KR101737055B1

KR101737055B1 - 비쑥을 포함하는 알츠하이머병 예방용 조성물

Info

Publication number: KR101737055B1
Application number: KR1020140154364A
Authority: KR
Inventors: 함경식; 조정용; 박경희; 황도영; 키티퐁; 박선영
Original assignee: 목포대학교산학협력단
Priority date: 2014-11-07
Filing date: 2014-11-07
Publication date: 2017-05-18
Also published as: KR20160055317A

Abstract

본 발명은 비쑥(Artemisia scoparia Waldst.)의 고압열수추출물을 포함하고, a) 알츠하이머병 유발 인자인 아밀로이드 생성에 관여하는 BACE1의 발현을 억제; b) 뇌에서 아밀로이드 분해 또는 제거에 관여하는 IDE 및 LRP1의 발현을 촉진; c) 과인산화 타우(tau) 단백질 형성을 억제; 및 d) 뇌 조직에 산화 스트레스를 감소시키는. 알츠하이머병 예방 조성물을 제공한다.

Description

비쑥을 포함하는 알츠하이머병 예방용 조성물 {COMPOSITION FOR PREVENTING ALZHEIMER'S DISEASE COMPRISING ARTEMISIA SCOPARIA WALDST.}

본 기술은 뇌 효율 저하로부터 기인한 치매 등 질병의 예방 분야의 기술로서, 특히, 알츠하이머병의 인체 내 생물학적 유발 경로를 효율적으로 차단할 수 있는 알츠하이머병 등의 치매 예방용 기능성 조성물에 관한 것이다.

최근 인간의 평균 수명이 연장되고 노령화 사회가 되어 가면서 발생되는 노인성 질환은 보건 및 의료, 복지적인 측면에서 사회적인 문제가 되고 있어 이에 대한 강구책이 필요한 실정이다. 이러한 노인성 질환은 생활습관병인 당뇨, 혈압, 뇌졸중 등의 대사 증후군을 포함하여 노화 및 퇴행성 신경장애(neurodegenerative disorder)에 관련된 질환 등을 말할 수 있으며 근래에 들어 크게 증가하고 있다. 이중 퇴행성 신경장애는 현재까지 정확한 원인이 밝혀지지 않은 상태로 신경세포의 기능 저하 및 소실에 의해 인지 능력, 지각 및 감각 능력, 운동조절능력 이상 등 다양한 기능의 이상을 발생시키게 된다. 이러한 퇴행성 신경장애의 하나인 알츠하이머병(Alzheimer's disease)은 인지기능 저하와 행동장애를 주로 나타내는 노인성 치매로 잘 알려져 있으며 전 세계적으로 환자가 급증하고 있는 질환이다. 알츠하이머병의 주요한 신경 병리학적 소견으로는 아밀로이드베타단백질로 구성된 플라그의 응집, 과인산화된 타우단백질로 구성된 신경원섬유덩굴(neurofibrillary tangle)형성, 신경전달물질인 아세틸콜린(acetylcholine) 함량 감소 등이 주요 원인으로 보고되고 있으며 유전이나 생활 습관과 같은 환경적 원인이 관여한다고 제기되고 있지만, 그 원인과 발병 기전에 대해서는 아직도 완전히 밝혀지지 않고 있다. 최근까지 알츠하이머병의 치료제 혹은 예방제로는 콜린성 가설(cholinergic hypothesis)에 근거한 치료제가 근간이 되고는 있으나 아세틸콜린의 농도를 일시적으로 상승시켜 치료효과를 나타낼 뿐 근원적인 치료제 및 예방제는 전무한 있는 실정이다. 그러므로 알츠하이머병 예방하거나 치료에 효과를 갖는 식품 소재의 개발이 절실히 요구되고 있다.

삭제

전영은 외 4인. 해조류의 항산화 활성 및 아세틸콜린에스테라제 저해 활성. 한국식품영양과학회지. 제41권, 제4호, 2012년, 4월.

본 발명의 목적은 비쑥 추출물과, 아밀로이드 베타 생성 및 과인산화 타우 단백질 생성 등의 알츠하이머병 발병 원인에 관련된 인자들과의 상관관계를 규명함으로써 비쑥 고압열수추출물을 이용한 알츠하이머병 예방용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 실시예에 따른 알츠하이머병 예방 조성물은 비쑥(Artemisia scoparia Waldst.)의 고압열수추출물을 포함하고, a) 알츠하이머병 유발 인자인 아밀로이드 생성에 관여하는 BACE1의 발현을 억제; b) 뇌에서 아밀로이드 분해 또는 제거에 관여하는 IDE 및 LRP1의 발현을 촉진; c) 과인산화 타우(tau) 단백질 형성을 억제; 및 d) 뇌 조직에 산화 스트레스를 감소시킨다.

상기 알츠하이머병 예방 조성물은 상기 비쑥의 고압열수추출물의 동결건조물을 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에 따른 알츠하이머병 예방용 비쑥 고압열수추출물을 섭취하면 알츠하이머병 발병 원인 인자인 아밀로이드 베타 생성을 억제하고, 아밀로드 베타 생성에 관여하는 β-secretase(BACE1)의 발현을 억제하고, 과인산화 tau 단백질 형성을 억제하고 산화 스트레스를 줄여 줌으로써 알츠하이머병을 예방할 수 있다.

비쑥은 식품 원료로 등록되어 있고 예전부터 식용으로 이용되고 있어 독성이나 부작용 등의 문제를 해결할 수 있어, 지역 농가에서 대량으로 재배하게 된다면 산업적인 측면에서 부가가치를 창출할 수 있다.

또한, 식품 원료로 등록되어 있는 새로운 염생식물을 발굴함으로써 식품 및 의약품 신소재로 활용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 비쑥을 이용한 알츠하이머병 예방 조성물의 제조 과정을 설명하기 위하여 개략적으로 도시한 순서도이다.
도 2는 비쑥을 섭취시킨 쥐의 뇌 조직에서 아밀로이드 베타 생성물인 Aβ1-42의 생성량을 정상식이군과 비교한 그래프이다.
도 3은 비쑥을 섭취시킨 쥐의 뇌 조직에서 아밀로이드 베타 생성에 관여하는 BACE1의 발현량을 정상식이군과 비교한 그래프이다.
도 4는 비쑥을 섭취시킨 쥐의 뇌 조직에서 아밀로이드 베타 생성물의 제거에 관여하는 RAGE의 발현량을 정상식이군과 비교한 그래프이다.
도 5는 비쑥을 섭취시킨 쥐의 뇌 조직에서 아밀로이드 베타 제거에 관여하는 Low density lipoprotein receptor related protein 1(LRP1)의 발현을 정상식이군과 비교한 그래프이다.
도 6은 비쑥을 섭취시킨 쥐의 뇌 조직에서 아밀로이드 베타를 분해 시켜 제거하는 insulin degrading enzyme(IDE)의 발현량을 정상식이군과 비교한 그래프이다.
도 7은 비쑥을 섭취시킨 쥐의 뇌 조직에서 p-tau ser396의 발현량을 정상식이군과 비교한 그래프이다.
도 8은 비쑥을 섭취시킨 쥐의 뇌 조직에서 과인산화된 p-tau ser404의 발현량을 정상식이군과 비교한 그래프이다.
도 9는 비쑥을 섭취시킨 쥐의 뇌 조직에서 p-GSK3β Tyr216의 발현량을 정상식이군과 비교한 그래프이다.
도 10은 비쑥을 섭취시킨 쥐의 뇌 조직에서 tau 단백질 탈인산화효소인 protein phosphatase-2A(PP2A)의 발현량을 정상식이군과 비교한 그래프이다.
도 11은 비비쑥을 섭취시킨 쥐의 뇌 조직에서 지질 과산화물 함량을 정상식이군과 비교한 그래프이다.
도 12는 비쑥을 섭취시킨 쥐의 뇌 조직에서 단백질 산화물 함량을 정상식이군과 비교한 그래프이다.
도 13은 비쑥을 섭취시킨 쥐의 뇌 조직에서 NF-kB p65 발현량을 정상식이군과 비교한 그래프이다.

이하, 본 발명의 일 실시예에 따른 알츠하이머병 예방 조성물 및 이의 제조방법에 대하여 자세하게 설명하도록 한다. 그러나 하기 실시예적인 기재를 통하여 본 발명의 기술사상이 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 기술 사상은 오직 후술할 청구범위에 의하여 고려될 수 있을 뿐이다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 알츠하이머병 예방 조성물의 제조 과정을 설명하기 위하여 개략적으로 도시한 순서도이다.

도 1을 참조하면, 추출 대상인 비쑥은 증기를 이용하여 수 분 동안 열처리한 후 열풍 건조 방식 등에 의하여 건조되어 준비된다. 상기 건조된 비쑥은 추출의 효율성을 고려하여 분말화 되는 과정을 거친다. 분말화된 비쑥 건조물은 액상 추출 방식에 의하여 추출될 수 있는 데, 상기 액상 추출 방식으로서는 열수 추출 방식이 바람직하다. 또한, 상기 열수추출은 121℃ 이상의 고열 및 10기압 이상의 고압 하에서 이루어지는 것이 바람직하며 수십분 동안 이루어질 수 있다.

상기 열수 추출물은 그 자체로서 본 발명의 목적을 달성할 수 있으나 후속되는 여과공정 및 동결건조 공정을 거쳐 고형화됨으로써 제형면에서 활용의 폭이 확장될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 조성물은 후술할 실험결과에서 입증되는 바와 같이, 엔지오텐신 전환효소의 억제 특성을 가지며 이러한 특성에 일부 기인하여 혈압상승 억제 특성을 갖는 것으로 파악된다.

나아가, 상기 조성물은 아밀로이드 베타 생성을 억제하고, 특히 아밀로드 베타 생성에 관여하는 β-secretase(BACE1)의 발현을 억제하고, 과인산화 tau 단백질 형성을 억제하고 산화 스트레스를 줄여 줌으로써 알츠하이머병을 예방할 수 있다.

이하에서는 구체적인 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예에 의하여 본 발명의 기술 사상이 한정되는 것은 아니다.

실시예

[실시예 1] 비쑥 고압 열수추출물의 제조

본 발명에 사용한 비쑥은 2013년 5월에 전라남도 증도에서 자생한 것으로, 이를 채취한 후 물로 깨끗하게 세척하였다. 세척한 비쑥을 증기로 2분 동안 열처리한 다음 열풍건조기로 건조시켜 사용하였다. 비쑥 3 kg 중량부를 기준으로 물 30 L 중량부를 가하여 고압추출장치에 넣어 120℃에서 15 기압(atm)에서 30분 동안 고압 열수로 추출한 다음 여과 및 동결 건조하여 비쑥고압열수추출물을 제조하였다.

효과 실험

[실험 1] 동물실험을 통한 비쑥 고압열수추출물의 알츠하이머병 예방 효과

상기 실시예 1에서 제조된 비쑥고압열수추출물을 본태성 고혈압 환자에 섭취시킬 경우 알츠하이머병 예방 효과가 있는지 알아보고자 7주령의 본태성고혈압 쥐(spontaneously hypertensive rat, SHR)에 6주간 섭취시킨 후 알츠하이머병 유발에 관여하는 인자들을 조사하였다.

즉, 본 발명에 사용된 본태성고혈압 쥐는 4주령 (평균 몸무게 80 ㅁ 10 g)으로 중앙실험동물(서울, 한국)에서 구입하여 사용하였다. 실험동물들은 일반 조제 사료(퓨리나)로 3주간 실험동물센터에 적응시킨 후 체중을 측정하여 각각의 실험집단(n=8)으로 분류하였다. 사육환경은 온도 21~24℃, 상대습도는 50~60%가 되도록 유지하였고 조명주기는 12시간으로 하였으며 물과 식이는 자유롭게 섭취하도록 하였다. 실험에 사용한 사료는 AIN-93G 기준으로 정상식이군을 제조하였으며, 비쑥식이군에는 AIN-93G 정상식이에 2% (w/w) 비쑥고압추출물이 되도록 맞추어 사료를 제조하였다. 이후 비쑥사료를 쥐에게 6주 동안 섭취시켰으며, 물과 식이는 자유롭게 섭취하도록 하였다. 실험동물은 희생 전 12시간 절식시킨 다음 에테르로 마취한 한 서두를 절단기로 절단하여 희생시켰다. 얻어진 서두로부터 기요틴(Guillotine) 방법을 이용하여 뇌 조직을 분리하였으며, 분리된 전뇌(whole brain)는 바로 ??80ㅀC의 급속 냉동고(deep freezer)에 보관하여 실험에 사용하였다.

[실험 1-1] 비쑥의 아밀로이드 베타 생성 억제 효과 확인

비쑥을 6주 동안 섭취시킨 본태성고혈압 쥐의 뇌조직을 대상으로 아밀로이드 베타(Amyloid β) 생성물인 Aβ1-42 함량을 Wako Human/rat amyloid 1-42 ELISA kit를 이용하여 측정하였다.

즉, 비쑥을 섭취시킨 쥐의 뇌조직으로부터 얻어진 단백질 용액(100 μL)을 각각의 ELISA kit에 가한 다음 4^oC에서 12시간 동안 반응시킨 다음 상층액을 제거하고 세척하였다. 이 반응 kit에 100 μl HRP-컨쥬게이트 항체(HRP-conjugated antibody) 용액을 가하여 4^oC에서 1-2시간 동안 반응시킨 다음 항체 용액을 제거하고 세척한 kit에 100 μl TMB 용액을 가하여 상온에서 암 조건으로 30 min 동안 반응시켰다. 이 반응 kit에 100 μl의 stop 용액을 첨가한 다음 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료군의 뇌 조직에서 Aβ1-40과 Aβ1-42 함량은 표준물질[Aβ1-40 (1-100 pmol/l)와 Aβ1-42 (0.1-20 pmol/l)]을 이용하여 작성한 표준 곡선을 이용하여 구하였다.

도 2는 비쑥을 섭취시킨 쥐의 뇌 조직에서 아밀로이드 베타 생성물인 Aβ1-42의 생성량을 정상식이군과 비교한 것이다.

도 2에 도시한 바와 같이 비쑥을 섭취시킨 쥐의 뇌에서 Aβ1-42 함량은 비쑥을 첨가하지 않는 정상사료를 섭취시킨 쥐에 비해 낮았으나 두 식이군 간 유의적인 차이는 관찰되지 않았다(P < 0.05).

아밀로이드 베타는 아밀로이드 베타 전구단백질인 APP(Amyloid Precursor Protein)의 비정상적인 대사로 인하여 생성되는 독성 대사물질로 β-secretase (BACE1) 와 γ-sceretase의 작용에 의해 APP가 비정상적으로 분해되면서 생성된다. 이 중 Aβ1-42는 생성물의 약 10% 정도의 비율을 차지하고 있으며 소수성을 띄어 아밀로이드 베타 중합체를 잘 형성시킬 뿐 아니라 그 독성이 강하다고 알려져 있다. 비쑥 식이군은 비쑥을 첨가하지 않은 정상 식이군과 비교했을 때 알츠하이머 원인물질로 알려져 있는 Aβ1-42의 함량의 통계적 유의 차이는 나타나지 않은 것으로 확인하였다.

[실험 1-2] 비쑥의 아밀로이드 베타 생성 및 제거 인자 조절 효과 확인

비쑥을 섭취시킨 본태성고혈압 쥐의 뇌조직을 대상으로 아밀로이드 베타 생성 및 제거에 관여하는 인자들의 발현량을 웨스턴 블로팅(western blottin)에 의해 다음과 같은 방법으로 측정하였다.

즉, 상기 전뇌 조직(0.3 g)에 0.05% triton x-10, 0.2 M HEPES (pH 7.4), 0.01M NaF, 0.01M EDTA (pH 7.4), 2mM 페닐메틸설포닐 플로라이드(phenylmethylsulfonyl fluoride), 0.01M 소듐 피로포스페이트(sodium pyrophosphate), 1 μg/ml 펩스테인(pepstain), 1 μg/ml 류펩틴(leupeptin), 및 0.1 μg/ml 아프로틴(aprotin)을 조제된 리시스 버퍼(lysis buffer) 1 ml를 가한 다음 얼음 상에서 폴리트론(Polytron, PT1200E, Kinematicca AG)으로 균질화시켰다. 균질화된 용액은 4^oC에서 1시간 동안 서서히 교반시킨 다음 4^oC에서 15,000xg으로 20분 동안 원심분리한 다음 상층액을 얻었다. 각 처리군의 단백질 함량은 브래드포드법(Bradford method)으로 측정하였다. 각 식이군에 대한 동일한 단백질 용액 (100 μg, 10 μL)에 2 x 트리신 샘플 버퍼(Tricine sample buffer, Biorad) 10 μL를 가하여 95^oC에서 5분 동안 변성(denaturation)하였다. 이후 상기 용액을 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)으로 전기영동하였다. 전개된 단백질들은 폴리비닐리덴 플로라이드(polyvinylidene fluoride, PVDF) 멤브레인 I를 이동시킨 다음, 이 멤브레인을트리스 버퍼 살린(Tris-Buffer-Saline)으로 세척한 후 3% 보빈 세럼 알부민(bovine serum albumin, BSA)이 함유된 0.05% Tween-20 (TBST) 버퍼로 1시간동안 블로킹하였다. 이후 TBST 용액으로 5 분씩 3회 반복 세척된 멤브레인을 1차항체(primary antibody)가 함유된 리포필라이즈 버퍼(lypophilized buffer)에 넣고 상온에서 서서히 교반시키면서 반응시켰다. 1차 항체 반응이 끝난 멤브레인을 TBST 용액으로 5 분씩 3회 반복 세척한 다음 겨자무과산화효소(horseradish peroxidase) HRP-컨쥬게이트 goat anti-rabbit 이뮤노글로블린 G를 가하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후 세척된 멤브레인은 루미놀이 함유된 ECL(enhanced chemiluminescence) 용액과 반응시켰다. 1차 항체로는 BACE1 (1:1,000), LRP1 (1:1,000), RAGE (1:1,000), NEP (1:1,000), IDE (1:1,000), p-tau ser309 (1:500), p-tau ser404 (1:500), p-GSK 3β tyr216 (1:1000), p-PP2A Tyr307 (1:1000), beta actin (1:1,000), 그리고 GPADH (1:1,000)로 각각 희석한 리포필라이즈 버퍼를 사용하였다.

도 3은 비쑥을 섭취시킨 쥐의 뇌 조직에서 아밀로이드 베타 생성에 관여하는 BACE1의 발현량을 정상식이군과 비교하여 나타낸 것이다.

도 3을 참조하면, 비쑥을 섭취시킨 쥐의 뇌 조직에서 아밀로이드 베타 생성에 관여하는 BACE1의 발현량이 비쑥을 첨가하지 않는 사료를 섭취시킨 쥐에 비해 유의적으로 낮음을 확인할 수 있다. BACE1은 γ-sceretase와 함께 아밀로이드 베타를 생성하는 효소이다. 비쑥은 BACE1 발현을 억제함으로써 아밀로이드 베타 생성을 줄여 주는 효과가 있을 것으로 시사되었다.

도 4는 비쑥을 섭취시킨 쥐의 뇌 조직에서 아밀로이드 베타 생성물의 제거에 관여하는 RAGE의 발현량을 정상식이군과 비교하여 나타낸 것이다.

도 4를 참조하면, 비쑥을 섭취시킨 쥐의 뇌 조직에서 아밀로이드 베타 제거에 관여하는 RAGE(receptor for advanced glycation end products)의 발현량이 비쑥을 첨가하지 않은 사료를 섭취시킨 쥐의 정상 식이군에 비해 유의적으로 낮음을 확인하였다(P < 0.05). RAGE는 혈액 내에 존재하는 아밀로이드 베타를 뇌 조직으로 이동시켜 뇌 조직내의 아밀로이드 베타 함량을 증가시키는 인자이다. 비쑥은 RAGE의 발현을 억제하여 혈액 내에 존재하는 아밀로이드 베타를 뇌 조직내로 이동을 억제함으로써 아밀로이드 베타 함량을 줄여주는 효과가 있음을 알 수 있었다.

도 5는 비쑥을 섭취시킨 쥐의 뇌 조직에서 아밀로이드 베타 제거에 관여하는 Low density lipoprotein receptor related protein 1(LRP1)의 발현량을 정상식이군과 비교하여 나타낸 것이다.

도 6은 비쑥을 섭취시킨 쥐의 뇌 조직에서 아밀로이드 베타를 분해하는 insulin degrading enzyme (IDE) 의 발현량을 정상식이군과 비교하여 나타낸 것이다.

도 5와 6을 참조하면, 비쑥을 섭취시킨 쥐의 뇌조직에는 비쑥을 첨가하지 않은 사료를 섭취시킨 쥐에 비해 유의적으로 높은 LRP1 및 IDE의 발현량을 나타냈다(P < 0.05). LRP1은 혈액-뇌 장벽(blood-brain barrier)에서 아밀로이드 베타를 혈액으로 배출하는 인자이다. 또한 IDE는 뇌 조직에 존재하는 아밀로이드 베타를 분해하는 인자이다. 그러므로 비쑥은 LRP1및 IDE 발현량을 높여 뇌 조직에서 아밀로이드 베타를 제거함으로써 뇌 조직 내 아밀로이드 베타 함량을 줄여주는 효과가 있음을 알 수 있었다.

[실험 1-3] 비쑥의 과인산화 tau 단백질 형성 억제 효과 확인

비쑥을 6주 동안 섭취시킨 본태성 고혈압쥐의 뇌 조직을 대상으로 과인산화된 tau단백질인 p-tau ser369 및 p-tau ser404과 tau단백질의 인산화 조절에 관여하는 p-GSK 3β Tyr216, p-PP2A Tyr307을 조사하였다. 그 인자들의 측정 방법은 상기에 기술된 웨스턴 블랏팅(western blotting) 방법(실험 1-2)과 동일한 방법으로 실시하였다.

도 7은 비쑥을 섭취시킨 쥐의 뇌조직에서 p-tau ser396의 발현량을 정상식이군과 비교하여 나타낸 것이다.

도 8은 비쑥을 섭취시킨 쥐의 뇌조직에서 과인산화된 p-tau ser404의 발현량을 정상식이군과 비교하여 나타낸 것이다.

도 7과 8에서 제시한 바와 같이, 비쑥을 섭취한 쥐의 뇌조직에서 총 tau 단백질에 대한 p-tau ser396 및 p-tau ser404의 발현량은 비쑥을 첨가하지 정상사료를 섭취한 쥐에 비해 유의적으로 낮게 나타냈다(P < 0.05). Tau 단백질은 세포내 미세관에 결합되어 있는 미세관 결합단백질(microtubule-associated protein)로 정상인의 경우 인산화와 탈인산화가 평형상태를 이루면서 뇌세포의 항상성 유지에 중요한 기능을 한다. 그러나 과인산화 tau 단배질의 증가는 신경원섬유덩굴(neurofibrillary tangle) 및 신경그물 실(neuropil thread)을 형성시키며 결국 알츠하이머병을 유발하는데, 알츠하이머병 환자의 뇌에서는 정상인에 비해 과인산화된 tau 단백질 함량이 높다고 보고되고 있다. 그러므로 비쑥은 과인산화된 tau 단백질 형성을 줄어줌으로써 신경섬유덩굴 형성 억제와 함께 알츠하이머병을 예방하는데 도움을 주는 것으로 해석되었다.

도 9는 비쑥을 섭취한 쥐의 뇌조직에서 총 glycogen synthase kinase 3beta(GSK3β)에 대한 p-GSK3β Tyr216의 발현 정도를 정상식이군과 비교하여 나타낸 것이다.

도 10은 비쑥을 섭취한 쥐의 뇌조직에서 총 protein phosphatase 2A(PP2A)에 대한 p-PP2A Tyr307의 발현 정도를 정상식이군과 비교하여 나타낸 것이다.

도 9와 10에 나타낸 바와 같이, 비쑥을 섭취한 쥐의 뇌 조직에서 p-GSK3β Tyr216 및 p-PP2A Tyr307의 발현량은 비쑥을 첨가하지 않는 정상사료를 섭취시킨 쥐와 유의적인 차이를 보이지는 않았으나 낮은 경향을 나타냈다.

Glycogen synthase kinase-3beta(GSK3β)는 tau 단백질을 인산화효소로, 활성형인 p-GSK3β Tyr216의 과 발현은 알츠하이머병 유발에 매개체이다. 또한 PP2A는 tau 단백질의 탈인산화 효소로, 불활성형인 p-PP2A Tyr307의 발현 증가는 알츠하이머병을 유발할 수 있다. 그러므로 비쑥은 활성형인 p-GSK3β Tyr216 및 불활성형인 p-PP2A Tyr307의 발현을 억제하는데 긍정적인 영향을 주므로 알츠하이머병 예방에 도움을 줄 것으로 해석되었다.

[실험 1-3] 비쑥의 산화 스트레스 및 염증 반응 억제 효과 확인

비쑥을 섭취시킨 본태성고혈쥐의 뇌 조직을 대상으로 지질과산화물, 단백질산화물, 그리고 염증 유발 인자인 NF-kB p65 발현량을 조??여 산화 스트레스를 조사하였다.

지질과산화물 함량은 TBARS 법에 의해 측정하였다. 즉, 비쑥을 섭취시킨 본태성고혈쥐의 뇌 조직 0.15 g을 0.01 M Tris-HCl 버퍼 (pH 7.4) 1 mL을 가한 후 얼음 상에서 폴리트론(Polytron, PT1200E, Kinematicca AG)으로 균질화 시켰다. 그리고 4^oC에서 10,000xg으로 10분 동안 원심분리하여 얻어진 상등액 100 μL 에 0.15 M Tris-HCl 버퍼 (pH 7.4) 1 mL 와 10 mM 인산 칼륨 버퍼 (KH₂PO₄) 300 μL를 첨가한 후 진탕 항온 수조 (shaking water bath)를 이용하여 37^oC에서 20분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 20% trichloroacetic acid가 함유된 0.6 M HCl 0.5 mL와 0.67% thiobarbituric acid가 함유된 1 M NaOH용액 0.5 mL를 첨가하여 혼합한 다음 95℃에서 15분 동안 반응시켰다. 이 반응용액을 냉각시킨 다음 5000ㅧg로 10 분 동안 원심 분리하고 532 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이들 흡광도 값은 작성된 표준용액 (malondialdehyde, MDA)의 표준곡선을 이용하여 뇌 조직에서의 지질 과산화물 함량으로 환산하였다.

각 식이군의 뇌 조직에서 단백질 카르보닐화 화합물 (PCO) 함량을 측정하였다. 즉, 각 식이군의 뇌 조직으로부터 얻어진 단백질 2 mg에 총 1 mL 이 되도록 10 mM 2,4-dinitrophenylhydrazine (DNPH)을 가한 다음 상온 및 암실에서 1시간 동안 반응시키고 15분 간격으로 교반하였다. 반응이 끝난 후 냉각된 10% trichloroacetic acid (w/v) 1 mL를 가하여 혼합한 다음 3000ㅧg로 10 분 동안 원심분리하고 상등액을 제거한 후 얻어진 단백질 펠렛(pellet)을 ethanol/ethyl acetate (1:1, v/v) 용액 2 mL로 3회 반복하여 세척하였다. 그리고 6 M guanidine hydrochloride (pH 2.3) 1.5 mL로 단백질 펠렛을 용해시켜 37℃에서 10 분 동안 반응시킨 후 370 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 흡광도값에 대한 DNPH의 molar extinction coefficient (??= 2.2 ㅧ 104 cm-1 M-1)를 나누어 뇌 조직에서의 단백질 산화 생성물인 protein carbonyl 함량으로 환산하였다.

또한 비쑥을 섭취시킨 쥐의 뇌 조직을 대상으로 NF-kB p65의 발현량은 상기(실험1-2)에서 제시한 웨스턴 블로팅 방법과 동일한 방법으로 실시하였으며 NF-kB p65의 1차 항체는 리포필라이즈 버퍼를 이용하여 1:1,000로 희석하여 사용하였다.

도 11은 비쑥을 섭취시킨 쥐의 뇌 조직에서 지질 과산화물 함량을 정상식이군과 비교하여 나타낸 것이다.

도 12는 비쑥을 섭취시킨 쥐의 뇌 조직에서 단백질 산화물 함량을 정상식이군과 비교하여 나타낸 것이다.

도 13은 비쑥을 섭취시킨 쥐의 뇌 조직에서 염증 반응에 관여하는 NF-kB p65 발현량을 정상식이군과 비교하여 나타낸 것이다.

도 11, 12 및 13에 제시한 바와 같이, 비쑥이 첨가된 사료을 섭취한 쥐는 비쑥을 첨가하지 않은 정상사료를 섭취한 쥐에 비해 뇌 조직에서 유의적으로 낮은 지질 과산화물 (malondialdehyde, MDA), 단백질 산화물, 그리고 NF-kB p65 함량을 나타냈다.

산화스트레스와 염증 반응 증가는 알츠하이머병 유발과 밀접하게 관련되어 있다. 그러므로 비쑥은 뇌 조직에서 산화 스트레스와 염증 반응을 적게 영향을 주어 알츠하이머병 유발을 줄여 줄 수 있음을 확인하였다.

Claims

비쑥(Artemisia scoparia Waldst.)을,
i) 증제, ii) 열풍건조, iii) 분말화, iv) 고압 열수추출, v) 여과 및 vi) 여과액의 동결건조 단계를 거쳐 수득된 비쑥추출물을 유효성분으로 하고 아밀로이드 베타 생성 억제 기능을 갖는,
알츠하이머병 예방용 조성물.
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