KR101735052B1 - 메조포러스 실리카 나노입자 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 평균 직경이 4~5nm로 확장된 포어 크기를 가지는 확장된-메조포어, 및 입자 내부와 외부에 평균 직경이 20~60nm의 초대형 메조포어를 포함하는 것을 특징으로 하는 메조포러스 실리카 나노입자(MSNs)와 이의 제조방법, 및 이를 거대 분자의 전달을 위한 전달체로 사용하는 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 극대화된 포화 크기를 가지는 MSN 물질을 제조하기 위하여, 가장 일반적인 포어 확장 분자를 사용하는 방법 대신에 부분적인 탈금속화 공정을 통하여 선택적인 에칭 방법을 이용하였다. 이러한 공정에서는, Al, 또는 Si 원자들이 스팀 또는 화학적 에천트에 의해 선택적으로 제거될 수 있으며, 결과적으로 포어 크기는 부분적으로 증가하게 된다. 따라서 본 발명에서는 SiO₂의 조절된 에칭을 통하여 200nm 이내에 있는 포어-확장된 MSN 물질을 제조할 수 있는 효과를 가진다. 또한, MSN 크기는 다양한 용도에 적합하도록 200nm 이하로 유지할 수 있다.

Description

메조포러스 실리카 나노입자 및 이의 제조방법{Mesoporous silica nanoparticles, and method for preparing thereof}

본 발명은 메조포러스 실리카 나노입자, 이의 제조방법, 및 이를 이용한 거대 분자의 전달을 위한 전달체로의 용도에 관한 것이다.

메조포러스 실리카 나노입자(Mesoporous silica nanoparticles, 이하 'MSNs'라 함)는 높은 표면적을 가지며, 작은 분자로부터 단백질에 이르기까지 매우 광범위한 게스트(guest) 물질로서 잘 배열된 메조스케일 기공(pore)를 가지는 높은 기공 부피로 인해 유용한 약물 또는 단백질 전달 담체로서 다양하게 응용되어 왔다.

내포작용(endocytosis)을 통한 다양한 세포 내로 MSN의 높은 내재화 효능(internalization efficacy)으로 다른 경쟁 담체들보다 많은 잇점들을 가져왔다.

게스트 장착된 메조포어의 정교한 캐핑(sophisticated capping) 방법 및 캐핑되지 않은 방법을 이용한 MSNs에 기반한 서방형 방출되는 시스템과 관련된 많은 연구들이 증가되고 있다.

그러나, 단백질과 같은 큰 게스트 분자들을 위한 MSN 전달 시스템의 한 가지 결정적인 문제점은 통상 2~5nm 범위를 가지는 메조포어의 포어 크기의 한계에 있다는 것이다.

Kresge 등에 의해 MCM-41의 포어 확장을 위한 기본 방법에서는 팽창제(swelling agent)라고 불리는 소수성 포어 확장 분자의 사용을 개시하고 있다. 예를 들어, 1,3,5-트리메틸벤젠(TMB)을 포어 확장제로서 MCM-41 전구체(precursor) 용액에 그 함량을 달리하면서 단순히 첨가함으로써 포어가 6.5nm까지 확장된 MCM-41을 성공적으로 합성하였다.

또한, Zhao 등은 가수분해 조건 하에서 규산질 벽의 약한 구조 안정성을 극복하기 위하여 SBA-15를 위한 비이온성 플루로닉계 템플레이트 시스템을 이용한 방법을 개발하였다. SBA-15는 상기 MCM-41에 비해 더 두꺼운 실리카 벽을 가질뿐만 아니라 더 큰 메조포어를 가지는 것으로 밝혀졌다.

또한, P123 블록 공중합체를 포함하는 실리카졸의 에이징 온도를 단순히 변화시키는 것에 의해, SBA-15의 포어 크기를 8.9nm까지 매우 미세하게 조절한 결과도 있다. 그러나, 이러한 방법들은 여전히 200nm 이하의 포어 확장된 MSNs의 용도에만 제한적인 문제들이 있다.

최근, 이러한 문제들을 해결하려는 다양한 노력들이 진행되었다. 몇몇 유망한 논물들에서는 확장된 메조포어를 가지는 MSNs을 제시하고 있다. Min and Ryoo et al.은 2-단계 합성법을 이용하여 얻어진 확장된 포어를 가지는 MSNs을 보고하였다.

먼저 MSNs을 제조한 다음, 140℃에서 4시간 동안 동일 부피의 에탄올을 함유한 과량의 TMB의 존재하에서 산성-추출시킨 MSNs을 열처리시키는 과정을 거친다. 최종 포어-확장된 MSN은 포어 크기가 23nm를 가졌다.

유전자 전달을 위한 포어-확장된 MSNs의 성공적인 응용에도 불구하고, 이러한 제조방법에서는 여전히 고압의 폭탄(bomb)에서 높은 온도와 열처리 및 장시간의 반응시간이 필요하다. 따라서, 다양한 개선된 응용분야에 사용할 수 있는 포어-확장된 MSN의 새롭고, 단순한 제조방법이 필요한 실정이다.

비특허문헌 0001) Beck, J. S.; Vartuli, J. C.; Roth, W. J.; Leonowicz, M. E.; Kresge, C. T.; Schmitt, K. D.;( Chu, C. T. W.; Olson, D. H.; Sheppard, E. W.; McCullen, S. B.; Higgins, J. B.; Schlenker, J. L. J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 10834??10843. Zhao, D.; Huo, Q.; Feng, J.; Chmelka, B. F.; Stucky, G. D. J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 6024??6036.

본 발명의 목적은 입자 크기에서 중요한 변화를 가지지 않으면서, 짧은 반응 시간을 가지는 매우 온화한 조건에서 포어-확장된 메조포러스 실리카 나노입자 (MSNs)을 효과적으로 제조할 수 있는 방법을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제조되어, 확장된-메조포어, 및 초대형 메조포어를 모두 포함하는 메조포러스 실리카 나노입자(MSNs)를 제공하는 데 있다.

또한, 추가적으로 본 발명은 상기 메조포러스 실리카 나노입자(MSNs)를 거대 게스트 분자들의 전달체로 사용되는 용도를 제공하는 데도 있다.

본 발명에 따른 메조포러스 실리카 나노입자(MSNs)는 평균 직경이 4~5nm로 확장된 포어 크기를 가지는 확장된-메조포어, 및 입자 내부와 외부에 평균 직경이 20~60nm의 초대형 메조포어를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 확장된-메조포어는 Ca, 및 Mg 원자를 포함하는 알칼리 토금속 에천트를 이용하여 상기 실리카를 에칭시킴으로써 형성되는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 메조포러스 실리카 나노입자(MSNs)의 제조방법은 실리카 전구체를 이용하여 메조포러스 실리카 나노 입자를 제조하는 단계, 상기 제조된 메조포러스 실리카 나노 입자를 알칼리 토금속염 용액과 혼합하여 반응시키는 단계, 및 상기 반응물을 세척 및 건조시키는 단계를 포함할 수 있다.

상기 알칼리 토금속염 용액은 메탄올 용매를 사용하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명에 따르면, 상기 확장된-포어를 가지는 메조포러스 실리카 나노입자(MSNs)를 거대 게스트 분자들의 전달체로 사용되는 용도를 제공한다.

본 발명에 따르면, 극대화된 포화 크기를 가지는 MSN 물질을 제조하기 위하여, 가장 일반적인 포어 확장 분자를 사용하는 방법 대신에 부분적인 탈금속화 공정을 통하여 선택적인 에칭 방법을 이용하였다. 이러한 공정에서는, Al, 또는 Si 원자들이 스팀 또는 화학적 에천트에 의해 선택적으로 제거될 수 있으며, 결과적으로 포어 크기는 부분적으로 증가하게 된다.

따라서 본 발명에서는 SiO₂의 조절된 에칭을 통하여 200nm 이내에 있는 포어-확장된 MSN 물질을 제조할 수 있는 효과를 가진다. 또한, MSN 크기는 다양한 용도에 적합하도록 200nm 이하로 유지할 수 있다.

도 1은 하소된 MSN의 TEM 이미지이고,
도 2는 하소된 MSN(a) 과 Ca-MSN (b)의 FE-SEM 이미지와, 다른 확대Ca-MSN (c)와 Mg-MSN (d)를 다른 배율로 확대시킨 TEM 이미지이고,
도 3은 as-prepared MSN (a), Ca-MSN (b), 및 Mg-MSN (c)의 고체 상태의 ¹³C CP-MAS NMR 스펙트럼이고,
도 4는 as-prepared MSN, 하소된 MSN, Ca-MSN, 및 Mg-MSN의 TG 프로파일 그래프이고,
도 5는 구조 에칭을 통하여 템플릿이 없는 Ca-MSN 과 Mg-MSN의 생성 과정 및 CTPB 템플릿의 이온-교환 과정을 모식화한 것이고,
도 6은 비코팅된 Mg-MSN 의 상이한 배율로 측정한 SEM 이미지이고, (ㅧ30 000 (a) and ㅧ50 000 (b))
도 7은 하소된 MSN, Ca-MSN, 및 Mg-MSN (a)의 PXRD 패턴이고, 하소된 MSN, Ca-MSN, 및 Mg-MSN (b)의 N2 가스 흡착/탈착 결과이고, MSN (c), Ca-MSN (d), 및 Mg-MSN (e) 의 BJH 포어 크기 분포 그래프를 나타낸 것이며,
도 8은 ultra microtomed Ca-MSN의 TEM 이미지이고,
도 9는 Ca-MSN을 상이한 경사각에 따른 각 2D TEM 이미지를 작업하여 그 입자의 3D TEM 이미지를 나타낸 것이고,
도 10은 Ca-MSN (a)의 2D TEM 이미지와, single Ca-MSN 의 3D 재구성을 통하여 얻어진 단면의 이미지(b)이고,
도 11은 하소된 MSN (a), Ca-MSN (b), 및 Mg-MSN (c)의 고체 상태의 ²⁹Si DP-MAS NMR 스펙트럼이고,
도 12a는 3가지 종류의 포피린 게스트 분자의 구조이고,
도 12b는 MSN, Ca-MSN, 및 Mg-MSN에 흡착된 세가지 포피린 화합물의 함량을 나타낸 것이고,
도 12c는 BSA (PDB entry 4F5S) 와 IgG (PDB entry 1IGT)의 구조이고
도 12d는 MSN, Ca-MSN, 및 Mg-MSN에 흡착된 BSA 와 IgG의 함량을 나타낸 것이고,
도 13은 Ca-MSN으로부터 흡착된 IgG의 시험관내(in-vitro) 방출 특성을 측정 그래프이다.

이하에서 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 명세서에서 사용된 용어는 특정 실시예를 설명하기 위하여 사용되며, 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 다른 경우를 분명히 지적하는 것이 아니라면, 복수의 형태를 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 경우 "포함한다(comprise)" 및/또는 "포함하는(comprising)"은 언급한 형상들, 숫자, 단계, 동작, 부재, 요소 및/또는 이들 그룹의 존재를 특정하는 것이며, 하나 이상의 다른 형상, 숫자, 동작, 부재, 요소 및/또는 그룹들의 존재 또는 부가를 배제하는 것이 아니다.

본 발명은 매우 안전하고 간단한 방법을 이용하여 메조포러스 실리콘 나노 입자(MSNs)와 이의 제조방법, 및 거대 물질의 전달을 위한 상기 물질의 전달체로서의 용도를 제공한다.

본 발명의 명세서 전반에 걸쳐 사용된 '메조포러스'라는 것은 입자 내에 포함된 포어의 평균 직경이 메조포어(mesopore)의 범위, 즉 2~50nm인 포어들이 분포된 것을 의미한다. 그러나, 본 발명의 MSNs에 포함되는 초대형 메조포어의 경우 통상적인 메조포어 범위인 2~50nm를 초과하는 경우까지 포함하는 의미이다.

본 발명에 따른 메조포러스 실리콘 나노 입자는 평균 직경이 4~5nm로 확장된 포어 크기를 가지는 확장된-메조포어, 및 입자 내부와 외부에 평균 직경이 20~60nm의 초대형 메조포어를 모두 포함할 수 있다.

지금까지 단백질과 같은 거대 게스트 분자들의 전달을 위하여 사용되는 MSNs들은 대부분 메조포어의 크기가 2~5nm 범위를 가지기 때문에 그 응용 범위에 한계가 있었다.

그러나, 본 발명에 따른 MSNs는 평균 직경이 4~5nm로 확장된 포어 크기를 가지는 확장된-메조포어, 및 입자 내부와 외부에 평균 직경이 20~60nm의 초대형 메조포어를 동시에 포함하기 때문에 거대 게스트 분자들의 전달을 위한 전달체로서 그 응용범위가 더 확대될 것으로 기대한다.

이러한 본 발명의 MSNs는 하소 공정만을 거친 MSN보다 확장된 포어 크기를 가지는 4~5nm 크기의 메조 포어들이 고르게 분포되어 있으며, 상기 실리카 나노 입자의 내부와 외부에는 다수의 초대형 메조포어들이 포함되어 있다.

상기 초대형 메조포어들은 상기 4~5nm 크기의 메조 포어들이 붕괴되어 하나의 거대한 메조포어를 형성한 것으로 볼 수 있다.

종래에는 확장된 포어 크기를 가지는 MSNs의 제조를 위하여 팽창제를 사용하였으나, 본 발명에서는 알칼리 토금속 에천트를 사용하여 실리카 물질을 에칭시킴으로써 본 발명에 따른 구조를 가지도록 한다.

이러한 본 발명에 따른 메조포러스 실리카 나노입자(MSNs)의 제조방법은 실리카 전구체를 이용하여 메조포러스 실리카 나노 입자를 제조하는 단계, 상기 제조된 메조포러스 실리카 나노 입자를 알칼리 토금속염 용액과 혼합하여 반응시키는 단계, 및 상기 반응물을 세척 및 건조시키는 단계를 포함할 수 있다.

먼저, 실리카 전구체를 염기성 배지에서 계면활성제를 첨가하여 반응시키는 단계로서, 상기 실리카 전구체는 다양한 알킬그룹을 가지는 테트라알콕시실란 화합물이 바람직하며, 당 업계에서 통상적으로 사용되는 것인 한 특별한 제한없이 사용될 수 있다. 상기 테트라알콕시실란의 예로서는 테트라에톡시실란 (TEOS), 또는 테트라메톡시실란 (TMOS)을 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 계면활성제는 세틸피리디늄 브로마이드(CTPB)와 같은 양이온계 계면활성제가 바람직하며, 상기 CTPB에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 결과물에서 계면활성제 템플릿은 에어 하에서 하소 공정을 이용하여 제거시키면 메조포러스 실리카 나노 입자를 얻게 된다.

그 다음 단계는, 상기 메조포러스 실리카 나노 입자와 알칼리 토금속염 용액을 혼합하여 반응시키는 단계이다.

상기 알칼리 토금속염 용액은 Ca 및 Mg을 포함하는 알칼리 토금속을 포함하는 이들의 용액으로서, 상기 실리카 입자를 에칭시키는 에천트로 작용한다.

상기 Ca 및 Mg을 포함하는 알칼리 토금속염 용액의 예를 들면, Ca(NO₃)₂ㅇ4H₂O 용액, Mg(NO₃)₂ㅇ6H₂O 용액이 있으며, 상기 용액들은 메탄올 용매를 사용하여 용해시켜 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 반응은 30~70℃의 온도 범위에서 24~72시간 동안 수행시킬 수 있으며, 상기 알칼리 토금속염 용액의 에칭 반응을 통하여 상기 용액에 포함된 Ca⁺² 및 Mg⁺² 이온이 실리카 입자를 직접 공격함으로써 그 내부에 채널 형태의 다수의 초대형 포어가 형성된 것으로 설명될 수 있다.

또한 상기 반응은 pH 4~6의 산성 조건에서 수행되는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 상기 확장된-포어를 가지는 메조포러스 실리카 나노입자(MSNs)는 단백질 및 항체와 같이 그 크기가 큰 거대 게스트 분자들의 전달체로 사용될 수 있다.

이하에서 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 이하의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 또한, 이하의 실시예에서는 특정 화합물을 이용하여 예시하였으나, 이들의 균등물을 사용한 경우에 있어서도 동등 유사한 정도의 효과를 발휘할 수 있음은 당업자에게 자명하다.

실시예 1 : Ca - MSN 의 제조

1) MSN 의 제조

염기성 배지에서 계면활성제로서 세틸피리디늄 브로마이드(CTPB), 실리카 원료로서 테트라에틸 올쏘실리케이트(TEOS)를 이용하여 MSN를 제조하였다. CTPB(1.050 g, 2.73 mmol)과 2.0M NaOH 수용액(3.5 mL)를 탈이온화된 물(240mL)에 넣고 80℃에서 40분 동안 혼합시키면 투명한 노란색으로 나타났다. 이때, TEOS(5.0 mL, 22.4 mmol)를 상기 혼합물에 빠르게 주입시키고, 80℃에서 추가로 2.5시간 동안 교반시켰다. 노란색 고체 결과물을 여과시키고, 충분한 함량의 탈이온화시킨 물로 세척하여, 80℃에서 밤새 건조시켰다. 계면활성제 템플릿은 550 ℃에서 5시간 동안 에어 하에서 하소 공정을 이용하여 제거시켰다.

2) Ca - MSN 의 제조

상기 제조된 MSN 고체(0.5 g)을 Ca(NO₃)₂ㅇ4H₂O 용액(100 mL, 0.1 M 메탄올에 용해시킨 것임)에 혼합한 다음, 50℃에서 48시간 동안 교반시켰다. 고온 여과시킨 침전물을 메탄올과 탈이온화된 물로 세척하고, 80℃에서 밤새 건조시켰다.

먼저, 염기성 배지에서 계면활성제를 첨가하여 상기 실리카 전구체와 반응시키고, 첨가된 계면활성제 템플릿은 하소 공정을 통하여 제거시키면 메조포러스 실리카 나노 입자를 얻을 수 있다.

상기 얻어진 메조포러스 실리카 나노 입자를 알칼리 토금속염 용액과 혼합 및 반응시키면 알칼리 토금속 치환된 메조포러스 실리카 나노 입자를 얻을 수 있다.

실시예 2 : Mg - MSN 의 제조

상기 실시예 1의 1)에서 제조된 MSN 고체 (0.5 g)을 Mg(NO₃)₂ㅇ6H₂O 용액 (100 mL, 0.1 M 메탄올에 용해시킨 것임)과 혼합시키는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 과정을 거쳐 Mg-MSN을 제조하였다.

대조군 1

상기 실시예 1의 1)에서 제조된 하소된 MSN을 본 발명과 비교하기 위하여 대조군으로 사용하였다.

실험예 1 : 포피린 고정화

각 실리카 나노스피어의 표면 특성을 규명하기 위하여 각각 상이한 전하를 띄는 세 개의 포피린 화합물, 1)메조-테트라(4-N-메틸피리딜)포피린 테트라아요다이드 (TMPYP, Strem), 2) 메조-테트라페닐-21H,23H-포피린 징크(ZnTPP, Sigma-Aldrich), 및 3)테트라소듐 메토-테트라(4-설포네이트페닐)포피린 도데카하이드레이트 (TSPHP, Strem)을 이용하였다.

상기 대조군 1, 실시예 1~2에서 제조된 10 mg의 실리카 나노입자들(각각 MSN, Ca-MSN, and Mg-MSN)을 0.5 mM 포피린 용액(10 mL, ZnTPP는 아세톤에 용해시키고, TMPYP와 TSPHP는 탈이온화된 물에 용해시킨 것임)과 혼합한 다음, 상온의 암실에서 24시간 동안 약하게 교반시켰다.

상기 혼합물을 9000rpm에서 15분 동안 원심분리시키고, 상청액을 수집하였다. 상기 상청액 중의 포피린 잔류 함량을 계산하기 위하여, 각 포피린 화합물의 특성 흡수 파장(TMPYP at 421 nm, ZnTPP at 421 nm, and TSPHP at 414 nm)에서 100배 희석시킨 상청액을 UV??vis spectrometry를 이용하여 모니터링하였다.

실험예 2 : 단백질 고정화

염소 혈청으로부터 얻어진 2가지 단백질 IgG (Sigma no. I5256)와 BSA (Sigma no. A2153)를 단백질 고정화 실험을 위해 사용하였다. 상기 IgG는 PBS 용액(pH 7.40) 으로부터 실리카 샘플에 흡착되었으며, BSA 흡착은 아세테이트 완충액(pH 4.80)에서 수행되었다. 각 실리카 샘플들(5 mg, MSN, Ca-MSN, Mg-MSN)은 먼저 적절한 완충액 (2.5mL)에서 배양시킨 다음, IgG 흡착을 위한 PBS와 BSA 흡착을 위한 아세테이트 완충액을 1시간 동안 약하게 교반시켰다.

단백질 용액(2.5mL)을 0.8 mg mL??1 농도의 적절한 완충액으로 용해시키고, 상기 실리카 혼합물에 주입시켰다. 그 다음, 상기 혼합물을 24시간 동안 실온에서 교반시켰다. 상기 혼합물을 9000rpm에서 20분 동안 원심분리시키고, 상청액을 각 샘플로부터 수집하였다. 상기 각 상청액 중의 잔류 단백질 함량은 595nm에서 흡광도를 가지는 Bradford assay (Sigma no. B6916)를 이용하여 계산하였다.

실험예 3 : 구조 확인( FE - SEM , SEM , TEM 결과)

FE-SEM 이미지는 Hitachi Ultra-High-Resolution Analytical FE-SEM SU-70 (accelerating voltage = 5 kV)를 이용하였다. TEM 측정을 위한 카본 필름에 의해 지지된 구리 그리드 상에 샘플의 아세톤 현탁액을 떨어뜨리고 건조시켜, EDS spectrum을 위한 EDAX가 구비된 JEOL JEM-3000F (300 kV)를 이용하였다.

종래 MSN 물질을 문헌상에 나타낸 변형된 공지의 방법에 따라, 염기성 용액 내의 세틸피리디늄 브로마이드(CTPB)를 이용하여 제조한 대조군 1에 따른 MSNs의 평균 입자 크기는 다음 도 1의 TEM 이미지로부터 계산된 것과 같이 약 200nm 미만인 것으로 나타났다. 또한, 구형 및 막대 형태의 입자 모폴로지가 관찰되었다.

또한, 상기 대조군 1에 따른 하소시킨 MSN과 이온 교환을 통하여 CTPB 템플릿을 제거시킨 각각 실시예 1에 따른 Ca-MSN의 FE-SEM 사진(각각 a, b)과 실시예 1에 따른 Ca-MSN과 실시예 2에 따른 Mg-MSN의 TEM 사진(각각 c, d)을 다음 도 2에 나타내었다.

다음 도 2 a와 b에서와 같이, 하소시킨 MSN과 Ca-MSN의 입자 모폴로지에서는 두 샘플들 간의 어떠한 불일치성도 발견되지 않았다. 그러나, 하소된 MSN과 다르게 Ca-MSN은 매우 거친 입자 표면을 나타냈다. 대부분의 입자들이 그들의 고유한 크기를 유지하고 있었지만, FE-SEM 이미지를 통하여 매우 큰 채널과 표면 결함이 관찰되었다.

또한, 다음 도 2c에서와 같이 Ca-MSN에서 발생된 큰 채널들이 TEM의 측정 결과에서 선명하게 나타나고 있음을 알 수 있다. 결국, 입자 크기는 크게 변화하지 않았으나, 매우 많은 새로운 채널들이 생성되었음을 알 수 있다. 따라서, Ca(NO3)2ㅇ4H2O의 0.1M 메탄올 용액으로의 처리를 통하여 Ca-MSN에서 매우 큰 채널들이 효과적으로 생성되었음을 알 수 있다.

실험예 4 : CTPB template 잔류 함량 측정- NMR 데이터 + 탄소 함량 측정

상기 실시예 1에 따라 제조된 Ca-MSN 내에 잔류된 CTPB 템플릿의 함량을 고체 상태의 ¹³C cross-polarization magic angle spinning (CP-MAS) NMR spectroscopy를 이용하여 측정하였으며, 그 결과를 다음 도 3에 나타내었다.

고체상태의 magic-angle spinning (MAS) 핵자기공명(NMR) 스펙트럼은 ²⁹Si, ¹³C, 및 ¹H 에 대하여 각각 99.4, 125.8, 및 500 MHz 에서 Bruker Avance II spectrometer를 이용하였으며, ²⁹Si, ¹³C 핵은 이웃하는 ¹H 핵으로부터 direct-polarization (DP) 또는 cross-polarization (CP)를 이용하여 얻었다. ²⁹Si DP-MAS 스펙트럼은 테트라메틸실란을 이용하여 계산하였다.

놀랍게도, 매우 소량의 잔류 CTPB 템플릿이 존재하는 것을 알 수 있으며, 특히 3시간 동안 얻어진 MSN에 비해 5시간으로 확장된 시간으로 얻어진 샘플에서 CTPB의 자기 공명 시그널이 더 약하게 얻어지는 것으로 나타났다.

Ca-MSN(b) 과 Mg-MSN(c) 모두에서 각각 144.8 과 128.8 ppm에서 관찰되는 CTPB의 방향족 시그널은 관찰되지 않았다.

또한, 원소 분석을 통하여 Ca-MSN에서 탄소 함량은 2.8중량%인데 반해, MSN에서의 탄소 함량은 31.7중량%로 측정되었다.

다음 도 4의 TGA 분석 결과를 통하여, MSN에 비해 Ca-MSN에서의 잔류된 CTPB의 함량이 더 소량인 것을 알 수 있다. 약 120℃에서 초기 무게 손실이 있은 후, 표면에서 포획된 물 분자의 제거로 인해 800℃에서 최종 무게 손실은 5중량% 미만이다.

이러한 결과들을 기초로 하여, Ca(NO3)2ㅇ4H2O 메탄올 용액의 처리는 Ca2+ 이온 또는 단백질로 CTP+ 이온을 단순히 이온-교환시키거나, 또는 큰 채널을 생성(다음 도 5 참조)시킬 수 있도록 Ca2+ 이온에 의해 실리카 벽을 에칭시키는 방법을 통하여 CTPB 템플릿은 두 방법 모두를 이용하더라도 효과적으로 제거될 수 있음을 알 수 있었다.

Ca2+ 이온을 이용한 실리카의 에칭 메커니즘은 Ca(NO3)2ㅇ4H2O (pH ∼ 5.65)의 0.1M 산성 메탄올 용액을 결합한 결과 및 Ca2+ 이온이 SiO2를 직접 공격한 결과가 합해진 것으로 설명될 수 있다.

흥미롭게도, Mg(NO3)2ㅇ6H2O로 처리한 경우에도 상기 Ca(NO3)2ㅇ4H2O의 처리한 경우와 매우 유사한 결과를 나타낸다. Mg(NO3)2ㅇ6H2O 의 0.1M 메탄올 용액의 경우 그 pH는 5.32로서 역시 산성이다. Mg-MSN는 다음 도 6에서와 같이 매우 거친 에칭된 표면 구조를 나타낸다. 또한, 상기 도 2d에서 나타낸 TEM 이미지에서도 확장된 새로운 메조포어와 CTPB로부터 유래된 원래 크기의 메조포어 템플릿 모두 관찰되고 있다. 그러나, SEM과 TEM 이미지를 주의깊게 관찰해 보면, Ca(NO3)2ㅇ4H2O 용액을 이용한 에칭 효과가 같은 조건에서 Mg(NO3)2ㅇ6H2O 용액을 이용한 것보다 보다 효과적인 것을 알 수 있다.

실험예 5 : X-선 회절 분석

분말의 X-선 회절 패턴을 Bruker D8 Advance diffractometer (40 kV, 40 mA, step size = 0.02ㅀ)을 이용하여 측정하였다.

다음 도 7a에서 확인할 수 있는 바와 같이, 하소된 MSN의 패턴과 비교했을 때 Ca-MSN 과 Mg-MSN 두 샘플은 매우 비슷한 양상의 분말 X-선 회절 패턴을 나타내고 있다.

따라서, Ca-MSN 과 Mg-MSN의 구조는 판상비가 1:√3:√4:√7를 가지는 (100), (110), (200), 및 (210) 피크들을 포함하는 헥사고날 MCM-41 실리카의 잘 resolved 회절 패턴 특성을 가지는 MSNs의 헥사고날 시메트리를 유지하고 있음을 알 수 있다. 또한, Ca-MSN (2.06ㅀ, d-spacing =4.29 nm)과 Mg-MSN (2.06ㅀ, d-spacing = 4.29 nm) 모두에서 (100) 면에서 나타나는 회절 피크들은 하소된 MSN의 2.19ㅀ (d-spacing = 4.03 nm)에서 관찰되는 것과 비교했을 때 매우 미세하게 변화된 것으로 관찰되었다.

포어가 커졌음에도 불구하고, 헥사고날 메조포어의 균일한 셀 크기는 거의 일정하게 유지됨을 알 수 있다. 아마도 이들의 큰 치수 또는 작은 수의 회절 면으로 인해 극대화된 포어에 해당되는 피크는 발견되지 않았다.

또한, 다음 도 7b를 참조하면, 하소된 MSN(760 m2 g??1)에 비해 Ca-MSN (312 m2 g??1)와 Mg-MSN (425 m2 g??1) 모두 BET 표면적의 감소가 수반되는 것으로 나타났다. 이는 포어가 커짐으로 인한 결과로 볼 수 있다.

MSNs의 포어 부피는 0.63 cm3 g??1로서, 이 또한, Ca-MSN (0.45 cm3 g??1)과 Mg-MSN (0.41 cm3 g??1)의 값보다 큰 것을 알 수 있다. 하소된 MSN과 비교하여 Ca-MSN과 Mg-MSN의 포어 부피가 감소한 것은 주로 Ca-MSN 과 Mg-MSN의 외부 표면의 동시 에칭으로 인한 것으로 볼 수 있으며, 이로 인해 포어 부피를 크게 증가시키지 못한 것이다.

이러한 결과는 다음 도 7c~7e의 Barrett??Joyner??Halenda (BJH) 포어 사이즈 분포 그래프에서 확인할 수 있는 바와 같이, 초-대형 포어 및 확장된 메조포어의 존재에 의해서도 뒷받침된다. MSN의 경우 2.44nm의 초기 메조포어 크기를 가지지만, Ca-MSN의 경우 5.41 nm, Mg-MSN의 경우 4.19 nm로 메조 포어가 커진 것으로 측정되었다. 또한, 포어 크기가 24.5nm와 44.2 nm 인 초-대형 포어도 관찰되었다.

또한, 상기 초-대형 포어의 평균 포어 크기(4Vtot/Atot)를 Hg-porosimetry를 이용하여 측정하였으며, 여기서 Vtot는 총 점유 부피이고, Atot는 총 포어 면적이다.

Ca-MSN와 Mg-MSN는 평균 포어 크기가 각각 47.5와 52.4 nm로 측정되었다. 이러한 값은 TEM 측정 결과와 잘 일치하는 것이다. 통상적으로, 산-추출 과정은 그 표면에 유기관능기를 가지는 하소된 MSN에서 암모늄계 유기 템플릿의 제거를 위해 일반적으로 많이 적용되어 온 방법이다.

그러나, 이 경우, 실리카 구조가 과하게 에칭된 것은 관찰되지 않았다. 결과적으로, 산-추출된 샘플은 높은 표면적을 가지는 잘 배열된 헥사고날 채널을 나타냈다. 선택적으로, 실리카 물질을 염기성 수성 하이드록사이드 용애으로 처리하여 포러스 할로우 실리카 스피어, 실리카/카본 코어/쉘 입자, Au/실리카 코어-쉘 나노스피어, 및 골이 진 포러스 실리카 스피어와 같은 형태가 다른 다양한 포러스 물질 제조를 위한 실리카 에칭에 효율적인 것으로 알려져 있다.

그러나, 아직까지는 알칼리 토금속을 에천트로 사용하여 에칭시키는 방법을 이용하여 포어-확장된 MSNs을 얻은 결과는 아무도 제시하지 못하고 있다.

실험예 6 : TEM 단층촬영 결과

또한, ultra microtomed Ca-MSN의 TEM 이미지를 통해서도 Ca-MSN의 표면뿐만 아니라 그 내부에서도 새로운 큰 채널들이 위치해 있는 것으로 측정되었다.(도 8 참조) Ca-MSN의 포어 구조를 상세히 관찰하기 위하여 3차원 TEM 단층촬영을 수행하였다.

전자 단층촬영은 한국기초과학연구소의 Tecnai G2 Spirit (120 kV)를 이용하였으며, 기본 데이터는 +60ㅀ 에서 ??60ㅀ까지 매 2ㅀ마다 얻었다. 이미지 배열은 IMOD software를 이용하였으며, 주어진 이미지는 AMIRA 4.0 software를 이용하여 얻었다.

하나의 Ca-MSN을 가지고 상이한 경사각에 따른 각 2D TEM 이미지를 작업하여 그 입자의 3D 모폴로지를 얻었다. (도 9)

다음 도 10은 Ca-MSN의 재구성된 TEM 단층 촬영 이미지를 나타낸 것으로, 10a는 비교를 위한 Ca-MSN의 일반적인 TEM 이미지이다. 또한, Ca-MSN의 3D 재구성을 통하여 얻어진 단면 이미지를 나타낸 다음 도 10b에서는 한쪽 끝에서 다른 쪽으로 관통한 듯한 2개의 선명한 초-대형 메조포어(밝은 회색 부분)가 관찰되는데, 이로 인해 거대한 게스트 분자들을 잡아두는 데 적합하다. 가장 긴 직경을 기준으로 한 상기 두 포어들의 포어 크기는 약 43.8nm와 32.9nm였다. 완전히 재구성된 3D 부피 이미지(도 10c, 10d)를 보면, 그 표면에서 초-대형 메조포어들의 다수의 구멍들(openings)이 발견됨을 알 수 있다.

실험예 6 : ζ- potential 측정결과

샘플 회전자는 5kHz의 회전속도로 회전시켰으며, ζ-포텐셜 측정은 Otsuka ELS-8000 전기영동 광산란 스펙트로포토미터를 이용하여 수행하였다.

샘플 입자(3mg)는 증류수(10mL)에 현탁시켜, 30분 동안 초음파처리하여 ζ-포텐셜 측정하였다. N2 흡착-탈착 측정은 Belsorp-miniII at 77 K (BEL Japan)을 이용하였다. Hg-porosimetric 분석은 Micromeritics AutoPore IV 9500를 이용하였으며, 샘플들을 높은 진공 하에서 423K의 온도에서 2시간 동안 건조시켰다. 각 샘플에서 카본 함량은 EA1112 (CE Instruments, Italy)를 이용하여 측정하였다.

Ca-MSN와 Mg-MSN의 표면 특성 확인을 위하여 제타-포텐셜(ζ-potential)을 측정하였으며, 그 결과를 다음 표 1에 나타내었다.

재료	ζ-otential(mV)
하소된 MSN(대조군 1)	-36.66ㅁ0.46
Ca-MSN(실시예 1)	-23.60ㅁ0.39
Mg-MSN(실시예 2)	-21.50ㅁ0.43

상기 표 1의 결과에서와 같이, Ca-MSN(??23.60 mV)와 Mg-MSN (??21.50 mV)는 하소된 MSN (??36.66 mV)에 비해 비교적 비슷한 값의 표면 포텐셜 값을 가지는 것을 알 수 있다. 이는 이들의 표면에 잔류되어 있는 양이온 때문인 것으로 볼 수 있다. 그러나, ICP 분석을 기초로 잔류 양이온은 Ca-MSN 에서는 Ca가 1.94중량%, Mg-MSN 에서는 Mg가 1.35중량%로 소량만이 잔류된 것으로 나타났다. 표면에서 이러한 Ca 또는 Mg 이온의 잔류량이 비교적 소량이기 때문에 Ca-MSN 과 Mg-MSN 의 감소된 표면 저항은 산성 표면의 실라놀(Si??OH) 그룹의 더 높은 함량으로 응축되도록 할 수 있다. 이는 다음 도 11의 고체 상태의 ²⁹Si DP-MAS NMR 스펙트럼에 의해서도 명확하게 뒷받침된다.

실험예 7 : NMR 측정 결과

3 종류의 MSNs의 고체 상태의 ²⁹Si DP-MAS NMR 측정을 통해 실리카 구조의 평균 축합도(degree of condensation) 정보를 얻을 수 있다. 실리콘 공명 피크들이 이들의 특성 피크들인 Q⁴ ((

SiO)₄Si), Q³ ((

SiO)₃SiOH), 및 Q² ((

SiO)₂Si(OH)₂) 에서 관찰됨을 알 수 있다. Q4/(Q3 + Q2) 비율은 실리카 구조에서 평균 축합도를 정량적으로 평가할 수 있다. 예상할 수 있는 바와 같이, Ca-MSN (2.03)와 Mg- MSN (1.70)에서의 비율이 하소된 MSN (1.17)에 비해 더 높게 나타났다. 따라서, Ca-MSN와 Mg-MSN에서 표면 전하의 감소는 알칼리 토금속염의 처리시키는 동안 실리카 구조에서 실리카의 농축에 더 기여하는 것을 알 수 있다.

실험예 8 : 흡착 특성 분석

다음 도 12a에서와 같이 거대한 게스트 분자의 흡착 테스트는 상이한 전하를 가지는 포프린 화합물을 이용하였다.

MSN에 봉입된 포피린은 촉매, 광감성 재료, 및 포텐셜 암 치료 등과 같은 다양한 용도에 응용될 수 있기 때문에 본 발명에서는 포피린 화합물 시리즈를 선택하였다.

메조-테트라(4-N-메틸피리딜)포피린 테트라아요다이드 (TMPYP)와 테트라소듐 메토-테트라(4-설포네이트페닐)포피린 도데카하이드레이트 (TSPHP)는 각각 영구 +와 ?? 전하를 가지며, 메조-테트라페닐-21H,23H-포피린 징크(ZnTPP)는 중성의 전하를 띈다. 다음 도 12b에서와 같이, 양성 전하를 띄는 TMPYP에서 가장 많은 흡수가 일어나며, 음성 전하를 띄는 TSPHP 의 흡착이 가장 작은 값을 나타낸다.

Ca-MSN와 Mg-MSN는 더 낮은 표면적과 음전하를 띔에도 불구하고 모두 MSN에 비해 더 많은 TMPYP를 흡수하는 것으로 나타났으며, 이는 MSN보다 더 큰 포어로 인해 두 물질에서 캡슐화(encapsulation)할 수 있는 높은 용량을 가지는 것으로 볼 수 있다.

또한, 흡착 함량은 포어 직경이 3.5nm이고, BET 비표면적이 950 m2/g인 메조포어 실리카의 그램당 177mg으로 보고된 이전 연구의 값을 초과한다. 그러나, Ca-MSN 와 Mg-MSN의 더 낮은 표면 전하에도 불구하고, Ca-MSN 와 Mg-MSN 모두에서 MSN에 비해 음전하를 띄는 게스트인 TSPHP, 중성인 ZnTPP에서 더 낮은 흡착량을 나타냈다.

따라서, Ca-MSN 와 Mg-MSN의 초-대형 포어는 양전하를 띄는 게스트 분자를 포착하는 데 더 효과적이다.

Ca-MSN 와 Mg-MSN의 생분자 제거 능력(biomolecular sequestration abilities)을 연구하기 위하여 소 혈청 알부민(BSA)와 immunoglobulin G (IgG)의 uptake amounts는 다음 도 12c에서와 같이 각각 69와 150kDa로 큰 분자 크기를 가지는 것으로 나타났다. 두 단백질은 다공성 물질에 의해 큰 단백질 또는 항체 제거 효과를 측정하는 데 많이 사용된다.

다공성 물질에 의한 BSA와 IgG의 세포간 전달은 그 성공에 한계가 있다. 단백질과 항체의 흡착량은 Bradford assay에 의해 측정하였다.

Ca-MSN 그램당 약 307 mg 의 BSA와 262 mg 의 IgG이 흡착되었으며, 이러한 수치는 다음 도 12d에서 확인할 수 있는 바와 같이, Mg-MSN 그램당 263 mg의 BSA와 115 mg 의 IgG; 및 MSN 그램당 250 mg의 BSA와 162 mg의 IgG보다 더 높은 값이다.

Mg-MSN에 비해 Ca-MSN에 고정화된 함량이 더 높은 값을 나타내는 것은 초-대형 메조포어 구조를 잘 발달할 수 있도록 한다.

하소된 MSN보다 더 낮은 표면적을 가지는 Ca-MSN을 고려할 때, 이러한 BSA 와 IgG 에서의 높은 흡착 능력은 단백질 전달 및 효소 고정에 매우 놀랍고 중요한 결과이다. 실리카 표면에서 Ca+2 이온은 단백질 및 이들의 높은 친화력으로 인한 큰 분자들의 흡착을 개선시킬 수 있다.

실험예 9 : In - vitro 방출 특성

Ca-MSN으로부터 흡착된 IgG의 시험관내(in-vitro) 방출 특성을 측정하였다. 다음 도 13을 참조하면, 방출 초기 단계에서는 방출 속도가 매우 느린 것으로 관찰되다가 점점 증가되는 것을 알 수 있다. 이러한 결과를 토대로, Ca-MSN은 큰 게스트 분자들의 잠정적인 전달 담체로 사용될 수 있을 것으로 기대한다.

Claims (5)

1. 삭제
2. 삭제
3. 계면활성제를 포함하는 염기성 수용액에 실리카 전구체를 혼합하여 메조포러스 실리카 나노 입자를 제조하는 단계,
   상기 제조된 메조포러스 실리카 나노 입자를 메탄올 용매를 사용하는 알칼리 토금속염 용액과 혼합하여 반응시키는 단계, 및
   상기 반응으로 생성된 생성물을 세척 및 건조시키는 단계를 포함하는 메조포러스 실리카 나노입자(MSNs)의 제조방법.
   
4. 제3항에 있어서,
   상기 계면활성제를 포함하는 염기성 수용액은 계면활성제로서 세틸피리디늄 브로마이드(CTPB)와 NaOH수용액을 혼합한 것을 특징으로 하는 메조포러스 실리카 나노입자(MSNs)의 제조방법.
   
5. 제3항에 있어서,
   상기 알칼리 토금속염 용액은 질산칼슘 4수화물(Ca(NO₃)₂·4H₂O) 또는 질산마그네슘 6수화물(Mg(NO₃)₂·6H₂O)의 용액인 것을 특징으로 하는 메조포러스 실리카 나노입자(MSNs)의 제조방법.

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