KR101776367B1 - 고감도 전기화학 기반 바이오 센서 키트 제조 방법 및 이로부터 제조된 바이오 센서 키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 고감도 전기화학적 바이오 센서 키트를 제조하는 방법 및 상기 제조하는 방법에 의해 제조된 전기화학적 바이오 센서 키트에 관한 것이다. 아울러, 본 발명은 상기 전기화학적 바이오 센서 키트를 이용하는 검출 목적 물질의 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명은 전기화학 바이오 센서의 민감도를 저해시키는 전극 오염(electrode fouling) 형성을 방지할 수 있는 기술과 본 센서에 항체의 고정화를 신속하게 저가로 수행할 수 있는 기술을 포함하는 고감도 전기화학 바이오 센서에 대한 것이다.
Description
본 발명은 고감도 전기화학적 바이오 센서 키트를 제조하는 방법 및 상기 제조하는 방법에 의해 제조된 전기화학적 바이오 센서 키트에 관한 것이다. 아울러, 본 발명은 상기 전기화학적 바이오 센서 키트를 이용하는 검출 목적 물질의 검출 방법에 관한 것이다.
전기화학 바이오 센서는 광센서에 비해 기기의 크기가 작고, 비용 절감이 가능하여 소비자에게 친숙한 센서로서 바이오 센서 시장에서 최근 각광받고 있다. 전기화학 바이오 센서는 기본적으로 채널 내부에 금속으로 구성된 전극이 형성되어 있으며, 금속판 위에 검출하고자 하는 물질과 특이적으로 반응할 수 있는 생체 물질을 고정화시키게 된다. 무기물인 금속 표면에 유기물인 생체 물질을 고정화하기 위해서는 Self Assembled Monolayers (SAMs)와 같은 화학 물질의 처리가 필요하다.
여러 연구에 따르면 SAMs를 전극에 형성시킴으로서 전기적 활성물질이 SAMs에 의해 전극 표면에 닿지 못하고 SAMs와 비특이적인 결합을 통해 전기화학적 신호가 감소되는 현상이 발생하는 것으로 알려져 있다 (K. L. Prime & G. M. Whitesides, J. Am . Chem . Soc . 1993, 115, 10714-10721; W. Senaratne, L. Andruzzi & C. K. Ober, Biomacromolecules . 2005, 6, 2427-244; S. Ko, B. Kim, S.S. Jo, S.Y. Oh, J.K. Park, Biosens Bioelectron . 2007, 23, 51-59.). 또한, 전극 표면으로의 생체 물질의 고정화는 생체 물질 자체가 전극의 흐름을 방해하는 요소로 작용하거나 전기적 활성 물질과의 비특이적 결합을 통해 신호의 세기를 감소시키는 역할을 하게 될 뿐만 아니라 생체 물질 자체가 전극 표면에 어떠한 표면 처리 없이도 비특이적으로 결합하여 전기적 활성물질의 인지를 저해할 수 있다. 결과적으로 SAMs 및 생체 물질들에 의한 전기적 활성물질의 이동 방해 현상은 전기화학 바이오 센서의 민감도를 떨어뜨리게 된다.
전기화학센서의 떨어진 민감도를 회복시키기 위한 기존의 연구들은 생체 물질의 비특이적 결합에 의한 전극 오염 (electrode fouling) 현상 제어를 위해 전극 표면에 전도성 또는 비전도성, 천연, 이온성 고분자 등을 코팅하는 방법들이 대부분이었다(J. J. Fei, Y. H. Wu, X. B. Ji, J. Wang, S. S. Hu & Z. Q. Gao, Anal . Sci., 2003, 19, 1259; Y. Ivanov, I. Marinov, K. Gabrovska, N. Dimcheva & T. Godjevargova, J. Mol . Catal . B: Enzym ., 2010, 63, 141.). 사용된 고분자 물질의 코팅은 생체 물질의 특이적 고정화를 유도하고 비특이적 결합은 저해하며, 전자의 교환 및 산화 환원의 재현성, 생체 안전성 등의 장점을 가지고 있으나, 이러한 코팅 방식도 결국 전극 표면에 SAMs을 형성하게 되며, 이를 통해 SAMs에 의한 전극 오염 (electrode fouling) 현상이 일어나게 된다.
한편, 센서의 민감도를 높이는 또 하나의 기술로는 나노 입자의 사용을 들 수 있다. 나노 입자는 부피당 표면적이 넓어 같은 부피라도 많은 양의 물질을 표면에 고정화 시킬 수 있으며, 이를 통해 생체 반응에 의한 신호의 세기를 증폭시킬 수 있다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 고감도 전기화학 기반 바이오 센서 시스템을 개발하기 위하여 노력한 결과, SAMs와 생체물질의 비특이적 결합에 의한 전극 오염을 원천적으로 막고 나노 입자를 사용하여 추가적인 민감도 증대를 획득할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 고감도 전기화학적 바이오 센서 키트를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 전기화학적 바이오 센서 키트를 제조하는 방법에 의해 제조된, 전기화학적 바이오 센서 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 전기화학적 바이오 센서 키트를 이용하는 검출 목적 물질의 검출 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 고감도 바이오 센서 키트의 제조 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명의 바이오 센서 키트의 제조 방법은 동일한 검출 목적 물질에 특이적으로 결합하는 바이오 센서를 제조하는 단계와 실리카 나노입자를 만드는 단계를 포함한다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 기판 상에 금을 박막한 마이크로 채널 상판과 기판 상에 전극을 포함하는 마이크로 채널 하판을 포함하며, 상기 채널 상판의 박막된 금에 검출 목적 물질에 특이적으로 결합하는 항체가 결합되고, 상기 채널 상판과 하판이 부착하여 마이크로 채널을 형성하는 것인 바이오 센서와 검출 목적 물질에 특이적으로 결합하는 항체가 결합된 검출용 실리카 나노 입자를 포함하는 전기화학적 바이오 센서 키트를 제조하는 방법을 제공한다.
상기 바이오 센서를 제조하는 단계는,
1) 기판에 전극 패턴 및 전극 형성 부위에 해당하는 금 박막층을 형성하여 전기화학적 바이오 센서의 상판을 제조하는 단계;
2) 상기 상판을 전극이 형성되지 않은 하판과 부착시켜 마이크로 채널을 형성하는 단계;
3) 상기 마이크로 채널에 금 결합 단백질-단백질 G(GBP-ProG)를 포함하는 유체를 통과시키는 단계;
4) 상기 마이크로 채널에 검출 목적 물질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 유체를 통과시켜, GBP-ProG와의 결합을 통해 항체를 바이오 센서 상판에 고정하는 단계; 및
5) 상기 상판을 전극이 형성되지 않은 하판에서 분리하여 전극이 형성된 하판에 부착하여 바이오 센서를 제조하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 바이오 센서를 제조하는 단계에서 상기 3) 또는 4) 단계 이후에 마이크로 채널에 인산 완충 용액(Phosphate-buffered saline, PBS)을 통과시켜 상판 금 박막층에 결합하지 않은 GBP-ProG 또는 항체를 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 3) 단계 이후에 마이크로 채널에 블락킹(blocking) 용액을 통과시켜, 융합 단백질이 결합하지 않은 금 박막층을 블락킹하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 이러한 블락킹하는 단계 이후에 마이크로 채널에 인산 완충 용액(Phosphate-buffered saline, PBS)을 통과시켜 블락킹 용액을 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 블락킹 용액은, 검출 목적 물질을 포함하는 시료에 의해 비특이적인 결합이 일어날 수 있는 금 박막층이나 실리카 나노입자에 비특이적인 결합을 줄이는 것은 무엇이든 가능하며, 예를 들어, 인간혈청 알부민(Human Serum Albumin, HSA), 우혈청 알부민(Bovine Serum Albumin, BSA) 또는 스킴밀크(Skim milk) 등일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
이러한 인산 완충 용액을 통과시키는 과정은 바이오 센서가 검출 목적 물질을 특이적으로 결합할 수 있도록 특이성을 높이는 과정이다.
한편, 본 발명에서 상기 실리카 나노 입자를 제조하는 단계는,
a) 실리카 나노 입자와 실리카 결합 단백질-단백질 G(SBP-ProG) 융합 단백질을 섞어, 실리카 나노 입자 표면에 SBP-ProG 융합 단백질을 부착시키는 단계; 및
b) 상기 a) 단계를 거친 실리카 나노 입자에 알칼라인 탈인산화 효소(Alkaline phosphatase, AP)로 표지된 검출 목적 물질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 액체를 섞어, SBP-ProG와의 결합을 통해 항체를 실리카 나노 입자에 고정하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 항체에 표지 되는 효소는 산화 환원 반응을 일으킬 수 있는 산화 환원 효소이면 모두 가능하기에 알칼라인 탈인산화 효소(Alkaline phosphatase, AP)로 제한되지 않는다.
본 발명의 실리카 나노 입자를 제조하는 단계는 상기 a) 단계를 거친 실리카 나노 입자와 블락킹 용액을 섞어, 융합 단백질이 결합하지 않은 실리카 나노 입자 표면을 블락킹(blocking)하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 전기화학 바이오 센서의 제작방법은 상판의 GBP-ProG와 IgG의 고정화를 상판과 하판 부착 이전에 진행하는 것을 통해 하판의 불특이적인 항체의 결합을 막아 전극 오염 현상을 방지할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 상판의 GBP-ProG와 IgG의 고정화를 상판과 하판 부착 이전에 진행한 본 발명의 바이오 센서 키트의 민감도와 상판의 GBP-ProG와 IgG의 고정화를 상판과 하판 부착 이후에 진행한 대조군의 민감도를 비교하였으며, 그 결과 본 발명의 바이오 센서 키트가 센서의 민감도가 현저히 높음을 확인하였다. 구체적으로 대조군의 경우 GBP-ProG와 IgG가 상판의 금 박막층 부위와 하판의 금 전극 부위에 모두 고정화 되어 AP-anti-IgG를 실험군 보다 더 많은 양이 결합할 수 있었음에도 불구하고 산화 피크가 3배 이상 낮게 나오는 것을 확인할 수 있었다(도 2).
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 바이오 센서 키트의 제조 방법에 의해 제조된 고감도 전기화학적 바이오 센서 키트를 제공한다.
본 발명에서 전기화학적 바이오 센서 키트는 상기 제조 방법에 개시되어 있듯이, 본 발명의 바이오 센서와 실리카 나노 입자로 구성되어 있다.
구체적으로, 본 발명은 기판 상에 금을 박막한 마이크로 채널 상판과 기판 상에 전극을 포함하는 마이크로 채널 하판을 포함하며, 상기 채널 상판의 박막된 금에 검출 목적 물질에 특이적으로 결합하는 항체가 결합되고, 상기 채널 상판과 하판이 부착하여 마이크로 채널을 형성하는 것인 바이오 센서와 검출 목적 물질에 특이적으로 결합하는 항체가 결합된 검출용 실리카 나노 입자를 포함하는 전기화학적 바이오 센서 키트를 제공한다.
더욱 구체적으로, 본 발명은 a) 기판 상에 금을 박막한 마이크로 채널 상판; 기판 상에 전극을 포함하는 마이크로 채널 하판; 검출 목적 물질에 특이적으로 결합하는 항체; 및 상기 상판에 상기 항체를 고정하는 금 결합 단백질(Gold binding protein, GBP)-단백질 G(protein G) 융합 단백질; 을 포함하며, 상기 금 결합 단백질-단백질 G 융합 단백질을 구성하는 금 결합 단백질은 상기 상판에 박막된 금에 결합되고, 단백질 G는 항체에 결합되고, 상기 채널 상판과 채널 하판이 부착하여 마이크로 채널을 형성하는 것인 전기화학적 바이오 센서;와 b) 실리카 나노 입자; 알칼라인 탈인산화 효소(Alkaline phosphatase, AP)로 표지된 검출 목적 물질에 특이적으로 결합하는 항체; 및 상기 나노 입자에 상기 검출 목적 물질에 특이적으로 결합하는 항체를 고정하는 실리카 결합 단백질(Silica binding protein, SBP)-단백질 G(protein G) 융합 단백질; 을 포함하며, 상기 실리카 결합 단백질-단백질 G 융합 단백질을 구성하는 실리카 결합 단백질은 실리카 나노 입자에 결합되고, 단백질 G는 항체에 결합되는 것인 검출용 실리카 나노 입자;를 포함하는 것을 특징으로 하는, 전기화학적 바이오 센서 키트를 제공한다.
본 발명의 전기화학적 바이오 센서 키트는 전기화학적 바이오 센서와 검출용 실리카 나노 입자를 포함하는 것이다.
본 발명에서 상기 금 결합 단백질-단백질 G 융합 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있으며, 상기 실리카 결합 단백질-단백질 G 융합 단백질은 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 금 결합 단백질(Gold-binding protein)과 항체의 Fc 영역에 결합하는 단백질 G(protein G)가 융합된 단백질을 이용하여 항체를 전기화학적 바이오 센서의 상판에 부착시켰다. 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성되는 금 결합 단백질을 사용하였으며, 서열번호 8의 아미노산 서열로 구성되는 단백질 G를 사용하였다. 상기 둘을 연결한 융합 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 것을 사용하였다.
또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서는 실리카 결합 단백질(Silica binding protein, SBP)과 항체의 Fc 영역에 결합하는 단백질 G(protein G)가 융합된 단백질을 이용하여 항체를 실리카 나노 입자에 부착시켰다. 서열번호 6의 아미노산 서열로 구성되는 실리카 결합 단백질을 사용하였으며, 서열번호 9의 아미노산 서열로 구성되는 단백질 G를 사용하였다. 상기 둘을 연결한 융합 단백질은 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성되는 것을 사용하였다.
본 발명에서 상기 기판은 각종 생체 시료에 영향을 미치지 않는 고체로 이루어질 수 있으며, 예를 들어 금속, 플라스틱, 실리카 등 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 본 발명의 바이오 센서를 구성하기 위해 플라스틱으로 된 기판을 사용하였다. 플라스틱으로 된 기판을 기반으로 금 박막층이 박막된 바이오 센서 상판 및 전극이 형성된 하판을 제조하였다.
본 발명의 전기화학적 바이오 센서 키트는 전극 오염(electrode fouling) 현상이 방지되는 것일 수 있다.
본 발명에서 전극 오염(electrode fouling) 현상이란 전기화학적 센서 등에서 전기화학 신호를 보내거나 받는 전극 표면에 시료나 반응물 등이 부착하여 센서의 전기화학 신호에 대한 민감성이 낮아지는 현상을 의미한다. 특히, 본 발명에서는 바이오 센서에 대하여 바이오 시료나 항체, 항체 결합 단백질 등이 전극에 부착되는 것을 통해 일어날 수 있다.
본 발명의 전기화학적 바이오 센서 키트를 구성하는 바이오 센서는 상판의 금 박막층 부분에만 항체 결합 단백질 및 항체가 결합되어 있어 바이오 센서 하판에 존재하는 전극 오염을 원천적으로 방지하는 특징을 가지고 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에 의하면 상기 구성의 차이에 의해 센서 민감도가 약 3배 차이가 나는 현저한 차이를 보이고 있다(도 2). 또한, 본 발명의 실리카 나노 입자를 이용하여 민감도를 더욱 증진시키고 있다(도 3).
본 발명의 전기화학적 바이오 센서 키트의 검출 목적 물질은 화합물, 단백질, 사이토카인, 수용체 단백질, DNA, SNP, RNA, miRNA 및 세균과 바이러스를 포함하는 병원성 미생물로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 본 발명의 검출 목적 물질은 특정 질병 또는 증상의 진단, 질병의 진전 정도, 질병 또는 증상의 발생 가능성 예측이나 특정 치료에 대한 예후 예측 등에 마커로 사용되는 것일 수 있다.
본 발명의 검출 목적 물질은 질병 마커일 수 있으며, 각종 암의 마커일 수 있으며, 특히 전립선암의 마커일 수 있고, 구체적으로 Prostate specific antigen (PSA)일 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, 전립선암 마커인 PSA에 특이적인 항체를 바이오 센서 상판 금 박막층과 실리카 나노 입자에 결합시켜, PSA의 측정능력을 확인한 결과, 농도 의존적으로 민감한 항원 검출 능력을 가지는 것을 확인하였다(도 4).
한편, 알칼라인 탈인산화 효소(Alkaline phosphatase, AP)로 표지된 검출 목적 물질에 특이적으로 결합하는 항체는 본 발명의 실리카 나노 입자에 결합될 수 있으며, 이를 통해 마이크로 채널에 존재하는 검출 목적 물질의 양을 측정하는데 사용될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 전기화학적 바이오 센서 키트는 바이오 센서 상판에 존재하던 검출 목적 물질에 특이적으로 결합하는 항체에 의해 마이크로 채널에 잔존하게 되고, 이에 알칼라인 탈인산화 효소(Alkaline phosphatase, AP)로 표지된 검출 목적 물질에 특이적으로 결합하는 항체가 결합된 실리카 나노 입자를 처리하여 나노 입자가 검출 목적 물질에 결합하여 마이크로 채널 내에 남게 된다. 상기 마이크로 채널 내에 남게 된 나노 입자의 양을 측정하여 검출 목적 물질의 양을 측정하게 되는데, 이는 실리카 나노 입자의 알칼라인 탈인산화 효소의 기질인 ρ-Aminophenylphosphate monosodium salt (PAPP)를 마이크로 채널 내로 통과시켜 얻어지는 산화 환원 그래프를 통해 측정할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 AP 표지 항체(AP-labeled anti-IgG)를 실리카 나노 입자에 결합시켜 사용하였으며, 생체 시료 처리 및 나노입자 처리 후 AP의 기질인 ρ-Aminophenylphosphate monosodium salt (PAPP)를 5 분간 흘려준 뒤, 5분 뒤에 CV를 이용하여 산화 환원 그래프를 획득하였다. 특히, 상판의 GBP-ProG와 IgG의 고정화를 상판과 하판 부착 이후에 진행한 경우를 대조군으로 한경우와 비교하였으며, 그 결과 GBP-ProG와 IgG의 고정화를 상판과 하판 부착 이전에 한 본 발명의 바이오 센서 키트가 센서의 민감도가 현저히 높음을 확인하였다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 전기화학적 바이오 센서 키트를 이용하는 검출 목적 물질의 검출 방법을 제공한다.
구체적으로 본 발명은 상기 전기화학적 바이오 센서 키트를 이용하여 하기 단계를 포함하는 검출 목적 물질의 검출 방법으로서,
1) 상기 전기화학적 바이오 센서 키트의 바이오 센서의 마이크로 채널 내로 시료를 통과시키는 단계;
2) 상기 마이크로 채널 내로 상기 전기화학적 바이오 센서 키트의 실리카 나노 입자를 처리하는 단계; 및
3) 상기 마이크로 채널 내로 알칼라인 탈인산화 효소의 기질인 ρ-Aminophenylphosphate monosodium salt (PAPP)를 통과시켜 얻어지는 산화 환원 그래프를 측정하는 단계를 포함하는, 검출 방법일 수 있다.
본 발명에서 바이오 센서 키트 및 검출 목적 물질 등은 상기 설명한 바와 같다.
상기 검출 방법에서 상기 1) 또는 2) 단계 이후에 마이크로 채널에 인산 완충 용액(Phosphate-buffered saline, PBS)을 통과시키는 세척 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 인산 완충 용액을 통과시키는 과정은 바이오 센서 및 나노 입자가 검출 목적 물질에 특이적으로 결합하고 특이적으로 검출하기 위한 과정이다.
본 발명은 전기화학 바이오 센서의 민감도를 저해시키는 전극 오염(electrode fouling) 형성을 방지할 수 있는 기술과 본 센서에 항체의 고정화를 신속하게 저가로 수행할 수 있는 기술을 포함하는 고감도 전기화학 바이오 센서에 대한 것이다.
도 1은 본 발명의 고감도 전기화학 바이오 센서 키트의 모식도이다.
도 2는 본 발명의 전기화학 바이오 센서의 제작 방법에 따른 전극 오염(electrode fouling) 현상의 방지 효과를 확인한 도면이다. 구체적으로 검출 목적 물질에 특이적으로 결합하는 항체를 바이오 센서의 상판과 하판 조립 전에 상판에 결합시켜 제조하는 경우(A, 청색), 항체를 상판과 하판 조립 후에 결합시켜 제조하는 경우(B, 적색) 및 항체를 결합시키지 않고 PBS를 처리한 음성 대조군(C, 녹색)의 전기화학적 검출 실험의 결과를 확인하였다.
도 3은 실리카 나노 입자를 이용한 검출 신호를 증가시키는 효과를 확인한 도면이다. 구체적으로 실리카 나노 입자(SiNP/SBP-ProG/AP-anti-IgG 복합체)를 이용한 경우(A, 청색), 검출 목적 물질에 특이적으로 결합하는 항체(AP-anti-IgG)를 이용한 경우(B, 적색) 및 항체를 결합시키지 않고 PBS를 처리한 음성 대조군(C, 녹색)의 전기화학적 검출 실험의 결과를 확인하였다.
도 4는 본 발명의 고감도 전기화학 바이오 센서 키트를 이용하여, 다양한 농도(0, 0.01, 0.1, 1, 10 ng/mL)의 전립선암 생체 마커(prostate specific antigen, PSA) 단백질을 검출한 결과이다.
도 2는 본 발명의 전기화학 바이오 센서의 제작 방법에 따른 전극 오염(electrode fouling) 현상의 방지 효과를 확인한 도면이다. 구체적으로 검출 목적 물질에 특이적으로 결합하는 항체를 바이오 센서의 상판과 하판 조립 전에 상판에 결합시켜 제조하는 경우(A, 청색), 항체를 상판과 하판 조립 후에 결합시켜 제조하는 경우(B, 적색) 및 항체를 결합시키지 않고 PBS를 처리한 음성 대조군(C, 녹색)의 전기화학적 검출 실험의 결과를 확인하였다.
도 3은 실리카 나노 입자를 이용한 검출 신호를 증가시키는 효과를 확인한 도면이다. 구체적으로 실리카 나노 입자(SiNP/SBP-ProG/AP-anti-IgG 복합체)를 이용한 경우(A, 청색), 검출 목적 물질에 특이적으로 결합하는 항체(AP-anti-IgG)를 이용한 경우(B, 적색) 및 항체를 결합시키지 않고 PBS를 처리한 음성 대조군(C, 녹색)의 전기화학적 검출 실험의 결과를 확인하였다.
도 4는 본 발명의 고감도 전기화학 바이오 센서 키트를 이용하여, 다양한 농도(0, 0.01, 0.1, 1, 10 ng/mL)의 전립선암 생체 마커(prostate specific antigen, PSA) 단백질을 검출한 결과이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 고감도 플라스틱 전기화학 바이오 센서 제작
본 발명의 고감도 전기화학 바이오 센서를 제작하는 과정에서 금이 박막된 상판과 금 전극이 형성된 하판을 부착하기 전 상판에 박막된 금 표면에 특정 물질의 포획 기능을 갖는 생체 물질을 고정화시킴으로서 전극 오염(electrode fouling)을 방지하고자 하였다.
구체적으로, 금이 박막된 상판에 검출하고자 하는 물질과 특이적으로 반응하는 생체 물질의 고정화를 위해 금 결합 단백질(Gold binding protein, GBP)-ProG 융합 단백질을 링커로서 사용하여 제작과정이 간단하고 빠르게 일어나도록 하고, 생체 물질의 안전성을 유지하고자 하였다. 이러한 바이오 센서 제작 과정은 하기와 같이 이루어졌다.
1-1. 제조 방법
플라스틱에 금을 박막하기 위해 플라즈마 처리를 한 뒤, e-beam evaporator를 이용하여 크롬과 금을 박막하였다. 이후 photolithography를 통해 전극 패턴 및 전극 형성 부위에 상응하는 상판 플라스틱 표면 금 박막층을 형성하였다.
금이 박막된 상판은 전극이 형성되지 않은 하판과 부착시켜 마이크로 채널이 형성된 칩을 만든다. 채널의 양 끝은 inlet과 outlet이 형성되어 물질의 주입 및 흐름을 돕는다. 주입구에 Syringe pump를 연결하여 채널 내로 주입되는 버퍼 및 생체 물질의 유속이 일정하게 유지될 수 있도록 하였다.
다음으로 형성된 채널을 세척하기 위해 syringe pump(Harvard apparatus, USA)로 PBS 버퍼(pH 7.4; 이후 사용된 PBS 버퍼의 pH는 모두 동일함) 200 ㎕를 1분간 흘려주었다.
이후 검출하고자 하는 물질과 특이적으로 반응하는 생체 물질의 고정화를 위한 링커로 GBP-ProG (1 mg/mL)을 5 ㎕/min의 속도로 100 ㎕ 주입하였다. 금 박막층 부위에 고정되지 않은 GBP-ProG를 제거하기 위해 PBS 버퍼 200 ㎕를 20 ㎕/min의 유속으로 흘려주었다.
다음으로 융합 단백질(GBP-ProG)이 고정되지 않은 금 표면에 여타의 다른 생체 물질이 비특이적으로 고정되는 것을 막기 위해 BSA (1 ㎎/㎖) (GIBCO®, USA)를 5 ㎕/min의 유속으로 5분간 흘려주었다. 이후 금 표면에 결합하지 않은 BSA를 제거하기 위해 PBS 버퍼를 10분간 20 ㎕/min의 유속으로 흘려주었다. 이후 IgG (500 ㎍/㎖) (Sigma-Aldrich, USA)를 5 ㎕/min의 유속으로 채널 내에 20분간 주입하여 플라스틱 전기화학 센서를 구성하는 상판에 고정화시켰다. 다음으로 PBS 버퍼를 5분간 20 ㎕/min의 유속으로 흘려 상판의 금 표면에 고정되지 않은 IgG를 제거하였다.
이후 상판을 칩으로부터 분리하여 금 전극이 형성된 하판에 부착하였다. 다음으로 채널 내에 PBS를 5분간 20 ㎕/min의 유속으로 흘려준 뒤 alkaline phosphatase (AP) (Abnova, USA)가 표지된 anti-IgG (Sigma-Aldrich, USA) (AP-anti-IgG) (100 ㎍/㎖)를 5 ㎕/min의 유속으로 채널 내에 주입하여 IgG에 의해 포획될 수 있도록 하였다 (AP 표지 과정은 Abnova에서 제공하는 방법으로 진행함). 이후 IgG와 반응하지 않은 AP-labeled anti-IgG를 PBS 버퍼 200 ㎕를 20 ㎕/min의 유속으로 흘려 제거하였다.
1-2. 플라스틱 전기화학 바이오 센서 전극 오염(
electrode
fouling
) 현상 측정
상기 실시예 1-1에서 제조한 플라스틱 전기화학 바이오 센서의 전극 오염 현상을 측정하기 위해, 전기화학적 검출 실험을 진행하였다. 구체적으로, AP의 기질인 ρ-Aminophenylphosphate monosodium salt (PAPP) (Gold Biotechnology, USA) (1mM)를 5μL/min으로 5분간 흘려준 뒤, 5분 후에 CV (CH instruments, Inc., USA)를 이용하여 산화 환원 그래프를 획득하였다. 위 실험에 대한 대조군으로는 GBP-ProG와 IgG의 고정화를 상판과 하판 부착 이후 진행하였다. 이를 통해, 전극상에 생체 물질과 같은 오염 물질에 의한 전극 오염 (electrode fouling) 현상이 센서의 민감도를 저해하는지 여부를 확인하고자 하였다.
그 결과, 도 2에서 확인할 수 있듯이 대조군(B)의 경우 GBP-ProG와 IgG가 상판의 금 박막층 부위와 하판의 금 전극 부위에 모두 고정화되어 AP-anti-IgG가 실험군보다 더 많은 양이 결합할 수 있었음에도 불구하고 산화 피크가 실험군(A)에 비하여 3배 이상 낮게 나오는 것을 확인하였다. 이는 전극 표면에 형성된 오염막이 전기적 활성물질의 신호를 감지하지 못하도록 하여 산화 환원 피크가 낮게 나오게 되었음을 나타내는 결과이다. 따라서, 본 기술의 플라스틱 전기화학 바이오 센서의 제작 방법을 통해 전극 오염 현상을 현저히 낮출 수 있음을 확인하였다.
실시예
2. 실리카 나노 입자를 통한 전기화학 바이오 센서의 민감도 증대
본 기술은 바이오 센서의 민감도를 좀 더 향상시키기 위해 100 nm 직경을 갖는 실리카 나노 입자 (SiNP)를 이용하였다. 나노 입자는 부피당 표면적이 높아 같은 부피라도 더 많은 생체 물질을 고정화 할 수 있다는 장점을 가지고 있다. 본 기술은 또한 SiNP에 어떠한 물리 화학적 처리 없이도 직접적으로 결합하는 SBP-ProG를 이용하여 검출하고자 하는 물질의 포획이 좀 더 효율적으로 이루어질 수 있도록 하였으며, 생체 물질의 고정화가 간단한 방법으로 안정적인 반응이 될 수 있도록 하였다.
2-1. 실리카 나노 입자 제조 및 이를 이용한 바이오 센서 제작
우선, SiNP에 생체 물질을 고정화하였다. 구체적으로, 600 ㎕의 D.W.(증류수)에 실리카 비드 75 ㎕를 넣어 vortexing한 뒤 17000 rpm, 4 ℃, 30 min 조건으로 원심 분리하였다. 다음으로 상층액을 제거하고 PBS 500 ㎕를 넣어 SiNP가 고르게 분포하도록 초음파처리(sonication) 및 vertexing을 충분히 가해주었다.
그 뒤 500 ㎍/㎖의 농도로 PBS 버퍼에 희석해 놓은 SBP-ProG를 100 ㎕씩 SiNP가 분산되어져 있는 용액에 넣어 실온에서 20분 동안 반응시키고 같은 조건으로 원심분리하여 상층액을 제거한 뒤 PBS 버퍼 500 ㎕를 넣어 초음파처리 및 vortexing하였다 (이때 원심분리는 3번 반복 실시함). 다음으로 1% BSA 100 ㎕ 넣어 30분간 실온에서 반응시켜 반응하지 않은 실리카 비드 표면을 blocking 한 후 원심분리 하여 상층액을 제거하였다. AP가 표지된 anti-IgG (AP-anti-IgG) (500 ㎍/㎖) 100 ㎕를 각각 실온에서 30분간 반응시켰다. SiNP에 고정화되지 않은 AP-anti-IgG를 제거하기 위해 1000 rpm, 4 ℃, 30분의 조건으로 원심분리를 하고, 500 ㎕의 PBS 버퍼를 넣어 초음파 처리 및 vortexing 하였다 (2회 반복). 상기와 같은 방법으로 SiNP/SBP-ProG/AP-anti-IgG complex를 제조하였다.
2-2. 나노 입자 포함 바이오 센서의 반응 민감도 측정
상기 실시예 2-1에서 제조한 SiNP/SBP-ProG/AP-anti-IgG complex 나노 입자를 포함하는 바이오 센서의 반응 민감도를 측정하였다. 구체적으로, 상기 500 ㎕의 SiNP/SBP-ProG/AP-anti-IgG complex 중 100 ㎕를 취하여 상판의 금 박막층 부위에 GBP-ProG와 IgG가 고정된 전기화학 바이오 센서 채널 내부로 syringe pump를 이용하여 5 ㎕/min의 유속으로 20분 주입하였다.
산화 환원 반응의 유도를 위해 AP의 기질인 PAPP를 5 ㎕/min의 유속으로 5분간 주입하여 AP와 반응할 수 있도록 하였으며, 5분 후에 CV를 이용하여 산화 환원 피크를 확인하였다. 실험의 대조군으로는 SiNB/SBP-ProG/AP-anti-IgG complex를 사용하지 않고 100 ㎕ AP-anti-IgG (500 ㎍/㎖)를 전기화학 바이오 센서의 채널에 위와 동일한 조건으로 주입하여 산화 환원 피크를 확인하였다.
그 결과, 도 3에서 확인할 수 있듯이 SiNP/SBP-ProG/AP-anti-IgG complex를 이용하여 생체 물질을 고정화시킨 경우(A) AP-anti-IgG를 사용한 대조군(B)보다 3.37 μA 더 높은 산화 피크를 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 하나의 AP-anti-IgG와 IgG가 결합한다고 하더라도 SiNP/SBP-ProG/AP-anti-IgG complex를 이용하게 되면 나노 입자 표면에는 IgG와 결합하지 않은 AP-anti-IgG가 한 개 이상 존재하게 됨으로 더 높은 신호를 획득할 수 있게 된다.
또한 SiNP에 고정된 AP-anti-IgG는 SBP-ProG에 의해 버퍼 방향으로 적절한 배향성을 유지한 상태로 고정화되어지기 때문에 항원-항체 반응의 효율성이 높아, IgG와의 반응이 SBP-ProG를 사용하지 않은 경우보다 효율적으로 일어났을 것이라고 예상된다.
실시예
3. 고감도 전기화학 바이오 센서를 이용한 전립선암 생체
마커
검출
본 발명의 고감도 전기화학 바이오 센서는 전기화학적인 분석이 요구되는 식품, 의료, 환경, 군사 등의 다양한 분야에서 사용 가능하다. 다양한 분야에서의 이용 가능성을 확인하기 위해, 전립선암 생체 마커로 알려진 Prostate specific antigen (PSA)를 이용하여 실험을 진행하였다.
PSA는 FDA로부터 암 진단을 위해 사용허가 받은 종양표지 인자들 중 하나로 시중에 많은 진단 키트들이 판매되고 있다. 그러나 판매되고 있는 키트들의 대부분이 정량 평가가 되지 않고 4 ng/㎖의 PSA 농도를 기준으로 질병의 가능성이 있는지 없는지에 대한 가능성만을 제시하기 때문에 정확한 진단에 어려움이 있다.
아울러, ELISA 방법의 경우 진단 키트 보다 정확한 결과를 획득할 수 있으나, 전문가의 도움이 필요하며 결과를 획득하기까지 3시간 이상의 시간이 소요된다는 단점을 가지고 있다.
3-1.
PSA
탐지용 고감도 전기화학 바이오 센서
키트
제조 방법
먼저 상기 실시예 2-1에 개시된 방법과 동일한 방법으로 SiNP/SBP-ProG complex를 제조하였다. 이후 AP-anti-IgG 대신 AP-anti-PSA(Mouse monoclonal [2H9], abcam, UK)를 사용하여 준비하였다.
다음으로 먼저 상기 실시예 1-1에 개시된 방법과 동일한 방법으로 플라스틱 전기화학 바이오 센서의 표면에 생체 물질을 고정하였다. 다만, IgG 대신 anti-PSA(Mouse monoclonal [5A6], abcam, UK)를 사용하였다.
상기 과정을 통하여 SiNP/SBP-ProG/AP-anti-PSA의 나노 입자와 anti-PSA를 부착한 플라스틱 전기화학 바이오 센서를 포함하는 PSA 탐지용 고감도 전기화학 바이오 센서 키트를 제작하였다. 이러한 본 발명의 고감도 전기화학 바이오 센서 키트의 구성 및 사용 기작은 도 1에 도식화한 바와 같다.
3-2.
PSA
탐지용 고감도 전기화학 바이오 센서
키트
민감도 측정 실험
상기 실시예 3-1에서 제조한 PSA 탐지용 고감도 전기화학 바이오 센서 키트의 PSA 탐지능을 확인하기 위하여 실험을 진행하였다.
먼저, SiNP/SBP-ProG/AP-anti-PSA 나노 입자에 항원인 PSA를 반응은 준비된 500 ㎕의 SiNP/SBP-ProG/AP-anti-PSA 용액에 다양한 농도의 PSA(0.01, 0.1, 1, 10 ng/㎖)를 100 ㎕ 넣어 30 분간 실온에서 반응한 뒤 원심분리 (1000 rpm, 4 ℃, 30 min)하여 상층액을 제거하였다. 이후 PBS 버퍼 500 ㎕를 넣어 초음파처리 및 vortexing하여 용액 내에 SiNP/SBP-ProG/AP-anti-PSA/PSA가 잘 분산되어 질 수 있도록 하였다.
상기 SiNP/SBP-ProG/AP-anti-PSA/PSA 100 ㎕를 플라스틱 전기화학 바이오 센서에 5 ㎕/min의 유속으로 20분간 주입하고, PBS 버퍼를 20 ㎕/min의 유속으로 10분간 흘려 washing 과정을 진행하였다. 다음으로 PAPP (1 mM)을 5 ㎕/min의 유속으로 5분간 흘려준 후, 5분 동안 반응을 진행한 뒤, CV 데이터를 획득하였다.
그 결과, 도 4에서 확인할 수 있듯이 농도 의존적인 산화 피크가 나타났으며, 그 검출 민감도는 0.01 ng/㎖이었다. 이는 PSA를 통한 전립선암 진단 시 1 내지 4 ng/㎖이 정상, 4 ng/㎖ 초과시 비정상임을 감안할 때 본 발명의 전기화학 바이오 센서의 민감도가 매우 높다는 것을 나타내는 것으로, 이를 통해 PSA를 통한 전립선암 의심 환자 및 환자의 구분을 할 수 있다는 것을 의미한다.
상기 결과를 종합하면 본 발명의 플라스틱 전기화학 바이오 센서 및 본 발명의 나노 입자를 이용하여 전극 오염을 방지하고, 바이오 센서의 민감도를 증진시킬 수 있음을 확인하였다. 특히, 본 발명에 의한 PSA 검출 기술과 같은 의약 용도의 바이오 센서는 향후 전문가의 도움 없이 약 30 내지 40분이면 그 결과를 확인할 수 있을 뿐만 아니라 높은 민감도로 정성 및 정량 측정이 가능하기 때문에 정확한 진단이 가능하다는 장점을 갖는다. 따라서, 상기와 같은 결과를 통해 의료 분야로의 이용이 가능함을 확인하였으며, 실제 정성 및 정량 측정이 필요한 다양한 분야에서도 이용할 수 있음을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> College of Medicine Pochon CHA University Industry-Academic Cooperation Foundation
<120> Method for preparation of a highly sensitive electro-chemical
biosensor kit and the biosensor kit made by the same
<130> PA130846KR
<160> 9
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 705
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial GBP-protein G fusion sequence
<400> 1
atgcatcacc atcaccatca ccatggtaag acgcaagcca cgagcggcac catccagagc 60
atgcatggta aaacgcaagc cacgtctggt acgattcaaa gcatgcatgg caagacgcag 120
gccacctctg gcacgatcca aagcgaattc ttgaaaggcg aaacaactac tgaagctgtt 180
gatgctgcta ctgcagaaaa agtcttcaaa caatacgcta acgacaacgg tgttgacggt 240
gaatggactt acgacgatgc gactaagacc tttacagtta ctgaaaaacc agaagtgatc 300
gatgcgtctg aattaacacc agccgtgaca acttacaaac ttgttattaa tggtaaaaca 360
ttgaaaggcg aaacaactac tgaagctgtt gatgctgcta ctgcagaaaa agtcttcaaa 420
caatacgcta acgacaacgg tgttgacggt gaatggactt acgacgatgc gactaagacc 480
tttacagtta ctgaaaaacc agaagtgatc gatgcgtctg aattaacacc agccgtgaca 540
acttacaaac ttgttattaa tggtaaaaca ttgaaaggcg aaacaactac taaagcagta 600
gacgcagaaa ctgcagaaaa agccttcaaa caatacgcta acgacaacgg tgttgatggt 660
gtttggactt atgatgatgc gactaagacc tttacggtaa ctgaa 705
<210> 2
<211> 235
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial GBP-protein G fusion sequence
<400> 2
Met His His His His His His His Gly Lys Thr Gln Ala Thr Ser Gly
1 5 10 15
Thr Ile Gln Ser Met His Gly Lys Thr Gln Ala Thr Ser Gly Thr Ile
20 25 30
Gln Ser Met His Gly Lys Thr Gln Ala Thr Ser Gly Thr Ile Gln Ser
35 40 45
Glu Phe Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr
50 55 60
Ala Glu Lys Val Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly
65 70 75 80
Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Lys
85 90 95
Pro Glu Val Ile Asp Ala Ser Glu Leu Thr Pro Ala Val Thr Thr Tyr
100 105 110
Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu
115 120 125
Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe Lys Gln Tyr Ala Asn
130 135 140
Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr
145 150 155 160
Phe Thr Val Thr Glu Lys Pro Glu Val Ile Asp Ala Ser Glu Leu Thr
165 170 175
Pro Ala Val Thr Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys
180 185 190
Gly Glu Thr Thr Thr Lys Ala Val Asp Ala Glu Thr Ala Glu Lys Ala
195 200 205
Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Val Trp Thr Tyr
210 215 220
Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu
225 230 235
<210> 3
<211> 618
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial SBP-protein G fusion sequence
<400> 3
ccacctcctt ggctaccata catgccgcct tggtctttga aaggcgaaac aactactgaa 60
gctgttgatg ctgctactgc agaaaaagtc ttcaaacaat acgctaacga caacggtgtt 120
gacggtgaat ggacttacga cgatgcgact aagaccttta cagttactga aaaaccagaa 180
gtgatcgatg cgtctgaatt aacaccagcc gtgacaactt acaaacttgt tattaatggt 240
aaaacattga aaggcgaaac aactactgaa gctgttgatg ctgctactgc agaaaaagtc 300
ttcaaacaat acgctaacga caacggtgtt gacggtgaat ggacttacga cgatgcgact 360
aagaccttta cagttactga aaaaccagaa gtgatcgatg cgtctgaatt aacaccagcc 420
gtgacaactt acaaacttgt tattaatggt aaaacattga aaggcgaaac aactactaaa 480
gcagtagacg cagaaactgc agaaaaagcc ttcaaacaat acgctaacga caacggtgtt 540
gatggtgttt ggacttatga tgatgcgact aagaccttta cggtaactga actcgagcac 600
caccaccacc accactga 618
<210> 4
<211> 205
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial SBP-protein G fusion sequence
<400> 4
Pro Pro Pro Trp Leu Pro Tyr Met Pro Pro Trp Ser Leu Lys Gly Glu
1 5 10 15
Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe Lys
20 25 30
Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp
35 40 45
Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Lys Pro Glu Val Ile Asp Ala
50 55 60
Ser Glu Leu Thr Pro Ala Val Thr Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly
65 70 75 80
Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr
85 90 95
Ala Glu Lys Val Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly
100 105 110
Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Lys
115 120 125
Pro Glu Val Ile Asp Ala Ser Glu Leu Thr Pro Ala Val Thr Thr Tyr
130 135 140
Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Lys
145 150 155 160
Ala Val Asp Ala Glu Thr Ala Glu Lys Ala Phe Lys Gln Tyr Ala Asn
165 170 175
Asp Asn Gly Val Asp Gly Val Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr
180 185 190
Phe Thr Val Thr Glu Leu Glu His His His His His His
195 200 205
<210> 5
<211> 42
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> trimer of gold binding protein
<400> 5
Met His Gly Lys Ala Gln Ala Thr Ser Gly Thr Ile Gln Ser Met His
1 5 10 15
Gly Lys Ala Gln Ala Thr Ser Gly Thr Ile Gln Ser Met His Gly Lys
20 25 30
Ala Gln Ala Thr Ser Gly Thr Ile Gln Ser
35 40
<210> 6
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Silica binding protein
<400> 6
Pro Pro Pro Trp Leu Pro Tyr Met Pro Pro Trp Ser
1 5 10
<210> 7
<211> 555
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic sequence of protein G
<400> 7
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caatacgcta acgacaacgg tgttgacggt gaatggactt acgacgatgc gactaagacc 120
tttacagtta ctgaaaaacc agaagtgatc gatgcgtctg aattaacacc agccgtgaca 180
acttacaaac ttgttattaa tggtaaaaca ttgaaaggcg aaacaactac tgaagctgtt 240
gatgctgcta ctgcagaaaa agtcttcaaa caatacgcta acgacaacgg tgttgacggt 300
gaatggactt acgacgatgc gactaagacc tttacagtta ctgaaaaacc agaagtgatc 360
gatgcgtctg aattaacacc agccgtgaca acttacaaac ttgttattaa tggtaaaaca 420
ttgaaaggcg aaacaactac taaagcagta gacgcagaaa ctgcagaaaa agccttcaaa 480
caatacgcta acgacaacgg tgttgatggt gtttggactt atgatgatgc gactaagacc 540
tttacggtaa ctgaa 555
<210> 8
<211> 185
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic sequence of protein G
<400> 8
Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu
1 5 10 15
Lys Val Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp
20 25 30
Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Lys Pro Glu
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Val Ile Asp Ala Ser Glu Leu Thr Pro Ala Val Thr Thr Tyr Lys Leu
50 55 60
Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn
85 90 95
Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr
100 105 110
Val Thr Glu Lys Pro Glu Val Ile Asp Ala Ser Glu Leu Thr Pro Ala
115 120 125
Val Thr Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu
130 135 140
Thr Thr Thr Lys Ala Val Asp Ala Glu Thr Ala Glu Lys Ala Phe Lys
145 150 155 160
Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Val Trp Thr Tyr Asp Asp
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Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu
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<211> 193
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> protein G sequence
<400> 9
Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu
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Lys Val Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp
20 25 30
Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Lys Pro Glu
35 40 45
Val Ile Asp Ala Ser Glu Leu Thr Pro Ala Val Thr Thr Tyr Lys Leu
50 55 60
Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn
85 90 95
Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr
100 105 110
Val Thr Glu Lys Pro Glu Val Ile Asp Ala Ser Glu Leu Thr Pro Ala
115 120 125
Val Thr Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu
130 135 140
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145 150 155 160
Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Val Trp Thr Tyr Asp Asp
165 170 175
Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Leu Glu His His His His His
180 185 190
His
Claims (20)
1) 기판에 전극 패턴 및 전극 형성 부위에 해당하는 금 박막층을 형성하여 전기화학적 바이오 센서의 상판을 제조하는 단계;
2) 상기 상판을 전극이 형성되지 않은 하판과 부착시켜 마이크로 채널을 형성하는 단계;
3) 상기 마이크로 채널에 금 결합 단백질-단백질 G(GBP-ProG)를 포함하는 유체를 통과시키는 단계;
4) 상기 마이크로 채널에 검출 목적 물질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 유체를 통과시켜, GBP-ProG와의 결합을 통해 항체를 바이오 센서 상판에 고정하는 단계; 및
5) 상기 상판을 전극이 형성되지 않은 하판에서 분리하여 전극이 형성된 하판에 부착하여 바이오 센서를 제조하는 단계를 포함하는, 전기화학적 바이오 센서 키트의 제조 방법.
2) 상기 상판을 전극이 형성되지 않은 하판과 부착시켜 마이크로 채널을 형성하는 단계;
3) 상기 마이크로 채널에 금 결합 단백질-단백질 G(GBP-ProG)를 포함하는 유체를 통과시키는 단계;
4) 상기 마이크로 채널에 검출 목적 물질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 유체를 통과시켜, GBP-ProG와의 결합을 통해 항체를 바이오 센서 상판에 고정하는 단계; 및
5) 상기 상판을 전극이 형성되지 않은 하판에서 분리하여 전극이 형성된 하판에 부착하여 바이오 센서를 제조하는 단계를 포함하는, 전기화학적 바이오 센서 키트의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 3) 단계 이후에 마이크로 채널에 인산 완충 용액(Phosphate-buffered saline, PBS)을 통과시켜 상판 금 박막층에 결합하지 않은 GBP-ProG를 제거하는 단계를 추가로 포함하는, 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 3) 단계 이후에 상기 마이크로 채널에 블락킹(blocking) 용액을 통과시켜, 융합 단백질이 결합하지 않은 금 박막층을 블락킹하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 제조 방법.
제3항에 있어서, 상기 블락킹하는 단계 이후에 마이크로 채널에 인산 완충 용액(Phosphate-buffered saline, PBS)을 통과시켜 블락킹 용액을 제거하는 단계를 추가로 포함하는, 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 4) 단계 이후에 마이크로 채널에 인산 완충 용액(Phosphate-buffered saline, PBS)을 통과시켜 상판 금 박막층에 결합하지 않은 항체를 제거하는 단계를 추가로 포함하는, 제조 방법.
제1항에 있어서,
a) 실리카 나노 입자와 실리카 결합 단백질-단백질 G(SBP-ProG) 융합 단백질을 섞어, 실리카 나노 입자 표면에 SBP-ProG 융합 단백질을 부착시키는 단계; 및
b) 상기 a) 단계를 거친 실리카 나노 입자에 알칼라인 탈인산화 효소(Alkaline phosphatase, AP)로 표지된 검출 목적 물질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 액체를 섞어, SBP-ProG와의 결합을 통해 항체를 실리카 나노 입자에 고정하여 실리카 나노 입자를 제조하는 단계를 추가로 포함하는, 제조 방법.
a) 실리카 나노 입자와 실리카 결합 단백질-단백질 G(SBP-ProG) 융합 단백질을 섞어, 실리카 나노 입자 표면에 SBP-ProG 융합 단백질을 부착시키는 단계; 및
b) 상기 a) 단계를 거친 실리카 나노 입자에 알칼라인 탈인산화 효소(Alkaline phosphatase, AP)로 표지된 검출 목적 물질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 액체를 섞어, SBP-ProG와의 결합을 통해 항체를 실리카 나노 입자에 고정하여 실리카 나노 입자를 제조하는 단계를 추가로 포함하는, 제조 방법.
제6항에 있어서, 상기 a) 단계를 거친 실리카 나노 입자와 블락킹 용액을 섞어, 융합 단백질이 결합하지 않은 실리카 나노 입자 표면을 블락킹(blocking)하는 단계를 추가로 포함하는, 제조 방법.
제1항에 따른 제조 방법에 의해 제조된, 전기화학적 바이오 센서 키트에 있어서,
a) 기판 상에 금을 박막한 마이크로 채널 상판;
기판 상에 전극을 포함하는 마이크로 채널 하판;
검출 목적 물질에 특이적으로 결합하는 항체; 및
상기 상판에 상기 항체를 고정하는 금 결합 단백질(Gold binding protein, GBP)-단백질 G(protein G) 융합 단백질; 을 포함하며, 상기 금 결합 단백질-단백질 G 융합 단백질을 구성하는 금 결합 단백질은 상기 상판에 박막된 금에 결합되고, 단백질 G는 항체에 결합되고, 상기 채널 상판과 채널 하판이 부착하여 마이크로 채널을 형성하는 것인 전기화학적 바이오 센서;와
b) 실리카 나노 입자;
산화 환원 효소로 표지된 검출 목적 물질에 특이적으로 결합하는 항체; 및
상기 나노 입자에 상기 검출 목적 물질에 특이적으로 결합하는 항체를 고정하는 실리카 결합 단백질(Silica binding protein, SBP)-단백질 G(protein G) 융합 단백질; 을 포함하며, 상기 실리카 결합 단백질-단백질 G 융합 단백질을 구성하는 실리카 결합 단백질은 실리카 나노 입자에 결합되고, 단백질 G는 항체에 결합되는 것인 검출용 실리카 나노 입자;를 포함하는 것을 특징으로 하며, 상기 전기화학적 바이오 센서 키트는 전극 오염(electode fouling) 현상이 방지되는 것인, 전기화학적 바이오 센서 키트.
a) 기판 상에 금을 박막한 마이크로 채널 상판;
기판 상에 전극을 포함하는 마이크로 채널 하판;
검출 목적 물질에 특이적으로 결합하는 항체; 및
상기 상판에 상기 항체를 고정하는 금 결합 단백질(Gold binding protein, GBP)-단백질 G(protein G) 융합 단백질; 을 포함하며, 상기 금 결합 단백질-단백질 G 융합 단백질을 구성하는 금 결합 단백질은 상기 상판에 박막된 금에 결합되고, 단백질 G는 항체에 결합되고, 상기 채널 상판과 채널 하판이 부착하여 마이크로 채널을 형성하는 것인 전기화학적 바이오 센서;와
b) 실리카 나노 입자;
산화 환원 효소로 표지된 검출 목적 물질에 특이적으로 결합하는 항체; 및
상기 나노 입자에 상기 검출 목적 물질에 특이적으로 결합하는 항체를 고정하는 실리카 결합 단백질(Silica binding protein, SBP)-단백질 G(protein G) 융합 단백질; 을 포함하며, 상기 실리카 결합 단백질-단백질 G 융합 단백질을 구성하는 실리카 결합 단백질은 실리카 나노 입자에 결합되고, 단백질 G는 항체에 결합되는 것인 검출용 실리카 나노 입자;를 포함하는 것을 특징으로 하며, 상기 전기화학적 바이오 센서 키트는 전극 오염(electode fouling) 현상이 방지되는 것인, 전기화학적 바이오 센서 키트.
삭제
제8항에 있어서, 상기 산화 환원 효소는 알칼라인 탈인산화 효소(Alkaline phosphatase, AP)인 것인, 전기화학적 바이오 센서 키트.
제8항에 있어서, 상기 금 결합 단백질-단백질 G 융합 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 것인, 전기화학적 바이오 센서 키트.
제8항에 있어서, 상기 실리카 결합 단백질-단백질 G 융합 단백질은 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성되는 것인, 전기화학적 바이오 센서 키트.
제8항에 있어서, 상기 기판은 플라스틱인 것인, 전기화학적 바이오 센서 키트.
삭제
제8항에 있어서, 상기 검출 목적 물질은 화합물, 단백질, 사이토카인, 수용체 단백질, DNA, SNP, RNA, miRNA 및 세균과 바이러스를 포함하는 병원성 미생물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 전기화학적 바이오 센서 키트.
제8항에 있어서, 상기 검출 목적 물질은 질병 마커인 것인, 전기화학적 바이오 센서 키트.
제16항에 있어서, 상기 질병 마커는 전립선암의 마커인 Prostate specific antigen(PSA)인 것인, 전기화학적 바이오 센서 키트.
제8항에 따른 전기화학적 바이오 센서 키트를 이용하고 하기 단계를 포함하는 검출 목적 물질의 검출 방법으로서,
1) 상기 전기화학적 바이오 센서 키트의 바이오 센서의 마이크로 채널 내로 시료를 통과시키는 단계;
2) 상기 마이크로 채널 내로 상기 전기화학적 바이오 센서 키트의 실리카 나노 입자를 처리하는 단계; 및
3) 상기 마이크로 채널 내로 알칼라인 탈인산화 효소의 기질인 ρ-Aminophenylphosphate monosodium salt (PAPP)를 통과시켜 얻어지는 산화 환원 그래프를 측정하는 단계를 포함하는, 검출 방법.
1) 상기 전기화학적 바이오 센서 키트의 바이오 센서의 마이크로 채널 내로 시료를 통과시키는 단계;
2) 상기 마이크로 채널 내로 상기 전기화학적 바이오 센서 키트의 실리카 나노 입자를 처리하는 단계; 및
3) 상기 마이크로 채널 내로 알칼라인 탈인산화 효소의 기질인 ρ-Aminophenylphosphate monosodium salt (PAPP)를 통과시켜 얻어지는 산화 환원 그래프를 측정하는 단계를 포함하는, 검출 방법.
제18항에 있어서, 상기 1) 단계 이후에 마이크로 채널에 인산 완충 용액(Phosphate-buffered saline, PBS)을 통과시키는 세척 단계를 추가로 포함하는, 검출 방법.
제18항에 있어서, 상기 2) 단계 이후에 마이크로 채널에 인산 완충 용액을 통과시키는 세척 단계를 추가로 포함하는, 검출 방법.
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| KR1020140121168A KR101776367B1 (ko) | 2014-09-12 | 2014-09-12 | 고감도 전기화학 기반 바이오 센서 키트 제조 방법 및 이로부터 제조된 바이오 센서 키트 |
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