KR101748137B1 - 헤마글루티닌과 사이알릭산을 함유하고 있는 단소포체를 이용한 인플루엔자 바이러스 융합 기작의 세포외 측정 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 헤마글루티닌(Hemagglutinin)을 함유하고 있는 단소포체와 사이알릭산(Sialic acid)을 함유하고 있는 단소포체를 이용하여 세포 외에서 인플루엔자 바이러스의 융합을 측정하는 방법으로, 더욱 상세하게는 헤마글루티닌 및 형광공여물질을 함유하고 있는 단소포체의 제작을 통해 인플루엔자 바이러스를 모사하고, 사이알릭산 및 형광수용물질을 함유하고 있는 단소포체의 제작을 통해 숙주세포의 세포막을 모사한다. 그 후 두 단소포체 간의 융합을 세포외에서 형광공명에너지전달 (fluorescence resonance energy transfer) 현상을 이용하여 FRET값을 추적함으로서 인플루엔자 바이러스의 융합과정을 단분자 수준에서 모니터링하고 헤마글루티닌의 작용을 방해하는 물질을 도메인별로 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 헤마글루티닌과 결합하는 물질의 존재를 세포외에서 측정하는 방법을 사용하여, 헤마글루티닌(hemagglutinin)의 특정 부위와 결합하는 미량 물질을 스크리닝하는 작업을 수행할 수 있다.
약물과 특정 단백질이 결합된 상태인 복합체 분석은 약물의 기능의 분석 및 개선에 필수적인 작업이라서, 이러한 작업을 위해 단백질과 약물의 결정 구조 파악 장비, 자기핵공명분석 장비와 같은 고가의 분석 장비를 사용해야 하는데, 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌을 타겟으로 하는 약물의 경우 본 발명의 방법을 이용하여 간단하고 경제적으로 약물이 헤마글루티닌의 어느 부위에 작용하는지 분석할 수 있는 효과가 있다.

Description

헤마글루티닌과 사이알릭산을 함유하고 있는 단소포체를 이용한 인플루엔자 바이러스 융합 기작의 세포외 측정 방법 {Method of cell free assay for measurement of influenza virus fusion using hemagglutinin and sialic acid containing single vesicle}

본 발명은 헤마글루티닌(Hemagglutinin)을 함유하고 있는 단소포체와 사이알릭산(Sialic acid)을 함유하고 있는 단소포체를 이용하여 세포 외에서 인플루엔자 바이러스의 융합을 측정하는 방법으로, 더욱 상세하게는 헤마글루티닌 및 형광공여물질을 함유하고 있는 단소포체의 제작을 통해 인플루엔자 바이러스를 모사하고, 사이알릭산 및 형광수용물질을 함유하고 있는 단소포체의 제작을 통해 숙주세포의 세포막을 모사한다. 그 후 두 단소포체 간의 융합을 세포외에서 형광공명에너지전달 (fluorescence resonance energy transfer) 현상을 이용하여 FRET값을 추적함으로서 인플루엔자 바이러스의 융합과정을 단분자 수준에서 모니터링하고 헤마글루티닌의 작용을 방해하는 물질을 헤마글루티닌 도메인별로 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

인플루엔자 바이러스가 동물세포의 late endosome과의 융합을 통해 세포질 내로 바이러스 복제에 필요한 유전 물질 및 단백질을 배출하는 기작은 바이러스가 개체를 복제하는데 있어 매우 필수적인 과정이다. 이 과정은 인플루엔자 바이러스의 주요 막 단백질 인 헤마글루티닌(hemagglutinin)에 의해 수행되는 것으로 알려져 있으며,이 헤마글루티닌의 저해를 통해 인플루엔자로 인한 질병의 치료제를 개발할 수있기 때문에 주목받아 왔다.

인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌(hemagglutinin)은 동물세포에서 단일 펩타이드(single peptide)로 발현된 후, 특정 프로테아제(protease)에 의해 잘려지게 된다. 이때 HA1와 HA2 domain으로 분리되고 N-terminal HA1부분과 C-terminal HA2부분은 이황화결합으로 연결되어 있다. 이와 같은 헤마글루티닌(hemagglutinin)은 인플루엔자 바이러스 세포막에서 동형의 trimer로 구성되어 있는 것으로 알려져 있다. 또한 HA1 domain은 동물세포의 late endosome에 존재하는 사이알릭산(sialic acid)과의 결합에 중요한 역할을 하고 있으며 HA2는 late endosome과의 융합 역할을 하고 있다.

따라서 인플루엔자 바이러스의 융합 기작을 연구하기 위한 기초로서 헤마글루티닌(hemagglutinin)을 이용한 다양한 실험기법들이 개발 되었다. 대형 단일층 소포체(large unilamellar vesicle)와 형광 염료로 염색된 인플루엔자 바이러스간의 지질혼합(lipid mixing) 과정을 모니터링 함으로써 인플루엔자 바이러스의 융합이 연구(Ruigrok, R. W., et al., "Conformational changes in the hemagglutinin of influenza virus which accompany heat-induced fusion of virus with liposomes." Virology 155(2): 484-497, 1986)되었고 이를 통해 헤마글루티닌(hemagglutinin)의 구조적 형상변화(conformational change)가 인플루엔자 바이러스의 융합을 유도한다는 사실이 밝혀졌다. 또한 형광 염료로 염색된 인플루엔자 바이러스와 유리 기판위에 코팅된 지지막(supported membrane)과의 융합과정을 형광 현미경으로 관찰하는 기법도 개발(Wessels, L., et al., "Rapid membrane fusion of individual virus particles with supported lipid bilayers." Biophys J 93(2): 526-538, 2007)되었다. 그리고 인플루엔자 바이러스의 세포막과 바이러스 안쪽을 서로 다른 형광염료로 염색한 후, 지지막(supported membrane)과 융합되는 과정을 관찰하는 기법도 보고되었다.

최근에는 실제 인플루엔자 바이러스를 직접 사용하는 것이 아닌 헤마글루티닌(hemagglutinin)을 이용하여 인플루엔자 바이러스의 융합기작을 규명하려는 연구(Kim, C. S., et al., "The final conformation of the complete ectodomain of the HA2 subunit of influenza hemagglutinin can by itself drive low pH-dependent fusion." J Biol Chem 286(15): 13226-13234, 2011)들이 시작되었지만, 위의 방법들은 측정 방법의 한계가 있다. 첫 번째로 실제 인플루엔자를 다루기 위해서는 Biosafety Level 2로 승인받은 연구시설이 필수적으로 요구되는데, 이와 같은 승인을 받은 연구시설은 숫자가 적고 갖추려면 많은 비용이 들게 된다. 두 번째는 동물세포의 endosome을 모사하기 위해서 사용된 지지막(supported membrane)은 이미징측면에서 매우 유동적(dynamic)이고 불균질적(heterogeneous)이어서 이미징의 정교함이 떨어지는 단점을 지니고 있다. 세 번째는 대부분의 지질혼합(lipid mixing)기법은 ensemble assay로서 손쉽게 이용할 수 있는 장점이 있지만 단분자 레벨에서 일어나는 사건(event)을 반영하지 못하고 모든 사건(event)들의 평균만을 반영하기 때문에 초기에 일어나는 사건(event)의 정보를 전혀 반영하지 못하는 단점을 가지고 있다. 마지막 문제점으로 대장균(Escherichia coli)의 발현 시스템(expression system)으로부터 얻어지는 재조합(recombinant) 헤마글루티닌(hemagglutinin)은 post-translational modification process가 없는 원핵세포로부터 만들어지기 때문에 진핵세포인 실제 동물세포에서 일어나는 post-translational modification을 거친 헤마글루티닌(hemagglutinin)과 구조 및 활성에서 차이를 보이게 되므로, 실제 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌과 차이가 있게 된다.

따라서 위와 같은 단점을 극복하고 분자수준에서 보다 정확한 인플루엔자 바이러스의 융합과정을 세포외에서 구현하고, 헤마글루티닌 저해제를 스크리닝하기 위해서, 본 발명자들은 Baculovirus expression system을 이용한 재조합(recombinant) 헤마글루티닌(hemagglutinin)을 사용하였고 supported membrane의 약점을 극복하고자 single vesicle fusion assay 방법을 이용하여 단일 vesicle 단위의 사건(event)들을 모니터링함으로서 정밀하게 인플루엔자 바이러스의 융합과정을 세포외에서 단분자 수준으로 모사하고, 헤마글루티닌 저해제를 스크리닝할 수 있다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 헤마글루티닌과 형광공여물질을 함유하고 있는 단소포체와 사이알릭산 및 형광수용물질을 함유하고 있는 단소포체의 융합과정을 세포외에서 모사하고 관찰함으로써 인플루엔자 바이러스 융합을 세포외에서 단분자 수준으로 모사하여 세포외에서 항인플루엔자 바이러스 물질을 탐색할 수 있는 헤마글루티닌 저해제 스크리닝 방법을 제공함에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 측정 대상 시료를 포함하는 용액을, 헤마글루티닌(Hemagglutinin)과 형광공여물질을 함유하는 단소포체(single vesicle)를 포함하는 용액과 혼합하여 인큐베이션 하는 단계; (b) 상기 (a)단계에서 얻어진 혼합용액을, 강글리오사이드 추출물(Ganglioside extract)과 형광수용물질을 함유하는 단소포체를 포함하는 용액과 혼합하여 인큐베이션하는 단계; (c) 상기 (b)단계 동안 혼합용액의 형광 변화를 측정하여 데이터를 얻는 단계; 및 (d) 상기 (c)단계에서 획득한 형광 변화 데이터로부터, 측정 대상 시료가 헤마글루티닌 저해 물질인지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 인플루엔자 바이러스 융합 기작의 세포외 측정 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 (a) 측정 대상 시료를 포함하는 2종류 이상 농도의 용액을, 헤마글루티닌 분자의 HA1 도메인과 HA2 도메인 모두를 함유하는 단소포체(single vesicle)를 포함하는 용액과 각각 혼합하여 인큐베이션 하는 단계; (b) 상기 (a)단계에서 얻어진 각각의 혼합용액을, 강글리오사이드 추출물(Ganglioside extract)과 형광수용물질을 함유하는 단소포체를 포함하는 용액과 혼합하여 인큐베이션하는 단계; (c) 상기 (b)단계 동안 각각의 혼합용액의 형광 데이터를 얻는 단계; 및 (d) 상기 (c)단계에서 획득한 형광 데이터로부터, 측정 대상 시료가 헤마글루티닌 중에서 어느 부위에 작용하는지를 확인하는 단계를 포함하는 인플루엔자 바이러스 융합 기작의 세포외 측정 방법을 제공한다.

상기 (d)단계에서 상기 측정 대상 시료가 헤마글루티닌 중에서 어느 부위에 작용하는지를 확인하는 것은, (1) 상기 각각의 혼합용액의 형광 데이터에서 각각의 데이터 분포를 얻는 단계; (2) 상기 각각의 데이터 분포로부터, 상기 측정 대상 시료의 농도의 변화에 따라 상관관계를 가지고 변화하는 분포의 부분을 확인하는 단계; (3) 상기 상관관계를 가지고 변화하는 분포의 부분의 의미를, 헤마글루티닌을 포함하는 소포체의 융합 모델에 따라 해석하는 단계; 및 (4) 상기 (3)단계의 해석에 따라 측정 대상 시료가 작용하는 헤마글루티닌의 부위를 결정하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따르면, 헤마글루티닌과 결합하는 물질의 존재를 세포외에서 측정하는 방법을 사용하여, 헤마글루티닌(hemagglutinin)의 특정 부위와 결합하는 미량 물질을 스크리닝하는 작업을 수행할 수 있다.

약물과 특정 단백질이 결합된 상태인 복합체 분석은 약물의 기능의 분석 및 개선에 필수적인 작업이라서, 이러한 작업을 위해 단백질과 약물의 결정 구조 파악 장비, 자기핵공명분석 장비와 같은 고가의 분석 장비를 사용해야 하는데, 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌을 타겟으로 하는 약물의 경우 본 발명의 방법을 이용하여 간단하고 경제적으로 약물이 헤마글루티닌의 어느 부위에 작용하는지 분석할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 전반사 형광 현미경(Total internal reflection fluorescence microscope)에서 헤마글루티닌 및 형광공여물질을 함유한 단소포체와 사이알릭산 및 형광수용물질을 함유하고 있는 단소포체와의 융합 양상을 측정하는 방법에 대한 모식도.
도 2는 헤마글루티닌 및 형광공여물질을 함유한 단소포체와 사이알릭산 및 형광수용물질을 함유하고 있는 단소포체와의 융합 과정 중 FRET값과 형광 강도의 변화도.
도 3은 헤마글루티닌 저해물질이 두 단소포체 간의 융합을 방해하는 과정을 나타낸 모식도.
도 4는 pH 5.5와 pH 7.5에서 두 단소포체간의 융합정도를 전반사 형광 현미경을 통해 이미징을 한 형광 사진 비교도.
도 5는 pH 5.5와 pH 7.5에서 두 단소포체 융합과정에서 각 단소포체의 상태를 FRET값을 기준으로 비교한 비교도.
도 6은 헤마글루티닌의 HA2 domain의 구조적 변화를 저해하는 물질로 알려진 TBHQ를, A) 처리하지 않거나, B) 0.5μM 농도로 처리하거나, C) 1.0μM 농도로 처리하여 FRET값을 기준으로 비교한 비교도.
도 7은 TBHQ를, 처리하지 않거나, 0.5μM 농도로 처리하거나, 1.0μM 농도로 처리하여, FRET값이 0.4에서 0.8에 해당하는 population이 농도의존적으로 감소하는지 여부를 확인한 그래프.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

일 관점에서, 본 발명은 (a) 측정 대상 시료를 포함하는 용액을, 헤마글루티닌(Hemagglutinin)과 형광공여물질을 함유하는 단소포체(single vesicle)를 포함하는 용액과 혼합하여 인큐베이션 하는 단계; (b) 상기 (a)단계에서 얻어진 혼합용액을, 강글리오사이드 추출물(Ganglioside extract)과 형광수용물질을 함유하는 단소포체를 포함하는 용액과 혼합하여 인큐베이션하는 단계; (c) 상기 (b)단계 동안 혼합용액의 형광 변화를 측정하여 데이터를 얻는 단계; 및 (d) 상기 (c)단계에서 획득한 형광 변화 데이터로부터, 측정 대상 시료가 헤마글루티닌 저해 물질인지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 인플루엔자 바이러스 융합 기작의 세포외 측정 방법을 제공한다.

본 발명 상기 (a) 단계에 있어서, 헤마글루티닌은 HA1 도메인과 HA2 도메인 중 어느 하나 또는 모두를 포함하는 분자일 수 있다.

본 발명 상기 (a) 단계에 있어서, 헤마글루티닌은 바쿨로바이러스 발현 시스템(Baculovirus expression system)을 통해 재조합한(recombinant) 헤마글루티닌인 것이 바람직하다

본 발명 상기 (a) 단계와 상기 (b) 단계에 있어서, (a)단계의 형광공여물질과 (b)단계의 형광수용물질은 10nm 이내 거리로 접근할 경우 서로 반응하여 형광을 방출하는 물질인 것이 바람직하다.

본 발명 상기 (c) 단계에 있어서, 형광 변화를 측정하는 것은 현미경을 이용하며, 현미경은 전반사 형광 현미경(Total internal reflection fluorescence microscope)이 바람직하다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 (a) 측정 대상 시료를 포함하는 2종류 이상 농도의 용액을, 헤마글루티닌 분자의 HA1 도메인과 HA2 도메인 모두를 함유하는 단소포체(single vesicle)를 포함하는 용액과 각각 혼합하여 인큐베이션 하는 단계; (b) 상기 (a)단계에서 얻어진 각각의 혼합용액을, 강글리오사이드 추출물(Ganglioside extract)과 형광수용물질을 함유하는 단소포체를 포함하는 용액과 혼합하여 인큐베이션하는 단계; (c) 상기 (b)단계 동안 각각의 혼합용액의 형광 데이터를 얻는 단계; 및 (d) 상기 (c)단계에서 획득한 형광 데이터로부터, 측정 대상 시료가 헤마글루티닌 중에서 어느 부위에 작용하는지를 확인하는 단계를 포함하는 인플루엔자 바이러스 융합 기작의 세포외 측정 방법을 제공한다.

상기 (d)단계에서 상기 측정 대상 시료가 헤마글루티닌 중에서 어느 부위에 작용하는지를 확인하는 것은, (1) 상기 각각의 혼합용액의 형광 데이터에서 각각의 데이터 분포를 얻는 단계; (2) 상기 각각의 데이터 분포로부터, 상기 측정 대상 시료의 농도의 변화에 따라 상관관계를 가지고 변화하는 분포의 부분을 확인하는 단계; (3) 상기 상관관계를 가지고 변화하는 분포의 부분의 의미를, 헤마글루티닌을 포함하는 소포체의 융합 모델에 따라 해석하는 단계; 및 (4) 상기 (3)단계의 해석에 따라 측정 대상 시료가 작용하는 헤마글루티닌의 부위를 결정하는 단계를 포함할 수 있다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 헤마글루티닌과 형광공여물질을 함유한 단소포체를 포함하는 헤마글루티닌 저해 물질 측정용 조성물을 제공한다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 강글리오사이드 추출물과 형광수용물질을 함유하는 단소포체가 뉴트라비딘(Neutravidin)을 통해 PEG와 바이오틴-PEG로 코팅된 수정 슬라이드 기판에 고정된 헤마글루티닌 저해 물질 측정용 키트를 제공한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 헤마글루티닌과 사이알릭산을 함유한 단소포체의 융합과 측정

(1) 단소포체의 준비

헤마글루티닌 및 형광공여물질을 함유하고 있는 단소포체의 준비과정은 다음과 같다. 지질성분 1,2dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE), 콜레스테롤, 1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine percholate; DiIC18(3) (DiI, 형광공여물질)가 35:33:30:2 mol%가 되도록 깨끗이 세척된 유리병에 첨가한다. 그 후 vacuum dryer에 넣고 2시간 동안 건조를 한다. 건조 후, 1% n-octyl-β-glucopyranoside (OG)가 첨가된 융합버퍼 (25 mM HEPES, 100 mM 포타슘 클로라이드, 5% 글리세롤, pH 7.4)로 녹인다. 헤마글루티닌은 녹인 지질용액의 농도에 1/250 혹은 1/500 mol%가 되도록 첨가하고 4℃에서 1시간 교반한다. 그 후, 1% OG농도가 임계 마이셀 농도 (critical micelle concentration) 이하로 희석이 되도록 융합버퍼를 첨가하고 헤마글루티닌 및 지질성분 용액과 섞는다. 임계 마이셀 농도 (critical micelle concentration)으로 희석된 용액은 희석튜브 (12 kDa cut-off)에 옮기고 튜브를 융합버퍼 1L가 담긴 비이커에 띄운 후, 깨끗이 세척된 Bio-beads SM-2 2g을 첨가한다. 그 후 magnetic bar를 이용하여 12시간동안 융합버퍼를 교반하면서 용액내의 OG를 제거한다. 그 후 희석튜브 내에 있는 헤마글루티닌 및 DiI (형광공여물질)가 함유된 단소포체 용액을 새로운 1.5 ml 플라스틱 튜브에 옮기고 4℃에서 보관한다.

사이알릭산 및 형광수용물질을 함유하고 있는 단소포체의 준비과정은 다음과 같다. 지질성분 DOPC, DOPE, 콜레스테롤, 1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindodicarbocyanine percholate; DiIC18(5) (DiD, 형광수용물질), 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) sodium salt (Biotin-DPPE), 그리고 총 ganglioside extract (사이알릭산 주성분)가 35:32.8:30:2:0.1:0.1 mol%가 되도록 깨끗이 세척된 유리병에 첨가한다. 그 후 vacuum dryer에 넣고 2시간 동안 건조를 한다. 건조 후, 1% OG가 첨가된 융합버퍼 (25 mM HEPES, 100 mM 포타슘 클로라이드, 5% glycerol, pH 7.4)로 녹인다. 그 후, 1% OG농도가 임계 마이셀 농도 (critical micelle concentration) 이하로 희석이 되도록 융합버퍼를 첨가하고 지질성분 용액과 섞는다. 임계 마이셀 농도 (critical micelle concentration) 이하로 희석된 용액은 희석튜브 (12 kDa cut-off)에 옮기고 튜브를 융합버퍼 1L가 담긴 비이커에 띄운 후, 깨끗이 세척된 Bio-beads SM-2 2g을 첨가한다. 그 후 magnetic bar를 이용하여 12시간동안 융합버퍼를 교반하면서 용액내의 OG를 제거한다. 그 후 희석튜브 내에 있는 사이알릭산과 DiD (형광수용물질)가 함유된 단소포체 용액을 새로운 1.5 ml 플라스틱 튜브에 옮기고 4℃에서 보관한다.

(2) 단소포체의 고정

사이알릭산 및 형광수용물질을 함유하고 있는 단소포체를 고정화하는 수정 슬라이드 및 유리 커버 슬라이드의 제작은 다음과 같다. 첫 번째, 수정 슬라이드에 다이아몬드 드릴 팁 및 드릴을 이용해서 짧은 쪽을 기준으로 아래 위로 2개의 구멍을 뚫고, 총 4 세트를 만든다. 두 번째, 수정 슬라이드 (quartz slide) 및 유리 커버 슬라이드 (glass cover slide)를 깨끗이 세척하기 위해서 Piranha solution (황산:과산화수소=1:3)에서 30분을 반응시키고 3차 증류수로 깨끗이 세척을 한다. 세 번째, 수정 슬라이드에 메톡시폴리에틸렌글리콜 및 바이오틴-폴리에틸렌글리콜로 코팅하기 위해서 수정 슬라이드를 메탄올 150 ml, 아세트산 7.5 ml, 그리고 N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilane (amino silane) 1.5 ml이 함유된 용액에 5분간 반응을 시키고 sonic bath에서 1분 30초간 반응을 시키고 다시 5분간 반응을 시킨다. 네 번째, 메탄올로 세척을 하고 다시 3차 증류수로 깨끗이 세척을 한 후 건조한다. 다섯 번째, 세척된 유리커버 슬라이드도 건조한다. 여섯 번째, 건조된 수정 슬라이드 위에 메톡시폴리에틸렌글리콜와 바이오틴-폴리에틸렌글리콜 혼합용액 65 μl (바이오틴-폴리에틸렌글리콜 0.4 mg, 메톡시폴리에틸렌글리콜 16 mg을 0.1 M 소디윰 바이카보네이트 solution 65 μl에 섞는다)을 떨어뜨리고 유리커버 스라이드를 위에 기포가 생기지 않도록 덮는다. 일곱 번째, 12시간동안 습도가 90%이상 유지가 되는 공간에서 반응 후, 수정 슬라이드과 유리커버 슬라이드를 분리하고 3차 증류수로 깨끗이 세척을 한 후 건조한다. 여덟 번째, 양면 테이프를 자르고 수정 슬라이드의 구멍사이에 붙임으로서 채널을 4개로 만든다. 아홉 번째, 그 위에 유리커버 슬라이드를 덮고 수정 슬라이드와 유리커버 슬라이드 사이를 에폭시 접착제를 이용해서 밀폐시킨다.

사이알릭산과 형광수용물질을 함유하고 있는 단소포체를 메톡시폴리에틸렌글리콜와 바이오틴-폴리에틸렌글리콜로 코팅된 수정 슬라이드에 고정화하는 방법은 다음과 같다. 첫 번째, T50 버퍼 (10 mM Tris, 50 mM 소디윰 클로라이드, pH 8.0)를 를 이용하여 채널을 2번 세척을 한다. 두 번째, 뉴트라비딘 용액 (0.1 mg Neutravidin /T50 버퍼) 100 μl를 채널에 주입 후 5분간 반응시킨다. 세 번째, 남아있는 뉴트라비딘을 제거하기 위해서 융합버퍼로 2번 세척을 한다. 네 번째, 단소포체 용액을 융합버퍼 (25 mM HEPES, 100 mM 포타슘 클로라이드, 5% 글리세롤, pH 7.4)를 이용하여 희석을 하고 희석용액 100 μl를 채널을 통해 주입한 후 5분간 인큐베이션을 한다. 다섯 번째, 남아있는 단소포체를 제거하기 위해서 융합버퍼로 세척을 한다.

(3) 헤마글루티닌 함유 단소포체와 사이알릭산 함유 단소포체 간 융합

헤마글루티닌 및 형광공여물질을 함유하고 있는 단소포체와 사이알릭산 및 형광수용물질과의 융합을 측정하는 방법은 다음과 같다. 첫 번재, 사이알릭산 및 형광수용물질을 함유하고 있는 단소포체가 고정화되어 있는 채널에 헤마글루티닌 및 형광공여물질을 함유하고 있는 단소포체 용액을 적당량을 주입한다. 두 번째, 적당시간동안 반응 후 융합버퍼를 이용하여 남아있는 헤마글루티닌 및 형광공여물질을 함유하고 있는 단소포체를 제거한다. 세 번째, 두 단소포체의 반응이 종료된 슬라이드를 전반사 형광 현미경의 샘플 스테이지에 올리고 두 단소포체의 형광세기를 이미징한다. 이미징과정에서 두 단소포체는 도 1과 같은 모습으로 융합이 이루어 진다. 네 번째, 두 단소포체의 형광세기를 이용하여 FRET값을 도출하고 도 2에서 보는 바와 같은 FRET 값이 변화에 근거하여 두 단소포체 간의 융합 정도를 분석한다.

실시예 2. 헤마글루티닌 저해 물질 스크리닝

(1) 단소포체의 준비

헤마글루티닌 저해제를 포함하고 있는 물질 스크리닝 방법은 다음과 같다. 헤마글루티닌 및 형광공여물질을 함유하고 있는 단소포체의 제작으로 시작된다. 지질성분 DOPC, DOPE, 콜레스테롤, DiI (형광공여물질)가 35:33:30:2 mol%가 되도록 깨끗이 세척된 유리병에 첨가한다. 그 후 vacuum dryer에 넣고 2시간 동안 건조를 한다. 건조 후, 1% OG가 첨가된 융합버퍼 (25 mM HEPES, 100 mM 포타슘 클로라이드, 5% 클리세롤, pH 7.4)로 녹인다. 헤마글루티닌은 녹인 지질용액의 농도에 1/250 혹은 1/500 mol%가 되도록 첨가하고 4℃에서 1시간 교반한다. 그 후, 1% OG농도가 임계 마이셀 농도 (critical micelle concentration)이하로 희석이 되도록 융합버퍼를 첨가하고 신속하게 헤마글루티닌 및 지질성분 용액과 섞는다. 임계 마이셀 농도 (critical micelle concentration)이하로 희석된 용액은 희석튜브 (12 kDa cut-off)에 옮기고 튜브를 융합버퍼 1L가 담긴 비이커에 띄운 후, 깨끗이 세척된 Bio-beads SM-2 2g을 첨가한다. 그 후 magnetic bar를 이용하여 12시간동안 융합버퍼를 교반하면서 용액내의 OG를 제거한다. 그 후 희석튜브 내에 있는 헤마글루티닌 및 DiI (형광공여물질)가 함유된 단소포체 용액을 새로운 1.5 ml 플라스틱 튜브에 옮기고 4℃에서 보관한다.

사이알릭산과 형광수용물질을 함유하고 있는 단소포체의 제작은 다음과 같다. 지질성분 DOPC, DOPE, 콜레스테롤, DiD (형광수용물질), Biotin cap DPPE, 그리고 total ganglioside extract (사이알릭산 주성분)가 35:32.8:30:2:0.1:0.1 mol%가 되도록 깨끗이 세척된 유리병에 첨가한다. 그 후 vacuum dryer에 넣고 2시간 동안 건조를 한다. 건조 후, 1% OG가 첨가된 융합버퍼 (25 mM HEPES, 100 mM 포타슘 클로라이드, 5% 글리세롤, pH 7.4)로 녹인다. 그 후, 1% OG농도가 임계 마이셀 농도 (critical micelle concentration)이하로 희석이 되도록 융합버퍼를 첨가하고 지질성분 용액과 섞는다. 임계 마이셀 농도 (critical micelle concentration) 이하로 희석된 용액은 희석튜브 (12 kDa cut-off)에 옮기고 튜브를 융합버퍼 1L가 담긴 비이커에 띄운 후, 깨끗이 세척된 Bio-beads SM-2 2g을 첨가한다. 그 후 magnetic bar를 이용하여 12시간동안 융합버퍼를 교반하면서 용액내의 OG를 제거한다. 그 후 희석튜브 내에 있는 사이알릭산과 DiD (형광수용물질)가 함유된 단소포체 용액을 새로운 1.5 ml 플라스틱 튜브에 옮기고 4℃에서 보관한다.

(2) 단소포체의 고정

사이알릭산과 형광수용물질을 함유하고 있는 단소체를 고정화하는 수정 슬라이드 및 유리 커버 슬라이드의 제작은 다음과 같다. 첫 번째 ,수정 슬라이드에 다이아몬드 드릴 팁 및 드릴을 이용해서 짧은 쪽을 기준으로 아래 위로 2개의 구멍을 뚫고, 총 4 세트를 만든다. 두 번째, 수정 슬라이드 (quartz slide) 및 유리 커버 슬라이드 (glass cover slide)를 깨끗이 세척하기 위해서 Piranha solution (황산:과산화수소=1:3)에서 30분을 반응시키고 3차 증류수로 깨끗이 세척을 한다. 세 번째, 수정 슬라이드에 메톡시폴리에틸렌글리콜과 바이오틴-폴리에틸렌글리콜로 코팅하기 위해서 수정 슬라이드를 메탄올 150 ml, 아세트산 7.5 ml, 그리고 1.5 ml amino silane이 함유된 용액에 5분간 반응을 시키고 sonic bath에서 1분 30초간 반응을 시키고 다시 5분간 반응을 시킨다. 네 번째, 메탄올로 세척을 하고 다시 3차 증류수로 깨끗이 세척을 한 후 건조한다. 다섯 번째, 세척된 유리커버 슬라이드도 건조한다. 여섯 번째, 건조된 수정 슬라이드 위에 메톡시폴리에틸렌글리콜과 바이오틴-폴리에틸렌글리콜 혼합용액 65 μl (바이오틴-폴리에틸렌글리콜 0.4 mg, 메톡시폴리에틸렌글리콜 16 mg을 65 μl of 0.1 M 소디윰 바이카보네이트 용액 65 μl에 섞는다)을 떨어뜨리고 유리커버 슬라이드를 위에 기포가 생기지 않도록 덮는다. 일곱 번째, 12시간동안 습도가 90%이상 유지가 되는 공간에서 반응 후, 수정 슬라이드과 유리커버 슬라이드를 분리하고 3차 증류수로 깨끗이 세척을 한 후 건조한다. 여덟 번째, 양면 테이프를 자르고 수정 슬라이드의 구멍사이에 붙임으로서 채널을 4개로 만든다. 아홉 번째, 그 위에 유리커버 슬라이드를 덮고 수정 슬라이드와 유리커버 슬라이드 사이를 에폭시 접착제를 이용해서 밀폐시킨다.

사이알릭산과 형광수용물질을 함유하고 있는 단소포체를 메톡시폴리에틸렌글리콜과 바이오틴-폴리에틸렌글리콜로 코팅된 수정 슬라이드에 고정화하는 방법은 다음과 같다. 첫 번째, T50 버퍼 (10 mM Tris, 50 mM 소디윰 클로라이드, pH 8.0)를 를 이용하여 채널을 2번 세척을 한다. 두 번째, 뉴트라비딘 용액 (0.1 mg Neutravidin/T50 버퍼) 100 μl를 채널에 주입 후 5분간 반응시킨다. 세 번째, 남아있는 뉴트라비딘을 제거하기 위해서 융합버퍼로 2번 세척을 한다. 네 번째, 단소포체 용액을 융합버퍼 (25 mM HEPES, 100 mM 포타슘 클로라이드, 5% 글리세롤, pH 7.4)를 이용하여 희석을 하고 희석용액 100 μl를 채널을 통해 주입한 후 5분간 인큐베이션을 한다. 다섯 번째, 남아있는 단소포체를 제거하기 위해서 융합버퍼로 세척을 한다.

(3) 헤마글루티닌 저해물질 처리 후 단소포체 간 융합과 분석

헤마글루티닌 저해물질을 함유하고 있는 물질에 의한 헤마글루티닌 및 형광공여물질을 함유하고 있는 단소포체와 사이알릭산 및 형광수용물질과의 융합 저해정도를 측정하는 방법은 다음과 같다. 첫 번째, 사이알릭산 및 형광수용물질을 함유하고 있는 단소포체가 고정화되어 있는 채널에 헤마글루티닌 및 형광공여물질을 함유하고 있는 단소포체 용액 및 헤마글루티닌 저해물질을 함유하고 있는물질을 적당량 주입한다. 두 번째, 적당시간동안 반응 후 융합버퍼를 이용하여 남아있는 헤마글루티닌 및 형광공여물질을 함유하고 있는 단소포체 및 처리물질를 제거한다. 세 번째, 두 단소포체의 반응이 종료된 슬라이드를 전반사 형광 현미경의 샘플 스테이지에 올리고 두 단소포체의 형광세기를 이미징한다. 네 번째, 두 단소포체의 형광세기를 이용하여 FRET값을 도출하고 물질 처리전의 FRET값과 비교함으로서 도 3과 같은 모습으로 처리물질에 의한 두 단소포체간의 융합이 저해되는 정도를 분석한다.

실시예 3. 헤마글루티닌과 사이알릭산을 함유한 단소포체의 융합 양상과 pH에 따른 변화 측정

(1) 단소포체 간 융합과 다른 pH에서 보이는 형광 강도 차이 측정

사이알릭산과 DiD (형광수여물질)이 포함된 단소포체를 메톡시폴리에틸렌글리콜과 바이오틴-폴리에틸렌글리콜로 코팅되어 있는 표면에 뉴트라비딘을 이용하여 고정화하였다. 그 후 pH 5.5와 pH 7.5로 맞춘 상태의 헤마글루티닌과 DiI (형광공여물질)을 함유하고 있는 단소포체 용액을 주입하고 5분간 반응을 시켰다. 반응 완료 후 융합버퍼를 이용하여 완전히 세척 후 전반사 형광 현미경에 올려서 두 단소포체의 형광 강도를 이미징하였다. 도 4에 나타난 바와 같이, pH 5.5와 pH 7.5에서 형광공여채널과 형광수용채널에 탐지된 단소포체의 개수 및 형광 강도를 측정하였다. 그 결과 pH 5.5에서는 pH 7.5에 비해 많은 수로 단소포체가 탐지되었으며, 각각에 대한 형광 강도가 측정되었다. 이는 헤마글루티닌의 저해 조건 pH인 pH 7.5에 비해 헤마글루티닌의 정상 작용 pH인 pH 5.5에서 헤마글루티닌이 활성화되었고 사이알릭산과 DiD가 포함된 단소포체와의 결합력 및 빈도수가 증가되었다는 것을 보여주고 있다.

(2) 다른 pH에서 보이는 형광 강도의 통계적 분포 차이

실시예 3의 (1)과 같은 방법으로 10번 반복 측정하여, 결과를 도출하였다. 도 5에 나타난 것과 같이, pH 7.5에서 두 단소포체의 형광 강도를 이용한 FRET값(

)의 대부분이 0.15에서 0.3사이에 머물고 있었으며 이것은 도 2를 바탕으로 해석을 하면 대부분의 상태는 단소포체가 단순히 결합되어 있는 것으로 분석할 수 있다. 반면 pH 5.5에서는 FRET값의 대부분이 0.3-0.6 값을 가졌으며, 0.6이상이 되는 population도 관측이 되었다. 도 2를 바탕으로 해석을 하면 단소포체의 상태가 단순한 결합을 넘어 헤마글루티닌에 의해 완전히 융합이 이루어지는 것으로 분석할 수 있다. 따라서 본 실시예를 바탕으로 헤마글루티닌을 함유하고 있는 단소포체를 이용하여 인플루엔자 바이러스의 융합과정을 세포외에서 단분자 수준에서 관측할 수 있다는 것을 보여주고 있으며, 또한 pH의 차이를 통해 헤마글루티닌의 저해작용을 구현했음을 알 수 있다. 결국 이러한 정밀한 단소포체 융합과정의 세포외 단분자 수준 측정 방법을 통해 헤마글루티닌 저해 물질의 존재를 측정할 수 있다.

실시예 4. 헤마글루티닌 저해물질 TBHQ에 의한 헤마글루티닌과 사이알릭산을 함유한 단소포체의 융합 양상 변화 측정

(1) 다른 농도의 TBHQ를 처리하였을 때 보이는 단소포체 간 융합의 형광 강도 차이 측정

사이알릭산과 DiD (형광수여물질)이 포함된 단소포체를 메톡시폴리에틸렌글리콜과 바이오틴-폴리에틸렌글리콜로 코팅되어 있는 표면에 뉴트라비딘을 이용하여 고정화하였다. 그리고 나서, 헤마글루티닌의 HA2 domain의 구조적 변화를 저해하는 역할을 하는 것으로 알려져 있는 TBHQ(Tert-butylHydroquinone)를 0.5μM, 1.0μM의 농도가 되도록 헤마글루티닌과 DiI (형광공여물질)을 함유하고 있는 단소포체 용액에 넣고, 이 TBHQ가 포함된 헤마글루티닌과 DiI 함유 용액을 고정화된 사이알릭산과 DiD이 포함된 단소포체에 주입하고서 5분간 반응을 시켰다. 반응 완료 후 융합버퍼를 이용하여 완전히 세척 후 전반사 형광 현미경에 올려서 두 단소포체의 형광 강도를 이미징하였다.

< Tert-butylHydroquinone (TBHQ)의 구조식 >

(2) 다른 농도의 TBHQ에서 보이는 형광 강도의 통계적 분포 차이로부터 헤마글루티닌 작용 부위 분석

실시예 4의 (1)과 같은 방법으로 10번 반복 측정하여, 결과를 도출하였다. 도 6에 나타난 것과 같이, B)의 경우인 TBHQ 0.5 μM와 (C)의 경우인 TBHQ 1 μM로 처리된 군을 A)의 경우와 같이 TBHQ를 처리하지 않은 군과 비교하면, FRET값이 0.4에서 0.8에 해당하는 population의 수가 급격히 감소하는 것을 확인할 수 있었으며(도 7 참조), 이것은 도 3을 바탕으로 해석을 하면 대부분의 상태는 HA2 domain의 구조적 변화로 인해 단소포체들이 Fusion되지 못한 것으로 분석할 수 있다. 그리고 이러한 현상은 TBHQ의 농도에 비례하는 것을 알 수 있다.

따라서 본 실시예에서 볼 수 있는 원리를 이용하여, 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌과 결합하여 저해하는 물질이 어느 부위에 작용하는지를 알 수 있어서, 세포외에서 단분자 수준으로 경제적으로 관측할 수 있다는 것을 보여주고 있다.

이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

Claims (3)

1. (a) 측정 대상 시료를 포함하는 용액을, 헤마글루티닌(Hemagglutinin)과 형광공여물질을 함유하는 단소포체(single vesicle)를 포함하는 용액과 혼합하여 인큐베이션 하는 단계;
   (b) 상기 (a)단계에서 얻어진 혼합용액을, 강글리오사이드 추출물(Ganglioside extract)과 형광수용물질을 함유하는 단소포체를 포함하는 용액과 혼합하여 인큐베이션하는 단계;
   (c) 상기 (b)단계 동안 혼합용액의 형광 변화를 측정하여 데이터를 얻는 단계; 및
   (d) 상기 (c)단계에서 획득한 형광 변화 데이터로부터, 측정 대상 시료가 헤마글루티닌 저해 물질인지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 인플루엔자 바이러스 융합 기작의 세포외 측정 방법.
   
2. (a) 측정 대상 시료를 포함하는 2종류 이상 농도의 용액을, 헤마글루티닌 분자의 HA1 도메인과 HA2 도메인 모두를 함유하는 단소포체(single vesicle)를 포함하는 용액과 각각 혼합하여 인큐베이션 하는 단계;
   (b) 상기 (a)단계에서 얻어진 각각의 혼합용액을, 강글리오사이드 추출물(Ganglioside extract)과 형광수용물질을 함유하는 단소포체를 포함하는 용액과 혼합하여 인큐베이션하는 단계;
   (c) 상기 (b)단계 동안 각각의 혼합용액의 형광 데이터를 얻는 단계; 및
   (d) 상기 (c)단계에서 획득한 형광 데이터로부터, 측정 대상 시료가 헤마글루티닌 분자의 HA1 도메인과 HA2 도메인 중에서 어느 도메인에 작용하는지를 확인하는 단계를 포함하는 인플루엔자 바이러스 융합 기작의 세포외 측정 방법.
   
3. 제 2항에 있어서,
   상기 (d)단계에서 상기 측정 대상 시료가 헤마글루티닌 분자의 HA1 도메인과 HA2 도메인 중에서 어느 도메인에 작용하는지를 확인하는 것은,
   (1) 상기 각각의 혼합용액의 형광 데이터에서 각각의 데이터 분포를 얻는 단계;
   (2) 상기 각각의 데이터 분포로부터, 상기 측정 대상 시료의 농도의 변화에 따라 상관관계를 가지고 변화하는 분포의 부분을 확인하는 단계;
   (3) 상기 상관관계를 가지고 변화하는 분포의 부분의 의미를, 헤마글루티닌을 포함하는 소포체의 융합 모델에 따라 해석하는 단계; 및
   (4) 상기 (3)단계의 해석에 따라 측정 대상 시료가 작용하는 부분이, 헤마글루티닌의 HA1 도메인 부위인지 또는 HA2 도메인 부위인지를 결정하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 바이러스 융합 기작의 세포외 측정 방법.

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