KR101777468B1 - Emp2 유전자가 결여된 폐암 유발 동물모델의 제조방법 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 상피막단백질 2(Epithelial membrane protein 2; EMP2) 유전자를 이용한 폐암 유발 동물모델의 제조 방법 및 이의 용도에 관한 것이다. 상기 방법에 의해 제조된 동물모델에서, 폐암 유발 효과뿐만 아니라, 폐로의 암 전이 촉진 효과를 확인하였는바, 본 발명의 동물모델을 이용하여 폐암 치료를 위한 후보약물 스크리닝 등의 임상적 연구에 다각적으로 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 EMP2 유전자의 결여를 통한 폐암 유발 동물모델의 제조방법으로서, 보다 구체적으로는 폐암의 유발 및 폐로의 전이가 촉진된 폐암 질환 동물모델의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
전 세계적으로 폐암(lung cancer)은 남녀 모두의 성별에서 두 번째로 흔히 발생하는 암으로서, 모든 암에서 15%를 차지한다. 2011년 미국 암 학회(American cancer society)의 보고에 따르면, 한 해 22만건 이상이 폐암으로 진단을 받으며, 이 중 약 70%가 사망에 이르는데 이는 암 사망률 중에서 27%를 차지한다고 보고된 바 있다.
이러한 폐암은 폐에서 기원한 악성종양인 원발성 폐암과 다른 장기에서 폐로 전이된 폐의 전이암으로 분류되며, 조직형에 따라 크게 소세포 폐암(small cell lung cancer)과 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer)으로 구분한다. 폐암의 치료에 있어서, 초기 비전이성(non-metastatic) 폐암은 화학요법 및 방사선에 대한 민감도가 매우 낮기 때문에 백금을 함유하는 시스플라틴(cisplatin)과 관련된 보조적인 화학요법(ancillary chemotherapy)을 병용하면서 수술적으로 치료하는 반면, 초기 단계를 지나 전이성 폐암인 경우에는 다양한 화학요법 및 방사선 치료가 사용된다.
폐암의 증상은 지속적인 기침, 흉부 통증, 체중감소, 손톱 손상, 관절 통증, 및 호흡의 단기화(shortness of breath) 등이 있으나, 폐암은 일반적으로 천천히 진행되기 때문에 초기에는 그 증상을 거의 보이지 않으므로 폐암의 조기 발견 및 치료가 어렵고, 뼈, 간, 소장, 및 뇌 등 전신에 전이된 후에 발견할 가능성이 높다. 따라서 폐암의 전이 및 그 예후의 조기 진단 방법으로서 종양의 크기, 림프절 전이 유무 등을 조사하거나 폐종양 조직 또는 림프절 등을 생검하여 면역조직화학적 방법으로 분석하고 있으며, 흉부 X-선 촬영, 흉부전산화 단층 촬영, 기관지 내시경 등의 기술을 이용하고 있으나, 높은 발병률과 사망률에도 불구하고 아직 폐암을 완전히 극복할 수 있는 어떠한 유효 약물도 개발되지 않은 실정이다.
이에, 폐암에 대한 효과적인 진단 및 치료에 대한 필요성이 요구되고 있으며, 폐암의 메커니즘 연구와 치료법 연구를 위한 생체 시료 개발을 위하여 적합한 동물모델은 필수적이다. 따라서 최근 원발성 폐암 또는 폐로의 전이암을 발생시킨 동물모델에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있으나(한국 특허공개번호 10-2010-0015667), 아직 미비한 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 상피막단백질 2(Epithelial membrane protein 2; EMP2) 유전자를 넉아웃 시킨 마우스에서, 폐암 유발 효과, 상기 마우스와 암 질환 마우스간 교배를 통해 제조한 마우스에서, 폐 조직 내 종양세포 및 결절의 증가를 확인하고 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.
이에, 본 발명의 목적은 상피막단백질 2(Epithelial membrane protein 2; EMP2) 유전자를 넉아웃시키는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 폐암 질환 동물모델의 제조방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 a) 상피막단백질 2(Epithelial membrane protein 2; EMP2) 유전자가 넉아웃된 동물모델을 제조하는 단계; 및 b) 상기 동물모델과 암 질환 동물모델을 교배시키는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 폐암 질환 동물모델의 제조방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에 의해 제조된 폐암 질환 동물모델을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 동물모델을 이용한 폐암 치료제 후보약물 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상피막단백질 2(Epithelial membrane protein 2; EMP2) 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 암 전이 억제용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상피막단백질 2(Epithelial membrane protein 2; EMP2) 유전자를 넉아웃시키는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 폐암 질환 동물모델의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 a) 상피막단백질 2(Epithelial membrane protein 2; EMP2) 유전자가 넉아웃된 동물모델을 제조하는 단계; 및 b) 상기 동물모델과 암 질환 동물모델을 교배시키는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 폐암 질환 동물모델의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 암 질환 동물모델은 MMTV-PyMT(murine mammary tumor virus-polyoma middle T) 마우스 또는 K-Ras 유전자 돌연변이 마우스(KRASG12D)일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 암은 유방암, 위암, 대장암, 및 췌장암으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 폐암 질환 동물모델을 제공한다.
또한, 본 발명은 a) 상기 동물모델에 시험물질을 처리하는 단계; b) 상기 시험물질을 처리한 동물모델에서 폐암세포의 성장을 측정하는 단계; 및 c) 비처리군과 비교하여 폐암세포의 성장을 억제시키는 물질을 폐암 치료물질로 선정하는 단계를 포함하는 폐암 치료 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상피막단백질 2(Epithelial membrane protein 2; EMP2) 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 암 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 전이 억제방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 암 전이 억제용 조성물 제조를 위한 상피막단백질 2(Epithelial membrane protein 2; EMP2) 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 신규한 용도를 제공한다.
본 발명은 상피막단백질 2(Epithelial membrane protein 2; EMP2) 유전자를 넉아웃시키는 단계 또는 상기 넉아웃 동물모델과 암 질환 동물모델을 교배시키는 단계를 포함하는, 폐암 질환 동물모델의 제조방법으로서, 상기 방법에 의해 제조된 동물모델에서, 폐암 유발 효과뿐만 아니라, 폐로의 암 전이 촉진 효과를 확인하였는바, 폐암 치료를 위한 후보약물 스크리닝등의 임상적 연구에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 EMP2 유전자를 넉아웃(knockout)시키는 과정을 간략하게 나타낸 모식도이다.
도 2는 표적 벡터를 도입한 마우스 배아줄기세포에 대한 EMP2 유전자의 넉아웃 여부를 Southern blot으로 확인한 결과이다.
도 3은 EMP2 넉아웃 마우스의 EMP2 발현여부를 Western blot으로 확인한 결과이다.
도 4는 Urethane 처리에 의해 폐암이 유발된 EMP2 넉아웃 마우스(EMP2 -/-) 및 대조군(EMP2 +/+)의 병리 조직학적 검사결과이다.
도 5는 Urethane 처리에 의해 폐암이 유발된 EMP2 넉아웃 마우스(EMP2 -/-) 및 대조군(WT)간 폐 종양세포 분포를 비교한 결과이다.
도 6은 Urethane 처리에 의해 폐암이 유발된 EMP2 넉아웃 마우스(EMP2 -/-) 및 대조군(WT)간 폐 종양세포 수를 비교한 결과이다.
도 7은 Lewuis lung carcinoma 세포 주입에 의한 EMP2 넉아웃 마우스(EMP2 -/-) 및 대조군(WT)의 폐의 암전이 여부를 육안으로 관찰한 결과이다.
도 8은 Lewuis lung carcinoma 세포 주입에 의한 EMP2 넉아웃 마우스(EMP2 -/-) 및 대조군(WT)간 전이에 의한 폐 종양세포 분포를 비교한 결과이다.
도 9는 Lewuis lung carcinoma 세포 주입에 의한 EMP2 넉아웃 마우스(EMP2 -/-) 및 대조군(WT)간 전이에 의한 폐 결절의 수를 비교한 결과이다.
도 10a는 폐암 질환 마우스(K-Ras/EMP(-/-))와 대조군인 K-ras/EMP(+/+) 마우스의 폐 종양세포 분포를 비교한 결과이다.
도 10b는 폐암 질환 마우스(K-Ras/EMP(-/-))와 대조군인 K-ras/EMP(+/+) 마우스의 폐 결절의 수를 비교한 결과이다.
도 11은 폐암 질환 마우스(K-Ras/EMP(-/-))와 대조군인 K-ras/EMP(+/+) 마우스의 종양세포의 폐 조직 내 침윤을 병리 조직학적으로 확인한 결과이다.
도 12는 암 전이에 의한 폐암 질환 마우스(EMP2(-/-)MMTV-pyMT)와 대조군인 WT/MMTV-PyMT 마우스의 유방암 발생여부를 병리 조직학적으로 확인한 결과이다.
도 13은 암 전이에 의한 폐암 질환 마우스(EMP2(-/-)MMTV-pyMT)와 대조군인 WT/MMTV-PyMT 마우스의 폐 조직내 결절형성을 육안으로 확인한 결과이다.
도 14는 암 전이에 의한 폐암 질환 마우스(EMP2(-/-)MMTV-pyMT)와 대조군인 WT/MMTV-PyMT 마우스의 종양세포의 폐 조직 내 침윤을 병리 조직학적으로 확인한 결과이다.
도 15는 암 전이에 의한 폐암 질환 마우스(EMP2(-/-)MMTV-pyMT)와 대조군인 WT/MMTV-PyMT 마우스의 전이에 의한 폐 종양세포 분포를 비교한 결과이다.
도 16은 암 전이에 의한 폐암 질환 마우스(EMP2(-/-)MMTV-pyMT)와 대조군인 WT/MMTV-PyMT 마우스의 전이에 의한 폐 결절의 수를 비교한 결과이다.
도 2는 표적 벡터를 도입한 마우스 배아줄기세포에 대한 EMP2 유전자의 넉아웃 여부를 Southern blot으로 확인한 결과이다.
도 3은 EMP2 넉아웃 마우스의 EMP2 발현여부를 Western blot으로 확인한 결과이다.
도 4는 Urethane 처리에 의해 폐암이 유발된 EMP2 넉아웃 마우스(EMP2 -/-) 및 대조군(EMP2 +/+)의 병리 조직학적 검사결과이다.
도 5는 Urethane 처리에 의해 폐암이 유발된 EMP2 넉아웃 마우스(EMP2 -/-) 및 대조군(WT)간 폐 종양세포 분포를 비교한 결과이다.
도 6은 Urethane 처리에 의해 폐암이 유발된 EMP2 넉아웃 마우스(EMP2 -/-) 및 대조군(WT)간 폐 종양세포 수를 비교한 결과이다.
도 7은 Lewuis lung carcinoma 세포 주입에 의한 EMP2 넉아웃 마우스(EMP2 -/-) 및 대조군(WT)의 폐의 암전이 여부를 육안으로 관찰한 결과이다.
도 8은 Lewuis lung carcinoma 세포 주입에 의한 EMP2 넉아웃 마우스(EMP2 -/-) 및 대조군(WT)간 전이에 의한 폐 종양세포 분포를 비교한 결과이다.
도 9는 Lewuis lung carcinoma 세포 주입에 의한 EMP2 넉아웃 마우스(EMP2 -/-) 및 대조군(WT)간 전이에 의한 폐 결절의 수를 비교한 결과이다.
도 10a는 폐암 질환 마우스(K-Ras/EMP(-/-))와 대조군인 K-ras/EMP(+/+) 마우스의 폐 종양세포 분포를 비교한 결과이다.
도 10b는 폐암 질환 마우스(K-Ras/EMP(-/-))와 대조군인 K-ras/EMP(+/+) 마우스의 폐 결절의 수를 비교한 결과이다.
도 11은 폐암 질환 마우스(K-Ras/EMP(-/-))와 대조군인 K-ras/EMP(+/+) 마우스의 종양세포의 폐 조직 내 침윤을 병리 조직학적으로 확인한 결과이다.
도 12는 암 전이에 의한 폐암 질환 마우스(EMP2(-/-)MMTV-pyMT)와 대조군인 WT/MMTV-PyMT 마우스의 유방암 발생여부를 병리 조직학적으로 확인한 결과이다.
도 13은 암 전이에 의한 폐암 질환 마우스(EMP2(-/-)MMTV-pyMT)와 대조군인 WT/MMTV-PyMT 마우스의 폐 조직내 결절형성을 육안으로 확인한 결과이다.
도 14는 암 전이에 의한 폐암 질환 마우스(EMP2(-/-)MMTV-pyMT)와 대조군인 WT/MMTV-PyMT 마우스의 종양세포의 폐 조직 내 침윤을 병리 조직학적으로 확인한 결과이다.
도 15는 암 전이에 의한 폐암 질환 마우스(EMP2(-/-)MMTV-pyMT)와 대조군인 WT/MMTV-PyMT 마우스의 전이에 의한 폐 종양세포 분포를 비교한 결과이다.
도 16은 암 전이에 의한 폐암 질환 마우스(EMP2(-/-)MMTV-pyMT)와 대조군인 WT/MMTV-PyMT 마우스의 전이에 의한 폐 결절의 수를 비교한 결과이다.
본 발명자들은, EMP2 유전자를 넉아웃 시킨 마우스에서, 우수한 폐암 유발 효과 및 암 전이능을 확인하였다. 또한, 상기 EMP2 넉아웃 마우스와 암 질환 동물모델(MMTV-PyMT 마우스, K-Ras 유전자 돌연변이 마우스)을 교배시켜 제조한 동물모델에서, 폐조직 내 침윤된 종양세포의 면적 증가 및 폐로의 암 전이능을 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 상피막단백질 2(Epithelial membrane protein 2; EMP2) 유전자를 넉아웃시키는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 폐암 질환 동물모델의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 EMP 2 넉아웃 동물모델과 암 질환 동물모델을 교배시키는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 폐암 질환 동물모델의 제조방법을 제공한다
본 발명에서 넉아웃되는 상피막단백질 2(Epithelial membrane protein 2; EMP 2) 는 GAS3/PMP22(growth arrest specfic gene 3/ peripheral myelin protein-22) 계열의 막 단백질로서, 유방암, 자궁암에서 그 발현이 상승되는 것으로 알려져 있고, 정상 폐조직에서 발현이 높은 것이 알려져 있으나, 폐암 질환에서의 관련성에 대해서는 알려진 바가 없는 실정이다. 이에, 본 발명자들은 이러한 점에 착안하여 EMP2 유전자와 폐암의 발병 및 전이능간 관련성을 새롭게 규명하고자 하였다.
본 발명에서 사용되는 용어, "넉아웃(knock-out)"은 유전자의 부분적, 실질적, 완전한 결실, 침묵(silencing), 비활성화 또는 하향조절 (down-regulation)을 의미하며, 상기 방법에 의해서 EMP2 유전자가 넉아웃된 돌연변이체는 헤테로 돌연변이체(+/-) 역시 포함하며, 이를 통하여 폐암이 유발된 동물모델을 제공한다.
또한, 본 발명의 방법에 의해 유발되는 질병인 "폐암"은 폐 조직 내에 발생하는 악성종양으로서, 폐에서 기원한 악성종양인 원발성 폐암과 다른 장기에서 폐로 전이된 폐의 전이암으로 분류되며, 본 동물모델은 원발성 폐암뿐만아니라, 타 장기로부터 전이된 폐암 질환 동물모델의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 폐암 질환 동물모델을 제공한다. 상기 동물의 종류로는 마우스, 랫트(rat), 소, 말, 돼지, 원숭이, 오리, 개, 고양이 등이 될 수 있고, 마우스인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
아울러, 본 발명에서 암 질환 동물모델은 바람직하게는 MMTV-PyMT(murine mammary tumor virus-polyoma middle T) 마우스 또는 K-Ras 유전자 돌연변이 마우스(KRASG12D) 일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, "전이"는 초기 종양세포로부터 전이성 암세포가 떨어져나와 정상 조직의 간질성 기질 (interstitial stroma)과 기저막 (basal membrane, BM)과 같은 세포외 기질 (extracellular matrix, ECM)을 침윤 (invasion)하여 혈관이나 림프관으로 들어간 다음 다른 목표 조직의 모세혈관벽에 부착되고 세포의 기질과 기저막을 통하여 모세관으로부터 침출하여 새로운 조직에서 증식하는 과정을 통하여, 암세포가 증식하는 것을 일컬으며, 본 발명에서, 상기 목표조직은 폐 조직을 의미하며, 초기 종양세포는 바람직하게는 유방암, 위암, 대장암, 또는 췌장암 세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서는 EMP2 유전자를 넉아웃 시킨 마우스에서 대조군과 비교하여 우수한 폐암 유발 효과 및 암 전이능을 확인하였으며(실시예 1 및 2 참조), 상기 넉아웃 마우스와 암 질환 마우스(MMTV-PyMT 마우스), K-Ras 유전자 돌연변이 마우스(KRASG12D) 등을 각각 교배시켜 제조한 동물모델에서도 폐조직 내 침윤된 종양세포의 면적 및 결절이 유의적으로 증가하였는바, 상기 동물모델을 이용하여 폐암의 치료 및 연구에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다(실시예 3 참조).
이에, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 동물모델을 이용한 폐암 치료제 후보약물 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 스크리닝 방법은 a) 상기 동물모델에 시험물질을 처리하는 단계; b) 상기 시험물질을 처리한 동물모델에 폐암세포의 성장을 측정하는 단계; 및 c) 비처리군과 비교하여 폐암세포의 성장을 억제시키는 물질을 폐암 치료물질로 선정하는 단계를 포함할 수 있으며, 상기 후보약물은 천연화합물, 합성화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아 또는 진균의 대사 산물 및 생활성 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 양태로서, 상피막단백질 2(Epithelial membrane protein 2; EMP2) 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 암 전이 억제용 약학적 조성물 및 이를 이용한 암 전이 억제방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. EMP2 넉아웃(knockout)에 의한 폐암 질환 마우스의 제조 및 검증
본 실시예에서는 EMP2 유전자와 폐암의 발생 또는 전이와의 관련성을 조사하기 위해서, EMP2 유전자를 넉아웃시킨 벡터를 이용한 형질전환 마우스를 제조하였다.
보다 구체적으로, 도 1에 나타낸 바와 같이, EMP2 유전자는 Exon 1(서열번호 1), Exon 2(서열번호 2), Exon 3(서열번호 3), Exon 4(서열번호 4), 및 Exon 5(서열번호 5)를 포함하고 있으며, 이 중에서 서열번호 3으로 이루어진 세 번째 exon이 deletion (결손)된 넉아웃 마우스 제조를 위해 표적벡터(targeting vector)를 제조하였다. 이후, 전기천공법(electroporation)을 이용하여 마우스 배아줄기세포 (E14Tg2A)에 표적 벡터를 도입하고, puromycin 약제에 선택적으로 살아남는 배아줄기세포 클론 100개를 확보하였으며, 상동재조합(homologous recombination)이 일어나 "targeted locus"를 가진 마우스 배아줄기세포 클론을 찾았다. 이후, 게놈 DNA를 BamHI 효소를 자른 다음, Southern blot probe를 이용하여 Southern blot analysis를 수행하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 야생형(wild-type)의 경우 12.4 kb 위치에 시그널 (DNA band)이 관찰되었으며, 돌연변이(targeted locus)의 경우 9.6 bk 위치에 시그널이 관찰되었다. 돌연변이가 확인된 마우스 배아줄기세포 클론(Emp2(+/-))을 수정란(blastocyst)에 주입하고 대리모에 이식하여 20일 후 키메라(chimera) 마우스를 얻었다. 키메라 마우스를 C57BL/6 마우스와 교배하여 태어난 마우스 중, 유전자 검사를 통해 Emp2(+/-) 마우스를 구별하였다. 그리고 Emp2(+/-) 마우스 암수를 교배하여 Emp2(-/-)를 확보하였다.
또한, 도 3에 나타낸 바와 같이, 대조군 (WT(+/+) MEF)과 비교하여, EMP2 넉아웃 마우스 (EMP2 (-/-) MEF)에서 EMP2발현이 억제됨을 확인하였고, 이로써 실시예 1에서 제조된 EMP2 넉아웃 마우스를 검증하였다.
실시예 2. EMP2 넉아웃 마우스를 이용한 폐암 유발 및 우수한 전이능 확인
본 실시예에서는 실시예 1에서 제조된 EMP2 넉아웃 마우스를 이용하여, 폐암 유발 및 전이의 연관성을 분석하였다. 20 마리의 6주령 EMP2(-/-) 마우스와 EMP2(+/+) 마우스에 Urethane을 10주간 처리하여 폐암을 유발하였다. 이후, 안락사시켜 EMP2 넉아웃 마우스와 야생형인 대조군간 폐암 유발의 정도를 폐의 병리 조직학적 검사, 폐 종양세포의 분포 및 종양세포 수를 통하여 비교하였다. 또한, Lewuis lung carcinoma 세포 2×105개를 EMP2 넉아웃 마우스와 야생형인 대조군의 꼬리정맥에 주사하여 폐로의 암 전이를 유발하였으며, 30일이 지난 후, 마우스를 안락사시켜 폐로의 암전이 정도를 폐의 육안적 관찰, 폐 종양세포의 분포 및 전이에 의한 폐 결절(nodule)의 수를 통하여 비교하였다.
그 결과, 도 4 내지 도 6에 나타낸 바와 같이, EMP2 넉아웃 마우스는 야생형 대조군과 비교하여, 병리 조직학적 검사 결과, 미분화 세포들의 침윤 및 왕성한 세포분열을 확인하였으며, 폐 조직 내 유의적인 종양세포 분포 및 세포수 증가를 확인하였다.
또한, 도 7 내지 도 9에 나타낸 바와 같이, EMP2 넉아웃 마우스는 야생형 대조군과 비교하여, 육안으로 관찰한 결과, 전이에 의한 폐 조직 내 종양세포의 종창을 확인하였으며, 폐 조직 내 유의적인 종양세포 분포 및 결절의 증가를 확인하였다.
상기 결과는 EMP2를 넉아웃시킴으로써, 폐암 유발을 촉진시킬 수 있음을 뿐만 아니라, 폐로의 암 전이를 촉진시킬 수 있음을 의미한다.
실시예 3. EMP2 넉아웃 마우스를 이용한 폐암 질환 마우스의 제조 및 검증
3-1. K-Ras 유전자 돌연변이 마우스와의 교배를 통한 폐암 발생 촉진 효과 확인
본 실시예에서는 EMP2 넉아웃 마우스와 종양 유전자로 알려진 K-Ras 유전자가 변이된 마우스(KRASG12D)를 교배시켜 폐암 질환 모델을 제조하였다.
또한, 상기 제조된 마우스에서, 폐암 유발을 확인하기 위하여 상기 폐암 질환 마우스(K-Ras/EMP(-/-))와 대조군인 K-Ras/EMP(+/+) 마우스를 대상으로 폐의 병리 조직학적 검사를 실시하였으며, 폐 종양세포의 분포 및 결절의 수를 비교하였다. 구체적으로, 동물의 사육은 온도 22℃, 상대습도 50%, 조명시간은 12시간(오전 8시 점등-오후 8시 소등) 및 조도 200-300 lux로 설정된 시설에서 수행하였다. 순화 기간을 거쳐 polycarbonate 사육 상자에 5마리씩 수용하였고 실험 동물용 고형 사료와 정수 장치가 구비된 수도수를 자유롭게 섭취하도록 하였다. 마우스는 5마리를 하나의 실험군으로 설정하였으며, 모든 실험동물은 Institute of Laboratory Animal Resources의 'Guide for the Care and Use of Laboratory Animal' (1996, USA)에 준하여 취급하였다. 12주령 실험동물을 CO2 가스로 희생시킨 후, 폐를 적출하여 10% 중성 완충 포르말린(10% neutral buffered formalin, NBF) 고정액에서 24시간 동안 고정시켰다. 이후, 폐 표면의 암조직 개수를 측정하였으며, 일정한 수세 및 통상적인 방법에 따라 알콜 탈수 과정을 거쳐 파라핀으로 포매하였다. 포매된 폐 조직은 박절편기를 이용하여 4μm 두께의 연속 절편을 제조하여 hematoxylin-eosin (H＆E) 염색을 시행한 다음 permount로 봉입하여 영구표본을 작성한 뒤, 병리 조직학적 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, K-Ras/EMP(+/+) 마우스와 비교하여, 폐암 질환 마우스(K-Ras/EMP(-/-))에서 폐 조직내 침윤된 종양세포의 면적(도 10a 참조) 및 결절(nodule)이 유의적으로 증가함(도 10b 참조)을 확인하였으며, 도 11에 나타낸 바와 같이, 폐암 질환 마우스에서 폐 조직 내 폐암 발생 증가를 현미경을 통하여 확인하였다.
K-Ras 유전자의 돌연변이는 위암, 대장암, 및 췌장암과 밀접한 관련성이 있다는 점을 고려해 볼 때, 상기 결과는 EMP2 넉아웃 마우스와 K-ras 유전자 돌연변이 마우스를 교배시킴으로써, 위암, 대장암 또는 췌장암으로부터 전이된 폐암 질환 동물모델 역시 효과적으로 제조할 수 있음을 의미한다.
3-2.
MMTV
-
PyMT
마우스와의 교배를 통한 암 전이 촉진 효과 확인
본 실시예에서는 MMTV-PyMT(murine mammary tumor virus-polyoma middle T) 마우스는 유방암 유발 동물모델로서, 유방암에서 폐로의 전이가 촉진된 동물모델을 개발하기 위하여, 상기 실시예 2의 실험 결과에 기반하여, EMP2 넉아웃 마우스와 MMTV-PyMT 마우스를 교배시켜, 암 전이에 의한 폐암 질환 동물모델을 제조하였다.
표 1에 나타낸 바와 같이, 먼저, Emp2(+/-) MMTV-PyMT 마우스를 제조한 후, Emp2(-/-); MMTV-PyMT 마우스 암컷을 제조하였다. Emp2(+/-) MMTV-PyMT 마우스를 제조하기 위하여 MMTV-PyMT 마우스와 Emp2(-/-) 마우스를 교배하여 얻은 새끼들에 대한 유전자 검사를 수행하였으며, 이들 중 Emp2(+/-);MMTV-PyMT 유전자 형을 가진 마우스를 선별하였다. 이후, Emp2(+/-) 마우스와 1 단계에서 확보된 Emp2(+/-);MMTV-PyMT 마우스를 교배하여 새끼를 얻었으며, 이들 중 유전자 검사를 통해 Emp2(+/+);MMTV-PyMT, Emp2(-/-);MMTV-PyMT 마우스를 구별하였고, 각각을 대조군과 실험군으로 이용하였다.
또한, 상기 제조된 마우스에서, 유방암에서 폐로의 전이능을 확인하기 위하여 상기 암 전이에 의한 폐암 질환 마우스(EMP(-/-) MMTV-PyMT)와 대조군인 EMP(+/+) MMTV-PyMT 마우스를 대상으로 폐의 육안적 관찰 및 병리 조직학적 검사를 실시하였으며, 전이에 의한 폐 종양세포의 분포 및 결절의 수를 비교하였다.
도 12에 나타난 바와 같이, 폐암 질환 마우스(EMP(-/-) MMTV-PyMT)와 대조군인 EMP(+/+) MMTV-PyMT 마우스에서 유방암의 발생을 병리 조직학적 검사를 통하여 확인한 결과, 대조군인 EMP2(+/+)/MMTV-PyMT 6주령에서는 암의 발생이 미미했던 반면, 폐암 질환 마우스(EMP(-/-) MMTV-PyMT)에서는 유방암의 발생이 현저함을 확인하였으며, 도 13 및 도 14에 나타낸 바와 같이, 대조군인 EMP(+/+) MMTV-PyMT 마우스와 비교하여, 폐암 질환 마우스에서 유방암 전이에 의한 폐 조직 내 결절(nodule)이 유의적으로 증가함을 확인하였고, 폐 조직 내 침윤된 종양세포의 면적 증가를 전자현미경을 통하여 확인하였다.
또한, 도 15 및 도 16에 나타낸 바와 같이, 폐암 질환 마우스에서 폐 조직 내 종양세포 및 결절의 수가 현저하게 증가함을 수치적으로 비교하여 확인하였다.
상기 결과는 EMP2 넉아웃 마우스와 유방암 동물모델인 MMTV-PyMT 마우스를 교배시킴으로써, 유방암으로부터 전이된 폐암 질환 동물모델을 효과적으로 제조할 수 있음을 의미한다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> Dongguk University Industry-Academic Cooperation Foundation
<120> Lung cancer-related animal model by causing deficiency of EMP2
gene and uses thereof
<130> S-A-2015-0240_MP15-115
<150> KR 10-2014-0141117
<151> 2014-10-17
<160> 6
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 157
<212> DNA
<213> EMP2 Exon1
<400> 1
cgggcgggca gggaggcggg ctagggagag ggcggcaggg aggaggctcg gcagcccgga 60
gggcggagga cgccgcgcag tcccagcccc aagcttcaaa acagccggcg cctcgcccca 120
cgcgcagccc gccactgtgt ccagacgccc gtgcccg 157
<210> 2
<211> 163
<212> DNA
<213> EMP2 Exon2
<400> 2
gtttggattt gtctctcgcc atctttgtct cctcatctct ctttggactt cctgctgccc 60
ccttggcctt cactgccctg tgaacatgtt ggtgattctt gccttcatca ttgtcttcca 120
catcgtgtcc acggcactcc tgttcatttc taccattgac aat 163
<210> 3
<211> 106
<212> DNA
<213> EMP2 Exon3
<400> 3
gcctggtggg taggcgacag cttctctgct gacctctgga gagtgtgcac caacagcaca 60
aactgtaccg agatcaatga gctgaccggc cctgaagcgt ttgaag 106
<210> 4
<211> 147
<212> DNA
<213> EMP2 Exon4
<400> 4
gttattctgt gatgcaggcg gtgcaggcca ccatgatcct ctccaccatc ctctcctgca 60
tctccttcct catctttctg ctccagctct tccgcctcaa gcagggagag aggttcgtcc 120
tgacgtccat catccagctc atgtcct 147
<210> 5
<211> 2867
<212> DNA
<213> EMP2 Exon5
<400> 5
gtctgtgtgt catgatcgga gcttccatct atacagaccg gcgccaagac cttcaccaac 60
agaacagaaa actctattac ctactgcaag aaggcagcta cggctactct ttcatcctgg 120
cctgggtggc ctttgccttc actttcatca gcggcctcat gtacatgatc ctgaggaagc 180
gtaaataagt gtcagaagtc tgaccaccct cccacagggt ggcatccatg gtcacataac 240
cattttgtat ataatcattt tttgtgtttt ttctagcaaa catattgttt cctttaaaag 300
cttttatgaa gaagaagaag gagaaggaga aggagaagga gaaggagaag gagaaggaga 360
aggagaagga gaaggagaag gagaagaaga agaagaagaa gaagaagaag aagaagaaga 420
agaagaagaa gaagaagaaa gaatagagac agagaaggag tttctgcatt cttgggatca 480
caaaccagac catgaaagct ggcattcaga atgcctgcct accaaaagtc tcagcaaggc 540
ccagcaagct ccacaggatg cttttcaagg gtggctctgt ggtgtgggta cggccaaagg 600
tggggaaagc cagtctttgg gagcagactc tttgtaggag tctgcccttc cctcttcccc 660
tgcccactcc actctgacag ccacaggtgg aatgatgagg gcccaaatgt gggacatcta 720
tgctcagata ttaaacctaa gctcacgtaa gaagtgggca aagactggcc ctggtttgtc 780
tgtaagagac ccagagtttc ccaacccccc tgccatgagc taggtcatca cactaatttg 840
ttgatgtttg ctcctgtttg ccttaaggat agtgaccctt gcctgacgca gatgtcatgt 900
ttaggcatta agtgtccata ggtcattccg tagggcatct agtacacgtc ggttcacaaa 960
tctacttcca agaccctcag aatccttcat taaagggctg ggcctgggtg tctgaatttc 1020
tgatgagctc cctgcaatat ggttaaatgc actataactg gaggtcagag ccttagaacc 1080
ggggggagca gagccacctt gtaaatgtta tcaggctaat cacaatgaga tggccccact 1140
gctagctacg tctcagcctc catcagctct tgctgcctct tccacagctg cttacatctg 1200
ggacacttgt gccccattcc caggccatac aagcctggaa ggtgggctgg acagcctcct 1260
ccctgaccta catgggaagg tctctccttt tcttcccgcc cttttttcta atgtggatgc 1320
ttccattaat cctctgtttc tggagccttg gaagatctgt cttccattca ttcatccacc 1380
catccatcat tcaacatgaa tgggtcatgt cacgtgttgg gtgcaaggga tactctttca 1440
aaacaatccc tcacgagact cacagtctag tgaagagcac acgccagaaa ccaattagag 1500
aagctaccaa ccacgatgga acatcaggga ttcaaaacct cggggtgaga gggagcctac 1560
tttctctgtg ttcttctaag agccctgatg gctctcgatt gctctgaaca gaggtccact 1620
tggtccagtg ctatcatggg tagtgcccac gaggtttccc cagagaatac tactgtagag 1680
cattctatac tccccacagg gagacaggaa aggattccca gagccatggc tcttaagatg 1740
gtcctcgaag gaaaatccag tcatttccaa gtgggccctg aaccctgagg ctatggggag 1800
gtcttcagaa gtcctggaag agtgacaaca cccgagtccc aggagctctg tgatggcaac 1860
cttctccctt gaacaccctt ttccattttt gagcatcgag ttggagaggt gattctggga 1920
cagggtgtgt atatttgtgt tgtttaaaca cattcacatg taagctgcct gaggggaggg 1980
gatgtttgcc tctagctcag tcccagtgga gctgggggga tgatgagtct gagtggcttt 2040
agggccatca ttgacaccac ctcagtacaa acggactccc ctcccttcct ccctctcttc 2100
tatcctcctt tccttccttc ccttagcagg gctgccaagg tgatatggga cagcgacagg 2160
gcaaacgatc acctgttgcc ttaatgaact ttccacagct cactgctggc taggtcgtag 2220
agtttctcct tgtcttgtga ggcccaagga aggaggccaa tctaaagtgt cctccatacc 2280
ttccccttgg gggcttttct gtaatacttg tttaaaaatt gttctgatga tcatgatgga 2340
aacagacaga ccaccttaga accagaggcc tgaaagcctg acctgaccag cacagattcc 2400
cacttcagaa ccccagggct atggaagtgc ccttgtccaa cgctatggga atagtcctgt 2460
gggttgtctc tgcttgccac tgtggccagc attccagtgc ctacagccac ctgtgcctac 2520
agccacctgt gccatgagaa gtgcctctcc tgctctatgc cctgcatttg ggatgctaag 2580
aagaggtgag ggtgtgagcg agaacagatc cacccttctc ctaggtagga tcagctctca 2640
attggtgctt atcactagtt atcaaagaac agcagagaca gctgcgttat ccaagaagca 2700
agtattagga ccaaaacctg ttactgtatt taaaggaact ttagtttgcg tatcttacat 2760
ttttataaag tactgtaatt cagggggtgg ggtatgcaac agagacagac taacccatgt 2820
ttgtcatttg cattaaaatt attttgggtc tctgtttaaa gaatttg 2867
<210> 6
<211> 519
<212> DNA
<213> EMP2 coding sequence
<400> 6
atgttggtga ttcttgcctt catcattgtc ttccacatcg tgtccacggc actcctgttc 60
atttctacca ttgacaatgc ctggtgggta ggcgacagct tctctgctga cctctggaga 120
gtgtgcacca acagcacaaa ctgtaccgag atcaatgagc tgaccggccc tgaagcgttt 180
gaaggttatt ctgtgatgca ggcggtgcag gccaccatga tcctctccac catcctctcc 240
tgcatctcct tcctcatctt tctgctccag ctcttccgcc tcaagcaggg agagaggttc 300
gtcctgacgt ccatcatcca gctcatgtcc tgtctgtgtg tcatgatcgg agcttccatc 360
tatacagacc ggcgccaaga ccttcaccaa cagaacagaa aactctatta cctactgcaa 420
gaaggcagct acggctactc tttcatcctg gcctgggtgg cctttgcctt cactttcatc 480
agcggcctca tgtacatgat cctgaggaag cgtaaataa 519
Claims (7)
- 상피막단백질 2(Epithelial membrane protein 2; EMP2) 유전자를 넉아웃시키는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 폐암 질환 동물모델의 제조방법.
- 하기의 단계를 포함하는 인간을 제외한 폐암 질환 동물모델의 제조방법:
a) 상피막단백질 2(Epithelial membrane protein 2; EMP2) 유전자가 넉아웃된 동물모델을 제조하는 단계; 및
b) 상기 동물모델과 암 질환 동물모델을 교배시키는 단계.
- 제2항에 있어서,
상기 암 질환 동물모델은 MMTV-PyMT(murine mammary tumor virus-polyoma middle T) 마우스 또는 K-Ras 유전자 돌연변이 마우스(KRASG12D)인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
- 제2항에 있어서,
상기 암은 유방암, 위암, 대장암, 및 췌장암으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
- 제1항 또는 제2항의 방법에 의해 제조된 폐암 질환 동물모델.
- 하기의 단계를 포함하는 폐암 치료 후보물질의 스크리닝 방법:
a) 상기 제5항의 동물모델에 시험물질을 처리하는 단계;
b) 상기 시험물질을 처리한 동물모델에서 폐암세포의 성장을 측정하는 단계; 및
c) 비처리군과 비교하여 폐암세포의 성장을 억제시키는 물질을 폐암 치료물질로 선정하는 단계.
- 삭제
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|---|---|---|---|
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| KR1020140141117 | 2014-10-17 |
Publications (2)
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Family
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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|---|---|
| KR (1) | KR101777468B1 (ko) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102191341B1 (ko) * | 2019-03-15 | 2020-12-16 | 국립암센터 | 유방암 동물모델의 제조방법 및 이의 용도 |
| KR102649080B1 (ko) * | 2020-07-21 | 2024-03-20 | 동국대학교 산학협력단 | Emp2의 바이러스성 폐렴 또는 패혈증의 진단을 위한 용도 |
-
2015
- 2015-10-06 KR KR1020150140300A patent/KR101777468B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (2)
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|---|
| Oncogene, 2013.01.21, 32권, 46호, 5369-5376 페이지 |
| 동국대학교 대학원 약학과 이은지의 석사학위논문, '폐암세포주에서 SPC에 의한 EMP2의 감소가K8 인산화 및 재구축을 유발하는 메커니즘에 관한 연구' (2014년 2월 공개)* |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20160045580A (ko) | 2016-04-27 |
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