 위해 사용되고; 6개의 챔버가 3 mL의 세척 용액, 100 마이크로리터의 세포 재현탁 용액, 450 마이크로리터의 용해 용액, 550 마이크로리터의 무수 에탄올, 2 마이크로리터의 세척 완충액, 2000 마이크로리터의 탈이온수 및 400 마이크로리터의 용리 완충액으로 미리 충전된다.
바이오칩셋은 표준 3 cc 진공채혈관(분리 실험을 위해, 혈액이 적절한 항응고제를 함유하는 튜브에 수집됨)을 수용한다. 혈액 수집 튜브가 고무 마개된 엔드 다운(rubber stoppered end down)을 갖는 바이오칩으로 삽입된다. 사용자가 기계 상의 시작 버튼을 누르는 경우 정제 처리가 개시된다. 기계 내에서, 혈액 수집 튜브가 혈액 수집 튜브 공동의 기부에 위치된 2개의 공동 핀으로 밀려진다. 공동 핀이 고무 마개를 통해 관통하고, 혈액 수집 튜브가 5 psi로 공압 가압되어 8 마이크론의 공칭 포어 크기를 갖는 필터(예를 들어, 류코소르브(Leukosorb B) 배지, Pall Corporation, Port Washington, NY)를 통해 혈액 수집 튜브로부터 혈액을 유도하여, 혈액으로부터 백혈구를 제거하였다. 플로우스루(flowthrough)가 0.2 마이크론의 폴리카르보네이트 트랙-에치(track-etch) 막(SPI-Pore™ Track-Etch Membrane, Structure Probe, Inc., West Chester, PA)의 단일층을 통해 통과되어 막 상에서의 포획을 통해 박테리아를 농축시키며, 이러한 플로우스루는 소모 챔버로 루팅된다.
재현탁 용액(100 마이크로리터)이 트랙-에치 막의 표면에 적용되고, 트랙 에치 막 상에 보유된 병원체가 재현탁되고, 농축된 병원체 현탁액이 생성된다(이는 또한 잔여 백혈구를 포함할 수 있음). 이러한 현탁액은 용해 챔버로 공압 유도된다. DNA 정제가 실시예 5 및 6에 기재된 바와 같이 수행되고, 모든 부피는 비례적으로 낮아진다. 무질서 용해 시약이 용해 챔버로 유도되고, 공기가 용해/소모 챔버로 공압 유도되어 용해질의 무질서 기포형성이 달성된다. 에탄올 저장소로부터의 에탄올이 용해/소모로 유도되고, 무질서 기포형성에 의해 혼합된다. 용해질/에탄올 혼합물이 홀딩 챔버로 공압 유도되고, 정제 막을 통해 용해/소모 챔버로 유도된다. 상기 막은 일련의 3회의 세척에 적용되어 결합되지 않은 물질 및 잔여 용해 용액이 제거된다. 이후, 필터가 공기 건조된다. 20.5 마이크로리터의 용리 용액이 정제 막을 통해 용리 용액으로부터 용리액 홀딩 챔버로 공압 유도된다. 이러한 보다 적은 부피는 분리된 핵산의 큰 비율이 이후의 증폭 반응에서 증폭되는 것을 보장한다.
용리액은 용리액 홀딩 챔버로부터 용리액 계량 챔버로 공압 유도되고, 과량의 용리액이 용리액 홀딩 챔버로 다시 공압 유도된다. 용리액이 용리액 계량 챔버로부터 PCR 케이크 챔버로 공압 유도된다. 20.5 마이크로리터의 계량된 용리액이 동결건조된 PCR 반응 혼합물을 함유하는 케이크를 재구성시키기 위해 전달되어 증폭을 위한 PCR 혼합물이 생성된다. 상기 케이크는 인간 STR 프라이머 쌍(각각의 쌍 중 하나는 형광 표지됨)이 80 프라이머 쌍(각각의 쌍의 어느 일원도 표지되지 않음)의 세트로 대체된 것을 제외하고는 도 5 및 6의 것과 동일한 구성요소를 함유한다. 80 프라이머 쌍은 스태필로코쿠스, 스트렙토코쿠스, 및 예르시니아 엔테로콜리티카를 포함하는 10개의 병원체의 각각에 대한 8개의 특이적 좌위이다(훨씬 많은 세트의 좌위가 요망시 가능하다). 재구성된 PCR 반응 혼합물이 케이크 챔버로부터 열 주기 챔버로 공압 유도되고, 일렬 벤트 막에서 정지된다. 31 주기의 증폭 프로토콜이 적용되어 열 주기 챔버 내에서 반응이 주기화된다. 모든 스크립트화 및 처리 단계까 실시예 5 및 6에 기재된 바와 같이 본질적으로 수행된다.
PCR 생성물이 열 주기 챔버로부터 PCR 계량 챔버로 공압 유도되고, 벤트 막에서 정지된다. 6 마이크로리터의 PCR 생성물이 결합 챔버에서 94 마이크로리터의 탈이온수와 혼합된다. 결합 챔버는 계량된 PCR 및 계량된 물(2개의 독립적 유동으로부터 유래함)이 조합되어 동결건조된 시퀀싱 케이크의 재구성을 위한 샘플을 형성하는 것을 가능케 한다. 희석된 PCR 생성물은 결합 챔버로부터 유도되고, 8개의 계량 챔버로 분할되고, 상기 계량 챔버 각각은 11 마이크로리터를 보유하며, 벤트 막에 의해 일렬화된다. 8개의 샘플 각각은 시퀀싱 케이크 재구성 챔버로 유도된다. 8개의 케이크는 생어 반응 혼합물의 약간 상이한 형태(염료-표지된 종료자의 사용을 기초로 하여, 각각의 신장 생성물은 서열의 상기 위치에서의 염기에 해당하는 단일한 형광 표지를 포함함)이며, 각각의 케이크는 10개의 관심 병원체 각각에 대한 좌위에 대한 것인 10개의 시퀀싱 프라이머의 독특한 세트를 함유한다. 제공된 병원체에 대해, 특정 좌위에 대한 하나의 프라이머 쌍은 케이크 1에 존재하고, 두번째 프라이머 쌍은 케이크 2에 존재하고, 이후 동일하며; 이러한 배치는 각각의 케이크로부터의 제공된 병원체에 대해 단일한 DNA 서열이 생성되는 것을 보장한다. 재구성된 시퀀싱 반응 혼합물은 케이크 챔버로부터 주기 서열 사이클링 챔버(두번째 열 사이클러 바로 위에 위치됨)로 공압 유도되고, 일렬 벤트 막에서 정지하며; 각각의 사이클링 챔버는 10 마이크로리터를 보유한다. 주기 시퀀싱은 다음과 같이 수행된다: 15초 동안 95℃ 후, [5초 동안 95℃, 10초 동안 50℃, 및 25초 동안 60℃]의 30주기. 8개의 시퀀싱 반응 각각(이제, 2개의 혈액 샘플에 대해 전체 16개)에 대해, 10 마이크로리터의 시퀀싱 반응 생성물이 초여과를 위한 제조에서 결합 챔버에서 100 마이크로리터의 탈이온수와 혼합된다.
전기영동 분리 성능은 분리를 방해하는 시퀀싱에 필요한 이온을 제거하기 위한 시퀀싱 생성물(및 PCR 반응 전)의 정제에 의해 크게 개선될 수 있다. 초여과를 포함하는 다양한 방법이 이용될 수 있고, 여기서 작은 이온/프라이머/혼입되지 않은 염료 표지가 필터를 통해 유도되고, 필터 상에 요망되는 생성물이 남겨지고, 이는 이후에 용리될 수 있고, 분리 및 검출에 직접 적용될 수 있다. 초여과 매질은 폴리에테르설폰 및 재생된 셀룰로오스 "직물(woven)" 필터, 뿐만 아니라 고도로-균일한 크기의 포어가 극도로 얇은(1-10 μm) 막에 형성된 트랙-에치(track-etch) 막을 포함한다. 트랙-에치 막은 표면 아래의 약간의 깊이에서 생성물을 포획하는 것이 아니라 필터의 표면 상의 포어 크기보다 큰 크기의 생성물을 수집하는 장점을 갖는다.
따라서, 희석된 시퀀싱 생성물을 초여과 필터를 통해 유도시켰다. 필터는 생어 시퀀싱 생성물을 포획하나, 이온 및 희석된 시퀀싱 완충액은 통과시킨다. 필터 상의 물질을 이온 및 완충액을 추가로 제거하기 위해 필터를 통해 200 μl의 탈이온수를 공압 유도시킴으로써 세척하였다. 최종적으로, 세척된 생어 시퀀싱 생성물을 필터 챔버로 10 μl의 탈이온수를 공압 유도시켜 생어 시퀀싱 생성물을 재현탁시킴으로써 필터로부터 용리시켰다. 이후, 용리액을 결합 챔버로 공압 유도시켰다. 포름아미드는 포름아미드 시약 챔버로부터 포름아미드 계량 챔버로 공압 유도된다. 포름아미드는 계량 챔버로 유동하고, 벤트 막에서 정지한다. 과량의 포름아미드는 포름아미드 챔버로부터 소모 챔버로 공압 유도된다. 10 마이크로리터의 계량된 초여과된 생성물이 계량 챔버로부터 결합 챔버로 공압 유도된다. 계량된 포름아미드를 포름아미드 계량 챔버로부터 결합 챔버로 공압 유도시켰다. 결합 챔버는 계량된 초여과된 생성물 및 계량된 포름아미드(2개의 독립적 유동으로부터 유래됨)가 조합되어 분리 및 검출을 위한 샘플을 형성하는 것을 가능케 한다. 바이오칩이 60℃로 가열되는 것을 제외하고는 전기영동이 실시예 5 및 6에 기재된 바와 같이 수행된다. 주입 전압 및 시간, 및 분리 전압 및 시간은 실시예 5 및 6의 것과 동일하다. 2개의 혈액 샘플이, 분리 및 검출을 위해 16 채널의 생성물을 생성하도록 처리된다. 일반적으로, 샘플 당 분리 채널의 수는 좌위의 가장 큰 수와 동등하며, 프라이머 쌍은 평가시 병원체 중 하나에 대해 질의된다.
광학 시스템은 레이저 유도 형광 여기 및 검출을 실행하도록 활성화된다. 레이저는 200 mW로 설정되고, 5 Hz의 데이터 수집 속도가 이행된다. 색 보정 후, 자동화된 베이스콜러(basecaller)가 증폭 및 시퀀싱 프라이머가 각각 증폭 및 시퀀싱 케이크에 혼입된 10개의 병원체 중 하나를 함유하는 레인으로부터 시퀀스를 발생시킨다. 레인 당 약 500 bp의 시퀀스가 생성된다.
바이오칩은 임상 샘플 유형 및 확인되는 병원체를 기초로 하여 다수의 방식으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 특정 박테리아, 예를 들어, 프란시셀라 툴라레니스(Francisella tularenis) 및 클라미디아 트라코마스티스(Chlamydia trachomastis)는 포유동물 세포 내에서 이의 생애 주기의 유의한 부분을 소비한다. 일부는 절대(obligate) 세포내 유기체이며, 다른 박테리아는 임의로 세포내에 존재한다. 혈액에서의 상기 세포내 박테리아에 대한 DNA 정제는 주요한 것을 제외하고는 상기 기재된 것과 유사한다. 세포 분리 필터 상 및 세포 분리 필터를 통한 전체 혈액의 적용 후, 필터에 의해 포획된 백혈구는 관심 DNA를 함유한다. 필터가 세척되고, 100 마이크로리터로 재현탁되고, 시약 부피에서 상응하는 감소가 존재하는 실시예 Ⅰ에 기재된 바와 같은 구아니디늄-기반 정제에 적용된다.
요망시, 장치는 최초에 백혈구를 용해(예를 들어, 삼투적으로)시키도록 설계될 수 있고, 이는 박테리아에 비해 포유동물 세포의 용해의 비교적 용이함의 장점을 갖는다. 이러한 환경에서, 온전한 세포내 박테리아가 방출되고, 세포 추출물은 박테리아 포획 필터를 통해 존재하게 되고, 세척된다. 박테리아 DNA는 이후 상기 기재된 바와 같이 정제된다. 유사하게, 전체 혈액은 세포 분리의 부재하에서 용해될 수 있어, 세포외 또는 세포내 박테리아 또는 바이러스 DNA가 정제되는 것을 가능케 한다.
본 발명의 여러 구체예가 기재되었으나, 제시되고 기재된 이의 세부사항에 대한 다양한 변형이 본 발명의 범위를 벗어남이 없이 이루어질 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다.

Claims (50)

  1. 대량유체 블록을 사출 성형시키는 단계로서, 상기 블록은 (i) 적어도 하나의 처리되지 않은 샘플을 수용하기 위한 수단, (ii) 완전히 제조된 바이오칩에서 유체 전달 수단이 유체 플레이트와 유체 소통하도록 위치되고 형성된 유체 전달 수단, 및 (iii) 블록 내의 적어도 하나의 성형된 특징부로서, 상단 및 하단을 갖는 특징부를 포함하는 단계; 제 1 호일 밀봉부를 상기 상단 또는 상기 하단에 결합시켜 개방 말단을 갖는 적어도 하나의 시약 저장 챔버를 형성시키는 단계; 액체 시약으로 상기 적어도 하나의 시약 저장 챔버를 충전시키는 단계; 상기 대량유체 블록에서 제 2 호일 밀봉부를 상기 개방 상단에 결합시켜 적어도 하나의 충전된 시약 저장 챔버를 형성시키는 단계; 상부면 및 하부면을 갖는 상기 유체플레이트를 사출 성형하는 단계로서, 각각의 상기 상부면 및 하부면은 다수의 미세유체 특징부 및 상기 상부면으로부터 상기 하부면으로 연장되어 유체 상부면을 유체 하부면에 연결시키는 적어도 하나의 스루 홀 (through hole)을 포함하는 단계; 상부면 및 하부면을 갖는 공압 플레이트를 사출 성형하는 단계로서, 각각의 상기 상부면 및 하부면은 다수의 미세유체 특징부 및 상기 상부면으로부터 상기 하부면으로 연장되어 공압 상부면을 하부면에 연결시키는 적어도 하나의 스루 홀을 포함하는 단계; 상기 대량유체 블록에서 처리된 완전히 제조된 바이오칩 샘플에서 유체 전달 수단에 의해 상기 유체 플레이트로 옮겨지도록 상기 대량유체 블록 및 상기 유체 플레이트를 정렬시키는 단계; 상기 적어도 하나의 스루 홀을 이용하여 공압 및 유체 플레이트를 정렬시키는 단계를 포함하고, 상기 시약 저장 챔버는 첫번째 또는 두번째 정렬 단계 전에 또는 후에 충전될 수 있고, 상기 미세유체 블록, 유체 및 공압 플레이트는 임의의 차례 또는 순서로 사출 성형될 수 있는 바이오칩의 제조 방법.
  2. 대량유체 블록을 사출 성형시키는 단계로서, 상기 블록은 (i) 적어도 하나의 처리되지 않은 샘플을 수용하기 위한 수단, (ii) 완전히 제조된 바이오칩에서 유체 전달 수단이 유체 플레이트와 유체 소통하도록 위치되고 형성된 유체 전달 수단, 및 (iii) 블록 내의 적어도 하나의 성형된 특징부로서, 상단 및 하단을 갖는 특징부를 포함하는 단계; 제 1 호일 밀봉부를 상기 상단 또는 상기 하단에 결합시켜 개방 말단을 갖는 적어도 하나의 시약 저장 챔버를 형성시키는 단계; 액체 시약으로 상기 적어도 하나의 시약 저장 챔버를 충전시키는 단계; 상기 대량유체 블록에서 제 2 호일 밀봉부를 상기 개방 상단에 결합시켜 적어도 하나의 충전된 시약 저장 챔버를 형성시키는 단계; 상부면 및 하부면을 갖는 상기 유체플레이트를 사출 성형하는 단계로서, 각각의 상기 상부면 및 하부면은 다수의 미세유체 특징부 및 상기 상부면으로부터 상기 하부면으로 연장되어 유체 상부면을 유체 하부면에 연결시키는 적어도 하나의 스루 홀 (through hole)을 포함하고, 상기 다수의 미세유체 특징부 중 둘 이상은 2도 미만의 구배각(draft angle)을 갖는 단계; 상부면 및 하부면을 갖는 공압 플레이트를 사출 성형하는 단계로서, 각각의 상기 상부면 및 하부면은 다수의 미세유체 특징부 및 상기 상부면으로부터 상기 하부면으로 연장되어 공압 상부면을 하부면에 연결시키는 적어도 하나의 스루 홀을 포함하는 단계; 상기 대량유체 블록에서 처리된 완전히 제조된 바이오칩 샘플에서 유체 전달 수단에 의해 상기 유체 플레이트로 옮겨지도록 상기 대량유체 블록 및 상기 유체 플레이트를 정렬시키는 단계; 상기 적어도 하나의 스루 홀을 이용하여 공압 및 유체 플레이트를 정렬시키는 단계를 포함하고, 상기 시약 저장 챔버는 첫번째 또는 두번째 정렬 단계 전에 또는 후에 충전될 수 있고, 상기 미세유체 블록, 유체 및 공압 플레이트는 임의의 차례 또는 순서로 사출 성형될 수 있는 바이오칩의 제조 방법.
  3. 대량유체 블록을 제작하는 단계로서, 상기 블록은 (i) 적어도 하나의 처리되지 않은 샘플을 수용하기 위한 수단, (ii) 완전히 제조된 바이오칩에서 유체 전달 수단이 유체 플레이트와 유체 소통하도록 위치되고 형성된 유체 전달 수단, 및 (iii) 블록 내의 적어도 하나의 성형된 특징부로서, 상단 및 하단을 갖는 특징부를 포함하는 단계; 제 1 호일 밀봉부를 상기 상단 또는 상기 하단에 결합시켜 개방 말단을 갖는 적어도 하나의 시약 저장 챔버를 형성시키는 단계; 액체 시약으로 상기 적어도 하나의 시약 저장 챔버를 충전시키는 단계; 상기 대량유체 블록에서 제 2 호일 밀봉부를 상기 개방 상단에 결합시켜 적어도 하나의 충전된 시약 저장 챔버를 형성시키는 단계; 상부면 및 하부면을 갖는 상기 유체플레이트를 제작하는 단계로서, 각각의 상기 상부면 및 하부면은 적어도 하나의 미세유체 특징부 및 상기 상부면으로부터 상기 하부면으로 연장되어 상부면을 하부면에 연결시키는 적어도 하나의 스루 홀 (through hole)을 포함하는 단계; 공압 상부면, 공압 하부면 및 공압 상부면으로부터 공압 하부면으로 연장되어 공압 상부면을 하부면에 연결시키는 적어도 하나의 스루 홀을 함유하도록 공압 플레이트를 제작하는 단계로서, 각각의 공압 상부면 및 하부면은 다수의 미세유체 특징부를 포함하는 단계; 상기 대량유체 블록에서 처리된 완전히 제조된 바이오칩 샘플에서 유체 전달 수단에 의해 상기 유체 플레이트로 옮겨지도록 상기 대량유체 블록 및 상기 유체 플레이트를 정렬시키는 단계; 상기 적어도 하나의 스루 홀을 이용하여 공압 및 유체 플레이트를 정렬시키는 단계를 포함하고, 적어도 하나의 미세유체 블록, 유체 플레이트 또는 공압 플레이트가 사출 성형에 의해 제작되는 바이오칩의 제조 방법.
  4. 대량유체 블록을 사출 성형시키는 단계로서, 상기 블록은 (i) 적어도 하나의 처리되지 않은 샘플을 수용하기 위한 수단, (ii) 완전히 제조된 바이오칩에서 유체 전달 수단이 유체 플레이트와 유체 소통하도록 위치되고 형성된 유체 전달 수단, 및 (iii) 블록 내의 적어도 하나의 성형된 특징부로서, 상단 및 하단을 갖는 특징부를 포함하는 단계; 제 1 호일 밀봉부를 상기 상단 또는 상기 하단에 결합시켜 개방 말단을 갖는 적어도 하나의 시약 저장 챔버를 형성시키는 단계; 액체 시약으로 상기 적어도 하나의 시약 저장 챔버를 충전시키는 단계; 상기 대량유체 블록에서 제 2 호일 밀봉부를 상기 개방 상단에 결합시켜 적어도 하나의 충전된 시약 저장 챔버를 형성시키는 단계; 상부면 및 하부면을 갖는 상기 유체플레이트를 사출 성형하는 단계로서, 각각의 상기 상부면 및 하부면은 다수의 미세유체 특징부 및 상기 상부면으로부터 상기 하부면으로 연장되어 유체 상부면을 하부면에 연결시키는 적어도 하나의 스루 홀 (through hole)을 포함하는 단계; 상부면 및 하부면을 갖는 공압 플레이트를 사출 성형하는 단계로서, 각각의 상기 상부면 및 하부면은 다수의 미세유체 특징부 및 상기 상부면으로부터 상기 하부면으로 연장되어 공압 상부면을 하부면에 연결시키는 적어도 하나의 스루 홀을 포함하고, 상기 다수의 미세유체 특징부 중 둘 이상은 2도 미만의 구배각(draft angle)을 갖는 단계; 상기 대량유체 블록에서 처리된 완전히 제조된 바이오칩 샘플에서 유체 전달 수단에 의해 상기 유체 플레이트로 옮겨지도록 상기 대량유체 블록 및 상기 유체 플레이트를 정렬시키는 단계; 상기 적어도 하나의 스루 홀을 이용하여 공압 및 유체 플레이트를 정렬시키는 단계를 포함하고, 상기 시약 저장 챔버는 첫번째 또는 두번째 정렬 단계 전에 또는 후에 충전될 수 있고, 상기 미세유체 블록, 유체 및 공압 플레이트는 임의의 차례 또는 순서로 사출 성형될 수 있는 바이오칩의 제조 방법.
  5. 대량유체 블록을 사출 성형시키는 단계로서, 상기 블록은 (i) 적어도 하나의 처리되지 않은 샘플을 수용하기 위한 수단, (ii) 완전히 제조된 바이오칩에서 유체 전달 수단이 유체 플레이트와 유체 소통하도록 위치되고 형성된 유체 전달 수단, 및 (iii) 블록 내의 적어도 하나의 성형된 특징부로서, 상단 및 하단을 갖는 특징부를 포함하는 단계; 제 1 호일 밀봉부를 상기 상단 또는 상기 하단에 결합시켜 개방 말단을 갖는 적어도 하나의 시약 저장 챔버를 형성시키는 단계; 액체 시약으로 상기 적어도 하나의 시약 저장 챔버를 충전시키는 단계; 상기 대량유체 블록에서 제 2 호일 밀봉부를 상기 개방 상단에 결합시켜 적어도 하나의 충전된 시약 저장 챔버를 형성시키는 단계; 상부면 및 하부면을 갖는 상기 유체플레이트를 사출 성형하는 단계로서, 각각의 상기 상부면 및 하부면은 다수의 미세유체 특징부 및 상기 상부면으로부터 상기 하부면으로 연장되어 유체 상부면을 유체 하부면에 연결시키는 적어도 하나의 스루 홀 (through hole)을 포함하고, 상기 표면 중 적어도 하나가 다수의 미세유체 특징부 중 둘 이상이 1.00 mm이상의 피치(pitch)인 1 cm2이상의 영역을 포함하는 단계; 상부면 및 하부면을 갖는 공압 플레이트를 사출 성형하는 단계로서, 각각의 상기 상부면 및 하부면은 다수의 미세유체 특징부 및 상기 상부면으로부터 상기 하부면으로 연장되어 공압 상부면을 하부면에 연결시키는 적어도 하나의 스루 홀을 포함하는 단계; 상기 대량유체 블록에서 처리된 완전히 제조된 바이오칩 샘플에서 유체 전달 수단에 의해 상기 유체 플레이트로 옮겨지도록 상기 대량유체 블록 및 상기 유체 플레이트를 정렬시키는 단계; 상기 적어도 하나의 스루 홀을 이용하여 공압 및 유체 플레이트를 정렬시키는 단계를 포함하고, 상기 시약 저장 챔버는 첫번째 또는 두번째 정렬 단계 전에 또는 후에 충전될 수 있고, 상기 미세유체 블록, 유체 및 공압 플레이트는 임의의 차례 또는 순서로 사출 성형될 수 있는 바이오칩의 제조 방법.
  6. 대량유체 블록을 사출 성형시키는 단계로서, 상기 블록은 (i) 적어도 하나의 처리되지 않은 샘플을 수용하기 위한 수단, (ii) 완전히 제조된 바이오칩에서 유체 전달 수단이 유체 플레이트와 유체 소통하도록 위치되고 형성된 유체 전달 수단, 및 (iii) 블록 내의 적어도 하나의 성형된 특징부로서, 상단 및 하단을 갖는 특징부를 포함하는 단계; 제 1 호일 밀봉부를 상기 상단 또는 상기 하단에 결합시켜 개방 말단을 갖는 적어도 하나의 시약 저장 챔버를 형성시키는 단계; 액체 시약으로 상기 적어도 하나의 시약 저장 챔버를 충전시키는 단계; 상기 대량유체 블록에서 제 2 호일 밀봉부를 상기 개방 상단에 결합시켜 적어도 하나의 충전된 시약 저장 챔버를 형성시키는 단계; 상부면 및 하부면을 갖는 상기 유체플레이트를 사출 성형하는 단계로서, 각각의 상기 상부면 및 하부면은 다수의 미세유체 특징부 및 상기 상부면으로부터 상기 하부면으로 연장되어 유체 상부면을 하부면에 연결시키는 적어도 하나의 스루 홀 (through hole)을 포함하는 단계; 상부면 및 하부면을 갖는 공압 플레이트를 사출 성형하는 단계로서, 각각의 상기 상부면 및 하부면은 다수의 미세유체 특징부 및 상기 상부면으로부터 상기 하부면으로 연장되어 공압 상부면을 공압 하부면에 연결시키는 적어도 하나의 스루 홀을 포함하고, 상기 표면 중 적어도 하나는 다수의 미세유체 특징부 중 둘 이상이 1.00 mm이상의 피치(pitch)인 1 cm2이상의 영역을 포함하는 단계; 상기 대량유체 블록에서 처리된 완전히 제조된 바이오칩 샘플에서 유체 전달 수단에 의해 상기 유체 플레이트로 옮겨지도록 상기 대량유체 블록 및 상기 유체 플레이트를 정렬시키는 단계; 상기 적어도 하나의 스루 홀을 이용하여 공압 및 유체 플레이트를 정렬시키는 단계를 포함하고, 상기 시약 저장 챔버는 첫번째 또는 두번째 정렬 단계 전에 또는 후에 충전될 수 있고, 상기 미세유체 블록, 유체 및 공압 플레이트는 임의의 차례 또는 순서로 사출 성형될 수 있는 바이오칩의 제조 방법.
  7. 대량유체 블록을 사출 성형시키는 단계로서, 상기 블록은 (i) 적어도 하나의 처리되지 않은 샘플을 수용하기 위한 수단, (ii) 완전히 제조된 바이오칩에서 유체 전달 수단이 유체 플레이트와 유체 소통하도록 위치되고 형성된 유체 전달 수단, (iii) 블록 내의 적어도 하나의 성형된 특징부로서, 상단 및 하단을 갖는 상기 특징부, 및 (iv) 다수의 미세유체 특징부 중 둘 이상이 1.00 mm이상의 피치(pitch)인 1 cm2이상의 영역 내 다수의 미세유체 특징부를 포함하는 단계; 제 1 호일 밀봉부를 상기 상단 또는 상기 하단에 결합시켜 개방 말단을 갖는 적어도 하나의 시약 저장 챔버를 형성시키는 단계; 액체 시약으로 상기 적어도 하나의 시약 저장 챔버를 충전시키는 단계; 상기 대량유체 블록에서 제 2 호일 밀봉부를 상기 개방 상단에 결합시켜 적어도 하나의 충전된 시약 저장 챔버를 형성시키는 단계; 상부면 및 하부면을 갖는 상기 유체플레이트를 사출 성형하는 단계로서, 각각의 상기 상부면 및 하부면은 다수의 미세유체 특징부 및 상기 상부면으로부터 상기 하부면으로 연장되어 유체 상부면을 하부면에 연결시키는 적어도 하나의 스루 홀 (through hole)을 포함하는 단계; 상부면 및 하부면을 갖는 공압 플레이트를 사출 성형하는 단계로서, 각각의 상기 상부면 및 하부면은 다수의 미세유체 특징부 및 상기 상부면으로부터 상기 하부면으로 연장되어 공압 상부면을 하부면에 연결시키는 적어도 하나의 스루 홀을 포함하는 단계; 상기 대량유체 블록에서 처리된 완전히 제조된 바이오칩 샘플에서 유체 전달 수단에 의해 상기 유체 플레이트로 옮겨지도록 상기 대량유체 블록 및 상기 유체 플레이트를 정렬시키는 단계; 상기 적어도 하나의 스루 홀을 이용하여 공압 및 유체 플레이트를 정렬시키는 단계를 포함하고, 상기 시약 저장 챔버는 첫번째 또는 두번째 정렬 단계 전에 또는 후에 충전될 수 있고, 상기 미세유체 블록, 유체 및 공압 플레이트는 임의의 차례 또는 순서로 사출 성형될 수 있는 바이오칩의 제조 방법.
  8. 대량유체 블록을 제작하는 단계로서, 상기 블록은 (i) 적어도 하나의 처리되지 않은 샘플을 수용하기 위한 수단, (ii) 완전히 제조된 바이오칩에서 유체 전달 수단이 유체 플레이트와 유체 소통하도록 위치되고 형성된 유체 전달 수단, 및 (iii) 블록 내의 적어도 하나의 성형된 특징부로서, 상단 및 하단을 갖는 특징부를 포함하는 단계; 제 1 호일 밀봉부를 상기 상단 또는 상기 하단에 결합시켜 개방 말단을 갖는 적어도 하나의 시약 저장 챔버를 형성시키는 단계; 액체 시약으로 상기 적어도 하나의 시약 저장 챔버를 충전시키는 단계; 상기 대량유체 블록에서 제 2 호일 밀봉부를 상기 개방 상단에 결합시켜 적어도 하나의 충전된 시약 저장 챔버를 형성시키는 단계; 상부면 및 하부면을 갖는 상기 유체플레이트를 제작하는 단계로서, 각각의 상부면 및 하부면은 적어도 하나의 미세유체 특징부를 포함하고, 유체 상부면, 유체 하부면 및 상기 상부면으로부터 상기 하부면으로 연장되어 상부면을 하부면에 연결시키는 적어도 하나의 스루 홀 (through hole)을 함유하도록 상기 유체플레이트를 제작하는 단계; 공압 상부면, 공압 하부면 및 공압 상부면으로부터 공압 하부면으로 연장되어 공압 상부면을 하부면에 연결시키는 적어도 하나의 스루 홀을 함유하도록 공압 플레이트를 제작하는 단계로서 각각의 공압 상부면 및 하부면은 다수의 미세유체 특징부를 포함하는 단계; 상기 대량유체 블록에서 처리된 완전히 제조된 바이오칩 샘플에서 유체 전달 수단에 의해 상기 유체 플레이트로 옮겨지도록 상기 대량유체 블록 및 상기 유체 플레이트를 정렬시키는 단계; 상기 적어도 하나의 스루 홀을 이용하여 공압 및 유체 플레이트를 정렬시키는 단계를 포함하고, 적어도 하나의 미세유체 블록, 유체 플레이트 또는 공압 플레이트가 사출성형에 의해 제작되고, 적어도 하나의 사출 성형된 부분이 1.00 mm이상의 피치(pitch)에서 둘 이상의 미세유체 특징부를 함유하는 1 cm2이상의 영역을 갖는 바이오칩의 제조 방법.
  9. (a) 인터페이스에서 20 내지 500 psig의 압력을 공급하기 위한 공압 서브시스템을 갖는 기계; 및
    (b) 상단 및 하단; 하단에 결합된 제 1 호일 밀봉부; 상단에 결합된 제 2 호일 밀봉부; 및 공압(pneumatic) 입구를 갖는 미리 로딩된 시약 저장 챔버를 포함하는 상기 기계로의 삽입을 위한 바이오칩을 포함하고, 상기 인터페이스는 상기 기계로부터 20 내지 500 psig의 압력을 수용하고 이를 상기 상단에 전달하여 상기 제 1 및 제 2 호일이 파열되어 시약 저장 챔버의 내용물이 방출되도록 위치되고 형성된 장치.
  10. 제 9항에 있어서, 호일 밀봉부 중 하나 또는 둘 모두가 스코어링(scoring)되는 장치.
  11. 제 10항에 있어서, 유체 서브어셈블리에 연결된 장치.
  12. 제 11항에 있어서, 파열 전에 스페이서 플레이트가 제 1 호일의 팽창을 수용하기 위해 크기 조절되도록, 용기와 유체 서브어셈블리 사이에 배치되는 스페이서 플레이트를 제공하는 것을 추가로 포함하는 장치.
  13. 제 9항에 있어서, 시약 저장 챔버가 적어도 하나의 밀봉된 미리 로딩된 시약 튜브를 함유하는 장치.
  14. 제 9항에 있어서, 시약 저장 챔버가 튜브 내 튜브 구조인 장치.
  15. 제 9항에 있어서, 시약 저장 챔버가 단일 튜브 구조인 장치.
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 삭제
  37. 삭제
  38. 삭제
  39. 삭제
  40. 삭제
  41. 삭제
  42. 삭제
  43. 삭제
  44. 삭제
  45. 삭제
  46. 삭제
  47. 삭제
  48. 삭제
  49. 삭제
  50. 삭제
KR1020127026428A 2010-03-09 2011-03-09 샘플 투입 및 결과 발생 처리를 제공하기 위한 단일한 바이오칩 및 이의 제조 방법 KR101796110B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US33974310P 2010-03-09 2010-03-09
US61/339,743 2010-03-09
PCT/US2011/027787 WO2011112746A2 (en) 2010-03-09 2011-03-09 Unitary biochip providing sample-in to results-out processing and methods of manufacture

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020177031928A Division KR101951906B1 (ko) 2010-03-09 2011-03-09 샘플 투입 및 결과 발생 처리를 제공하기 위한 단일한 바이오칩 및 이의 제조 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20130051439A KR20130051439A (ko) 2013-05-20
KR101796110B1 true KR101796110B1 (ko) 2017-11-10

Family

ID=44120911

Family Applications (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020197004937A KR102027441B1 (ko) 2010-03-09 2011-03-09 샘플 투입 및 결과 발생 처리를 제공하기 위한 단일한 바이오칩 및 이의 제조 방법
KR1020127026428A KR101796110B1 (ko) 2010-03-09 2011-03-09 샘플 투입 및 결과 발생 처리를 제공하기 위한 단일한 바이오칩 및 이의 제조 방법
KR1020197028003A KR20190111165A (ko) 2010-03-09 2011-03-09 샘플 투입 및 결과 발생 처리를 제공하기 위한 단일한 바이오칩 및 이의 제조 방법
KR1020177031928A KR101951906B1 (ko) 2010-03-09 2011-03-09 샘플 투입 및 결과 발생 처리를 제공하기 위한 단일한 바이오칩 및 이의 제조 방법

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020197004937A KR102027441B1 (ko) 2010-03-09 2011-03-09 샘플 투입 및 결과 발생 처리를 제공하기 위한 단일한 바이오칩 및 이의 제조 방법

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020197028003A KR20190111165A (ko) 2010-03-09 2011-03-09 샘플 투입 및 결과 발생 처리를 제공하기 위한 단일한 바이오칩 및 이의 제조 방법
KR1020177031928A KR101951906B1 (ko) 2010-03-09 2011-03-09 샘플 투입 및 결과 발생 처리를 제공하기 위한 단일한 바이오칩 및 이의 제조 방법

Country Status (10)

Country Link
US (1) US9354199B2 (ko)
EP (4) EP4124857A1 (ko)
JP (7) JP5815572B2 (ko)
KR (4) KR102027441B1 (ko)
CN (1) CN103097883B (ko)
AU (1) AU2011224387B2 (ko)
CA (1) CA2792249C (ko)
ES (2) ES2798099T3 (ko)
NZ (2) NZ702814A (ko)
WO (1) WO2011112746A2 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102022111890B3 (de) 2022-05-12 2023-03-16 Dermagnostix GmbH Verfahren zur Deparaffinierung von Formalin-fixiertem Paraffin-eingebettetem Gewebe

Families Citing this family (64)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008030631A2 (en) 2006-02-03 2008-03-13 Microchip Biotechnologies, Inc. Microfluidic devices
US20090047673A1 (en) 2006-08-22 2009-02-19 Cary Robert B Miniaturized lateral flow device for rapid and sensitive detection of proteins or nucleic acids
CA2984820C (en) 2007-04-04 2021-12-07 Ande Corporation Plastic microfluidic separation and detection platforms
EP2279403B1 (en) 2008-05-05 2016-03-16 Los Alamos National Security, LLC Highly simplified lateral flow-based nucleic acid sample preparation and passive fluid flow control
JP2012529908A (ja) 2009-06-15 2012-11-29 ネットバイオ・インコーポレーテッド 法医学的ｄｎａの定量化のための改善された方法
US8720036B2 (en) 2010-03-09 2014-05-13 Netbio, Inc. Unitary biochip providing sample-in to results-out processing and methods of manufacture
DK2699700T3 (en) 2011-04-20 2016-08-01 Mesa Biotech Inc Integrated device for nukleinsyreregistrering and identification
US9207690B2 (en) * 2011-09-23 2015-12-08 Analogic Corporation Thermal cycling
US10845277B2 (en) * 2012-10-18 2020-11-24 Innovaprep, Llc Liquid to liquid biological particle fractionation and concentration
JP2014124097A (ja) * 2012-12-25 2014-07-07 Hitachi High-Technologies Corp 核酸分析用カートリッジ及び核酸分析装置
GB2516666B (en) * 2013-07-29 2015-09-09 Atlas Genetics Ltd Fluidic cartridge for nucleic acid amplification and detection
CN105873681B (zh) 2013-11-18 2019-10-11 尹特根埃克斯有限公司 用于样本分析的卡盒和仪器
GB201401584D0 (en) * 2014-01-29 2014-03-19 Bg Res Ltd Intelligent detection of biological entities
JP6500349B2 (ja) * 2014-06-03 2019-04-17 株式会社島津製作所 培地用バルブ及びこれを備えた培地供給システム
US10870845B2 (en) 2014-07-01 2020-12-22 Global Life Sciences Solutions Operations UK Ltd Methods for capturing nucleic acids
US10472620B2 (en) 2014-07-01 2019-11-12 General Electric Company Method, substrate and device for separating nucleic acids
US9593368B2 (en) * 2014-07-01 2017-03-14 General Electric Company Methods for amplifying nucleic acids on substrates
WO2016025332A1 (en) * 2014-08-12 2016-02-18 President And Fellows Of Harvard College System and method for monitoring health based on collected bodily fluid
EP3190169A4 (en) 2014-09-02 2018-03-21 Toshiba Medical Systems Corporation Nucleic acid detection cassette
CA2987633A1 (en) 2015-06-02 2016-12-08 Biofire Defense, Llc Sample to sequence
WO2017146062A1 (ja) 2016-02-22 2017-08-31 日本電気株式会社 マイクロチップ
WO2017180909A1 (en) 2016-04-13 2017-10-19 Nextgen Jane, Inc. Sample collection and preservation devices, systems and methods
JP6613212B2 (ja) 2016-07-25 2019-11-27 株式会社日立ハイテクノロジーズ 気泡除去構造、及び気泡除去方法
GB2554377A (en) * 2016-09-23 2018-04-04 Dnanudge Ltd Method and apparatus for analysing a biological sample
EP3523036A1 (en) * 2016-10-07 2019-08-14 Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH Analysis device and method for testing a sample
EP3984642B1 (en) * 2016-11-17 2023-09-06 Combinati Incorporated Methods and systems for nucleic acid analysis and quantification
EP3338889A1 (en) 2016-12-23 2018-06-27 IMEC vzw Combined extraction and pcr systems
US11168318B2 (en) 2017-02-15 2021-11-09 Ande Corporation Systems and methods for rapid nucleic acid extraction, purification and analysis from bone and tooth
US11900604B2 (en) 2017-07-12 2024-02-13 Ande Corporation Adaptive expert system for analysis and classification of DNA sample data
TWI741658B (zh) 2018-01-24 2021-10-01 美商伊路米納有限公司 流體緩衝
WO2020028273A1 (en) 2018-07-30 2020-02-06 Ande Corporation Multiplexed fuel analysis
US10467679B1 (en) 2019-04-15 2019-11-05 Dnanudge Limited Product recommendation device and method
US20220042884A1 (en) * 2019-01-15 2022-02-10 Essenlix Corporation Devices and methods for tissue and cell staining (ii)
JP2020146308A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146298A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146297A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146299A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146303A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146300A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146302A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146313A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146309A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146314A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146301A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146312A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146318A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146317A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146307A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146311A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146306A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146310A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146304A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146315A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146316A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
US10811140B2 (en) 2019-03-19 2020-10-20 Dnanudge Limited Secure set-up of genetic related user account
US10699806B1 (en) 2019-04-15 2020-06-30 Dnanudge Limited Monitoring system, wearable monitoring device and method
USD975312S1 (en) 2020-02-14 2023-01-10 Beckman Coulter, Inc. Reagent cartridge
WO2022070662A1 (ja) * 2020-09-29 2022-04-07 富士フイルム株式会社 検査容器、検査装置及び核酸検査方法
GB2613115A (en) * 2020-10-06 2023-05-24 Hitachi High Tech Corp Sample processing device, sample processing apparatus, and sample processing method
KR20230121089A (ko) * 2020-12-15 2023-08-17 바이오메센스 인크. 대변 샘플을 처리하기 위한 시스템 및 방법
TWI757167B (zh) 2021-05-04 2022-03-01 國立清華大學 擾流穩定晶片、液滴生成系統及液滴製備方法
WO2023288079A2 (en) * 2021-07-16 2023-01-19 Janus-I Science Inc. Breathalyzer system for detection of respiratory pathogens
CN113878818B (zh) * 2021-09-29 2024-03-26 重庆佳鑫一帆科技有限公司 一种医疗外壳具有除气泡功能的成型设备
WO2024040223A1 (en) * 2022-08-18 2024-02-22 Cerillo Inc Manufacturable co-culture module

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008513022A (ja) 2004-09-15 2008-05-01 マイクロチップ バイオテクノロジーズ， インコーポレイテッド マイクロ流体デバイス
JP2008151770A (ja) 2006-11-22 2008-07-03 Fujifilm Corp マイクロ流路チップ
WO2008087405A1 (en) 2007-01-16 2008-07-24 Lab 901 Limited Microfluidic device
WO2009049268A1 (en) * 2007-10-12 2009-04-16 Rheonix, Inc. Integrated microfluidic device and methods

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6375817B1 (en) * 1999-04-16 2002-04-23 Perseptive Biosystems, Inc. Apparatus and methods for sample analysis
GB0129816D0 (en) * 2001-12-13 2002-01-30 The Technology Partnership Plc Testing device for chemical or biochemical analysis
US7279134B2 (en) * 2002-09-17 2007-10-09 Intel Corporation Microfluidic devices with porous membranes for molecular sieving, metering, and separations
US7435381B2 (en) * 2003-05-29 2008-10-14 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Packaging of microfluidic devices
KR20060069825A (ko) 2003-08-01 2006-06-22 제넨테크, 인크. 제한된 다양성을 갖는 항체 ｃｄｒ 폴리펩티드 서열
DE10344229A1 (de) * 2003-09-24 2005-05-19 Steag Microparts Gmbh Mikrostruktuierte Vorrichtung zum entnehmbaren Speichern von kleinen Flüssigkeitsmengen und Verfahren zum Entnehmen der in dieser Vorrichtung gespeicherten Flüssigkeit
US20050164373A1 (en) * 2004-01-22 2005-07-28 Oldham Mark F. Diffusion-aided loading system for microfluidic devices
US7832429B2 (en) * 2004-10-13 2010-11-16 Rheonix, Inc. Microfluidic pump and valve structures and fabrication methods
WO2006119280A2 (en) * 2005-05-03 2006-11-09 Handylab, Inc. Lyophilized pellets
US8206974B2 (en) * 2005-05-19 2012-06-26 Netbio, Inc. Ruggedized apparatus for analysis of nucleic acid and proteins
CN101248191A (zh) * 2005-07-06 2008-08-20 生物芯片创新控股有限公司 分析靶核酸序列的方法与试剂盒
US7976795B2 (en) * 2006-01-19 2011-07-12 Rheonix, Inc. Microfluidic systems
JP5415253B2 (ja) * 2006-03-24 2014-02-12 ハンディラブ・インコーポレーテッド 微小流体サンプルを処理するための一体化システム及びその使用方法
US7998708B2 (en) * 2006-03-24 2011-08-16 Handylab, Inc. Microfluidic system for amplifying and detecting polynucleotides in parallel
FR2907374B1 (fr) 2006-10-23 2010-04-30 Ldl Tech Dispositif de fixation mecanique sur jante d'un capteur pour pneumatiques.
US8691592B2 (en) * 2006-12-14 2014-04-08 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Mechanically actuated diagnostic device
CA2984820C (en) * 2007-04-04 2021-12-07 Ande Corporation Plastic microfluidic separation and detection platforms
DE102007027370A1 (de) * 2007-06-11 2008-12-18 Wilo Ag Laufrad aus flächigem Material
JP4766011B2 (ja) 2007-06-20 2011-09-07 セイコーエプソン株式会社 流体噴射装置およびその製造方法
SE0701839L (sv) 2007-08-08 2008-12-16 Purus Ab Avlopp
US8245378B2 (en) * 2007-09-13 2012-08-21 Nike, Inc. Method and apparatus for manufacturing components used for the manufacture of articles
US20120115212A1 (en) * 2007-10-22 2012-05-10 Bernhard Weigl Assay Tube
KR20090079032A (ko) * 2008-01-16 2009-07-21 삼성전자주식회사 혈액 생화학 반응을 위한 미세유동장치에 액상 시약을저장하는 방법
WO2009108260A2 (en) * 2008-01-22 2009-09-03 Microchip Biotechnologies, Inc. Universal sample preparation system and use in an integrated analysis system
KR100960066B1 (ko) * 2008-05-14 2010-05-31 삼성전자주식회사 동결건조시약이 저장된 미세유동장치 및 이를 이용한시료분석방법
EP2198964B8 (de) * 2008-11-06 2013-04-24 F. Hoffmann-La Roche AG Verfahren zum Bereitstellen eines getrockneten Reagenz in einem mikrofluidischen System
US9012208B2 (en) * 2009-02-03 2015-04-21 Netbio, Inc. Nucleic acid purification
US8074608B1 (en) 2010-06-09 2011-12-13 Smith David L Cat climbing apparatus

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008513022A (ja) 2004-09-15 2008-05-01 マイクロチップ バイオテクノロジーズ， インコーポレイテッド マイクロ流体デバイス
JP2008151770A (ja) 2006-11-22 2008-07-03 Fujifilm Corp マイクロ流路チップ
WO2008087405A1 (en) 2007-01-16 2008-07-24 Lab 901 Limited Microfluidic device
WO2009049268A1 (en) * 2007-10-12 2009-04-16 Rheonix, Inc. Integrated microfluidic device and methods

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102022111890B3 (de) 2022-05-12 2023-03-16 Dermagnostix GmbH Verfahren zur Deparaffinierung von Formalin-fixiertem Paraffin-eingebettetem Gewebe
WO2023217310A1 (de) 2022-05-12 2023-11-16 Dermagnostix GmbH Verfahren zur deparaffinierung von formalin-fixiertem paraffin-eingebettetem gewebe

Also Published As

Publication number Publication date
ES2798099T3 (es) 2020-12-09
EP3690433A1 (en) 2020-08-05
JP2019030302A (ja) 2019-02-28
KR20190032460A (ko) 2019-03-27
EP4124857A1 (en) 2023-02-01
EP4124856A1 (en) 2023-02-01
JP2019058172A (ja) 2019-04-18
JP2017200481A (ja) 2017-11-09
CA2792249C (en) 2021-05-04
NZ702814A (en) 2016-07-29
JP6151311B2 (ja) 2017-06-21
WO2011112746A3 (en) 2012-01-12
EP3690433B9 (en) 2022-12-21
JP2020141679A (ja) 2020-09-10
CN103097883A (zh) 2013-05-08
EP3690433B1 (en) 2022-08-17
CN103097883B (zh) 2016-03-02
EP2545365B1 (en) 2020-04-29
JP6429940B2 (ja) 2018-11-28
EP2545365A2 (en) 2013-01-16
NZ721912A (en) 2018-01-26
KR101951906B1 (ko) 2019-05-31
JP6698770B2 (ja) 2020-05-27
JP7023312B2 (ja) 2022-02-21
WO2011112746A2 (en) 2011-09-15
AU2011224387B2 (en) 2015-12-24
US20110220502A1 (en) 2011-09-15
US9354199B2 (en) 2016-05-31
KR102027441B1 (ko) 2019-10-01
JP2013521780A (ja) 2013-06-13
JP2016005458A (ja) 2016-01-14
AU2011224387A1 (en) 2012-10-04
CA2792249A1 (en) 2011-09-15
KR20130051439A (ko) 2013-05-20
KR20170142991A (ko) 2017-12-28
JP6698786B2 (ja) 2020-05-27
KR20190111165A (ko) 2019-10-01
JP6654681B2 (ja) 2020-02-26
JP2019047799A (ja) 2019-03-28
JP5815572B2 (ja) 2015-11-17
ES2930133T3 (es) 2022-12-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101796110B1 (ko) 샘플 투입 및 결과 발생 처리를 제공하기 위한 단일한 바이오칩 및 이의 제조 방법
US20230256451A1 (en) Unitary Biochip Providing Sample-in to Results-Out Processing and Methods of Manufacture
AU2020202163A1 (en) Unitary biochip providing sample-in to results-out processing and methods of manufacture
AU2013204387B2 (en) Unitary biochip providing sample-in to results-out processing and methods of manufacture

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant