KR101764757B1 - 신규한 한국산 겨우살이 발효용 유산균 및 이를 이용한 유산균 발효유 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신규한 한국산 겨우살이 발효용 유산균, 이를 이용한 유산균 발효유 제조방법 및 상기 유산균을 유효성분으로 함유하는 프로바이오틱스 및 겨우살이 유산균 발효유 제조방법에 관한 것으로 한국산 겨우살이의 발효에 적합한 신규한 유산균 Lactobacillus plantarum GLKM42 및 Lactobacillus casei GLKM43 균주를 제공하는 효과가 있고 상기 한국산 겨우살이 발효용 유산균을 접종 배양하여 얻는 것이 특징인 겨우살이 발효유의 제조방법을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.
Description
본 발명은 신규한 한국산 겨우살이 발효용 유산균, 이를 이용한 유산균 발효유 제조방법 및 상기 유산균을 유효성분으로 함유하는 프로바이오틱스 및 겨우살이 유산균 발효유 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명 한국산 겨우살이로부터 발효용 유산균을 분리하고 이를 유효성분으로 함유하는 프로바이오틱스 및 상기 겨우살이 발효용 유산균을 우유에 접종 배양하여 겨우살이 발효유를 제조하는 방법에 관한 것이다.
유산균은 물질대사에 의해 탄수화물을 젖산으로 분해시키며 요거트, 유산균음료 및 김치 등의 식품을 발효시킨다. 유산균에 의해 당성분은 산, 가스 및 알코올 등으로 대사변화가 일어나고 식품의 산도는 내려가게 되어 향미를 증진시키며 부패의 속도를 늦추어 식품의 저장성을 높이며 일부 유산균은 장내 유산균으로 다른 병원 미생물로부터 몸을 지키고 항상성 유지를 돕는다. 따라서 최근 식품산업적 측면에 있어서 새로운 유산균 탐색은 매우 중요한 의미를 갖는다.
본 발명에 사용된 한국산 겨우살이는 겨우살이 속의 식물로써 세계 전역에 분포하여 자라는 다년생의 반기생 식물이며 전세계적으로 30속 1500종의 식물이 있는 것으로 알려져 있다. 로란타세(Loranthaccae), 비스카세(Viscaccae) 및 에레몰레피다세(Eremolepidaccae)의 3개의 과로 나누어지며 한국 등 아시아 지역에서 자라는 겨우살이는 로란타세과에 속하는 것으로 비스컴 알붐 콜로라툼(Viscum album coloratum)이라 분류하며 한방에서는 곡기생, 상기생 및 동청 등 다양한 이름으로 알려져 있다. 일반적으로 겨우살이 식물들은 렉틴(lectin)이라는 당단백질과 탄수화물, 비스코톡신(viscotoxin A2 , A3 , B), 비신(viscine), 루에페올(luepeol), 이노시톨(inositol), 트리테르페노이드(triterpenoid), 올레아놀산(oleanolicacid), 플라보야도리닌(Flavoyadorinin A, B), 루페올(lupeol), 알카로이드(alkaloids) 및 비타민류(vitamin E, C) 등의 여러 성분을 함유하고 있으며 상기 성분들의 화학적 조성은 각 식물의 생장지역 및 기생 숙주 등에 따라 특이성이 있는 것으로 알려져 있다(Becker H., Botany of European Mistletoe(Viscum album L.), Oncology 43, suppl., 1:2, 1986). 특히 한국산과 유럽산 렉틴은 면역조절 기능을 하는 것으로 알려져 있으며 암세포들에 대한 세포독성과 암전이 억제 및 신생혈관 형성 억제 효과들로 인한 항암효과가 있는 것으로 잘 알려져 있다 (‘과학으로 밝혀진 겨우살이의 신비’, 중앙미디어, 김종배 저). 또한 자연살해세포, 수지상세포 (Jong-Jin Kim, et al ., Enhanced dendritic cell maturation by the B-chain of Korean mistletoe lectin (KML-B), a novel TLR4 agonist, International Immunopharmacology 21:309-319, 2014) 및 대식세포와 같은 면역 세포들을 활성시킬 뿐만 아니라 여러 사이토카인(cytokine) 분비도 촉진시키는 면역 조절 기능도 잘 알려져 있다(Hajto T. et al ., Increased secretion of tumor necrosis factor-α, interleukin 1, and interleukin 6 by human mononuclear cells exposed to ß-Galactoside-specific galactoside-specific lectin from clinically applied mistletoe extract, Cancer Res . 50:3322-3326, 1990).
프로바이오틱스란 체내에 들어가서 건강에 좋은 효과를 주는 살아있는 균을 말한다. 현재까지 알려진 대부분의 프로바이오틱스는 Lactobacilli, Bifidobacteria 등의 유산균(O’May GA & Macfarlane GT, Probiotic efficacy:are the claims justified? In Probiotic Dairy Products, pp. 138-166, 2005)이며 일부 Bacillus 등을 포함하고 있다(식약청 건강기능식품 기능성원료, 식품의약품안전처, 2011).
또한, 프로바이오틱스는 장내 균형을 개선하는 역할을 하는 것으로 알려져 있으며 주된 효과가 밝혀지지는 않았으나 장 내 pH조절 및 유해균을 감소시키고 면역세포를 자극하여 면역력을 강화시킨다. 또, 젖당 분해를 도와 젖당 불내증(Lactose Intolerance)을 감소시킬 뿐 아니라 특히 암예방에도 도움을 주는 것으로 알려져 있어 현재 기능성 식품으로 큰 관심을 얻고 있다(Hoolihan KL. Prophylactic and therapeutic uses of probiotics: A review. J. Am . Diet . Assoc . 101: 229-238, 2001).
본 발명의 선행기술로 겨우살이를 발효시키는 신규 유산균인 락토바실러스 카제이 케이 와이 22713이 대한민국 등록특허 제10-0277348호에 공지된 바 있으나 이는 겨우살이를 발효시키는 새로운 유산균인 락토바실러스 카제이 KY 22713에 관한 것으로 겨우살이를 발효시켜 정상세포에 대한 겨우살이의 세포독성은 감소시키면서 암세포에 대한 겨우살이의 세포독성은 그대로 유지시키는 새로운 유산균에 관한 것이다. 그리고 겨우살이를 발효시키는 신규 유산균인 락토바실러스 에스에스피이 케이와이 22704가 대한민국 등록특허 제10-0277350호에 공지되어 있으나 이는 겨우살이를 발효시키는 새로운 유산균인 락토바실러스 ssp. KY 22704에 관한 것으로 겨우살이를 발효시켜 정상세포에 대한 겨우살이의 세포독성은 감소시키면서 암세포에 대한 겨우살이의 세포독성은 그대로 유지시키는 새로운 유산균에 관한 것이다.
또한, 프로바이오틱 유산균 및 이를 포함하는 조성물이 대한민국 등록특허 제10-0720025호에 공지되어 있으나 이는 다양한 장내 병원성 세균을 효과적으로 억제할 수 있는 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus) G19 균주 및 비피도박테리움 보움(Bifidobacterium boum) R5 균주 및 이를 포함하는 프로바이오틱 조성물에 관한 것이다.
또, 프로바이오틱스 유산균을 활용한 발효유 제조방법이 대한민국 등록특허 제10-1427830호에 공지된 바 있으나 이는 프로바이오틱스 유산균인 Lactobacillus sp YH KCCM 10887P 및 ABT-5 유산균을 정백당 50g과 탈지유 30g을 포함한 원유 1000g에 동시에 접종하여 발효시키는 단계를 포함하는 프로바이오틱스 유산균을 활용한 발효유 제조방법에 관한 것이다.
따라서, 상기 특허문헌 어디에도 신규한 한국산 겨우살이 발효용 유산균인 Lactobacillus plantarum GLKM42, Lactobacillus casei GLKM43 균주 및 이를 유효성분으로 함유하는 겨우살이 유산균 발효유의 제조방법에 관한 발명은 공지된 바 없다.
따라서, 본 발명의 목적은 한국산 겨우살이의 발효에 유용한 신규한 유산균을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 한국산 겨우살이 발효용 유산균을 우유에 접종 배양하여 얻을 수 있는 겨우살이 발효유 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명은 한국산 겨우살이로부터 유산균을 분리하는 단계와; 상기 분리단계에서 얻은 유산균을 시퀀싱하여 16s rRNA서열을 분석하는 단계와; 상기 분석단계에서 얻은 유산균을 배양하여 1× PBS로 세척하고 남아있는 유산균 pellet을 우유에 희석하는 단계와; 상기 단계에서 얻은 유산균 희석액을 겨우살이동결건조 가루와 혼합하여 이를 신선한 우유 원액에 첨가한 후 다시 배양하여 겨우살이 발효유를 제조하는 단계와; 상기 제조단계에서 얻은 겨우살이 발효유 내 유산균 간의 길항작용 유무를 확인하는 단계와; 상기 겨우살이 발효유 내 유산균 수와 pH를 측정하는 단계와; 상기 겨우살이 발효유의 렉틴 함량을 측정하는 단계와; 상기 겨우살이 발효유를 ICR 마우스에 음용시켜 프로바이오틱스 유산균의 활성을 평가하는 단계를 통하여 달성하였다.
본 발명은 한국산 겨우살이의 발효에 유용한 신규한 유산균을 제공하는 효과가 있고 이를 우유에 접종 배양하여 한국산 겨우살이 발효용 유산균이 접종되고 겨우살이 렉틴이 함유된 겨우살이 발효유의 제조방법을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.
도 1은 본 발명 한국산 겨우살이 발효용 유산균 L. plantarum GLKM42 및 L. casei GLKM43 균주 간의 길항작용에 의한 성장억제를 나타낸 사진도이다.
본 발명의 구체적인 내용을 실시예를 들어 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명 Lactobacillus plantarum GLKM42 균주는 2014년 11월 14일자 대한민국 305-806 대전광역시 유성구 과학로 125 소재의 한국생명공학연구원(KRIBB)에 기탁번호 KCTC 12723BP로 기탁보관되었다.
본 발명 Lactobacillus casei GLKM43 균주는 2014년 11월 14일자 대한민국 305-806 대전광역시 유성구 과학로 125 소재의 한국생명공학연구원(KRIBB)에 기탁번호 KCTC 12724BP로 기탁보관되었다.
본 발명의 L. plantarum GLKM42 균주의 518 forward primer를 사용하여 분석한 16s rRNA 염기서열은 서열번호 1로 표시하고 800 reverse primer를 사용하여 분석한 16s rRNA 염기서열은 서열번호 2로 표시하였다. 또, L. casei GLKM43 균주의 518 forward primer를 사용하여 분석한 16s rRNA 염기서열은 서열번호 3으로 표시하고 800 reverse primer를 사용하여 분석한 16s rRNA 염기서열은 서열번호 4로 표시하였다.
본 발명에서는 상기 겨우살이 발효유에 접종한 유산균 L. plantarum GLKM42 및 L. casei GLKM43 균주를 혼합하여 사용하였으나 이를 단독으로 사용하여도 무방하다.
실시예
1. 한국산 겨우살이 수집 및 전처리
본 발명에 사용된 겨우살이는 강원도 일대에서 참나무를 숙주로 하여 자생하는 것으로 12월에서 2월 사이에 채취하였다. 실험에 사용된 겨우살이는 가지의 끝에서부터 두 마디까지의 잎, 줄기, 열매를 증류수에서 3회 세척 후 세절하여 동결건조하고 분쇄한 후 은박 포장하여 4℃에서 보관하였다.
실시예
2. 본 발명 유산균 분리
본 발명에 따른 4℃에서 보관하고 있던 한국산 겨우살이를 설탕과 물의 1:1비율로 혼합한 설탕물에 처리하여 2주간 26℃의 상온에 유지시켰다. 상온에서 유지시킨 상기 한국산 겨우살이와 설탕물의 혼합물을 유산균 선택배지인 MRS agar plate에 희석시켜 26℃의 상온으로 48시간 배양시켜 얻은 2종류의 콜로니를 각각 배양한 후 National Center for Biotechnology Information(NCBI) BLAST를 사용하여 518 forward primer와 800 reverse primer로 16S rRNA 염기서열을 분석하였다(표 1).
| Length | Score | Identities | ||
| GLKM42_518F (서열번호 1) |
ref|NR_075041.1| | 1571 | 1626 bits (880) | 907/918 (99%) |
| CAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTAAGAGATTAGACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGGTGAATACGTTCCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCAATGGAGAGTTTGTAACACCCAAAAGTCGGGGGGGGTAACCTTTTTAGGAACCAGCCGCCCTAAAGTGGGGACAGATGATTAGGG | ||||
| GLKM42_800R (서열번호 2) |
ref|NR_075041.1| | 1571 | 1411 bits (764) | 768/770 (99%) |
| TTTCGAGCATCAGCGTCAGTTACAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTTTCCCAGTTTCCGATGCACTTCTTCGGTTGAGCCGAAGGCTTTCACATCAGACTTAAAAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAAATACCGTCAATACCTGAACAGTTACTCTCAGATATGTTCTTCTTTAACAACAGAGTTTTACGAGCCGAAACCCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTTCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATTACCCTCTCAGGTCGGCTACGTATCATTGCCATGGTGAGCCGTTACCCCACCATCTAGCTAATACGCCGCGGGACCATCCAAAAGTGATAGCCGAAGCCATCTTTCAAGCTCGGACCATGCGGTCCAAGTTGTTATGCGGTATTAGCATCTGTTTCCAGGTGTTATCCCCCGCTTCTGGGCAGGTTTCCCACGTGTTACTCACCAGTTCGCCACTCACTCAAATGTAAATCATGATGCAAGCACCAATCAATACCAGAGTTCGTTCGACTTGCATGTATTAGGCACGCCGCCAGCGTTCGTCCTGAG | ||||
| GLKM43_518F (서열번호 3) |
ref|NR_075032.1| | 1568 | 2601 bits (1408) | 1425/1433 (99%) |
| TTCCCCTTCGGGGGCAAAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATGACTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAGTAAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAGACCGCGAGGTCAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGGTGAATACGTTCCCGGGGCCTTGTACACACCGGCCGGTCAAACCATGGAGAAGTTTGTAA | ||||
| GLKM43_800R (서열번호 4) |
ref|NR_075032.1| | 1568 | 1423 bits (770) | 770/770 (100%) |
| CTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTTTCCCAGTTTCCGATGCGCTTCCTCGGTTAAGCCGAGGGCTTTCACATCAGACTTAAAAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTGGATACCGTCACGCCGACAACAGTTACTCTGCCGACCATTCTTCTCCAACAACAGAGTTTTACGACCCGAAAGCCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTGCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATCAACCTCTCAGTTCGGCTACGTATCATCGCCTTGGTGAGCCATTACCTCACCAACTAGCTAATACGCCGCGGGTCCATCCAAAAGCGATAGCTTACGCCATCTTTCAGCCAAGAACCATGCGGTTCTTGGATCTATGCGGTATTAGCATCTGTTTCCAAATGTTATCCCCCACTTAAGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCACTCGTTCCATGTTGAATCTCGGTGCAAGCACCGATCATCAACGAGAACTCGTTCGACTTGCATGTATTAGGCACGCCGCCAGCGTTCATCCTG | ||||
실시예
3. 본 발명 유산균
L.
plantarum
GLKM42
및
L.
casei
GLKM43
균주의 배양 및 전처리
본 발명에 따른 BLAST 분석 결과 상기 배양된 균주는 2종 모두 Lactobacillus종으로 Lactobacillus plantarum GLKM42 및 Lactobacillus casei GLKM43 균주로 명명하고 그 균주는 2014년 11월 14일자 대한민국 305-806 대전광역시 유성구 과학로 125 소재의 한국생명공학연구원(KRIBB)에 기탁번호 KCTC 12723BP 및 KCTC 12724BP로 기탁보관되었다. 본 발명 유산균 L. plantarum GLKM42 및 L. casei GLKM43 균주를 각각 유산균 선택배지인 MRS broth에 2회 계대배양한 후 새로운 MRS broth에 5% 접종시켜 26℃에서 하루 배양하였다. 배양된 유산균 L. plantarum GLKM42 및 L. casei GLKM43 균주를 각각 1×PBS로 세척한 후 남아있는 2종의 유산균 pellet을 1 mL 우유에 함께 접종한 뒤 4℃에서 보관하였다.
실시예
4. 본 발명 유산균
L.
plantarum
GLKM42
및
L.
casei
GLKM43
균주가 접종된 겨우살이 발효유 제조
실시예 1에 따른 4℃에 보관되어 있는 겨우살이 동결건조 가루와 우유에 희석시킨 본 발명 유산균 L. plantarum GLKM42 및 L. casei GLKM43 균주를 우유 원액에 함께 첨가하여 본 발명 유산균 L. plantarum GLKM42 및 L. casei GLKM43 균주의 최종 균 수가 1×1010CFU/mL 이상이 되도록 하였다. 상기 과정으로 만들어진 본 발명 유산균 L. plantarum GLKM42 및 L. casei GLKM43 균주가 포함된 시료를 26℃에 24시간 및 48시간 배양하여 발효시켜 얻은 본 발명 유산균 L. plantarum GLKM42 및 L. casei GLKM43 균주를 접종 배양하여 얻은 겨우살이발효유를 공시재료로 사용하였다.
실험예
1. 본 발명 유산균
L.
plantarum
GLKM42
및
L.
casei
GLKM43
균주 간의 길항작용 유무
본 발명 유산균 L. plantarum GLKM42 및 L. casei GLKM43 균주 간의 길항작용의 유무를 확인하기 위하여 각각 two-layer method를 사용하여 겨우살이 발효유의 스타터로서의 가능성을 평가하였다. 각각의 Two-layer 모두 MRS 배지를 사용하였고 1.5% MRS agar(Agar, Bacteriological., Affymetrix USB, USA) plate(Petri Dish 10090, SPL Life Science, Korea)위에 suspense을 잘한 각각의 유산균 L. plantarum GLKM42 및 L. casei GLKM43 균주를 5 uL씩 spot하여 26℃에서 24시간 배양한 후 colony를 확인하였다. 0.75% MRS agar를 over-layered로 붓기 전에 45~50℃에서 본 발명 유산균 L. plantarum GLKM42 및 L. casei GLKM43 균주를 1.0×106CFU/mL가 되도록 서로 교차하여 접종한 후 섞어주고 poured over한 후 다시 동일한 조건인 26℃에 24시간 배양하였다. 실험 결과 spot 주위에 clear zone이 명확하게 생성되지 않아 균주 간의 길항작용이 일어나지 않음으로 두 균주를 겨우살이 발효유의 스타터로서의 함께 사용 가능함을 확인하였다(도 1).
실험예
2. 발효시간에 따른 본 발명 유산균
L.
plantarum
GLKM42
및
L. casei
GLKM43
균주가 접종된 겨우살이 발효유 내의 유산균 수와
pH
측정
본 발명 유산균 L. plantarum GLKM42 및 L. casei GLKM43 균주가 접종된 겨우살이 발효유의 시간별 발효 정도를 분석하기 위하여 26℃에서 MRS agar 배지를 사용한 평판배양법으로 유산균 수의 변화를 평가하고 유산균 대사산물인 젖산으로 인한 시료의 pH 변화를 pH meter(Orion 720A+, Thermo Orion)를 사용하여 측정하였다.
실험 결과 48시간 이후 본 발명 유산균 L. plantarum GLKM42 및 L. casei GLKM43 균주가 접종된 겨우살이 발효유를 포함한 모든 겨우살이 발효유의 pH가 pH 4.3~4.4 범위로 측정되어 발효가 잘 이루어졌음을 확인하였고 본 발명 유산균 균주가 접종된 겨우살이 동결건조 가루가 제외된 발효유(음성대조군), 본 발명 유산균 L. plantarum GLKM42 및 L. casei GLKM43 균주가 접종된 겨우살이 발효유, 현재 시중에 판매되고 있는 발효유에 한국산 겨우살이를 첨가하여 발효시킨 발효유(양성대조군)를 가지고 확인한 결과 현재 시중에 판매되고 있는 발효유의 스타터 유산균 수에 비해, 본 발명 유산균 L. plantarum GLKM42 및 L. casei GLKM43 균주가 접종된 겨우살이 발효유 내의 유산균의 수가 10배 이상 증식한 것을 확인하였다(표 2).
| pH | No. | pH | No. | pH | No. | |
| Fermentation time | 0(hour) | 24(hour) | 48(hour) | |||
| A | 6.91 | 9.1 | 6.48 | 8.8 | 4.47 | 9.3 |
| B | 6.86 | 8.8 | 5.88 | 8.9 | 4.33 | 9.3 |
| C | 6.95 | 8.0 | 4.95 | 7.0 | 4.34 | 8.6 |
[주] 1.
No
.는
log10
cfu
/
mL
의 유산균 수를 의미한다.
2. A : 음성 대조군, B : 본 발명 유산균
L.
plantarum
GLKM42
및
L.
casei
GLKM43
균주가 접종된 겨우살이 발효유, C:양성 대조군
실험예
3. 본 발명 유산균
L.
plantarum
GLKM42
및
L.
casei
GLKM43
균주가 접종된 겨우살이 발효유의 렉틴 농도 측정
본 발명 유산균 L. plantarum GLKM42 및 L. casei GLKM43 균주가 접종된 겨우살이 발효유를 ELISA법(T. J. Yoon, et al ., Production of monoclonal antibodies specific to Korean mistletoe lectin (KML-C) and their characterization, J. Pharm . Soc . Korea 45(2):180-189, 2001)을 이용하여 시료 속 렉틴의 농도를 측정하였다. anti-KMLC polyclonal rabbit sera를 96-well plate에 coating한 후 5% 저지방우유로 차단시켰다. 한국산겨우살이렉틴(KMLC) 표준시료와 렉틴을 정량할 시료를 모두 2배씩 8회 희석하여 각 well에 넣고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 8B112C5 단일클론항체(monoclonal antibody)를 희석하여 well당 100 uL씩 주입하고 1시간 동안 37℃에서 반응시킨 후 TMB 용액을 넣어 발색 시켰다. 발색 후 반응정지용액으로 반응을 정지시키고 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
본 발명 유산균 균주가 접종된 겨우살이 동결건조 가루가 제외된 발효유(음성대조군), 본 발명 유산균 L. plantarum GLKM42 및 L. casei GLKM43 균주가 접종된 겨우살이 발효유, 현재 시중에 판매되고 있는 발효유에 한국산 겨우살이를 첨가하여 발효시킨 발효유(양성대조군)를 가지고 확인한 결과 시중에 판매되고 있는 발효유에 한국산 겨우살이를 첨가하여 발효시킨 양성 대조군(positive control)보다 본 발명 유산균 L. plantarum GLKM42 및 L. casei GLKM43 균주가 접종된 겨우살이 발효유의 렉틴 함량이 2배 이상 높게 나타났다(표 3).
| A | B | C | |
| without KM powder | Concentration of KM powder = 3mg/mL | ||
| (㎍/mL) | 0 | 93.8 | 41.3 |
[주] 1.모든 시료는 24시간 배양하였다.
2. A : 음성 대조군, B : 본 발명 유산균
L.
plantarum
GLKM42
및
L.
casei
GLKM43
균주가 접종된 겨우살이 발효유, C:양성 대조군
실험예
4. 본 발명 유산균
L.
plantarum
GLKM42
및
L.
casei
GLKM43
균주가 접종된 겨우살이 발효유 식음에 따른 실험용 마우스 대장 내의
균총
확인
본 발명 유산균 L. plantarum GLKM42 및 L. casei GLKM43 균주가 접종된 겨우살이 발효유 식음에 의한 대장 내의 유익균과 유해균의 비율 변화를 확인하기 위해 일반실험용 ICR 마우스의 대장을 해부하고 그 균총을 MacConkey, MRS 배지, Reinforced Cloatridial Agar, Tryptone Yeast Extract Agar 및 Brucella Agar Base를 선택배지로 사용하여 평판배양법으로 확인하였다. 본 발명 유산균 L. plantarum GLKM42 및 L. casei GLKM43 균주가 접종된 겨우살이 발효유를 일반실험용 ICR 마우스의 식수에 30배 희석시켜 식음하는 유산균의 최종 균수가 프로바이오틱스 섭취량 기준 1×108CFU/mL 이상이 되도록 7주간 음용하게 한 후 대장을 해부하여 0.1 중량% peptone water 5 mL에 보관하였다. 원심분리 한 후 상등액 1 mL을 얻어 유익균과 유해균을 분리하는 선택배지에 계대 배양하였다. 선택배지로는 호기배양으로 Enterobacteria와 Lactobacilli의 분리를 위하여 MacConkey 및 MRS 배지를 사용하였고 혐기배양으로 total anaerobes, bifidobacteria 및 Bacteroies의 분리를 위하여 Reinforced Cloatridial Agar, Tryptone Yeast Extract Agar 및 Brucella Agar Base을 사용하였다.
본 발명 유산균 균주가 접종된 겨우살이 동결건조 가루가 제외된 발효유(음성대조군), 본 발명 유산균 L. plantarum GLKM42 및 L. casei GLKM43 균주가 접종된 겨우살이 발효유, 현재 시중에 판매되고 있는 발효유에 한국산 겨우살이를 첨가하여 발효시킨 발효유(양성대조군)를 가지고 확인한 결과 대장 내 혐기균의 분포와 유익균인 lactobacilli 및 bifidobacteria의 분포가 본 발명 유산균 L. plantarum GLKM42 및 L. casei GLKM43 균주가 접종된 겨우살이 발효유를 식음한 실험군에서 가장 높게 나타나 본 발명 유산균 L. plantarum GLKM42 및 L. casei GLKM43 균주가 프로바이오틱스 유산균임을 확인하였다(표 4).
| Groups | Lactobacilli | Bifidobacteria | Total Anaerobes |
Bacteroides | Enterobacteria |
| A | 7.1±0.05 | 8.4±0.01 | 7.6±0.07 | 6.3±0.07 | 5.8±0.05 |
| B | 8.7±0.01 | 8.4±0.03 | 8.5±0.02 | 5.5 | 7.7±0.03 |
| C | 8.1±0.06 | 8.0±0.08 | 8.1±0.06 | 3.5±0.03 | 7.4±0.02 |
[주] 1.발현된 결과는 대장의
log10
CFU
/g의 표준편차(
SD
) 값을 의미한다.
2. A : 음성 대조군, B : 본 발명 유산균
L.
plantarum
GLKM42
및
L.
casei
GLKM43
균주가 접종된 겨우살이 발효유, C:양성 대조군
이상 설명한 바와 같이 본 발명은 한국산 겨우살이의 발효에 적합한 신규한 유산균을 제공하는 데 그 목적이 한국산 겨우살이 발효용 유산균 Lactobacillus plantarum GLKM42 및 Lactobacillus casei GLKM43이 접종된 겨우살이 발효유의 제조방법을 제공하는 뛰어난 효과가 있으므로 유산균을 이용한 발효식품산업상 매우 유용한 발명인 것이다.
<110> MISTLETOEBIO Co., Ltd
<120> A novel Lactobacilli species for ferment Korean mistletoe
<130> P5622
<160> 4
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 918
<212> RNA
<213> Lactobacillus plantarum GLKM42_518F
<400> 1
caggcggttt tttaagtctg atgtgaaagc cttcggctca accgaagaag tgcatcggaa 60
actgggaaac ttgagtgcag aagaggacag tggaactcca tgtgtagcgg tgaaatgcgt 120
agatatatgg aagaacacca gtggcgaagg cggctgtctg gtctgtaact gacgctgagg 180
ctcgaaagta tgggtagcaa acaggattag ataccctggt agtccatacc gtaaacgatg 240
aatgctaagt gttggagggt ttccgccctt cagtgctgca gctaacgcat taagcattcc 300
gcctggggag tacggccgca aggctgaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc 360
ggtggagcat gtggtttaat tcgaagctac gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatact 420
atgcaaatct aagagattag acgttccctt cggggacatg gatacaggtg gtgcatggtt 480
gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttatta 540
tcagttgcca gcattaagtt gggcactctg gtgagactgc cggtgacaaa ccggaggaag 600
gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg 660
gatggtacaa cgagttgcga actcgcgaga gtaagctaat ctcttaaagc cattctcagt 720
tcggattgta ggctgcaact cgcctacatg aagtcggaat cgctagtaat cgcggatcag 780
catgccgcgg gtgaatacgt tccccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accaatggag 840
agtttgtaac acccaaaagt cggggggggt aaccttttta ggaaccagcc gccctaaagt 900
ggggacagat gattaggg 918
<210> 2
<211> 770
<212> RNA
<213> Lactobacillus plantarum GLKM42_800R
<400> 2
tttcgagcat cagcgtcagt tacagaccag acagccgcct tcgccactgg tgttcttcca 60
tatatctacg catttcaccg ctacacatgg agttccactg tcctcttctg cactcaagtt 120
tcccagtttc cgatgcactt cttcggttga gccgaaggct ttcacatcag acttaaaaaa 180
ccgcctgcgc tcgctttacg cccaataaat ccggacaacg cttgccacct acgtattacc 240
gcggctgctg gcacgtagtt agccgtggct ttctggttaa ataccgtcaa tacctgaaca 300
gttactctca gatatgttct tctttaacaa cagagtttta cgagccgaaa cccttcttca 360
ctcacgcggc gttgctccat cagactttcg tccattgtgg aagattccct actgctgcct 420
cccgtaggag tttgggccgt gtctcagtcc caatgtggcc gattaccctc tcaggtcggc 480
tacgtatcat tgccatggtg agccgttacc ccaccatcta gctaatacgc cgcgggacca 540
tccaaaagtg atagccgaag ccatctttca agctcggacc atgcggtcca agttgttatg 600
cggtattagc atctgtttcc aggtgttatc ccccgcttct gggcaggttt cccacgtgtt 660
actcaccagt tcgccactca ctcaaatgta aatcatgatg caagcaccaa tcaataccag 720
agttcgttcg acttgcatgt attaggcacg ccgccagcgt tcgtcctgag 770
<210> 3
<211> 1433
<212> RNA
<213> Lactobacillus casei GLKM43_518F
<400> 3
ccaggatgaa cgctggcggc gtgcctaata catgcaagtc gaacgagttc tcgttgatga 60
tcggtgcttg caccgagatt caacatggaa cgagtggcgg acgggtgagt aacacgtggg 120
taacctgccc ttaagtgggg gataacattt ggaaacagat gctaataccg catagatcca 180
agaaccgcat ggttcttggc tgaaagatgg cgtaagctat cgcttttgga tggacccgcg 240
gcgtattagc tagttggtga ggtaatggct caccaaggcg atgatacgta gccgaactga 300
gaggttgatc ggccacattg ggactgagac acggcccaaa ctcctacggg aggcagcagt 360
agggaatctt ccacaatgga cgcaagtctg atggagcaac gccgcgtgag tgaagaaggc 420
tttcgggtcg taaaactctg ttgttggaga agaatggtcg gcagagtaac tgttgtcggc 480
gtgacggtat ccaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt 540
aggtggcaag cgttatccgg atttattggg cgtaaagcga gcgcaggcgg ttttttaagt 600
ctgatgtgaa agccctcggc ttaaccgagg aagcgcatcg gaaactggga aacttgagtg 660
cagaagagga cagtggaact ccatgtgtag cggtgaaatg cgtagatata tggaagaaca 720
ccagtggcga aggcggctgt ctggtctgta actgacgctg aggctcgaaa gcatgggtag 780
cgaacaggat tagataccct ggtagtccat gccgtaaacg atgaatgcta ggtgttggag 840
ggtttccgcc cttcagtgcc gcagctaacg cattaagcat tccgcctggg gagtacgacc 900
gcaaggttga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt 960
aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat cttttgatca cctgagagat 1020
caggtttccc cttcgggggc aaaatgacag gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg 1080
tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctta tgactagttg ccagcattta 1140
gttgggcact ctagtaagac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa 1200
tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atggatggta caacgagttg 1260
cgagaccgcg aggtcaagct aatctcttaa agccattctc agttcggact gtaggctgca 1320
actcgcctac acgaagtcgg aatcgctagt aatcgcggat cagcacgccg cgggtgaata 1380
cgttcccggg gccttgtaca caccggccgg tcaaaccatg gagaagtttg taa 1433
<210> 4
<211> 770
<212> RNA
<213> Lactobacillus casei GLKM43_800R
<400> 4
ctttcgagcc tcagcgtcag ttacagacca gacagccgcc ttcgccactg gtgttcttcc 60
atatatctac gcatttcacc gctacacatg gagttccact gtcctcttct gcactcaagt 120
ttcccagttt ccgatgcgct tcctcggtta agccgagggc tttcacatca gacttaaaaa 180
accgcctgcg ctcgctttac gcccaataaa tccggataac gcttgccacc tacgtattac 240
cgcggctgct ggcacgtagt tagccgtggc tttctggttg gataccgtca cgccgacaac 300
agttactctg ccgaccattc ttctccaaca acagagtttt acgacccgaa agccttcttc 360
actcacgcgg cgttgctcca tcagacttgc gtccattgtg gaagattccc tactgctgcc 420
tcccgtagga gtttgggccg tgtctcagtc ccaatgtggc cgatcaacct ctcagttcgg 480
ctacgtatca tcgccttggt gagccattac ctcaccaact agctaatacg ccgcgggtcc 540
atccaaaagc gatagcttac gccatctttc agccaagaac catgcggttc ttggatctat 600
gcggtattag catctgtttc caaatgttat cccccactta agggcaggtt acccacgtgt 660
tactcacccg tccgccactc gttccatgtt gaatctcggt gcaagcaccg atcatcaacg 720
agaactcgtt cgacttgcat gtattaggca cgccgccagc gttcatcctg 770
Claims (5)
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 한국산 겨우살이로부터 Lactobacillus plantarum GLKM42(KCTC 12723BP) 균주 와 Lactobacillus casei GLKM43(KCTC 12724BP) 균주를 분리하는 단계(a)와; 상기 (a) 단계에서 얻은 유산균 균주들을 배양하여 우유에 희석하는 단계(b)와; 상기(b) 단계에서 얻은 유산균 희석액을 겨우살이 동결건조 가루와 혼합하여 이를 우유 원액에 첨가한 후 다시 배양하는 것이 특징인 겨우살이 발효유의 제조방법.
- 제4항의 방법에 따라 제조되어 렉틴 함량이 증대되고 대장 내 락토바실러스(Lactobacillus), 비피도박테리아(Bifidobacteria), 혐기균(Total Anaerobes), 혐기성 그람음성세균(Bacteroides), 엔테로박테리아(Enterobacteria) 증식이 시중에 판매되고 있는 발효유보다 증대된 것이 특징인 겨우살이 발효유.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020150017933A KR101764757B1 (ko) | 2015-02-05 | 2015-02-05 | 신규한 한국산 겨우살이 발효용 유산균 및 이를 이용한 유산균 발효유 제조방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020150017933A KR101764757B1 (ko) | 2015-02-05 | 2015-02-05 | 신규한 한국산 겨우살이 발효용 유산균 및 이를 이용한 유산균 발효유 제조방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20160096756A KR20160096756A (ko) | 2016-08-17 |
| KR101764757B1 true KR101764757B1 (ko) | 2017-08-16 |
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ID=56873519
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020150017933A KR101764757B1 (ko) | 2015-02-05 | 2015-02-05 | 신규한 한국산 겨우살이 발효용 유산균 및 이를 이용한 유산균 발효유 제조방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101764757B1 (ko) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100277348B1 (ko) | 1998-12-03 | 2001-01-15 | 이은선 | 겨우살이를 발효시키는 신규 유산균인 락토바실러스 카제이 케이 와이 22713 |
-
2015
- 2015-02-05 KR KR1020150017933A patent/KR101764757B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100277348B1 (ko) | 1998-12-03 | 2001-01-15 | 이은선 | 겨우살이를 발효시키는 신규 유산균인 락토바실러스 카제이 케이 와이 22713 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 약학회지, Vol.39 no.1, pp.24-30(1995.) |
| 한국식품과학회지, Vol.41, pp.560-565(2009.)* |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20160096756A (ko) | 2016-08-17 |
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