KR101732062B1 - 트라우스토키트리드 균주로부터 무용매 추출을 통한 바이오오일 추출 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 트라우스토키트리드 습식 균체로부터 유기용매를 사용하지 않고 물리적 파쇄 방법으로 고농도의 오메가-3 불포화지방산을 함유한 바이오오일을 고효율로 획득하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 바이오오일 추출 방법은 트라우스토키트리드 균체로부터 균체의 건조과정을 배제하고, 유기용매의 사용 없이 경제적이고, 환경 친화적으로 고농도의 DHA 오일을 고효율로 획득하는 데 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

트라우스토키트리드 균주로부터 무용매 추출을 통한 바이오오일 추출 방법{Method for extracting bio-oil from Thraustochytrid strains through solvent-free extraction}

본 발명은 트라우스토키트리드 균주로부터 무용매 추출을 통한 바이오오일 추출 방법에 관한 것이다.

다중불포화지방산 DHA(Docosahexaenoic acid)은 두뇌, 안구조직 및 신경계에 필수적인 지방산으로 특히 유아의 시력 및 운동신경능력 개발에 중요한 기능을 하는 것으로 알려져 있다. 또한 치매 환자 뇌에서는 그 양이 현저하게 줄어드는 것으로 보고되었으며, 노안의 황반변성 억제 등 다양한 항노화 기능들이 새롭게 밝혀지고 있다. 사람을 비롯한 대부분의 고등 동물은 정상적인 생체기능에 필요한 다중불포화지방산을 자체적으로 원활하게 합성하지 못하기 때문에 다중불포화지방산을 필수 영양소로 반드시 섭취하여야 하며, 세계보건기구는 하루 1 g 이상의 DHA 함유 다중불포화지방산을 꾸준히 섭취할 것을 권장하고 있다.

전통적으로 DHA 다중불포화지방산의 공급원은 참치, 연어와 같은 해양 생태환경의 상위를 차지하는 심해성 어류들이다. 하지만, 해양환경의 오염이 심해지면서 심해성 어류의 체내에 수은을 비롯한 중금속, 환경호르몬, 방사성물질 등 오염물질 축적으로 인해 심해어류 섭취에 대한 위험이 커지고 있다. 따라서 DHA 다중불포화지방산 오일을 안전하고, 안정적으로 공급할 수 있는 새로운 방법에 대한 관심이 고조되고 있다.

트라우스토키트리드(Thraustochytrid)는 유기종속영양의 해양 단세포 조류로서, 자연계에서 DHA 다중불포화지방산의 주요한 생산자로 기능을 한다. 트라우스토키트리드가 생성하는 DHA 다중불포화지방산 함유 유지는 미국 식품의약안전처로부터 GRAS(Generally Recognized As Safe) 인증을 받아 식품 첨가 및 건강기능성식품 원료 상용화가 이루어지고 있다. 또한 국내에서도 트라우스토키트리드 조류는 식품원재료로 사용 허가가 이루어져 산업적으로 매우 중요한 가치를 지닌다.

트라우스토키트리드 균주로부터 DHA와 같은 고기능 다중불포화지방산의 생산은 배양, 회수 및 추출과정이 필요하며, 추출과정에는 일반적으로 헥산(Hexane) 또는 클로로포름(Chloroform)과 같은 유기용매를 사용한다. 이러한 유기용매를 이용한 고기능 다중불포화지방산의 추출은 휘발성 및 가연성에 기인한 위험한 조작환경, 유기용매 회수 및 정제에 따른 공정상의 복잡성 때문에 추출 비용 증가, 잔류용매의 위험성 등의 단점이 있다. 따라서 상기의 문제점을 해결할 수 있는 유기용매를 사용하지 않는 추출 방법의 필요성이 대두되고 있다.

이에 본 발명에서는 유기용매를 첨가하지 않고도 오일을 95% 이상의 높은 효율로 추출하는 기술을 개발하고자 하였다.

한편, 한국등록특허 제10-1115357호에서는 '습식 상태의 미세조류 균체로부터 조오일을 추출하는 방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1521274호에서는 '신규 미세조류 오란티오키트리움（Aurantiochytrium sp.) LA3（KCTC12685BP) 및 이를 이용한 바이오오일의 제조방법'이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 '트라우스토키트리드계 균주로부터 무용매 추출을 통한 바이오오일 추출 방법'에 대해서는 밝혀진 바가 전혀 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 트라우스토키트리드 조류의 습식 균체로부터 비극성 유기용매를 사용하지 않고 물리적 파쇄 방법만으로 고농도의 오메가-3 불포화지방산을 함유한 바이오오일을 고효율로 획득함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 습식상태의 미세조류를 비드밀(bead mill)에 투입하여 미세조류 세포를 파쇄시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세조류로부터 바이오오일을 추출하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 추출 방법은 트라우스토키트리드 균체로부터 균체의 건조과정을 배제하고, 유기용매의 사용 없이 경제적이고, 환경 친화적으로 고농도의 DHA 오일을 고효율로 획득하는 데 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 트라우스토키트리드 조류 균체로부터 유지 추출을 위한 비드밀 파쇄 공정의 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 비드밀 파쇄 공정의 수리학적 체류시간에 따른 트라우스토키트리드 균체의 유지 추출 효율을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 비드밀 처리 교반속도에 따른 트라우스토키트리드 균체로부터 유지 추출 효율을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 비드밀 처리에 의한 유지 추출 효율의 개선 과정을 나타낸 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

a) 습식상태의 미세조류를 비드밀(bead mill)에 투입하여 미세조류 세포를 파쇄시키는 단계; 및

(b) 상기 (a) 단계에 의하여 파쇄된 미세조류를 원심분리하여 수용성의 하층과 바이오오일을 함유하는 상층으로 분리하고 상층을 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 용매 추출 없이 미세조류로부터 바이오오일을 추출하는 방법을 제공한다.

본 발명에서의 (a) 단계는 건조된 미세조류가 아닌 자연 또는 배양 상태 그대로의 수분을 포함하고 있는 미세조류를 습식파쇄함으로써 실시된다.

본 발명의 바람직한 일 구현 예에 따르면, 본 발명의 (a) 단계는 바람직하게는 20~40 %(w/v) 농도의 미세조류 배양액을 비드밀로 파쇄시킬 수 있다.

본 발명의 '바이오오일(bio-oil)'은 미세조류에 포함된 모든 종류의 오일을 의미하며, 예컨대, 다중불포화지방산(예컨대, 오메가-3 불포화지방산 및 오메가-6 불포화지방산), 라우릭 산(Lauric acid), 미리스틱 산(Myristic acid), 팔미틱 산(Palmitic acid), 스테아릭 산(Stearic acid) 및 아라키딕 산(Arachidic acid)과 같은 포화지방산, 인지질(Phospholipid) 및 스테로이드(Steroid) 계열의 화합물을 포함한다.

본 발명의 미세조류는 바이오오일이 풍부한 미세조류일 수 있으나 그에 제한되지 않으며, 바람직하게는 트라우스토키트리계(Thraustochytrid) 미세조류일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 스키조키트리움(Schizochytrium) 속 미세조류일 수 있고, 가장 바람직하게는 스키조키트리움 SH103(Schizochytrium sp. SH103)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 방법은 비드밀 파쇄 공정의 수리학적 체류 시간(Hydraulic Retention Time, HRT)의 조절을 통해 미세조류의 바이오오일 추출효율을 증진시킬 수 있다.

수리학적 체류 시간은 일정한 용기에 일정 유량의 유체가 체류할 수 있는 시간을 나타내는 것으로, 본 발명에 따른 일 구현 예에서 연속적 비드밀 파쇄 공정의 수리학적 체류시간은 2~60분일 수 있으며, 바람직하게는 3~10분일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 3~6분일 수 있으며, 더 더욱 바람직하게는 4분일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에서, 상기 (a) 단계의 비드밀의 교반속도를 700~1200rpm, 바람직하게는 1000~1200rpm, 더 더욱 바람직하게는 1200rpm으로 수행하는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에서, 상기 (a) 단계에서 사용되는 비드밀 내의 비드의 직경은 2~10mm일 수 있으며, 바람직하게는 직경 2~4mm일 수 있으나, 가장 바람직하게는 3mm일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에서, 상기 (a) 단계는 바람직하게는 습식상태의 스키조키트리움(Schizochytrium) 속 미세조류를 직경이 2~4mm인 비드를 포함하는 비드밀(bead mill)에 투입하여 1000~1200rpm의 교반속도로 3~6분 동안 미세조류 세포를 파쇄시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 상기 (a) 단계에 파쇄된 미세조류를 원심분리하여 수용성의 하층과 바이오오일을 함유하는 상층으로 분리하고, 상층을 회수하는 단계를 포함한다.

원심분리에 의하여 파쇄 세포 혼합물은 파쇄된 세포의 고형물을 포함하는 수용성 용액층인 하층과 바이오오일을 포함하는 상층으로 분리할 수 있다. 상기 과정은 클로로포름과 같은 유기 용매의 사용 없이 수행된다.

본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 유기용매의 사용 없이도 비드밀 처리를 통해서만 스키조키트리움 미세조류로부터 96.7%의 매우 높은 유지 추출이 가능하였다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 트라우스토키트리드 습식 균체로부터 오일 추출 효율에 대한 비드밀 처리 시간에 따른 영향

트라우스토키트리드 조류 스키조키트리움 속에 속하는 SH103(Schizochytrium sp. SH103, 이하 스키조키트리움 SH103이라 함) 균주를 기본배지(탄소원 포도당 60 g/ℓ, 질소원 효모 추출물 10 g/ℓ, 인공 해수염 5 g/ℓ, KH₂PO₄ 9g/ℓ)를 이용해 28℃에서 120 rpm으로 1.5일간 회분식 배양하였다.

DHA 다중불포화지방산을 함유한 오일의 함량은 수정된 Bligh-Dyer법(Burja et al., 2007)에 의하여 분석되었다. 건조 균체량 125 mg에 클로로포름(Chloroform) 6.25 ㎖, 메탄올 12.5 ㎖, 50 mM K₂HPO₄ 버퍼(pH 7.4) 5 ㎖을 가하여 28℃에서 200 rpm으로 1시간 동안 반응한 후 클로로포름 6.25 ㎖, K₂HPO₄ 버퍼 6.25 ㎖을 첨가하여 30회 정도 섞어준 후 30분 동안 방치하여 수층과 오일이 함유된 유기용매층으로 분리되도록 하였다. 미리 무게를 측정해둔 알루미늄 접시로 클로로포름층을 조심스럽게 옮긴 후 90℃에서 30분 동안 건조한 후 오일의 무게를 측정하였다. 전체 오일 함량은 아래와 같이 산출하였다.

총 오일 함량 (%, 오일 g/건조균체량 100 g) = (W_L-W_D) × V_C × 100/V_P × W_S

W_L: 알루미늄 접시의 무게, W_D: 알루미늄 접시 + 지질의 무게, V_C: 클로로포름의 총 부피, V_P: 알루미늄 접시에 옮긴 클로로포름의 부피, W_S: 사용한 균체의 무게 (건조중량)

그 결과, 배양 36시간 배양을 통해 스키조키트리움 SH103 균주에서 생성된 유지의 함량은 23.1 g/ℓ(15.4 g/ℓ-day)이었으며, 사용된 포도당 영양원으로부터 유지의 생산 수율은 0.35 g-oil/g-glucose인 것으로 나타났다.

스키조키트리움 SH103 균체로부터 유기용매를 사용하지 않고, 비드밀을 이용한 유지 추출 효율을 분석하였다. 도 1에 개시된 바와 같이, 약 30% 농도로 농축한 스키조키트리움 속 SH103 균체(300 g/ℓ)를 직경 5mm 구형의 세라믹 비드(지르코니아 99% 이상)를 약 70% 채운 용기(3ℓ)에 주입하여 700rpm 속도로 비드밀을 교반하여 균체를 파쇄하였다. 반복적인 비드밀 처리를 통해 수리학적 체류시간(Hydraulic retention time, HRT)을 달리하여 파쇄공정을 거친 후 원심분리법(10분, 10,000rpm)을 사용하여 균체 밖으로 유출된 유지를 회수하여 추출 효율을 비교하였다. 도 2에 개시한 바와 같이 비드밀 처리 과정의 수리학적 체류시간에 따라 유지 추출 효율이 급격히 증가하였으며, 체류시간이 4분일 때 최대 78.5%의 높은 추출 효율을 보인 후 증가속도는 점차 둔화되는 것으로 나타났다.

실시예 2 : 비드밀 교반 속도의 증가에 따른 유지 추출 효율 증진 확인

동일한 방법(300g/ℓ 균체, 세라믹 비드 5mm, 수리학적 체류시간 4분)으로 비드밀 파쇄 공정의 비드밀 교반 속도를 증가하여 스키조키트리움 SH103 균주로부터 유지 추출 효율을 분석하였다. 도 3에 개시한 바와 같이 비드밀 교반 속도를 700rpm에서 1,000rpm으로 높여 주었을 때 유지 추출 효율을 78.5%에서 86%로 9.5% 증가하는 것으로 나타났다. 또한 사용된 장비(DATM-3, (주)동서, 대한민국)에서 최대의 교반 속도 1,200rpm으로 처리하였을 때, 유지 추출효율은 91.5%까지 증가하였지만, 그 상승폭은 6.4%로 다소 둔화되는 것으로 나타났다(표 1).

연속식 비드밀 파쇄 공정의 교반속도 및 비드 사이즈 영향 비교

수리학적 체류시간(분)	교반속도(rpm)	비드 직경(mm)	유지 추출효율(%)
4	700	5	78.5
4	1,000	5	86.0
4	1,200	5	91.5
4	1,200	3	96.7
4	1,200	1	-

실시예 3 : 비드 사이즈에 따른 유지 추출 효율 확인

또한 비드의 크기에 따른 스키조키트리움 SH103 균주로부터 유지 추출 효율을 분석하였다. 균체의 파쇄 효율을 높이기 위해 직경이 보다 작은 3mm의 비드로 대체하였을 때, 유지 추출 효율은 최대 96.7%까지 증가하는 것으로 나타났다 (표 1). 반면, 더욱 작은 사이즈인 직경이 1mm의 비드를 사용하였을 때는 유지 추출이 거의 이루어지지 않았는데, 이는 스키조키트리움 속 SH103 균체의 파쇄가 원활하게 이루어지지 않았기 때문인 것으로 사료된다.

이상의 결과로부터 유기용매의 사용없이도 비드밀 처리를 통해서만 트라우스토키트리드 조류 스키조키트리움 SH103 균주로부터 96.7%의 매우 높은 유지 추출이 가능함을 확인하였다(도 4).

Claims (7)

1. (a) 습식상태의 스키조키트리움(Schizochytrium) 속 미세조류를 직경이 2~4mm인 비드를 포함하는 비드밀(bead mill)에 투입하여 1,000~1,200rpm의 교반속도로 3~6분 동안 미세조류 세포를 파쇄시키는 단계; 및
   (b) 상기 (a) 단계에 의하여 파쇄된 미세조류를 원심분리하여 수용성의 하층과 바이오오일을 함유하는 상층으로 분리하고 상층을 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 용매 추출 없이 미세조류로부터 바이오오일을 추출하는 방법.
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