KR101757621B1 - EsHsp90.1 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 비생물적 스트레스 내성 관련 EsHsp90.1 (Elymus sibiricus L. Heat shock protein 90.1) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자 및 이를 이용하여 비생물적 스트레스에 대한 내성을 증진시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 EsHsp90.1 유전자는 고온, 염, 기근, 또는 중금속과 같은 다양한 비생물적 스트레스 환경에서 발현이 증가한다. 따라서, EsHsp90.1 유전자는 목초의 분자육종에 이용되어 비생물적 스트레스 내성이 강한 형질전환체를 개발하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

EsHsp90.1 유전자 및 이의 용도{EsHsp90.1 gene and uses thereof}

본 발명은 여러 비생물적 스트레스에 대한 내성을 부여하는 유전자에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 특정 유전자 또는 단백질을 이용하여 비생물적 스트레스에 대한 내성을 증진시키는 방법에 관한 것이다.

식물은 성장하면서 다양한 환경 스트레스에 노출되며, 이러한 환경 스트레스에 의해 식물의 수량과 품질이 현저히 저하되고 있다. 이러한 환경요인에 의한 수량저하를 방지하고 생산성을 최대한 높이기 위해서는 재해 내성 작물의 개발이 필수 불가결한 조건이다.

스트레스는 다른 생물체에 의해 일어나는 생물적 스트레스 및, 물리학적 또는 화학적 환경의 변화에 의해 일어나는 비생물적 스트레스가 있다. 환경 스트레스에 대한 식물의 적응능력을 분자수준에서 이해하고 분자육종을 통하여 환경 스트레스 조건에서도 식물의 생산성을 유지 및 향상시킬 수 있는 품종을 육성하는 것은 매우 중요한 일이며, 기존의 고전적인 육종방법에 의한 재해 내성 작물 개발의 한계를 극복할 수 있는 대안으로 대두되고 있다.

유전물질의 정보가 1차원적 폴리펩타이드를 생성하는 기작은 잘 알려져 있지만, 그 폴리펩타이드가 특정한 기능을 갖는 3차원적 구조를 형성하는 과정에 대해서는 알려진 바가 적다. 처음에 통용된 가설은 자가조립에 의해 3차원 구조가 형성된다는 것으로, 이는 각 폴리펩타이드가 자발적으로 낮은 자유에너지의 접힘 구조로 상호 변환되므로 아미노산을 암호화하는 핵산 서열의 특이성만으로도 기능적 구조의 단백질을 만드는 것이 충분하다는 것이다. 그러나 몇몇 단백질에서 조립을 도와주는 역할을 하는 단백질, 즉 분자 샤페론이 단백질의 완전한 조립에 필요하다는 것이 1980년 말에 밝혀짐으로써, 자가조립이 보편적 메카니즘이 아니며 분자 샤페론이 많은 단백질의 3차원적 구조 형성에 필요함이 알려졌다(Pahl, A. et al., Cell Stress amp; Chaperones , 2, 78-86, 1997).

분자 샤페론은 통상 열충격단백질(heat shock protein, HSP)이라고 알려져 있는데, 많은 경우 폴리펩타이드 내의 하부 도메인(sub domain) 간 또는 폴리펩타이드와 다른 분자들 간의 상호작용에 의해 부정확한 구조를 형성하는 것을 방지하는 역할을 한다. 분자 샤페론은 폴리펩타이드의 정확한 조립을 매개하지만 기능을 갖춘 단백질로의 조립이 끝나면 더 이상 그 단백질의 서브유닛이 아니므로 조립되는 단백질과는 관련없는 성분이 된다.

분자 샤페론은 비기능적인(nonfunctional) 구조를 만드는 다른 조립 경로를 저해함으로써 폴리펩타이드가 자가 조립되는 것을 돕는데, 새롭게 합성되는 폴리펩타이드 사슬의 접힘을 매개하여 단백질 기질이 더 이상 잘못 접히지 않는 구조로 형성되면 그들로부터 분리된다. 이러한 분자 샤페론은 단백질의 접힘과 조립 과정 동안 부분적으로 접힌 중간대사물에 일시적으로 결합하는 능력에 의해 특징지어 지는데, 일반적으로 완전하게 접히고 조립된 구조에는 결합하지 않으며 너무 이른 접힘과 중간대사물의 집합을 막아서 생산적인 접힘과 조립이 좀 더 효율적인 과정이 되도록 하는 역할을 한다.

이와 같이, 분자 샤페론은 광범위한 단백질들의 잘못 접힘을 방지하여 정상적인 구조의 단백질이 형성되는데 도움을 준다는 것이 확인되고 있다. 또한, 분자 샤페론에 의해 도움을 받는 대상 단백질이 생물체의 생리나 발생 과정에 중요한 역할을 할 경우 분자 샤페론은 결과적으로 생물체의 생리와 발생 과정에 중요한 영향을 미칠 것으로 예상되며, 이러한 경우의 예들이 종종 보고되고 있다(Mayer, M.P. and Bukau, B., Biol. Chem. , 379, 261-268, 1998; Waters, E.R., Lee, G.J., and Vierling, E., J. Exp. Bot. , 47, 325-338, 1996).

최근 식물에서 비생물적 스트레스에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있으며, 다양한 종류의 비생물적 스트레스 유도성 단백질, 예컨대 열충격단백질의 동정 및 기능 해석이 이루어져 이들 대부분이 분자 샤페론으로 기능하고 있음이 밝혀지고 있다(Chen et al, 1994, Biol Chem 269: 13216-13223; Vierling, 1991, Plant Mol Biol 42: 579-620; Waters et al, 1996, J Exp Bot 47: 325-338).

그 중에서도 식물 특유의 HSP인 저분자량의 HSP(small HSP)에 대한 연구가 활발히 이루어져 세포내의 다양한 기관에서 기능을 하는 small HSPs이 분리되어 졌으며(Chen et al, 1994, Biol Chem 269: 13216-13223; LaFayette et al, 1996, Plant Mol Biol 30:159-169, Lee et al, 1995, J Biol Chem 270:10432-10438; Osteryoung et al, 1994, J Biol Chem 269: 28676-28682; Vierling et al, 1988, EMBO J 7: 575-581), 이들 스트레스 내성 유전자의 도입에 따른 부분적인 고온 내성을 나타내는 형질전환식물이 보고되고 있다(Lee et al, 1996, Plant J 8: 603-612; Waters et al, 1996, J Exp Bot 47: 325-338).

비생물적 환경 스트레스는 식물에 있어서 가장 치명적인 손상을 가져오는 중요한 요인 중의 하나이다. 스트레스 하에서는 대부분의 하우스 키핑 유전자들의 발현이 정지되고 HSP 합성에 필요한 유전자 발현계가 활성화되어 다양한 분자량을 가지는 HSP가 합성된다. 이 HSP는 고온에 따른 단백질의 변성방지 및 변성된 단백질의 폴딩(folding)을 도움으로써 단백질의 비가역적인 응집(aggregation)을 방지하여 스트레스에 대한 내성을 획득하게 한다. 식물에서 스트레스에 의해 유도되는 단백질 중 가장 많은 양과 종류를 나타내는 것이 분자량 15-30 kDa의 small HSPs이다.

한국등록특허 제10-1183112호에서는 비생물적 스트레스 내성 유전자인 알팔파 유래의 Mshsp23.3 유전자가 개시되어 있다.

지구 온난화에 의해 유발된 환경 스트레스는 농업 분야에서 오랫동안 주요한 문제로 논의 되어왔다. 온도 변화, 물 결핍 및 토양 오염은 경작지 내 작물의 생산성을 현저하게 감소시켰다. 시베리언 와일드 라이(Elymus sibiricus L.)는 다년생, 캐스피토스(caespitose) 및 자가 수분하는 잡초로 북아시아가 원산지이나, 북유럽, 일본 및 북미 일부에까지 넓게 분포되어 있다. 시베리언 와일드 라이는 기근 및 저온 스트레스에 대한 내성으로 강한 환경 적응성을 보이며, 중앙아시아 및 중국 북부에 사료 자원으로 사용된다. 시베리언 와일드 라이는 강한 환경 적응성으로 인해 스트레스 내성이 우수한 사료 작물로써 사용될 가능성이 높지만, 이의 스트레스 내성을 가지는 유전자를 밝혀내고 이를 이용하여 비생물적 환경 스트레스에 대한 내성을 증진시키는 방법에 대한 연구는 아직까지 미흡한 실정이다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 다양한 비생물적 환경 스트레스에서 반응하여 내성을 증진시키는 열충격단백질(Heat shock protein) 및 이를 발현시키는 유전자를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 다양한 비생물적 환경 스트레스에서 활성을 띄는 열충격단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 상기 유전자를 형질전환하여 비생물적 환경 스트레스에 대한 내성을 증진시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 생물체의 비생물적 스트레스 저항성을 향상시키기 예의 연구 노력한 결과, 본 발명의 EsHsp90.1 유전자가 비생물적 스트레스 저항성에 관여한다는 놀라운 발견을 하여, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명에서는 시베리언 와일드 라이그래스(Siberian wild rye grass)(Elymus sibiricus L.)로부터 얻은 cDNA 라이브러리의 차별적 스크리닝(differential screening)에 의해 EsHsp90.1 cDNA 클론을 분리하였다. 클로닝된 이 유전자는 비생물적 스트레스 저항성 반응에서 발현이 증가하도록 유도되었으며, 이 유전자를 대장균 및 식물에 형질전환시켜 중금속 또는 기근 스트레스에 대한 저항성의 증가와 관련이 있음을 규명하였다.

본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 EsHsp90.1(Elymus sibiricus L. Heat shock protein 90.1) 단백질을 코딩하거나 또는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 비생물적 스트레스 반응성 및 비생물적 스트레스 내성 증진용 유전자를 제공한다. 또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 비생물적 스트레스 반응성 및 비생물적 스트레스 내성 증진용 단백질을 제공한다. 본 발명에 있어서, 상기 비생물적 스트레스는 고온, 저온, 염, 기근, 중금속, 및 산화 스트레스 등으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.

본 발명자들은 식물의 성장을 저해하는 여러 가지 비생물적 스트레스 환경에서 상기 EsHsp90.1 유전자가 어떠한 기작을 통하여 발현되어 비생물적 스트레스 저항성을 유도하는지 확인하기 위하여, 여러 가지 비생물적 스트레스 조건들을 식물체에 처리한 후 노던 블럿팅(Northern blotting)을 실시함으로써, 고온, 저온, 염, 기근, 중금속, 또는 산화 스트레스 등에서 상기 유전자 발현이 유도됨을 확인하였다. 즉, 상기와 같은 비생물적 스트레스 조건 하에서는 식물이 스트레스 환경을 극복하기 위해 상기 EsHsp90.1 유전자의 발현이 촉진되는 것을 확인하였다.

또한, 본 발명은 상기 비생물적 스트레스 반응성 유전자는 비생물적 스트레스 진단용 마커에 포함되어 사용될 수 있다. 바람직하게, 상기 마커는 비생물적 스트레스 환경에 의해 상기 비생물적 스트레스 반응성 유전자의 발현이 증가될 수 있으며, 상기 유전자의 발현의 증가는 비생물적 스트레스에 대한 내성을 향상시키는 기작이 될 수 있다.

본 발명에서, 용어, “진단용 마커”란 정상 세포와 비생물적 스트레스를 받은 세포를 구분하여 진단할 수 있는 물질을 의미한다. 상기 진단용 마커는 정상 세포에 비하여 비생물적 스트레스에 노출된 세포에서 증가양상을 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예를 들어, mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등)과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적상, 비생물적 스트레스 진단용 마커는 EsHsp90.1 유전자일 수 있으며, 이는 비생물적 스트레스에서 발현이 증가하는 유전자이다.

유의성 있는 진단 마커의 선택과 적용은 진단 결과의 신뢰도를 결정짓는다. 유의성 있는 진단 마커란, 진단하여 얻은 결과가 정확하여 타당도(validity)가 높고 반복 측정시에도 일관된 결과를 나타내도록 신뢰도(reliability)가 높은 마커를 의미한다. 본 발명의 비생물적 스트레스 진단용 마커는, 비생물적 스트레스에 의해 직접적 또는 간접적 요인으로 발현이 항상 증가하는 유전자들로 반복된 실험에서 동일한 결과를 나타내며, 발현 수준의 차이가 대조군과 비교할 때 매우 커서 잘못된 결과를 내릴 확률이 거의 없는 신뢰도가 높은 마커이다. 그러므로 본 발명의 유의성 있는 진단 마커의 발현 정도를 측정하여 얻은 결과를 토대로 진단된 결과는 타당하게 신뢰할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명의 유전자를 숙주식물에 형질전환하여 상기 유전자로부터 전사된 mRNA를 확인함으로써 숙주식물들이 비생물적 스트레스에 노출되어 있는지 여부를 진단하는 방법을 제공한다. 바람직하게, 상기 방법은 전사된 mRNA의 양이 증가하는 것을 통해 비생물적 스트레스에 노출됨을 확인할 수 있으며, 이는 예를 들어, 노던 블롯(northern blot) 등을 통해 확인할 수 있다.

또한, 본 발명은 비생물적 스트레스에서 특이적으로 발현이 증가하는 EsHsp90.1 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 비생물적 스트레스 진단용 조성물을 제공한다.

생물학적 시료 중의 유전자 발현 수준은 mRNA 또는 단백질의 양을 확인함으로써 확인할 수 있다.

본 발명에서 “mRNA 발현수준 측정”이란 비생물적 스트레스에 의한 영향을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 비생물적 스트레스 마커 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정한다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 “단백질 발현수준 측정”이란 비생물적 스트레스에 의한 영향을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 비생물적 스트레스 마커 유전자로부터 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 바람직하게는, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 구체적인 일 양태에서는, EsHsp90.1 유전자에 특이적인 프라이머 서열을 포함하는 비생물적 스트레스 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다. 본 발명의 프라이머는, 각 마커 유전자 특이적인 프라이머로 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산이다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다.

본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등), 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 본 발명의 핵산 서열은 또한 검출 가능한 시그날을 직접적으로 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 표지의 예로는 방사성 동위원소, 형광성 분자, 바이오틴 등이 있다.

또 다른 일 양태로서, 본 발명은 EsHsp90.1 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 비생물적 스트레스 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명에서, “항체”란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.

상기한 바와 같이 비생물적 스트레스에 대한 마커 단백질이 규명되었으므로, 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.

다클론 항체는 상기한 비생물적 스트레스 관련 마커 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.

단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전지영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제할 수 있다.

또한 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

본 발명의 또 다른 양태에서는, 본 발명에 따른 상기 비생물적 스트레스 진단용 조성물을 포함하는 비생물적 스트레스 진단 키트를 제공한다. 바람직하게, 상기 비생물적 스트레스 진단 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다.

일 양태로서, 상기 진단 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트일 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 각 마커 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp 의 길이이다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.

또 다른 양태로는, 바람직하게 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

또한 바람직하게는, ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. ELISA 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 EsHsp90.1 (Elymus sibiricus L. Heat shock protein 90.1) 단백질을 포함하는 비생물적 스트레스 내성 증진용 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 EsHsp90.1 단백질을 코딩하는 유전자 또는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 EsHsp90.1 유전자를 포함하는 비생물적 스트레스 내성 증진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기 비생물적 스트레스 내성 증진용 조성물은 유효성분으로서 EsHsp90.1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함한다. 상기 EsHsp90.1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 발현시킴으로써 미생물 또는 식물체의 비생물적 스트레스 내성을 증진시킬 수 있다.

본 발명에 따른 EsHsp90.1 단백질의 범위는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 비생물적 스트레스 내성을 증진시키는 활성을 의미한다.

본 발명은 또한 EsHsp90.1 단백질의 단편, 유도체 및 유사체(analogues)를 포함한다. 본원에 사용된, 용어 "단편", "유도체" 및 "유사체"는 본 발명의 EsHsp90.1 폴리펩티드와 실질적으로 같은 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 폴리펩티드를 말한다. 본 발명의 단편, 유도체 및 유사체는 (i) 하나 이상의 보존적(conservative) 또는 비보존적 아미노산 잔기(바람직하게는 보존적 아미노산 잔기)가 치환된 폴리펩티드(상기 치환된 아미노산 잔기는 유전암호에 의해 암호화될 수도, 되지 않을 수도 있다), (ii) 하나 이상의 아미노산 잔기에서 치환기(들)를 가지는 폴리펩티드, (iii) 또 다른 화합물(폴리펩티드의 반감기를 연장할 수 있는 화합물, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜)과 결합된 성숙 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드, 또는 (iv) 부가적인 아미노산 서열(예를 들면, 선도 서열, 분비 서열, 상기 폴리펩티드를 정제하는데 사용된 서열, 프로테이노젠(proteinogen) 서열 또는 융합 단백질)과 결합된 상기 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드일 수 있다. 본 발명에 정의된 상기 단편, 유도체 및 유사체는 당업자에 잘 알려져 있다.

본 발명의 상기 유전자는 서열번호 1로 표시되는 유전자 또는 EsHsp90.1 단백질을 코딩하는 DNA 또는 RNA 일 수 있다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA 또는 인위적인 합성 DNA를 포함한다. DNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. DNA는 코딩(coding) 가닥 또는 넌코딩(non-coding) 가닥일 수 있다.

서열번호 2로 표시되는 성숙(mature) 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 오직 성숙 폴리펩티드만을 암호화하는 코딩 서열; 성숙 폴리펩티드 및 다양한 부가적인 코딩 서열을 암호화하는 서열; 성숙 폴리펩티드(및 임의의 부가적인 코딩 서열) 및 넌코딩 서열을 암호화하는 서열을 포함한다.

용어 "폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드"는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 부가적인 코딩 및/또는 넌코딩 서열을 더 포함하는 폴리뉴클레오티드를 말한다.

또한, 본 발명은 상기와 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 단편, 유사체, 및 유도체를 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 상기 폴리뉴클레오티드의 변이체에 관한 것이다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 자연적으로 발생하는 대립유전자 변이체 또는 비자연적으로 발생하는 변이체일 수 있다. 상기 뉴클레오티드 변이체는 치환 변이체, 결실 변이체, 및 삽입 변이체를 포함한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 대립유전자 변이체는 폴리뉴클레오티드의 대안이며, 이는 하나 이상의 치환, 결실 또는 삽입된 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 변이체에 의해 암호화된 폴리펩티드에서 실질적인 기능 변화를 초래하지는 않는다.

또한, 본 발명은 상기 기재된 서열번호 1의 염기서열 및 상기 기재된 서열번호 1의 염기서열과 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 80%의 동일성을 가지는 서열과 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 특히, 스트린전트 조건하에 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명에서, "스트린전트 조건"은 (1) 0.2 × SSC, 0.1% SDS, 60℃와 같은 더 낮은 이온강도 및 더 높은 온도하에서의 혼성화 및 세척; 또는 (2) 50%(v/v) 포름아미드, 0.1% 소혈청/0.1% Ficoll 및 42℃ 등과 같은 변성제의 존재하에 혼성화; 또는 (3) 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 가지는 단지 2개의 서열 사이에서 발생하는 혼성화를 말한다. 게다가, 혼성화가 가능한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드의 생물학적 기능 및 활성은 서열번호 2로 표시되는 성숙 폴리펩티드의 생물학적 기능 및 활성과 동일하다.

바람직하게는 본 발명의 EsHsp90.1 유전자는 시베리언 와일드 라이그래스(Siberian wild rye grass)(Elymus sibiricus L.)로부터 유래된 것이다. 그러나, 본 발명의 구현예는 시베리언 와일드 라이그래스 EsHsp90.1 유전자와 높은 상동성(예를 들면, 60% 이상, 즉 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 심지어 98%의 서열 동일성)을 갖고 다른 식물로부터 유래한 다른 유전자를 또한 포함한다. 서열정렬 방법, 및 서열 동일성 또는 상동성을 결정하기 위한 수단(예를 들면, BLAST)은 당업계에 주지되어 있다.

또한, 본 발명은 상기 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 유전자 또는 상기 EsHsp90.1 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 본 발명에서 사용된 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

본 발명에서, EsHsp90.1 단백질을 암호화하는 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 재조합 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.

EsHsp90.1 단백질-암호화 DNA 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(유럽특허등록 제0116718호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 유럽특허등록 제0120516호 및 미국특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다. 바람직하게는, 상기 재조합 벡터는 pKBS1-1 벡터, pBI101 벡터, 또는 pCAMBIA 벡터 등일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 예를 들어, 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS, SWPA2, 또는 히스톤 프로모터 등 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 예를 들어 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 또는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 본 발명의 벡터를 원핵세포에 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예를 들어, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포(예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법, 하나한 방법(Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

식물의 형질전환은 유전자를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 또는 조직 배양기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(유럽특허 제0301316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 유럽공개특허 제120516호 및 미국특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 세포에 형질전환시켜 EsHsp90.1 유전자 발현을 증가시키는(바람직하게는, 과발현하는) 단계를 포함하는 비생물적 스트레스에 대한 내성을 증진시키는 방법을 제공한다.

상기 형질전환 대상은 그 종류에 특별한 제한이 있는 것이 아니라 통상적인 미생물 또는 식물일 수 있다. 상기 형질전환 대상 식물로는 목초, 잔디 및 사료작물 식물로서 오차드그라스, 톨 페스큐, 페레니얼 라이그라스, 크리핑 벤트그라스, 티모시, 이탈리안 라이그라스, 켄터키블루그라스, 레드톱, 리드카나리그라스, 버뮤다그래스, 테프그라스, 또는 바히아그래스 등의 화본과 목초; 알팔파, 버즈풋 트레포일, 화이트크로버, 또는 레드크로버 등의 두과 목초; 또는 옥수수, 수수, 보리, 호밀 등의 사료작물 등에 형질전환될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 비생물적 스트레스는 고온, 염, 기근 또는 중금속 스트레스 등이 있을 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게 기근 또는 중금속 스트레스일 수 있다. 또한, 상기 중금속은 바람직하게는 비소일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 EsHsp90.1 유전자를 과발현시킨 비생물적 스트레스에 대한 내성이 증진된 형질전환체를 제공한다. 상기 형질전환체는 그 종류에 특별한 제한이 있는 것이 아니라 통상적인 미생물 또는 식물일 수 있다.

일 실시예에서, 본 발명자들은 Dane K. Fisher and Mark J. Guiltinan. "Plant Molecular Biology Reporter" pp. 278-289, 1995에 의해 검토된 아그로박테리움 유전자 전달 시스템에 기초하여, 모델 식물에 EsHsp90.1 유전자를 형질전환시키기 위해 CaMV 35S 프로모터의 조절 하에서 식물 형질전환 벡터 pCAMBIA3300-EsHsp90.1 시스템을 사용하였다. EsHsp90.1 유전자가 과발현된 형질전환체를 수득하여 이의 중금속(비소) 또는 기근 내성을 분석한 결과, 야생형에 비해 형질전환된 식물의 중금속 또는 기근 내성이 증가하는 특징을 확인할 수 있었다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 비생물적 스트레스에 대한 내성이 증진된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 예를 들면, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefiaciens)에 의해 매개될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환된 식물세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

형질전환된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다(Handbook of Plant Cell Culture, 1-5권, 1983-1989 Momillan, N.Y.).

본 발명의 시베리언 와일드 라이그래스(Siberian wild rye grass)(Elymus sibiricus L.) 유래 EsHsp90.1 유전자는 고온, 염, 기근, 또는 중금속과 같은 다양한 비생물적 스트레스 환경에서 발현이 증가한다. 따라서, EsHsp90.1 유전자는 목초의 분자육종에 이용되어 비생물적 스트레스 내성이 강한 형질전환 식물체를 개발하는데 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 EsHsp90.1 유전자의 분자유전학적 계통도 분석 결과를 나타낸다.
도 2는 식물체에 고온, 저온, 염, 기근, 중금속(구리, 카드뮴, 비소), 메틸비올로겐, 및 과산화수소 스트레스를 가할 때 EsHsp90.1 RNA의 발현량을 노던 블롯으로 측정한 결과이다.
도 3은 재조합 EsHsp90.1 단백질의 발현 및 정제의 실험 방법에 관한 모식도를 나타낸다.
도 4는 재조합 EsHsp90.1 단백질의 발현 및 정제에 관한 12% SDS-PAGE 결과를 나타낸다.
도 5는 실시예 5에서 사용된 pCAMBIA3300-Multi 벡터를 나타낸다.
도 6 및 도 7은 식물 형질전환 벡터 pCAMBIA3300-EsHsp90.1 시스템을 나타낸다.
도 8은 담배 식물체에 형질전환으로 벡터 및 EsHsp90.1 단백질을 발현시켜 비소(As 200μM) 스트레스에 대한 내성을 비교 분석한 사진이다.
도 9는 담배 식물체에서 형질전환으로 벡터 및 EsHsp90.1 단백질을 발현시켜 기근(15% PEG) 스트레스에 대한 내성을 비교 분석한 사진이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1: EsHsp90.1 유전자의 염기서열 및 아미노산 서열 분석

본 실시예에서 사용된 시베리언 와일드 라이그래스의 종자는 울란바토르, 몽골(Ulaanbaatar, Mongolia)로부터 획득하였다. 시베리언 와일드 라이그래스의 식물 재료는 국립축산과학원의 초지사료과에서 생장시켰다. 종자를 원예 배양 배지(horiculture nursery medium, Biomedia)를 포함하는 화분에 심었으며, 400μmol m^-2s^-1의 빛의 세기로 14시간 동안 25℃의 생장상(growth chamber)에서 생장시켰다.

4주령의 유식물을 생장상 내에서 42℃의 고온 하에 6시간 동안 노출시켰으며, 대조군은 25℃ 상온에 노출시켰다. 각각 처리 이후, 잎을 수확하였고 액체질소에 의해 냉동시켰다. 전체 RNA는 TRIzol 시약 (Qiagen, CA, USA)을 사용하여 처리군 및 대조군 식물의 잎으로부터 분리하였다. GeneFishing^TM DEG 키트(Seegene)를 사용하여, EsHsp90.1의 2103 bp의 부분 cDNA 절편을 ACP-based PCR을 사용하여 분리하였다.

핵산, 아미노산 서열, 및 보존된 도메인을 NCBI-BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 및 Bioedit (version 7.2.3) 소프트웨어 (Hall, 1999)를 사용하여 분석하였다. EsHsp90.1의 등전점(pI) 및 분자량을 ExPASy(http://web.expasy.org/compute_pi/)의 컴퓨터 pI/Mw 툴을 사용하여 계산하였다. 컴퓨터 pI/Mw 툴을 사용하여, 계산된 등전점(pI) 및 분자량은 각각 4.95 및 80446.31 Da로 예상된다.

EsHsp90.1의 염기 서열(서열번호 1) 및 아미노산 서열(서열번호 2)을 하기 표 1에 나타내었다.

서열번호 1

TGCCGCCCCTGGAGGACGATGCCGGTGAGAGCAAGATGGAGGAAGTCGACTGA

서열번호 2

MASETETFAFQAEINQLLSLIINTFYSNKEIFLRELISNASDALDKIRFESLTDKSKLDAQPELFIHIIPDKATNTLTLIDSGIGMTKSDLVNNLGTIARSGTKDFMEALAAGADVSMIGQFGVGFYSAYLVAERVVVTSKHNDDEQYVWESQAGGSFTVTRDTTGEPLGRGTKITLYLKDDQLEYLEERRLKDLVKKHSEFISYPISLWTEKTTEKEISDDEDEDEKKDTEEGKVEEIDEEKEEKEKKKKKIKEVSHEWNLINKQKPIWMRKPEEITKDEYAAFYKSLTNDWEEHLAVKHFSVEGQLEFKAVLFVPKRAPFDLFDTRKKLNNIKLYVRRVFIMDNCEELIPEWLSFVKGIVDSEDLPLNISRETLQQNKILKVIRKNLVKKCIELFFEIAENKEDYNKFYEAFSKNLKLGIHEDSQNRTKIAELLRYHSTKSGDELTSLKDYVTRMKEGQNEIYYITGESKKAVENSPFLEKLKKKGYEVIYMVDAIDEYAIGQLKEFEGKKLVSATKEGLKLDESEDEKKKQEELKEKFEGLCKVIKEVLGDKVEKVIVSDRVVDSPCCLVTGEYGWTANMERIMKAQALRDSSMAGYMSSKKTMEINPENAIMDELRKRADADKNDKSVKDLVMLLFETSLLTSGFSLEDPNTFGTRIHRMLKLGLSIDEDDEAPENDTDMPPLEDDAGESKMEEVD

실시예 2: EsHsp90.1 유전자의 분자유전학적 계통도 분석

EsHsp90.1이 어느 클래스에 속하는지 밝히기 위하여 아라비답시스 small Hsps와 계통 분석을 실시하였다. 아라비답시스 내 small Hsps의 아미노산 서열 및 다른 식물 종으로부터 EsHsp90.1의 상동체를 NCBI-BLAST 내 blastp를 사용하여 유사도 검색 후 GenBank^TM 데이터베이스로부터 검색하였다. 다중서열정렬은 ClustalX2(Larkin et al., 2007) 및 GeneDoc(version 2.7) 소프트웨어(Nicholas and Nicholas, 1997)를 사용하여 수행하였다. 계통도를 EMBL-EBI(http://www.ebi.ac.uk/Tools/phylogeny/clustalw2_phylogeny/) 상의 ClustalW2 프로그램으로부터 알고리즘을 사용하여 구성하였다.

도 1에 나타난 결과를 볼 때, EsHsp90.1은 아라비답시스의 세포질 클래스 I small Hsp들과 서열 상동성을 보였으며, 특히 AtHsp90.1과 가장 높은 서열 상동성을 보였다.

실시예 3: 비생물적 스트레스 처리에 따른 EsHsp90.1 유전자의 발현 조사

EsHsp90.1의 발현 분석을 위해, 4주령의 시베리안 와일드 라이그라스 유식물에 각각 고온(42℃), 저온(4℃), 염(NaCl 250mM), 기근(drought), 구리(CuSO₄, 250μM), 카드뮴(CdCl₂, 250μM), 비소(Na₂HAsO₄.7H₂O, 250μM), 메틸 비올로겐(MV, 1 mM) 또는 과산화수소(H₂O₂, 10 mM)를 처리하였다. 고온 또는 저온 처리를 위해, 유식물을 42℃ 또는 4℃의 온도 조절된 생장상으로 옮겼다. 염 또는 중금속 처리를 위해, 유식물을 상기 농도의 염 또는 중금속을 포함하는 물로 관수하였다. 메틸비올로겐 및 과산화수소 처리를 위해, 상기 농도의 MV 또는 과산화수소를 포함하는 물 위에 잎 조각을 띄웠다. 스트레스 처리된 식물을 수확하고, 액체 질소로 냉각시켜 사용 전까지 -80℃에서 보관했다.

노던 블롯 분석(Northern blot analysis)

다양한 비생물적 스트레스에 반응하는 EsHsp90.1 유전자의 전사 발현을 조사하기 위해, 전체 RNA를 TRIzol 시약(Qiagen, CA, USA)으로 각 스트레스 처리된 잎으로부터 분리하였다. 추출된 전체 RNA(10g)를 포름알데하이드를 포함하는 1.2% 아가로스 겔에 전기영동하여 분획한 후 Hybond-N⁺ 나일론 막(Amersham, Little Chalfont, UK)에 전이하였다. 블롯을 PCR 증폭된 EsHsp90.1 유전자인 ³²P-표지된 프로브(³²P-labeled probe)로 하룻밤 혼성화하고, 노던 블롯 분석을 수행하였다.

도 2에 나타낸 바와 같이, EsHsp90.1 mRNA의 양은 고온 스트레스 환경에서 급속하고 방대하게 증가하였고, 처리 후 12시간까지 높은 수준으로 유지되었다. 저온 스트레스 환경에서 EsHsp90.1 mRNA의 양은 처리 직후 증가하였으나 점차 감소하였으며, 염 스트레스 환경에서는 처리 후 점차적으로 36시간까지 증가하였으며, 기근 스트레스 환경에서는 물 공급 중단 후 6시간 까지 발현이 증가한 후 조금 감소하였다. 또한, 구리 또는 카드뮴 처리 하에서는 EsHsp90.1의 발현이 증가하였으나, 비소 처리 하에서는 특별한 증가 양상을 보이지 않았다. 산화 스트레스를 일으키는 메틸비올로겐(MV) 및 과산화수소는 EsHsp90.1 mRNA의 확연한 증가를 유도하였다. 이러한 결과를 볼때, EsHsp90.1 유전자는 고온, 저온, 염, 기근, 중금속, 또는 MV, 과산화수소와 같은 산화성 스트레스에 의해 발현이 증가하여, 식물체의 비생물적 스트레스 내성에 중요한 역할을 하는 것을 확인하였다.

실시예 4: 재조합 EsHsp90.1 단백질의 발현 및 정제

재조합 EsHsp90.1 단백질의 발현 및 정제의 실험 방법에 관한 모식도를 도 3에 나타내었다. 재조합 EsHsp90.1 단백질의 발현을 실험하기 위해, N-말단에 글루타치온 S-트랜스퍼레이즈(glutathione S-transferase, GST) 및 C-말단에 6x-히스티딘-태그(6x-His tag)를 사용하고, T7 프로모터와 함께 EsHsp90.1을 pET-41a 플라스미드에에 결합시켰다. 플라스미드를 Rosetta2(DE3)pLysS 세포로 형질전환시키고, 플라스미드를 포함하는 단일 콜로니를 37℃에서 하룻밤 생장시켰다. 배양물을 카나마이신과 함께 새로운 LB 액체배지에 접종시키고, OD600이 0.6-0.8에 이르기까지 배양했다. 재조합 단백질을 0.2 mM 아이소프로필-1-티오-β-_D-갈락토피라노사이드(isopropyl-1-thio-β-_D-galactopyranoside, IPTG) 첨가하여 유도했고 이후 세포를 4시간 동안 배양했다. 원심분리에 의한 수확 이후, 세포를 인산 버퍼 식염수(phosphate buffered saline, PBS)에 재현탁 및 사용 전까지 -80 °C에서 냉각시켰다. 해동 후, 재현탁된 세포를 1% 트리톤 X-100의 존재 하에 20분 동안 얼음 상에 배양시키고, 초음파분해로 분해하였다. 원심분리 후, 상청액을 글루타치온 세파로스 4B 친화성 칼럼에 처리했다. GST 융합된 EsHsp90.1 재조합 단백질을 10mM 감소된 글루타치온으로 용리하고, 이후 40mM HEPES (pH 7.5) 버퍼에 대하여 투석했다.

재조합 EsHsp90.1 단백질의 발현 조건을 실험하기 위해, EsHsp90.1을 포함하는 세포를 0 nM, 0.2 mM 및 1 mM의 IPTG 농도 및 IPTG 유도 이후 18℃에서 16시간, 26℃에서 6시간, 및 37℃에서 4시간의 온도 및 시간 조건에서 배양했다. 하기 표 2에 세포 배양 결과를 나타내었다.

샘플		1/4 diluted A600 (96-well plate)	세포 밀도 (cells/ml)	1×109 Cells(ml)
온도	IPTG(mM)
18℃	0	0.459	2.11E+09	0.47
	0.2	0.398	1.80E+09	0.55
	1	0.398	1.80E+09	0.55
26℃	0	0.352	1.57E+09	0.64
	0.2	0.342	1.52E+09	0.66
	1	0.336	1.48E+09	0.67
37℃	0	0.267	1.13E+09	0.88
	0.2	0.276	1.18E+09	0.85
	1	0.308	1.34E+09	0.75
Blank		0.046	-	-

도 4에 12% SDS-PAGE 결과를 나타내었으며, 재조합 EsHsp90.1 단백질은 0.2 mM 및 1 mM의 IPTG 농도로 유도한 이후 18℃에서 16시간, 26℃에서 6시간, 및 37℃에서 4시간의 조건에서 각각 발현되었다. 또한, 12% SDS-PAGE 결과를 볼 때, 재조합 EsHsp90.1 단백질은 예상되는 크기인 114.7 kDa 주변에 나타났다. IPTG 유도한 경우에는 전체 분획에서 단백질이 높게 발현되는 반면, IPTG 유도하지 않은 경우에는(0 mM) 검출되지 않았다. 재조합 EsHsp90.1 단백질은 상청액(S) 및 펠렛(P) 분획 모두에서 유사하게 발현되었다. 특히, 세포를 0.2 mM의 IPTG로 유도한 이후 26℃에서 6시간 동안 배양한 경우에 실험 결과가 가장 바람직하게 나타났으며, 상기 조건이 최적의 발현 조건임을 확인하였다.

실시예 5: 모델 식물(담배)을 이용한 EsHsp90 .1 단백질 발현에 따른 중금속 (비소) 또는 기근에 대한 내성 측정

본 실시예에서 사용된 형질전환 기술은 Dane K. Fisher and Mark J. Guiltinan. "Plant Molecular Biology Reporter" pp. 278-289, 1995에 의해 검토된 아그로박테리움 유전자 전달 시스템에 기초한다. 모델 식물에 EsHsp90.1 유전자를 형질전환시키기 위해 CaMV 35S 프로모터의 조절 하에서 식물 형질전환 벡터 pCAMBIA3300-EsHsp90.1 시스템을 사용하였다. 도 5에 pCAMBIA3300-Multi 벡터를 나타내었으며, 도 6 및 도 7에 식물 형질전환 벡터 pCAMBIA3300-EsHsp90.1 시스템을 나타내었다.

EsHsp90.1이 형질전환된 담배 식물체(Tg-1 및 Tg-2)의 비소에 대한 내성을 분석하기 위하여, 200μM의 비소(As)가 첨가된 MS 배지에 야생형(WT) 및 형질전환된 담배 식물체(Tg-1 및 Tg-2)를 발아시켜 2주 동안 배양한 후 식물체의 생장을 조사하여, 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타난 결과를 볼 때, 비소를 처리한 야생형(WT) 식물체의 생장은 크게 억제된 반면, 형질전환된 담배 식물체(Tg-1 및 Tg-2)는 야생형(WT)에 비해 현저하게 생장된 것을 확인하였다. 또한, 형질전환된 담배 식물체는 비소 처리 하에서도 엽록소의 양 및 생중량이 야생형에 비해 현저하게 높은 것으로 나타났고, 뿌리 길이도 야생형에 비해 긴 것으로 나타났다.

또한, EsHsp90.1이 형질전환된 담배 식물체(Tg-1 및 Tg-2)의 기근에 대한 내성을 분석하기 위하여, 15% PEG 조건의 MS 배지에 야생형(WT) 및 형질전환된 담배 식물체(Tg-1 및 Tg-2)를 발아시켜 2주 동안 배양한 후 식물체의 생장을 조사하여, 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9에 나타난 결과를 볼 때, 기근 스트레스 하에 야생형(WT) 식물체의 생장은 크게 억제된 반면, 형질전환된 담배 식물체(Tg-1 및 Tg-2)는 야생형(WT)에 비해 현저하게 생장된 것을 확인하였다. 또한, 형질전환된 담배 식물체는 기근 스트레스 하에서도 엽록소의 양이 야생형에 비해 현저하게 높은 것으로 나타났고, 생중량이 더 높으며, 뿌리 길이도 야생형에 비해 긴 것으로 나타났다.

이러한 결과로부터 형질전환된 EsHsp90.1 단백질의 발현이 식물체의 비소 또는 기근 스트레스에 대한 내성을 증진시키는 것을 확인하였다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Eshsp90.1 gene and uses thereof <130> P15-235 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 2103 <212> DNA <213> Siberian wildrye (Elymus sibiricus) cytosolic Hsp90.1 (EsHsp90.1) <400> 1 atggcttcgg agaccgagac cttcgccttc caggccgaga tcaaccagct gctctcgctc 60 atcatcaaca ccttctactc caacaaggag atcttcctcc gcgagctcat ctccaacgcc 120 tctgatgcgt tggacaagat caggtttgag agcctgactg acaagagcaa gctggatgct 180 cagccagagc tgttcatcca cattatccct gacaaggcca cgaacacgct cacgcttatt 240 gacagtggta ttggtatgac caagtcagac ctcgtgaaca accttggtac cattgcaagg 300 tctggcacca aggatttcat ggaggcactg gctgctggtg ccgatgtgtc catgattggt 360 cagtttggtg tcggtttcta ctctgcttac cttgttgccg agagagtcgt tgtgaccagc 420 aagcacaacg atgatgagca gtatgtgtgg gagtcccagg ctggtggctc ctttactgtg 480 acacgtgata ctactggaga gccccttgga aggggtacta agatcaccct ctacctcaag 540 gacgatcagt tggagtacct tgaggagcgt cgccttaagg atctggtgaa gaaacactcc 600 gagttcatca gctatcccat ctctctctgg acggagaaga ccactgagaa ggaaatttct 660 gacgatgaag atgaggatga gaagaaggat actgaggagg gcaaggttga ggaaattgat 720 gaagagaagg aagaaaagga gaagaaaaag aagaagatca aggaggtttc tcacgagtgg 780 aacctgatca acaagcaaaa gcccatctgg atgaggaagc cagaggagat caccaaggat 840 gagtatgctg ccttctacaa gagcctgaca aacgactggg aggagcacct tgccgtcaag 900 cacttctctg tggaggggca gcttgagttc aaggccgtcc tcttcgttcc aaagagggcc 960 ccctttgacc tctttgacac caggaagaag ctcaacaaca tcaagctcta tgtgcgccgt 1020 gtcttcatca tggacaactg tgaggagctg atcccagagt ggctgagctt tgtcaagggc 1080 attgttgact ctgaggatct tcccctcaac atctcccgtg agactctcca gcagaacaag 1140 atcctgaagg tcatccggaa gaaccttgtc aagaagtgca ttgagctctt ctttgagatt 1200 gctgagaaca aggaggacta caacaagttc tacgaggcct tctccaagaa cctcaagctt 1260 ggcatccacg aggactccca gaacaggacc aagattgctg agcttctgag gtaccactcc 1320 accaagagtg gcgatgagct gacgagcctt aaggactatg tgaccaggat gaaggaggga 1380 cagaacgaga tctactacat cactggtgag agcaagaagg ctgtggagaa ctctcccttc 1440 cttgagaagc tgaagaagaa gggctacgag gtcatctaca tggttgacgc cattgatgag 1500 tatgctattg gtcagctcaa ggagtttgag ggcaagaagc ttgtttctgc caccaaggag 1560 ggtctgaagc ttgatgagag tgaagacgag aagaagaagc aggaggagct caaggagaag 1620 tttgaggggc tgtgcaaggt tatcaaggag gtgctaggtg acaaggtgga gaaggtcatt 1680 gtctctgacc gtgttgtgga ctccccgtgc tgtctggtga ctggcgagta tgggtggacc 1740 gccaacatgg agaggatcat gaaggcccag gccttaaggg actcgagcat ggctggctac 1800 atgtcgagca agaagaccat ggagatcaac cctgagaatg ccatcatgga cgagctccgc 1860 aagcgcgctg acgctgacaa gaacgacaag tcggtcaagg acctggttat gctgctcttc 1920 gagacctccc tgctcacctc tggcttcagc ctggaggacc ccaacacctt cggcaccagg 1980 atccaccgca tgctcaagct tggcctgagc attgatgagg acgacgaggc gcctgagaat 2040 gacaccgaca tgccgcccct ggaggacgat gccggtgaga gcaagatgga ggaagtcgac 2100 tga 2103 <210> 2 <211> 700 <212> PRT <213> Siberian wildrye (Elymus sibiricus) cytosolic Hsp90.1 (EsHsp90.1) <400> 2 Met Ala Ser Glu Thr Glu Thr Phe Ala Phe Gln Ala Glu Ile Asn Gln 1 5 10 15 Leu Leu Ser Leu Ile Ile Asn Thr Phe Tyr Ser Asn Lys Glu Ile Phe 20 25 30 Leu Arg Glu Leu Ile Ser Asn Ala Ser Asp Ala Leu Asp Lys Ile Arg 35 40 45 Phe Glu Ser Leu Thr Asp Lys Ser Lys Leu Asp Ala Gln Pro Glu Leu 50 55 60 Phe Ile His Ile Ile Pro Asp Lys Ala Thr Asn Thr Leu Thr Leu Ile 65 70 75 80 Asp Ser Gly Ile Gly Met Thr Lys Ser Asp Leu Val Asn Asn Leu Gly 85 90 95 Thr Ile Ala Arg Ser Gly Thr Lys Asp Phe Met Glu Ala Leu Ala Ala 100 105 110 Gly Ala Asp Val Ser Met Ile Gly Gln Phe Gly Val Gly Phe Tyr Ser 115 120 125 Ala Tyr Leu Val Ala Glu Arg Val Val Val Thr Ser Lys His Asn Asp 130 135 140 Asp Glu Gln Tyr Val Trp Glu Ser Gln Ala Gly Gly Ser Phe Thr Val 145 150 155 160 Thr Arg Asp Thr Thr Gly Glu Pro Leu Gly Arg Gly Thr Lys Ile Thr 165 170 175 Leu Tyr Leu Lys Asp Asp Gln Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Arg Arg Leu 180 185 190 Lys Asp Leu Val Lys Lys His Ser Glu Phe Ile Ser Tyr Pro Ile Ser 195 200 205 Leu Trp Thr Glu Lys Thr Thr Glu Lys Glu Ile Ser Asp Asp Glu Asp 210 215 220 Glu Asp Glu Lys Lys Asp Thr Glu Glu Gly Lys Val Glu Glu Ile Asp 225 230 235 240 Glu Glu Lys Glu Glu Lys Glu Lys Lys Lys Lys Lys Ile Lys Glu Val 245 250 255 Ser His Glu Trp Asn Leu Ile Asn Lys Gln Lys Pro Ile Trp Met Arg 260 265 270 Lys Pro Glu Glu Ile Thr Lys Asp Glu Tyr Ala Ala Phe Tyr Lys Ser 275 280 285 Leu Thr Asn Asp Trp Glu Glu His Leu Ala Val Lys His Phe Ser Val 290 295 300 Glu Gly Gln Leu Glu Phe Lys Ala Val Leu Phe Val Pro Lys Arg Ala 305 310 315 320 Pro Phe Asp Leu Phe Asp Thr Arg Lys Lys Leu Asn Asn Ile Lys Leu 325 330 335 Tyr Val Arg Arg Val Phe Ile Met Asp Asn Cys Glu Glu Leu Ile Pro 340 345 350 Glu Trp Leu Ser Phe Val Lys Gly Ile Val Asp Ser Glu Asp Leu Pro 355 360 365 Leu Asn Ile Ser Arg Glu Thr Leu Gln Gln Asn Lys Ile Leu Lys Val 370 375 380 Ile Arg Lys Asn Leu Val Lys Lys Cys Ile Glu Leu Phe Phe Glu Ile 385 390 395 400 Ala Glu Asn Lys Glu Asp Tyr Asn Lys Phe Tyr Glu Ala Phe Ser Lys 405 410 415 Asn Leu Lys Leu Gly Ile His Glu Asp Ser Gln Asn Arg Thr Lys Ile 420 425 430 Ala Glu Leu Leu Arg Tyr His Ser Thr Lys Ser Gly Asp Glu Leu Thr 435 440 445 Ser Leu Lys Asp Tyr Val Thr Arg Met Lys Glu Gly Gln Asn Glu Ile 450 455 460 Tyr Tyr Ile Thr Gly Glu Ser Lys Lys Ala Val Glu Asn Ser Pro Phe 465 470 475 480 Leu Glu Lys Leu Lys Lys Lys Gly Tyr Glu Val Ile Tyr Met Val Asp 485 490 495 Ala Ile Asp Glu Tyr Ala Ile Gly Gln Leu Lys Glu Phe Glu Gly Lys 500 505 510 Lys Leu Val Ser Ala Thr Lys Glu Gly Leu Lys Leu Asp Glu Ser Glu 515 520 525 Asp Glu Lys Lys Lys Gln Glu Glu Leu Lys Glu Lys Phe Glu Gly Leu 530 535 540 Cys Lys Val Ile Lys Glu Val Leu Gly Asp Lys Val Glu Lys Val Ile 545 550 555 560 Val Ser Asp Arg Val Val Asp Ser Pro Cys Cys Leu Val Thr Gly Glu 565 570 575 Tyr Gly Trp Thr Ala Asn Met Glu Arg Ile Met Lys Ala Gln Ala Leu 580 585 590 Arg Asp Ser Ser Met Ala Gly Tyr Met Ser Ser Lys Lys Thr Met Glu 595 600 605 Ile Asn Pro Glu Asn Ala Ile Met Asp Glu Leu Arg Lys Arg Ala Asp 610 615 620 Ala Asp Lys Asn Asp Lys Ser Val Lys Asp Leu Val Met Leu Leu Phe 625 630 635 640 Glu Thr Ser Leu Leu Thr Ser Gly Phe Ser Leu Glu Asp Pro Asn Thr 645 650 655 Phe Gly Thr Arg Ile His Arg Met Leu Lys Leu Gly Leu Ser Ile Asp 660 665 670 Glu Asp Asp Glu Ala Pro Glu Asn Asp Thr Asp Met Pro Pro Leu Glu 675 680 685 Asp Asp Ala Gly Glu Ser Lys Met Glu Glu Val Asp 690 695 700

Claims (13)

1. 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 EsHsp90.1(Elymus sibiricus L. Heat shock protein 90.1) 단백질을 코딩하거나 또는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 비생물적 스트레스 반응성 및 비생물적 스트레스 내성 증진용 유전자.
2. 제1항에 있어서, 상기 비생물적 스트레스는 고온, 저온, 염, 기근, 중금속, 및 산화 스트레스로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 비생물적 스트레스 반응성 및 비생물적 스트레스 내성 증진용 유전자.
3. 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 비생물적 스트레스 반응성 및 비생물적 스트레스 내성 증진용 단백질.
4. 제1항의 유전자를 숙주식물에 형질전환하여 상기 유전자로부터 전사된 mRNA를 확인함으로써 숙주식물들이 비생물적 스트레스에 노출되어 있는지 여부를 진단하는 방법.
5. 비생물적 스트레스에서 특이적으로 발현이 증가하는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 EsHsp90.1 유전자의 mRNA 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 비생물적 스트레스 진단용 조성물.
6. 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 EsHsp90.1(Elymus sibiricus L. Heat shock protein 90.1) 단백질을 포함하는 비생물적 스트레스 내성 증진용 조성물.
7. 제6항의 단백질을 코딩하는 유전자 또는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 유전자를 포함하는 비생물적 스트레스 내성 증진용 조성물.
8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 비생물적 스트레스는 중금속 또는 기근 스트레스인 것을 특징으로 하는 비생물적 스트레스 내성 증진용 조성물.
9. 제6항의 단백질을 코딩하는 유전자 또는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
10. 제9항의 재조합 벡터로 형질전환된 비생물적 스트레스 내성이 증진된 숙주세포.
11. 제9항의 재조합 벡터를 세포에 형질전환시켜 EsHsp90.1 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 비생물적 스트레스 내성을 증진시키는 방법.
12. 제9항의 재조합 벡터를 세포에 형질전환시켜 EsHsp90.1 유전자를 과발현시킨 비생물적 스트레스 내성이 증진된 형질전환체.
13. 제9항의 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 비생물적 스트레스에 대한 내성이 증진된 형질전환 식물체의 제조 방법.

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