KR101740915B1 - 오론 화합물 합성방법 그리고 이를 포함하는 항염증 조성물 - Google Patents

Abstract

시판되는 개시물질로부터 오론 화합물인 러고론 A (화합물 1a), 그람플라보노이드 A (화합물 1b) 및 그 유도체들 (화합물 1c 내지 1o)을 높은 수율로 효율적으로 합성하는 방법을 발명하였다. 또한, 그들의 항염증 효과를 LPS-유도 RAW-264.7 대식세포에서 평가하였다. 오론 화합물은 세포독성을 나타내지 않으며, 10μM 농도에서 LPS로 유도되는 산화질소 생성을 약하게 또는 잘 저해하는 것으로 나타났고, 화합물 1a - 1o의 IC₅₀ 값은 각각 3.39 내지 19.55 μM 범위였다. 본 발명에서 합성한 15개 오론 화합물 중 최대 저해활성은 화합물 1g (63.98%; IC₅₀ = 4.50), 그 다음은 화합물 1o (49.07%; IC₅₀ = 4.98)와 러고론 A (41.72%; IC₅₀ = 3.39) 순으로 나타났다. 5,6-다이메톡시벤조퓨란-3(2H)-온 (화합물 5)에서 유도된 오론 화합물들 중 4-브로모페닐기 (화합물 1g의 경우), 페로세닐기 (화합물 1o의 경우) 및 4-하이드록시페닐기 (화합물 1a의 경우)와 결합한 화합물들이 다른 오론 화합물에 비해 iNOS 매개 산화질소 저해제에 효과적이었다.

Description

오론 화합물 합성방법 그리고 이를 포함하는 항염증 조성물 {Synthetic method for aurone compounds and anti-inflammatory compounds containing thereof}

본 발명은 오론 화합물 합성방법 그리고 이를 포함하는 항염증 조성물에 관한 것이다.

염증은 조직 손상, 부상, 감염 물질 또는 자기면역반응에 대한 주요한 자기방어반응 중 하나이며, 면역반응의 필수적인 부분이다 (1). 염증반응은 부종, 부분적인 붉어짐, 통증 및 때때로 기능의 손실을 포함한다 (2). 시간과 병리학적 특성에 근거하여 염증은 급성 또는 만성으로 나눌 수 있다. 염증 기작은 크게 아라키돈산 (AA)-의존적 경로와 AA-비의존적 경로로 나눌 수 있다 (3). 아라키돈산-의존적 경로에서 막 인지질에서 포스포라이페이즈 A2 (PLA2)에 의해 분리되는 아라키돈산은 사이클로옥시게네이즈 (COXs), 리포옥시게네이즈 (LOXs) 및 사이토크롬 P450 (CYO450) 모노옥시게네이즈의 기질로서 염증 캐스캐이드에서 다양한 역할을 수행하는 프로스타글란딘 (PGs) 및 류코트리엔 (LTs) 등과 같은 다른 대사산물을 생성한다 (4). COXs는 COX-1 (생리학적 형태), COX-2 (염증성/유도성 형태) 및 COX-3 (기능이 알려지지 않음)으로 나눌 수 있다 (5). 유사하게, 현재까지 몇 개의 LOX 아이소머가 확인되었는데, 그 중 12-LOX와 5-LOX는 항염증제 개발에서 보장된 표적으로 여겨진다. 이와 대조적으로, 염증의 이차 기작은 산화질소 합성효소 (nitric oxide synthase; NOS), NF-kB (nuclear factor-kB) 및 PPAR (peroxisome proliferator activated receptor)을 포함한다.

산화질소 합성효소 (NOS)는 L-아르기닌으로부터 산화질소를 생성하며, 세 가지 형태 즉 상피세포 NOS (eNOS), 신경세포 NOS (nNOS) 및 유도 가능한 형태의 NOS (iNOS)로 존재한다. 산화질소는 작고 확산이 잘 되는 전이 프리라디칼이며, 양날의 검과 같이 작용한다. 생리적으로 필수적인 양의 산화질소는 eNOS 및 nNOS에 의해 만들어지며, 이것은 신호전달에 결정적이다. 암세포, 바이러스 및 세균 사멸을 돕기 위하여 유도 가능한 효소 (iNOS)에 의하여 "필요에 따라" 높은 수준의 산화질소가 생성된다. 산화질소의 저생산 및 과생산은 다양한 인간 병인과 관련되어 있다. eNOS 및 nNOS로부터 충분하지 않은 NO 생산은 고혈압, 동맥경화 및 심혈관질환을 일으킬 수 있고, 반면 iNOS에 의한 과다한 NO 생산은 염증, 천식, 당뇨, 뇌졸중, 암 및 신경퇴행성 질환을 일으킬 수 있다 (6,7). 뿐만 아니라, 내생성 또는 외생성 NO는 두경부 편평세포암 (head and neck squamous cell carcinoma; HNSCC) 세포주 및 배양된 집뇨관 세포에서도 MAP 카이네이즈와 수퍼옥사이드를 통해 COX-2 발현을 간접적으로 상향조절한다 (8,9). 따라서, iNOS 저해에 의한 과량 NO 생성의 제어는 항염증 효과를 일으킬 수 있다.

고전적인 스테로이드성 항염증제 (steroidal anti-inflammatory drugs; SAIDs)는 염증을 치료하기 위해 PLA2를 간접적으로 저해하기 때문에 부작용으로 인하여 적용에 많은 제약이 있다. 비스테로이드성 항염제 (Non-steroidal anti-inflammatory drugs; NSAIDs)는 COX를 저해하여 활성을 나타내기 때문에 급성 또는 만성 염증 치료에 일반적으로 사용 가능하다. 그러나, 장기간 구강투여는 제한되는데, 그것은 COX-1과 COX-2 항존효소의 억제로 인하여 부작용, 특히 위장관, 신장 및 심혈관계에 관련된 부작용이 일어날 가능성이 크기 때문이다 (10). 이후, 선택적 COX-2 저해제 (COXIBs)가 이러한 위험성을 감소시키기 위하여 도입되었다. 이들 선택적 COX-2 저해제가 위장관 손상의 위험을 감소시키는 반면, 전통적인 비스테로이드성 항염증제와 같이, 이들도 심장마비, 뇌졸중과 같은 심혈관계 질환의 위험성을 증가시키는 것으로 나타났다. 그리하여 부작용을 최소화한 좀더 효과적인 항염증제를 찾기 위한 연구들이 진행 중이다.

플라보노이드는 다양한 생물활성을 나타내는 천연 식물 산물 중 하나이다 (11). 오론 (Aurones; 2-benzylidenebenzofuran-3(2H)-ones)은 주요한 플라보노이드의 서브클래스이며, 구조적으로 플라본 및 C₆-C₃-C₆ 프레임웍을 가진 2-벤조일벤조[b]퓨란과 유사하다 (도 1). 이 이차 대사산물은 대부분 수화, 메톡실화 및/또는 글리코실화된 상태로 발견되며 꽃과 과일의 착색에 중요한 역할을 한다. 식물에서, 오론은 해충 섭식저해물질 (12), 항진균제 (13) 및 항기생충제 (14) 활성으로 인해 보호작용을 한다. 최근 오론은 다양한 활성으로 인해 큰 관심을 끌고 있다. 몇몇 천연 및 비천연 오론들은 항암제, 항산화제, 항염증제, 항바이러스제, 항호르몬제, 항당뇨제 및 항비만제로서 연구되고 있다 (15,16). 또한, 어떤 오론 화합물들은 티로시나제, 뉴라미다제, 히스톤 디아세틸화제 (HDAC) 및 아세틸콜린에스터레이즈 (AChE)와 같은 효소에 대한 저해활성을 나타낸다 (16). 뿐만 아니라, 몇몇 방사성 표지된 오론 유도체들은 알츠하이머병에서 β-아밀로이드 플라크의 분자 영상 탐침으로 이용되었다 (17). 이처럼 다양한 약학적 및 물리학적 특성으로 인해 이 중요한 헤테로사이클릭 화합물의 디자인과 합성은 많은 연구자들의 특별한 관심을 끌고 있다.

최근 연구에서 오론 천연산물인 러고론 A (화합물 1a)와 그람플라보노이드 A (화합물 1b)가 각각 해당화 (Rosa rugosa)와 아룬디나 그람니폴리아 (Arundina gramnifolia)로부터 분리되었고 두 오론 화합물은 항-HIV 활성을 나타내었다 (18,19).

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위와 같이 러고론 A (화합물 1a)와 그람플라보노이드 A와 같은 오론 화합물은 식물에서 분리되었으나, 화학적 합성방법이 알려지지 않았다. 따라서, 본 발명은 러고론 A (화합물 1a) 및 그람플라보노이드 A, 이들의 유도체와 같은 오론 화합물을 화학적으로 합성하는 방법을 제공하려는 것을 목표로 한다.

또한, 본 발명은 부작용이 적은 항염증제로 이용 가능한 화합물을 제공하려는 것을 목표로 한다.

본 발명자들은 시판되는 개시물질로부터 오론 화합물인 러고론 A (화합물 1a), 그람플라보노이드 A (화합물 1b) 및 그 유도체들 (화합물 1c 내지 1o)을 높은 수율로 효율적으로 합성하는 방법을 발명하였다. 또한, 그들의 항염증 효과를 LPS-유도 RAW-264.7 대식세포에서 평가하였다. 오론 화합물은 세포독성을 나타내지 않으며, 10μM 농도에서 LPS로 유도되는 산화질소 생성을 약하게 또는 잘 저해하는 것으로 나타났고, 화합물 1a - 1o의 IC₅₀ 값은 각각 3.39 내지 19.55 μM 범위였다. 본 발명에서 합성한 15개 오론 화합물 중 최대 저해활성은 화합물 1g (63.98%; IC₅₀ = 4.50), 그 다음은 화합물 1o (49.07%; IC₅₀ = 4.98)와 러고론 A (41.72%; IC₅₀ = 3.39) 순으로 나타났다. 5,6-다이메톡시벤조퓨란-3(2H)-온 (화합물 5)에서 유도된 오론 화합물들 중 4-브로모페닐기 (화합물 1g의 경우), 페로세닐기 (화합물 1o의 경우) 및 4-하이드록시페닐기 (화합물 1a의 경우)와 결합한 화합물들이 다른 오론 화합물에 비해 iNOS 매개 산화질소 저해제에 효과적이었다.

본 발명은

화학식 2로 표시되는 3,4-다이메톡시벤즈알데하이드의 CH₂Cl₂ 용액에 m-클로로퍼벤조익산을 가하고 반응 혼합물을 교반하여 화학식 3으로 표시되는 3,4-다이메톡시페놀을 얻는 단계;

보론 트리플루오라이드 다이에틸 에터레이트 (Boron trifluoride diethyl etherate)를 상기 3,4-다이메톡시페놀과 클로로아세틱 안하이드라이드의 혼합물에 0℃에서 가한 후 90℃로 가열하여 교반한 다음, 교반하지 않고 15시간 동안 상온에 두고, 물을 혼합물에 가하고 교반하여 화학식 4로 표시되는 2-클로로-1-(2-하이드록시-4,5-다이메톡시페닐)에타논 {2-Chloro-1-(2-hydroxy-4,5-dimethoxyphenyl)ethanone}을 얻는 단계;

상기 2-클로로-1-(2-하이드록시-4,5-다이메톡시페닐)에타논과 아세트산 나트륨을 에탄올에서 교반한 현탁액을 환류하여 화학식 5로 표시되는 5,6-다이메톡시벤조퓨란-3(2H)-온 {5,6-Dimethoxybenzofuran-3(2H)-one}을 얻는 단계; 및

상기 5,6-다이메톡시벤조퓨란-3(2H)-온과 화학식 7로 표시되는 방향족 알데하이드 화합물을 MeOH : H₂O = 2:1 혼합용매에 넣고 교반한 용액에 KOH를 가하고 혼합물을 교반하여 화학식 8로 표시되는 화합물을 얻는 단계;를 포함하는 오론 화합물 합성방법에 관한 것이다.

<화학식 2>

<화학식 3>

<화학식 4>

<화학식 5>

<화학식 7>

<화학식 8>

{단, 상기 화학식 7과 화학식 8의 Ar은 4-OEOM-Ph, 4-OMe-Ph, Ph, 4-Me-Ph, 4-F-Ph, 4-Cl-Ph, 4-Br-Ph, 4-I-Ph, 4-CF₃-Ph, 4-CN-Ph, 퓨란-2-일 (furan-2-yl), 티오펜-2-일 (thiophen-2-yl), 2,2-다이메틸-2H-크로멘-6-일 (2,2-dimethyl-2H-chromen-6-yl), 벤조퓨란-2-일 (benzofuran-2-yl), 2-페로세닐 (2-ferrocenyl) 중 선택된 1종임}

또한, 본 발명은 상기 화학식 8로 표시되는 화합물 중 (Z)-2-(4-(에톡시메톡시)벤질리덴)-5,6다이메톡시벤조퓨란-3(2H)-온 {(Z)-2-(4-(Ethoxymethoxy)benzylidene)-5,6-dimethoxybenzofuran-3(2H)-one}을 메탄올에 넣고 교반한 용액에 1N HCl을 넣고 교반하여 화학식 1로 표시되는 러고론 A {(Z)-2-(4-hydroxybenzylidene)-5,6-dimethoxybenzofuran-3(2H)-one}를 얻는 단계;를 더 포함하는 오론 화합물 합성방법에 관한 것이다.

<화학식 1>

또한, 본 발명은 상기 화학식 7로 표시되는 방향족 알데하이드 화합물 중 Ar이 4-OEOM-Ph인 4-(에톡시메톡시)벤즈알데하이드를 화학식 6으로 표시되는 4-하이드록시벤즈알데하이드의 아세톤 용액에 트리에틸아민을 가하여 교반한 후 0℃로 식히고 클로로메틸에틸에테르를 한 방울씩 가하고 테트라부틸암모늄 아이오다이드의 아세톤 용액을 가하여 얻은 것임을 특징으로 하는 오론 화합물 합성방법에 관한 것이다.

<화학식 6>

또한, 본 발명은 상기 화학식 8로 표시되는 화합물이 (Z)-2-(4-(에톡시메톡시)벤질리덴)-5,6-다이메톡시벤조퓨란-3(2H)-온 {(Z)-2-(4-(Ethoxymethoxy)benzylidene)-5,6-dimethoxybenzofuran-3(2H)-one}, (Z)-2-(4-하이드록시벤질리덴)-5,6-다이메톡시벤조퓨란-3(2H)-온 {(Z)-2-(4-hydroxybenzylidene)-5,6-dimethoxybenzofuran-3(2H)-one}, (Z)-5,6-다이메톡시-2-(4-메톡시벤질리덴)벤조퓨란-3(2H)-온 {(Z)-5,6-Dimethoxy-2-(4-methoxybenzylidene)benzofuran-3(2H)-one}, (Z)-2-벤질리덴-5,6-다이메톡시벤조퓨란-3(2H)-온 {(Z)-2-Benzylidene-5,6-dimethoxybenzofuran-3(2H)-one}, (Z)-2-(4-플루오로벤질리덴)-5,6-다이메톡시벤조퓨란-3(2H)-온 {(Z)-2-(4-fluorobenzylidene)-5,6-dimethoxybenzofuran-3(2H)-one}, (Z)-2-(4-클로로벤질리덴)-5,6-다이메톡시벤조퓨란-3(2H)-온 {(Z)-2-(4-chlorobenzylidene)-5,6-dimethoxybenzofuran-3(2H)-one}, (Z)-2-(4-브로모벤질리덴)-5,6-다이메톡시벤조퓨란-3(2H)-온 {(Z)-2-(4-bromobenzylidene)-5,6-dimethoxybenzofuran-3(2H)-one}, (Z)-2-(4-아이오도벤질리덴)-5,6-다이메톡시벤조퓨란-3(2H)-온 {(Z)-2-(4-iodobenzylidene)-5,6-dimethoxybenzofuran-3(2H)-one}, (Z)-5,6-다이메톡시-2-(4-(트리플루오로메틸)벤질리덴)벤조퓨란-3(2H)-온 (Z)-5,6-dimethoxy-2-(4-(trifluoromethyl)benzylidene)benzofuran-3(2H)-one, (Z)-4-((5,6-다이메톡시-3-옥소벤조퓨란-2(3H)-일리덴)메틸)벤조나이트릴 {(Z)-4-((5,6-dimethoxy-3-oxobenzofuran-2(3H)-ylidene)methyl)benzonitrile}, (Z)-2-(퓨란-2-일메틸렌)-5,6-다이메톡시벤조퓨란-3(2H)-온 {(Z)-2-(furan-2-ylmethylene)-5,6-dimethoxybenzofuran-3(2H)-one}, (Z)-5,6-다이메톡시-2-(티오펜-2-일메틸렌)벤조퓨란-3(2H)-온 {(Z)-5,6-Dimethoxy-2-(thiophen-2-ylmethylene)benzofuran-3(2H)-one}, (Z)-2-((2,2-다이메틸-2H-크로멘-6-일)메틸렌)-5,6-다이메톡시벤조퓨란-3(2H)-온 {(Z)-2-((2,2-dimethyl-2H-chromen-6-yl)methylene)-5,6-dimethoxybenzofuran-3(2H)-one}, (Z)-2-(벤조퓨란-2-일메틸렌)-5,6-다이메톡시벤조퓨란-3(2H)-온 {(Z)-2-(benzofuran-2-ylmethylene)-5,6-dimethoxybenzofuran-3(2H)-one} 및 (Z)-5,6-다이메톡시-(2-페로세닐리덴)-벤조퓨란-3(2H)-온 {(Z)-5,6-Dimethoxy-(2-ferrocenylidene)-benzofuran-3(2H)-one} 중 선택된 1종 이상임을 특징으로 하는 오론 화합물 합성방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 합성된 오론 화합물을 포함하는 항염증 약학 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 오론 화합물이 (Z)-2-(4-하이드록시벤질리덴)-5,6-다이메톡시벤조퓨란-3(2H)-온 {(Z)-2-(4-hydroxybenzylidene)-5,6-dimethoxybenzofuran-3(2H)-one}, (Z)-2-(4-브로모벤질리덴)-5,6-다이메톡시벤조퓨란-3(2H)-온 {(Z)-2-(4-bromobenzylidene)-5,6-dimethoxybenzofuran-3(2H)-one} 및 (Z)-5,6-다이메톡시-(2-페로세닐리덴)-벤조퓨란-3(2H)-온 {(Z)-5,6-Dimethoxy-(2-ferrocenylidene)-benzofuran-3(2H)-one} 중 선택된 1종 이상임을 특징으로 하는 항염증 약학 조성물에 관한 것이다.

러고론 A (화합물 1a), 그람플라보노이드 A (화합물 1b) 및 그 유도체들 (화합물 1c 내지 1o)을 유효성분으로 함유하는 약학 조성물은 약학 분야에서 통상적으로 허용되는 담체와 함께 배합하여 통상적인 방법에 의해 경구 또는 주사 형태로 제형화할 수 있다. 경구용 조성물로는 예를 들면 정제 및 젤라틴 캡슐이 있으며, 이들은 활성 성분 이외에도 희석제(예: 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활탁제(예: 실리카, 탤크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)을 함유하고, 정제는 또한 결합제(예: 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스 및/또는 폴리비닐피롤리돈)를 함유하며, 경우에 따라서 붕해제(예: 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨염) 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제 및 감미제를 함유하는 것이 바람직하다. 주사용 조성물은 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하고, 언급한 조성물은 멸균되고/되거나 보조제(예: 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제 용액 촉진제, 삼투압 조절을 위함 염/또는 완충제)를 함유한다. 또한, 이들은 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있다.

이와 같이 제조된 약학 제제는 목적하는 바에 따라 경구로 투여하거나, 비경구 방식 즉, 정맥 내, 피하, 복강 내 투여 또는 국소적용할 수 있다. 용량은 일일 투여량 0.0001~100㎎/㎏을 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

나아가, 본 발명은 상기 러고론 A (화합물 1a), 그람플라보노이드 A (화합물 1b) 및 그 유도체들 (화합물 1c 내지 1o)을 유효성분으로 하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 아토피, 피부소양증과 같은 피부염증을 비롯한 염증질환의 예방과 치료에 유용한 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 정의되는 염증질환이란 아토피 피부염을 포함하는 피부염증질환, 신경교종세포 등 신경세포 염증질환, 척추염, 요도염, 방광염, 신염, 신우신염, 혈관염, 비염, 인후염, 편도염, 급성통증 또는 염증성 장질환 등이며, 바람직하게는 피부염증질환, 요도염, 방광염, 신염, 신우신염, 비염, 인후염, 편도염 또는 염증성 장질환이다.

뿐만 아니라, 본 발명은 아래 화학식 8로 표시되는 신규 오론 화합물에 관한 것이다. 본 발명의 합성방법으로 처음 밝혀진 이들 신규 오론 화합물은 항염증 효능 등 유용한 생물학적 활성이 있을 것으로 기대된다.

<화학식 8>

{단, Ar은 Ph, 4-Me-Ph, 4-F-Ph, 4-Cl-Ph, 4-Br-Ph, 4-I-Ph, 4-CF₃-Ph, 4-CN-Ph, 퓨란-2-일 (furan-2-yl), 티오펜-2-일 (thiophen-2-yl), 2,2-다이메틸-2H-크로멘-6-일 (2,2-dimethyl-2H-chromen-6-yl), 벤조퓨란-2-일 (benzofuran-2-yl), 2-페로세닐 (2-ferrocenyl) 중 선택된 1종임}

본 발명에서 합성한 오론 화합물은 세포독성을 나타내지 않으며, LPS로 유도되는 산화질소 생성을 약하게 또는 잘 저해하는 것으로 나타났다.

또한, 본 발명에서 합성한 15개 오론 화합물 중 화합물 1g, 화합물 1o 및 러고론 A는 다른 오론 화합물에 비해 iNOS 매개 산화질소 저해제에 효과적이었다.

도 1은 오론, 플라본, 2-벤조일벤조[b]퓨란의 일반적인 구조와 러고론 A (화합물 1a)와 그람플라보노이드 A (화합물 1b)의 구조를 나타낸다.
도 2는 본 발명에 의한 러고론 A (화합물 1a)와 그람플라보노이드 A (화합물 1b) 및 이들의 유도체 (화합물 1c ~1o) 합성방법을 나타낸다.
도 3은 본 발명에 의해 합성된 화합물 1a ~1o에 대하여 LPS로 유도된 산화질소 생성 저해효과를 시험한 결과이다.

아래에서는 구체적인 실시예를 들어 본 발명의 구성을 좀 더 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 실시예의 기재에만 한정된 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.

모든 화학제품은 특별한 언급이 없는 한 구입한 그대로 정제하지 않고 사용하였다. 크로마토그래피에 사용한 모든 용매는 구입하여 별도의 정제 없이 바로 사용하였다. ¹H-NMR 스펙트럼은 Varian Mercury-300 MHz FT-NMR 및 ¹³C에 대해서는 75 MHz로 기록하였고, 화학적 이동 (δ)은 TMS에 대하여 ppm (parts per million)으로 나타내었고, 커플링 상수 (J)는 Hz로 인용하였다. CDCl₃/DMSO-d₆는 용매 및 내부 스탠다드로 이용하였다. 질량 스펙트럼은 JMS-700 (JEOL)을 이용하여 기록하였다. 녹는점은 MEL-TEMP Ⅱ 장치에서 측정하고, 보정하지 않았다. 박막 크로마토그래피 (TLC)는 DC-Plastikfolien 60, F₂₅₄ (Merck, 층 두께 0.2 mm) 플라스틱 판에 실리카젤을 입힌 플레이트를 이용하였고, UV (254 nm)를 이용하여 관찰하거나 또는 p-아니스알데하이드와 포스포몰리브딕산 (PMA)으로 염색하여 관찰하였다. 크로마토그래피 정제는 Kieselgel 60 (60-120 mesh, Merck)을 이용하여 수행하였다.

3,4- 다이메톡시페놀 (3,4- dimethoxyphenol ) (화합물 3)

CH₂Cl₂ (25 mL)에 녹인 3,4-다이메톡시벤즈알데하이드 (화합물 2) 용액 (1.50 g, 9.03 mmol)에 m-클로로퍼벤조익산 (2.23 g with 77%, ca. 9.93 mmol)을 가하고 혼합물을 상온에서 15시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 다이메틸 설파이드 (1 mL)를 가하여 반응을 멈추게 하고 Na₂SO₃ 포화 수용액 (3 x 20 mL)과 식염수 (20 mL)로 세척하였다. 유기용매상은 무수 Na₂SO₄로 건조하고 진공농축하였다. 잔여물은 메탄올 (23 mL)에 용해한 다음 K₂CO₃ (2.49 g, 18.05 mmol)로 처리하고, 혼합물은 30분간 상온에서 교반하였다. 메탄올을 제거한 후 잔여물은 EtOAc (30 mL)에 용해하고, H₂O (2 x 15 mL)와 식염수 (15 mL)로 세척하고, 무수 Na₂SO₄로 건조하였다. 유기용매상은 여과, 농축하고, 잔여물은 컬럼 크로마토그래피 (EtOAc/hexane=1/1)로 정제하여 백색 고체 화합물 3 (1.34 g, 96%)을 얻었다. 녹는점 78-80 ℃; R_f = 0.47 (EtOAc/hexane=1/1); ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 6.70 (d, 1H, J = 8.7 Hz), 6.45 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 6.33 (dd, 1H, J = 8.7, 2.4 Hz), 5.83 (br s, 1H), 3.81 (s, 3H), 3.77 (s, 3H).

2- 클로로 -1-(2- 하이드록시 -4,5- 다이메톡시페닐 ) 에타논 {2- Chloro -1-(2-hydroxy-4,5-dimethoxyphenyl)ethanone} (화합물 4)

보론 트리플루오라이드 다이에틸 에터레이트 (Boron trifluoride diethyl etherate) (0.44 mL, 3.50 mmol, 1.75당량)를 화합물 3 (0.31 g, 2.0 mmol, 1당량)과 클로로아세틱 안하이드라이드 (1.03 g, 6.0 mmol, 3.0 equiv.)의 혼합물에 0℃에서 가하였다. 반응 혼합물은 90℃로 가열하여 2.5시간 동안 교반한 다음 교반하지 않고 15시간 동안 상온에 두었다. 물 (10 mL)을 혼합물에 가하여 10분간 교반하였다. 반응 혼합물은 CHCl₃ (3 x 30 mL)로 추출하였다. 혼합 유기용매층은 물 (2 x 20 mL)과 식염수 (3 x 20 mL)로 세척하고 무수 Na₂SO₄로 건조한 후 진공농축하였다. 조화합물을 에탄올로부터 재결정화하여 연황색 고체 화합물 4 (0.32 g, 70%)를 얻었다. 녹는점 150-152℃C; ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 6.97 (1H, s), 6.46 (1H, s), 4.61 (2H, s), 3.92 (3H, s), 3.86 (3H, s); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 194.2, 161.2, 157.8, 142.4, 110.3, 109.4, 101.0, 56.9, 56.6, 45.2.

5,6- 다이메톡시벤조퓨란 -3(2 H )-온 {5,6- Dimethoxybenzofuran -3(2 H )-one} (화합물 5)

화합물 4 (0.31 g, 1.344 mmol)와 아세트산 나트륨 (0.33 g, 4.03 mmol)을 에탄올 (9 mL)에 넣고 교반한 현탁액을 세 시간 동안 환류 (~85-90 ℃)하였다. 반응 완료 후, 상온으로 식히고 용매를 진공에서 제거하였다. H₂O (8 mL)를 조화합물에 가하고 1N HCl로 중화한 다음 EtOAc (3 x 25 mL)로 추출하였다. 혼합 유기용매층은 식염수 (2 x 15 mL)로 세척하고, 무수 Na₂SO₄로 건조한 후 진공농축하였다. 조화합물을 컬럼 크로마토그래피 (EtOAc/hexane=1/3-1/2)로 정제하여 백색 고체상의 순수한 화합물 5 (0.21 g, 81%)를 얻었다. 녹는점 158-160℃; R_f = 0.26 (EtOAc/hexane=1/2); ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7.01 (1H, s), 6.58 (1H, s), 4.61 (2H, s), 3.97 (3H, s), 3.87 (3H, s); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 198.1, 171.6, 158.7, 146.0, 112.6, 103.1, 95.9, 75.8, 56.8, 56.6.

4-( 에톡시메톡시 ) 벤즈알데하이드 {4-( Ethoxymethoxy ) benzaldehyde } (화합물 7)

4-하이드록시벤즈알데하이드 (화합물 6) (0.12 g, 1.0 mmol)를 무수 아세톤 (5 mL)에 교반한 용액에 트리에틸아민 (0.21 mL, 1.5 mmol)을 가하고 상온에서 20분간 교반하였다. 혼합물은 0℃로 식히고 클로로메틸에틸에테르 (0.11 mL, 1.2 mmol)를 한 방울씩 가하고 테트라부틸암모늄 아이오다이드 (0.04 g, 0.1 mmol)를 무수 아세톤 (2 mL)에 용해한 용액을 가하였다. 반응 혼합물은 상온으로 올려 22시간 동안 교반하였다. 용매는 진공에서 제거하였다. 물 (5 mL)을 조화합물에 가하고 EtOAc (2 x 20 mL)로 추출하였다. 혼합 유기용매층은 식염수 (2 x 15 mL)로 세척한 후 무수 Na₂SO₄로 건조하고 진공농축하였다. 조화합물을 컬럼 크로마토그래피 (EtOAc/hexane=1/5)로 정제하여 무색 액상 화합물 7 (0.16 g, 88%)을 얻었다. R_f= 0.39 (EtOAc:hexane=1:5); ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 9.88 (1H, s), 7.82 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.14 (2H, d, J = 8.4 Hz), 5.29 (2H, s), 3.73 (2H, q, J = 6.9 Hz), 1.22 (3H, t, J = 6.9 Hz); ¹³C NMR (75 MHz, (75 MHz, CDCl₃) δ 190.8, 162.5, 132.0, 116.5, 93.1, 65.0, 15.5.

오론 ( aurone ) 합성의 일반적인 절차

화합물 5 (0.06 g, 0.31 mmol)와 알데하이드 (화합물 7, 7b-7o) (0.46 mmol, 1.5당량)를 MeOH/H₂O (2/1, 3 mL)에 넣고 교반한 용액에 KOH (0.14 g, 2.47 mmol, 8당량)를 상온에서 가하고 혼합물을 50℃에서 2.5시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후, 상온으로 식히고 H₂O (4 mL)를 가한 후 CH₂Cl₂ (3 x 20 mL)로 추출하였다. 혼합 유기용매층은 식염수 (2 x 20 mL)로 세척한 후 무수 Na₂SO₄로 건조하고 진공농축하였다. 컬럼 크로마토그래피 (EtOAc/hexane=3/10-1/1 또는 acetone/hexane=3/10-1/1)로 조화합물을 정제하여 황색 고체상의 정제된 오론 화합물을 얻었다.

( Z )-2-(4-( 에톡시메톡시 ) 벤질리덴 )-5,6- 다이메톡시벤조퓨란 -3(2 H )-온 {( Z )-2-(4-(Ethoxymethoxy)benzylidene)-5,6-dimethoxybenzofuran-3(2 H )-one} (화합물 8) 수율: 86%; 황색 고체; R_f = 0.39 (EtOAc/hexane=1/2); ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7.82 (2H, d, J = 8.7 Hz), 7.15 (1H, s), 7.09 (2H, d, J = 8.7 Hz), 6.79 (2H, s), 5.27 (2H, s), 4.00 (3H, s), 3.89 (3H, s), 3.74 (2H, q, J = 7.0 Hz), 1.23 (3H, t, J = 7.0 Hz); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 183.3, 163.3, 158.7, 157.6, 147.2, 146.8, 133.2, 126.3, 116.7, 113.5, 112.2, 104.4, 95.8, 93.2, 64.8, 56.9, 56.7, 15.4; EI-MS m/z 356 (M⁺), 355 (M⁺ - H), 180 (base), 165.

( Z )-2-(4- 하이드록시벤질리덴 )-5,6- 다이메톡시벤조퓨란 -3(2 H )-온 {( Z )-2-(4-hydroxybenzylidene)-5,6-dimethoxybenzofuran-3(2 H )-one} ( rugaurone A) (화합물 1a)

화합물 8 (0.05 g, 0.14 mmol)을 메탄올 (3.0 mL)에 넣고 교반한 용액에 1N HCl (0.42 mL, 3.0당량)을 넣고 60℃에서 30분간 교반하였다 (맑은 용액이 될 때까지 교반함). 상온으로 식힌 다음, H₂O (4 mL)를 가하고 EtOAc (3 x 20 mL)로 추출하였다. 혼합 유기용매층은 식염수 (2 x 15 mL)로 씻고, 무수 Na₂SO₄로 건조하고 진공농축하여 황색 고체상의 정제된 오론 화합물 1a (0.04, 96%)를 얻었다. 녹는점 260-262℃; R_f = 0.24 (EtOAc/hexane=1/2); ¹H NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 10.16 (1H, s), 7.83 (2H, d, J = 8.7 Hz), 7.19 (1H, s), 7.16 (1H, s), 6.88 (2H, d, J = 8.7 Hz), 6.76 (1H, s), 3.93 (3H, s), 380 (3H, s); ¹³C NMR (75 MHz, DMSO-d₆) δ 182.3, 163.0, 159.9, 158.0, 147.0, 146.4, 134.0, 123.7, 116.7, 112.9, 112.5, 104.5, 97.1, 57.4, 56.8; EI-MS m/z 298 (M⁺, base), 281, 180, 165; HRMS: Calcd for C₁₇H₁₄O₅ (M⁺): 298.0841, found: 298.0853.

( Z )-5,6- 다이메톡시 -2-(4- 메톡시벤질리덴 ) 벤조퓨란 -3(2 H )-온 {( Z )-5,6-Dimethoxy-2-(4-methoxybenzylidene)benzofuran-3(2 H )-one} ( 그람플라보노이드 A) (화합물 1b): 수율: 87%; 황색 고체; 녹는점 199-201℃; R_f = 0.27 (EtOAc/hexane=1/2); ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7.82 (2H, d, J = 8.7 Hz), 7.13 (1H, s), 6.93 (2H, d, J = 8.7 Hz), 6.77 (2H, s), 3.99 (3H, s), 3.88 (3H, s), 3.85 (3H, s); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 183.2, 163.2, 161.0, 157.6, 147.1, 146.7, 133.2, 125.4, 114.6, 113.5, 112.4, 104.4, 95.8, 56.9, 56.6, 55.6; EI-MS m/z 312 (M⁺), 311 (M⁺ - H), 281, 180 (base); HRMS: Calcd for C₁₈H₁₆O₅ (M⁺): 312.0998, found: 312.1002.

( Z )-2- 벤질리덴 -5,6- 다이메톡시벤조퓨란 -3(2 H )-온 {( Z )-2- Benzylidene -5,6-dimethoxybenzofuran-3(2 H )-one} (화합물 1c): 수율: 59%; 황색 고체; 녹는점 159-162℃; R_f = 0.37 (EtOAc/hexane = 1/2); ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7.85 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.44-7.35 (3H, m), 7.12 (1H, s), 6.77 (2H, s), 3.98 (3H, s), 3.87 (3H, s); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 183.5, 163.6, 157.8, 148.1, 146.7, 132.6, 131.5, 129.8, 129.0, 113.1, 112.2, 104.2, 95.8, 56.9, 56.6; EI-MS m/z 282 (M⁺) 281 (M⁺ - H, base), 180, 165; HRMS: C₁₇H₁₄O₄ (M⁺) 계산된 분자량: 282.0892, 측정된 분자량: 282.0885.

( Z )-5,6- 다이메톡시 -2-(4- 메톡시벤질리덴 ) 벤조퓨란 -3(2 H )-온 {( Z )-5,6-dimethoxy-2-(4-methylbenzylidene)benzofuran-3(2 H )-one} (화합물 1d): 수율: 90%; 황색 고체; 녹는점 183-185℃; R_f = 0.36 (EtOAc/hexane = 1/2); ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7.75 (2H, d, J = 8.1 Hz), 7.22 (1H, d, J = 8.1 Hz), 7.13 (1H, s), 6.78 (2H, s), 3.99 (3H, s), 3.88 (3H, s), 2.39 (3H, s); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 183.5, 163.4, 157.6, 147.7, 146.7, 140.3, 131.5, 129.8, 113.3, 112.5, 104.2, 95.8, 56.9, 56.6, 22.0; EI-MS m/z 296 (M⁺, base), 295 (M⁺ - H), 281, 180; HRMS: Calcd for C₁₈H₁₆O₄ (M⁺): 296.1049, found: 296.1061.

( Z )-2-(4- 플루오로벤질리덴 )-5,6- 다이메톡시벤조퓨란 -3(2 H )-온 {( Z )-2-(4-fluorobenzylidene)-5,6-dimethoxybenzofuran-3(2 H )-one} (화합물 1e): 수율: 60%; 황색 고체; 녹는점 178-181℃; R_f = 0.36 (EtOAc/hexane = 1/2); ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7.85 (2H, dd, J = 8.4, 5.7 Hz), 7.13 (1H, s), 7.09 (2H, d, J = 8.4 Hz), 6.78 (1H, s), 6.74 (1H, s), 4.00 (3H, s), 3.89 (3H, s); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 183.3, 163.5, 163.3 (d, J = 250.0 Hz), 157.8, 147.7 (d, J = 2.8 Hz), 146.8, 133.4 (d, J = 8.6 Hz), 128.9 (d, J = 3.4 Hz), 116.2 (d, J = 21.6 Hz), 113.1, 111.0, 104.2, 95.8, 57.0, 56.6; EI-MS m/z 300 (M⁺, base), 299 (M⁺ - H), 180, 165.

( Z )-2-(4- 클로로벤질리덴 )-5,6- 다이메톡시벤조퓨란 -3(2 H )-온 {( Z )-2-(4-chlorobenzylidene)-5,6-dimethoxybenzofuran-3(2 H )-one} (화합물 1f): 수율: 92%; 황색 고체; 녹는점 213-215℃; R_f = 0.43 (EtOAc/hexane = 1/2); ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7.80 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.39 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.15 (1H, s), 6.80 (1H, s), 6.74 (1H, s), 4.02 (3H, s), 3.90 (3H, s); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 183.2, 163.5, 157.8, 148.2, 146.8, 135.6, 132.6, 131.1, 129.2, 113.0, 110.6, 104.2, 95.8, 57.0, 56.6; EI-MS m/z 318 (M⁺ + 2), 316 (M⁺, base), 315 (M⁺ - H), 180, 165.

( Z )-2-(4- 브로모벤질리덴 )-5,6- 다이메톡시벤조퓨란 -3(2 H )-온 {( Z )-2-(4-bromobenzylidene)-5,6-dimethoxybenzofuran-3(2 H )-one} (화합물 1g): 수율: 88%; 황색 고체; 녹는점 221-223℃; R_f = 0.39 (EtOAc/hexane=1/2); ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7.68 (2H, d, J = 8.1 Hz), 7.51 (2H, d, J = 8.1 Hz), 7.10 (1H, s), 6.76 (1H, s), 6.67 (1H, s), 4.00 (3H, s), 3.88 (3H, s); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 183.1, 163.5, 158.0, 148.3, 147.0, 132.7, 132.2, 131.6, 124.0, 113.1, 110.6, 104.4, 95.8, 56.9, 56.7; EI-MS m/z 362 (M⁺ + 2), 360 (M⁺), 281, 181 (base).

( Z )-2-(4- 아이오도벤질리덴 )-5,6- 다이메톡시벤조퓨란 -3(2 H )-온 {( Z )-2-(4-iodobenzylidene)-5,6-dimethoxybenzofuran-3(2 H )-one} (화합물 1h): 수율: 85%; 황색 고체; 녹는점 220-222℃; R_f = 0.36 (EtOAc/hexane = 1/2); ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7.76 (2H, d, J = 8.1 Hz), 7.58 (2H, d, J = 8.1 Hz), 7.15 (1H, s), 6.81 (1H, s), 6.71 (1H, s), 4.02 (3H, s), 3.90 (3H, s); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 183.4, 163.6, 157.9, 148.5, 146.9, 138.2, 132.8, 132.1, 113.1, 110.9, 104.2, 96.3, 95.8, 57.1, 56.7; EI-MS m/z 408 (M⁺, base), 407 (M⁺ - H), 281, 180.

( Z )-5,6- 다이메톡시 -2-(4-( 트리플루오로메틸 ) 벤질리덴 ) 벤조퓨란 -3(2 H )-온 ( Z )-5,6-dimethoxy-2-(4-(trifluoromethyl)benzylidene)benzofuran-3(2 H )-one (화합물 1i): 수율: 94%; 황색 고체; 녹는점 200-202℃; R_f = 0.41 (EtOAc/hexane = 1/2); ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7.92 (2H, d, J = 8.1 Hz), 7.63 (2H, d, J = 8.1 Hz), 7.11 (1H, s), 6.79 (1H, s), 6.73 (1H, s), 4.02 (3H, s), 3.88 (3H, s); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 183.2, 163.8, 158.1, 149.0, 147.0, 136.1, 131.4, 130.9 (q, J = 33.1 Hz), 125.8 (q, J = 3.8 Hz), 124.1 (q, J = 270.2 Hz), 112.8, 109.8, 104.2, 95.8, 57.0, 56.6; EI-MS m/z 350 (M⁺, base), 349 (M⁺ - H), 281, 180; HRMS: Calcd for C₁₈H₁₃F₃O₄ (M⁺): 350.0766, found: 350.0777.

( Z )-4-((5,6- 다이메톡시 -3- 옥소벤조퓨란 -2(3 H )- 일리덴 ) 메틸 ) 벤조나이트릴 {( Z )-4-((5,6-dimethoxy-3-oxobenzofuran-2(3 H )-ylidene)methyl)benzonitrile} (화합물 1j): 수율: 88%; 황색 고체; 녹는점 238-240℃; R_f = 0.38 (EtOAc/hexane = 1/1); ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7.93 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.68 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.14 (1H, s), 6.81 (1H, s), 6.72 (1H, s), 4.03 (3H, s), 3.90 (3H, s); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 183.2, 163.9, 158.2, 149.4, 147.1, 137.2, 132.6, 131.5, 118.8, 112.7, 112.5, 109.3, 104.3, 95.9, 57.1, 56.7; EI-MS m/z 307 (M⁺, base), 306 (M⁺ - H), 292, 180; HRMS: Calcd for C₁₈H₁₃NO₄ (M⁺): 307.0845, found: 307.0853.

( Z )-2-( 퓨란 -2- 일메틸렌 )-5,6- 다이메톡시벤조퓨란 -3(2 H )-온 {( Z )-2-(furan-2-ylmethylene)-5,6-dimethoxybenzofuran-3(2 H )-one} (화합물 1k): 수율: 89%; 황색 고체; 녹는점 170-172℃; R_f = 0.29 (EtOAc/hexane = 1/2); ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7.58 (1H, d, J = 2.1 Hz), 7.11 (1H, s), 7.02 (1H, d, J = 3.3 Hz), 6.78 (1H, s), 6.77 (1H, s), 6.56 (1H, dd, J = 3.3, 2.1 Hz), 3.99 (3H, s), 3.88 (3H, s); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 182.7, 163.1, 157.6, 149.0, 146.7, 146.2, 145.2, 116.8, 113.5, 113.1, 104.1, 100.8, 95.8, 56.9, 56.6; EI-MS m/z 272 (M⁺, base), 257 (M⁺ - CH₃), 180, 165; HRMS: Calcd for C₁₅H₁₂O₅ (M⁺): 272.0685, found: 272.0676.

( Z )-5,6- 다이메톡시 -2-(티오펜-2- 일메틸렌 ) 벤조퓨란 -3(2 H )- 온 { ( Z )-5,6-Dimethoxy-2-(thiophen-2-ylmethylene)benzofuran-3(2 H )-one} (화합물 1l): 수율: 93%; 황색 고체; 녹는점 179-181℃; R_f = 0.31 (EtOAc/hexane = 1/2); ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7.55 (1H, d, J = 4.8 Hz), 7.44 (1H, d, J = 3.3 Hz), 7.10 (1H, s), 7.09 (1H, dd, J = 4.8, 3.3 Hz), 7.05 (1H, s), 6.77 (1H, s), 3.98 (3H, s), 3.87 (3H, s); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 182.6, 163.0, 157.6, 146.7, 146.4, 135.8, 132.8, 131.4, 128.1, 113.7, 106.2, 104.1, 95.9, 57.0, 56.6; EI-MS m/z 288 (M⁺, base), 273 (M⁺ - CH₃), 180, 165; HRMS: Calcd for C₁₅H₁₂O₄S (M⁺): 288.0456, found: 288.0460.

( Z )-2-((2,2- 다이메틸 -2H- 크로멘 -6-일)메틸렌)-5,6- 다이메톡시벤조퓨란 -3(2 H )-온 {( Z )-2-((2,2- dimethyl -2H- chromen -6- yl ) methylene )-5,6-dimethoxybenzofuran-3(2 H )-one} (화합물 1m): 수율: 92%; 황색 고체; 녹는점 157-160℃; R_f = 0.27 (EtOAc/hexane = 1/2); ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7.64 (1H, dd, J = 8.4, 2.1 Hz), 7.50 (1H, d, J = 2.1 Hz), 7.14 (1H, s), 6.81 (1H, d, J = 8.4 Hz), 6.79 (1H, s), 6.74 (1H, s), 6.37 (1H, d, J = 9.6 Hz), 5.66 (1H, d, J = 9.6 Hz), 4.00 (3H, s), 3.89 (3H, s), 1.46 (6H, s); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 183.3, 163.1, 157.4, 154.9, 147.0, 146.6, 133.1, 131.4, 129.7, 125.4, 122.0, 121.6, 117.1, 113.5, 112.7, 104.1, 95.8, 77.5, 56.9, 56.6, 28.7; EI-MS m/z 364 (M⁺), 349 (M⁺ - CH₃, base), 180.

( Z )-2-( 벤조퓨란 -2- 일메틸렌 )-5,6- 다이메톡시벤조퓨란 -3(2 H )-온 {( Z )-2-(benzofuran-2-ylmethylene)-5,6-dimethoxybenzofuran-3(2 H )-one} (화합물 1n): 수율: 73%; 황색 고체; 녹는점 225-227℃; R_f = 0.36 (EtOAc/hexane = 1/2); ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7.62 (1H, d, J = 7.2 Hz), 7.53 (1H, d, J = 8.4 Hz), 7.37 (1H, s), 7.36 (1H, t, J = 8.4 Hz), 7.25 (1H, t, J = 7.2 Hz), 7.14 (1H, s), 6.88 (1H, s), 6.85 (1H, s), 4.03 (3H, s), 3.90 (3H, s); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 182.6, 163.4, 157.8, 155.7, 150.5, 148.1, 146.9, 129.0, 126.4, 123.6, 121.8, 113.3, 112.6, 111.7, 104.2, 100.8, 95.9, 57.0, 56.7; EI-MS m/z 322 (M⁺, base), 180, 165; HRMS: Calcd for C₁₉H₁₄O₅ (M⁺): 322.0841, found: 322.0833.

( Z )-5,6- 다이메톡시 -(2- 페로세닐리덴 )- 벤조퓨란 -3(2 H )-온 {( Z )-5,6-Dimethoxy-(2-ferrocenylidene)-benzofuran-3(2 H )-one} (화합물 1o): 수율: 77%; 황색 고체; 녹는점 179-181℃; R_f = 0.37 (EtOAc/hexane = 1/2); ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7.16 (1H, s), 6.80 (1H, s), 6.77 (1H, s), 4.82 (2H, t, J = 2.0 Hz), 4.51 (2H, t, J = 2.0 Hz), 4.17 (5H, s), 4.01 (5H, s), 4.01 (3H, s), 3.90 (3H, s); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 181.9, 162.7, 157.2, 147.1, 146.6, 115.2, 114.1, 104.2, 95.8, 75.5, 71.8, 71.5, 70.1, 56.9, 56.7; EI-MS m/z 390 (M⁺, base), 325, 180.

합성된 화합물들에 대한 생물학적 효능 시험

에셔리키아 콜라이 유래 지다당과 DMSO (dimethyl sulfoxide)는 Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)에서 구입하였다. DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium), 우태혈청 (fetal bovine serum; FBS), 페니실린 및 스트렙토마이신은 Hyclone (Logan, UT, USA)에서 구입하였다. Cell Titer 96® Aqueous One Solution과 Griess reagent system은 Promega (Madison, MI, USA)에서 구입하였다.

세포 배양과 세포생존율 분석

RAW 264.7 대식세포를 한국세포은행 (Seoul, Korea)에서 입수하여 10% FBS, 100 U/mL 페니실린 및 100 ㎍/mL 스트렙토마이신을 함유한 DMEM에서 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 세포생존율에 대한 다양한 화합물의 효과는 CellTiter 96® AQueous One Solution Assay of cell proliferation을 이용하여 생존 세포의 수를 계수하는데 사용되는 색도측정법으로 측정하였다. 이 분석방법으로 배양과정이 완료된 후 남은 생존세포 수를 측정하였다. RAW264.7 세포를 바닥이 편평한 96웰 플레이트에 2 X 10⁴ 세포 농도로 넣고, 각 화합물을 지시된 농도에 따라 각 플레이트에 가하였다. 24시간 배양 후, 생존세포 수는 제조자의 지시에 따라 계수하였다. 이 분석방법은 테트라졸리움 화합물인 MTS가 포마잔으로 환원되는데 근거한 것인데, 포마잔은 490㎚에서 최적 흡광도를 나타낸다. 따라서, 세포배양액에서 산물의 양은 490㎚에서 포마잔의 광학농도로 나타내며, 이는 생존세포수와 직접적으로 비례한다.

산화질소 측정

마우스 대식세포에 의해 생성된 NO의 양은 RAW264.7 세포배양액 상층액에서 측정한 값으로 나타내었다. RAW264.7 세포는 200 ㎕의 배양배지가 든 96-웰 세포배양 플레이트에서 5 X 10⁴ 세포밀도가 되도록 넣고 12시간 동안 배양하였다. 세포는 500 ng/㎖의 LPS 내에서 오론 화합물 1a 내지 1o를 지시한 농도대로 18시간 동안 처리하였다. 생성된 NO의 양은 Griess reagent system (Promega)을 이용하여 제조자의 지시에 따라 측정하였다.

통계 분석

데이터는 평균±표준편차로 나타내었다. 값은 GraphPad Prism 4.0 소프트웨어 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA)를 이용한 본페로니 다중비교 사후검정과 함께 ANOVA (one-way analysis of variance)로 평가하였다. p-value＜0.05는 통계학적으로 유의한 것으로 평가된다.

결과 및 고찰

본 발명의 러고론 A (화합물 1a), 그람플라보노이드 A (화합물 1b) 및 그 유도체들 (화합물 1c~1o)의 합성방법이 도 2에 개시되어 있다. 합성은 3,4-다이메톡시벤즈알데하이드 (베라트랄데하이드; veratraldehyde) (화합물 2)를 3,4-다이메톡시페놀 (화합물 3)으로 전환하는 단계로 시작하였다. 알데하이드 (화합물 2)를 Baeyer-Villiger 반응으로 산화한 다음 가수분해하여 페놀 (화합물 3)을 96% 수율로 얻었다. 화합물 3의 2-클로로-1-(2-하이드록시-4,5-다이메톡시페닐)에타논 (화합물 4)로의 전환은 문헌 (23)에 보고된 바와 같은데, 클로로아세토나이트릴과 ZnCl₂는 각각 친전자체와 루이스-산 촉매로 이용하였고, 전체 수율은 매우 낮았다. 이 반응에서는 기체 HCl을 이용하여 중간체인 2-클로로-1-(2-하이드록시-4,5-다이메톡시페닐)에탄 이미늄 가수분해를 수행하였는데, 이 반응은 추가적인 실험 기구가 필요하고 대규모로 수행하기도 어렵다.

이러한 단점을 극복하기 위하여 본 발명자들은 친전자체로 클로로아세트산 무수물과, 루이스-산으로서 BF₃.Et₂O (boron trifluoride etherate)를 이용하여 반응시켜 보았다. 그 결과, 화합물 4를 70% 수율로 얻었으며, 이 화합물은 이어 아세트산 나트륨을 이용하여 분자내 원환화하여 5,6-다이메톡시벤조퓨란-3(2H)-온 (화합물 5)을 81% 수율로 얻었다.

다음으로, 본 발명자들은 화합물 5와 다른 방향족 알데하이드 (화합물 7 및 화합물 7b~7o) 간에 응축반응을 수행하였다. 1당량의 화합물 5와 1.5당량의 방향족 알데하이드 (화합물 7 및 화합물 7b~7o)를 MeOH/H₂O (2/1) 용액 내에서 8당량의 KOH 존재 하에 50℃로 반응시켜 오론 화합물 8과 화합물 1b 내지 1o를 좋은 수율 내지 현저한 수율로 분리하였다. 전자-주게 그룹 및 전자-제거 그룹을 동시에 갖는 방향족 알데하이드를 오론 유도체 합성에 이용하였다. 또한, 헤테로 방향족 알데하이드로부터 유래한 오론 유도체들도 합성되었다. 4-하이드록시벤즈알데하이드 (화합물 6)을 EOM-Cl (chloromethyl ethyl ether)과 TBAI (triethylamine/tetrabutylammonium iodide) 시스템으로 처리하여 얻은 화합물 7과 화합물 5의 응축으로 얻은 오론 화합물 8을 1N HCl로 60℃에서 처리하여 EOM (chloromethyl ethyl ether)-없는 오론 화합물 1a (러고론 A)를 96% 수율로 얻었다. 오론의 구조는 스펙트럼 (¹H- & ¹³C-NMR 및 MS) 데이터로 확인하였다.

제조한 러고론 A (화합물 1a), 그람플라보노이드 A (화합물 1b) 및 그 유도체들 (1c 내지 1o)의 항염증 활성을 평가하기 위하여 본 발명자들은 LPS로 자극한 RAW264.7 대식세포주에서 L-NMMA (N ^G -monomethyl-L-arginine acetate)를 양성 대조군으로 이용하여 염증의 필수 매개자 중 하나인 산화질소의 양을 측정하였다 (24, 25, 26).

RAW264.7 세포를 지다당 (LPS)으로 자극하고, 세포를 다양한 농도의 오론 화합물 (화합물 1a ~1o)로 처리한 다음 산화질소의 생성을 측정하였다 (표 1). 오론 화합물은 10μM에서 LPS로 유도되는 산화질소 생성을 약하게 또는 잘 저해하는 것으로 나타났다. 본 발명에서 합성한 오론 중 세 가지 화합물 즉, 러고론 A (화합물 1a), 화합물 1g 및 화합물 1o는 10μM에서 현저한 활성을 나타내었다 (표 1과 도 3). 15개 화합물 중 최대 저해활성은 화합물 1g (63.98%), 그 다음은 화합물 1o (49.07%)와 러고론 A (41.72%) 순으로 나타났다.

다음으로, 세포사멸이 오론 처리군에서 감소된 NO 발현에 의한 것이 아님을 확인하기 위하여 세포생존율을 분석하였다 (표 2). 두 가지 농도 (1 및 10 μM)의 오론 (화합물 1a - 1o)과 24시간 배양한 결과, 대조군과 비교하여 어떤 현저한 생존율 변화도 나타나지 않았다. 이 데이터는 오론 처리가 iNOS로 매개되는 산화질소를 억제하여 LPS로 유도되는 염증반응을 감소시킬 수 있음을 나타낸다. 화합물 1a - 1o의 IC₅₀ 값은 GraphPad Prism 4.0 소프트웨어를 이용하여 평가하였고, 그 결과는 각각 3.39 내지 19.55 μM 범위에 있었다 (표 2). 이러한 약학적 결과로부터 본 발명자들은 5,6-다이메톡시벤조퓨란-3(2H)-온 (화합물 5)에서 유도된 오론 화합물들 중 4-브로모페닐기 (화합물 1g의 경우), 페로세닐기 (화합물 1o의 경우) 및 4-하이드록시페닐기 (화합물 1a의 경우)와 결합한 화합물들이 다른 오론 화합물에 비해 iNOS 매개 산화질소 저해제에 효과적이라고 제안한다.

Claims (7)

1. 화학식 2로 표시되는 3,4-다이메톡시벤즈알데하이드의 CH₂Cl₂ 용액에 m-클로로퍼벤조익산을 가하고 반응 혼합물을 교반하여 화학식 3으로 표시되는 3,4-다이메톡시페놀을 얻는 단계;
   보론 트리플루오라이드 다이에틸 에터레이트 (Boron trifluoride diethyl etherate)를 상기 3,4-다이메톡시페놀과 클로로아세틱 안하이드라이드의 혼합물에 0℃에서 가한 후 90℃로 가열하여 교반한 다음, 교반하지 않고 15시간 동안 상온에 두고, 물을 혼합물에 가하고 교반하여 화학식 4로 표시되는 2-클로로-1-(2-하이드록시-4,5-다이메톡시페닐)에타논 {2-Chloro-1-(2-hydroxy-4,5-dimethoxyphenyl)ethanone}을 얻는 단계;
   상기 2-클로로-1-(2-하이드록시-4,5-다이메톡시페닐)에타논과 아세트산 나트륨을 에탄올에서 교반한 현탁액을 환류하여 화학식 5로 표시되는 5,6-다이메톡시벤조퓨란-3(2H)-온 {5,6-Dimethoxybenzofuran-3(2H)-one}을 얻는 단계; 및
   상기 5,6-다이메톡시벤조퓨란-3(2H)-온과 화학식 7로 표시되는 방향족 알데하이드 화합물을 MeOH : H₂O = 2:1 혼합용매에 넣고 교반한 용액에 KOH를 가하고 혼합물을 교반하여 화학식 8로 표시되는 화합물을 얻는 단계;를 포함하는 화학식 8로 표시되는 오론 화합물 합성방법.
   <화학식 2>
   

   

   
   <화학식 3>
   

   

   
   <화학식 4>
   

   

   
   <화학식 5>
   

   

   
   <화학식 7>
   

   

   
   <화학식 8>
   

   

   
   {단, 상기 화학식 7과 화학식 8의 Ar은 4-OH-Ph, 4-OEOM-Ph, 4-OMe-Ph, Ph, 4-Me-Ph, 4-F-Ph, 4-Cl-Ph, 4-Br-Ph, 4-I-Ph, 4-CF₃-Ph, 4-CN-Ph, 퓨란-2-일 (furan-2-yl), 티오펜-2-일 (thiophen-2-yl), 2,2-다이메틸-2H-크로멘-6-일 (2,2-dimethyl-2H-chromen-6-yl), 벤조퓨란-2-일 (benzofuran-2-yl), 2-페로세닐 (2-ferrocenyl) 중 선택된 1종임}
2. 청구항 1에 있어서,
   상기 화학식 7로 표시되는 방향족 알데하이드 화합물 중 Ar이 4-OEOM-Ph인 4-(에톡시메톡시)벤즈알데하이드는 화학식 6으로 표시되는 4-하이드록시벤즈알데하이드의 아세톤 용액에 트리에틸아민을 가하여 교반한 후 0℃로 식히고 클로로메틸에틸에테르를 한 방울씩 가하고 테트라부틸암모늄 아이오다이드의 아세톤 용액을 가하여 얻은 것임을 특징으로 하는 합성방법.
   <화학식 6>
   

   
3. 청구항 1의 방법으로 합성된 오론 화합물을 포함하는 항염증 약학 조성물.
   
4. 청구항 3에 있어서,
   상기 오론 화합물은 (Z)-2-(4-하이드록시벤질리덴)-5,6-다이메톡시벤조퓨란-3(2H)-온 {(Z)-2-(4-hydroxybenzylidene)-5,6-dimethoxybenzofuran-3(2H)-one}, (Z)-2-(4-브로모벤질리덴)-5,6-다이메톡시벤조퓨란-3(2H)-온 {(Z)-2-(4-bromobenzylidene)-5,6-dimethoxybenzofuran-3(2H)-one} 및 (Z)-5,6-다이메톡시-(2-페로세닐리덴)-벤조퓨란-3(2H)-온 {(Z)-5,6-Dimethoxy-(2-ferrocenylidene)-benzofuran-3(2H)-one} 중 선택된 1종 이상임을 특징으로 하는 항염증 약학 조성물.
   
5. 화학식 8로 표시되는 오론 화합물.
   <화학식 8>
   

   

   
   {단, Ar은 4-Me-Ph, 4-F-Ph, 4-Cl-Ph, 4-Br-Ph, 4-I-Ph, 4-CF₃-Ph, 4-CN-Ph, 퓨란-2-일 (furan-2-yl), 티오펜-2-일 (thiophen-2-yl), 2,2-다이메틸-2H-크로멘-6-일 (2,2-dimethyl-2H-chromen-6-yl), 벤조퓨란-2-일 (benzofuran-2-yl), 2-페로세닐 (2-ferrocenyl) 중 선택된 1종임}
   
   
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