KR101775984B1 - 중동호흡기증후군 코로나바이러스 검출용 분자비콘 및 이의 용도 - Google Patents
중동호흡기증후군 코로나바이러스 검출용 분자비콘 및 이의 용도Info
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Abstract
본 발명은 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV) 검출용 분자비콘(molecular beacon)에 관한 것으로, 보다 구체적으로 중동호흡기증후군 코로나바이러스의 nsp3 영역과 구조단백질 영역인 M 염기서열 부위를 탐지하는 분자비콘, 이를 이용한 중동호흡기증후군 코로나바이러스 감염 진단용 키트 및 중동호흡기증후군 코로나바이러스 검출방법에 관한 것이다. 본 발명의 분자비콘은 항체 이상의 표적 친화력을 가지며, 항체 및 압타머에 비해 크기가 월등히 작아 표적 분자와 높은 결합력으로 반응할 수 있고, 온도 변화에 민감하지 않으며 변성이 없고, 빠른 시간 안에 소량의 표적 핵산 분자만으로도 탐지가 가능한 장점이 있다. 또한, 형광 또는 UV 스펙트럼을 사용하는 간편한 방법으로 검출이 가능하므로, 본 발명의 분자비콘을 이용한 MERS-CoV 검출용 키트는 MERS-CoV 감염 여부의 진단에 널리 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV) 검출용 분자비콘(molecular beacon)에 관한 것으로, 보다 구체적으로 중동호흡기증후군 코로나바이러스의 nsp3 영역과 구조단백질 영역인 M 염기서열 부위를 탐지하는 분자비콘, 이를 이용한 중동호흡기증후군 코로나바이러스 감염 진단용 키트 및 중동호흡기증후군 코로나바이러스 검출방법에 관한 것이다.
최근 우리나라에 전파되었던 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV)는 2012년에 새로 발견된 베타코로나바이러스(Betacoronavirus; βCoV)로 약 3만kb의 (+)-센스 단일가닥(single-stranded) RNA 바이러스이며, 5′-복제효소-구조단백질(spike-envelope-membrane-nucleocapsid)-poly(A)-3′[5′-ORF1a/b-S-E-M-N-poly(A)]의 구조를 갖는다. nsp3 (papain-like protease), nsp5 (chymotrypsin-like, 3C-like, 또는 main protease), nsp12 (RNA-dependent RNA polymerase [RdRp]), nsp13 (helicase), 기타 nsp는 바이러스의 복제와 전사에 관여하며, 다른 구조단백질인 E-M-N은 ORF 6,7,8에 의해 암호화하여 비리온과 어셈블리된다. M과 파파인 유사 단백질분해효소와 보조단백질인 4A,4B,5는 인터페론 길항체로 바이러스의 복제와 병원성을 조절하는 것으로 알려져 있다.
각종 바이러스의 검출용 조직과 배양 세포에서 유전자의 발현을 탐색하기 위한 방법으로 DNA 마이크로어레이나 qPCR 등의 기술들이 소개되어 왔으나, 이들은 복제된 상대적인 바이러스 mRNA에서 측정 가능한 바이러스 게놈을 정량화하는 단계를 필요로 하므로, 많은 시간과 비용이 소요되는 단점이 있다. 한편, 분자비콘(molecular beacon)은 특정 핵산의 존재를 알려 주는 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브로서, 양 말단에 각각 형광체와 소광체가 결합되어 있는 헤어핀(hairpin) 형태를 갖는다. 상기 형광체에서 발생한 형광은 내부적으로 소광체에 의해 소광된 상태로 있게 되나, 표적 핵산과 혼성화 반응이 일어나게 되면 상기 헤어핀 구조의 자가 결합 부위가 열리면서 형광이 발생하게 된다. 분자비콘 관련 기술의 예로서, 대한민국 등록특허 제10-0607901호는 단일가닥 핵산 서열에 따른 분자비콘을 제조하고, 상기 제조된 분자비콘을 이용하여 특정물질을 동정 및 정량하는 방법을 개시하고 있으며, 대한민국 등록특허 제10-1449843호는 우수한 소광 특성을 갖는 흑연 나노입자를 함유하는 분자비콘을 개시한다. 또한, 대한민국 등록특허 제10-1249493호는 과산화효소 활성이 있는 핵산효소와 헤어핀 구조를 형성하는 분자비콘의 복합체와 블로커 핵산 및 핵산중합효소 반응을 통한 표적핵산을 검출하는 방법을 개시하였다. 그러나 아직까지 MERS-CoV를 특이적으로 검출할 수 있는 DNA 분자비콘은 개시된 바 없다.
이에 본 발명자들은 MERS-CoV의 감염 여부를 빠른 시간 내에 간편하면서도 정확하게 확인할 수 있는 특정 서열의 MERS-CoV 검출용 분자비콘을 개발하게 되었다.
본 발명의 목적은 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV)를 특이적으로 검출할 수 있는 분자비콘(molecular beacon)을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 분자비콘을 이용한 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV) 감염 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 분자비콘을 이용한 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV)의 검출방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 양 말단 부위에 분자비콘의 신호 개폐(on/off)를 조절하는 서열을 포함하며, 그 사이에 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV)의 특정 영역을 감지하는 상보적 염기서열을 포함하는 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV) 검출용 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 링커(linker) 영역을 추가로 포함할 수 있다. 상기 링커 영역은 올리고뉴클레오티드의 말단에 형광체 또는 소광체를 도입하기 용이하도록 하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열을 갖는다. 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드의 경우, 5'-말단의 13개 염기서열과 3'-말단의 24개 염기서열은 분자비콘 신호의 개폐(on/off)를 조절하는 부위이며, 그 사이에 위치한 14번부터 35번 염기까지가 MERS-CoV의 PLpro nsp3 영역을 감지하는 상보적인 염기서열이 위치하는 영역이다(도 2). 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드의 경우에는, 5'-말단의 13개 염기서열과 3'-말단의 22개 염기서열은 분자비콘 신호의 개폐(on/off)를 조절하는 부위이며, 그 사이에 위치한 14번부터 35번 염기까지가 MERS-CoV의 구조단백질 M의 영역을 감지하는 상보적인 염기서열이 위치하는 영역이다(도 2).
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 5'-말단 부위에는 형광체가, 3'-말단 부위에는 소광체가 각각 결합될 수 있으며, 상기 분자비콘 신호 개폐 조절부위는 MERS-CoV의 표적 핵산이 인식될 경우에만 소광체와 형광체 간의 거리를 멀어지게 하는 분자비콘의 중요 자기인식 기능 염기서열 영역이다.
또한, 본 발명은 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드; 상기 올리고뉴클레오티드의 5'-말단에 연결된 형광체; 및 상기 올리고뉴클레오티드의 3'-말단에 연결된 소광체를 포함하는 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV) 검출용 분자비콘(molecular beacon)을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 형광체의 예로는, 로다민과 그의 유도체, 플루오레신과 그의 유도체, 쿠마린과 그의 유도체, 아크리딘과 그의 유도체, 피렌과 그의 유도체, 에리트로신과 그의 유도체, 에오신과 그의 유도체 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열의 8번째 염기는 비오틴(biotin) 결합 부위일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 분자비콘을 포함하는 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV) 감염 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 분자비콘은 막, 용액, 유리 또는 플라스틱 중합체, 기타 고체 지지체의 표면에 고정화된 것일 수 있다. 본 발명의 분자비콘을 고체 지지체의 표면에 고정화하는 과정은 당업계에 알려진 임의의 프로브 고정화 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면, 비오틴-스트렙타비딘(biotin-streptavidin), NH2-COOH의 EDC링커에 의한 가교결합법, 80 ℃에서의 베이킹 또는 UV 가교화가 사용될 수 있다. 또한, 활성화된 고체 기판 상에서 프로브 중합체가 포토리소그래피에 의하여 합성되는 방법 (WO 92/100092) 또는 이미 합성된 프로브를 활성화된 기판의 표면에 공유 결합시키는 방법 (spotting 법) 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 분자비콘은 마이크로어레이의 기판상에 고정화되어 있는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 분자비콘은 고체 지지체의 표면에 고정화될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 고정화는 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 8번째 염기에 결합된 비오틴(biotin)과 고체 지지체에 연결된 스트렙타비딘(streptavidin) 사이의 상호작용에 의해 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은, 검체로부터 핵산을 수득하는 단계; 상기 핵산을 상기 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV) 검출용 분자비콘과 반응시키는 단계; 및 상기 분자비콘으로부터 발생하는 형광을 검출하는 단계를 포함하는 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV) 검출방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 검체로부터 핵산을 수득하는 단계는 당 업계에 알려진 임의의 핵산 추출법, 예컨대 페놀-클로로포름 추출법, 핵산에 고상제제를 이용한 정제법 또는 칼럼에 충진된 레진을 이용하여 흡착시켜 추출하는 법 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 핵산을 수득하는 단계는 검체로부터 RNA를 분리하는 단계; 및 분리된 RNA로부터 cDNA나 RNA를 얻는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 cDNA를 합성하는 방법은 역전사효소를 이용하여 분리된 RNA로부터 cDNA를 얻는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 이러한 역전사효소 반응은 PCR 반응과 연계될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 분자비콘 시스템은 RNA 또는 cDNA형태로 반응을 구현할 수도 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 반응은 핵산과 분자비콘 사이의 혼성화(hybridization) 반응으로, 실온에서 이루어질 수 있다. 또한, 상기 반응에 사용되는 분자비콘의 농도는 10 내지 100 pmol인 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 분자비콘은 항체 이상의 표적 친화력을 가지며, 항체 및 압타머에 비해 크기가 월등히 작아 표적 분자와 높은 결합력으로 반응할 수 있고, 온도 변화에 민감하지 않으며 변성이 없고, 빠른 시간 안에 소량의 표적 핵산 분자만으로도 탐지가 가능한 장점이 있다. 또한, 형광 또는 UV 스펙트럼을 사용하는 간편한 방법으로 검출이 가능하므로, 본 발명의 분자비콘을 이용한 MERS-CoV 검출용 키트는 MERS-CoV 감염 여부의 진단에 널리 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 분자비콘(molecular beacon)의 구조를 나타낸 그림이다.
도 2는 MERS-CoV의 PLpro nsp3 영역을 감지하는 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드와, MERS-CoV의 구조단백질 M 영역을 감지하는 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드의 구조를 나타낸 그림이다.
도 3은 서열번호 1 또는 2의 올리고뉴클레오티드에서 비오틴이 결합하는 부위를 나타낸 그림이다.
도 4는 본 발명에 따른 MERS-CoV 검출용 분자비콘으로 분석한 MERS-CoV의 nsp3에 대한 UV 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 MERS-CoV 검출용 분자비콘으로 분석한 MERS-CoV의 nsp3에 대한 UV 스펙트럼의 형광강도를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 MERS-CoV 검출용 분자비콘으로 분석한 MERS-CoV의 M에 대한 UV 스펙트럼의 형광강도를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명에 따른 MERS-CoV 검출용 분자비콘으로 분석한 MERS-CoV의 nsp3를 공초점 현미경으로 관찰한 결과(적색형광)를 나타낸 것이다.
도 8은 MERS-CoV의 표적 핵산인자를 탐지할 수 있는 정량적 분자비콘 증폭시스템의 형광프로브 반응 개념도이다.
도 9는 중동호흡기 코로나 바이러스의 합성 유전자로부터 분자비콘으로 분석한 MER-CoV의 N영역을 농도별로 탐지한 PCR 결과물을 1% 아가로즈겔에서 분리한 밴드이다.
도 10은 중동호흡기 코로나 바이러스의 합성 유전자로부터 분자비콘로 분석한 MER-CoV의 N영역을 농도별로 탐지한 nanodrop uv-spectrum 그래프이다.
도 11은 중동호흡기 코로나 바이러스의 합성 유전자로부터 분자비콘로 분석한 MER-CoV의 nsp2영역을 농도별로 탐지한 nanodrop uv-spectrum 그래프이다.
도 12는 본 발명의 일실시예에 따른 MER-CoV의 nsp3 또는 M 영역을 감지하는 상보적인 염기서열을 포함하는 분자비콘을 이용하여 시험관 내에서 반응시킨 결과값이다.
도 13은 본 발명의 일실시예에 따른 MER-CoV M을 검출하는 분자비콘의 구조를 나타낸 그림이다. 염기번호 1에서 12 내지 36에서 57/59은 표적 중동호흡기 바이러스 핵산이 존재할 경우만 인식하여 소광체와 형광체 간의 거리가 멀어지게 하는 분자비콘의 중요 자기인식 기능 염기서열 영역을 나타낸다.
도 14는 MERS-CoV와 사스 코로나바이러스의 유전자게놈 유사성에 관한 그림을 나타낸 것으로 본 발명의 표적부위를 선정하는데 지표이다.
도 15는 기존 MERS-CoV의 표적 영역 qRT-PCR의 프라이머 영역과 유전자 지도를 나타낸 것이다.
도 16은 MERS-CoV의 표적 핵산인자를 탐지할 수 있는 정량적 분자비콘 증폭시스템의 형광프로브 반응 개념도이다.
도 17은 MERS-CoV을 탐지하기 위한 시험관 내 액체상의 시료의 울트라 분자비콘 시스템과 선행 시험 결과값을 나타낸 것이다.
도 18은 MERS-CoV의 다양한 표적 염기서열 영역과 바이러스를 탐지하기 위한 UFO 매개 분석법의 개념도와 이에 따른 실험 결과값(초강력 형광강도)을 나타낸 이다.
도 19는 MERS-CoV을 탐지하기 위한 FRET 분석법의 개념도와 이를 이용하여 다양한 바이러스를 탐지한 결과값을 나타낸 것이다.
도 20은 나노입자표면에 표지한 MERS-CoV의 다양한 표적영역을 대상으로 분자비콘 탐지시스템을 부착하여 분석한 결과값이다.
도 21은 MERS-CoV을 탐지하기 위해 다중 바이러스를 탐지할 수 있는 96웰(well) 내지 시험관 내 측정을 이용하는 방법을 나타낸 것이다.
도 22는 MERS-CoV을 탐지하기 위한 스트립 진단키트를 적용한 초간편 분석 기법을 나타낸 개념도이다.
도 23은 MERS-CoV을 탐지하기 위해 공기 속에 존재하는 바이러스를 특정 종이막이나 반응 막대에 코팅된 민들레 홀씨기능 다중 표적인자의 분자비콘시약을 코팅하여 반응시 나타난 형광영상 이미징 결과이다.
도 24는 공기중에 MERS-CoV와 같은 급성 호흡기바이러스를 탐지하기 위한 카멜레온 장난감이나 모형에 분자비콘 탐지 시약을 코팅시켜 색상에 따라 바이러스의 감염유무를 확인할 수 있는 기법을 나타낸 개념도이다.
도 25는 본 발명의 중동호흡기 코로나 바이러스 탐지용 분자비콘으로 분석한 MERS-CoV의 PLOpro nsp3에 대한 UV 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 26은 본 발명의 중동호흡기 코로나 바이러스 탐지용 분자비콘으로 분석한 MERS-CoV의 M에 대한 농도별 UV 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 27은 본 발명의 중동호흡기 코로나 바이러스 탐지용 분자비콘으로 분석한 MERS-CoV의 nsp3에 대한 농도별로 반응시킨 UV 스펙트럼 시료를 공초점 현미경으로 관찰한 적색형광을 나타낸 이미지이다.
도 28은 본 발명의 중동호흡기 코로나 바이러스의 합성 유전자에 대해 분자비콘으로 분석한 MER-CoV의 N 영역을 농도별로 탐지한 qRT-PCR 결과물의 증폭정도를 나타낸 그래프이다.
도 29는 본 발명의 일실시예에 따른 MERS-CoV의 nsp2 영역을 감지하는 프로브와 이에 대한 프라이머를 나타낸 그림이다.
도 30은 본 발명의 일실시예에 따른 MERS-CoV의 N2 영역을 감지하는 프로브와 이에 대한 프라이머를 나타낸 그림이다.
도 2는 MERS-CoV의 PLpro nsp3 영역을 감지하는 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드와, MERS-CoV의 구조단백질 M 영역을 감지하는 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드의 구조를 나타낸 그림이다.
도 3은 서열번호 1 또는 2의 올리고뉴클레오티드에서 비오틴이 결합하는 부위를 나타낸 그림이다.
도 4는 본 발명에 따른 MERS-CoV 검출용 분자비콘으로 분석한 MERS-CoV의 nsp3에 대한 UV 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 MERS-CoV 검출용 분자비콘으로 분석한 MERS-CoV의 nsp3에 대한 UV 스펙트럼의 형광강도를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 MERS-CoV 검출용 분자비콘으로 분석한 MERS-CoV의 M에 대한 UV 스펙트럼의 형광강도를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명에 따른 MERS-CoV 검출용 분자비콘으로 분석한 MERS-CoV의 nsp3를 공초점 현미경으로 관찰한 결과(적색형광)를 나타낸 것이다.
도 8은 MERS-CoV의 표적 핵산인자를 탐지할 수 있는 정량적 분자비콘 증폭시스템의 형광프로브 반응 개념도이다.
도 9는 중동호흡기 코로나 바이러스의 합성 유전자로부터 분자비콘으로 분석한 MER-CoV의 N영역을 농도별로 탐지한 PCR 결과물을 1% 아가로즈겔에서 분리한 밴드이다.
도 10은 중동호흡기 코로나 바이러스의 합성 유전자로부터 분자비콘로 분석한 MER-CoV의 N영역을 농도별로 탐지한 nanodrop uv-spectrum 그래프이다.
도 11은 중동호흡기 코로나 바이러스의 합성 유전자로부터 분자비콘로 분석한 MER-CoV의 nsp2영역을 농도별로 탐지한 nanodrop uv-spectrum 그래프이다.
도 12는 본 발명의 일실시예에 따른 MER-CoV의 nsp3 또는 M 영역을 감지하는 상보적인 염기서열을 포함하는 분자비콘을 이용하여 시험관 내에서 반응시킨 결과값이다.
도 13은 본 발명의 일실시예에 따른 MER-CoV M을 검출하는 분자비콘의 구조를 나타낸 그림이다. 염기번호 1에서 12 내지 36에서 57/59은 표적 중동호흡기 바이러스 핵산이 존재할 경우만 인식하여 소광체와 형광체 간의 거리가 멀어지게 하는 분자비콘의 중요 자기인식 기능 염기서열 영역을 나타낸다.
도 14는 MERS-CoV와 사스 코로나바이러스의 유전자게놈 유사성에 관한 그림을 나타낸 것으로 본 발명의 표적부위를 선정하는데 지표이다.
도 15는 기존 MERS-CoV의 표적 영역 qRT-PCR의 프라이머 영역과 유전자 지도를 나타낸 것이다.
도 16은 MERS-CoV의 표적 핵산인자를 탐지할 수 있는 정량적 분자비콘 증폭시스템의 형광프로브 반응 개념도이다.
도 17은 MERS-CoV을 탐지하기 위한 시험관 내 액체상의 시료의 울트라 분자비콘 시스템과 선행 시험 결과값을 나타낸 것이다.
도 18은 MERS-CoV의 다양한 표적 염기서열 영역과 바이러스를 탐지하기 위한 UFO 매개 분석법의 개념도와 이에 따른 실험 결과값(초강력 형광강도)을 나타낸 이다.
도 19는 MERS-CoV을 탐지하기 위한 FRET 분석법의 개념도와 이를 이용하여 다양한 바이러스를 탐지한 결과값을 나타낸 것이다.
도 20은 나노입자표면에 표지한 MERS-CoV의 다양한 표적영역을 대상으로 분자비콘 탐지시스템을 부착하여 분석한 결과값이다.
도 21은 MERS-CoV을 탐지하기 위해 다중 바이러스를 탐지할 수 있는 96웰(well) 내지 시험관 내 측정을 이용하는 방법을 나타낸 것이다.
도 22는 MERS-CoV을 탐지하기 위한 스트립 진단키트를 적용한 초간편 분석 기법을 나타낸 개념도이다.
도 23은 MERS-CoV을 탐지하기 위해 공기 속에 존재하는 바이러스를 특정 종이막이나 반응 막대에 코팅된 민들레 홀씨기능 다중 표적인자의 분자비콘시약을 코팅하여 반응시 나타난 형광영상 이미징 결과이다.
도 24는 공기중에 MERS-CoV와 같은 급성 호흡기바이러스를 탐지하기 위한 카멜레온 장난감이나 모형에 분자비콘 탐지 시약을 코팅시켜 색상에 따라 바이러스의 감염유무를 확인할 수 있는 기법을 나타낸 개념도이다.
도 25는 본 발명의 중동호흡기 코로나 바이러스 탐지용 분자비콘으로 분석한 MERS-CoV의 PLOpro nsp3에 대한 UV 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 26은 본 발명의 중동호흡기 코로나 바이러스 탐지용 분자비콘으로 분석한 MERS-CoV의 M에 대한 농도별 UV 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 27은 본 발명의 중동호흡기 코로나 바이러스 탐지용 분자비콘으로 분석한 MERS-CoV의 nsp3에 대한 농도별로 반응시킨 UV 스펙트럼 시료를 공초점 현미경으로 관찰한 적색형광을 나타낸 이미지이다.
도 28은 본 발명의 중동호흡기 코로나 바이러스의 합성 유전자에 대해 분자비콘으로 분석한 MER-CoV의 N 영역을 농도별로 탐지한 qRT-PCR 결과물의 증폭정도를 나타낸 그래프이다.
도 29는 본 발명의 일실시예에 따른 MERS-CoV의 nsp2 영역을 감지하는 프로브와 이에 대한 프라이머를 나타낸 그림이다.
도 30은 본 발명의 일실시예에 따른 MERS-CoV의 N2 영역을 감지하는 프로브와 이에 대한 프라이머를 나타낸 그림이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1>
본 발명에 따른
MERS
-
CoV
검출용
분자비콘의
제작
GenBank로부터 MERS-CoV의 서열을 입수하고 dnastar 프로그램을 이용하여 보존된 표적 영역(nsp3와 M 영역)을 선발하고, 표적 영역을 감지할 수 있는 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드를 합성하였다(도 2).
상기 합성된 올리고뉴클레오티드를 92℃에서 2분간, 72℃에서 1분간 4℃에서 10분간 처리하여 3차원 구조를 가진 입체 분자비콘 프로브를 만들고, QD565, QD525 및/또는 QD705와 소광체인 BHQ1, BHQ2 또는 BHQ3을 각각 양쪽에 부착시킨 형광 분자비콘 프로브의 아민기와 양식에 따라 용액상태, 나노입자 표면, 유리표면, 막 또는 플라스틱 중합체와 고체 지지체의 표면에 고정화된 카르복실기 화합물에 근거리 링커인 EDC같은 화합물로 연결시켜 프로브 세트를 첨가하여, 실온에서 2분 동안 반응시킴으로써 고정화하였다. 얻어진 혼성체를 상기한 바와 같은 수종의 각 바이러스로부터 준비한 핵산이 포함되어 있는 시료를 상기 바이러스에 특이적인 올리고뉴클레오티드가 고정화되어 있는 상태에 첨가하고 25℃에서 2분 동안 혼성화 반응을 수행하였다.
<
실시예
2>
MERS-CoV의 nsp2, 3, M 및 N2 영역의 특정 부위에 대해 인공 합성한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 대상으로 본 발명의 분자비콘의 형광 신호를 분석하였다.
혼성화후 세척 완충액으로 세척후 200-800nm에서 nanodrop으로 흡광도를 측정하였으며 고유의 피크가 보이는 영역을 토대로 반응유무를 확인하였다.
또한, 스트렙타비딘으로 코팅된 슬라이드 표면에 비오틴이 부착된 수종의 프로브와 프라이머를 혼합하여 이를 유리판에 분주한 다음 2분 후에 공초점 현미경으로 관찰한 결과, MERS-CoV의 nsp2, nsp3, M 그리고 N2의 올리고 뉴클레오티드에 결합에 의해 형광비콘의 신호가 켜져서 적색 형광이 관찰된 것을 알 수 있었다.
<
실시예
3>
MERS-CoV의 nsp2, 3와 M 영역의 특정 영역에 대해 환자검체를 대상으로 분자비콘 시스템 프로브 1pmol (10μl)와 검체 1μl이상 (50pmol)이상을 에펜도로프튜브에 넣고 2분간 실온상태에서 혼성화시킨 다음 이를 nanodrop(Therma, USA)를 이용하여 1μl를 분주하고 uv-spetrum으로 확인하면서 양을 측정한 결과 100pmol에서 가장 강하게 반응하였으며, 이는 해당 바이러스가 존재하는 수 개에서 수천 개가 존재하는 정도이므로 발병 초기에 감염 유무를 확인하기에 적합한 농도범위로 볼 수 있다.
유리 슬라이드 위에 도말 후 LSM710공초점 현미경하에서 em/ex을 565/635nm파장대에서 확인하여 본 결과 적색 형광의 스팟이 정확히 확인되었으며, 이는 검체양과 형광 이미징와의 정확히 일치하는 경향을 보여 분자비콘 시스템으로 최단시간 초스피드로 정량화할 수 있다는 결론을 제시하고 있다.
<
실시예
4>
중동호흡기
바이러스(
MERS
-
CoV
) 이외 수종의 바이러스에 특이적인 표적서열을 탐지하기 위한 형광 프라이머의 선정
본 실시예에서는 중동호흡기 바이러스 (MERS-CoV), 홍역 바이러스 (measles virus), 엔테로바이러스 (enterovirus), 라이노바이러스 (rhinovirus), 사스 연관 코로나바이러스 (SARS-associated coronavirus: SARS-coV), 수두바이러스 (varicella zoster virus : VSV), 아데노바이러스 (adenovirus), 인간 파라인플루엔자바이러스 1 (human parainfluenza virus 1: HPIV 1), 인간 파라인플루엔자바이러스 2 (human parainfluenza virus 2: HPIV 2), 인간 파라인플루엔자바이러스 3 (human parainfluenza virus 3: HPIV 3), 인플루엔자바이러스 A (Influenza virus A : IVA), 인플루엔자바이러스 B (Influenza virus B : IVB) 및 호흡기세포융합바이러스 A (respiratory syncytial virus A : RSVA)와 호흡기세포융합바이러스 B (respiratorysyncytial virus B : RSVB)에 특이적인 표적서열을 탐지할 수 있는 형광 프로브 프라이머 세트를 디자인하였다.
먼저 genebank로부터 호흡기 질환을 야기하는 바이러스의 서열을 입수하고 dnastar 프로그램을 이용하여 이들로부터 각각 보존된 영역을 선발하였다. MERS-CoV의 nsp3와 M영역, N2, 홍역바이러스의 L유전자, 엔테바이러스 UTR(폴리단백질), 라이노바이러스 5UTR (폴리단백질), SARS-CoV(GD69), VZV (ORF54), 아데노바이러스 (HEXON), HPIV1 (HN), HPIV2(HN), HPIV3(HN), IVA (MP), IVB(NP), RSVA(F유전자), RSVB (F 유전자)으로 이들 보존적 영역으로부터 홍역바이러스 ,엔테로바이러스, 라이노바이러스, SARS-Cov, 아데노바이러스, VZV, HPIV1, HPIV2, HPIV3, IVA, IVB, RSVA 및 RSVB에 각각 특이적인 서열의 프라이머쌍을 선정하였다.
- MERS-CoV 특이적 프로브 (서열번호 3)
ttcgctgtttaccatagaaggtgtaaaggagtttttgtttgagggacaggtaaacagcg
- MERS-CoV 229e 특이적 프로브 (서열번호 4)
ttcgctgtcaacttccacactcaatgaatgcggagtggtaaatgtaggaagttgacagcg
- 홍역 바이러스(measles virus) 특이적 프로브 (서열번호 5)
atggatggatgtrgtgaggaa
- 엔테 로바이러스(enterovirus) 특이적 프로브 (서열번호 6)
tcgtaagggcaactctgcagcg
- 라이노바이러스(rhinovirus) 특이적 프로브 (서열번호 7)
gtcgtaatgagcaattccgggacg
- 사스 연관 코로나바이러스(SARS-associated coronavirus:SARS-coV) 특이적 프로브 (서열번호 8)
ttcgctgtcatgcaagtcgaagaggtgcaaccatccatgatatcatgacagcg
- 수두바이러스(varicella zoster virus : VSV) 특이적 프로브 (서열번호 9)
acccttccatttaaaccactggtatag
- 아데노바이러스(adenovirus) 특이적 프로브 (서열번호 10)
gcgctrgayatgacttttgaggt
- 인간 파라인플루엔자바이러스 1 (human parainfluenza virus 1: HPIV 1) 특이적 프로브 (서열번호 11)
atgttctgtamtagstgcaggaacaag
- 인간 파라인플루엔자바이러스 2 (human parainfluenza virus 2: HPIV 2) 특이적 프로브 (서열번호 12)
atctaaccagtatttagcaatggg
- 인간 파라인플루엔자바이러스 3 (human parainfluenza virus 3: HPIV 3) 특이적 프로브 (서열번호 13)
tggcataaygtgytatcaagaccag
- 인플루엔자바이러스 A (Influenza virus A :IVA) 특이적 프로브 (서열번호 14)
ggctaaagacaagaccratcctg
- 인플루엔자바이러스 B (Influenza virus B : IVB) 특이적 프로브 (서열번호 15)
aaccagatgatggtcaaagctggrc
- 호흡기세포융합바이러스 A (respiratory syncytial virus A : RSVA) 특이적 프로브 (서열번호 16)
ccagcaaagttaytctatcatgtc
- 호흡기세포융합바이러스 B (respiratory syncytial virus B : RSVB) 특이적 프로브 (서열번호 17)
ttyttctgrtcatttgttataggca
1) 프로브의 설계
각 바이러스 게놈의 표적영역으로부터 프로브를 선정하였으며 그 서열은 염기서열을 22 올리고뉴클레오티드를 포함한 핵산 형광 분자비콘 프로브로 제작되었다.
2) 혼성화 반응
상기 프로브가 합성된 구조를 우선 92℃에서 2분간, 72℃에서 1분간 4℃에서 10분간 처리하고 3차원 구조를 가진 입체 분자비콘 프로브에 QD565, QD525 및 QD705와 소광체인 BHQ1, BHQ2 혹은 BHQ3을 각각 양쪽에 부착시킨 형광 분자비콘 프로브의 아민기와 양식에 따라 용액상태, 나노입자 표면, 유리표면, 막 또는 플라스틱 중합체와 고체 지지체의 표면에 고정화된 카르복실기 화합물에 근거리 링커인 EDC같은 화합물로 연결시켜 프로브 세트를 첨가하여, 실온에서 2분 동안 반응시킴으로써 고정화하였다. 얻어진 혼성체를 상기한 바와 같은 수종의 각 바이러스로부터 준비한 핵산이 포함되어 있는 시료를 상기 바이러스에 특이적인 올리고뉴클레오티드가 고정화되어 있는 상태에 첨가하고 25℃에서 2분 동안 혼성화 반응을 수행하였다.
<
실시예5
>
수종의 호흡기질환과 관련된 바이러스의 검출
혼성화 후 세척 완충액으로 세척후 200-800nm에서 nanodrop으로 흡광도를 측정하였으며 고유의 피크가 보이는 영역을 토대로 반응유무를 확인하였다.
<
실시예6
>
수종의
호흡기질환탐지하기
위한
분자비콘
기법 반응개념도
바이러스를 증폭하여 정량하는데 요구되는 형광프로브와 소광체 및 상위센서스 프라이머와 하위센스 프라이머로부터 cDNA합성 바이러스를 정량하기 위한 real time PCR을 수행하기 위한 개념도를 나타낸 것이다(도 8).
실험예
1
MERS-CoV의 nsp2, 3, M 및 N2 영역의 특정영역에 대해 인공 합성한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 대상으로 스트렙토아비딘으로 코팅된 슬라이드표면에 바이오틴이 부착된 수종의 프로브와 프라이머를 혼합하여 이를 유리판에 분주한 다음 이를 2분 후에 공초점 현미경으로 관찰한 결과 MERS-CoV의 nsp2, nsp3, M 그리고 N2의 올리고 뉴클레오티드에 결합에 의해 형광분자비콘의 신호가 켜져서 적색 형광이 관찰된 것을 알 수 있었다(도 9).
실험예
2
MERS-CoV의 nsp2, 3와 M영역의 특정영역에 대해 환자검체를 대상으로 분자비콘 시스템 프로브 1pmol (10μl)와 검체 1μl이상 (50pmol)이상을 에펜도로프튜브에 넣고 2분간 실온상태에서 혼성화를 시킨 다음 이를 nanodrop(Therma, USA)를 이용하여 1μl를 분주하고 uv-spetrum으로 확인하면서 양을 측정한 결과 도 10, 11처럼 100pmol에서 가장 강하게 반응하였으며 이는 해당 바이러스가 존재하는 수개에서 수천개가 존재하는 정도이므로 발병 초기에 감염 유무를 확인하기에 적합한 농도범위라 사료된다. 유리슬라이드 위에 도말후 LSM710 공초점 현미경하에서 em/ex을 565/635nm파장대에서 확인하여 본 결과 적색형광의 스팟이 정확히 확인되어 이는 검체양과 형광 이미징와의 정확히 일치하는 경향을 보여 분자비콘 시스템으로 최단시간 초스피드로 정량화할 수 있다는 결론을 제시하고 있다.
실험예
3
MERS-CoV의 N2 특정 영역에 대해 환자검체 시료를 통해 분리한 것을 확인할 목적으로 가상의 N2 영역의 게놈을 인공합성하여 이것을 주형으로 sense primer; GGCACTGAGGACCCACGTT (서열번호 18) 1ul, antisesne primer; TTGCGACATACCCATAAAAGCA (서열번호 19) 1ul으로, premix 10ul, 가상의 N2 영역의 주형 유전자 100pmol aaactcggcactgaggacccacgttggccccaaattgctgagcttgctcctacagccagtgcttttatgggtatgtcgcaatttaaa (서열번호 20)을 2ul, dH20 11 ul 해서 PCR(폴리머효소 연쇄반응 장치)에서 94℃에서 5분, 95℃에서 30초, 72℃에서 30초, 58℃에서 30초간을 한 사이클로 하여 30사이클을 수행후 72℃에서 5분간 반응후 4℃에서 유지하여 반응을 종결한 것을 1% 아가로즈 젤을 제작하여 분주한 결과 N2 영역의 밴드를 확인하였다. 이를 토대로 메르스 바이러스의 N2영역 존재는 결론적으로 바이러스가 존재한다는 의미로 시사되어지는데 메르스 바이러스는 취급상 주의를 요하므로 real time PCR를 수행시 RT(역전사과정)을 IN VITRO상에서 수행하지 않고 메르스가 의심되는 시료를 생물학적 방어시설이 구축된 음압상태의 실험실 상태에서 수행하기 위해 ONE STEP qPCR을 수행해야 하므로 본 결과물을 토대로 가상의 N2 염기서열을 대상으로 하이를 정량적으로 측정하기 위한 sense primer; GGCACTGAGGACCCACGTT 1ul,, antisesne primer; TTGCGACATACCCATAAAAGCA 1ul으로, qPCR용 premix 10ul, 가상의 N2 영역의 주형 유전자 100pmol aaactcggcactgaggacccacgttggccccaaattgctgagcttgctcctacagccagtgcttttatgggtatgtcgcaatttaaa을 2ul, dH20 11ul 해서 100 pmol FAM-CCCCAAATTGCTGAGCTTGCTCCTACA-BHQ1 VIVAL7 (서열번호 21)의 qPCR(폴리머효소 연쇄반응 장치)에서 94℃에서 5분, 95℃에서 25초, 60℃에서 30초를 한 사이클로 하여 45사이클을 수행후 정량화한 것을 나타내었다.
실험예
4
바이러스를 탐지하기 위하여 생검이나 공기중으로 RNAzol 100μl으로 바이러스외피를 파괴시킨 후 분리된 Total RNA를 96well용 plate나 유리판에서 분자비콘 기법 반응개념으로 MERS-CoV의 nsp3와 M영역를 표적으로 하기 위해 탐지 프로브의 5’말단에는 아민기를 부착하고 여기에 형광체의 카르복실기와 EDC와 1:1:78비율로 혼합하여 아미노결합을 유도하고 5’말단에서 8mer(올리고머) 티염기(T)에 biotin을 부착시키고 3‘말단에는 소광체(BHQ; black quencher hole)를 부착하였다. 액체상태의 바이오틴이 부착된 형광프로브와 소광체의 프로브 1nM를 10μl을 바이러스의 RNA가 소량 존재시 plate 바닥에 아비딘이 부착되어 있는 상태에서 프로브가 결합하고 소량의 바이러스를 탐지하여 형광을 얻기 위한 것으로 이를 반응유무를 얻기 위해 합성된 MERS-CoV의 nsp3와 M영역의 일부 게놈을 인공합성하여 (도 12a) 이를 0, 1, 10, 25, 50, 75, 100pmol농도로 90μl되게 상기 프로브와 반응시켜 시너지 HT의 multiplate(BioTek)를 이용하여 25℃에서 565/635nm파장대에서 형광강도를 측정한 결과 다음과 같이 nsp3영역은 0, 1, 24±6, 56±15, 231±43, 290±11, 450±21AFI(임의 형광도)였고 M은 0, 1, 16±2, 57±9, 189±23, 234±18, 357±43 AFI(임의 형광도)였다(도 12b).
실험예
5
중동호흡기 바이러스의 nsp3와 M영역을 진단하기 위한 특정영역의 게놈인 ATAGAAGGTGTAAAGGAG (서열번호 22), TGCGCCTCAGTGAGTTGCGTCA (서열번호 23)를 대상으로 5‘영역에는 형광체와 자기인식 개폐를 조절하게 링커 유전자 서열인 TTCGCTGTTTACC (서열번호 24)를 3’영역은 5’영역과 바이러스의 일부 영역을 인식하게 하는 염기서열인 TGTTTGAGGGACAGGTAAACAGCG(nsp3) (서열번호 25)와 TATTAGACATGATTATACAGCG (서열번호 26) 염기서열로 구성된 메르스 탐지 nsp3(62염기)와 M(58염기)프로브를 제작하였다(도 13).
실험예
6
수종의 호흡기질환 바이러스를 대상으로 본 프로브를 활용하는 이유는 이들 바이러스들은 급성기 호흡질환을 야기하는 바이러스인 점, 치명적인 높은 사망률과 전파속도가 아주 높은 이유로 감염후 호흡기 바이러스의 특정 바이러스를 확인하기 위해서는 어느 정도의 바이러스 titer(기준량)이 존재하는 감염후 2주 후에 기존방법인 qRT-PCR(정량 역전사유전자연쇄증폭법)으로 확인하는 방법과 달리 감염후 초동방역과 음압격리를 통한 치료를 하기 위한 시간적이고 임상 안전상 바이러스의 복제초기인 PLOpro의 nsp3와 바이러스의 복제중기단계인 바이러스의 외피 막단백질이 합성과정 유무를 확인하므로 본 메르스의 감염 시간을 예측하기 위하여 표적 염기서열을 선정하기 위함이다(도 14)
실험예
7
메르스의 2개의 비구조 단백질영역인 ORF1a와 ORF1b(오알에프:단백질 개시시작점과 종결점 간의 한 세트) 그리고 E, M, N, S 같은 바이러스의 껍질에 해당되는 구조단백질로 구성되어 있는데 일반적으로 바이러스 감염을 위해 유전자부분인 ORF는 qRT-PCR을 수행하고 E, M, N, S는 ELISA(면역효소측정법)으로 하거나 qRT-PCR법을 수행하는데 기존 CDC나 WHO의 지정 방법은 hsp3와 N를 분석하는 qRT-PCR법을 통해 정량하거나 존재유무를 확인하는 방법을 예시하지만 이는 탐지하기 위한 바이러스의 양이 확보되는 시기인 2주 정도 시간이 소요되고 바이러스의 RNA 게놈을 추출하는 시간과 비용이 많이 소요되는 문제점이 있지만 본 발명에서 제시하고자 하는 방법은 감염 초기에 감지하기 위한 목적으로 감염 초기에 소량으로 저비용으로 단시간에 결과를 확보할수 있다는 장점이 있다(도 15).
실험예
8
일반적으로 바이러스 감염을 위해 유전자부분인 ORF(단백질합성 세트)를 qRT-PCR을 수행하는데 이를 수행하기 위해 프라이머가 요구되는데 nsp3의 sense primer; TTTTAACGCTCACCCCACG (서열번호 27), antisense primer; CCACAACTTCCACATCAATG (서열번호 28)가 택맨프로브는 FAM-CCCAACCTACATTTACCACTCCGCA-BHQ1 (서열번호 29), M영역은 sense primer;AGGGTGTACCTCTTAATGCCAATTCT (서열번호 30), antisense primer;TCTGTCCTGTCTCCGCCAATA (서열번호 31)가 택맨프로브는 FAM-ACCCCCTGCGCAAAATGCTGGG-BHQ1 (서열번호 32)으로 해서 qRT-PCR을 수행시 기존 택맨 프로브와 사이그로 의 반응성과 정확도가 거의 손색이 없을 정도로 정확하게 우수하였다(도 16).
실험예
9
메르스 바이러스가 감염초기에 유전자가 소량 존재시 시험관내에서 바이러스 존재유무를 확인하기란 어려운데 이를 극복하기 위해서는 프로브의 존재하는 형광체의 강도가 기존 프로브의 형광체로는 불가하지만 본 발명에서는 이를 극복하기 위해 기존 형광체인 FAM대신 QD525나 QD565를 사용하므로 반감기와 강도면에서 우수한 형광체를 해 극복하였고(도 17a) 이를 각각의 프로브 1nM를 10μl으로 소량의 표적 DNA나 RNA를 탐지하는데 유용한 것으로 상기 실험예의 방법과 동일하에서 실제 nsp3는 0, 1, 50, 100pmol에서 0, 5, 156±23, 342±34이고 M은 0, 10±0, 121±15, 290±32으로 나타내었다(도 17b).
실험예
10
특정 담체표면에 UFO강한 빛처럼 형광빛을 내게끔 형광체와 소광체가 연결된 분자비콘을 다양하게 표현하게 사이즈가 다른 양자점 나노입자를 연결하여 급성 호흡기 질환바이러스 다른 종류가 저준위로 있거나 동일 바이러스의 다른 탐지 영역을 감지 가능한 분자비콘기법(도 18a) 을 통해 바이러스를 탐지하기 위한 형광프로브와 소광체를 통해 바이러스를 탐지하기 위한 각각의 프로브 1nM를 10μl으로 실험예 4처럼 동일조건하에서 UFO분자비콘 방법으로 500nm의 나노입자의 SiO2같은 산화철류의 표면에 개질화하여 인공적인 SARS-COV의 N, 메르스의 N, AI의 H1, RSV의 A 영역의 염기를 합성하여 100 pmol을 통해 확인한 반응정도는 0, 5, 156±23, 342±34을 나타 내었다(도 18b).
실험예
11
상기 나노입자 표면에 다양한 호흡기질환 바이러스를 동시에 관련된 바이러스와 혼재시 각각의 바이러스에 특이적인 프로브를 합성하여 공여체 형광체를 각각 다르게 부착하여 수용자를 통해 상이한 바이러스와 관계를 동시에 탐지 가능한 분자비콘 기법 반응도를 통해 바이러스를 탐지하기 위한 형광프로브를 통해 반응시 30분전후의 반응결과치는 각각의 프로브 1nM를 10μl으로 실험예 4처럼 동일조건하에서 분당 1회씩 측정한 공여체의 형광수치는 SARS-COV의 N, 메르스의 N, AI의 H1, RSV의 A에서 각각 2, 129±15, 234±34, 145±24, 256±22이고 수용자의 수치는 45±2, 23±6, 67±3, 25±8, 256±22이357±43였으며 30분 후에 반응결과치는 0, 21±2, 33±3, 15±5, 25±2이고 수용자의 수치는 211±25, 321±36, 267±16, 190±18였는데 이는 다양한 바이러스가 존재하더라도 충분히 판정이 가능하고 시간이 경과함에 따라 여기-저기 상태에서 에너지 변화가 충분히 전환하는 것은 바이러스가 구분될수 있음을 알 수 있다(도 19)
실험예
12
단일 바이러스를 복제시기를 알수 있도록 표적 유전자를 동시에 감지하거나 관련된 호흡기 바이러스와 혼재시 상호 구분되게 하기 위해 다양한 형광체를 통해 바이러스를 탐지 가능한 분자비콘 기법을 통해 500nm의 나노입자의 SiO2같은 산화철류의 표면에 개질화하여 각각의 프로브 1nM를 10μl으로 실험예 4처럼 동일조건하에서 MB자체, 인공적인 MERS nsp3, S, E, N, nsp5, M영역의 염기를 합성하여 100 pmol을 대상으로 확인한 반응정도는 1, 1234±341, 24±5, 56±8, 27±2, 678±78, 23±4을 나타 내었는데 이는 바이러스가 우선 복제시기에 따라 탐지 정도가 다르게 감지할수 있음을 알수 있다(도 20b).
실험예
13
바이러스끼리 진화상 동질성을 알기 위한 기존바이러스와 출현 바이러스 간의 관계를 유사성을 규명하기 위해 탐지 가능한 분자비콘 기법 반응개념도를 통해 기존 바이러스와 대조하여 탐지하기 위한 기존 바이러스의 게놈과 MERS-COV의 변이성을 확인하기 위한 형광프로브와 소광체를 통해 바이러스를 탐지법으로 유브이 형광빛이 있는 곳에서 확인한 결과 기존바이러스와 달리 변이성인 경우 분자형광비콘으로 인한 형광빛이 나타냄을 알수 있다(도 21).
실험예
14
바이러스를 간이적으로 스트립키트로 탐지 가능한 분자비콘 기법 반응 개념도를 통해 이미 알고 있는 바이러스의 S유전자에 대한 항체를 표지하여 대조군으로 사용하고 실험군으로 가상의 복제 초기에 복제하는 nsp3의 영역을 측정하기 위해 가상 유전자 nsp3와 여기에 40nm사이즈의 나노금입자 표면에 분자비콘 시스템인 프로브를 부착형 시료와 반응시켜 스트립에 분리시 대조군은 대조군만이 실험군은 대조군과 동시에 nsp3가 있는 경우 반응하여 밴드가 하나 더 나타내어 2개의 밴드가 나타냄으로 측정하고자 하는 nsp3의 존재를 간이적으로 측정이 가능하였다(도 22).
실험예
15
공기속에 존재하는 바이러스를 민들레 홀씨처럼 시약이 분무되면서 간이적으로 공기속에 존재하는 바이러스를 UV 광 존재하에서 가능한 분자비콘 기법으로 공기속에 바이러스가 존재시 분무기속에 RNAzol을 일정하게 분무하면 바이러스의 입자가 파괴되면서 유전자가 노출되는데 이때 분자비콘 프로브 1nM를 10μl를 동시에 분무하면 공기속의 nsp3의 존재를 확인하기 위해 유브이를 조사하면 적색이나 녹색형광이 존재시 바이러스의 존재를 확인할수 있다(도 23).
실험예
16
공기, 물체표면이나 물속에 속에 존재하는 바이러스가 특정 반응 물체에 접촉시 분자비콘 시스템처럼 카멜레온의 색상이 변하는 방법을 이용하여 실시간적으로 바이러스를 모니터링이 가능한 분자비콘 기법으로 인공 카멜레온 장난감의 표면에 분자비콘 프로브 1nM를 10μl으로 도말하여 실온상태에서 공기나 액체에 노출시 유브이 광존재하에서 QD405, 505, 525, 565, 597,635의 다양한 형광이 청색, 노랑색, 녹색, 적색, 심홍색등으로 수시로 변하게 하는 것을 통해 바이러스가 존재를 탐지할 수 있었다(도 24).
실험예 17 농도별로 바이러스 PLOpro nsp3유전자의 탐지
호흡기 바이러스를 대상으로 229E, SARS-COV, MERS-COV PLOpro nsp3를 대상으로 농도별로 프로브 1nM를 10μl으로 혼성화후 200-800nm에서 nanodrop으로 흡광도를 측정하였으며 고유의 피크가 보이는 영역을 토대로 반응유무를 확인하였는데 도 18처럼 nanodrop200에서 확인한 결과 MERS-CoV PLpro nsp3프로브 1nM를 10μl으로 특정 파장대에서 농도의존적으로 260nm흡광도가 급격히 증가되고 229E나 SARS-CoV 경우 100pmol는 전혀 반응을 하지 않았는데 이는 특정 영역에만 정확히 결합해야 반응하기 때문이라 사료되어진다(도 25).
실험예 18 농도별로 바이러스 M유전자의 탐지
호흡기 바이러스인 MERS-COV의 M영역을 대상으로 농도별로 프로브 1nM를 10μl으로 혼성화후 마이크로파이펫으로 1μl을 200-800nm에서 nanodrop의 반응구에 260nm 흡광도를 측정하였으며 고유의 피크가 보이는 영역을 토대로 확인하였는데 도 19처럼 nanodrop200에서 확인결과 M프로브가 특정 파장대에서 농도의존적으로 흡광도가 증가되는데 기존 방법으로 탐지할수 없는 농도에서 충분히 감지됨을 알수 있다(도 26).
실험예 19 농도별로 MERS-CoV바이러스 유전자의 형광이미지
호흡기 바이러스인 MERS-COV의 nsp3영역을 대상으로 농도별로 프로브 1nM를 10μl으로 혼성화 후 마이크로파이펫으로 1μl을 200-800nm에서 nanodrop으로 260nm흡광도를 측정하였으며 고유의 피크가 260nm에서 보이는 영역을 토대로 확인하였는데 도 27처럼 nanodrop200에서 확인결과 nsp3프로브가 특정 파장대에서 농도의존적으로 LSM710 공초점 현미경(칼자이즈,독일)으로 관찰시 565nm/635nm에서 형광을 측정하였는데 기존 방법으로 탐지할수 없는 농도에서 단시간에 충분히 감지됨을 알수 있다(도 27).
실험예 20 농도별로 바이러스 N2유전자의 탐지
호흡기 바이러스인 MERS-COV의 N2영역을 대상으로 농도별로 혼성화후 프로브 1nM를 10μl으로 혼성화후 마이크로파이펫으로 1μl을 200-800nm에서 nanodrop의 반응구에 분주하고 260nm흡광도를 측정하였으며 고유의 피크가 보이는 영역을 토대로 확인하였는데 도 22처럼 nanodrop200에서 확인결과 N2프로브가 특정 파장대에서 농도의존적으로 흡광도가 증가되는데 기존 방법으로 탐지할수 없는 농도에서 충분히 감지됨을 알수 있다(도 10).
실험예 21 농도별로 바이러스 nsp2유전자의 탐지
호흡기 바이러스인 MERS-COV의 nsp2영역을 대상으로 농도별로 프로브 1nM를 10μl으로혼성화후 1μl을 마이크로파이펫으로 나노드랍 반응구에서 200-800nm에서 흡광도를 측정하였으며 고유의 피크가 보이는 영역을 토대로 확인하였는데 도 23처럼 nanodrop200에서 확인결과 N2프로브가 특정 파장대에서 농도의존적으로 흡광도가 증가되는데 기존 방법으로 탐지할 수 없는 농도에서 충분히 감지됨을 알 수 있다(도 11).
실험예 22 농도별로 바이러스 N2유전자 증폭
호흡기 바이러스인 MERS-COV의 N2영역을 인공적으로 합성하여 농도별로 희석후 1,10,100pmol으로 주형으로 정량 유전자연쇄반응을 PCR premix 12μl, 증류수 5μl, N2타켓 주형 합성물 1μl, 프라이머 각 1μl으로 해서 95℃ 2분, 95℃ 30초, 72℃ 30초, 60℃ 30초로 45사이클으로 하여 최종적으로 72℃에서 5분을 유전자연쇄반응을 통해 합성한 것으로 1% agarose에서 반응을 용출한 결과 밴드가 보인 곳에는 농도의존적으로 증가된 밴드를 확인하였다. 따라서 기존 유전자 증폭기법과 동일한 조건하에서도 소량의 표적 유전자만이 있어도 충분히 바이러스의 존재를 확인할수 있다(도 9).
실험예 23 농도별로 바이러스 N2유전자 정량화
호흡기 바이러스인 MERS-COV의 N2영역을 인공적으로 합성하여 농도별로 희석후 1,10,100pmol으로 주형으로 실험예7에서처럼 정량 유전자연쇄반응을 qPCR premix 10μl, 증류수 5μl, N2타켓 택맨프로브2μl, 표적 주형 합성물 1μl, 플라이머 각 1μl으로 해서 95℃ 2분, 95℃ 30초, 60℃ 30초로 45사이클으로 하여 최종적으로 60℃에서 5분을 통해 종결하여 사이클이 증가할수록 유전자 증폭이 증가됨을 확인되었다. 따라서 본 발명에선 MERS-COv를 감지하기 위한 최소의 감염시료에서도 명확히 존재 유무를 확인할수 있으며 단시간에 정확히 서로 다른 바이러스도 감지할 수 있음을 알수 있으며 감염 초기에 매우 민감하게 감지할 수 있음을 나타내었다(도 28).
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<120> Molecular beacon for detection of MERS-CoV and uses thereof
<130> NP15-1305
<160> 32
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV nsp3
<400> 1
ttcgctgttt accatagaag gtgtaaagga gtttttgttt gagggacagg taaacagcg 59
<210> 2
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV M
<400> 2
ttcgctgata atctgcgcct cagtgagttg cgtcatatta gacatgatta tacagcg 57
<210> 3
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV
<400> 3
ttcgctgttt accatagaag gtgtaaagga gtttttgttt gagggacagg taaacagcg 59
<210> 4
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV 229e
<400> 4
ttcgctgtca acttccacac tcaatgaatg cggagtggta aatgtaggaa gttgacagcg 60
60
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> measles virus
<400> 5
atggatggat gtrgtgagga a 21
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> enterovirus
<400> 6
tcgtaagggc aactctgcag cg 22
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> rhinovirus
<400> 7
gtcgtaatga gcaattccgg gacg 24
<210> 8
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SARS-coV
<400> 8
ttcgctgtca tgcaagtcga agaggtgcaa ccatccatga tatcatgaca gcg 53
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VSV
<400> 9
acccttccat ttaaaccact ggtatag 27
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> adenovirus
<400> 10
gcgctrgaya tgacttttga ggt 23
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HPIV 1
<400> 11
atgttctgta mtagstgcag gaacaag 27
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HPIV 2
<400> 12
atctaaccag tatttagcaa tggg 24
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HPIV 3
<400> 13
tggcataayg tgytatcaag accag 25
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IVA
<400> 14
ggctaaagac aagaccratc ctg 23
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IVB
<400> 15
aaccagatga tggtcaaagc tggrc 25
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RSVA
<400> 16
ccagcaaagt taytctatca tgtc 24
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RSVB
<400> 17
ttyttctgrt catttgttat aggca 25
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV N2 sense primer
<400> 18
ggcactgagg acccacgtt 19
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV N2 antisense primer
<400> 19
ttgcgacata cccataaaag ca 22
<210> 20
<211> 87
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV N2 template
<400> 20
aaactcggca ctgaggaccc acgttggccc caaattgctg agcttgctcc tacagccagt 60
gcttttatgg gtatgtcgca atttaaa 87
<210> 21
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV N2 probe
<400> 21
ccccaaattg ctgagcttgc tcctaca 27
<210> 22
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV nsp3 detection sequence
<400> 22
atagaaggtg taaaggag 18
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERS-CoV M detection sequence
<400> 23
tgcgcctcag tgagttgcgt ca 22
<210> 24
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> linker gene
<400> 24
ttcgctgttt acc 13
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nsp3 detection
<400> 25
tgtttgaggg acaggtaaac agcg 24
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> M detection
<400> 26
tattagacat gattatacag cg 22
<210> 27
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nsp3 sense primer
<400> 27
ttttaacgct caccccacg 19
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nsp3 antisense primer
<400> 28
ccacaacttc cacatcaatg 20
<210> 29
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nsp3 TaqMan probe
<400> 29
cccaacctac atttaccact ccgca 25
<210> 30
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> M sense primer
<400> 30
agggtgtacc tcttaatgcc aattct 26
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> M antisense primer
<400> 31
tctgtcctgt ctccgccaat a 21
<210> 32
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> M TaqMan probe
<400> 32
accccctgcg caaaatgctg gg 22
Claims (10)
- 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV) 검출용 올리고뉴클레오티드.
- 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV) 검출용 올리고뉴클레오티드.
- 제1항에 있어서,
상기 올리고뉴클레오티드는 중동호흡기증후군 코로나바이러스의 nsp3 (non-structural protein 3) 유전자 부위를 감지하는 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드. - 제2항에 있어서,
상기 올리고뉴클레오티드는 중동호흡기증후군 코로나바이러스의 구조단백질 M 유전자 부위를 감지하는 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드. - 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드; 상기 올리고뉴클레오티드의 5'-말단에 연결된 형광체; 및 상기 올리고뉴클레오티드의 3'-말단에 연결된 소광체를 포함하는 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV) 검출용 분자비콘(molecular beacon).
- 제5항에 있어서,
서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열의 8번째 염기는 비오틴(biotin) 결합 부위인 것을 특징으로 하는 분자비콘(molecular beacon). - 제5항 또는 제6항의 분자비콘을 포함하는 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV) 감염 진단용 키트.
- 제7항에 있어서,
상기 분자비콘은 고체 지지체의 표면에 고정화되어 있는 것을 특징으로 하는 키트. - 공기, 물체 표면이나 물속에 존재하는 핵산 또는 검체로부터 수득된 핵산을 제5항 또는 제6항의 분자비콘과 반응시키는 단계; 및
상기 분자비콘으로부터 발생하는 형광을 검출하는 단계를 포함하는 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV) 검출방법. - 제9항에 있어서,
상기 반응은 핵산을 10 내지 100 pmol의 분자비콘과 실온에서 혼성화시키는 것을 특징으로 하는 방법.
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| JP2006524052A (ja) | 2003-04-21 | 2006-10-26 | ゲノム インスティチュート オブ シンガポール | 重症急性呼吸器症候群コロナウイルスを検出する試薬および方法 |
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