KR101732245B1 - 살모넬라 티피뮤리움 검출용 다중인식 고분자 펩타이드 프로브 - Google Patents

살모넬라 티피뮤리움 검출용 다중인식 고분자 펩타이드 프로브 Download PDF

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Abstract

본 발명은 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806에 특이적으로 결합하는 다중인식 펩타이드 고분자 프로브에 관한 것이다. 본 발명의 고분자 프로브를 이용하면 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806을 효과적이고 특이적으로 검출할 수 있다.

Description

살모넬라 티피뮤리움 검출용 다중인식 고분자 펩타이드 프로브{Polyvalent-directed Polymer Peptide Probe for Detection of Salmonella Typhimurium}
본 발명은 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806에 특이적으로 결합하는 다중인식 고분자 펩타이드(Polyvalent-directed Polymer Peptide) 프로브에 관한 것이다.
살모넬라는 엔테로박테리아과의 살로넬라속(Salmonella)에 속하는 프로테오박테리아의 일종이다. 막대 모양의 세균으로 직경 약 0.7-1.5 μm, 길이 약 2-5 μm 정도의 크기로 주로 사람이나 동물의 소화관에 서식한다.
살모넬라에 감염되는 경우 보통 두통과 발열, 심한 복통, 설사, 오심, 구토의 증상이 생긴다. 살모넬라는 주로 감염된 가축(즉, 육류, 가금류, 달걀 및 이들의 부산물)을 식자재로 사용한 덜 익힌 음식을 섭취했을 때 인체에 전염된다. 또한 살모넬라는 감염된 사람의 손을 통해서 사람에게서 사람으로 전염되며, 동물에게서 사람으로 전염되기도 한다.
살모넬라균에 의해 발병하는 대표적인 질환으로 식중독이 있다. 식중독은 병원성 세균, 병원성 세균에서 발현되는 독소, 바이러스 및 자연계에 존재하는 독소에 의하여 발병하는 질병으로서 알려진 병원균도 많지만 불명의 원인도 다수 존재하는 질병이다. 국내의 식중독균에 의한 발병통계에 의하면 특히 병원성 대장균 및 살모넬라균에 의한 발병건수 및 환자수가 1, 2위를 차지하고 있다.
현재 대부분의 살모넬라 및 병원성 대장균등의 식중독균을 검출하는 방법은 세포 배양법, 유전자분석법(PCR) 및 면역분석법(ELISA)등을 사용하며, 이러한 방법들은 자체적으로 높은 민감도와 특이성을 제안하는 방법들이지만 검출시간이 제안하는 방법보다 길고 목표 분자의 분리정제가 필요하며 때로는 고가의 검출 장비가 필요한 현실이다. 때문에 현장에서 편리한 방법으로 조기에 식중독균을 검출하는 데는 한계가 있다고 판단되어진다.
식중독균의 특성상 질병증상이 나타나지 않는 조속한 시간 내에서 진단 여부가 매우 어려우며 초정밀 검역을 위하여 높은 감도, 신속성을 지닌 검출방법의 개발이 필수적이다. 따라서 현재 식중독 발병 원인균 1, 2위를 차지하는 살모넬라 및 병원성 대장균들 검체대상에 대하여 조기에 진단하여 검출할 수 있는 기술개발이 필요하다.
대한민국 공개특허공보 제10-2013-0062276호는 살모넬라 아종을 검출 및/또는 정량화하기 위한 핵산 프로브에 관하여 개시하고 있고, 대한민국 공개특허공보 제10-2013-0055040호는 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhymurium), 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum) 및 살모넬라 풀로룸(Salmonella pullorum) 의 동시 검출을 위한 프라이머 세트에 대하여 개시하고 있다. 또한 공개특허공보 제10-2009-0122554호에는 살모넬라 티피뮤리움 검출용 프라이머 세트에 관한 내용을 개시하고 있으며, 공개특허공보 제10-2014-0064399호에는 살모넬라 티피뮤리움에 특이적으로 결합하는 소정의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 압타머에 대하여 개시하고 있다.
본 발명은 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806에 특이적으로 결합을 형성하는, 종래 공지되지 않은 신규한 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 프로브를 폴리펩타이드 고분자 백본에 부착시켜 민감도 및 특이도가 더욱 증가된 다중인식 펩타이드 고분자 프로브를 제공한다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806 균주에 특이적으로 결합하는 신규한 프로브를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806 균주에 특이적으로 결합하는 다중인식 고분자 펩타이드를 발굴하였고, 이를 이용하면 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806 균주를 높은 친화도로 특이적으로 검출할 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 살모넬라 티피뮤리엄 KCCM 11806 검출용 다중인식 펩타이드 고분자 프로브를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상술한 다중인식 펩타이드 고분자 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806 검출용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상술한 다중인식 펩타이드 고분자 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806 검출 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806 검출 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 살모넬라 티피뮤리엄 KCCM 11806 검출용 다중인식 펩타이드 고분자 프로브를 제공한다:
(a) 폴리-라이신 백본; 및
(b) 서열목록 제1서열 또는 제2서열의 아미노산 서열을 가지며, 상기 백본에 결합된 둘 이상의 올리고펩타이드.
본 발명자들은 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806 균주에 특이적으로 결합하는 신규한 프로브를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806 균주에 특이적으로 결합하는 다중인식 고분자 펩타이드를 발굴하였고, 이를 이용하면 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806 균주를 높은 친화도로 특이적으로 검출할 수 있음을 규명하였다.
본 발명의 서열목록 제1서열 또는 제2서열의 아미노산 서열은 랜덤 파지 펩타이드 라이브러리(M13 파지 gp3 minor coat 단백질에 융합된 12개의 아미노산으로 구성된 무작위 배열을 통하여 27 억 개의 다양한 아미노산 서열을 가지도록 제작된 파지 펩타이드 라이브러리-Ph.DTM(Phage Display Peptide Library Kit, New England Biolabs)를 구입하여 사용함)를 이용하여 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806 균주에 특이적으로 결합하는 올리고펩타이드 서열을 찾아낸 것이다. 본 명세서 상의 용어 "올리고펩타이드"는 일반적으로 대략 아미노산 10개 전 후로 이루어지는 비교적 작은 펩타이드를 의미하고, 보다 구체적으로 본 발명에서는 상술한 펩타이드 라이브러리를 구성하는 12개의 아미노산으로 구성된 펩타이드를 의미한다.
본 발명의 올리고펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로는 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법이 포함되나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 본 발명의 펩타이드는 유전공학적 방법에 의해 제조될 수 있다. 우선, 통상적인 방법에 따라 상기 펩타이드를 코딩하는 DNA 서열을 제작한다. DNA 서열은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 제작할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(예: Biosearch 또는 Applied Biosystems사에서 판매하는 것)를 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 제작된 DNA 서열은 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 그 DNA 서열의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 DNA 서열에 의해 코딩된 실질적으로 순수한 펩타이드를 회수한다. 상기 회수는 이 기술분야에서 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다. 상기에서 '실질적으로 순수한 펩타이드'라 함은 본 발명에 따른 펩타이드가 숙주로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 본 발명의 펩타이드 합성을 위한 유전공학적 방법은 다음의 문헌을 참고할 수 있다: Maniatis et al., Molecular Cloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., Second(1998) and Third(2000) Edition; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie & Fink (eds.), Academic Press, San Diego, Calif,1991; 및 Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:12073-12080, 1990. 본 발명의 펩타이드는 N-말단의 아미노 말단의 반응성 제거를 위한 공지된 변성이 가능하고, 예를 들어 아세틸화(Acetylation)가 가능하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명인 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806에 특이적으로 결합하는 올리고펩타이드 범위에 포함될 수 있는 생물학적 기능 균등물은 본 발명의 펩타이드와 균등한 생물학적 활성을 발휘하는 아미노산 서열의 변이에 한정될 것이라는 것은 당업자에게 명확하다.
이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스 (hydropathic idex)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신 (+4.5); 발린 (+4.2); 루이신 (+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글라이신 (-0.4); 쓰레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 타이로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5).
펩타이드의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.
한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 펩타이드를 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌 (+3.0); 라이신 (+3.0); 아스팔테이트(+3.0± 1); 글루타메이트 (+3.0± 1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글라이신 (0); 쓰레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5 ± 1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 루이신 (-1.8); 아이소루이신 (-1.8); 타이로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4).
친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명인 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806에 특이적으로 결합하는 올리고펩타이드는 서열목록1 또는 2에 기재된 서열과 실질적인 동일성 (substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 98%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981) Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10(1990))은 NBCI (National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.
본 발명인 올리고펩타이드의 타겟인 "살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806"은 대표적인 살모넬라 종의 균주에 해당한다.
본 명세서 상의 용어 "다중인식 펩타이드 고분자 프로브(Polyvalent-directed Polymer Peptide, PDPP)" 는 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806에 결합하는 다중 인식 부위로서의 2이상의 상술한 올리고펩타이드를 포함하는 펩타이드 고분자를 의미한다. "다중인식 펩타이드 고분자 프로브"는 본 명세서 상에서 그 기재 편의를 위해 "펩타이드 고분자 프로브", "펩타이드 고분자", 또는 "고분자 프로브" 등으로 기재할 수 있다. 본 발명의 올리고펩타이드는 서열목록 제1서열 또는 제2서열의 아미노산 서열일 수 있고, 본 발명인 다중인식 펩타이드 고분자 프로브는 서열목록 제1서열의 올리고펩타이드와 서열목록 제2서열의 올리고펩타이드 중에서 선택되는 단일종의 올리고펩타이드 만을 포함할 수 있고, 또한 두 종류의 올리고펩타이드를 모두 포함하는 것도 가능하다. 두 종류의 올리고펩타이드를 모두 포함하는 경우, 두 올리고펩타이드의 상대적인 함량 비율은 제한되지 않는다.
본 발명의 "폴리-라이신 백본"은 복수 개의 라이신들 서로 간의 펩타이드 결합에 의해 형성된 아미노산 체인을 의미한다. 라이신은 측쇄에 반응성이 큰 아민기를 포함하고 있어서, 상술한 올리고펩타이드가 결합될 수 있는 부위를 제공한다. 폴리-라이신 백본은 복수 개의 라이신을 포함함으로써, 복수 개의 결합 부위를 제공하고, 이로 인해 복수 개의 올리고펩타이드가 결합할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 있어서, 본 발명의 폴리-라이신 백본은 D-라이신으로 구성된다. L-라이신으로 구성된 백본을 사용하는 경우에도, 본 발명인 다중인식 고분자 펩타이드 프로브의 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806 검출 활성 자체에는 큰 차이가 없을 것이지만, 체내 효소 반응에 대한 기질로서 제공되지 않도록 바람직하게 D-라이신으로 구성된 백본을 사용할 수 있다. 특별히 D-라이신으로 구성된 백본은 본 명세서 상에서 용어 "PDL(poly-D-lysine)"로 기재할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 폴리-라이신 백본은 30 kDa 내지 500 kDa인 것을 사용할 수 있다. 상기 백본은 바람직하게는 50 kDa 내지 450 kDa, 더 바람직하게는 70 kDa 내지 400 kDa, 더욱 더 바람직하게는 100 kDa 내지 350 kDa, 가장 바람직하게는 150 kDa 내지 300 kDa인 것을 사용할 수 있다. 150 kDa 내지 300 kDa의 폴리-라이신 백본은 대략 1000-2500개의 라이신을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 올리고펩타이드는 본 발명의 폴리-라이신 백본의 측쇄(side chain)의 아민 그룹에 결합되어 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상술한 올리고펩타이드와 폴리-라이신 백본의 측쇄의 아민 그룹 간의 결합은 링커에 의한 결합이다. 본 발명의 링커는 헤테로 이중 기능적인(heterobifunctional) 것을 바람직하게 이용할 수 있다. 본 발명의 올리고펩타이드는 헤테로 이중 기능적인 링커와 결합을 형성시키기 위해 일 말단에 시스틴을 추가로 포함할 수 있다. "헤테로 이중 기능적인 링커"는 일 말단에, 폴리-라이신 백본의 측쇄 아민 그룹과 치환반응을 일으킬 수 있는 좋은 이탈기를 포함하고, 다른 일 말단에, 상술한 올리고펩타이드의 카르복시말단 부근에 첨가된 시스틴의 설프히드릴기(sulfhydryl group)와 치환 반응을 일으킬 수 있는 치환기를 포함하는 링커를 나타낸다. 보다 구체적으로 예를 들면, SPDP(N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate), SATA(N-Succinimidyl S-Acetylthioacetate), SMPT(4-Succinimidyloxycarbonyl-α-Methyl-α-(2-Pridylditio)Toluene), SMCC(Sulfhydryl-4-(N-Maleimidomethyl)cyclohexane-1-Carboxylate), MBS(m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester), SMPB(Succinimidyl-4-(p-Maleimidophenyl)butyrate), GMBS(N-(γ-malemidobutyryloxy)succinimide ester)를 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상술한 링커들의 일 말단에 위치한 N-히드록시석신이미드 에스터(N-hydroxysuccinimide ester)는 좋은 이탈기(leaving group)로써 작용하여 폴리-라이신 백본의 측쇄(side chain)에 존재하는 아민 기(amine group)와의 치환반응으로 인해 폴리-라이신 백본과 SPDP를 결합시킨다. 그리고 상술한 링커들의 다른 일 말단에 포함된 치환기들은 본 발명의 단일 올리고펩타이드의 카르복시 말단 부근에 첨가된 시스틴의 설프히드릴기와의 치환 반응에 의해 가교 반응을 일으키고, [폴리-라이신 백본]-[링커]-[올리고펩타이드]를 형성하게 된다.
본 발명의 다중인식 고분자 펩타이드 프로브가 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806과 결합을 형성하였는지 여부를 용이하게 확인, 검출 및 정량하기 위하여, 본 발명인 프로브에 포함된 올리고펩타이드는 표지된 상태로 제공될 수 있다. 즉 검출가능한 표지에 링크(예: 공유 결합 또는 가교)되어 제공될 수 있다. 상기 링크는 본 발명의 펩타이드와 검출가능한 표지 사이에 직접 형성되는 것도 가능하지만, 링커를 통해서도 형성 가능하다. 상기 링커는 당업계에 공지된 어떠한 것도 사용 가능하며, 적합한 펩타이드 링커의 서열은 다음과 같은 요소를 고려하여 선택될 수 있다: (a) 유연한 연장된 컨포메이션에 적용될 수 있는 능력; (b) 에피토프와 상호작용 하는 이차구조를 생성하지 않는 능력; 및 (c) 에피토프와 반응할 수 있는 소수성 잔기 또는 전하를 갖는 잔기의 부재.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 올리고펩타이드는 발색효소, 방사성 동위원소, 크로모포어(chromopore), 발광물질 및 형광물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나로 표지된다.
상기 표지는 구체적으로 예를 들면, 발색효소에 해당하는 퍼옥시다제(peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase)); 방사성 동위원소에 해당하는 124I, 125I, 111In, 99mTc, 32P,35S; 크로모포어(chromophore); 발광물질 또는 형광물질에 해당하는 FITC, RITC, 로다민(rhodamine), 텍사스레드(Texas Red), 플로레신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 퀀텀닷(quantum dots)일 수 있고, 이에 제한되지 않는다.
유사하게, 상기 검출 가능한 표지는 항체 에피토프(epitope), 기질(substrate), 보조인자(cofactor), 저해제 또는 친화 리간드일 수 있다. 이러한 표지는 본 발명의 펩타이드를 합성하는 과정 중에 수행할 수도 있고, 이미 합성된 펩타이드에 추가로 수행될 수도 있다.
상기 검출 가능한 표지를 포함하는 올리고펩타이드는 각각의 표지에 대하여 종래 공지된 검출 방법을 이용하여 검출하는 것이 가능하다. 구체적으로 예를 들어 형광 신호 FITC를 표지로 이용하는 경우, 형광광도계(Fluorometer)를 이용하여 펩타이드에 연결되어진 FITC의 최대 파장(Excitation : 495 nm, Emission : 520 nm)에서 각 펩타이드 농도에 대한 형광세기를 측정하는 방법을 이용할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 다중인식 펩타이드 고분자 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806 검출용 조성물을 제공한다. 본 발명인 조성물은 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806 검출을 위한 다른 프로브들을 함께 포함할 수 있으며, 여러 균주의 동시 검출을 위해 다른 균주의 검출을 위한 프로브들을 함께 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 다중인식 펩타이드 고분자 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806 검출 키트를 제공한다. 본 발명인 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806 검출 키트는 서열목록 제1서열 또는 제2서열의 올리고펩타이드를 포함하는 다중인식 펩타이드 고분자 프로브를 포함하며, 상기 다중인식 펩타이드 고분자 프로브에 포함되는 올리고펩타이드는 앞서 기재한 바와 같이 화학적 또는 유전공학적 방법에 의해 수득된 것일 수 있다. 상기 다중인식 펩타이드 고분자 프로브 및 상기 올리고펩타이드에 관해서는 본 발명의 다른 일 양태들에 대한 설명을 위해 상술한 바와 동일하다. 본 발명의 키트에는 고분자 펩타이드의 구조 또는 생리 활성을 안정하게 유지시키는 완충액 또는 반응액이 추가로 포함될 수 있다. 또한, 안정성을 유지하기 위해, 분말 상태 또는 적절한 완충액에 용해된 상태 또는 4℃ 유지된 상태로 제공될 수 있다.
본 발명인 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806 검출 키트는 기존 PCR 방법에 비하여 빠르고 편리하게 현장에서 진단이 가능하고, 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806을 포함하는 식중독균 형광 검출 키트 형태로 제공될 수 있다. 식중독균만을 특이적으로 검출이 가능하며, 형광현미경을 통하여 식중독균을 이미지화하여 검출 할 수 있는 시스템의 형태로 제공될 수 있다.
살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806 검출을 용이하게 하기 위하여, 본 발명의 검출 키트에 포함되는 다중인식 펩타이드 고분자 프로브는 상술한 바와 같이 표지된 상태로 제공될 수 있다. 한편, 본 발명의 프로브가 표지되지 않은 채로 제공되는 경우에는, 본 발명인 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806 검출 키트는 본 발명의 고분자 프로브의 시험관 내 또는 검출 대상에 포함된 살모넬라 티피뮤리움 균주와의 결합여부 또는 그 위치를 탐색하기 위한 성분을 추가로 포함할 수 있다. 상기 성분은 본 발명의 펩타이드 고분자의 표지를 위한 공지의 화합물이거나, 항원-항체반응을 통한 탐색을 위하여 본 발명의 펩타이드 고분자 또는 본 발명의 펩타이드 고분자와 결합하는 특정 수용체에 대한 항체 또는 이들에 대한 2차 항체 및 이의 검출을 위한 시약일 수 있다. 구체적으로 본 발명의 검출은 종래의 면역분석(immunoassay) 방식 또는 프로토콜을 변형하여 실시될 수 있다. 예컨대, 종래 면역분석에서 항체 대신에, 본 발명의 펩타이드 고분자 프로브를 사용하고, 프로세스는 동일하게 하여 본 발명의 검출을 실시할 수 있다. 예를 들어, ELISA(enzyme-linked immunosorbant assay)는 ELONA(enzyme-linked oligonucleotide assay)로 조금 변형하여 실시된다.
또한 본 발명인 진단용 키트의 펩타이드 고분자 프로브는 플레이트의 표면에 코팅된 형태로 제공될 수도 있다. 이 경우에는 상기 플레이트에 직접 대상 시료를 접종하여 적당한 조건에서 반응시킨 후, 플레이트의 표면상에서의 대상 시료에 포함된 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806과 펩타이드 고분자 프로브의 결합을 관찰함으로써 살모넬라 티피뮤리움 균주를 검출할 수 있다.
본 발명의 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806 검출 키트는 병, 통(tub), 작은 봉지(sachet), 봉투(envelope), 튜브, 앰플(ampoule) 등과 같은 형태를 취할 수 있으며, 이들은 부분적으로 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일, 왁스 등으로부터 형성될 수 있다. 용기는 그 일부이거나 또는 기계적, 접착성 또는 기타 수단에 의해 용기에 부착될 수 있는 완전히 또는 부분적으로 분리가 가능한 마개를 장착할 수 있다. 또한 용기는 주사바늘에 의해 내용물에 접근할 수 있는 스토퍼가 장착될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806 검출 방법을 제공한다:
(a) 상술한 다중인식 펩타이드 고분자 프로브와 검출 대상 시료를 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 고분자 프로브와 검출 대상 시료에 포함될 수 있는 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806의 결합 여부를 확인하는 단계.
본 발명의 "검출 대상 시료"는 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806이 존재할 가능성이 있으며, 그 존재 여부를 확인할 필요가 있는 대상 시료를 의미한다. 구체적으로 예를 들면, 액체, 토양, 공기, 식품, 사료, 폐기물 및 동식물 중 어느 하나 이상에서 채취된 것일 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 더욱 구체적으로 상기 액체는 물, 혈액, 소변, 눈물, 땀, 타액, 림프 및 뇌척수액 등일 수 있으며, 상기 물은 강수(江水), 해수(海水), 호수(湖水) 및 우수(雨水) 등을 포함하고, 상기 폐기물은 하수, 폐수 등을 포함하며, 상기 동식물은 인체를 포함한다. 또한, 상기 동식물은 식품이나 동식물의 사료 등으로 이용될 수 있는 조직을 제공하는 것이면 특별히 제한되지 아니한다.
본 발명의 단계(b)에서의 결합 여부 확인은 본 발명의 다른 양태인 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806 검출용 다중인식 펩타이드 고분자 프로브에 관하여 상술한 내용을 참조할 수 있고, 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위해 생략하도록 한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806 검출용 다중인식 펩타이드 고분자 프로브를 제공한다.
(b) 본 발명은 상술한 다중인식 펩타이드 고분자 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806 검출용 조성물을 제공한다.
(c) 본 발명은 상술한 다중인식 펩타이드 고분자 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806 검출 키트를 제공한다.
(d) 본 발명은 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806 검출 방법을 제공한다.
(e) 본 발명을 이용하면, 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806에 결합하는 단일 올리고펩타이드 프로브보다 민감도 및 특이도가 더욱 우수한 펩타이드 고분자 프로브를 제공할 수 있다.
(f) 본 발명을 이용하면, 세포 표면을 그대로 인식함으로써 시료 추출 등의 전처리가 생략되어 단시간 내에 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806을 효과적이고 특이적으로 검출할 수 있다.
도 1은 세포와 결합하는 펩타이드 발현 파지 스크리닝을 위한 M13 파지 펩타이드 스크리닝의 계획도를 나타낸다. (a) PDL이 코팅된 플레이트의 각 웰에, (b) 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806을 고정시키고, (c) 12개의 랜덤 아미노산으로 구성된 펩타이드들이 발현된 M13 파지 라이브러리를 첨가한 후, (d, e) 다양한 세척 조건과 결합 시간을 조절하여 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806에 결합하는 파지를 결합시키면, 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806에 특이적으로 결합하는 파지만 확보된다. (f) 최종적으로 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806에 결합하는 펩타이드 발현 파지만 추출한다. 도 1의 (a)-(e)까지를 한 단계(round)라고 하며, 상기와 같은 과정을 바이오 패닝(biopanning)이라 칭한다.
도 2는 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806과 결합하는 펩타이드 발현 파지를 스크리닝하기 위한 4 라운드 바이오 패닝 실험조건을 나타낸다. 살모넬라 티피무리움 KCCM 11806에 대하여 높은 결합력 및 특이성을 가지는 펩타이드를 코딩한 파지를 검출하기 위하여 각 라운드에 따른 실험조건으로 라운드마다 NaCl과 Tween-20의 농도를 높이고, 파지 결합시간을 짧게 하여 살모넬라 티피무리움 KCCM 11806에 높은 결합력 및 특이성을 가지는 파지를 검출하였다.
도 3은 바이오 패닝에 따른 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806과 결합하는 펩타이드를 코딩한 파지의 검출빈도, 서열 결과 및 각 파지의 결합력에 대한 표를 나타낸다. 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806에 결합하는 총 60개의 파지 플라그를 확보하였다. 36개의 파지 플라그는 2종류의 서로 다른 서열의 펩타이드를 코딩한 것으로 분석되었다. 2개의 파지는 피코몰 수준으로 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806에 효과적으로 결합하는 것을 확인하였다.
도 4는 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806에 결합하는 각 파지에 대한 결합력을 분석한 결과에 대한 그래프를 나타낸다. 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806에 결합하는 펩타이드 발현 파지를 증폭한 뒤 농도를 측정하여, 파지에 대한 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806과의 결합력을 분석하였다.
도 5는 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806에 결합하는 각 파지에 대한 특이도를 분석한 그래프를 나타낸다. 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806에 결합하는 각각의 박테리오파지에 대한 특이성(specificity)를 분석하기 위하여 식중독 원인균 중 하나인 그램 네거티브 균인 비브리오 균과 소혈청 단백질에 처리하여 각 농도에서의 결합력을 비교 분석하였다.
도 6은 합성된 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806에 결합하는 올리고펩타이드 서열과 결합력에 대한 그래프를 나타낸다. 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806에 결합하는 (a) 박테리오파지내 펩타이드 서열을 분석하고, (b) 형광물질인 FITC를 부착하여 펩타이드와 박테리아 간의 결합력을 분석하였다.
도 7은 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806에 결합하는 STBP 1과 2 펩타이드에 대한 특이성(specificity)을 분석하기 위하여 식중독 원인균 중 하나인 그램 네거티브 균인 비브리오 균과 소혈청 단백질에 처리하여 각 농도에서의 결합력을 비교 분석하였다.
도 8은 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806과 결합하는 다중인식 펩타이드 고분자(PDPP) 프로브 합성의 모식도를 나타낸다. PDL(150-300 kDa)과 SPDP 링커의 반응을 통하여 PDL-SPDP 백본을 형성한 후, 각각의 단일 올리고펩타이드(STBP 1, 2)를 처리하여 STB-PDPP 1, 2를 형성한다. 이후 겔 여과(gel filtration) 컬럼을 이용하여 반응하지 않은 STBP를 분리하고 최종적으로 STB-PDPP 1, 2(1.7 μM과 1.7 μM)를 합성한다.
도 9는 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806에 대한 PDPP의 결합력 분석 결과를 나타낸다. 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806에 결합하는 단일 올리고펩타이드와 각 STB-PDPP를 농도에 따라 처리한 후, 결합력을 측정하였다. STB-PDPP 1과 2의 경우 각각 13배와 10배 이상의 결합력이 증가되는 것을 확인하였다.
도 10은 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806에 대한 PDPP의 특이도 분석 결과를 나타낸다. 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806에 결합하는 단일 올리고펩타이드와 STB-PDPP에 대한 특이성(specificity)를 분석하기 위하여 식중독 원인균 중 하나인 그램 네거티브 균인 비브리오 균과 소혈청 단백질에 처리하여 각 농도에서의 결합력을 비교 분석하였다.
도 11은 형광신호 측정을 통한 단일 올리고펩타이드와 PDPP를 이용한 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806에 대한 결합 이미지를 비교 분석 결과를 나타낸다. 도 11의 a)는 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806에 결합하는 펩타이드와 각각의 STB-PDPP를 반응시켜 현광현미경을 통하여 각 프로브의 세포와의 결합 이미지를 측정한 결과를 나타낸다. sc-펩타이드는 음성 대조군으로 랜덤 서열의 펩타이드를 처리하여 세포와의 결합 여부를 측정하였다. 도 11의 b)는 도 11의 a)와 동일한 실험 조건으로 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806에 대하여 각각의 프로브를 처리하고 형광리더기를 통하여 결합 신호를 측정한 결과를 나타낸다. 그 결과 도 11의 a)에서 나타나는 프로브 결합 이미지 신호와 도 11의 b)에 측정된 신호가 일치되는 것을 확인함으로써 STB-PDPP의 경우 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806에 단일 올리고펩타이드 보다 훨씬 더 높은 민감도를 가지고 결합되는 것을 분석하였다.
도 12는 형광신호 측정을 통한 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806과 비브리오균에 대한 결합 특이도에 따른 이미지 비교 분석 결과를 나타낸다. 도 12의 a)는 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806와 비브리오균에 STB-PDPP 1 및 2를 50 μM 씩 각각 반응시켜 현광현미경을 통하여 각 균에 대한 결합 이미지를 측정한 결과를 나타낸다. 그 결과 도 12의 a)에서 나타나는 결합 이미지 신호와 도 12의 b)에서 측정된 신호가 일치되는 것을 확인함으로써 STB-PDPP 1 및 2의 경우 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806에 특이적으로 결합하는 것을 분석하였다.
도 13은 형광신호 측정을 통한 PDPP를 이용한 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806에 대한 균의 검출한계(LOD) 측정 결과를 나타낸다. 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806에 결합하는 각각의 STB-PDPP에 대한 검출한계 분석은 도 11에서 진행한 동일한 실험 방법으로 측정하였다. 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806 세포 수에 따라 각 STB-PDPP를 처리한 결과, 각각 세포수가 감소함에 따라 형광 신호가 감소되는 것을 확인하였으며, 102의 세포에 STB-PDPP를 처리한 조건까지 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806이 검출됨을 확인하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 파지 디스플레이(Phage display) 방법을 사용한 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806에 특이적으로 결합하는 박테리오파지 선별
파지 디스플레이는 PDL(Poly-D-lycine)이 코팅된 96-웰 플레이트(SPR)를 사용하였다. 살모넬라 세포(한국미생물보존센터)는(1×108개 세포) 플레이트 표면에서 PDL 아민(positive charge) 그룹과 세포 표면(negative charge)의 이온 결합을 통하여 안정적으로 고정시킴으로써 파지 디스플레이의 효율을 높였다. 이렇게 고정된 세포에 랜덤 파지 펩타이드 라이브러리[M13 파지 gp3 minor coat 단백질에 융합된 12개의 아미노산으로 구성된 무작위 배열을 통하여 27억 개의 다양한 아미노산 서열을 가지도록 제작된 파지 펩타이드 라이브러리-Ph.DTM(Phage Display Peptide Library Kit, New England Biolabs)]를 이용한 스크리닝 과정에서 보다 높은 특이성 및 결합력 분석이 가능하도록 디자인하였다. 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806과 결합하는 파지 펩타이드를 스크리닝 하기 위하여, 세포를 플레이트 표면에 고정 시킨 후, M13 파지 펩타이드 라이브러리를 넣어 세포와 결합시키고, 다양한 결합 시간 및 세척조건을 통하여 높은 친화력으로 결합하는 펩타이드 발현 파지를 선별하였다. 이와 관련한 스크리닝 계획 및 반응조건들을 각각 도 1 및 도 2에 나타내었다. 도 1은 세포와 결합하는 펩타이드 발현 파지 스크리닝을 위한 M13 파지 펩타이드 스크리닝의 계획도이다. (a, b) PDL 코닝 96-웰 플레이트의 표면에 세포를 고정시키고, (c) M13 파지 표면에 12개 아미노산으로 구성된 펩타이드 라이브러리가 발현된 파지 라이브러리를 세포와 결합시킨 뒤에, (d, e) 다양한 조건으로 세척한 후, (f) 최종적으로 결합된 파지를 용출하여 파지를 얻었다. 상기와 같이 얻어진 파지를 대장균 (ER2738)에 감염시켜 증폭시키고, 증폭된 파지를 다시 세포와과 결합시킨 후, 세척 조건의 강도 및 반응 시간 조절 등의 조건으로 반복시킴으로써 보다 강한 결합력을 갖는 파지를 찾는 과정을 반복하였다. 이러한 일련의 과정을 바이오패닝(Biopanning)이라 명명한다. 도 2는 세포에 대하여 높은 특이성 및 결합력을 가진 펩타이드가 발현된 파지를 검출하기 위한 4 단계의 바이오 패닝 조건을 도표로 나타낸 것이다. 각각의 단계마다 강한 세척조건, 짧은 반응 시간으로 반응 조건을 다양하게 변화시켰으며, 바이오 패닝을 실시하여 세포에 결합하는 펩타이드를 가진 파지를 확보하였다. 상기에 의하여 얻어진 파지를 숙주세포인 대장균 ER2738 세포에 감염시켜서 LB 배지에서 증폭시킨 후, 60여 개의 파지 플라그를 선별 및 M13 파지 게놈성 DNA(Single Strand DNA)를 분리 정제하여 각각의 유전자 염기서열을 확인하였고, 파지 표면 단백질(gp3 minor coat 단백질)에 발현되어 세포와 결합하도록 제작된 펩타이드 부분의 아미노산 염기서열을 규명하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
실시예 2: 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806에 결합하는 펩타이드 발현 파지의 결합력 분석
스크리닝한 파지 결합력 분석을 진행하기 위하여 먼저 펩타이드가 발현된 파지를 증폭한 뒤 타이터링(Titering)을 통하여 파지 용액의 농도를 결정하였다. 이 후 세포가 결합된 플레이트에 파지를 농도별로 넣어주어 결합한 파지의 양을 측정함으로써 각각의 펩타이드 발현 파지의 결합력을 산출하였다.
구체적으로 세포 결합된 플레이트에 파지를 넣어준 뒤 세척하여 파지 표면 단백질을 인식하는 항체(Anti-M13 Monoclonal Antibody)를 이용한 효소면역측정법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)를 수행하였다. 해당 농도에 따르는 ELISA 신호를 표시하여 이를 포화곡선에 맞추어 외견상 Kd 값을 결정하였다.
실험 과정은 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806(1×108 세포/200 μl)을 PDL 코팅 플레이트에 고정시킨 후 증폭된 파지를 넣어준 뒤 2 시간 고정시키고, 1 X TBST 세척용액으로 5번 세척을 한 후, 항-M13 항체를 1시간 결합시켰다. 다음으로 항체가 붙은 단백질을 동일 세척용액으로 10번 세척한 다음, 2차 항체(HRP-conjugated Polyclonal Antibody)를 1시간 결합시키고, TMB(3,3' 5,5'- tetramethylbenzidine) 기질 용액을 15분 반응을 한 후, 1 M 황산을 넣어 반응을 종결시켰다. Kd 값은 450 nm에서 측정하여 얻어진 값으로 결정하였다. 그 결과, 도 3와 도 4에서 보는 바와 같이, 2개 펩타이드 발현 파지는 피코몰(pM) 농도의 결합력을 보여주었고, 이는 우수한 결합력을 나타내며, 기존의 항체-항원 반응의 결합력에 상응하는 결합력을 확인할 수 있었다.
실시 예 3: 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806에 결합하는 박테리오파지 특이도 분석
살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806에 결합하는 박타레오파지에 대한 특이도(specificity) 분석을 위하여 식중독 원인균 중 하나인 그램 네거티브 균인 비브리오 균과 소혈청 단백질에 처리하여 각 농도에서의 결합력을 비교 분석함으로 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806에 결합하는 박테리오파지의 특이도를 분석하였다. 측정 방법은 위 결합력 분석 방법과 동일하다. 분석 결과 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806에 결합하는 박테리오파지는 비브리오 균과 소혈청 단백질에 대한 결합력이 현저히 낮게 측정됨으로써 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806에 특이적으로 결합함을 확인하였다(참조: 도 5).
실시 예 4: 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806에 결합하는 펩타이드 서열 및 결합력 분석
펩타이드 발현 파지에서 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806을 특이적으로 인지하는 박테리오파지 2개에서 펩타이드(Salmonella Typhimurium Binding Phage, STBP) 서열을 분석하고, 펩타이드 서열에 형광물질(Fluorescein isothiocyanate, FITC)을 결합하여 합성을 하였다(참조: 도 6의 (a)).
서열은 다음과 같다.
STBP #1 : Ac-TNTSWDPQYNPDGCGK(FITC)-NH2
STBP #2 : Ac-NHIVPTSNRFNAGCGK(FITC)-NH2
표기된 아미노산 서열은 아미노 말단(N-말단)부터 나타낸다. N-말단에는 아미노 말단의 반응성 제거를 위해 아세틸화(Acetylation)를 시켰고 C-말단에는 카르복시말단에 FITC를 부착하기 위해 아미노산 K(Lysine)를 첨가하였다. 각각의 아미노산 서열의 카르복시말단 부근에는 GCGK가 첨가되는데, 이는 형광 펩타이드 탐침자 STBP-GCGK(FITC)의 민감도를 극대화시키기 위한 과정에 응용하기 위해서 첨가하였다. 펩타이드의 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806 박테리아에 대한 결합력 분석을 위하여 각각의 펩타이드를 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806이 고정된 PDL 코팅 플레이트에 고정에 농도별로 희석하여 결합시켰다. 플레이드 각 웰의 박테리아에 결합한 펩타이드는 형광광도계(Fluorometer)를 이용하여 펩타이드에 연결되어진 FITC의 최대 파장(Excitation : 495 nm, Emission : 520 nm)에서 각 펩타이드 농도에 대한 형광세기를 측정하였다. 펩타이드의 농도에 따른 형광 신호를 표지하여 포화곡선에 맞추어 Kd 값을 결정하였다(참조: 도 6의 (b)).
실시 예 5: 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806에 결합하는 펩타이드 특이도 분석
살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806에 결합하는 합성된 펩타이드에 대한 특이도(specificity) 분석을 위하여 식중독 원인균 중 하나인 그램 네거티브 균인 비브리오 균과 소혈청 단백질에 처리하여 각 농도에서의 결합력을 비교 분석함으로 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806에 결합하는 각 펩타이드에 대한 특이도를 분석하였다. 측정 방법은 위 결합력 분석 방법과 동일하다. 분석 결과 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806에 결합하는 펩타이드는 비브리오 균과 소혈청 단백질에 대한 결합력이 현저히 낮게 측정됨으로써 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806에 특이적으로 결합함을 확인하였다(참조: 도 7).
실시예 6: 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806에 특이적으로 결합하는 다중인식 펩타이드 고분자(PDPP) 프로브 합성
펩타이드의 경우 항체에 비해 크기도 작고 합성의 용이하다는 장점이 있지만, 목표 단백질과의 결합 후 항체와 마찬가지로 진단 프로브로써 신호가 낮은 제한된 부분이 있다. 이러한 단점을 보완하기 위해 생체적합성 고분자인 폴리아미노산 체인을 기본으로 한 다중 인식 펩타이드 고분자(Polyvalent-directed Peptide Polymer, PDPP) 프로브를 제작하였다. 고분자 사슬을 만들기 위해 체내 L-입체이성질체와 차이를 둔 폴리-D-라이신(poly-D-lysine, PDL)을 사용하였으며, 이에 단일 펩타이드와의 결합을 시키기 위하여 링커로써 헤테로 이중 기능적인(heterobifunctional) N-석신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트[N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate, SPDP]를 사용하였다. SPDP의 한 쪽에 위치한 N-히드록시석신이미드 에스터(N-hydroxysuccinimide ester)는 좋은 이탈기(leaving group)로써 작용하여 PDL의 측쇄(side chain)에 존재하는 아민 기(amine group)와의 치환반응으로 인해 PDL-SPDP를 연결시켰다. 이 후 PDL-SPDP 백본에 다른 한 쪽에 위치한 2-피리딜 디설파이드(2-pyridyl disulfide)와 단일 펩타이드의 카르복시말단 부근에 첨가된 시스틴의 설프히드릴기(sulfhydryl group)의 치환 반응에 의해 가교(cross-linking) 반응이 일어나면서 PDL-SPDP 고분자 백본에 각각의 펩타이드가 연결되며, 즉 PDL-SPDP-TNTSWDPQYNPDGCGK(FITC)과 PDL-SPDP-NHIVPTSNRFNAGCGK(FITC) (이하 STB-PDPP1과 STB-PEPP2) 형태의 프로브가 합성하였다. 이렇게 합성된 각각의 STB-PDPP는 겔 여과(gel filtration) 컬럼을 이용하여 반응하지 않은 단일 펩타이드와 PDL-SPDP 백본을 분리하여 최종적으로 STB-PDPP1(1.7 μM)과 STB-PDPP2(1.8 μM)를 합성하였다. 합성된 STB-PDPP는 형광광도계(Fluorometer)를 이용하여 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806 결합 펩타이드에 연결되어진 FITC의 최대 파장(Excitation : 495 nm, Emission : 520 nm)에서 각 펩타이드 농도에 대한 형광세기를 측정하여 농도를 결정하였다(참조: 도 8).
실시예 7: PDPP를 이용한 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806에 대한 결합력 분석
합성된 STB-PDPP 1, 2의 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806에 대한 결합력 분석을 진행하기 위하여 먼저 2 × 108 개의 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806 세포를 PDL 코팅 96 웰 플레이트에 고정시켰다. 이 후 세포가 결합된 플레이트에 STB-PDPP 1, 2를 각각 농도별로 넣어주어 결합한 각각의 STB-PDPP의 양을 형광광도계(Fluorometer)를 이용하여 각 STB-PDPP 내 연결되어진 FITC의 최대 파장(Excitation : 495 nm, Emission : 520 nm)에서 STB-PDPP 1, 2 농도에 대한 형광세기를 측정하였다. 각각의 STB-PDPP의 농도에 따른 형광 신호를 표지하여 포화곡선에 맞추어 K d 값을 결정하였다(참조: 도 9).
실시예 8: PDPP를 이용한 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806에 대한 특이도 분석
살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806에 결합하는 STB-PDPP에 대한 특이도(specificity) 분석을 위하여 식중독 원인균 중 하나인 그램 네거티브 균인 비브리오 균과 소혈청 단백질에 처리하여 각 농도에서의 결합력을 비교 분석함으로 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806에 결합하는 STB-PDPP 1, 2의 특이도를 분석하였다. 측정 방법은 위 결합력 분석 방법과 동일하다. 분석 결과 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806에 결합하는 각각의 STB-PDPP는 비브리오 균과 소혈청 단백질에 대한 결합력이 현저히 낮게 측정됨으로써 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806에 특이적으로 결합함을 확인하였다(참조: 도 10).
실시예 9: 단일 펩타이드와 PDPP를 이용한 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806에 대한 결합 및 비브리오 균에 대한 특이도 검증을 위한 이미지 비교 분석
살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806에 특이적으로 결합하는 각각의 단일 펩타이드와 STB-PDPP의 세포 표면 결합을 비교 분석하기 위하여 형광 현미경을 이용하여 측정하였다. 구체적인 실험 과정은 다음과 같다.
먼저 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806 세포를 성장시키고, 2 × 108 개의 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806를 마이크로 튜브에 옮기고, 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806를 PBST 세척 용액을 이용하여 원심분리 방법으로 3번 세척한다. 세척된 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806은 다시 100 μl PBS 완축용액으로 용해시킨 후, 1 μM의 각각의 단일 펩타이드와 STB-PDPP를 처리하여 1시간 동안 반응시킨다. 반응 후, PBST 용액을 이용하여 3번의 세척과정을 진행한 후, 10 μl PBS 완충요액으로 용해시킨 후, 글래스 슬라이드에 분주한다. 단일 펩타이드/STB-PDPP가 결합된 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806의 분주된 용액을 건조시키기 위하여 분젠버너(bunsen burner) 방법을 이용하였다. 마지막으로 커버 글래스를 이용하여 균을 덮고, 형광 현미경을 통하여 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806 세포 표면에 결합하는 단일 펩타이드와 STB-PDPP의 형광 신호를 측정하여 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806에 대한 결합 이미지를 분석하였다. 위 결합 이미지 분석에서 대조군으로 랜덤 서열의 단일 펩타이드(sc-peptide)를 사용하였다(참조: 도 11). 또한 다른 식중독균인 비브리오 균에 대한 특이도 검증을 위하여 위와 동일한 방법으로 이미지를 비교 분석 하였다(참조: 도 12).
실시예 10: 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806에 결합하는 PDPP를 이용한 균의 검출한계(Limit of detection, LOD) 분석
살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806에 특이적으로 결합하는 각각의 STB-PDPP에 대한 검출한계를 분석하기 위하여 위 언급된 결합 이미지 분석과 동일한 실험 방법을 통하여 검출한계를 측정하였다.
먼저 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806 세포를 성장시키고, 102, 104, 106, 108 개 각각의 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806를 취하여 1 μM의 각 STB-PDPP를 처리하여 1시간 동안 반응시킨다. 반응 후, 세척과정을 진행한 후, 10 μl PBS 완충요액으로 용해시킨 후, 아민 그룹이 코팅된 글래스 슬라이드에 분주한다. 마지막으로 커버 글래스를 이용하여 균을 덮고, 형광 현미경을 통하여 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806 세포 표면에 결합하는 단일 펩타이드와 STB-PDPP의 형광 신호를 측정하여 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806에 대한 결합 이미지 분석을 통하여 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806에 결합하는 STB-PDPP 1, 2 프로브에 대한 검출 한계(LOD = 102 CFU)를 측정하였다(참조: 도 13).
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> IUCF-HYU (Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University) <120> Polyvalent-directed Polymer Peptide Probe for Detection of Salmonella Typhimurium <130> PN140645 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide probe for Salmonella Typhimurium (STBP1) <400> 1 Thr Asn Thr Ser Trp Asp Pro Gln Tyr Asn Pro Asp 1 5 10 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide probe for Salmonella Typhimurium (STBP2) <400> 2 Asn His Ile Val Pro Thr Ser Asn Arg Phe Asn Ala 1 5 10

Claims (9)

  1. 다음을 포함하는 살모넬라 티피뮤리엄 KCCM 11806 검출용 다중인식 펩타이드 고분자 프로브:
    (a) 폴리-라이신 백본; 및
    (b) 서열목록 제1서열 또는 제2서열의 아미노산 서열을 가지며, 상기 백본에 결합된 둘 이상의 올리고펩타이드.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리-라이신 백본은 D-라이신으로 구성된 것을 특징으로 하는 다중인식 펩타이드 고분자 프로브.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리-라이신 백본은 30 kDa 내지 500 kDa인 것을 특징으로 하는 다중인식 펩타이드 고분자 프로브.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 올리고펩타이드는 상기 폴리-라이신 백본의 측쇄(side chain)의 아민 그룹에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 다중인식 펩타이드 고분자 프로브.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 결합은 링커에 의한 결합인 것을 특징으로 하는 다중인식 펩타이드 고분자 프로브.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 올리고펩타이드는 발색효소, 방사성 동위원소, 크로모포어(chromopore), 발광물질 및 형광물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나로 표지된 것을 특징으로 하는 다중인식 펩타이드 고분자 프로브.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 다중인식 펩타이드 고분자 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806 검출용 조성물.
  8. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 다중인식 펩타이드 고분자 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806 검출 키트.
  9. 다음 단계를 포함하는 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806 검출 방법:
    (a) 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 다중인식 펩타이드 고분자 프로브와 검출 대상 시료를 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 고분자 프로브와 검출 대상 시료에 포함될 수 있는 살모넬라 티피뮤리움 KCCM 11806의 결합 여부를 확인하는 단계.

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Development of ssDNA aptamers for the capsure and detection of Salmonella typhimurium (Anal. Methods, (2014.07.), Vol. 6, pp 7442-7448.)
다중인식 펩타이드 고분자를 이용한 식중독균 검출 기술 개발(농촌진흥청 완결과제 최종보고서, (2014.01.), pp 1-21.)

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