KR101763504B1

KR101763504B1 - 브루톤 티로신 키나아제의 억제제

Info

Publication number: KR101763504B1
Application number: KR1020157026057A
Authority: KR
Inventors: 프란시스코 자비어 로페즈-타피아
Original assignee: 에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date: 2013-03-05
Filing date: 2014-03-03
Publication date: 2017-07-31
Also published as: KR20150119944A; MX2015010983A; WO2014135474A1; JP2016510051A; CA2903137A1; US9663494B2; CN105143215B; US20150376166A1; RU2015141360A; EP2964642B1; EP2964642A1; BR112015021806A2; CA2903137C; HK1218416A1; CN105143215A

Abstract

본원은 BTK를 억제하는 하기 화학식 I에 따른 화합물을 개시한다:
[화학식 I]

상기 식에서,
모든 변수는 본원에 기재된 바와 같이 정의된다.
본원에 개시된 화합물은 BTK의 활성을 조절하고 과도한 BTK 활성과 관련된 질환을 치료하는 데 유용하다. 또한, 상기 화합물은 B 세포 이상 증식과 관련된 염증성 및 자가면역 질환, 예컨대 류마티스 관절염을 치료하는 데 유용하다. 또한, 화학식 I의 화합물 및 하나 이상의 담체, 희석제 또는 부형제를 함유하는 조성물을 개시한다.

Description

브루톤 티로신 키나아제의 억제제{INHIBITORS OF BRUTON'S TYROSINE KINASE}

본 발명은 BTK를 억제하고, B 세포 이상(aberrant) 활성화에 의해 유발되는 자가면역 및 염증성 질환의 치료에 유용한 신규한 화합물의 용도에 관한 것이다.

단백질 키나아제는 인간 효소의 가장 큰 계열 중 하나를 구성하고, 포스페이트 기를 단백질에 첨가함으로써 많은 상이한 신호전달 과정을 조절한다(문헌[T. Hunter, Cell 1987 50:823-829]). 구체적으로, 티로신 키나아제는 티로신 잔기의 페놀계 잔기 상의 단백질을 인산화한다. 티로신 키나아제 계열은 세포 성장, 이동 및 분화를 제어하는 일원을 포함한다. 비정상적 키나아제 활성은 암, 자가면역 및 염증성 질환을 포함하는 다양한 인간 질환에 연루되어 있다. 단백질 키나아제는 세포 신호전달의 핵심 조절자 중 하나이므로, 소분자 키나아제 억제제로 세포 기능을 조절하는 표적을 제공하고, 따라서 우수한 약물 설계 표적을 만든다. 키나아제-매개된 질환 과정의 치료 이외에도, 키나아제 활성의 선택적이고 효과적인 억제제는, 세포 신호전달 과정의 연구 및 치료 관심 대상의 다른 세포 표적의 식별에도 유용하다.

B 세포가 자가면역 및/또는 염증성 질환의 발병에 있어서 핵심 역할을 한다는 좋은 증거가 있다. B 세포를 감소시키는 단백질계 치료제, 예컨대 리툭산(Rituxan)은 자가항체-유도된 염증성 질환, 예컨대 류마티스 관절염에 효과적이다(문헌[Rastetter et al. Annu Rev Med 2004 55:477]). 따라서, B 세포 활성화에서 역할을 하는 단백질 키나아제의 억제제는 B 세포-매개된 질환의 병증, 예컨대 자가항체 생산에 대한 유용한 치료제이다.

B 세포 수용체(BCR)를 통한 신호전달은 증식 및 성숙한 항체 생산 세포로의 분화를 포함하는 다양한 B 세포 반응을 제어한다. BCR은 B 세포 활성에 대한 핵심 조절 요소이고, 이상 신호전달은 다수의 자가면역 및/또는 염증성 질환을 초래하는 병원성 자가항체의 형성 및 탈조절된 B 세포 증식을 야기할 수 있다. 브루톤 티로신 키나아제(BTK)는, 막 근위성(membrane proximal)이고 BCR의 바로 하류인 비-BCR 결합 키나아제이다. BTK의 결핍은 BCR 신호전달을 차단하는 것으로 나타났고, 따라서 BTK의 억제는 B 세포-매개된 질환 과정을 차단하는데 유용한 치료적 접근일 수 있다.

BTK는 티로신 키나아제의 Tec 계열의 일원이고, 초기 B 세포 발달, 및 성숙한 B 세포 활성화 및 생존의 중요한 조절자인 것으로 나타났다(문헌[Khan et al. Immunity 1995 3:283] 및 [Ellmeier et al. J. Exp. Med. 2000 192:1611]). 인간에서의 BTK 돌연변이는 X-연관성 무감마글로불린혈증(XLA) 질환을 초래한다(문헌[Rosen et al. New Eng. J. Med. 1995 333:431] 및 [Lindvall et al. Immunol. Rev. 2005 203:200]에서 검토됨). 이러한 환자들은 면역이 손상되고, B 세포의 손상된 성숙, 감소된 면역글로불린 및 말초 B 세포 수준, 줄어든 T 세포 독립성 면역 반응뿐만 아니라 BCR 자극 후 약화된 칼슘 가동화를 나타낸다.

자가면역 및 염증성 질환에서 BTK의 역할에 대한 증거는 또한 BTK-결핍 마우스 모델에 의해 제공되었다. 전신 홍반성 루푸스(SLE)의 임상전 뮤린 모델에서, BTK-결핍 마우스는 질환 진행의 현저한 개선을 나타낸다. 또한, BTK-결핍 마우스는 콜라겐-유도 관절염에 대해 내성이 있다(문헌[Jansson and Holmdahl Clin. Exp. Immunol. 1993 94:459]). 선택적인 BTK 억제제는 마우스 관절염 모델에서 투여량-의존적 효력이 있는 것으로 입증되었다(문헌[Z. Pan et al., Chem. Med Chem. 2007 2:58-61]).

BTK는 또한 질환 과정에 수반될 수 있는 B 세포 이외의 세포에 의해 발현된다. 예를 들면, BTK는 비만 세포에 의해 발현되고, BTK-결핍 골수 유래된 비만 세포는 손상된 항원-유도된 탈과립화(degranulation)를 입증한다(문헌[Iwaki et al. J. Biol. Chem. 2005 280:40261]). 이는 BTK가 병적 비만 세포 반응, 예컨대 알레르기 및 천식을 치료하는데 유용할 수 있음을 나타낸다. 또한, BTK 활성이 없는 XLA 환자로부터의 단핵구는 자극 후 감소된 TNF 알파 생산을 나타낸다(문헌[Horwood et al. J Exp Med 197:1603, 2003]). 따라서, TNF 알파 매개된 염증은 소분자 BTK 억제제에 의해 조절될 수 있다. 또한, BTK는 세포자멸(apoptosis)에서 역할을 하는 것으로 보고되었고(문헌[Islam and Smith Immunol. Rev. 2000 178:49]), 따라서 BTK 억제제는 특정 B 세포 림프종 및 백혈병의 치료에 유용할 수 있다(문헌[Feldhahn et al. J. Exp. Med. 2005 201:1837]).

본원은, 하기 기재된 바와 같이, 화학식 I의 BTK 억제제 화합물 및 이의 사용 방법을 제공한다.

본원은 하기 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다:

[화학식 I]

상기 식에서,

n은 1 또는 2이고;

R¹은 -C(=O)R^1', -S(=O)₂R^1' 또는 -OC(R^1')₂CH₂OH이고;

R^1'은 메틸 또는 모폴린이고;

R²는 H 또는 F이고;

R³은 클로로 또는 C(CH₂)₂R^3'이고;

R^3'은 메틸, 시아노 또는 하이드록시메틸이고;

X는 CH, CH₂ 또는 N이고;

X²은 CH 또는 N이고;

X³은 CH 또는 N이고;

Y는 CH 또는 O이되,

n이 2일 때, X는 모두 CH₂이다.

본원은 화학식 I의 화합물을 치료 효과량으로 이를 필요로 하는 환자에게 투여함을 포함하는 염증성 및/또는 자가면역 질환의 치료 방법을 제공한다.

본원은 화학식 I의 화합물을 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 함께 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

정의

본원에서 사용되는 단수형 개체는 하나 이상의 개체를 지칭한다(예를 들면, 화합물은 하나 이상의 화합물 또는 적어도 하나의 화합물을 지칭한다). 마찬가지로, 단수형, "하나 이상" 및 "적어도 하나"가 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다.

어구 "상기 정의된 바와 같은"은 상기 발명의 내용에 제공된 각각의 기에 대한 광범위한 정의 또는 광범위한 청구범위를 지칭한다. 하기 제공되는 모든 다른 실시양태에서, 각각의 실시양태에 존재할 수 있고 명시적으로 정의되지 않은 치환기는 상기 발명의 내용에 제공된 광범위한 정의를 보유한다.

본원에서 전이구에서든지 또는 청구항의 본문에서든지 사용된 바와 같이, 용어 "포함한다" 및 "포함하는"은 개방-종지형 의미를 갖는 것으로 해석되어야 한다. 즉, 상기 용어는 "적어도 ~을 갖는" 또는 "적어도 ~을 포함하는"이라는 표현과 같은 뜻으로 해석되어야 한다. 방법의 문맥에 사용되는 경우, 용어 "포함하는"은 이러한 방법이 적어도 언급된 단계를 포함하지만, 부가적인 단계도 포함할 수 있음을 의미한다. 화합물 또는 조성물의 문맥에 사용되는 경우, 용어 "포함하는"은 화합물 또는 조성물이 적어도 언급된 특징 또는 성분을 포함하지만, 부가적인 특징 또는 성분도 포함할 수 있음을 의미한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 달리 구체적으로 나타나지 않는 한, 용어 "또는"은, " 및/또는"의 "포괄적" 의미로 사용되고, "~중 하나"의 "배타적" 의미로 사용되지 않는다.

용어 "독립적으로"는 본원에서 동일한 화합물 내에서 동일하거나 상이한 정의를 갖는 변수의 존재 또는 부재와 무관하게 임의의 경우에 변수가 적용됨을 나타내는 것으로 사용된다. 따라서, R"가 2회 나타나고 "독립적으로 탄소 또는 질소"로 정의되는 화합물에서, R"는 둘 다 탄소이거나, R"는 둘 다 질소이거나, 하나의 R"는 탄소이고 나머지는 질소일 수 있다.

본 발명에서 사용되거나 청구되는 화합물을 도시하거나 기술하는 임의의 잔기 또는 화학식에서 임의의 변수가 1회보다 많이 나타나는 경우, 각각의 경우 그의 정의는 모든 다른 경우에서의 그의 정의와 독립적이다. 또한, 치환기 및/또는 변수의 조합은 이러한 화합물이 안정한 화합물을 초래하는 경우에만 허용된다.

결합의 말단에서의 기호 "*" 또는 결합을 관통하여 도시된 "

"는 각각 하나의 작용기 또는 다른 화학적 잔기가 분자의 나머지(이는 분자의 일부임)에 대해 부착되는 지점을 지칭한다. 따라서, 예를 들면, R⁴가

또는

인 MeC(=O)OR⁴는

이다.

고리계 내로 도시된 결합(별개의 정점에서 연결된 결합과는 상반됨)은 결합이 임의의 적합한 고리 원자에 부착될 수 있음을 나타낸다.

본원에서 사용되는 용어 "임의적" 또는 "임의적으로"는 후속적으로 기술된 사건 또는 상황이 필수적이지는 않지만 발생할 수 있고, 이러한 기재가 사건 또는 상황이 발생한 경우 및 발생하지 않은 경우를 포함함을 의미한다. 예를 들면, "임의적으로 치환된"은 임의적으로 치환된 잔기가 수소 원자 또는 치환기를 포괄할 수 있음을 의미한다.

어구 "임의적 결합"은 존재하거나 존재하지 않을 수 있는 결합을 의미하고, 이러한 기술은 단일 결합, 이중 결합 또는 삼중 결합을 포함한다. 치환기가 "결합" 또는 "부재"로 지정되는 경우, 이 치환기에 연결된 원자는 직접 연결된다.

용어 "약"은 본원에서 대략, 근처의, 개략적으로 또는 대충을 의미하는 것으로 사용된다. 용어 "약"이 수치 범위와 함께 사용되는 경우, 이는 제시된 수치 범위 위아래로 경계를 확장함으로써 범위를 변경한다. 일반적으로, 용어 "약"은 본원에서 수치 값을 언급된 값의 상하로 20%의 편차로 수식하기 위해 사용된다.

화학식 I의 특정 화합물은 호변이성질성을 나타낼 수 있다. 호변이성질성 화합물은 2개 이상의 상호전환가능한 종으로서 존재할 수 있다. 양성자성(prototropic) 호변이성질체는 2개의 원자 사이에 공유 결합된 수소 원자의 이동으로부터 유래한다. 호변이성질체는 일반적으로 평형 상태로 존재하고, 개별적인 호변이성질체를 단리하기 위한 시도는 통상적으로 혼합물을 생성하고, 이 혼합물의 화학적 및 물리적 특성은 화합물의 혼합물과 일치한다. 평형의 위치는 분자 내의 화학적 특징에 의존한다. 예를 들면, 많은 지방족 알데하이드 및 케톤, 예컨대 아세트알데하이드에서는 케토 형태가 우세한 반면, 페놀에서는 에놀 형태가 우세하다. 통상적인 양성자성 호변이성질체는 케토/에놀(

), 아미드/이미드산(

) 및 아미딘(

) 호변이성질체를 포함한다. 후자 2개는 특히 헤테로아릴 및 헤테로환형 고리에서 통상적이고, 본 발명은 상기 화합물의 모든 호변이성질체 형태를 포괄한다.

본원에 사용된 기술적 및 과학적 용어는 달리 정의되지 않는 한 본 발명이 속하는 분야의 숙련자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다. 당업자에게 공지된 다양한 방법론 및 물질을 본원에 참고한다. 약리학의 일반적인 원리를 설명하는 표준 참고 문헌은 문헌[Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10^th Ed., McGraw Hill Companies Inc., New York(2001)]을 포함한다. 당업자에게 공지된 임의의 적합한 물질 및/또는 방법을 본 발명의 실시에 이용할 수 있다. 그러나, 바람직한 물질 및 방법은 기술되어 있다. 하기 설명 및 실시예에 참고된 물질, 시약 등은 달리 나타내지 않는 한 상업적인 공급원으로부터 입수가능하다.

본원에 기술된 정의가 더해져 화학적으로 관련된 조합, 예컨대 "헤테로알킬아릴", "할로알킬헤테로아릴", "아릴알킬헤테로사이클릴", "알킬카본일", "알콕시알킬"등을 형성할 수 있다. 용어 "알킬"이 "페닐알킬" 또는 "하이드록시알킬"에서와 같이 다른 용어 뒤에서 접미사로서 사용되는 경우, 이는 다른 구체적으로 명명된 기로부터 선택되는 1 또는 2개의 치환기로 치환된 알킬 기(상기 정의된 바와 같음)를 지칭한다. 따라서, 예를 들면, "페닐알킬"은 1 또는 2개의 페닐 치환기를 갖는 알킬 기를 지칭하고, 이에 따라 벤질, 페닐에틸 및 바이페닐을 포함한다. "알킬아미노알킬"은 1 또는 2개의 알킬아미노 치환기를 갖는 알킬 기이다. "하이드록시알킬"은 2-하이드록시에틸, 2-하이드록시프로필, 1-(하이드록시메틸)-2-메틸프로필, 2-하이드록시부틸, 2,3-다이하이드록시부틸, 2-(하이드록시메틸), 3-하이드록시프로필 등을 포함한다. 따라서, 본원에서 사용되는 용어 "하이드록시알킬"은 하기 정의된 헤테로알킬 기의 부분 집합을 정의하기 위해 사용된다. 용어 "-(아르)알킬"은 비치환된 알킬 또는 아르알킬 기를 지칭한다. 용어 "(헤테로)아릴" 또는 "(헤트)아릴"은 아릴 또는 헤테로아릴 기를 지칭한다.

본원에서 사용되는 용어 "스피로 사이클로알킬"은 스피로환형 사이클로알킬 기, 예컨대 스피로[3.3]헵탄을 의미한다. 본원에서 사용되는 용어 "스피로헤테로사이클로알킬"은 스피로환형 헤테로사이클로알킬, 예컨대 2,6-다이아자 스피로[3.3]헵탄을 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "아실"은 화학식 -C(=O)R(이때, R은 수소 또는 본원에 정의된 바와 같은 저급 알킬임)의 기를 나타낸다. 본원에서 사용되는 용어 "알킬카본일"은 화학식 C(=O)R(이때, R은 본원에 정의된 바와 같은 알킬임)의 기를 나타낸다. 용어 "C₁ _-6 아실"은 1 내지 6개의 탄소 원자를 함유하는 기 -C(=O)R을 지칭한다. 본원에서 사용되는 용어 "아릴카본일"은 화학식 C(=O)R(이때, R은 아릴 기임)의 기를 의미하고, 본원에서 사용되는 용어 "벤조일"은 R이 페닐인 "아릴카본일" 기이다.

본원에서 사용되는 용어 "에스터"는 화학식 -C(=O)OR(이때, R은 본원에 정의된 바와 같은 저급 알킬임)의 기를 나타낸다.

본원에서 사용되는 용어 "알킬"은 1 내지 10개의 탄소 원자를 함유하는 포화된 1가 비분지쇄 또는 분지쇄 탄화수소 잔기를 나타낸다. 용어 "저급 알킬"은 1 내지 6개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 잔기를 나타낸다. 본원에서 사용되는 "C₁ _-10 알킬"은 1 내지 10개의 탄소로 이루어진 알킬을 지칭한다. 알킬 기의 예는 저급 알킬 기, 예컨대 메틸, 에틸, 프로필, i-프로필, n-부틸, i-부틸, t-부틸 또는 펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, 헥실, 헵틸 및 옥틸을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

용어 "알킬"이 "페닐알킬" 또는 "하이드록시알킬"에서와 같이 다른 용어의 뒤에서 접미사로서 사용되는 경우, 이는 다른 구체적으로 명명된 기로부터 선택되는 1 또는 2개의 치환기로 치환된 알킬 기(상기 정의된 바와 같음)를 지칭하는 것으로 의도된다. 따라서, 예를 들면 "페닐알킬"은 라디칼 R'R"-을 나타내되, 여기서 R'은 페닐 라디칼이고, R"은 본원에 정의된 바와 같은 알킬렌 라디칼이고, 이때 상기 페닐알킬 잔기의 부착점은 알킬렌 라디칼 상에 존재하는 것으로 이해된다. 아릴알킬 라디칼의 예는 벤질, 페닐에틸, 3-페닐프로필을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 용어 "아릴알킬" 또는 "아르알킬"은 R'이 아릴 라디칼인 것을 제외하고는 유사하게 해석된다. 용어 "(헤트)아릴알킬" 또는 "(헤트)아르알킬"은 R'이 임의적으로 아릴 또는 헤테로아릴 라디칼인 것을 제외하고는 유사하게 해석된다.

용어 "할로알킬", "할로-저급 알킬" 또는 "저급 할로알킬"은 하나 이상의 탄소 원자가 하나 이상의 할로겐 원자로 치환된 1 내지 6개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 잔기를 지칭한다.

본원에서 사용되는 용어 "알킬렌" 또는 "알킬렌일"은, 달리 나타내지 않는 한, 1 내지 10개의 탄소 원자의 포화된 2가 선형 탄화수소 라디칼(예를 들면, (CH₂₎ _n), 또는 2 내지 10개의 탄소 원자의 포화된 2가 분지형 탄화수소 라디칼(예를 들면, -CHMe- 또는 -CH₂CH(i-Pr)CH₂-)을 나타낸다. 메틸렌인 경우를 제외하고, 알킬렌 기의 개방 원자가(open valence)는 동일한 원자에 부착되지 않는다. 알킬렌 라디칼의 예는 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌, 2-메틸-프로필렌, 1,1-다이메틸-에틸렌, 부틸렌, 2-에틸부틸렌을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본원에서 사용되는 용어 "알콕시"는 -O-알킬 기(이때, 알킬은 상기 정의된 바와 같음), 예컨대 메톡시, 에톡시, n-프로필옥시, i-프로필옥시, n-부틸옥시, i-부틸옥시, t-부틸옥시, 펜틸옥시, 헥실옥시 및 이들의 이성질체를 의미한다. 본원에서 사용되는 "저급 알콕시"는 상기 정의된 바와 같은 "저급 알킬"기를 갖는 알콕시 기를 나타낸다. 본원에서 사용되는 "C₁ _-10 알콕시"는 알킬이 C₁ _-10인 -O-알킬을 지칭한다.

용어 "PCy₃"은 3개의 환형 잔기로 삼치환된 포스핀을 지칭한다.

용어 "할로알콕시", "할로-저급 알콕시" 또는 "저급 할로알콕시"는 하나 이상의 탄소 원자가 하나 이상의 할로겐 원자로 치환된 저급 알콕시 기를 지칭한다.

본원에서 사용되는 용어 "하이드록시알킬"은 상이한 탄소 원자 상의 1 내지 3개의 수소 원자가 하이드록실 기로 대체된 본원에 정의된 알킬 라디칼을 나타낸다.

본원에서 사용되는 용어 "알킬설폰일" 및 "아릴설폰일"은 화학식 -S(=O)₂R(이때, R은 각각 알킬 또는 아릴이고, 알킬 및 아릴은 본원에 정의된 바와 같음)의 기를 지칭한다. 본원에서 사용되는 용어 "헤테로알킬설폰일"이라는 용어는 화학식 -S(=O)₂R(이때, R은 본원에 정의된 "헤테로알킬"임)의 기를 나타낸다.

본원에서 사용되는 용어 "알킬설폰일아미노" 및 "아릴설폰일아미노"는 화학식 -NR'S(=O)₂R(이때, R은 각각 알킬 또는 아릴이고, R'는 수소 또는 C₁ _-3 알킬이고, 알킬 및 아릴은 본원에 정의된 바와 같음)의 기를 지칭한다.

본원에서 사용되는 용어 "사이클로알킬"은 3 내지 8개의 탄소 원자를 함유하는 포화된 탄소환형 고리, 즉 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸 또는 사이클로옥틸을 지칭한다. 본원에서 사용되는 "C₃ _-7 사이클로알킬"은 탄소환형 고리 내에 3 내지 7개의 탄소로 이루어진 사이클로알킬을 지칭한다.

본원에서 사용되는 용어 "카복시-알킬"은 1개의 수소 원자가 카복실로 치환된 알킬 잔기를 지칭하고, 이때 헤테로알킬 라디칼의 부착점은 탄소 원자를 통해서라고 이해된다. 용어 "카복시" 또는 "카복실"은 -CO₂H 잔기를 지칭한다.

본원에서 사용되는 용어 "헤테로아릴" 또는 "헤테로방향족"은 하나 이상의 N, O 또는 S 헤테로 원자가 혼입되고 나머지 고리 원자는 탄소인, 고리 당 4 내지 8개의 원자를 함유하는 하나 이상의 방향족 또는 부분적으로 불포화된 고리를 갖는 5 내지 12개의 고리 원자의 일환형 또는 이환형 라디칼을 의미하고, 이때 헤테로아릴 라디칼의 부착점은 방향족 또는 부분적으로 불포화된 고리 상에 존재한다고 이해된다. 당업자에게 널리 공지된 바와 같이, 헤테로아릴 고리는 이의 모든 탄소 대응자 보다 방향족 특성을 덜 갖는다. 따라서, 본 발명의 목적을 위해, 헤테로아릴 기는 어느 정도의 방향족 특성만을 가질 필요가 있다. 헤테로아릴 잔기의 예는 5 또는 6개의 고리 원자 및 1 내지 3개의 헤테로 원자를 갖는 일환형 방향족 헤테로환을 포함하고, 임의적으로 하이드록시, 시아노, 알킬, 알콕시, 티오, 저급 할로알콕시, 알킬티오, 할로, 저급 할로알킬, 알킬설핀일, 알킬설폰일, 할로겐, 아미노, 알킬아미노, 다이알킬아미노, 아미노알킬, 알킬아미노알킬 및 다이알킬아미노알킬, 니트로, 알콕시카본일 및 카바모일, 알킬카바모일, 다이알킬카바모일, 아릴카바모일, 알킬카본일아미노 및 아릴카본일아미노로부터 선택되는 하나 이상의, 바람직하게는 1 또는 2개의 치환기로 치환될 수 있는, 피리딘일, 피리미딘일, 피라진일, 옥사진일, 피롤릴, 피라졸릴, 이미다졸릴, 옥사졸릴, 4,5-다이하이드로-옥사졸릴, 5,6-다이하이드로-4H-[1,3]옥사졸릴, 이속사졸, 티아졸, 이소티아졸, 트라이아졸린, 티아다이아졸 및 옥사다이아졸린을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이환형 잔기의 예는 퀴놀린일, 이소퀴놀린일, 벤조푸릴, 벤조티오페닐, 벤즈옥사졸, 벤즈이속사졸, 벤조티아졸, 나프티리딘일, 5,6,7,8-테트라하이드로-[1,6]나프티리딘일 및 벤즈이소티아졸을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이환형 잔기는 임의적으로 다른 고리 상에 치환될 수 있으나, 부착점은 헤테로 원자를 함유하는 고리 상에 있다.

본원에서 사용되는 용어 "헤테로사이클릴", "헤테로사이클로알킬" 또는 "헤테로사이클"은 고리당 하나 이상의 고리 헤테로 원자(N, O 및 S(O)_0-2로부터 선택됨)를 포함하여 3 내지 8개의 원자의 스피로환형 고리계를 포함하는 하나 이상의 고리, 바람직하게는 1 또는 2개의 고리로 이루어진 1가 포화된 환형 라디칼을 나타내고, 달리 기재되지 않는 한, 이들은 임의적으로 하이드록시, 옥소, 시아노, 저급 알킬, 저급 알콕시, 저급 할로알콕시, 알킬티오, 할로, 저급 할로알킬, 하이드록시알킬, 니트로, 알콕시카본일, 아미노, 알킬아미노, 알킬설폰일, 아릴설폰일, 알킬아미노설폰일, 아릴아미노설폰일, 알킬설폰일아미노, 아릴설폰일아미노, 알킬아미노카본일, 아릴아미노카본일, 알킬카본일아미노, 아릴카본일아미노 및 이들의 이온 형태로부터 선택되는 하나 이상, 바람직하게는 1 또는 2개의 치환기로 독립적으로 치환될 수 있다. 헤테로환형 라디칼의 예는 모폴린일, 피페라진일, 피페리딘일, 아제티딘일, 피롤리딘일, 헥사하이드로아제피닐, 옥세타닐, 테트라하이드로푸라닐, 테트라하이드로티오페닐, 옥사졸리딘일, 티아졸리딘일, 이속사졸리딘일, 테트라하이드로피란일, 티오모폴린일, 퀴누클리딘일 및 이미다졸린일 및 이들의 이온 형태를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 예는 이환형, 예컨대 3,8-다이아자-바이사이클로[3.2.1]옥탄, 2,5-다이아자-바이사이클로[2.2.2]옥탄 또는 옥타하이드로-피라지노[2,1-c][1,4]옥사진일 수 있다.

BTK의 억제제

[화학식 I]

상기 식에서,

n은 1 또는 2이고;

R¹은 -C(=O)R^1',-S(=O)₂R^1' 또는 -OC(R^1')₂CH₂OH이고;

R^1'은 메틸 또는 모폴린이고;

R²는 H 또는 F이고;

R³은 클로로 또는 C(CH₂)₂R^3'이고;

R^3'은 메틸, 시아노 또는 하이드록시메틸이고;

X는 CH, CH₂ 또는 N이고;

X²는 CH 또는 N이고;

X³은 CH 또는 N이고;

Y는 CH 또는 O이되,

n이 2일 때, X는 모두 CH₂이다.

본원은 R²가 H인 화학식 I의 화합물을 제공한다.

본원은 R³이 t-부틸인 화학식 I의 화합물을 제공한다.

본원은 X³이 CH인 화학식 I의 화합물을 제공한다.

본원은 X²가 N인 화학식 I의 화합물을 제공한다.

본원은 R¹이 -C(=O)R^1'이고, R^1'이 모폴린인 화학식 I의 화합물을 제공한다.

본원은 n이 1인 화학식 I의 화합물을 제공한다.

본원은 X가 CH 또는 CH₂인 화학식 I의 화합물을 제공한다.

본원은 Y가 CH 또는 CH₂인 화학식 I의 화합물을 제공한다.

본원은 n이 2이고, Y가 O인 화학식 I의 화합물을 제공한다.

본원은 n이 2이고, Y가 O이고, R²가 H이고, R³이 t-부틸이고, X³이 CH이고, X²가 N인 화학식 I의 화합물을 제공한다.

본원은 R¹이 -S(=O)₂R^1'이고 R^1'이 메틸이거나, R¹이 -C(=O)₂R^1'이고 R^1'이 모폴린인 화학식 I의 화합물을 제공한다.

본원은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 화학식 I의 화합물을 제공한다:

2-[2-[2-(하이드록시메틸)-3-[1-메틸-5-[[5-(모폴린-4-카본일)피리딘-2-일]아미노]-6-옥소피리다진-3-일]페닐]-1-옥소-3,4-다이하이드로이소퀴놀린-6-일]-2-메틸프로판니트릴;

2-[8-플루오로-2-[2-(하이드록시메틸)-3-[5-[[5-(1-하이드록시-2-메틸프로판-2-일)옥시피리딘-2-일]아미노]-1-메틸-6-옥소피리다진-3-일]페닐]-1-옥소이소퀴놀린-6-일]-2-메틸프로판니트릴;

4-[2-(하이드록시메틸)-3-[1-메틸-5-[(5-메틸설폰일피리딘-2-일)아미노]-6-옥소피리다진-3-일]페닐]-8-(1-하이드록시-2-메틸프로판-2-일)-2,3-다이하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-5-온;

5-클로로-N-[2-(하이드록시메틸)-3-[1-메틸-5-[[5-(모폴린-4-카본일)피리딘-2-일]아미노]-6-옥소피리딘-3-일]페닐]-1,3-다이하이드로이소인돌-2-카복스아미드;

6-t-부틸-2-[2-(하이드록시메틸)-3-[1-메틸-5-[[5-(모폴린-4-카본일)피리딘-2-일]아미노]-6-옥소피리딘-3-일]페닐]-3,4-다이하이드로-2,7-나프티리딘-1-온;

6-t-부틸-2-[2-(하이드록시메틸)-3-[1-메틸-5-[[5-(모폴린-4-카본일)피리딘-2-일]아미노]-6-옥소피리다진-3-일]페닐]-3,4-다이하이드로-2,7-나프티리딘-1-온;

6-t-부틸-8-플루오로-2-[2-메틸-3-[1-메틸-5-[[5-(모폴린-4-카본일)피리딘-2-일]아미노]-6-옥소피리다진-3-일]페닐]프탈라진-1-온;

8-t-부틸-4-[2-(하이드록시메틸)-3-[1-메틸-5-[[5-(모폴린-4-카본일)피리딘-2-일]아미노]-6-옥소피리다진-3-일]페닐]-2,3-다이하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-5-온; 및

8-t-부틸-4-[2-(하이드록시메틸)-3-[1-메틸-5-[(5-메틸설폰일피리딘-2-일)아미노]-6-옥소피리다진-3-일]페닐]-2,3-다이하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-5-온.

본원은 화학식 I의 화합물을 치료 효과량으로 이를 필요로 하는 환자에게 투여함을 포함하는 류마티스 관절염의 치료 방법을 제공한다.

본원은 화학식 I의 화합물을 치료 효과량으로 이를 필요로 하는 환자에게 투여함을 포함하는 천식의 치료 방법을 제공한다.

본원은 화학식 I의 화합물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

본원은 염증성 질환의 치료용 약제의 제조에 있어서 화학식 I의 화합물의 용도를 제공한다.

본원은 자가면역 질환의 치료용 약제의 제조에 있어서 화학식 I의 화합물의 용도를 제공한다.

본원은 류마티스 관절염의 치료용 약제의 제조에 있어서 화학식 I의 화합물의 용도를 제공한다.

본원은 천식의 치료용 약제의 제조에 있어서 화학식 I의 화합물의 용도를 제공한다.

본원은 염증성 및/또는 자가면역 질환의 치료를 위해 상기 기재된 바와 같은 화합물의 용도를 제공한다.

본원은 류마티스 관절염의 치료를 위해 상기 기재된 바와 같은 화합물의 용도를 제공한다.

본원은 천식의 치료를 위해 상기 기재된 바와 같은 화합물의 용도를 제공한다.

본원은 본원에 기재된 바와 같은 화합물, 방법 또는 조성물을 제공한다.

화합물 및 제조

본 발명에 포괄되고 본 발명의 범주 내의 대표적인 화합물의 예를 하기 표에 제공하였다. 하기의 이러한 예 및 제조 방법은 당업자로 하여금 본 발명을 더욱 명확하게 이해하고 실시할 수 있도록 제공된다. 이들은 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 간주되어서는 안되며, 단지 본 발명을 예시하고 대표하는 것으로 간주된다.

일반적으로, 본원에 사용된 명명법은 IUPAC 체계 명명법의 생성을 위한 바일스타인 인스티튜트(Beilstein Institute) 컴퓨터화된 시스템인 오토놈티엠(AMUTONOMTM) 4.0 버전에 기초한다. 도시된 구조와 그 구조에 제시된 명칭이 불일치하는 경우, 도시된 구조 쪽에 좀더 무게를 두어야 한다. 또한, 구조의 입체화학 또는 구조의 일부가, 예를 들면, 볼드체 또는 점선으로 나타나지 않는 경우, 상기 구조 또는 구조의 일부는 모든 입체 이성질체를 포괄하는 것으로 해석되어야 한다.

하기 표 I은 일반적인 화학식 I의 화합물의 예를 도시한다. 이러한 화합물은 피리다진온 코어 기와 조합된 더 극성(cLogP<2) 선택성 기(예를 들면, t-부틸 벤즈아미드가 위치되는 경우)를 함유하도록 고안되어 이 유리한 조합을 함유하지 않는 유사한 화합물의 사용시 발견된 간 독성을 최소화한다.

[표 I]

일반적인 합성 반응식

본 발명의 화합물을 임의의 통상적인 방식으로 제조할 수 있다. 이러한 화합물을 합성하기 위한 적합한 방법을 실시예에 제시하였다. 일반적으로, 본 발명의 화합물을 하기 반응식에 따라 제조할 수 있다:

[반응식 1]

5-플루오로-인단-1-온(10)을 슈미트(Schmidt) 반응시켜 다이하이드로-이소퀴놀린온(11)을 수득하고, 이를 과잉 이소부티로니트릴 칼륨 염으로 처리하여 시아노 화합물(12)을 수득한다. 다이브로모벤즈알데하이드(13)와 부크발트-하르트비히(Buckwald-Hartwig) 커플링하여 모노브로마이드(14)를 수득하고, 이를 미리형성된 보로네이트(15)와 스즈키(Suzuki) 커플링하여 피리다진온(16)을 수득한다. 벤질 알코올로 최종 환원시켜 관심 화합물(1)을 수득한다.

[반응식 2]

1-브로모-3,5-다이플루오로벤젠(17)을 이소부티로니트릴의 리튬 염과 방향족 친핵성 치환반응시켜 선택적으로 시아노 화합물(18)을 수득하고, 이를 리튬 다이이소프로필아미드와 반응시켜 이의 리튬 염으로 전환하고, 이산화탄소로 급랭하여 산(19)을 수득한다. 카본일 다이이미다졸로 처리한 후 암모튬 하이드록사이드 아미드(20)를 수득한다. 에톡시-비닐 보로네이트(21)와 스즈키 커플링한 후 산 처리하여 이소퀴놀린온(22)을 수득하고, 이를 2-브로모-6-플루오로-벤즈알데하이드 및 칼륨 카보네이트와 방향족 친핵성 치환반응시켜 중간체(23)를 수득한다. 반면에, 6-아미노-피리딘-3-올(24)을 에틸 브로모-이소부티레이트(25)로 알킬화하여 방향족 에터(26)를 수득하고, 이를 브로모-클로로-피리다진온(27)과 부크발트-하르트비히 커플링하여 화합물(28)을 수득한다. 에스터를 LAH로 환원시켜 알코올(29)을 수득한다. 알코올(29)을 이의 보로네이트 에스터로 변환한 후, 브로마이드(23)와 스즈키 커플링하여 알데하이드(30)를 수득하고, 이를 상응하는 알코올로 환원시켜 관심 화합물(2)을 수득한다.

[반응식 3]

클로로벤즈알데하이드(31)로부터 수득된 O-메틸-2-클로로-벤즈알독심(32)을 Pd-촉매화된 C-H 활성화(문헌[J. Org. Chem. 2011, 76, 6414-420])하에 선택적으로 오르토-브롬화하여 화합물(33)을 수득하고, 이를 중간체(34)로 가수분해한다. 반면에, 5-브로모-피리딘-2-일아민(35)을 나트륨 메탄설피네이트로 처리하여 설폰(36)을 수득하고, 이를 브로모-피리다진온(27)과 커플링하여 중간체(37)를 수득한다. p-메톡시벤즈알데하이드(38)를 환원적으로 아민화하여 아미노알코올(39)을 수득하고, 이를 4-브로모-2-플루오로벤조산(40)과 축합한 후 아미드(41)로 변환한다. 나트륨 하이드리드로 처리한 후 벤조-옥사제핀온(42)으로 분자내 환화를 수행한다. 이소부티르알데하이드를 화합물(42)과 염기성 조건하에 팔라듐 촉매와 축합하여 알데하이드(43)를 수득한다. 탈벤질화 후 중간체(34)와 부크발트-하르트비히 커플링하여 비스-알데하이드(45)를 수득한다. 클로로피리다진온 중간체(37)와 스즈키 커플링하여 화합물(46)을 수득하고, 이를 환원시켜 관심 화합물(3)을 수득한다.

[반응식 4]

니트로알코올(47)을 O-보호하고 환원시켜 아닐린(49)을 수득하고, 이를 보로네이트 에스터(50)로 변환하고, 브로마이드(51)와 커플링하여 화합물(52)을 수득하고, 이의 이소시아네이트를 통해 클로로-이소인돌린(53)과 축합하여 우레아(54)를 수득한다. 최종 탈보호하여 관심 화합물(4)을 수득한다.

[반응식 5]

니코틴아미드(55)를 은 니트레이트 및 암모늄 퍼설페이트의 존재하에 2,2-다이메틸-프로피온산으로 처리하여 t-부틸니코틴아미드(56)를 수득하고, 이를 다시 은 니트레이트 및 암모늄 퍼설페이트의 존재하에 프탈이미도프로판산(57)으로 처리하여 화합물(58)을 수득한다(문헌[Journal of Heterocyclic Chemistry 1989, 26, 45]). 화합물(58)을 하이드라진으로 처리하여 프탈이미드를 탈보호하여 분자내 환화 후 다이하이드로-나프티리딘온(59)을 수득하고, 이를 부크발트-하르트비히 조건하에 다이브로모벤즈알데하이드(13)와 커플링하여 브로마이드(60)를 수득한다. 할라이드(61)와 스즈키 커플링하여 화합물(62)을 수득하고, 이를 환원시킨 후 관심 화합물(5) 및 화합물(6)을 수득한다.

[반응식 6]

플루오로프탈라진온(63)(US 2010/0222325 A1)을 팔라듐(O) 조건하에 다이브로모톨루엔(64)과 커플링하여 모노브로마이드(65)를 수득하고, 이를 보로네이트 에스터(66)로 변환하고, 스즈키 조건하에 화합물(15)과 커플링하여 관심 화합물(7)을 수득한다.

[반응식 7]

3-t-부틸페놀(67)을 브로마이드(68)로 알킬화하여 방향족 에터(69)를 수득하고, 이를 산 처리에 의해 환화하여 크로만올(70)을 수득한다. PCC로 산화하여 크로만온(71)을 수득한다. 나트륨 아지드 및 메탄설폰산으로 슈미트(Schmidt) 반응시켜 다이하이드로-벤즈옥사제핀온(72)을 수득하고, 이를 다이브로벤즈알데하이드(13)와 부크발트-하르트비히 커플링하여 브로마이드(73)를 수득한다. 상응하는 클로로피리다진온(15 또는 37)과 스즈키 커플링하여 화합물(74)을 수득하고, 이를 환원시켜 관심 화합물(8 및 9)을 수득한다.

약학 조성물 및 투여

본 발명의 화합물은 광범위하게 다양한 경구 투여 형태 및 담체로 제형화될 수 있다. 경구 투여는 정제, 코팅된 정제, 당의정, 경질 및 연질 젤라틴 캡슐, 용액, 유화액, 시럽 또는 현탁액의 형태일 수 있다. 본 발명의 화합물은 다른 투여 경로들 중에서 연속(정맥내 적하), 국소 비경구, 근육내, 정맥내, 피하, 경피(침투 증강제를 포함할 수 있음), 구강, 비강, 흡입 및 좌제를 포함하는 다른 투여 경로로 투여될 때 효과적이다. 바람직한 투여 방식은 일반적으로 활성 성분에 대한 환자의 반응 및 고통의 정도에 따라 조정될 수 있는 편리한 일일 투여량 양생법을 이용하는 경구식이다.

본 발명의 화합물 및 이의 약학적으로 이용가능한 염은, 하나 이상의 통상적인 부형제, 담체 또는 희석제와 함께, 약학 조성물 및 단위 투여량의 형태로 존재할 수 있다. 약학 조성물 및 단위 투여 형태는, 추가적인 활성 화합물 또는 주성분(principles)의 존재 또는 부재하에, 통상적인 비율의 통상적인 성분들로 구성될 수 있고, 단위 투여 형태는 사용하기로 의도된 일일 투여량 범위에 상응하는 임의의 적합한 효과량의 활성 성분을 함유할 수 있다. 약학 조성물은 고체, 예컨대 정제 또는 충전된 캡슐, 반고체, 분말, 서방성 제형으로; 액체, 예컨대 용액, 현탁액, 유화액, 엘릭시르(elixir) 또는 경구 사용을 위해 충전된 캡슐로; 직장 내 또는 질내 투여를 위해 좌제의 형태로; 또는 비경구적 사용을 위한 멸균 주사 용액의 형태로 사용될 수 있다. 전형적인 제제는 약 5 내지 약 95%(중량/중량)의 활성 화합물을 함유할 것이다. 용어 "제제" 또는 "투여 형태"는 활성 화합물의 고체 및 액체 제형 둘 다를 포함하는 것으로 의도되고, 당업자는 활성 성분이 표적 장기 또는 조직, 및 목적 투여량 및 약동학적 파라미터에 따라 상이한 제제로 존재할 수 있음을 이해할 것이다.

본원에서 사용되는 용어 "부형제"는 일반적으로 안전하고, 무독성이고, 생물학적으로 또는 달리 바람직한 약학 조성물을 제조하는데 유용한 화합물을 지칭하고, 수의학적 용도뿐만 아니라 인간 약학적 용도를 위해 허용가능한 부형제를 포함한다. 본 발명의 화합물은 단독으로 투여될 수 있으나, 일반적으로는 의도된 투여 경로 및 표준 약학적 실시와 관련하여 선택되는 하나 이상의 적합한 약학적 부형제, 희석제 또는 담체와 혼합되어 투여될 것이다.

"약학적으로 허용가능한"은 일반적으로 안전하고, 무독성이고, 생물학적으로 또는 달리 바람직한 약학 조성물을 제조하는데 유용한 것을 의미하고, 수의학적 용도뿐만 아니라 인간 약학적 용도에도 허용되는 것을 포함한다.

활성 성분의 "약학적으로 허용가능한 염" 형태는 또한, 비-염 형태에서는 부재하는, 활성 성분에 대한 바람직한 약동학적 특성을 초기에 부여할 수 있고, 심지어는 신체에서의 그의 치료 활성과 관련하여 활성 성분의 약역학에 긍정적으로 영향을 줄 수도 있다. 화합물의 "약학적으로 허용가능한 염"이란 어구는 약학적으로 허용되고 모 화합물의 목적한 약학적 활성을 보유하는 염을 의미한다. 상기 염은 다음을 포함한다: (1) 무기산, 예컨대 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등으로 형성되거나, 유기산, 예컨대 아세트산, 프로피온산, 헥산산, 사이클로펜탄프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 락트산, 말론산, 숙신산, 말산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 3-(4-하이드록시벤조일)벤조산, 신남산, 만델산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 1,2-에탄-다이설폰산, 2-하이드록시에탄설폰산, 벤젠설폰산, 4-클로로벤젠설폰산, 2-나프탈렌설폰산, 4-톨루엔설폰산, 캠퍼설폰산, 4-메틸바이사이클로[2.2.2]-옥트-2-엔-1-카복실산, 글루코헵톤산, 3-페닐프로피온산, 트라이메틸아세트산, t-부틸아세트산, 라우릴 설퓨르산, 글루콘산, 글루탐산, 하이드록시나프토산, 살리실산, 스테아르산, 뮤콘산 등으로 형성된 산 부가염; 또는 (2) 모 화합물에 존재하는 산성 양성자가 금속 이온, 예컨대 알칼리 금속 이온, 알칼리 토금속 이온 또는 알루미늄 이온으로 치환되는 경우 형성되거나, 유기 염기, 예컨대 에탄올아민, 다이에탄올아민, 트라이에탄올아민, 트로메타민, N-메틸글루카민 등으로 배위되는 경우 형성되는 염.

고형 제제는 분말, 정제, 알약, 캡슐, 샤쉐, 좌제 및 분산가능한 과립을 포함한다. 고체 담체는 희석제, 향미제, 가용화제, 윤활제, 현탁제, 결합제, 보존제, 정제 붕해제 또는 캡슐화 물질로서도 작용할 수 있는 하나 이상의 물질일 수 있다. 분말에서, 담체는 일반적으로 미분된 활성 성분과의 혼합물인 미분된 고체이다. 정제에서, 활성 성분은 일반적으로 적합한 비율로 필요한 결합 용량을 가진 담체와 혼합되고, 원하는 형태 및 크기로 압착된다. 적합한 담체는 마그네슘 카보네이트, 마그네슘 스테아레이트, 활석, 당, 락토스, 펙틴, 덱스트린, 전분, 젤라틴, 트래거캔트, 메틸셀룰로스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 저융점 왁스, 코코아 버터 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 고형 제제는, 활성 성분에 부가하여, 착색제, 향미제, 안정화제, 완충액, 인공 및 천연 감미제, 분산제, 증점제, 가용화제 등을 함유할 수 있다.

액체 제형이 또한 경구 투여에 적합하고, 이는 유화액, 시럽, 엘릭시르, 수용액, 수성 현탁액을 포함하는 액체 제형을 포함한다. 이들은 사용 직전에 액형 제제로 전환되도록 의도된 고형 제제를 포함한다. 유화액은 용액, 예컨대 수성 프로필렌 글리콜 용액 중에서 제조될 수 있거나, 유화제, 예컨대 레시틴, 소르비탄 모노올레에이트 또는 아카시아를 함유할 수 있다. 수용액은, 활성 성분을 물 중에 용해시키고 적합한 착색제, 향미제, 안정화제 및 증점제를 첨가함으로써 제조될 수 있다. 수성 현탁액은 미분된 활성 성분을 점성 물질, 예를 들면 천연 또는 합성 검, 수지, 메틸 셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스 및 다른 널리 공지된 현탁제와 함께 물 중에 분산시킴으로써 제조될 수 있다.

본 발명의 화합물은 비경구 투여용(예를 들어, 주사, 예컨대 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의함)으로 제형화될 수 있고, 앰플, 사전-충전된 주사기, 소용량 주입물, 또는 보존제가 첨가된 다중-투여 용기에 단위 투여량 형태로 존재할 수 있다. 상기 조성물은 오일성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액, 또는 유화액의 형태로, 예컨대 수성 폴리에틸렌 글리콜 중의 용액과 같은 형태를 취할 수 있다. 오일성 또는 비수성 담체, 희석제, 용매 또는 비히클의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일(예를 들면, 올리브 오일) 및 주사가능한 유기 에스터(예를 들면, 에틸 올레에이트)를 포함하고, 제형 보조제, 예컨대 보존제, 습윤제, 유화제 또는 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은, 멸균 고체의 무균 단리에 의해 또는 적합한 비히클(예를 들면, 멸균되고 발열원이 없는 물)을 이용하여 사용 전에 구성하기 위한 용액으로부터의 동결건조에 의해 수득되는, 분말 형태일 수 있다.

본 발명의 화합물은 피부에 바르는 연고, 크림 또는 로션으로서, 또는 경피 패치로서 국소 투여용으로 제형화될 수 있다. 연고 및 크림은, 예를 들면, 적합한 증점제 및/또는 겔화제를 첨가하여 수성 또는 오일성 기제로 제형화될 수 있다. 로션은 수성 또는 오일성 기제로 제형화될 수 있고, 또한 일반적으로 하나 이상의 유화제, 안정화제, 분산제, 현탁제, 증점제 또는 착색제를 포함할 것이다. 구강에서의 국소 투여에 적합한 제형은 풍미화된 기제(일반적으로, 수크로스 및 아카시아) 중에 활성 성분을 함유하는 로젠지 또는 트래거캔트; 불활성 기제(예를 들면, 젤라틴과 글리세린 또는 수크로스와 아카시아) 중에 활성 성분을 포함하는 향정(pastille); 및 적합한 액체 담체에 활성 성분을 포함하는 구강 세정제를 포함한다.

본 발명의 화합물은 좌제로 투여하기 위해 제형화될 수 있다. 저융점 왁스, 예컨대 지방산 글리세라이드 또는 코코아 버터의 혼합물을 먼저 용융시키고, 활성 성분을, 예를 들면, 교반하면서 균일하게 분산시킨다. 이어서, 용융된 균질 혼합물을 통상적인 크기의 성형 틀에 부어 냉각시키고, 고형화시킨다.

본 발명의 화합물은 질내 투여를 위해 제형화될 수 있다. 활성 성분에 추가하여 상기 담체들을 포함하는 페서리, 탐폰, 크림, 겔, 페이스트, 포말 또는 스프레이가 당업계에서 적당한 것으로 공지되어 있다.

본 발명의 화합물은 비강 투여를 위해 제형화될 수 있다. 용액 또는 현탁액은 통상적인 수단, 예컨대 점적기, 피펫 또는 스프레이를 사용하여 비강으로 직접 적용된다. 제형은 단일 또는 다중 투여 형태로 제공될 수 있다. 점적기 또는 피펫의 후자의 경우, 이는 적당한 사전-결정된 부피의 용액 또는 현탁액을 환자에게 투여하여 달성될 수 있다. 스프레이의 경우, 이는, 예를 들면, 계량 분무 스프레이 펌프(metering atomizing spray pump)를 사용하여 달성될 수 있다.

본 발명의 화합물은 비강내 투여를 포함하여, 특히 호흡기에 대한 에어로졸 투여를 위해 제형화될 수 있다. 상기 화합물은 일반적으로, 예컨대 5 ㎛ 이하 정도의 작은 입자 크기를 갖는다. 상기 입자 크기는 당업계에 공지된 수단, 예컨대 마이크로화(micronization)에 의해 수득될 수 있다. 활성 성분은 적합한 추진체, 예컨대 클로로플루오로카본(CFC)(예를 들면, 다이클로로다이플루오로메탄, 트라이클로로플루오로메탄 또는 다이클로로테트라플루오로에탄), 또는 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 이용하여 압축 팩에 제공된다. 에어로졸은 또한 통상적으로 계면활성제, 예컨대 레시틴을 함유할 수 있다. 약물의 투여량은 계량된 밸브로 제어될 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은 건조 분말, 예컨대 적합한 분말 기제, 예컨대 락토스, 전분, 전분 유도체, 예컨대 하이드록시프로필메틸 셀룰로스 및 폴리비닐피롤리딘(PVP) 중의 화합물의 분말 혼합물의 형태로 제공될 수 있다. 분말 담체는 비강에서 겔을 형성할 것이다. 분말 조성물은 단위 투여량 형태, 예를 들면, 분말이 흡입기에 의해 투여될 수 있는, 젤라틴 또는 블리스터 팩의 캡슐 또는 카트리지 내에 존재할 수 있다.

필요한 경우, 제형들은 활성 성분의 지속된 또는 제어된 방출 투여를 위해 수용된 장용 코팅으로 제조될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 화합물은 경피 또는 피하 약물 전달 장치에서 제형화될 수 있다. 이들 전달 시스템은 화합물의 지속 방출이 필요한 경우 및 환자의 치료 양생법의 준수가 중요한 경우 유리하다. 경피 전달 시스템에서의 화합물은 종종 피부-접착성 고체 지지체에 부착된다. 관심 화합물은 또한 침투 증강제, 예컨대 아존(1-도데실아자-사이클로헵탄-2-온)과 조합될 수 있다. 지속 방출 전달 시스템은 수술 또는 주사에 의해 피하층으로 피하 삽입된다. 피하 이식물은 지용성 막, 예컨대 실리콘 고무, 또는 생분해성 중합체, 예컨대 폴리아세트산에 화합물을 캡슐화시킨다.

약학적 담체, 희석제 및 부형제와 함께 적합한 제형은 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy 1995, edited by E. W. Martin, Mack Publishing Company, 19th edition, Easton, Pennsylvania]에 기재되어 있다. 숙련된 제형 과학자는 명세서의 교시 내에서 제형을 개질시켜, 본 발명의 조성물을 불안정하게 하거나 그의 치료 활성에 지장을 주지 않으면서도, 특정한 투여 경로를 위한 다양한 제형을 제공할 수 있다.

본 발명의 화합물을 물 또는 다른 비히클에 더욱 가용성이 되도록 하기 위한 개질은, 예컨대 약간의 개질(염 제형화, 에스터화 등)에 의해 쉽게 달성될 수 있고, 이는 당업자에게 널리 공지되어 있다. 환자에 있어서 최대의 유익한 효과를 위해 본 화합물의 약동학적 특성을 조정하기 위해 특정한 화합물의 투여 경로 및 투여 양생법을 개질하는 것도 당업자에게 널리 공지되어 있다.

본원에서 사용되는 용어 "치료 효과량"은 개인에 있어서 질환의 증상을 감소시키기 위해 요구되는 양을 의미한다. 투여량은 각각의 특정한 경우에서 개별 요건에 맞춰 조정될 것이다. 해당 투여량은 많은 인자, 예컨대 치료될 질환의 경중, 환자의 연령 및 일반적 건강 상태, 환자가 치료받고 있는 다른 약제, 투여 경로 및 형태, 및 관련 의료진의 선호도 및 경험에 따라 광범위한 한계 내에서 다양할 수 있다. 경구 투여의 경우, 1일당 약 0.01 내지 약 1000 mg/체중 kg의 일일 투여량이 단독 요법 및/또는 조합 요법에서 적당하여야 한다. 바람직한 일일 투여량은 1일당 약 0.1 내지 약 500 mg/체중 kg이고, 보다 바람직하게는 0.1 내지 약 100 mg/체중 kg이고, 가장 바람직하게는 1.0 내지 약 10 mg/체중 kg이다. 따라서, 70 kg의 성인에게 투여하기 위해, 투여량 범위는 1일당 약 7 mg 내지 0.7 g이 된다. 일일 투여량은 단일 투여로, 또는 전형적으로 1일당 1 내지 5회 투여의 분할 투여로 투여될 수 있다. 일반적으로, 치료는 화합물의 최적 투여량보다 더 적은, 소량의 투여량으로 개시된다. 이후, 개별 환자에 대한 최적 효과에 도달할 때까지, 투여량은 조금씩 증가된다. 본원에 기재된 질환을 치료하는 당업자는, 과도한 실험 없이도, 개인의 지식, 경험 및 본원의 개시 내용을 바탕으로, 주어진 질환 및 환자에 대한 본 발명의 화합물의 치료 효과량을 가늠할 수 있을 것이다.

약학 제제는 바람직하게는 단위 투여 형태이다. 이러한 형태에서, 제제는 적당량의 활성 성분을 포함하는 단위 투여량으로 분할되어 있다. 단위 투여 형태는 개별적 분량의 제제를 함유하는 포장된 제제, 예컨대 포장된 정제, 캡슐, 및 바이알 또는 앰플 내의 분말일 수 있다. 또한, 단위 투여 형태는 캡슐, 정제, 샤쉐 또는 로젠지 자체일 수 있거나, 적당한 개수의 포장된 형태의 어떤 것일 수 있다.

징후 및 치료 방법

화학식 I의 화합물은 브루톤 티로신 키나아제(BTK)를 억제한다. 상류 키나아제에 의한 BTK의 활성화는 포스포리파아제-Cγ의 활성화를 유발하여 전-염증성 매개 물질의 방출을 자극한다. 화학식 I의 화합물은 관절염 및 다른 항-염증성 및 항-자가면역 질환의 치료에 유용하다. 따라서, 화학식 I에 따른 화합물은 관절염의 치료에 유용하다. 화학식 I의 화합물은 세포 내 BTK를 억제하고 B-세포 발달을 조절하는 데 유용하다. 본 발명은 또한 화학식 I의 화합물을 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 함께 함유하는 약학 조성물을 포함한다.

본원에 기재된 화합물은 키나아제 억제제, 특히 BTK 억제제이다. 이들 억제제는 포유동물에서, BTK 억제 및/또는 B 세포 증식의 억제에 반응하는 질환을 비롯한, 키나아제 억제에 반응하는 하나 이상의 질환을 치료하는데 유용할 수 있다. 임의의 특정한 이론에 구속되고자 하지 않으면서, 본 발명의 화합물과 BTK의 상호작용은 BTK 활성의 억제를 야기하고, 이에 따라 상기 화합물의 약학적 효용을 초래하는 것으로 여겨진다. 따라서, 본 발명은 본원에 제공된 하나 이상의 화학적 물질의 치료 효과량을 상기 질환을 가진 포유 동물에 투여함을 포함하는, BTK 활성의 억제 및/또는 B 세포 증식의 억제에 반응하는 질환을 가지는 포유 동물, 예를 들면 인간의 치료 방법을 포함한다. 유효한 농도는 실험적으로, 예컨대 화합물의 혈중 농도를 분석하거나, 이론적으로, 생체이용률을 계산함으로써 알아낼 수 있다. BTK 이외에 영향을 받을 수 있는 다른 키나아제는 다른 티로신 키나아제 및 세린/트레오닌 키나아제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

키나아제는 기본적인 세포 과정, 예컨대 증식, 분화 및 사멸(세포자멸)을 제어하는 신호전달 경로에서 주목할 만한 역할을 한다. 비정상적인 키나아제 활성은 다양한 암, 자가면역 및/또는 염증성 질환, 및 급성 염증 반응을 포함하는, 광범위한 질환에 연관되어 있다. 주요한 세포 신호전달 경로에서의 키나아제의 광범위한 역할은 신호전달 경로 및 키나아제를 표적화하는 신규한 약물을 확인할 수 있는 중요한 기회를 제공한다.

일 실시양태는 BTK 활성 및/또는 B 세포 증식의 억제에 반응하는 자가면역 및/또는 염증성 질환, 또는 급성 염증성 반응을 갖는 환자의 치료 방법을 포함한다.

본 발명에 따른 화합물 및 조성물을 사용하여 영향을 받을 수 있는 자가면역 및/또는 염증성 질환은 건선, 알레르기, 크론병, 과민성 대장 증후군, 쇼그렌병(Sjogren's disease), 조직 이식 거부(tissue graft rejection) 및 이식된 장기의 초급성 거부 반응, 천식, 전신 홍반성 루푸스(및 관련된 사구체신염), 피부근염, 다발성 경화증, 경피증, 혈관염(ANCA-관련된 및 다른 맥관염), 자가면역 용혈성 및 혈소판 감소 상태, 굿패스쳐 증후군(Goodpasture's syndrome)(및 관련된 사구체신염 및 폐출혈), 죽상동맥경화증, 류마티스 관절염, 만성 특발성 혈소판감소성 자반증(ITP), 애디슨병, 파킨슨병, 알츠하이머병, 당뇨병, 패혈성 쇼크(septic shock) 및 중증 근무력증을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본원에 제공된 하나 이상의 화학적 개체를 항염증제와 조합하여 투여하는 치료 방법이 본원에 포함된다. 항염증제는 NSAID, 비-특이적 및 COX-2 특이적 사이클로옥스게나아제(cyclooxgenase) 효소 억제제, 금 화합물, 코르티코스테로이드, 메토트렉세이트, 종양 괴사 인자 수용체(TNF) 길항제, 면역억제제 및 메토트렉세이트를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

NSAID의 예는 이부프로펜, 플루르비프로펜, 나프록센 및 나프록센 나트륨, 디클로페낙, 디클로페낙 나트륨 및 미소프로스톨의 조합물, 술린닥, 옥사프로진, 디플루니살, 피록시캄, 인도메타신, 에토돌락, 페노프로펜 칼슘, 케토프로펜, 나트륨 나부메톤, 술파살라진, 톨메틴 나트륨 및 하이드록시클로로퀸을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. NSAID의 예는 또한 COX-2 특이적 억제제, 예컨대 셀레콕시브, 발데콕시브, 루미라콕시브 및/또는 에토리콕시브를 포함한다.

일부 실시양태에서, 항염증제는 살리실레이트이다. 살리실레이트는 아세틸살리실산 또는 아스피린, 나트륨 살리실레이트 및 콜린 및 마그네슘 살리실레이트를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

항염증제는 또한 코르티코스테로이드일 수 있다. 예를 들면, 코르티코스테로이드는 코르티손, 덱사메타손, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론, 프레드니솔론 나트륨 포스페이트 또는 프레드니손일 수 있다.

추가 실시양태에서, 항염증제는 금 화합물, 예컨대 금 나트륨 티오말레이트 또는 오라노핀이다.

본 발명은 또한 항염증제가 대사 억제제, 예컨대 다이하이드로폴레이트 환원효소 억제제(예를 들면, 메토트렉세이트) 또는 다이하이드로오로테이트 탈수소효소 억제제(예를 들면, 레플루노미드)인 실시양태를 포함한다.

본 발명의 다른 실시양태는 하나 이상의 항염증성 화합물이 항-C5 단일클론 항체(예를 들면, 에쿨리주맙 또는 펙셀리주맙), 항-TNF 알파 단일클론 항체인 TNF 길항제, 예컨대 엔타네르셉트, 또는 인플릭시맙과 조합하여 존재한다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 하나 이상의 활성제가 면역억제제 화합물, 예컨대 메토트렉세이트, 레플루노마이드, 사이클로스포린, 타크로리무스, 아자티오프린 및 마이코페놀레이트 모페틸로부터 선택되는 면역억제제 화합물과 조합하여 존재한다.

BTK를 발현하는 B 세포 및 B 세포 전구체는 B 세포 림프종, 림프종(호지킨 및 비-호지킨 림프종 포함), 모발 세포성 림프종, 다발성 골수종, 만성 및 급성 골수성 백혈병, 및 만성 및 급성 림프성 백혈병을 포함하나 이에 한정되지 않는, B 세포 악성 종양의 병증에 연루되어 있다.

BTK는 B 계통 림프구 세포에서 Fas/APO-1(CD-95) 사멸 유도 신호전달 복합체(DISC)의 억제제인 것으로 나타났다. 백혈병/림프종 세포의 운명은 DISC에 의해 활성화된 카스파아제(caspase)의 전-세포자멸 길항(opposing proapoptotic) 효과와, BTK 및/또는 이의 기질을 수반한 상류 항-세포자멸 조절 기전 사이의 균형에 달려 있다(문헌[Vassilev et al., J. Biol. Chem. 1998, 274, 1646-1656]).

또한, BTK 억제제가 화학감작제로서 유용하고, 따라서 다른 화학요법 약물, 특히, 세포자멸을 유도하는 약물과 조합하여 유용한 것으로 밝혀졌다. 화학감작 BTK 억제제와 병용될 수 있는 다른 화학요법 약물의 예는 토포이소머라아제 I 억제제(캠토테신 또는 토포테칸), 토포이소머라아제 II 억제제(예를 들면, 다우노마이신 및 에토포시드), 알킬화제(예를 들면, 사이클로포스파미드, 멜팔란 및 BCNU), 튜불린 유도제(예를 들면, 탁솔 및 빈블라스틴) 및 생물 제제(예를 들면, 항체, 예컨대 항 CD20 항체, IDEC 8, 면역독소 및 사이토카인)를 포함한다.

BTK 활성은 또한 9번 및 22번 염색체 일부의 전좌로부터 생성된 bcr - abl 융합 유전자를 발현하는 일부 백혈병과 관련되어 있다. 이러한 비정상성은 만성 골수성 백혈병에서 통상적으로 관찰된다. BTK는 bcr - abl 세포에서 세포자멸을 피하는 하류 생존 신호를 개시하는 bcr - abl 키나아제에 의해 구조적으로 인산화된다(문헌 [N. Feldhahn et al. J. Exp. Med. 2005 201(11):1837-1852]).

치료 방법

본원은 화학식 I의 화합물을 치료 효과량으로 이를 필요로 하는 환자에게 투여함을 포함하는 염증성 질환의 치료 방법을 제공한다.

본원은 화학식 I의 BTK 억제제 화합물을 치료 효과량으로 이를 필요로 하는 환자에게 투여함을 포함하는 염증성 및/또는 자가면역 질환의 치료 방법을 제공한다.

본원은 화학식 I의 BTK 억제제 화합물을 치료 효과량으로 이를 필요로 하는 환자에게 투여함을 포함하는 관절염의 치료 방법을 제공한다.

본원은 화학식 I의 BTK 억제제 화합물을 치료 효과량으로 이를 필요로 하는 환자에게 투여함을 포함하는 천식의 치료 방법을 제공한다.

본원은 화학식 I의 BTK 억제제 화합물을 치료 효과량으로 이를 필요로 하는 환자에게 투여함을 포함하는 B-세포 증식의 억제 방법을 제공한다.

본원은 화학식 I의 임의의 하나의 BTK 억제제 화합물을 투여함을 포함하는 BTK 활성의 억제 방법을 제공하고, 이때 BTK 억제제 화합물은 BTK 활성의 시험관내 생화학적 분석에서 50 μmol 이하의 IC₅₀을 나타낸다.

상기 방법의 하나의 변형에서, BTK 억제제 화합물은 BTK 활성의 시험관내 생화학적 분석에서 100 nmol 이하의 IC₅₀을 나타낸다.

상기 방법의 또 다른 변형에서, 상기 화합물은 BTK 활성의 시험관내 생화학적 분석에서 10 nmol 이하의 IC₅₀을 나타낸다.

본원은 화학식 I의 BTK 억제제 화합물과 조합하여 항-염증성 화합물을 치료 효과량으로 이를 필요로 하는 환자에게 공-투여함을 포함하는 염증성 질환의 치료 방법을 제공한다.

본원은 화학식 I의 BTK 억제제 화합물과 조합하여 항-염증성 화합물을 치료 효과량으로 이를 필요로 하는 환자에게 공-투여함을 포함하는 관절염의 치료 방법을 제공한다.

본원은 화학식 I의 BTK 억제제 화합물을 치료 효과량으로 이를 필요로 하는 환자에게 투여함으로써 림프종 또는 BCR-ABL1⁺ 백혈병을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 치료 활성 물질로서 사용하기 위한 상기한 바와 같은 화합물의 용도를 제공한다.

본 발명은 염증성 및/또는 자가면역 질환의 치료에 있어서 상기한 바와 같은 화합물의 용도를 제공한다.

본 발명은 염증성 및/또는 자가면역 질환의 치료용 약제의 제조를 위한 상기한 바와 같은 화합물의 용도를 제공한다.

본 발명은 염증성 및/또는 자가면역 질환의 치료에 사용하기 위한 상기한 바와 같은 화합물을 제공한다.

본 발명은 류마티스 관절염의 치료에 사용하기 위한 상기한 바와 같은 화합물을 제공한다.

본 발명은 천식의 치료에 사용하기 위한 상기한 바와 같은 화합물을 제공한다.

본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 발명을 제공한다.

실시예

일반적인 약어

통상적으로 사용되는 약어는 다음을 포함한다: 아세틸(Ac), 아조-비스-이소부티릴니트릴(AIBN), 기압(Atm), 9-보라바이사이클로[3.3.1]노난(9-BBN 또는 BBN), 2,2'-비스(다이페닐포스피노)-1,1'-바이나프틸(BINAP), t-부톡시카본일(Boc), 다이-t-부틸 파이로카보네이트 또는 boc 무수물(BOC₂O), 벤질(Bn), 부틸(Bu), 화학 초록 등록 번호(CASRN), 벤질옥시카본일(CBZ 또는 Z), 카본일 다이이미다졸(CDI), 1,4-다이아자바이사이클로[2.2.2]옥탄(DABCO), 다이에틸아미노황 트라이플루오리드(DAST), 다이벤질리덴아세톤(dba), 1,5-다이아자바이사이클로[4.3.0]논-5-엔(DBN), 1,8-다이아자바이사이클로[5.4.0]운데크-7-엔(DBU), N,N'-다이사이클로헥실카보다이이미드(DCC), 1,2-다이클로로에탄(DCE), 다이클로로메탄(DCM), 2,3-다이클로로-5,6-다이시아노-1,4-벤조퀴논(DDQ), 다이에틸 아조다이카복실레이트(DEAD), 다이-이소-프로필아조다이카복실레이트(DIAD), 다이-이소-부틸알루미늄하이드라이드(DIBAL 또는 DIBAL-H), 다이-이소-프로필에틸아민(DIPEA), N,N-다이메틸 아세트아미드(DMA), 4-N,N-다이메틸아미노피리딘(DMAP), N,N-다이메틸포름아미드(DMF), 다이메틸 설폭사이드(DMSO), 1,1'-비스-(다이페닐포스피노)에탄(dppe), 1,1'-비스-(다이페닐포스피노)페로센(dppf), 1-(3-다이메틸아미노프로필)-3-에틸카보다이이미드 하이드로클로라이드(EDCI), 2-에톡시-1-에톡시카본일-1,2-다이하이드로퀴놀린(EEDQ), 에틸(Et), 에틸 아세테이트(EtOAc), 에탄올(EtOH), 2-에톡시-2H-퀴놀린-1-카복실산 에틸 에스터(EEDQ), 다이에틸 에터(Et₂O), 에틸 이소프로필 에터(EtOiPr), O-(7-아자벤조트라이아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 아세트산(HATU), 아세트산(HOAc), 1-N-하이드록시벤조트라이아졸(HOBt), 고압 액체 크로마토그래피(HPLC), 이소-프로판올(IPA), 이소프로필마그네슘 클로라이드(iPrMgCl), 헥사메틸 다이실라잔(HMDS), 액체 크로마토그래피 질량 분광법(LCMS), 리튬 헥사메틸 다이실라잔(LiHMDS), 메타-클로로퍼옥시벤조산(m-CPBA), 메탄올(MeOH), 융점(mp), MeSO₂-(메실 또는 Ms), 메틸(Me), 아세토니트릴(MeCN), m-클로로과벤조산(MCPBA), 질량 스펙트럼(ms), 메틸 t-부틸 에터(MTBE), 메틸 테트라하이드로푸란(MeTHF), N-브로모숙신이미드(NBS), n-부틸리튬(nBuLi), N-카복시무수물(NCA), N-클로로숙신이미드(NCS), N-메틸모폴린(NMM), N-메틸피롤리돈(NMP), 피리디늄 클로로크로메이트(PCC), 다이클로로-((비스-다이페닐포스피노)페로센일) 팔라듐(II)(Pd(dppf)Cl₂), 팔라듐(II) 아세테이트(Pd(OAc)₂), 트리스(다이벤질리덴아세톤)다이팔라듐(0)(Pd₂(dba)₃), 피리디늄 다이크로메이트(PDC), 페닐(Ph), 프로필(Pr), 이소-프로필(i-Pr), 제곱인치당 파운드(psi), 피리딘(pyr), 1,2,3,4,5-펜타페닐-1'-(다이-t-부틸포스피노)페로센(Q-Phos), 실온(상온, rt 또는 RT), sec-부틸리튬(sBuLi), t-부틸다이메틸실릴 또는 t-BuMe₂Si(TBDMS), 테트라-n-부틸암모늄 플루오리드(TBAF), 트라이에틸아민(TEA 또는 Et₃N), 2,2,6,6-테트라메틸피페리딘 1-옥실(TEMPO), 트라이메틸실릴에톡시메틸(SEM), 트라이플레이트 또는 CF₃SO₂-(Tf), 트라이플루오로아세트산(TFA), 1,1'-비스-2,2,6,6-테트라메틸헵탄-2,6-다이온(TMHD), O-벤조트라이아졸-1-일-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트(TBTU), 박막 크로마토그래피(TLC), 테트라하이드로푸란(THF), 트라이메틸실릴 또는 Me₃Si(TMS), p-톨루엔설폰산 일수화물(TsOH 또는 pTsOH), 4-Me-C₆H₄SO₂- 또는 토실(Ts) 및 N-우레탄-N-카복시무수물(UNCA). 접두사 노말(n-), 이소(i-), 2급(sec-), 3급(t-) 및 네오를 포함하는 통상적인 명칭은, 알킬 잔기와 함께 사용되는 경우, 그의 통상적인 의미를 갖는다(문헌 [J. Rigaudy and D. P. Klesney, Nomenclature in Organic Chemistry, IUPAC 1979 Pergamon Press, Oxford]).

일반적 조건

본 발명의 화합물은 당업자에게 공지된 일반적인 합성 기법과 과정을 이용하여 시판되는 출발 물질로 시작하여 제조될 수 있다. 이러한 화합물의 제조에 적합한 반응식을 아래에 간략하게 기재하였다.　 추가적인 예시는 구체적인 실시예에서 찾을 수 있다.

구체적인 약어

일반적인 실험의 상세한 설명

시약을 알드리치(Aldrich), 오크우드(Oakwood), 매트릭스(Matrix) 또는 다른 공급처로부터 구입하고 추가 정제 없이 사용하였다. 가열을 위해 마이크로파 조사를 사용하는 반응을 퍼스날 케미스트리 엠리스 옵티마이저 시스템(Personal Chemistry Emrys Optimizer System) 또는 CEM 디스커버리 시스템을 사용하여 수행하였다. 다중-mg 내지 다중-g 규모의 정제를 당업자에게 공지된 방법, 예컨대 실리카 겔 플래시 컬럼의 용리에 의해 수행하고, 일부 경우에 콤비플래시(CombiFlash) 시스템으로 용리된 미리포장된 다중-g 실리카 겔 컬럼[레디셉(RediSep)] 배치를 사용하여 제조용 플래시 컬럼 정제를 또한 수행하였다. 바이오타지(Biotage: 상표) 및 ISCO(상표)는 또한 중간체의 정제를 위해 본 발명에 사용될 수 있는 플래시 컬럼 장치이다.

화합물의 동일성 및 순도를 판단하기 위한 목적으로, LCMS(액체 크로마토그래피/질량 분광법) 스펙트럼을 하기 시스템을 사용하여 기록하였다. 질량 스펙트럼을 측정하기 위해, 시스템은 마이크로매스 플랫폼(Micromass Platform) II 분광계로 이루어진다: 양성 모드의 ES 이온화(질량 범위: 150 내지 1200). 동시 크로마토그래피 분리를 하기 HPLC 시스템으로 수행하였다: ES 인더스트리즈 크로메가본드(Industries Chromegabond) WR C-18 3u 120 Å(3.2 x 30 mm) 컬럼 카트리지; 이동상 A: 물(0.02% TFA) 및 상 B: 아세토니트릴(0.02% TFA); 3분 이내에 10% B 내지 90% B의 구배; 1분의 평형 시간; 2 mL/분의 유속.

또한 화학식 1의 많은 화합물을 당업자에게 널리 공지된 방법을 사용하여 역상 HPLC로 정제하였다. 일부 경우에, 시마주(Shimadzu) 제조용 HPLC 시스템 및 립(Leap) 자동주입기에 부착된 길슨(Gilson) 215 수집기를 제어하는 PE Sciex 150 EX Mass Spec를 사용하여 제조용 HPLC 정제를 수행하였다. 양성 이온 검출시 LCMS 검출을 사용하여 화합물을 용리 스트림으로부터 수집하였다: C-18 컬럼(20 mL/분에서 용리하는 2.0 X 10 cm)으로부터 화합물의 용리를, 10분간에 걸쳐서 용매(A) 0.05% TFA/H₂O 및 용매(B) 0.035% TFA/아세토니트릴의 적절한 선형 구배 방식을 사용하여 수행하였다. HPLC 시스템에 주입하기 위해, 조질 샘플을 메탄올, 아세토니트릴 및 DMSO의 혼합물에 용해하였다.

브루커(Bruker) 400 MHz NMR 분광계를 사용하여 ¹H-NMR에 의해 화합물을 특징규명하였다.

본 발명의 화합물은 공지된 기법에 따라 합성될 수 있다. 하기 실시예 및 참조문헌은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공된다. 그러나, 실시예는 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않고, 본 발명의 실제 범주는 첨부된 청구범위에 제시된다. 실시예에서 최종 생성물의 명칭은 아이시스 명명법(Isis AutoNom) 2000을 사용하여 생성된다.

제조 실시예

DCM(168 mL) 중 5-플루오로-인단-1-온(15 g, 104.83 mmol)의 교반된 용액에 메스산(120 mL)을 0℃에서 첨가하였다. 이 투명한 용액에 나트륨 아지드(9.5 g, 146.76 mmol)를 -10℃에서 40분간에 걸쳐서 나눠서 첨가하였다. 혼합물을 2시간 동안 -10℃에서 교반하고, 20% 수성 NaOH 용액을 0℃에서 적가하고, 15분 동안 교반하였다(TLC, 실리카; 헥산 중 50% 에틸 아세테이트, R_f = 0.3). DCM을 분리한 후, 수성 부분을 DCM(2 x 50 mL)으로 추출하고, 유기 부분을 건조하고 농축하고, 조질 생성물을 정상 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔 100 내지 200, 생성물을 헥산 중 60% 에틸 아세테이트로 용리함)로 정제하여 백색 고체로서 6-플루오로-3,4-다이하이드로-2H-이소퀴놀린-1-온(12.0 g, 69.31%)을 수득하였다. LCMS: 166.0(M+H).

무수 THF(30 mL) 중 6-플루오로-3,4-다이하이드로-2H-이소퀴놀린-1-온(2.5 g, 15.14 mmol)의 교반된 용액에 이소부티로니트릴(3)(5.4 mL, 60.54 mmol)을 첨가하였다. 이 용액에 톨루엔(104 ml, 52 mmol) 중 0.5 M KHMDS를 0℃에서 서서히 첨가하였고, 이는 황색을 띤 점성 액체로 변하였다. 혼합물을 70℃에서 4시간 동안 가열하였다(LCMS로 모니터함). 실온으로 냉각하여 이소부티로니트릴(3 mL, 33.42 mmol)의 두번째 로트를 첨가하고, 다시 70℃로 가열하고 16시간 동안 교반하였다(TLC, 실리카; 헥산 중 50% 에틸 아세테이트, R_f = 0.25). 반응 혼합물을 냉각하고, 빙수(50 mL)로 급랭하고 에틸 아세테이트(3 x 50 mL)로 추출하였다. 합한 유기 부분을 농축하고, 수득된 조질 생성물을 콤비플래시 컬럼(용리액으로서 헥산 중 40 내지 60% 에틸 아세테이트를 사용함)으로 정제하여 백색 고체로서 2-메틸-2-(1-옥소-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-6-일)-프로피오니트릴(2.5 g, 77.09%)을 수득하였다. LCMS: 215.2(M+H).

무수 다이옥산(50 mL) 중 2-메틸-2-(1-옥소-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-6-일)-프로피오니트릴(2.5 g, 11.68 mmol)의 교반된 용액에 2,6-다이프로모-벤즈알데하이드(4.6 g, 17.52 mmol) 및 Cs₂CO₃(7.6 g, 23.36 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 아르곤으로 탈기하고, Pd(dba)₂(134 mg, 0.234 mmol) 및 Xantphos(206 mg, 0.35 mmol)를 첨가하고 다시 탈기하였다. 혼합물을 100℃에서 3시간 동안 가열하고, 실온으로 냉각하고, 셀라이트의 패드를 통해 여과하고, 에틸 아세테이트(3 x 50 mL)로 세척하였다. 혼합물을 농축하고 콤비플래시 컬럼(헥산 중 40% 에틸 아세테이트로 용리함)으로 정제하여 연갈색 고체로서 2-[2-(3-브로모-2-포름일-페닐)-1-옥소-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-6-일]-2-메틸-프로피오니트릴(2.5 g, 53.87%)을 수득하였다. LCMS: 397.2(M+H).

다이옥산(35 mL) 중 6-클로로-2-메틸-4-[5-(모폴린-4-카본일)-피리딘-2-일아미노]-2H-피리다진-3-온(1.5 g, 4.29 mmol)(US 2012/40949 A1), 비스(피나콜라토)다이보론(1.4 g, 5.57 mmol) 및 KOAc(무수)(1.3 g, 12.86 mmol)의 반응 혼합물을 아르곤으로 탈기하고, X-Phos(307 mg, 0.64 mmol) 및 Pd(OAc)₂(96 mg, 0.43 mmol)를 첨가하고, 98℃에서 15분 동안 교반하였다. 갈색 반응 혼합물은 녹색을 띤 갈색 용액으로 변하였다(LCMS로 모니터함). 플라스크를 가열 욕 밖으로 들어올리고, 냉각하고, 아르곤하에 다이옥산-물(1:1; 90 mL) 및 n-BuOH(10.5 mL) 중 2-[2-(3-브로모-2-포름일-페닐)-1-옥소-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-6-일]-2-메틸-프로피오니트릴(1.53 g, 3.86 mmol) 및 K₂CO₃(2.37 g, 17.15 mmol)의 탈기된 현탁액을 함유하는 두번째 플라스크로 셀라이트의 단 플러그를 통해 여과하였다. 반응 혼합물을 아르곤으로 탈기하고, 트라이사이클로헥실포스핀(359 mg, 1.28 mmol) 및 Pd(dba)₂(369 mg, 0.642 mmol)를 첨가하고, 다시 탈기하고, 110℃에서 1시간 동안 가열하였다. 반응 생성물을 실온으로 냉각하고, 셀라이트의 플러그를 통해 여과하고, 에틸 아세테이트(3 x 100 mL)로 세척하였다. 여액을 농축하고, 합한 조질 생성물을 정상 컬럼 크로마토그래피(정상 실리카 겔 100 내지 200 메시, DCM 중 2 내지 2.5% MeOH로 용리됨)로 정제하여 연갈색 고체로서 2-[2-(2-포름일-3-{1-메틸-5-[5-(모폴린-4-카본일)-피리딘-2-일아미노]-6-옥소-1,6-다이하이드로-이리다진-3-일}-페닐)-1-옥소-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-6-일]-2-메틸-프로피오니트릴(1.5 g, 55.56%)을 수득하였다. LCMS: 632.6(M+H).

DCM(55 mL) 및 MeOH(36 mL) 중 2-[2-(2-포름일-3-{1-메틸-5-[5-(모폴린-4-카본일)-피리딘-2-일아미노]-6-옥소-1,6-다이하이드로-이리다진-3-일}-페닐)-1-옥소-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-6-일]-2-메틸-프로피오니트릴(3 g, 4.75 mmol)의 교반된 용액에 물(3.6 mL) 중 나트륨 보로하이드리드(360 mg, 9.51 mmol)의 용액을 0℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 20분 동안 동일한 온도에서 교반하였다. 반응 생성물을 TLC(실리카, UV/DNP, DCM 중 5% MeOH, Rf=0.35)로 모니터하였다. 반응 생성물을 얼음으로 급랭하고, 유기 부분을 분리하고, 건조하고, 농축하였다. 조질 생성물을 정상 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(실리카, 100 내지 200, DCM 중 2 내지 2.5% MeOH로 용리됨)로 정제하였다. 정제된 물질을 DCM 및 헥산으로 재결정화하여 백색 고체로서 2-[2-(2-하이드록시메틸-3-{1-메틸-5-[5-(모폴린-4-카본일)-피리딘-2-일아미노]-6-옥소-1,6-다이하이드로-피리다진-3-일}-페닐)-1-옥소-1,2,3,4-테트라하이드로-이소퀴놀린-6-일]-2-메틸-프로피오니트릴(2.1 g, 69.7%)을 수득하였다. LCMS: 634.6(M+H).

5 L 3-목 플라스크 내에서, 실온에서 1-브로모-3,5-다이플루오로벤젠(300 g, 1.55 mol, 당량 1.00), 이소부티로니트릴(215 g, 3.11 mol, 당량 2) 및 THF(1.2 L)를 충전하였다. 1 M LiHMDS(1.71 L, 1.71 mol, 당량 1.1) 용액을 15 내지 22℃의 온도에서 냉수욕하에 2.5시간 동안 적가하였다. 2.5시간 후, HPLC(9% SM 및 12% 다이알킬화됨)에 의해 91% 전환하였다. 추가 0.1 당량의 LiHMDS 용액을 첨가하였다. 97%(3% SM 및 21% 다이알킬화됨) 전환될 때까지 밤새 교반하였다. 반응 생성물을 6 N HCl로 pH 약 3 내지 4까지 급랭하였다. 톨루엔(2x)으로 추출한 후, 합한 유기물을 농축하고, 더 많은 톨루엔을 사용하여 물 및 또한 과잉 이소부티로니트릴을 제거하였다. 다이알킬화된 부산물은 농축 동안 빠져나오고, n-헵탄(약 600 mL)을 첨가한 후, 밤새 실온에서 교반하였다. 용액을 여과하여 고체로서 나머지 부산물을 제거하고, 헵탄으로 세척하였다. 여액을 농축하여 90% HPLC 순도(SM이 없고 9% 다이알킬화됨)를 갖는 2-(3-브로모-5-플루오로페닐)-2-메틸프로판니트릴(337.9 g, 1.26 mol, 80.8% 수율)을 수득하였다.

2-(3-브로모-5-플루오로페닐)-2-메틸프로판니트릴(172 g, 710 mmol, 당량 1.00)을 THF(1.03 L)에 용해한 후, 용액을 -75℃로 냉각하였다. 2 M LDA(373 ml, 746 mmol, 당량 1.05)를 용액에 적가하고, -70℃ 미만으로 온도를 유지하였다. 추가 2시간 동안 교반하고, 분취액을 드라이아이스로 시험하고, 완전 전환하였다. 또 다른 3 L 드라이아이스 및 THF를 첨가하였다. 드라이아이스로 역 급랭하고, 30분 동안 전체 음이온 용액을 옮기고, -50℃ 미만(-60 내지 약 -50℃)으로 유지하였다. 추가 1시간 동안 교반한 후 실온으로 가온하였다. 물을 첨가하고 6 N HCl 용액으로 산성화하였다(pH 3 내지 4).

상을 분리하고 MTBE 및 DCM으로 추출하였다. 합한 유기물을 농축하였다. 오일로서 2-브로모-4-(2-시아노프로판-2-일)-6-플루오로벤조산(246 g, 765 mmol, 108% 수율)(약 89% HPLC 순도)을 수득하였다. 추가 정제하지 않고 다음 반응으로 넘어갔다.

CDI(3.33 g, 20.6 mmol, 당량 1.4)를 2-브로모-4-(2-시아노프로판-2-일)-6-플루오로벤조산(4.2 g, 14.7 mmol, 당량 1.00)의 THF(42 ml) 용액에 실온에서 나눠서 첨가하였다. 3시간 동안 교반하였다. 암모늄 하이드록사이드(17.1 g, 19.1 ml, 147 mmol, 당량 10)를 혼합물에 첨가하였다. 2시간 동안 교반하였다. 20% K₂CO₃ 용액으로 세척하여 미반응된 출발 물질을 제거한 후, 1 N HCl로 세척하였다. EtOAc/헵탄으로부터 결정화하여 2-브로모-4-(2-시아노프로판-2-일)-6-플루오로벤즈아미드(3.4 g, 11.9 mmol, 81.2% 수율)를 수득하였다.

다이옥산-물(7:1; 16 mL) 중 2-브로모-4(시아노-다이메틸-메틸)-6-플루오로-벤즈아미드(2 g, 7.018 mmol) 및 2-((E)-2-에톡시-비닐)-4,4,5,5-테트라메틸-[1,3,2]다이옥사보롤란(1.783 mL, 8.421 mmol)의 교반된 용액에 K₂CO₃(1.94 g, 14.04 mmol)을 첨가한 후 트라이사이클로헥실포스핀(157 mg, 0.561 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 질소로 잘 탈기하였다. 이 반응 혼합물에 Pd(dba)₂(161 mg, 0.281 mmol)를 첨가하고, 다시 질소로 탈기하고 90℃에서 16시간 동안 가열하고, 6 N HCl(6 mL)을 첨가하고, 40℃로 5시간 가열하였다(실리카 TLC; 헥산 중 50% 에틸 아세테이트, Rf = 0.3). 반응 혼합물로부터 다이옥산을 감압하에 제거하고, 수득된 조질 잔사를 헥산 중 10% EtOAc로 세척하여 정제하여 갈색 고체로서 2-(8-플루오로-1-옥소-1,2-다이하이드로-이소퀴놀린-6-일)-2-메틸-프로피오니트릴(1.26 g, 77.98%)을 수득하였다. LCMS: 229.2(M-H).

DMA(28 mL) 중 2-(8-플루오로-1-옥소-1,2-다이하이드로-이소퀴놀린-6-일)-2-메틸-프로피오니트릴(1.26 g, 5.478 mmol)의 교반된 용액에 2-브로모-6-플루오로-벤즈알데하이드(1.66 g, 8.217 mmol) 및 칼륨 카보네이트(1.512 g, 10.957 mmol)를 첨가한 후, 테트라에틸 암모늄 클로라이드(118 mg, 0.712 mmol)를 아르곤하에 첨가하였다. 반응 혼합물을 78℃에서 24시간 동안 가열하고(실리카 TLC; 헥산 중 50% 에틸 아세테이트, Rf = 0.50), 물을 첨가하고, DCM(2 x 90 mL)으로 추출하였다. 합한 추출물을 농축하여 조질 생성물을 수득하고, 이를 컬럼 크로마토그래피(정상 실리카 겔 100 내지 200 메시; 용리액으로서 헥산 중 25% EtOAc를 사용함)로 정제하여 연황색 고체로서 2-[2-(3-브로모-2-포름일-페닐)-8-플루오로-1-옥소-1,2-다이하이드로-이소퀴놀린-6-일]-2-메틸-프로피오니트릴(840 mg, 37.11%)을 수득하였다. LC/MC: 412.8(M+), 414.8(M+2).

다이옥산(50 mL) 중 6-클로로-4-[5-(2-하이드록시-1,1-다이메틸-에톡시)-피리딘-2-일아미노]-2-메틸-2H-피리다진-3-온(1 g, 3.08 mmol)(WO 2012/020008 A1), 비스(피나콜라토)다이보론(1.06 g, 4.00 mmol) 및 KOAc(무수)(907 mg, 9.23 mmol)의 반응 혼합물을 아르곤하에 탈기하였다. X-Phos(220 mg, 0.46 mmol) 및 Pd(OAc)₂(69 mg, 0.31 mmol)를 첨가하고, 98℃에서 15분 동안 교반하였다(LCMS로 모니터함). 플라스크를 가열 욕으로부터 들어올리고, 냉각하고, 아르곤하에 2-[2-(3-브로모-2-포름일-페닐)-8-플루오로-1-옥소-1,2-다이하이드로-이소퀴놀린-6-일]-2-메틸-프로피오니트릴(1.14 g, 2.77 mmol), K₂CO₃(1.7 g, 12.31 mmol), 다이옥산(15.6 mL), 물(15 mL) 및 n-BuOH(3.7 mL)의 탈기된 현탁액이 함유된 두번째 플라스크로 셀라이트의 단 플러그를 통해 여과하였다. 반응 혼합물을 다시 아르곤으로 탈기하고, 트라이사이클로헥실포스핀(257 mg, 0.92 mmol) 및 Pd(dba)₂(264 mg, 0.46 mmol)를 불활성 대기하에 첨가하고, 반응 혼합물을 110℃에서 1시간 동안 가열하였다. 반응 생성물을 실온으로 냉각하고, 셀라이트의 플러그를 통해 여과하고, 에틸 아세테이트(3 x 100 mL)로 세척하였다. 합한 여액을 농축하고, 수득된 조질 생성물을 정상 실리카 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔 100 내지 200 메시, DCM 중 2 내지 2.5% MeOH로 용리함)로 정제하여 갈색 점착성 고체로서 2-[8-플루오로-2-(2-포름일-3-{5-[5-(2-하이드록시-1,1-다이메틸-에톡시)-피리딘-2-일아미노]-1-메틸-6-옥소-1,6-다이하이드로-피리다진-3-일}-페닐)-1-옥소-1,2-다이하이드로-이소퀴놀린-6-일]-2-메틸-프로피오니트릴(1.1 g, 57.38%, 400 mg 혼합물)을 수득하였다. LCMS: 622.2(M+H).

DCM(46.7 mL) 및 MeOH(30.8 mL) 중 2-[8-플루오로-2-(2-포름일-3-{5-[5-(2-하이드록시-1,1-다이메틸-에톡시)-피리딘-2-일아미노]-1-메틸-6-옥소-1,6-다이하이드로-피리다진-3-일}-페닐)-1-옥소-1,2-다이하이드로-이소퀴놀린-6-일]-2-메틸-프로피오니트릴(2.4 g, 3.85 mmol)의 교반된 용액에 물(3.4 mL) 중 나트륨 보로하이드리드(292 mg, 7.70 mmol)의 용액을 0℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 15분 동안 동일한 온도에서 교반하였다(실리카 TLC; DCM 중 5% MeOH, Rf = 0.4). 반응 생성물을 얼음(100 g)으로 급랭하고, 유기 부분을 DCM(200 mL)으로 희석하고, 분리하고 건조하고 농축하였다. 수득된 조질 생성물을 정상 실리카 컬럼 크로마토그래피(실리카, 100 내지 200, DCM 중 2% MeOH로 용리함)로 정제하였다. 정제된 물질을 DCM 및 에터로 재결정화하여 백색 고체로서 2-[8-플루오로-2-(3-{5-[5-(2-하이드록시-1,1-다이메틸-에톡시)-피리딘-2-일아미노]-1-메틸-6-옥소-1,6-다이하이드로-피리다진-3-일}-2-하이드록시메틸-페닐)-1-옥소-1,2-다이하이드로-이소퀴놀린-6-일]-2-메틸-프로피오니트릴(1.6 g, 66.45%)을 수득하였다. LCMS: 625.3(M+H).

ACN(80 mL) 중 6-아미노-피리딘-3-올(4 g, 36.364 mmol)의 교반된 용액에 세슘 카보네이트(47.41 g, 145.45 mmol)를 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 교반하고, 2-브로모-2-메틸-프로피온산 에틸 에스터(5.66 g, 38.18 mmol)를 첨가하고, 16시간 동안 교반하였다(실리카 TLC; 헥산 중 50% EtOAc, Rf = 0.5). 반응 생성물에 물(200 mL)을 첨가하고, 에틸 아세테이트(3 x 100 mL)로 추출하였다. 합한 추출물을 농축하고, 수득된 조질 생성물을 컬럼 크로마토그래피(정상 실리카 겔 100 내지 200 메시, 용리액으로서 헥산 중 18 내지 22% EtOAc를 사용함)로 정제하여 연황색 고체로서 2-(6-아미노-피리딘-3-일옥시)-2-메틸-프로피온산 에틸 에스터(4.4 g, 53.96%)를 수득하였다. LCMS : 224.8(M+H).

무수 다이옥산(80 mL) 중 2-(6-아미노-피리딘-3-일옥시)-2-메틸-프로피온산 에틸 에스터(2 g, 8.929 mmol) 및 4-브로모-6-클로로-2-메틸-2H-피리다진-3-온(2.588 g, 11.607 mmol)의 교반된 용액에 Cs₂CO₃(10.188 g, 31.25 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 아르곤으로 잘 탈기하고, xantphos(774 mg, 1.339 mmol) 및 Pd₂(dba)₃(654 mg, 0.714 mmol)을 아르곤 대기하에 첨가하고, 90℃에서 18시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 냉각하고, 셀라이트의 플러그를 통해 여과하고, 다이옥산(50 mL)으로 세척하였다. 합한 추출물을 농축하여 조질 생성물을 수득하고, 이를 용리액으로서 헥산 중 18% EtOAc를 사용하는 정상 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 황색 고체로서 2-[6-(6-클로로-2-메틸-3-옥소-2,3-다이하이드로-피리다진-4-일아미노)-피리딘-3-일옥시]-2-메틸-프로피온산 에틸 에스터(2.7 g, 82.44%)를 수득하였다. LCMS : 367.0(M+H).

무수 THF(25 mL) 중 2-[6-(6-클로로-2-메틸-3-옥소-2,3-다이하이드로-피리다진-4-일아미노)-피리딘-3-일옥시]-2-메틸-프로피온산 에틸 에스터(1 g, 2.73 mmol)의 교반된 용액에 LAH(3.8 mL, 3.8 mmol, THF 중 1 M 용액)를 (주사기를 통해 15 분간에 걸쳐서) -40℃에서 적가하였다. 반응 혼합물을 1시간 동안 동일한 온도에서 교반하고(실리카 TLC; 용리액으로서 헥산 중 50% EtOAc를 사용함; Rf = 0.2), 물(0.1 mL)을 첨가하여 급랭하고, 10분 동안 교반하고, 5% NaOH 용액(0.2 mL)을 첨가하고, 10분 동안 교반하고, 물(0.2 mL)을 다시 첨가하고, 10분 동안 교반하고, 투명한 유기 부분을 분리하고, 건조하고 농축하고, 조질 생성물을 정상 실리카 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔 100 내지 200 메시, 헥산 중 40 내지 50% 에틸 아세테이트로 용리함)로 정제하여 회백색 고체로서 6-클로로-4-[5-(2-하이드록시-1,1-다이메틸-에톡시)-피리딘-2-일아미노]-2-메틸-2H-피리다진-3-온(650 mg, 73.42%)을 수득하였다. LCMS: 325.2(M+H).

메탄(150 mL) 중 4-메톡시벤즈알데하이드(20 g, 147.05 mmol)의 교반된 용액에 아미노 에탄올(35.88 g, 588.23 mmol) 및 아세트산(40.58 g, 676.47 mmol)을 첨가하고, 실온에서 20시간 동안 교반하고, 반응 생성물에 나트륨 시아노보로하이드리드(5.54 g, 88.23 mmol)를 첨가하고, 실온에서 36시간 동안 교반하였다(실리카 TLC; 용리액으로서 DCM 중 5% MeOH를 사용함; Rf = 0.2). 반응 혼합물에 물(500 mL) 중 포화 NaHCO₃을 첨가하고, EtOAc(3 x 300 mL)로 추출하였다. 합한 추출물을 건조하고, 진공하에 농축하여 적색을 띤 오일로서 2-(4-메톡시-벤질아미노)-에탄올(6.0 g, 22.51%)을 수득하였다. LCMS: 182.2(M+H).

DCM(20 mL) 중 2-(4-메톡시벤질아미노)에탄올(1.0 g, 5.52 mmol)의 교반된 용액에 4-브로모-2-플루오로벤조산(1.21 g, 5.52 mmol), DIPEA(1.18 mL, 7.18 mmol) 및 HATU(2.1 g, 5.52 mmol)를 첨가하고, 실온에서 16시간 동안 교반하였다(실리카 TLC; 이동 상으로서 DCM 중 5% MeOH; Rf = 0.5). 반응 혼합물을 농축하고, 잔사에 포화 수성 NH₄Cl(50 mL)을 첨가하고, EtOAc(3 x 20 mL)로 추출하였다. 합한 유기 상을 1% 수성 HCl(30 mL) 및 물(20 mL)로 세척하였다. 분리된 유기 부분을 건조하고, 농축하여 조질 덩어리를 수득하고, 이를 플래시 크로마토그래피(실리카 겔, 헥산 중 40% EtOAc로 용리함)로 정제하여 황색 액체로서 4-브로모-2-플루오로-N-(2-하이드록시-에틸)-N-(4-메톡시-벤질)-벤즈아미드(0.5 g, 23.68%)를 수득하였다. LCMS: 382.2(M+), 384.2(M+2).

DMF(10 mL) 중 4-브로모-2-플루오로-N-(2-하이드록시에틸)-N-(4-메톡시벤질)-벤즈아미드(1.0g, 2.61 mmol)의 교반된 용액에 NaH(파라핀 오일 중 60%; 0.125 g, 3.14 mmol)를 실온에서 첨가하고, 아르곤하에 16시간 동안 교반하였다(실리카 TLC; 헥산 중 50% EtOAc; Rf = 0.5). 반응 혼합물에 수성 포화 NH₄Cl(30 mL)을 첨가하고, EtOAc(3 x 25 mL)로 추출하였다. 합한 추출물을 물(50 mL)로 세척한 후 염수(30 mL)로 세척하고, 건조하고 농축하여 조질 덩어리를 수득하고, 이를 플래시 크로마토그래피(정상 실리카 겔, 용리액으로서 핵산 중 25% EtOAc를 사용함)로 정제하여 백색 고체로서 8-브로모-4-(4-메톡시-벤질)-3,4-다이하이드로-2H-벤조[f][1,4]옥사제핀-5-온(0.6 g, 63.28%)을 수득하였다. LCMS: 362.2(M+), 264.2(M+2).

밀봉관 내에서, 8-브로모-4-(4-메톡시-벤질)-3,4-다이하이드로-2H-벤조[f][1,4]옥사제핀-5-온(2 g, 5.52 mmol), BINAP(0.206 g, 0.33 mmol) 및 Cs₂CO₃(4.67 g, 14.36 mmol)을 다이옥산(35 mL)에 취하였다. 반응 혼합물을 아르곤으로 5분 동안 탈기하고, 이소부티르알데하이드(27)(1.03 g, 14.36 mmol) 및 Pd(OAc)₂(50 mg, 0.22 mmol)를 아르곤 대기하에 첨가하고, 반응 혼합물을 80℃로 서서히 가열하고 16시간 동안 교반하였다(실리카 TLC; 40% EtOAC/헥산; Rf = 0.4). 반응 혼합물에 수성 포화 NH₄Cl(50 mL)을 실온에서 첨가하고, EtOAc(2 x 40 mL)로 추출하고, 합한 추출물을 물(50 mL)로 세척하고, 건조하고 농축하였다. 수득된 조질 생성물 혼합물을 플래시 크로마토그래피(정상 실리카 겔, 이동 상으로서 헥산 중 25% EtOAc를 사용함)로 정제하여 백색 고체로서 순수한 2-[4-(4-메톡시-벤질)-5-옥소-2,3,4,5-테트라하이드로-벤조[f][1,4]옥사제핀-8-일]-2-메틸-프로피온알데하이드(1.0 g, 51.22%)를 수득하였다. LCMS: 354.0(M+H).

TFA(66.77 mL, 866.85 mmol) 중 2-[4-(4-메톡시-벤질)-5-옥소-2,3,4,5-테트라하이드로-벤조[f][1,4]옥사제핀-8-일]-2-메틸-프로피온알데하이드(1.5 g, 4.24 mmol)의 교반된 용액을 밀봉관 내에서 취하고, 반응 혼합물을 100℃에서 1시간 동안 가열하였다(실리카 TLC; 헥산 중 60% EtOAc; Rf = 0.2). 휘발성 물질을 감압하에 제거하고, 잔사를 수성 포화 NaHCO₃으로 중성화하고, EtOAc(2 x 200 mL)로 추출하였다. 합한 추출물을 건조하고 농축하여 조질 잔사를 수득하고, 이를 플래시 크로마토그래피(정상 실리카 겔, 용리액으로서 헥산 중 60% EtOAc를 사용함)로 정제하여 백색 고체로서 2-메틸-2-(5-옥소-2,3,4,5-테트라하이드로-벤조[f][1,4]옥사제핀-8-일)-프로피온알데하이드(0.7 g, 70.6%)를 수득하였다. LCMS: 234.4(M+H).

다이옥산(15 mL) 중 2-메틸-2-(5-옥소-2,3,4,5-테트라하이드로-벤조[f][1,4]옥사제핀-8-일)-프로피온알데하이드(0.5g,2.14mmol) 및 2-브로모-6-클로로-벤즈알데하이드(30)(1.175 g, 5.36 mmol)의 교반된 용액에 Cs₂CO₃(1.74 g, 5.36 mmol)을 첨가하고, 5분 동안 아르곤으로 탈기하였다. 탈기된 반응 혼합물에, Xantphos(0.124 g, 0.215 mmol) 및 Pd(dba)₂(0.062 g, 0.107 mmol)를 아르곤하에 첨가하였다. 반응 생성물을 105℃로 밀봉된 조건에서 6시간 동안 가열한 후 16시간 동안 실온에서 교반하에 가열하였다. 반응 혼합물을 EtOAc(300 mL)로 희석하고, 물(100 mL)로 세척하였다. 유기 층을 건조하고, 진공하에 농축하였다. 수득된 조질 잔사를 플래시 크로마토그래피(정상 실리카 겔, 헥산 중 30% EtOAc)로 정제하여 회백색 고체로서 2-클로로-6-[8-(1,1-다이메틸-2-옥소-에틸)-5-옥소-2,3-다이하이드로-5H-벤조[f][1,4]옥사제핀-4-일]-벤즈알데하이드(0.45 g, 56.4%)를 수득하였다. LCMS: 372.2(M+), 374.2(M+2).

6-클로로-4-(5-메탄설폰일-피리딘-2-일아미노)-2-메틸-2H-피리다진-3-온(0.75 g, 2.38 mmol)의 교반된 용액에, 비스(피나콜라토)다이보론(1.2 g, 4.76 mmol), X-phos(0.17 g, 0.357 mmol) 및 KOAc(0.7 g, 7.14 mmol)를 무수 다이옥산(75 mL)에 취하고 진공하에 방치하고 아르곤으로 재충전하였다. 이에 팔라듐 아세테이트(0.053 g, 0.238 mmol)를 첨가하고, 플라스크를 증발시키고, 아르곤으로 재충전하였다. 혼합물을 오일 욕에서 100℃로 가열하고, 30분 동안 교반하였다(LCMS로 모니터함). 소량의 데스-Cl 물질을 관찰하였다. 80℃까지 가열하였다. 플라스크를 가열 욕에서 들어올려 계속 교반하고, 2-클로로-6-[8-(1,1-다이메틸-2-옥소-에틸)-5-옥소-2,3-다이하이드로-5H-벤조[f][1,4]옥사제핀-4-일]-벤즈알데하이드(0.883 g, 2.38 mmol), K₂CO₃(1.64 g, 11.90 mmol), 물(5 mL; 개별적으로 탈기됨), 트라이사이클로헥실포스핀(200 mg, 0.71 mmol) 및 Pd(dba)₂(205 mg, 0.36 mmol)를 첨가하였다. 플라스크를 교반하고 2시간 동안 80℃에서 가열한 후 실온으로 냉각하였다. 이를 물(100 mL)에 붓고 EtOAc(3 x 150 mL)로 추출하고, 합한 추출물을 염수(200 mL)로 세척하고, 수성 부분을 DCM(200 mL) 중 5% MeOH로 재추출하였다. 2개의 유기 추출물을 합하고, 건조하고 감압하에 농축하였다. 수득된 조질 생성물을 플래시 크로마토그래피(실리카 겔, 헥산 중 70% EtOAc)로 정제하여 회백색 고체로서 2-[8-(1,1-다이메틸-2-옥소-에틸)-5-옥소-2,3-다이하이드로-5H-벤조[f][1,4]옥사제핀-4-일]-6-[5-(5-메탄설폰일-피리딘-2-일아미노)-1-메틸-6-옥소-1,6-다이하이드로-피리다진-3-일]-벤즈알데하이드(0.55 g, 37.5%)를 수득하였다. LCMS: 616.2(M+H).

메탄(90 mL) 및 다이클로로메탄(150 mL) 중 2-[8-(1,1-다이메틸-2-옥소-에틸)-5-옥소-2,3-다이하이드로-5H-벤조[f][1,4]옥사제핀-4-일]-6-[5-(5-메탄설폰일-피리딘-2-일아미노)-1-메틸-6-옥소-1,6-다이하이드로-피리다진-3-일]-벤즈알데하이드(2.5 g, 4.065 mmol)의 교반된 용액을 빙욕에서 냉각하였다. 이에 나트륨 보로하이드리드(0.92 g, 24.39 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 10분 동안 교반하고(실리카 TLC; 용리액으로서 오직 EtOAc를 사용함; Rf = 0.2), 물(600 mL)로 희석하고, 다이클로로메탄(2 x 600 mL)으로 추출하였다. 합한 유기 층을 염수(600 mL)로 세척하고, 건조하고 진공하에 농축하였다. 수득된 잔사를 헥산 중 80% EtOAc로 세척하여 회백색 고체로서 8-(2-하이드록시-1,1-다이메틸-에틸)-4-{2-하이드록시메틸-3-[5-(5-메탄설폰일-피리딘-2-일아미노)-1-메틸-6-옥소-1,6-다이하이드로-피리다진-3-일]-페닐}-3,4-다이하이드로-2H-벤조[f][1,4]옥사제핀-5-온(2 g, 79.39%)을 수득하였다. LCMS: 620.4(M+H).

DCM(220 mL) 중 2-클로로-벤즈알데하이드(10 g, 71.42 mmol)의 용액에 O-메틸-하이드록실아민 하이드로클로라이드(35)(7.11 g, 85.71 mmol) 및 피리딘(23 mL)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 1시간 동안 실온에서 교반하였다(실리카 TLC; 헥산 중 15% EtOAc; Rf = 0.6). 반응 혼합물을 농축하고, 수득된 잔사를 용리액으로서 헥산 중 10% EtOAc를 사용하여 플래시 크로마토그래피로 정제하여 무색 오일로서 [(2-클로로페닐)메틸리덴](메톡시)아민(9 g, 74.3%)을 수득하였다. LCMS: 170.4(M+H).

밀봉관 내에서 [(2-클로로페닐)메틸리덴](메톡시)아민(5 g, 29.58 mmol)을 DCE(100 mL)에 취한 후, N-브로모숙신이미드(5.23 g, 29.58 mmol), 은 트라이플루오로아세테이트(0.65 g, 2.95 mmol), 팔라듐 아세테이트(0.66 g, 2.95 mmol) 및 아세트산(1.77 g, 29.58 mmol)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 120℃로 24시간 동안 가열하였다. 실온에서, 물(150 mL) 및 DCM(300 mL)을 첨가하고, 혼합물을 셀라이트의 패드를 통해 여과하였다. 유기 층을 분리하고, 수성 층을 다이클로로메탄(200 mL)으로 재추출하였다. 합한 유기 층을 건조하고, 농축하고, 수득된 조질 덩어리를 오직 헥산을 사용하여 플래시 크로마토그래피로 정제하여 황색 액체로서 [(2-브로모-6-클로로페닐)메틸리덴](메톡시)아민(4.0 g, 54.4%)을 수득하였다.

밀봉관 내에서, [(2-브로모-6-클로로페닐)메틸리덴](메톡시)아민(4.0 g, 16.12 mmol)을 THF-H₂O(10:1; 110 mL)에 취하였다. 반응 혼합물에 PTSA(6.12 g, 32.25 mmol)를 첨가한 후 파라 포름알데하이드(4.83 g, 161.29 mmol)를 첨가하고, 100℃로 30분 동안 가열하였다(실리카 TLC; 용리액으로서 오직 헥산을 사용함; Rf = 0.3). 반응 혼합물을 EtOAc(500 mL)로 희석하고, 물(200 mL)로 세척하였다. 유기 층을 건조하고, 진공하에 농축하였다. 수득된 조질 잔사를 용리액으로서 헥산 중 5% EtOAc를 사용하여 플래시 크로마토그래피로 정제하여 황색 고체로서 2-브로모-6-클로로-벤즈알데하이드(3.0g, 84.75%)를 수득하였다.

환저 플라스크 내에서 아르곤하에 5-브로모-피리딘-2-일아민(10 g, 57.8 mmol), 나트륨 메탄설피네이트(9.4 g, 92.48 mmol), 구리(I) 트라이플레이트-벤젠 착체(1.74 g, 3.468 mmol), 라세믹 트랜스 1,2-다이아미노사이클로헥산(40)(1.41 mL, 11.742 mmol) 및 DMSO(50 mL)를 방치하였다. 반응 혼합물을 110℃에서 16시간 동안 가열하였다. 반응을 완료한 후, 혼합물을 빙수에 넣고, 수성을 EtOAc(3 x 100 mL)로 추출하였다. 합한 유기 층을 포화 염수 용액으로 세척하고, 무수 Na₂SO₄로 건조하고 감압하에 농축하였다. 조질 덩어리를 EtOAc-헥산으로 용리된 정상 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 갈색 고체로서 5-메탄설폰일-피리딘-2-일아민(4.0 g, 40.18%)을 수득하였다.

THF(40 mL) 중 5-메탄설폰일-피리딘-2-일아민(1.9 g, 11.047 mmol)의 용액에 칼륨 t-펜톡사이드(THF 중 2 M 용액)(4.2 mL, 8.4 mmol)를 적가하였다. 혼합물을 10분 동안 실온에서 교반한 후, 빙욕에서 냉각하고, 4-브로모-6-클로로-2-메틸-2H-피리다진-3-온(2.96 g, 13.256 mmol)을 THF(20 mL)에 용해하고, 이전 혼합물에 적가하였다. 전체 혼합물을 다시 실온으로 가온하고 1.5시간 동안 교반하였다. 반응을 완료한 후, 이를 소결된 깔때기를 통해 여과하였다. 여액을 포화 염수 용액으로 세척하고 무수 Na₂SO₄로 건조하고, 감압하에 농축하여 회백색 고체로서 조질 생성물 6-클로로-4-(5-메탄설폰일-피리딘-2-일아미노)-2-메틸-2H-피리다진-3-온(1.0 g, 28.76%)을 수득하고, 이를 추가 정제 없이 다음 단계를 위해 직접 사용하였다.

DCM(150 mL) 중 (2-브로모-6-니트로-페닐)-메탄(15.0 g, 64.65 mmol)의 용액에 연속하여 t-부틸 다이메틸 실릴 클로라이드(29.233 g, 193.94 mmol) 및 TEA(19.6 mL, 193.94 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 60℃에서 40시간 동안 교반하였다. 반응 생성물을 TLC로 모니터하였다(에틸 아세테이트:헥산 = 1:9; Rf = 0.7). 용매를 감압하에 제거하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(1.5 L)와 물(1.0 L) 사이에 분배하였다. 유기 층을 건조하고 여과하고 농축하였다. 조질 생성물을 헥산 중 헥산 내지 5% 에틸 아세테이트로 용리하는 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(정상, 100 내지 200 메시)로 정제하여 연황색 액체로서 순수한 (2-브로모-6-니트로-벤질옥시)-t-부틸-다이메틸-실란(21.0 g, 93.81%)을 수득하였다. LCMS: 346.4(M+), 348.4(M+2).

에탄올-물(1:1; 340 mL) 중 (2-브로모-6-니트로-벤질옥시)-t-부틸-다이메틸-실란(7.0 g, 20.29 mmol), 철 분말(3.83 g, 68.58 mmol) 및 암모늄 클로라이드(6.121 g, 114.44 mmol)의 혼합물을 90℃에서 4 시간 동안 가열하였다(실리카 TLC; 에틸 아세테이트:헥산 = 1:19, Rf = 0.4). 반응 혼합물을 셀라이트의 패드 및 소결된 깔때기를 통해 여과하고, 에틸 아세테이트(2 x 20 mL)로 세척하였다. 합한 여액 및 세척액을 농축하고, 에틸 아세테이트(1.5 L)를 조질 생성물에 첨가하고, 물(700 mL)로 세척하였다. 유기 층을 건조하고 여과하고 농축하고, 수득된 조질 생성물을 헥산 중 헥산 내지 2% 에틸 아세테이트로 용리하는 중성 알루미나 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 연주황색 액체로서 순수한 3-브로모-2-(t-부틸-다이메틸-실란일옥시메틸)-페닐아민(5.8 g, 90.37%)을 수득하였다.

다이옥산(60.0 mL) 중 3-브로모-2-(t-부틸-다이메틸-실란일옥시메틸)-페닐아민(1.0 g, 3.164 mmol)의 용액에 4,4,5,5,4',4',5',5'-옥타메틸-[2,2']바이[[1,3,2]다이옥사보롤란일](4.018 g, 15.821 mmol) 및 KOAc(0.932 g, 9.493 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 아르곤으로 탈기하고 이 혼합물에 Pd(OAc)₂(71 mg, 0.316 mmol) 및 X-Phos(211 mg, 0.443 mmol)를 첨가하고, 아르곤으로 추가 5시간 동안 계속 탈기한 후 90℃로 3시간 동안 가열하였다(실리카 TLC; 에틸 아세테이트:헥산 = 1:19, Rf = 0.4). 반응 혼합물을 셀라이트의 패드를 통해 여과하고, 다이옥산(2 x 5 mL)으로 세척하고, 여액과 합하였다. 합한 여액을 감압하에 농축하고, 수득된 조질 잔사를 헥산 중 헥산 내지 2% 에틸 아세테이트로 용리하는 중성 알루미나 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 연주황색 고체로서 순수한 2-(t-부틸-다이메틸-실란일옥시메틸)-3-(4,4,5,5-테트라메틸-[1,3,2]다이옥사보롤란-2-일)-페닐아민(350 mg, 30.44%)을 수득하였다. LCMS: 364.2(M+H).

밀봉관 내에서, 다이옥산(52.0 mL) 중 2-(t-부틸-다이메틸-실란일옥시메틸)-3-(4,4,5,5-테트라메틸-[1,3,2]다이옥사보롤란-2-일)-페닐아민(1.3 g, 3.58 mmol) 및 5-브로모-1-메틸-3-[5-(모폴린-4-카본일)-피리딘-2-일아미노]-1H-피리딘-2-온(1.407 g, 3.58 mmol)의 교반된 혼합물에 1 M 수성 K₂CO₃ 용액(10.7 mL)을 첨가하고, 아르곤으로 탈기하였다. S-Phos(220 mg, 0.54 mmol) 및 Pd(PPh₃)₄(207 mg, 0.18 mmol)를 연속하여 첨가하고, 다시 아르곤으로 탈기하고, 밀봉하고, 90℃에서 2.5시간 동안 가열하였다(실리카 TLC; 오직 에틸 아세테이트, Rf = 0.5). 반응 혼합물을 실온으로 냉각하고, 에틸 아세테이트(250 mL)를 첨가하였다. 유기 부분을 물(120 mL) 및 염수(120 mL)로 세척하고, 건조하고, 여과하고 진공에서 농축하여 조질 덩어리를 수득하고, 이를 헥산 중 50% 에틸 아세테이트로 용리하는 구배 극성을 사용하여 순수한 에틸 아세테이트로 정상 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(정상, 100 내지 200 메시)로 정제하여 회백색 고체로서 순수한 5-[3-아미노-2-(t-부틸-다이메틸-실란일옥시메틸)-페닐]-1-메틸-3-[5-(모폴린-4-카본일)-피리딘-2-일아미노]-1H-피리딘-2-온(1.31 g, 66.61%)을 수득하였다. LCMS: 550.4(M+H).

DCM(70.0 mL) 중 5-[3-아미노-2-(t-부틸-다이메틸-실란일옥시메틸)-페닐]-1-메틸-3-[5-(모폴린-4-카본일)-피리딘-2-일아미노]-1H-피리딘-2-온(700 mg, 1.27 mmol)의 용액에 트라이에틸아민(0.44 mL, 3.18 mmol)을 첨가하고, 0℃로 냉욕에서 냉각한 후 포스겐 용액[0.8 mL, 1.53 mmol(톨루엔 중 20%)]을 첨가하고, 10분 동안 0℃에서 교반한 후, 5-클로로-2,3-다이하이드로-1H-이소인돌(489 mg, 3.18 mmol) 첨가하고, 추가 30분 동안 교반하였다(실리카 TLC; 에틸 아세테이트 100%, Rf = 0.45). 용매를 진공하에 제거하고, 수득된 조질 생성물을 헥산 내지 100% 에틸 아세테이트 중 50% 에틸 아세테이트로 용리하는 구배를 사용하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(정상, 100 내지 200 메시)로 정제하여 갈색 점착성 고체로서 5-클로로-1,3-다이하이드로-이소인돌-2-카복실산(2-(t-부틸-다이메틸-실란일옥시메틸)-3-{1-메틸-5-[5-(모폴린-4-카본일)-피리딘-2-일아미노]-6-옥소-1,6-다이하이드로-피리딘-3-일}-페닐)-아미드(910 mg, 97.99%)를 수득하였다. LCMS: 729.4(M+H).

메탄(45.0 mL) 및 DCM(18.0 mL) 중 5-클로로-1,3-다이하이드로-이소인돌-2-카복실산(2-(t-부틸-다이메틸-실란일옥시메틸)-3-{1-메틸-5-[5-(모폴린-4-카본일)-피리딘-2-일아미노]-6-옥소-1,6-다이하이드로-피리딘-3-일}-페닐)-아미드(900 mg, 1.23 mmol)의 용액에 12 N HCl(0.9 mL)을 실온에서 첨가하고, 10분 동안 교반하였다(실리카 TLC; 용리액으로서 메탄:DCM = 1:19 사용됨, Rf = 0.4). 발포를 중단할 때까지 포화 NaHCO₃ 용액을 적가하였다. 반응 덩어리를 DCM(600 mL)으로 희석하고 물(100 mL) 및 염수(100 mL)로 세척하고, 건조하고 진공에서 농축하여 점착성 조질 덩어리를 수득하고, 이를 DCM-헥산 혼합물로부터 재결정화하여 회색 고체로서 순수한 5-클로로-1,3-다이하이드로-이소인돌-2-카복실산(2-하이드록시메틸-3-{1-메틸-5-[5-(모폴린-4-카본일)-피리딘-2-일아미노]-6-옥소-1,6-다이하이드로-피리딘-3-일}-페닐)-아미드(620 mg, 81.69%)를 수득하였다. LCMS: 615.2(M+H).

10% H₂SO₄(82 mL) 중 니코틴아니드(10.0 g, 81.88 mmol)의 교반된 용액에 2,2-다이메틸-프로피온산(41.8 g, 409.4 mmol) 및 AgNO₃(4.2 g, 24.564 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 교반하면서 70℃에서 가열하였다. CO₂ 증발이 중단될 때까지 H₂O(122 mL) 중 (NH₄)₂S₂O₈(56.1 g, 245.64 mmol)의 용액을 첨가하였다. 반응 생성물을 1시간 이상 동안 동일한 온도에서 아르곤 대기하에 교반하였다. 반응을 완료한 후, TLC로 모니터하고, 혼합물을 실온으로 냉각하고, 수성 NH₃을 첨가하여 pH 약 9로 조정하고, EtOAc(3 x 200 mL)로 추출하였다. 합한 유기 층을 물 및 염수로 세척하고, 무수 Na₂SO₄로 건조하고, 진공하에 농축하였다. 조질 화합물을 용리 용매로서 EtOAc-헥산을 사용하여 콤비플래시 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 회백색 고체로서 6-t-부틸-니코틴아니드(9.6 g, 66%)를 수득하였다. LCMS: 179.0(M+H).

10% H₂SO₄(90 mL) 중 6-t-부틸-니코틴아니드(2 g, 11.221 mmol)의 교반된 용액에 3-프탈이미도프로판산(9.84 g, 44.883 mmol), AgNO₃(1.91 g, 11.221 mmol), (NH₄)₂S₂O₈(20.5 g, 89.767 mmol) 및 세틸트라이메틸암모늄 브로마이드(1.8 g, 4.937 mmol)를 각각 첨가하고, 전체 혼합물을 90℃에서 30분 동안 가열하였다. 이 혼합물을 70℃로 냉각하고 ACN-H₂O(3:7)(100 mL) 중 (NH₄)₂S₂O₈(20.5 g, 89.767 mmol)의 용액을 첨가하고, 혼합물을 다시 90℃로 3시간 동안 가열하였다. 혼합물을 다시 70℃로 냉각하고, ACN-H₂O(3:7)(100 mL) 중 (NH₄)₂S₂O₈(20.5 g, 89.767 mmol)의 용액을 첨가하고, 90℃에서 16시간 동안 유지하였다. RM을 SiO₂ TLC로 모니터하고, 약간의 SM은 여전히 존재하므로 상기 혼합물을 다시 70℃로 냉각하고, ACN-H₂O(3:7)(100 mL) 중 (NH₄)₂S₂O₈(20.5 g, 89.767 mmol)의 용액을 첨가하고, 90℃에서 추가 6시간 동안 유지하였다. 소량의 출발 물질이 혼합물에 존재하고, 이는 연장된 가열 후에도 소비되지 않았다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각하고, 수성 NH₃을 첨가하여 pH 약 7로 중성화하고, DCM(2 x 300 mL)으로 추출하였다. 합한 유기 층을 물 및 염수로 세척하고, 무수 Na₂SO₄로 건조하고 진공하에 농축하여 조질 덩어리를 수득하고, 이를 정상 실리카 겔 컬럼의 작은 베드를 통해 통과시켜 원치않은 불순물을 제거하여 일부 다른 불순물과 함께 갈색 점성 오일로서 6-t-부틸-4-[2-(1,3-다이옥소-1,3-다이하이드로-이소인돌-2-일)-에틸]-니코틴아니드(1.7 g 조질)를 수득하였다. 이 불순한 물질을 추가 정제 없이 다음 단계를 위해 직접 사용하였다. LCMS: 353.0(M+H).

CH₃CN(40 mL) 중 (2.55 g, 조질, 7.256 mmol)의 교반된 용액에 NH₂NH₂.H₂O(0.68 mL, 14.513 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 3시간 동안 환류하였다. 반응을 완료한 후, SiO₂ TLC로 모니터하고, 혼합물을 실온으로 냉각하고, 소결 깔대기를 통해 여과하고, 여액을 감압하에 농축하였다. 조질 화합물을 용리 용매로서 EtOAc-헥산을 사용하여 정상 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 회백색 고체로서 6-t-부틸-3,4-다이하이드로-2H-[2,7]나프티리딘-1-온(165 mg, 2 단계에 걸쳐서 4.5%)을 수득하였다. LCMS: 205.0(M+H).

6-t-부틸-3,4-다이하이드로-2H-[2,7]나프티리딘-1-온(0.46 g, 2.252 mmol), 2,6-다이프로모-벤즈알데하이드(2.97 g, 11.26 mmol), 잔트포스(65.2 mg, 0.113 mmol) 및 Cs₂CO₃(1.03 g, 3.153 mmol)을 1,4-다이옥산(4.5 mL)에 취하고, 아르곤 가스를 혼합물을 통해 10분 동안 발포하였다. Pd(dba)₂(38.8 mg, 0.068 mmol)를 이에 첨가하고, 100℃에서 4시간 동안 교반하였다. 반응을 완료한 후, TLC로 모니터하고, 생성된 혼합물을 실온으로 냉각하고, 이를 EtOAc와 물 사이에 분배하였다. 유기 층을 수집하고, 무수 Na₂SO₄로 건조하고, 감압하에 농축하였다. 조질 덩어리를 EtOAc-헥산을 사용하여 정상 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 회백색 고체로서 2-브로모-6-(6-t-부틸-1-옥소-3,4-다이하이드로-1H-[2,7]나프티리딘-2-일)-벤즈알데하이드(416.0 mg, 47.7%)를 수득하였다. LCMS: 387.0(M) & 389.0(M+2).

무수 1,4-다이옥산(22 mL) 중 5-클로로-1-메틸-3-[5-(모폴린-4-카본일)-피리딘-2-일아미노]-1H-피리딘-2-온(506 mg, 1.29 mmol), 비스(피나콜라토)다이보론(424.7 mg, 1.67 mmol), X-phos(92 mg, 0.193 mmol) 및 KOAc(379 mg, 3.86 mmol)의 용액을 감압하에 방치하고, 아르곤으로 15분 동안 재충전하였다. Pd(OAc)₂(31.7 mg, 0.142 mmol)를 이에 첨가하고, 플라스크를 증발시키고, 다시 아르곤으로 5분 동안 재충전하였다. 이를 0.5시간 동안 환류한 후 실온으로 냉각하였다. 고체를 셀라이트 베드를 통해 여과 제거하고, 여액을 다음 반응을 위해 직접 사용하였다. 별도의 RB 플라스크 내에서, 다이옥산-물-n-부탄올(1:1:0.4)(13.6 mL) 중 2-브로모-6-(6-t-부틸-1-옥소-3,4-다이하이드로-1H-[2,7]나프티리딘-2-일)-벤즈알데하이드(0.5 g, 1.29 mmol), K₂CO₃(888 mg, 6.44 mmol) 및 Cy₃P(108 mg, 0.39 mmol)의 혼합물을 탈기하고 아르곤으로 15분 동안 재충전하였다. Pd(dba)₂(111 mg, 0.193 mmol), 이어서 이전 반응 생성물의 조질 용액을 이에 각각 첨가하고, 전체 혼합물을 110℃에서 1시간 동안 가열하였다. 반응을 완료한 후, TLC 및 LCMS로 모니터하고, 반응 생성물을 여과하고, 여액을 감압하에 농축하여 조질 생성물을 수득하고 이를 용리 용매로서 MeOH-EtOAc를 사용하여 정상 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 회백색 고체로서 2-(6-t-부틸-1-옥소-3,4-다이하이드로-1H-[2,7]나프티리딘-2-일)-6-{1-메틸-5-[5-(모폴린-4-카본일)-피리딘-2-일아미노]-6-옥소-1,6-다이하이드로-피리딘-3-일}-벤즈알데하이드(488 mg, 2 단계에 걸쳐서 61%)를 수득하였다. LCMS: 621.2(M+H).

메탄-DCM(2:3)(15.2 mL) 중 2-(6-t-부틸-1-옥소-3,4-다이하이드로-1H-[2,7]나프티리딘-2-일)-6-{1-메틸-5-[5-(모폴린-4-카본일)-피리딘-2-일아미노]-6-옥소-1,6-다이하이드로-피리딘-3-일}-벤즈알데하이드(1130 mg, 1.82 mmol)의 용액을 0℃로 냉각하고, 물(3.8 mL) 중 NaBH₄(344 g, 9.11 mmol)의 용액을 이에 적가하였다. 생성된 혼합물을 5분 동안 교반하고, 추가 고체 나트륨 보로하이드리드(344 g, 9.11 mmol)를 나눠서 첨가하고, 10분 동안 교반하였다. 반응을 완료한 후, LCMS로 모니터하고, 물로 희석하고, DCM으로 추출하고, Na₂SO₄로 건조하고, 감압하에 농축하였다. 조질 생성물을 DCM 중 염기성 용액(60:10:1의 DCM-MeOH-NH₄OH)을 사용하여 플래시 실리카 겔로 정제하여 6-t-부틸-2-(2-하이드록시메틸-3-{1-메틸-5-[5-(모폴린-4-카본일)-피리딘-2-일아미노]-6-옥소-1,6-다이하이드로-피리딘-3-일}-페닐)-3,4-다이하이드로-2H-[2,7]나프티리딘-1-온을 수득하고, 이를 다이에틸 에터 및 n-펜탄으로 세척하여 추가 정제하여 회백색 고체로서 6-t-부틸-2-(2-하이드록시메틸-3-{1-메틸-5-[5-(모폴린-4-카본일)-피리딘-2-일아미노]-6-옥소-1,6-다이하이드로-피리딘-3-일}-페닐)-3,4-다이하이드로-2H-[2,7]나프티리딘-1-온(215 mg, 18.96%)을 수득하였다. LCMS: 623.2(M+H).

무수 1,4-다이옥산(12.5 mL) 중 6-클로로-2-메틸-4-[5-(모폴린-4-카본일)-피리딘-2-일아미노]-2H-피리다진-3-온(280 mg, 0.801 mmol), 비스(피나콜라토)다이보론(264.3 mg, 1.041 mmol), X-phos(57.2 mg, 0.12 mmol) 및 KOAc(235.7 mg, 2.402 mmol)의 용액을 진공하에 방치하고, 아르곤으로 15분 동안 재충전하였다. Pd(OAc)₂(19.7 mg, 0.088 mmol)를 이에 첨가하고, 플라스크를 증발시키고, 다시 아르곤으로 5분 동안 재충전하였다. 이를 16분 동안 환류한 후 실온으로 냉각하였다. 고체를 셀라이트 베드를 통해 여과 제거하고 여액을 다음 반응을 위해 직접 사용하였다. 별도의 RB 플라스크 내에서 다이옥산-물-n-부탄올(1:1:0.25)(8.1 mL) 중 2-브로모-6-(6-t-부틸-1-옥소-3,4-다이하이드로-1H-[2,7]나프티리딘-2-일)-벤즈알데하이드(56)(305.0 mg, 0.788 mmol), K₂CO₃(543.4 mg, 3.938 mmol) 및 Cy₃P(66.3 mg, 0.236 mmol)의 혼합물을 탈기하고, 아르곤으로 15분 동안 재충전하였다. Pd(dba)₂(67.9 mg, 0.118 mmol), 이어서 이전 반응 생성물의 조질 용액을 이에 각각 첨가하고, 전체 혼합물을 110℃로 1시간 동안 가열하였다. 반응을 완료한 후 TLC 및 LCMS로 모니터하고, 반응 생성물을 여과하고, 여액을 감압하에 농축하여 조질 덩어리를 수득하고, 이를 용리 용매로서 EtOAc를 사용하여 정상 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 황색 고체로서 2-(6-t-부틸-1-옥소-3,4-다이하이드로-1H-[2,7]나프티리딘-2-일)-6-{1-메틸-5-[5-(모폴린-4-카본일)-피리딘-2-일아미노]-6-옥소-1,6-다이하이드로-피리다진-3-일}-벤즈알데하이드(291.0 mg, 2 단계에 걸쳐서 59.44%)를 수득하였다. LCMS: 622.6(M+H).

메탄-DCM(2:3)(22.2 mL) 중 2-(6-t-부틸-1-옥소-3,4-다이하이드로-1H-[2,7]나프티리딘-2-일)-6-{1-메틸-5-[5-(모폴린-4-카본일)-피리딘-2-일아미노]-6-옥소-1,6-다이하이드로-피리다진-3-일}-벤즈알데하이드(700 mg, 1.13 mmol)의 용액을 0℃로 냉각하고, 물(4 mL) 중 NaBH₄(213 mg, 5.63 mmol)의 용액을 이에 적가하였다. 생성된 혼합물을 5분 동안 교반하고, 추가 고체 나트륨 보로하이드리드(213 mg, 5.63 mmol)를 적가하고, 다시 10분 동안 상기 온도에서 교반하였다. 반응을 완료한 후, LCMS로 모니터하고, 물을 첨가하고, DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 무수 Na₂SO₄로 건조하고 감압하에 농축하였다. 조질 생성물을 DCM 중 4 내지 6% 매직 용액(60:10:1 비의 DCM-MeOH-NH₄OH)을 사용하여 플래시 실리카 겔로 정제하여 6-t-부틸-2-(2-하이드록시메틸-3-{1-메틸-5-[5-(모폴린-4-카본일)-피리딘-2-일아미노]-6-옥소-1,6-다이하이드로-피리다진-3-일}-페닐)-3,4-다이하이드로-2H-[2,7]나프티리딘-1-온을 수득하고, 이를 다이에틸 에터 및 n-펜탄으로 세척하여 추가 정제하여 회백색 고체(322 mg, 46.00%)를 수득하였다. LCMS: 624.4(M+H).

DMSO(10 mL) 중 6-t-부틸-8-플루오로-2H-프탈라진-1-온(58)(1 g, 4.545 mmol), 1,3-다이프로모-2-메틸-벤젠(2.27 g, 9.091 mmol), CuI(0.26 g, 1.364 mmol) 및 K₂CO₃(0.63 g, 4.545 mmol)의 현탁액을 탈기한 후 아르곤으로 15분 동안 밀봉관내에서 재충전하고, 혼합물을 140℃에서 18시간 동안 가열하였다. 반응을 완료한 후, LCMS로 모니터하고, 혼합물을 실온으로 냉각하고 EtOAc-H₂O로 희석하였다. 유기 층을 포화 염수 용액으로 세척하고, 무수 Na₂SO₄로 건조하고 감압하에 농축하였다. 조질 덩어리를 용리 용매로서 EtOAc-헥산을 사용하여 정상 실리카 겔로 정제하여 연황색 고체로서 2-(3-브로모-2-메틸-페닐)-6-t-부틸-8-플루오로-2H-프탈라진-1-온(4.65 g, 43%)을 수득하였다. LCMS: 389.0(M+), 391.2(M+2).

밀봉관 내에서, 2-(3-브로모-2-메틸-페닐)-6-t-부틸-8-플루오로-2H-프탈라진-1-온(1.55 g, 3.985 mmol), 비스(피나콜라토)다이보론(2.02 g, 7.969 mmol), X-phos(0.23 g, 0.398 mmol) 및 KOAc(0.9 g, 9.165 mmol)의 혼합물을 다이옥산(12 mL)에 취하고, 탈기한 후 아르곤으로 15분 동안 재충전하였다. Pd(OAc)₂(54 mg, 0.239 mmol)를 이에 첨가하고, 80℃에서 6시간 동안 가열하였다. 반응 생성물은 LCMS 및 TLC에 따라 완료되지 않았으므로, 모든 시약의 절반을 다시 첨가하고, 동일한 온도에서 16시간 동안 계속 가열하였다. 반응을 완료한 후, TLC 및 LCMS로 모니터하고, 혼합물을 실온으로 냉각하고, 셀라이트의 베드로 여과하였다. 여액을 감압하에 농축하고, 조질 덩어리를 EtOAc-헥산를 사용하여 정상 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피의 작은 베드를 통해 통과시켜 세미-순수한 6-t-부틸-8-플루오로-2-[2-메틸-3-(4,4,5,5-테트라메틸-[1,3,2]다이옥사보롤란-2-일)-페닐]-2H-프탈라진-1-온(0.8 g, 약 46.01%)을 수득하고, 이를 추가 정제 없이 다음 단계를 위해 직접 사용하였다. LCMS: 437.0(M+H).

10% 수성 다이옥산(69 mL) 중 6-t-부틸-8-플루오로-2-[2-메틸-3-(4,4,5,5-테트라메틸-[1,3,2]다이옥사보롤란-2-일)-페닐]-2H-프탈라진-1-온(2.4 g, 5.51 mmol) 및 6-클로로-2-메틸-4-[5-(모폴린-4-카본일)-피리딘-2-일아미노]-2H-피리다진-3-온(1.54 g, 4.4 mmol)의 용액에 Cs₂CO₃(6.75 g, 20.8 mmol)을 첨가하고, 이 혼합물을 120℃에서 3시간 동안 마이크로파 조건하에 가열하였다. 반응을 완료한 후, 혼합물을 셀라이트의 베드를 통해 여과하고, EtOAc로 세척하였다. 여액을 감압하에 농축하고, 조질 생성물을 DCM 중 10% 매직 용액(60:10:1 비의 DCM:MeOH:NH₄OH)을 사용하여 플래시 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 회백색 고체로서 6-t-부틸-8-플루오로-2-(2-메틸-3-{1-메틸-5-[5-(모폴린-4-카본일)-피리딘-2-일아미노]-6-옥소-1,6-다이하이드로-피리다진-3-일}-페닐)-2H-프탈라진-1-온(1.5 g, 43.7%)을 수득하였다. LCMS: 624.2(M+H).

물(20 mL) 중 나트륨 하이드록사이드(3.46 g, 86.667 mmol)의 교반된 용액에 3-t-부틸페놀(10 g, 66.667 mmol)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 2-(2-브로모-에틸)-[1,3]다이옥산(14.3 g, 73.33 mmol)을 이에 첨가하고, 생성된 혼합물을 41시간 동안 환류 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각한 후 교반하면서 EtOAc(150 mL)를 첨가하고, 아세트산을 첨가하여 pH 약 4로 조정한 후 물(100 mL) 및 EtOAc(150 mL)로 희석하였다. 분배한 후, 층을 분리하고, 유기 층을 물(3 x 100 mL)로 세척하고, 무수 Na₂SO₄로 건조하고, 감압하에 농축하여 2-[2-(3-t-부틸-페녹시)-에틸]-[1,3]다이옥산(16 g, 조질, 약 90.79%)을 수득하고, 이를 추가 정제 없이 다음 단계를 위해 직접 사용하였다. GC/MS: 264.0(M+).

농축된 HCl(80 mL)을 빙욕에서 냉각하고 THF(40 mL)를 이에 첨가하였다. THF(40 mL) 중 2-[2-(3-t-부틸-페녹시)-에틸]-[1,3]다이옥산(10 g, 조질, 37.879 mmol)을 상기 온도에서 서서히 교반하였다. 첨가를 완료한 후, 빙욕을 제거하고, 생성된 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 출발 물질의 소비를 완료한 후, 에터(100 mL)를 혼합물에 첨가하고, 층을 분리하였다. 합한 유기 층을 물로 세척하고, 무수 Na₂SO₄로 건조하고 농축하여 연황색 오일로서 조질 생성물 7-t-부틸-크로만-4-올(7.0 g, 조질)을 수득하고, 이를 추가 정제 없이 다음 단계에서 수행하였다.

7-t-부틸-크로만-4-올(7 g, 조질, 33.981 mmol)을 DCM(300 mL)에 취하고, 교반하면서 PCC(14.65 g, 67.961 mmol)를 나눠서 첨가하였다. 반응을 완료한 후, 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응을 완료한 후, LCMS로 모니터하고, 헥산을 반응 혼합물에 첨가하고, 셀라이트 베드를 통해 여과하였다. 여액을 감압하에 농축하고, 조질 덩어리를 용리 용매로서 EtOAc-헥산을 사용하여 정상 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 연갈색 고체로서 7-t-부틸-크로만-4-온(3.8 g, 2 단계에 걸쳐서 49.18%)을 수득하였다. LCMS: 205.2(M+H).

7-t-부틸-크로만-4-온(5.0 g, 24.51 mmol) 및 메탄 설폰산(7.5 mL)을 DCM(12 mL)에 취하고, 0℃로 냉각하였다. 고체 나트륨 아지드(3.2 g, 49.02 mmol)를 이 혼합물에 첨가하고, 생성된 혼합물을 상기 온도에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 NaOH의 20% 수용액에 0℃에서 붓고, 다시 10분 동안 교반하였다. 전체 수성 부분을 CH₂Cl₂(3 x 50 mL)로 추출하고, 합한 유기 층을 염수로 세척하고, 무수 Na₂SO₄로 건조하고 감압하에 농축하였다. 조질 덩어리를 EtOAc-헥산을 사용하여 정상 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 회백색 고체로서 8-t-부틸-3,4-다이하이드로-2H-벤조[f][1,4]옥사제핀-5-온(5.0 g, 93.03%)을 수득하였다. LCMS: 220.2(M+H).

8-t-부틸-3,4-다이하이드로-2H-벤조[f][1,4]옥사제핀-5-온(0.92 g, 4.201 mmol), 2,6-다이프로모-벤즈알데하이드(4.99 g, 18.904 mmol), 잔트포스(109.4 mg, 0.189 mmol) 및 Cs₂CO₃(1.91 g, 5.881 mmol)을 1,4-다이옥산(15 mL)에서 취하고, 아르곤을 혼합물을 통해 10분 동안 발포하였다. Pd(dba)₂(72.5 mg, 0.126 mmol)를 이에 첨가하고, 100℃에서 3시간 동안 교반하였다. 반응을 완료한 후, TLC로 모니터하고, 생성된 혼합물을 실온으로 냉각하고, 이를 EtOAc와 물 사이에 분배하였다. 유기 층을 수집하고, 무수 Na₂SO₄로 건조하고 감압하에 농축하였다. 조질 덩어리를 EtOAc-헥산을 사용하여 정상 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 연갈색 고체로서 2-브로모-6-(8-t-부틸-5-옥소-2,3-다이하이드로-5H-벤조[f][1,4]옥사제핀-4-일)-벤즈알데하이드(1.1 g, 65.09%)를 수득하였다. LCMS: 402.0(M-H) 및 404.0(M+H).

무수 1,4-다이옥산(30 mL) 중 6-클로로-2-메틸-4-[5-(모폴린-4-카본일)-피리딘-2-일아미노]-2H-피리다진-3-온(0.86 g, 2.464 mmol), 비스(피나콜라토)다이보론(1001.4 mg, 3.943 mmol), X-phos(176.2 mg, 0.37 mmol) 및 KOAc(725.6 mg, 7.393 mmol)의 용액을 진공하에 방치하고, 아르곤으로 15분 동안 재충전하였다. Pd(OAc)₂(55.3 mg, 0.246 mmol)를 이에 첨가하고, 플라스크를 증발시키고 아르곤으로 다시 5분 동안 재충전하였다. 이를 100℃에서 30분 동안 가열한 후, 실온으로 냉각하였다. 고체를 셀라이트 베드를 통해 여과 제거하고, 여액을 다음 반응을 위해 직접 사용하였다(M+H:316.2). 별도의 RB 플라스크 내에서, 다이옥산-물-n-부탄올(1:1:0.4)(24 mL) 중 2-브로모-6-(8-t-부틸-5-옥소-2,3-다이하이드로-5H-벤조[f][1,4]옥사제핀-4-일)-벤즈알데하이드(1 g, 2.481 mmol), K₂CO₃(1.03 g, 7.444 mmol) 및 Cy₃P(0.21 g, 0.744 mmol)의 혼합물을 탈기하고, 아르곤으로 15분 동안 재충전하였다. Pd(dba)₂(0.21 g, 0.372 mmol), 이어서 이전 반응 생성물의 조질 여액을 이에 각각 첨가하고, 전체 혼합물을 110℃에서 1.5시간 동안 가열하였다. 반응을 완료한 후, TLC 및 LCMS로 모니터하고, 반응 생성물을 여과하고, 여액을 감압하에 농축하여 조질 덩어리를 수득하고, 이를 용매로 용리하는 MeOH-EtOAc를 사용하여 콤비플래시 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 백색 고체로서 2-(8-t-부틸-5-옥소-2,3-다이하이드로-5H-벤조[f][1,4]옥사제핀-4-일)-6-{1-메틸-5-[5-(모폴린-4-카본일)-피리딘-2-일아미노]-6-옥소-1,6-다이하이드로-피리다진-3-일}-벤즈알데하이드(1.0 g, 2 단계에 걸쳐서 63.3%)를 수득하였다. LCMS: 637.6(M+H).

메탄-DCM(2:3)(69 mL) 중 2-(8-t-부틸-5-옥소-2,3-다이하이드로-5H-벤조[f][1,4]옥사제핀-4-일)-6-{1-메틸-5-[5-(모폴린-4-카본일)-피리딘-2-일아미노]-6-옥소-1,6-다이하이드로-피리다진-3-일}-벤즈알데하이드(4.6 g, 3.145 mmol)의 용액을 0℃로 냉각하고, 물(6.9 mL) 중 NaBH₄(1.38 g, 15.723 mmol)의 용액을 이에 적가하였다. 생성된 혼합물을 10분 동안 교반하고, 추가 고체 나트륨 보로하이드리드(2.7 g, 31.447 mmol)룰 나눠서 첨가하고, 다시 1시간 동안 상기 온도에서 교반하였다. 반응을 완료한 후, LCMS로 모니터하고, 물을 첨가하고, DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 무수 Na₂SO₄로 건조하고 감압하에 농축하였다. 조질 덩어리를 DCM 중 10 내지 30% 매직 용액(60:10:1 비 중 DCM-MeOH-NH₄OH)을 사용하여 플래시 실리카 겔로 정제하여 8-t-부틸-4-(2-하이드록시메틸-3-{1-메틸-5-[5-(모폴린-4-카본일)-피리딘-2-일아미노]-6-옥소-1,6-다이하이드로-피리다진-3-일}-페닐)-3,4-다이하이드로-2H-벤조[f][1,4]옥사제핀-5-온을 수득하고, 이를 다이에틸 에터 및 n-펜탄으로 세척하여 추가 정제하여 회백색 고체(2.12 g, 45.87%)를 수득하였다. LCMS: 639.2(M+H).

무수 1,4-다이옥산(70 mL) 중 6-클로로-4-(5-메탄설폰일-피리딘-2-일아미노)-2-메틸-2H-피리다진-3-온(0.78 g, 2.484 mmol), 비스(피나콜라토)다이보론(1009.5 mg, 3.975 mmol), X-phos(177.6 mg, 0.373 mmol) 및 KOAc(731.4 mg, 7.452 mmol)의 용액을 진공하에 방치하고, 아르곤으로 15분 동안 재충전하였다. Pd(OAc)₂(55.8 mg, 0.248 mmol)를 이에 첨가하고, 플라스크를 증발시키고 아르곤으로 5분 동안 다시 재충전하였다. 이를 100℃로 1시간 동안 가열한 후 실온으로 냉각하였다. 이 용액을 다음 반응에 직접 사용하였다(M+H: 323.6). 분별 RB 플라스크 내에서, 다이옥산-물-n-부탄올(1:1:0.25)(27 mL) 중 2-브로모-6-(8-t-부틸-5-옥소-2,3-다이하이드로-5H-벤조[f][1,4]옥사제핀-4-일)-벤즈알데하이드(1 g, 2.481 mmol), K₂CO₃(1.71 g, 12.407 mmol) 및 Cy₃P(0.21 g, 0.744 mmol)의 혼합물을 탈기하고 아르곤으로 15분 동안 재충전하였다. Pd(dba)₂(0.21 g, 0.372 mmol), 이어서 이전 반응 생성물의 조질 용액을 각각 이에 첨가하고, 전체 혼합물을 110℃에서 1.5시간 동안 가열하였다. 반응이 완료된 후, TLC 및 LCMS로 모니터하고, 반응 생성물을 여과하고, 여액을 감압하에 농축하여 조질 덩어리를 수득하고, 이를 용리 용매로서 MeOH-EtOAc를 사용하여 콤비플래시 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 연황색 고체로서 2-(8-t-부틸-5-옥소-2,3-다이하이드로-5H-벤조[f][1,4]옥사제핀-4-일)-6-[5-(5-메탄설폰일-피리딘-2-일아미노)-1-메틸-6-옥소-1,6-다이하이드로-피리다진-3-일]-벤즈알데하이드(510 mg, 2 단계에 걸쳐서 34.16%)를 수득하였다. LCMS: 602.2(M+H).

메탄-DCM(2:3)(30 mL) 중 2-(8-t-부틸-5-옥소-2,3-다이하이드로-5H-벤조[f][1,4]옥사제핀-4-일)-6-[5-(5-메탄설폰일-피리딘-2-일아미노)-1-메틸-6-옥소-1,6-다이하이드로-피리다진-3-일]-벤즈알데하이드(1 g, 1.572 mmol)의 용액을 0℃로 냉각하고, 물(3 mL) 중 NaBH₄(0.3 g, 7.862 mmol)의 용액을 이에 적가하였다. 생성된 혼합물을 10분 동안 교반하고, 추가 고체 나트륨 보로하이드리드(0.59 g, 15.723 mmol)를 적가하고 다시 1시간 동안 상기 온도에서 교반하였다. 반응을 완료한 후, LCMS로 모니터하고, 물을 첨가하고, DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 무수 Na₂SO₄로 건조하고, 감압하에 농축하였다. 조질 덩어리를 DCM 중 10 내지 30% 매직 용액(60:10:1 비의 DCM-MeOH-NH₄OH)을 사용하여 플래시 실리카 겔로 정제하여 8-t-부틸-4-{2-하이드록시메틸-3-[5-(5-메탄설폰일-피리딘-2-일아미노)-1-메틸-6-옥소-1,6-다이하이드로-피리다진-3-일]-페닐}-3,4-다이하이드로-2H-벤조[f][1,4]옥사제핀-5-온을 수득하고, 이를 다이에틸에터 및 n-펜탄으로 세척하여 추가 정제하여 회백색 고체(540 mg, 56.89%)를 수득하였다. LCMS: 604.4(M+H).

생물학적 실시예

브루톤 티로신 키나아제(BTK) 억제 분석

본 분석은 여과를 통해 방사성 ³³P 인산화된 생성물을 포획하는 것이다. BTK, 비오틴화된(biotinylated) SH₂ 펩타이드 기질(Src 상동) 및 ATP의 상호작용은 펩타이드 기질의 인산화를 일으킨다. 비오틴화된 생성물은 결합된 스트렙타비딘 세파로스 비드이다. 결합되고 방사표지된 모든 생성물을 섬광 계수기에 의해 검출한다.

분석되는 플레이트는 96-웰 폴리프로필렌(그라이너(Greiner)) 및 96-웰 1.2㎛ 친수성 PVDF 필터 플레이트(밀리포어(Millipore))이다. 본원에 기록된 농도는 최종 분석 농도이다: DMSO 중 10 내지 100 μM 화합물(버딕 앤드 잭슨(Burdick and Jackson)), 5 내지 10 nM BTK 효소(His-태깅됨, 전장), 30 μM 펩타이드 기질(비오틴-Aca-AAAEEIYGEI-NH₂), 100 μM ATP(시그마(Sigma)), 8 mM 이미다졸(시그마, pH 7.2), 8 mM 글리세롤-2-포스페이트(시그마), 200 μM EGTA(로슈 다이아그노스틱스(Roche Diagnostics)), 1 mM MnCl₂(시그마), 20 mM MgCl₂(시그마), 0.1 mg/ml BSA(시그마), 2 mM DTT(시그마), 1 μCi³³P ATP(아머샴(Amersham)), 20% 스트렙타비딘 세파로스 비드(아머샴), 50 mM EDTA(깁코(Gibco)), 2 M NaCl(깁코), 2 M NaCl w/1% 인산(깁코), 마이크로신트-20(퍼킨 엘머(Perkin Elmer)).

표준 96-웰 플레이트 분석 주형으로부터 생성된 데이터를 이용하여 화합물당 10-점 데이터로부터 IC₅₀ 측정을 계산하였다. 하나의 대조군 화합물 및 7개의 미공지된 억제제를 각각의 플레이트 상에서 시험하고, 각각의 플레이트를 2회 수행하였다. 전형적으로, 화합물을 100 μM에서 출발하여 3 nM에서 종결되는 반-로그(half-log)로 희석하였다. 대조군 화합물은 스타우로스포린이었다. 펩타이드 기질의 부재 하에 백그라운드를 계수하였다. 총 활성을 펩타이드 기질의 존재 하에 측정하였다. 하기 프로토콜을 사용하여 BTK 억제를 측정하였다:

1) 샘플 제조: 시험 화합물을 분석 완충액(이미다졸, 글리세롤-2-포스페이트, EGTA, MnCl₂, MgCl₂, BSA) 중의 반-로그 증가량으로 희석하였다.

2) 비드 제조

a) 500 x g에서 원심분리하여 비드를 헹군다.

b) PBS 및 EDTA로 비드를 재구성하여, 20% 비드 슬러리를 제조한다.

3) 기질(분석 완충액, DTT, ATP, ³³P ATP)을 함유하지 않는 반응 혼합물 및 기질(분석 완충액, DTT, ATP, ³³P ATP, 펩타이드 기질)을 함유하는 혼합물을 30℃에서 15분 동안 예비-배양한다.

4) 분석을 시작하기 위해, 효소 완충액(이미다졸, 글리세롤-2-포스페이트, BSA) 중 BTK(10 ㎕) 및 시험 화합물(10 ㎕)을 10분 동안 실온에서 예비-배양한다.

5) 기질을 함유하지 않거나 함유하는 반응 혼합물(30 ㎕)을 BTK 및 화합물에 첨가한다.

6) 총 분석 혼합물(50 ㎕)을 30℃에서 30분 동안 배양한다.

7) 분석물(40 ㎕)을 필터 플레이트 내의 비드 슬러리(150 ㎕)로 이동시켜 반응을 중지한다.

8) 30분 후 필터 플레이트를 하기 단계로 세척한다:

a) NaCl(3 x 250 ㎕);

b) 1% 인산을 함유한 NaCl(3 x 250 ㎕);

c) H₂O(1 x 250 ㎕).

9) 플레이트를 65℃에서 1시간 동안 또는 실온에서 밤새 건조한다.

10) 마이크로신트-20(50 ㎕)을 첨가하고, 섬광 계수기로 ³³P cpm을 계수한다.

원 데이터(raw data)로부터 %활성을 cpm 단위로 계산한다.

%활성 = (샘플 - 백그라운드)/(총 활성 - 백그라운드) x 100

단일부위 용량 반응 S자형 모델을 이용하여, %활성으로부터 IC₅₀을 계산한다.

y = A +((B - A)/(1 +((x / C)^D))))

이때, x = 화합물의 농도, y = %활성, A = 최소, B = 최대, C = IC₅₀, D = 1(경사 기울기)이다.

브루톤 티로신 키나아제 ( BTK ) 억제 TR - FRET (시간 분해 FRET ) 분석

이 BTK 경쟁 분석은 FRET(Forster/형광 공명 에너지 전달) 기법을 사용하여 브루톤 티로신 키나아제의 비활성화된 상태에 대한 화합물 효능(IC₅₀)을 측정하는 것이다. BTK-Eu 복합체를 얼음에서 1시간 동안 항온처리한 후 50 nM BTK-바이오이지(Bioease: 상표):10 nM Eu-스트렙타비딘(퍼킨 엘머, 카탈로그 번호 AD0062)의 출발 농도에서 사용하였다. 분석 완충액은 20 mM HEPES(pH 7.15), 0.1 mM DTT, 10 mM MgCl₂, 0.5 mg/ml BSA와 함께 3% 키나아제 안정화제(프레몬트 바이오솔루션스(Fremont Biosolutions), 카탈로그 번호 STB-K02)로 구성되었다. 1시간 후, 상기로부터의 반응 혼합물을 분석 완충액에서 10배 희석하여 5 nM BTK:1 nM Eu-스트렙타비딘 복합체(공여체 형광단)를 제조하였다. 이어서, 음성 대조군이 아닌 BTK-Eu를 단독으로 갖는 0.11 nM BTK-Eu 및 0.11 nM 키나아제 트레이서 178(인비트로겐, 카탈로그 번호 PV5593)의 혼합물(18 ㎕)을 384-웰 편평 바닥 플레이트(그레이너, 784076)에 분배하였다. 분석에서 시험될 화합물을 10x 농축하여 제조하고, 10-점 곡선을 생성하기 위해 절반-로그 증가의 연속 희석을 DMSO에서 수행하였다. FRET 반응을 개시하기 위해, DMSO에서 10x 스톡으로 제조된 화합물을 플레이트에 첨가하고, 상기 플레이트를 18 내지 24시간 동안 14℃에서 항온처리하였다.

항온처리 후, 플레이트를 BMG 페라스타(Pherastar) 형광 플레이트 판독기(또는 등가물)로 판독하고, 유로퓸 공여체 형광단(620 nm 방출) 및 FRET(665 nm 방출)로부터 방출 에너지를 측정하기 위해 사용하였다. 음성 대조군 웰 값을 평균화하여 평균 최소치를 수득하였다. 양성 "억제제가 없는" 대조군 웰을 평균화하여 평균 최대치를 수득하였다. 최대 FRET의 %를 다음 식으로 계산하였다:

%최대 FRET = 100 x [(FSR_화합물-FSR_{평균최소치})/(FSR_{평균최대치-}FSR_{평균최소치})]

이때, FSR은 FRET 신호 비이다. 활성 기준(엑셀)으로 %최대 FRET 곡선을 플롯팅하고, IC₅₀(%), 경사 기울기, z' 및 %CV를 측정하였다. 마이크로소프트 엑셀을 사용하여 중복 곡선(2개의 독립적인 희석으로부터의 일중항 억제 곡선)으로부터 평균 IC₅₀ 및 표준 편차를 유도하였다.

상기 분석에 대한 대표적인 화합물의 데이터를 하기 표 II에 열거하였다.

[표 II]

CD69 발현에 의해 측정되는 전혈 중 B 세포 활성화의 억제

인간 혈액 중에서 B 세포의 B 세포 수용체-매개된 활성화를 억제하는 BTK 억제제의 능력을 시험하는 과정은 하기와 같다:

인간 전혈(HWB)을 하기 제한을 갖는 건강한 자원자로부터 수득하였다: 24시간 약물 복용하지 않는 비흡연자. 나트륨 헤파린으로 응고방지된 배큐테이너(Vacutainer) 관으로 정맥 천자에 의해 채혈하였다. 시험 화합물을 PBS(20x) 중에서 목적 출발 약물 농도의 10배까지 희석한 후, PBS 중의 10% DMSO로 3회 연속 희석하여 9-점 투여량-반응 곡선을 생성하였다. 각각의 화합물의 희석액(5.5 ㎕)을 96-웰 V 바닥 플레이트(어넬리티컬 세일즈 앤 서비시스(Analytical Sales and Services), #59623-23)(2 x 2 ml)에 첨가하고, PBS(5.5 ㎕) 중 10% DMSO를 대조군 및 비자극 웰에 첨가하였다. HWB(100μl)를 각 웰에 첨가하고 혼합한 후, 플레이트를 37℃, 5% CO₂, 100% 습도에서 30분 동안 배양하였다. 염소 F(ab')2 항-인간 IgM(써던 바이오테크(Southern Biotech), #2022-14)(500μg/ml 용액 10 ㎕, 50 μg/ml 최종 농도)을 혼합하면서 각 웰(비자극 웰 제외)에 첨가하고, 상기 플레이트를 추가 20시간 동안 배양하였다.

20시간의 배양이 끝나는 시점에, 샘플을 형광-탐침-표지된 항체(PE 마우스 항-인간 CD20(15 ㎕), BD 파밍겐(Pharmingen), #555623 및/또는 APC 마우스 항-인간 CD69(20 ㎕), BD 파밍겐 #555533)와 함께 30분 동안, 37℃, 5% CO₂, 100% 습도에서 배양하였다. 보상 조정 및 초기 전압 설정을 위해, 유도된 대조군, 비염색물 및 단일 염색물이 포함되어 있다. 이어서, 샘플을 1X 파밍겐 용해 완충액(BD 파밍겐 #555899)(1 ml)에 용해하고, 플레이트를 1800 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 흡입에 의해 제거하고, 잔여 펠렛을 추가 1X 파밍겐 용해 완충액(1 ml)에 다시 용해하고, 플레이트를 상기와 같이 회전시켰다. 상청액을 흡인하고, 잔여 펠렛을 FACS 완충액(PBS + 1% FBS)으로 세척하였다. 최종 회전 후, 상청액을 제거하고, 펠렛을 FACS 완충액(180 ㎕)에 재현탁하였다. 샘플을 BD LSR II 유세포 분석기(flow cytometer)에서 HTS 96 웰 시스템으로 실시되기에 적합한 96 웰 플레이트로 옮겼다.

사용된 형광단에 대한 적절한 여기 및 방출 파장을 사용하여, 데이터를 획득하고, %양성 세포 값을 셀 퀘스트 소프트웨어(Cell Quest Software)를 사용하여 수득하였다. 결과를 먼저 FACS 분석 소프트웨어(플로우 조(Flow Jo))에 의해 분석하였다. 시험 화합물에 대한 IC₅₀을, 항-IgM에 의한 자극 이후에도 CD20-양성인 CD69-양성 세포의 %(비자극 백그라운드용 8개의 웰의 평균치를 뺀 후의 8개의 대조군 웰의 평균치)를 50% 만큼 감소시키는 농도로서 정의하였다. IC₅₀ 값을 XLfit 소프트웨어 버전 3, 식 201을 사용하여 계산하였다.

B 세포 활성화 억제 - 라모스( Ramos ) 세포 중의 B 세포의 FLIPR 분석

본 발명의 화합물에 의한 B 세포 활성화의 억제를 항-IgM 자극 B 세포 반응에 대한 시험 화합물의 효과를 측정함으로써 입증하였다.

B 세포의 FLIPR 분석은 항-IgM 항체에 의한 자극으로부터 세포내 칼슘 증가의 잠재적 억제제의 효과를 측정하는 세포 기재의 기능적 방법이다. 라모스 세포(인간 버킷(Burkitt) 림프종 세포주; ATCC 번호 CRL-1596)를 성장 배지(하기 기재됨)에서 배양하였다. 분석 하루 전, 라모스 세포를 새로운 성장 배지(상기와 동일함)에 재현탁하고, 조직 배양 플라스크 내에 0.5 x 10⁶ 세포/ml의 농도로 설정하였다. 분석 당일, 세포를 계수하고, 조직 배양 플라스크 내에 1 μM FLUO-3AM(테프랩스(TefLabs) 카탈로그 번호 0116, 무수 DMSO 및 10% 플루론산 중에서 제조됨)으로 보충된 성장 배지에서 1 x 10⁶ 세포/ml의 농도로 설정하고, 37℃(4% CO₂)에서 1시간 동안 배양하였다. 세포외 염료를 제거하기 위해, 세포를 원심분리(5분, 1000 rpm)에 의해 수집하고, 1 x 10⁶ 세포/ml로 FLIPR 완충액(하기 기재됨)에 재현탁한 후, 웰당 1 x 10⁵ 세포로 96-웰 폴리-D-리신 코팅된 흑색/투명 플레이트(BD 카탈로그 번호 356692)에 분배하였다. 시험 화합물을 100 μM 내지 0.03 μM(7개의 농도, 하기 세부사항) 범위의 다양한 농도로 첨가하고, 30분 동안 실온에서 세포와 함께 배양하였다. 라모스 세포의 Ca² ⁺ 신호전달을 10 μg/ml 항-IgM(써던 바이오테크(Southern Biotech), 카탈로그 번호 2020-01)의 첨가에 의해 자극하고, FLIPR(몰레큘라 디바이시스(Molecular Devices), 480 nM 여기에서 아르곤 레이저를 갖는 CCD 카메라를 사용하여 96 웰 플레이트의 이미지를 포획함)에서 측정하였다.

배지/완충액:

성장 배지: L-글루타민(인비트로겐(Invitrogen), 카탈로그 번호 61870-010), 10% 소태아혈청(FBS, 서밋 바이오테크놀로지(Summit Biotechnology) 카탈로그 번호 FP-100-05); 1 mM 나트륨 피루베이트(인비트로겐 카탈로그 번호 11360-070)를 함유한 RPMI 1640 배지.

FLIPR 완충액: HBSS(인비트로겐, 카탈로그 번호 141175-079), 2 mM CaCl₂(시그마 카탈로그 번호 C-4901), HEPES(인비트로겐, 카탈로그 번호 15630-080), 2.5 mM 프로베네시드(시그마, 카탈로그 번호 P-8761), 0.1% BSA(시그마, 카탈로그 번호 A-7906), 11 mM 글루코스(시그마, 카탈로그 번호 G-7528).

화합물 희석 세부사항:

100 μM의 최고의 최종 분석 농도를 달성하기 위해, 10 mM 화합물 저장 용액(DMSO 중에 제조됨)(24 ㎕)을 FLIPR 완충액(576 ㎕)에 직접 첨가하였다. 시험 화합물을 FLIPR 완충액(바이오멕(Biomek) 2000 로봇 피펫터(robotic pipettor)를 사용함)에 희석하여 하기 희석식을 생성하였다: 비히클, 1.00 x 10^-4 M, 1.00 x 10^-5, 3.16 x 10^-6, 1.00 x 10^-6, 3.16 x 10^-7, 1.00 x 10^-7, 3.16 x 10^-8.

검정 및 분석:

칼슘의 세포내 증가를, 최대-최소 통계자료(몰레큘라 디바이시스 FLIPR 제어 및 통계적 추출 소프트웨어를 사용하여 자극 항체의 첨가에 의해 야기된 피크에서 정지된 기준치(resting baseline)를 빼는 것)를 사용하여 기록하였다. 비선형 곡선 맞춤(그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 소프트웨어)을 사용하여 IC₅₀을 측정하였다.

마우스 콜라겐 유도성 관절염( mCIA )

0일에, 마우스의 꼬리의 끝 부분 또는 등의 여러 지점에 완전 프로인트 보조물질(Complete Freund's Adjuvant; CFA) 중 제 2 형 콜라겐의 유화액을 (i.d.) 주사하였다. 콜라겐 면역 조치 이후, 동물은 약 21 내지 35일에 관절염이 발달할 것이다. 관절염의 발병은 21일에 불완전 프로인트 보조물질(IFA; i.d.) 중 콜라겐의 전신 투여에 의해 동기화되었다(증강되었다). 증강된 신호의 경미한 관절염(점수 1 또는 2; 하기 기재된 점수 참조)의 임의의 발병에 대하여 20일 후에 매일 동물을 조사하였다. 증강된 후에, 마우스의 점수를 매기고, 처방 시간(전형적으로, 2주 내지 3주) 및 투약 빈도, 매일(QD) 또는 매일 2회(BID)로 후보 치료제를 투여하였다.

래트 콜라겐 유도성 관절염( rCIA )

0일에, 래트의 등의 여러 위치에 불완전 프로인트 보조물질(IFA) 중 소과 제 2 형 콜라겐의 유화액을 피내(i.d.) 주사하였다. 콜라겐 유화액의 증강 주사를 7일쯤에 꼬리의 끝 부분 또는 등의 대체 부위에 제공하였다(i.d.). 관절염은 일반적으로 최초 콜라겐 주사 후 12 내지 14일에 관찰되었다. 14일 이후로 하기하는 바와 같이 관절염의 발달에 대해 동물을 평가할 수 있다(관절염 평가). 2차 시도 시점에서 출발하는 예방 방식으로 처방 시간(전형적으로, 2주 내지 3주) 및 투약 빈도(매일(QD) 또는 1일 2회(BID))로 동물에 후보 치료제를 투여하였다.

관절염의 평가

양쪽 모델에서, 발 및 사지 관절에서 염증의 발달을 하기 기준에 따라 4개의 발의 평가에 관련된 점수 시스템을 사용하여 정량화하였다:

점수:

1 = 발 또는 하나의 발가락의 부종 및/또는 발적,

2 = 2개 이상의 관절에서의 부종,

3 = 2개 초과의 관절과 관련된 발의 심한 부종,

4 = 전체 발 및 발가락의 중증의 관절염.

기준치 측정을 위해 평가를 0일에 하고, 첫 징후 또는 부종시에서 다시 시작하여, 실험이 끝날 때까지 주당 3회 이하로 평가하였다. 각각의 마우스에 대한 관절염 지수는 개별 발의 4개의 점수를 더하고, 동물당 최대 점수를 16점으로 부여함으로써 수득하였다.

래트의 생체내 천식 모델

수컷 갈색-노르웨이 래트를 명반(alum)(0.2 ml) 중 OA(오브알부민)(100 μg)로 3주 동안 매주 1회(0일에, 7일에 및 14일에) i.p. 감작하였다. 21일에(최종 감작한 후 1주), 상기 래트에게 OA 에어로졸을 시도(45분 동안 1% OA)하기 0.5시간 전에 비히클 또는 화합물 제형을 피하로 매일 투여하고, 시도한지 4 또는 24시간 후에 종료하였다. 희생 시점에, 혈청 및 혈장을 각각 혈청 시험 및 PK를 위해 모든 동물로부터 수집하였다. 기관 캐뉼라를 삽입하고, 폐를 PBS로 세척하였다(3X). BAL 유체를 총 백혈구 수 및 차등(differential) 백혈구 계수에 대하여 분석하였다. 세포 중 분취량(20 내지 100 ㎕)의 총 백혈구 수를 콜터 계수기(Coulter Counter)로 측정하였다. 차등 백혈구 계수를 위해, 샘플(50 내지 200 ㎕)을 사이토스핀(Cytospin)에서 원심분리하고, 슬라이드를 디프-퀵(Diff-Quik)으로 염색하였다. 단핵구, 호산구, 호중구 및 림프구의 비율을 표준 형태학적 기준을 사용하여 광현미경 하에 계수하고, 백분율로 표현하였다. 대표적인 BTK 억제제는 대조군의 수준과 비교하여 OA 감작된 및 시도된 래트의 BAL에서 총 백혈구 수의 감소를 나타낸다.

전술된 발명은 명백함 및 이해를 목적으로 예시 및 실시예를 수단으로 하여 상세하게 기술되었다. 당업자에게는 첨부된 청구범위의 범주 내에서 변경 및 개질이 실시될 수 있다는 것이 자명할 것이다. 따라서, 상기 명세서는 예시를 의도로 한 것이며, 한정을 의도한 것이 아님이 이해되어야 한다. 따라서, 본 발명의 범주는 상기 명세서를 참조로 결정될 것이 아니라, 첨부된 청구범위가 목적하고자 하는 것의 등가물의 전체 범주와 함께, 첨부된 청구범위를 참조하여 결정되어야 할 것이다.

본원에 인용된 모든 특허, 특허 출원 및 공개 문헌은 각각의 개별 특허, 특허 출원 또는 공개 문헌이 개별적으로 언급된 것과 같은 정도로 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참고로 인용된다.

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2-[2-[2-(하이드록시메틸)-3-[1-메틸-5-[[5-(모폴린-4-카본일)피리딘-2-일]아미노]-6-옥소피리다진-3-일]페닐]-1-옥소-3,4-다이하이드로이소퀴놀린-6-일]-2-메틸프로판니트릴;
2-[8-플루오로-2-[2-(하이드록시메틸)-3-[5-[[5-(1-하이드록시-2-메틸프로판-2-일)옥시피리딘-2-일]아미노]-1-메틸-6-옥소피리다진-3-일]페닐]-1-옥소이소퀴놀린-6-일]-2-메틸프로판니트릴;
4-[2-(하이드록시메틸)-3-[1-메틸-5-[(5-메틸설폰일피리딘-2-일)아미노]-6-옥소피리다진-3-일]페닐]-8-(1-하이드록시-2-메틸프로판-2-일)-2,3-다이하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-5-온;
5-클로로-N-[2-(하이드록시메틸)-3-[1-메틸-5-[[5-(모폴린-4-카본일)피리딘-2-일]아미노]-6-옥소피리딘-3-일]페닐]-1,3-다이하이드로이소인돌-2-카복스아미드;
6-t-부틸-2-[2-(하이드록시메틸)-3-[1-메틸-5-[[5-(모폴린-4-카본일)피리딘-2-일]아미노]-6-옥소피리딘-3-일]페닐]-3,4-다이하이드로-2,7-나프티리딘-1-온;
6-t-부틸-2-[2-(하이드록시메틸)-3-[1-메틸-5-[[5-(모폴린-4-카본일)피리딘-2-일]아미노]-6-옥소피리다진-3-일]페닐]-3,4-다이하이드로-2,7-나프티리딘-1-온;
6-t-부틸-8-플루오로-2-[2-메틸-3-[1-메틸-5-[[5-(모폴린-4-카본일)피리딘-2-일]아미노]-6-옥소피리다진-3-일]페닐]프탈라진-1-온;
8-t-부틸-4-[2-(하이드록시메틸)-3-[1-메틸-5-[[5-(모폴린-4-카본일)피리딘-2-일]아미노]-6-옥소피리다진-3-일]페닐]-2,3-다이하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-5-온; 및
8-t-부틸-4-[2-(하이드록시메틸)-3-[1-메틸-5-[(5-메틸설폰일피리딘-2-일)아미노]-6-옥소피리다진-3-일]페닐]-2,3-다이하이드로-1,4-벤즈옥사제핀-5-온
으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물.
제 12 항의 화합물 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는, 염증성 또는 자가면역 질환을 치료하기 위한 약학 조성물로서, 상기 염증성 또는 자가면역 질환이 건선, 알레르기, 크론병, 과민성 대장 증후군, 쇼그렌병(Sjogren's disease), 조직 이식 거부, 이식된 장기의 초급성 거부 반응, 천식, 전신 홍반성 루푸스, 전신 홍반성 루푸스와 관련된 사구체신염, 피부근염, 다발성 경화증, 경피증, 혈관염, 자가면역 용혈성 및 혈소판 감소 상태, 굿패스쳐 증후군(Goodpasture's syndrome), 굿패스쳐 증후군과 관련된 사구체신염 또는 폐출혈, 죽상동맥경화증, 류마티스 관절염, 만성 특발성 혈소판감소성 자반증, 애디슨병, 파킨슨병, 알츠하이머병, 당뇨병, 패혈성 쇼크 및 중증 근무력증으로부터 선택되는, 약학 조성물.
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제 13 항에 있어서,
질환이 류마티스 관절염인 약학 조성물.
제 13 항에 있어서,
질환이 천식인 약학 조성물.
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