KR101731898B1 - 한방소재를 이용한 고령친화적 고품질 멸치 칼슘제 - Google Patents

Abstract

칼슘과 깊은 관계가 있는 질병들(골다공증, 동맥경화, 심장질환, 대장암 등)에 대하여 친환경 한방소재가 배합된 멸치 칼슘제의 섭취를 통해 칼슘 관련 질병들을 예방하고 칼슘섭취에 대한 부작용을 최소화하는 한방소재를 이용한 고령친화적 고품질 멸치 칼슘제에 관한 것으로, 숙지황, 당귀, 골쇄보, 구기자, 두충, 우슬, 육계, 속단, 감초, 구척 중의 어느 하나의 한약재 추출물 또는 이들 혼합물의 한약재 추출물과 멸치 분말을 포함하는 구성을 마련하여, 칼슘공급원으로 우수한 멸치의 칼슘과의 배합에 의한 기능성 증진시키고, 고령친화적인 기능성 식품을 제공할 수 있다.

Description

한방소재를 이용한 고령친화적 고품질 멸치 칼슘제{Anchovy calcium products of senior-friendly using oriental medicinal herb}

본 발명은 한방소재를 이용한 고령친화적 고품질 멸치 칼슘제에 관한 것으로, 특히 칼슘과 깊은 관계가 있는 질병들(골다공증, 동맥경화, 심장질환, 대장암 등)에 대하여 친환경 한방소재가 배합된 멸치 칼슘제의 섭취를 통해 칼슘 관련 질병들을 예방하고 칼슘섭취에 대한 부작용을 최소화하는 한방소재를 이용한 고령친화적 고품질 멸치 칼슘제에 관한 것이다.

칼슘은 뼈와 이의 성장과 유지, 혈액 응고, 근육의 수축 및 이완 등에 관여하며, 칼슘의 부족한 섭취는 골격과 치아조직의 성분변화를 가져오고 성장을 저하시키며, 뼈의 기형현상을 유발하기도 한다.

한국인의 영양섭취 실태조사 결과에 의하면 아직도 칼슘 섭취는 권장량에 못 미치는 것으로 나타나고 있다. 한국인 영양섭취기준(2010년, (사)한국영양학회)에 의하면 성인 남성의 경우 750mg(19~49세)에서 700mg(50세 이상), 성인 여성의 경우 650mg(1~49세)에서 700mg(50세 이상)으로 섭취 권장량을 규정하고 있으며, 사춘기(15~18세)에는 남녀 각각 900mg과 800mg으로 성인보다 많은 섭취량이 요구되나 실제 칼슘의 섭취 부족은 거의 모든 연령층에서 나타나고 있다. 특히, 칼슘부족과 관계가 깊은 골다공증은 중년기 이후의 여성에게 심각한 문제로 대두되고 있다. 골다공증을 일으키는 위험인자는 체중/신장비의 감소, 백인 또는 아시아인, 가족력, 칼슘 섭취의 저하, 운동부족, 미산부(nulliparity), 알콜중독, 흡연, 카페인 과량 섭취, 조기폐경, 무월경, 스테로이드 약물, 골절 병력, 갑상선, 질환, 암, 간, 대장, 신장의 질환 등과 같이 복합적인 것으로 알려져 있다.

칼슘은 체내에서 가장 많이 존재하는 무기질로, 보통 성인 체중의 1.52%인 1,000~1,500g 정도를 체내에 보유하고 있다. 체내 칼슘의 99% 정도는 골격과 치아를 형성하고 있으며 나머지 1% 정도만이 근육의 수축과 이완, 규칙적인 심장박동 혈액의 응고, 효소의 활성, 세포내 자극과 흥분의 전달과 같은 생리활성조절 기능을 담당하고 있다(Allen and Wood, 1994).

이와 같이 다양한 생리활성 조절기능을 가지는 칼슘은 체내에서 항상 일정한 농도로 유지되어야 하는데, 만일 장기간 칼슘 섭취가 부족해지면 골다공증(osteoporosis), 구루병(rickets), 테타니와 같은 결핍증이 유발될 뿐만 아니라 골격과 관련지어져 그 중요성이 강조되고 있다.

최근 칼슘이 성장기, 성인기 이후의 골격질환과 순환기계 질환, 대장질환 등과 밀접한 관련이 있으나 정상 식사만으로는 충분한 칼슘을 얻지 못하는 실정이므로 칼슘 함유식품에 대한 수요가 증가하고 있어 이에 소뼈, 난각, 굴피분말 등을 소재로 한 칼슘 함유식품 등이 시판되고 있으나 가장 널리 사용되는 우골분은 광우병 발생으로 인한 안전성 문제 때문에 전량수입이 금지되어 새로운 칼슘 소재 개발이 시급한 실정이다.

또한, 고령화시대에 노인들에게 자주 발생하는 골다공증, 동맥경화, 심장질환, 대장암 등은 칼슘과 깊은 연관성을 가지는 질병들이며 특히, 여성의 경우 폐경기가 되면 여성호르몬인 에스트로겐의 분비가 감소되어 칼슘의 체내흡수가 감소하기 때문에 여성의 골다공증이환율은 남성에 비해 약 4배 높게 나타나 전체 인구 중 13%를 차지하고 있는 것으로 조사되고 있으며, 과거에 비해 지방질과 인산염의 섭취가 증가된 식생활로 인해 소장 내에서 칼슘의 섭취가 저해된다는 연구결과가 있다.

최근 건강에 대한 관심이 높아지면서 여러 종류의 건강보조식품이 이용되고 있으며, 칼슘보조식품의 소비 또한 증가 추세에 있어 다양한 칼슘보충제가 수입되어 시판되고 있다. 그러나 칼슘성분은 용해도가 매우 낮아 제품생산에 많은 제약이 있으며, 칼슘보조제를 남용 및 오용할 경우에는 다른 무기질의 흡수방해, 위장장애, 변비, 결석증 등 부작용을 동반할 수 있다.

칼슘의 주요한 공급원 중 하나인 멸치(Engraulis japonicus)는 몸길이가 1∼15㎝에 이르는 다획성, 소형, 적색육 어류로서 전 세계 해역에서 고루 분포하지만 한국 연안에서는 연중 생산되는 주요 연근해 어류자원이다. 멸치의 서식 수온은 13∼23℃로서 우리나라에서는 동해, 서해, 남해의 모든 연안에 분포하나 주로 부산, 경남 및 전남지역의 해역에서 어획량이 많으며 계절적으로는 4∼6월 기간을 제외한 모든 기간에 기선권현망, 소형 정치망 및 근해유자망 어법으로 어획됨으로써 주요 연근해 어민의 소득원이 되고 있다.

우리나라의 경우 멸치의 연간 어획량은 연평균 20∼30만톤 수준에 이르러 단일 어종으로서 어획량이 매우 많지만, 원료어는 쉽게 부패변질하기 때문에 어획 즉시 저장성이 있는 제품으로 가공해야 하는 문제가 있다. 기존의 멸치 가공이용방법은 전체 어획량의 30∼40％ 수준만이 경제성 있는 건멸치 제품 형태로 소비되고 있으며 60∼70％ 수준의 멸치 어획물은 일시 대량처리에 적합하다는 이유 때문에 모두 염장 발효시켜 저부가가치의 젓갈류 제품형태로 소비되고 있는 실정이다.

한편, 멸치류의 어육은 일반적으로 다량의 칼슘을 함유하고 있어 대표적인 고칼슘 식품소재로만 인식되는 경향이 있으나 칼슘 이외에도 양질의 단백질과 EPA 및 DHA를 포함한 비교적 다량의 지방을 함유하고 있을 뿐 아니라 각종 유용한 비타민과 무기질 및 핵산 등 좋은 맛을 내는 정미성분들도 다량 함유하고 있어 영양 및 기호성을 특성으로 한 가공식품의 원료로서 잠재적 이용가치가 매우 높은 수산자원이다.

그러나 다른 어종에 비하여 부패속도가 빠르기 때문에 어획량의 대부분을 젓갈 및 액젓의 원료, 자건품의 원료로 사용되고 있고 있다(조영제 등, 2000). 멸치 액젓을 만들고 남은 부산물은 현재 폐기되거나 다양한 처리과정을 거쳐 사료 등으로 사용되고 있는 실정이므로 이를 활용하여 성장기나 노인기의 칼슘 영양을 극대화하기 위한 칼슘제의 개발이 필요하다.

이러한 멸치와 한방에 대한 기술의 일 예가 하기 문헌 1 및 2 등에 개시되어 있다.

예를 들어, 하기 특허문헌 1에는 도 1에 도시된 바와 같이, 멸치를 30∼60메쉬(mesh)의 크기로 분쇄하여 분말화하는 단계, 멸치분말을 중량 대비 2∼10배의 주정에 넣고 20∼60℃에서 1∼5시간 침지한 다음 여과 및 수세하여 주정을 제거하는 단계, 주정을 제거한 멸치분말을 40∼50℃에서 1∼3시간 건조하는 단계, 건조한 멸치분말을 구연산, 사과산, 젖산, 초산 중에서 선택된 어느 하나 이상의 0.5∼1.5% 유기산에 넣고 20∼50℃에서 30분∼2시간 동안 침지한 다음 40∼50℃에서 1∼3시간 동안 건조하는 단계를 포함하는 멸치분말의 제조방법에 대해 개시되어 있다.

또 하기 특허문헌 2에는 비린내를 없애고 기혈보강의 한방처방을 멸치가공에 적용한 것으로 방약합편의 고진음자처방에 따라 한약재료를 열수추출하여 기능성 멸치가공용액을 제조하고, 준비된 한약재 추출용액을 멸치에 흡수, 도포하고, 도포 후 멸치를 자연건조하고, 자연건조된 멸치의 비린내 제거 및 향미성 증대를 위해 녹차추출물에 정치하며, 상품화를 위해 수분함양 10%이하로 건조시켜 비린내를 없애고 기혈을 보강하여, 기혈(氣血)의 부족에 의해 생기는 조열(潮熱), 자한(自汗), 설사, 해수, 담다(痰多)를 예방할 수 있는 한방처방에 따른 기능성 멸치 및 그의 가공방법에 대해 개시되어 있다.

대한민국 등록특허공보 제10-0705790호(2007.04.03 등록) 대한민국 등록특허공보 제10-0655148호(2006.12.01 등록)

그러나 상술한 바와 같은 종래의 기술에서는 단순히 멸치에서 칼슘만 추출하거나 한방성분을 추가하는 기술에 대해서만 개시되어 있을 뿐, 멸치의 효율적인 칼슘의 추출에 대해서는 전혀 개시되어 있지 않았다.

또 상기와 같은 종래의 기술에서는 인체 내에서의 칼슘의 흡수에 대한 연구가 개시되어 있지 않으며, 항산화활성, 골 형성 등 노화활성을 억제하는 연구에 대해서도 전혀 개시되어 있지 않았다.

본 발명의 목적은 상술한 바와 같은 문제점을 해결하기 위해 이루어진 것으로서, 천연물질인 한방소재로부터 기능성 성분에 대한 최적의 추출 공정을 확립하고 이를 통해 얻어진 한방 추출물을 기반으로 하여 칼슘공급원으로 우수한 멸치 분말과의 배합에 의한 기능성 증진 및 고령친화적 멸치 칼슘제를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 소재의 안전성 및 활용성을 확인하고 생체 내 칼슘 흡수율을 향상시키며 이와 함께 한방의 방제학적 원리에 입각하여 한방 천연물질을 배합한 인체에 부작용없는 한방소재를 이용한 고령친화적 고품질 멸치 칼슘제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해 본 발명에 따른 한방소재를 이용한 고령친화적 고품질 멸치 칼슘제는 한방소재를 이용한 고령친화적 고품질 멸치 칼슘제로서, 숙지황, 당귀, 골쇄보, 구기자, 두충, 우슬, 육계, 속단, 감초 및 구척으로 이루어진 한약재 추출물과 멸치 분말을 포함하고, 상기 한약재 추출물은 전체 중량 100%에 대해 숙지황 10~20중량%, 당귀 10~20중량%, 골쇄보 10~15중량%, 구기자 10~20중량%, 두충 10~15중량%, 우슬 3~7중량%, 육계 3~7중량%, 속단 3~7중량%, 감초 3~7중량% 및 구척 3~7중량%로 이루어지고, 상기 멸치 분말은 멸치 잔사를 자숙, 수세 및 탈수공정을 거쳐 건조된 후, 500mesh로 분쇄된 것이고, 상기 멸치 분말은 수분 3.3중량%, 조단백질 26.6중량%, 조지방 1.6중량%, 조회분 66.0중량% 및 탄수화물 2.5중량%로 이루어지고, 상기 한약재 추출물은 수분 18.1중량%, 조단백질 7.5중량%, 조지방 0.9중량%, 조회분 5.5중량% 및 탄수화물 68.0중량%로 이루어진 것을 특징으로 한다.

또 본 발명에 따른 멸치 칼슘제에서, 상기 한약재 추출물은 수냉 냉각 순환식 추출기를 이용하여 상기 숙지황, 당귀, 골쇄보, 구기자, 두충, 우슬, 육계, 속단, 감초 및 구척의 혼합물 1kg과 물 4L 비율로 넣고 105±2℃에서 7시간 추출한 후 회전식 농축기에서 감압 농축한 것을 특징으로 한다.

또 본 발명에 따른 멸치 칼슘제에서, 상기 한약재 추출물과 멸치 분말은 중량비로서 1 : 1로 혼합된 것을 특징으로 한다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 한방소재를 이용한 고령친화적 고품질 멸치 칼슘제에 의하면, 천연물질인 한방소재로부터 기능성 성분에 대한 최적의 추출공정을 확립하고 이를 통해 얻어진 한방 추출물을 기반으로 하여 칼슘공급원으로 우수한 멸치 분말과의 배합에 의한 기능성 증진시키고, 고령친화적인 기능성 식품을 제공할 수 있다는 효과가 얻어진다.

또, 본 발명에 따른 한방소재를 이용한 고령친화적 고품질 멸치 칼슘제에 의하면, 초고령화 사회로의 진입, 골질환의 높은 이환율, 소비자들의 높은 관심도 등을 고려할 때, 기능성 한방소재를 결합한 고품질의 멸치 칼슘제를 개발하여 신성장동력산업으로 자리매김할 수 있으며, 이를 통해 국민 건강에 기여하고 농어민의 소득 창출을 통해 일자리 증대에 기여할 수 있다는 효과도 얻어진다.

도 1은 종래의 멸치분말의 제조방법의 공정도,
도 2는 본 발명을 적용하기 위해 실험동물을 폐경 이후의 호르몬 분비상태로 변화시켜 골다공증을 인위적으로 유발시키기 위한 양측 난소 절제술을 나타내는 도면,
도 3은 8주간의 체중을 매일 일정한 시간에 측정한 결과, Sham군, OVX군, OVX-AnCa군과 OVX-AnCa-OM군에서의 체중 변화를 나타내는 그래프,
도 4는 각각의 실험군에서 8마리의 SD-rat을 이용하여 측정한 결과, Sham군, OVX군, OVX-AnCa군과 OVX-AnCa-OM군에서의 골밀도를 나타내는 도면,
도 5는 Sham군, OVX군, OVX-AnCa군과 OVX-AnCa-OM군에서 실험 쥐의 대퇴골 무게(A), 대퇴골의 회분(B), 대퇴골의 칼슘(C와 D)에서 ANCA와 ANCA-OM 공급의 효과를 나타내는 그래프,
도 6은 Sham군, OVX군, OVX-AnCa군과 OVX-AnCa-OM군에서 멸치 분말 투여와 복합한약재추출물의 투여에 따른 혈청 중의 오스테오칼신 농도를 나타내는 그래프,
도 7은 Sham군, OVX군, OVX-AnCa군과 OVX-AnCa-OM군의 실험 쥐의 혈청에서 APL 농도 상태를 나타내는 그래프,
도 8은 Sham군, OVX군, OVX-AnCa군과 OVX-AnCa-OM군의 실험 쥐의 혈청에서 칼슘 농도 상태를 나타내는 그래프,
도 9는 Sham군, OVX군, OVX-AnCa군과 OVX-AnCa-OM군의 실험 쥐의 혈청에서 GOT와 GPT를 측정한 결과를 나타내는 그래프,
도 10은 Sham군, OVX군, OVX-AnCa군과 OVX-AnCa-OM군의 실험 쥐의 혈액에서 HDL(A), LDL(B) 및 트리글리 세라이드(C)를 나타내는 그래프.

본 발명의 상기 및 그 밖의 목적과 새로운 특징은 본 명세서의 기술 및 첨부 도면에 의해 더욱 명확하게 될 것이다.

본 발명에 따른 한방소재를 이용한 고령친화적 고품질 멸치 칼슘제는 숙지황, 당귀, 골쇄보, 구기자, 두충, 우슬, 육계, 속단, 감초, 구척 중의 어느 하나의 한약재 추출물 또는 이들 혼합물의 한약재 추출물(한방 추출물)과 멸치 분말을 포함한다.

본 발명에 적용하는 한방소재를 이용한 고령친화적 고품질 멸치 칼슘제에서 칼슘 소재로 이용하기 위해 사용한 멸치(Engraulis japonicus)잔사는 2013년 10월에 부산광역시소재 부경수산으로부터 원료를 구입하였다. 구입한 원료 잔사는 이물질 및 나트륨 제거를 위하여 자숙, 수세 및 탈수공정을 35회 반복하였다. 열풍건조기에서 건조하고, 분쇄기로 500mesh가 되도록 분쇄하여 실험에 소포장하여 사용하였다.

분석에 사용할 한방소재는 동의대 한의과대학 처방에 근거한 노인성 골다공증에 도움을 줄 수 있는 한방소재를 선택하였다. 한방추출물은 수냉 냉각 순환식 추출기 DM-1000(Daehan Median Co., LTD, Seoul, Korea)를 이용하여 한방소재 1kg과 물 4L 비율로 넣고 105±2℃에서 7시간 추출한 후 회전식 농축기에서 감압 농축하여 사용하였다.

일반성분은 상법에 따라 측정하였다. 즉, 수분은 상압가열 건조법, 조단백질은 semimicro Kjeldahl법, 조지방은 Soxhlet법, 조회분은 건식회화법으로 측정하였다. 탄수화물은 전체 100%에서 수분, 조단백질, 조지방과 조회분 함량을 제외한 값으로 계산하였다.

대장균군수의 측정은 대장균군 측정용 3M 배지에 35±2℃에서 24±2℃시간 배양한 후 생성된 붉은 집락종 주위에 기포를 형성하고 있는 집락수를 계산하고 그 평균 집락수에 희석배수를 곱하여 대장균군수를 산출하였다.

중금속의 정량으로서, 납 및 수은의 분석을 위해 시료의 분해는 식품공전의 식품 중 '7. 유해물질시험법'에서 건식회화법을 사용하여 시험용액을 조제하였으며, 유도결합플라즈마법을 이용하여 분석하였다. 비소의 분석을 위해 시료의 분해는 식품공전의 식품 중 '7. 유해물질시험법'에서 습식회화법을 사용하여 시험용액을 조제하였으며, 마이크로웨이브법을 이용하여 분석하였다.

무기질의 정량으로서, 마그네슘의 정량은 질산(HNO₃)을 이용하여 습식분해한 후 ICP(inductively coupled spectrophotometer : SPECTRO ARCOS-유도결합플라즈마분석기, SPECTROBLUE ICP-OES (Radial, Axial, Twin Interface)를 이용하여 분석하였다. 나트륨의 정량은 시료를 건식회화법을 이용하여 시험용액을 조제한 후 ICP, SPECTROBLUE ICP-OES를 이용하여 분석하였다. 인의 정량은 몰리브덴 청 비색법을 이용하여 분석하였다.

또한 칼슘 함량 측정에 대해서는 다음과 같이 실시하였다.

시료 투여 8주 후에 실험동물을 희생시키고 대퇴골을 절취하였다. 대퇴골에 잔류하고 있는 지방 및 주위조직을 제거하고 생리식염수로 세척한 후 105±5℃에서 건조하여 무게를 측정하여 실험동물의 체중으로 환산하였다.

건조된 대퇴골을 회분 도가니에 각각 담아 550~600℃에서 12시간 동안 완전히 회화시킨 다음 30분 방냉한 후 회분의 무게를 측정하였다. 회화된 회분은 1N HCl에 용해한 후 1% La₂O₃로 희석하여 원자흡광광도계(atomic absorption spectrometer, Perkin Elmer Co., Santa Clara, CA, USA)로 칼슘 함량을 측정하였다.

또한, 본 발명에서 실험에 사용한 동물은 중앙실험동물(주)(서울시, 한국)로부터 구입한 4주령의 암컷 Sprague-Dawley(SD)계 흰쥐를 사용하였다.

동의대학교 블루바이오소재 개발 및 실용화지원센터의 실험동물시설에서 1주일간 순화 적응시킨 후 일반증상을 관찰하여 이상이 없는 건강한 동물을 선택하여 사용하였다.

시험동물사육은 온도 23±2℃, 상대습도 50±10%, 환기 횟수 10~18회/시간, 조명시간 12시간(오전 8시~오후 8시) 및 조도 150~300 Lux로 설정된 사육환경을 유지하였으며, 방사선 멸균된 실험동물용 고형사료와 고압 멸균한 1차 증류수를 자유롭게 섭취할 수 있게 하였다.

동물실험은 동의대학교 동물실험윤리위원회의 사전 심의를 받아 동물실험윤리위원회의 규정에 따라 수행하였다.

실험동물을 폐경 이후의 호르몬 분비상태로 변화시켜 골다공증을 인위적으로 유발시키기 위하여 양측 난소 절제술(ovariectomy, OVX)을 시행하였다. 무균 조작 하에 일반적인 수술 전 처치방법에 따라 10% 포비돈 요오드로 수술부위 및 주위를 소독한 후, 양쪽 등의 피부, 근육, 복막의 절개를 시행하여 양쪽 난소를 모두 노출시킨 후 난소를 적출하고 절제부위는 흡수성 봉합사로 결찰 및 봉합하였다.

투여용량 설정 및 투여방법은 다음과 같이 실행하였다.

강제경구 투여 전 4시간 동안 절식시킨 다음, 체중을 측정하고 체중 범위에 따른 무작위법에 의거하여 암컷 SD(Sprague-Dawley)계 흰쥐를 각각 32마리의 실험동물을 8마리씩 실험군을 분리하였다. 투여 용량은 이전의 보고(김향숙 등, 2013)를 참고하여 멸치 분말 시료의 용량을 정하였으며 한약재 복합 추출물 분말의 용량은 1:1 등비를 투여 2주 후 혈청의 칼슘변화량을 확인하여 한약재 복합 추출물 분말의 총 투여량을 200 mg/day, 멸치 분말 시료의 투여량을 100 mg/day로 용량을 설정하였다.

실험군에 따라 정해진 용량을 경구투여용 스테인레스 재질 존데(sonde)를 이용하여 경구투여하였다. 1일 1회 시험물질 투여 후 2시간 동안은 사료를 제한하였으며, 음수는 제한 없이 계속 공급하였다. 실험군 1인 OVX-AnCa군에는 멸치 분말(100mg/day)을 멸균된 생리식염수에 현탁하여 투여하였으며, 실험군 2인 OVX-AnCa-OM군에는 멸치 분말과 복합한약재추출물을 표 3-4에 기술되어 있는 것과 같은 용량을 생리식염수 1 mL에 현탁하여 투여하였다. Sham군과 OVX군에는 생리식염수 동량을 같은 방법으로 투여하였다. 실험동물의 개별특성에 따라 한꺼번에 투여가 불가능할 경우에는 같은 날에 2회에 걸쳐 나누어 투여하였다.

본 발명에서 혈액채취 및 부검은 다음과 같이 실시하였다.

실험동물을 희생시키기 전 12시간 절식시킨 후 데시케이터(desicator) 안에 디에틸 에테르를 적당량 취하여 마취시킨 뒤 하복부를 개복하고, 멸균주사기를 이용하여 심장 채혈법으로 혈액을 채취하였다. 혈액채취 후에 주요 내부 장기의 병변을 각 실험군과 대조군을 육안적으로 관찰하여 이상 유무를 확인하였다.

또한 관능 검사는 하기와 같이 실시하였다.

조직감(texture), 풍미(flavor), 색(color), 맛(taste), 이물감(feeling of irritation), 전체적인 기호도(Overall acceptance)의 6개 검사항목으로 나누어 기호도가 낮으면 1, 가장 높으면 5의 점수를 주도록 하여 최고 5점, 최저 1점의 범위에 의해 평가를 실시하였다. 시료를 일회용 접시에 가로, 세로, 높이가 1.5 x 1.0 x 0.7cm³ 크기로 잘라 2조각씩 제시하였으며, 시료의 평가는 제조 후 24시간 지난 것을 사용한다.

상술한 바와 같은 실험으로부터 얻은 결과들의 실험군별 상호비교를 한 평균치는 평균표준오차(meanSD)로써 산출하였다. 실험군들 간의 통계처리는 Student's t-test를 하였고 P-value가 0.05 미만인 경우 유의한 것으로 판정하였다.

본 발명에 따른 멸치 분말의 일반성분은 하기 표 1에서 알 수 있는 바와 같이, 수분 3.3중량%, 조단백질 26.6중량%, 조지방 1.6중량%, 조회분 66.0중량% 및 탄수화물 2.5중량%였다.

멸치 분말은 조회분의 함량이 66.0%로 가장 높은 함량을 보여 무기질의 공급원으로서의 가능성을 보여주었고, 그 다음으로 조단백질의 함량이 26.9%로 가장 높아 가공공정의 개선이 이루어진다면, 보다 많은 협잡물의 제거로 높은 무기질 함량의 증가를 꾀할 수 있으리라 기대된다. 반면 조단백질의 함량이 높은 것으로 나타나 멸치 분말은 단백질 공급원으로서 식품소재로의 이용 및 활용 가능성을 보여주고 있다.

한편, 한약재 추출물(한방추출물)은 하기 표 2에서 알 수 있는 바와 같이, 수분 18.1중량%, 조단백질 7.5중량%, 조지방 0.9중량%, 조회분 5.5중량% 및 탄수화물 68.0중량%였다.

상기 한방추출물은 탄수화물분의 함량이 68.0%로 가장 높은 함량을 보였고, 그 다음으로 수분, 조단백질, 조회분, 조지방의 순으로 나타나 조회분의 함량이 가장 낮은 것으로 판명되었다.

멸치 분말을 대상으로 무기질 함량을 분석한 결과는 표 3에 나타내었다.

칼슘 24.4g/100g ash, 인 13.3g/100g ash으로 구성되어 있었고, 나트륨, 칼륨 및 마그네슘은 0.10.5g/100g ash으로 미량 함유되어 있었다. 중금속의 경우 납(0.1mg/kg ash), 비소(0.1mg/kg ash)와 수은(불검출 0.0mg/kg ash)은 원료 안전성에 전혀 문제가 되지 않은 것으로 조사되었다. 이는 멸치의 경우 청정해역으로 알려진 남해안에서 어획되어 오염 정도가 적은 것으로 판단되었다.

한방추출물을 대상으로 무기질 함량을 분석한 결과는 표 4와 같다.

칼슘분말에 비하여 소량이였지만 칼슘 4.3mg/100g ash, 인 11.2mg/100g ash으로 구성되어 있었고, 마그네슘은 8.1mg/100g ash으로 미량 함유되어 있었다. 중금속의 경우 납(0.1mg/kg ash)과 수은(불검출0.0mg/kg ash)은 검출되지 않아 원료 안전성에 전혀 문제가 되지 않은 것으로 분석되었다. 이는 국내산 및 수입산 모두 규격에 통과한 한방소재를 선택하므로 식품안전성에는 큰 문제가 없는 것으로 판단된다.

납(Pb: Lead)에 의한 오염은 살충제 농약인 비산납 등이 토양을 오염시켜 축적되고 있다(김덕웅, 2005). 납 중독시, 신경, 평활근 장애와 적혈구 중의 헤모글로빈을 감소시켜 빈혈을 유발하며 빈혈, 뇌손상마비, 신장 장애 등의 급성독성 증상과 창백한 피부, 두통, 식욕 감퇴 등의 만성 증상을 일으키는 것으로 알려져 있다(Concon, 1988; Choi, 1995; Conor, 1991). 건강기능식품공전에서 기준규격으로 제시한 칼슘 중 납의 허용기준치인 0.3 mg/kg을 충족하는 결과로서 규격보다 3배 정도 낮게 검출되어 납의 안전성에 대해 확인할 수 있었다.

비소(As: Arsenic)는 특히 토양, 물 및 동식물에 함유되어 있으나 식품에 함유되어 있는 형태는 대부분 독성이 적은 유기 비소 형태로 알려져 있다(유춘철 외, 2005). 섭취시 구토, 혈뇨성 설사를 일으키고 장기간 노출시 식욕부진, 체중감소, 안면부종, 폐색성 황달, 신경염이나 피부각화증을 유발할 수 있다(김미혜 외, 2004.). 멸치 분말 및 한방추출물 모두 낮은 수준의 함량을 보였다.

수은(Hg: Mercury)의 경우는 화장품, 의약품, 도료 등에 사용되어온 금속으로 수은광산, 화학공장, 아말감, 체온계, 수은 전지 등에서 오염되며, 오늘날 농작물에 대한 오염원으로는 페닐초산 수은 등 수은계 농약의 토양오염, 공장폐수, 도시하수의 농경지로의 유입을 들 수 있다. 특히 일본에서 발생한 유기 수은 중독인 Minamata병은 어패류 오염으로 중추신경 마비 증상을 일으키는 것으로 알려져 있다. WTO의 자료에 의하면 식품에서 무기 형태로 존재하는 수은 함량은 20 g/kg 이하로 알려져 있다(Concon, 1988; Choi, 1995; Conor, 1991). 본 발명에 적용되는 멸치 분말 및 한방추출물 모두 검출되지 않아 중금속에 의한 안전성의 문제에 만족할 수준의 분석 결과를 보였다.

대장균군은 복합 한약제 추출물과 멸치 분말 모두 음성으로 나타나 건강기능식품공전에서 칼슘의 기준규격으로 제시한 기준을 충족하여 대장균군에 의한 안전성 문제를 확보하였다.

다음에 본 발명에 따른 한방소재 기능성 성분의 최적 추출방법 확립에 대해 설명한다.

복합 한약제 추출물 조제방법은 동의대학교 한의과대학 및 블루바이오 소재개발 및 실용화 지역혁신센터의 자료에 근거한 노인성 골다공증에 도움을 줄 수 있는 한방소재를 선택하였다. 한방추출물은 수냉 냉각 순환식 추출기(DM-1000, Daehan Median CO., LTD, Seoul, Korea)를 이용하여 한방소재 1kg과 물 4L 비율로 넣고 105±2℃에서 7시간 추출한 후 회전식 농축기에서 감압 농축하여 사용하였다. 사용된 한방소재는 숙지황, 당귀, 골쇄보, 구기자, 두충, 거사, 우슬, 육계, 속단, 감초, 구척 등으로 골질환 예방 치료 및 치료용으로 알려져 있는 한방소재를 적당한 비율로 혼합하여 사용하였다.

본 발명에 적용되는 한방 추출물과 멸치 분말의 제조 방법은 다음과 같다.

본 발명에서는 폐경기 후의 골다공증은 폐경이라는 물리적 현상과 직접적인 관계를 갖고 있으므로, 폐경기 여성의 골다공증 치료에 접근하기 위해서는 노화라는 거시적 관점에서 접근했다.

폐경(menopause)이란 월경이 완전히 끝난 것을 말하며 폐경이 되는 시기는 대개 49세 전후이다. 폐경은 자궁이나 난소 등이 인위적으로 제거되어도 나타나며 폐경 부인의 75%는 증상이 없으나 약 25%의 경우에서 초기에는 홍조, 작열감, 불면증, 냉한 등의 혈관 운동계 증상이 주로 나타나며 점차 동맥경화증, 재발성 요도염, 골다공증, 비뇨생식기 위축 등이 나타나고 자율신경 계통의 불균형으로 인한 피로감, 의기소침, 현기증, 홍조, 불면, 불쾌감, 집중력 감퇴, 호흡곤란감, 정서불안, 긴장감 등이 함께 나타난다.

의학적인 치료에 있어서는 특별한 금기증상, 예컨대 에스트로겐(estrogen) 의존성 종양, 유방암, 원인 불명의 자궁출혈, 자궁암, 뇌졸중, 동맥경화증, 혈전 색전성질환 등이 없다면 에스트로겐을 우선적으로 처방한다. 골다공증의 발생빈도를 보더라도 에스트로겐을 투여하지 않은 40대 이후의 부인들은 1,000명 중 75명 꼴이었으나 에스트로겐 투여 후에는 25명 정도로 감소한다.

에스트로겐 치료에는 위험성이 내포되어 있는데, 에스트로겐의 발암성이 그것이다. 수년 전에는 프로제스틴 병용요법이 권장되기도 하였지만 최근에는 오히려 유방암을 심화시킨다는 보고가 있다(Schairer et. al., 2000; Stephens et. al, 2000).

따라서 한방부인과학에서는 골다공증을 만성 갱년기 장애의 한 유형으로 보고 폐경기 질환의 범주에서 다루고 있다. 따라서 폐경의 전반적인 신체변화를 중심으로 신장과 간이 허약해져서 부인과질환이 올 경우에는 육미지황탕과 우귀환을 가미하여 활용한다는 보고가 있다(한방부인과학, 2001).

또한, 단독 또는 2가지 정도의 한약재와 칼슘의 병용 보고 논문 및 골다공증에 대한 발표 논문, 특허, 보고서 등을 종합하여 표와 같은 복합한방추출물 레시피를 마련하였다.

숙지황, 당귀, 골쇄보, 구기자, 두충, 우슬, 육계, 속단, 감초, 구척 등을 주요성분으로 한약재를 배합하고 추출물의 분말을 제조하였다. 구체적인 배합비는 표 5와 같다.

숙지황은 Scrophulariaceae과에 속하는 지황(Rehmannia glutinosa var. purpurea)의 뿌리를 9번 증숙하여 건조한 것으로 본초학적으로 생식기능감퇴와 노화성으로 온 골다공증에 효능이 있는 것으로 화학성분으로는 tyrosine, ajugol, 8-epi-Loganic acid, Alanine, Aucubin, Catalpol, Glutamic acid, Isoleucine, Rehmaionoside 이 중 aucubin은 콜라겐(collagen) 합성 촉진작용을 한다.

당귀는 미나리과에 속하며 여성을 위한 약초라고 할 만큼 부인병에 효과적으로 방풍의 대용으로 쓰기도 한다. 뿌리가 약재로 쓰이는데, 뿌리의 주요 성분으로는 pyranocoumarin계 decursin, decursinol의 AChE 억제작용 등이 보고되어 있고 방향성 정유와 당류와 비타민 E 등이 함유되어 있다. Niwa 등(2001)은 당귀의 brefeldin A가 p53 의존성 기전에 의해 파골세포의 apoptosis를 유도함으로써 osteoclastic bone resorption를 저해하는 것으로 보고하였다.

골쇄보는 고란초과의 뿌리를 건조한 것으로 근육과 뼈를 강하게 하며 통증을 억제하고 소염, 강장작용, 타박상 등의 염증을 완화 효능이 있는 것으로 알려져 있다. Yamaguchi(1999) 등은 난소절제로 유발한 골다공증 마우스에 대해 골쇄보가 골무게의 손실을 유의성 있게 억제하였다고 보고하였다(Yamaguchi K., 1999). 또한 골쇄보는 한의학적으로 신양을 보함으로써 비뇨생식기뿐만 아니라 근골을 강화는 효능이 있음이 알려져 있다.

구기자는 가지과에 속하는 구기자나무(Lycium chinense , L. barbarum)의 열매(Lycii fructus)를 말한다. 본초학에서는 화학성분으로는 phenol류와 sterol류, enol류, betaine, diosgenin, kukoamine A, lyciumamide, lyciumin, stigmasterol, sugiol, beta-amyrin, beta-Sitosterol 등이 검정되어 있는데, 구기자의 약리연구에 대해서는 주로 간세포보호작용과 방사선 보호작용에 대한 연구들이 있는데 이는 모두 손상 및 노화된 세포의 재생 효능 작용에 의한 것으로 밝혀져 있다.

두충은 두충과에 속한 두중(Eucommia ulmoides)의 나무껍질을 건조한 것이다. 간과 신장을 보호하고, 근골격계 질환을 예방하는 효능을 갖고 있어서 골격기능과 호르몬 기능 유지와 관련된 작용을 한다. 화학성분으로는 ajugoside, aucubin, betulin, caffeic acid, eucommioside III, genipin, geniposide, geniposidic acid, syringin, syringoside, alyposide, ligustrin, beta-Sitosterol 등이 밝혀져 있다. 두충의 약리작용은 활성산소를 제거하여 항산화작용을 갖는 한편 Li 등(1998)은 geniposidic acid와 aucubin(Monoterpenoid)이 collagen 합성을 촉진함으로써 근육과 뼈를 강화시키는 작용을 한다고 보고하였다.

우슬은 비름과인 쇠무릎(Achyranthes bidentata , A. japonica)의 뿌리를 지칭한다. 효능은 어혈을 제거하고 진통효과가 있으며, 간과 신장을 보호하고, 근골격계 질환을 예방하는 효능 작용을 하여 노화성 골질환에 효능이 있다. 화학성분으로는 tyrosine, arginine, aspartic acid, glutamic acid, inokosterone, leucine, oleanolic acid, phenylalanine, proline, serine 등이 있다. 우슬에 대해 Xie 등(2001)은 SOD 활성을 증가시키고 ALT와 AST를 저하시켜 산소라디칼을 제거함으로써 항산화 및 항노화활성을 가지며, 혈액순환과 어혈제거를 촉진하여 만성 간손상을 회복시킨다고 하였다.

육계는 녹나무과에 속하며 나무껍질을 건조시킨 약제로 위를 따뜻하게 하여 근육과 뼈를 강화하며, 혈류 개선을 통한 모든 약제의 흡수를 증진시는 효능이 있다. 또 육계는 중추억제, 진정, 진통, 해열, 관상동맥 혈류량 증가 및 허리와 무릎 연약증 등 약리작용이 있다.

속단은 꿀풀과에 속하는 속단의 뿌리로서 한국생약규격집에는 Phlomis umbrosa라 규정하고 있다. 화학성분으로는 betonicine이 있는데 이는 항염증활성을 갖고 있으며 succinic acid 및 asperosaponin FH1, cantleyine, daucosterol, venoterpine, -sitosterol 등이 함유되어 있다. 노화로 인한 비뇨생식기능 감퇴, 골격약화, 골절 등 예방에 효능이 있다.

감초는 콩과에 속하는 Glycyrrhiza속으로, 주성분은 triterpenoid계 saponin, glycyrrhizin 등이 주성분으로 분해산물인 glucuronic acid는 인체 해독작용, 항산화작용, 항염증작용 및 부신피질호르몬작용 등의 효능이 있어 칼슘제 복용 시 위에 부담과 부작용을 최소화하는 제재로 이용할 수 있다.

구척은 뿌리가 길고 잔가지가 많아 개의 등골뼈와 같아 붙여진 이름으로 허리와 다리를 튼튼하게 하며 관절의 움직임을 용이하게 하여 요통, 관절염, 하체무력증에 효능이 있는 것으로 보고되고 있다(박종희 등, 2009).

다음에 본 발명에 따른 한방추출물과 멸치 분말 혼합물의 골격대사능 평가하였다.

(1) 난소적출로 골다공증을 유도한 Sprague-Dawley (SD) rat을 이용한 in vivo 동물실험

1) 실험동물

실험에 사용한 동물은 중앙실험동물(주)(서울시, 한국)로부터 구입한 4주령의 암컷 Sprague-Dawley (SD)계 흰쥐를 사용하였다.

동의대학교 블루바이오소재개발 및 실용화지원센터의 실험동물시설에서 1주일 간 순화 적응시킨 후 일반증상을 관찰하여 이상이 없는 건강한 동물을 선택하여 사용하였다.

시험동물사육은 온도 23±2℃, 상대습도 50±10%, 환기 횟수 10~18회/시간, 조명시간 12시간(오전 8시~오후 8시) 및 조도 150~300 Lux로 설정된 사육환경을 유지하였으며, 방사선 멸균된 실험동물용 고형사료와 고압멸균한 1차 증류수를 자유롭게 섭취할 수 있게 하였다.

동물실험은 동의대학교 동물실험윤리위원회의 사전 심의를 받아 동물실험윤리위원회의 규정에 따라 수행하였다.

2) 난소절제술 및 분류

실험동물을 폐경 이후의 호르몬 분비상태로 변화시켜 골다공증을 인위적으로 유발시키기 위하여 도 2에 도시된 바와 같이, 양측 난소 절제술(ovariectomy, OVX)을 시행하였다. 도 2는 본 발명을 적용하기 위해 실험동물을 폐경 이후의 호르몬 분비상태로 변화시켜 골다공증을 인위적으로 유발시키기 위한 양측 난소 절제술을 나타내는 도면이다.

무균 조작 하에 일반적인 수술 전 처치방법에 따라 도 2에 도시된 바와 같이, 10% 포비돈 요오드로 수술부위 및 주위를 소독한 후, 양쪽 등의 피부, 근육, 복막의 절개를 시행하여 양쪽 난소를 모두 노출시킨 후 난소를 적출하고 절제부위는 흡수성 봉합사로 결찰 및 봉합하였다.

난소절제술의 영향을 배제하기 위하여 난소절제술과 동일하게 수술하였지만 난소를 제거하지 않은 대조군(sham-operation, Sham군)과, 난소적출군(OVX), 난소적출 후 멸치 분말 투여군(OVX-AnCa), 난소적출 후 표 6 및 표 7에 도시된 바와 같이, 멸치 분말+한약재투여군(OVX-AnCa-OM) 등 4개 군으로 분류하였다.

3) 시험물질의 추출 및 조제

실험에 사용한 한약재들은 (주)대한생약제품(부산시 소재)에서 구입하여 사용하였다. 표 5의 함량비와 같이 건조중량을 각각 달아 4배의 증류수를 가하여 105±2℃에서 7시간 동안 열수 추출하였다. 추출액은 부직포와 Whattman paper No. 1 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)으로 여과한 다음 감압 농축하였으며, 동결건조기(FDU-2000, EYELA, Japan)를 이용하여 동결건조 후 복합한약재추출물 분말을 얻었다. 멸치 분말은 지에스피(주)에서 제공한 것을 사용하였다. 멸치 분말과 한약재 복합 추출물을 1:2 (g/g)의 비율로 균일하게 혼합하여 -80℃의 냉동고에 보관하면서 본 연구의 시료로 사용하였다.

4) 투여용량 설정 및 투여방법

강제경구 투여 전 4시간 동안 절식시킨 다음, 체중을 측정하고 체중 범위에 따른 무작위법에 의거하여 암컷 Sprague-Dawley (SD)계 흰쥐를 각각 32마리의 실험동물을 8마리씩 실험군을 표 8과 같이 분리하였다.

투여 용량은 이전의 보고(김향숙 등, 2013)를 참고하여 멸치 분말 시료의 용량을 정하였으며 한약재 복합 추출물 분말의 용량은 1:1 등비를 투여 2주 후 혈청의 칼슘변화량을 확인하여 한약재 복합 추출물 분말의 총 투여량을 200 mg/day 멸치 분말 시료의 투여량을 100 mg/day로 용량을 설정하였다. 실험군에 따라 정해진 용량을 경구투여용 스테인레스 재질 존데를 이용하여 경구투여 하였다. 1일 1회 시험물질 투여 후 2시간 동안은 사료를 제한하였으며, 음수는 제한 없이 계속 공급하였다. 실험군 1인 OVX-AnCa군에는 멸치 분말(100 mg/day)을 멸균된 생리식염수에 현탁하여 투여하였으며, 실험군 2인 OVX-AnCa-OM군에는 멸치 분말과 복합한약재추출물을 표 8에 기술되어 있는 것과 같은 용량을 생리식염수 1 mL에 현탁하여 투여하였다. Sham군과 OVX군에는 생리식염수 동량을 같은 방법으로 투여하였다. 실험동물의 개별특성에 따라 한꺼번에 투여가 불가능할 경우에는 같은 날에 2회에 걸쳐 나누어 투여하였다.

5) 일반증상 관찰 및 체중측정

투여 당일에는 투여 직후 30분 동안에는 이상증상 유무에 대해 지속적으로 관찰하였고, 투여 후 6시간까지 매시간, 투여 후 1일부터 14일까지는 1일 1회 일정한 시간에 일반 상태의 변화, 중독 증상의 발현, 사망 동물의 유무 및 기타 이상 증상에 대하여 관찰하였다.

체중변화 관찰은 모든 동물에 대하여 12시간 동안 절식시킨 다음 실험동물용 저울을 이용하여 1주일에 1회, 실험 일정상 정해진 시간에 측정하였다.

8주간의 체중을 매일 일정한 시간에 측정한 결과, Sham군의 경우에는 체중이 정상적으로 증가한 반면, 난소를 적출하여 골다공증이 유발된 OVX군의 경우에는 지속적인 체중이 증가하였다. OVX 처리를 한 후 시료를 투여한 실험군 2개 군인 OVX-AnCa군과 OVX-AnCa-OM군의 경우에는 OVX군에 비해서는 도 3에 도시된 바와 같이, 유의한 차이의 체중 감소의 경향을 보였다. 도 3은 8주간의 체중을 매일 일정한 시간에 측정한 결과, Sham군, OVX군, OVX-AnCa군과 OVX-AnCa-OM군에서의 체중 변화를 나타내는 그래프이다.

난소를 절제한 실험동물은 에스트로겐의 결핍 때문에 전반적으로 체중이 증가하는 것으로 알려져 있다(Mobasseri S et. al., 2004). 난소를 적출하여 골다공증을 유발한 OVX군의 체중증가는 이와 같은 갱년기 여성에 있어 체중증가가 일어나는 현상과 일치한다. 한편 실험군 2개 군에서의 상대적 체중감소는 이러한 갱년기 이후에 동반되는 골다공증에 대한 개선효과를 반증하는 결과이다.

6) 혈액채취 및 부검

실험동물을 희생시키기 전 12시간 절식시킨 후 데시케이터 안에 디에틸 에테르를 적당량 취하여 마취시킨 뒤 하복부를 개복하고, 멸균주사기를 이용하여 심장 채혈법으로 혈액을 채취하였다.

혈액채취 후에 주요 내부 장기의 병변을 각 실험군과 대조군을 육안적으로 관찰하여 이상 유무를 확인하였다.

4개의 실험군 모두에서 주요 내부 장기들의 특이한 이상함은 관찰되지 않았으나, 뚜렷한 체중증가가 이루어진 OVX군과 OVX-AnCa군, OVX-AnCa-OM군에서는 내장지방이 Sham군에 비해 상대적으로 많이 관찰되었다.

다음에 골밀도를 측정하였다.

8주간의 투여 후 실험동물을 희생시키고 양쪽의 대퇴골을 분리하여 적출한 다음 골격에 붙어있는 근육, 인대 및 지방을 제거하고 생리식염수로 세정한 후, 50℃에서 건조하여 대퇴골 시료를 준비하였다.

소동물용 에너지 방사선 골밀도 측정기(pDEXA X-ray bone densitometer, Norland medical systems Inc., USA)를 사용하여 대퇴골의 골밀도를 측정하였다. 해상도는 1.0×1.0 mm, 스피드는 20 mm/sec, 샘플의 길이는 1.60 cm, 폭(너비)은 3.90 cm로 설정하여 측정하였다.

각각의 실험군에서 8마리의 SD-rat을 이용하여 측정한 결과, Sham군과 OVX군의 경우에는 상대적으로 낮은 골밀도를 나타내었으며, OVX-AnCa 및 OVX-AnCa-OM 등 실험군 2개군의 경우에는 표 9 및 도 4에 도시된 바와 같이, 골밀도의 증가가 통계적으로 유의미하게 나타났다. 도 4는 각각의 실험군에서 8마리의 SD-rat을 이용하여 측정한 결과, Sham군, OVX군, OVX-AnCa군과 OVX-AnCa-OM군에서의 골밀도를 나타내는 도면이다.

Sham군은 평균 0.186 g/㎠, 난소적출을 실시하여 골다공증을 유발한 OVX군은 평균 0.170 g/㎠으로 수치상으로는 약간의 차이를 보였지만, t-test로 유의성을 검증한 결과 유의미한 차이를 나타내었다. 이는 OVX군에서 난소적출로 인해 골다공증이 유발되고 대퇴골의 골밀도가 유의하게 감소되었다는 것을 의미한다.

한편 멸치 분말만 투여한 OVX-AnCa 실험군에서는 평균 0.270 g/㎠의 골밀도를, OVX-AnCa-OM 실험군에서는 0.310 g/㎠의 골밀도를 나타내었다. 두 실험군 모두에서 OVX군에 비교하여 높아진 골밀도를 나타내었으며, 복합한약재 추출물을 투여한 OVX-AnCa-OM군에서 가장 높은 골밀도를 나타내었다.

이소플라본, 녹각, 상표소, 젤라틴 등의 골다공증에 대한 영향을 본 다른 보고들의 경우, 정도의 차이는 있지만 골다공증이 유도된 실험동물의 경우에 골밀도가 정상군에 비해 상대적으로 저하되며, 시료를 투여한 실험군의 경우에는 증가하는 현상과 일치하는 경향을 나타내었다(김계엽 등, 2009; 황정수 등, 2010; 이재우 등, 2009; 박정은 등, 2012).

다음에 골 칼슘 함량을 측정하였다.

시료 투여 8주 후에 실험동물을 희생시키고 대퇴골을 절취하였다. 대퇴골에 잔류하고 있는 지방 및 주위조직을 제거하고 생리식염수로 세척한 후 105±5℃에서 건조하여 무게를 측정하여 실험동물의 체중으로 환산하였다.

건조된 대퇴골을 회분 도가니에 각각 담아 550~600℃에서 12시간 동안 완전히 회화시킨 다음 30분 방냉한 후 회분의 무게를 측정하였다. 회화된 회분은 1 N HCl에 용해한 후 1% La₂O₃로 희석하여 원자흡광광도계(atomic absorption spectrometer, Perkin Elmer Co., Santa Clara, CA, USA)로 칼슘 함량을 측정하였다.

대퇴골 건조무게는 OVX군에서 유의적으로 낮게 나타났으며, 2개 실험군에서는 Sham군 대퇴골 무게보다 약간씩 증가하는 경향을 나타내었다. 이러한 대퇴골 무게가 골다공증 이전으로의 복귀현상은 젖산칼슘, 우골칼슘, 탄산칼슘 등의 공급에서도 유사한 현상이 나타났다는 이전 주관기관의 보고와 일치한다.

대퇴골의 회분 함량의 변화를 보면, OVX군에서는 299.6mg으로 Sham군의 317.8mg에 비하여 유의성 있게 감소하였다. 반면에 멸치 분말 투여군이나 복합한약재분말 투여군에서는 표 10 및 도 5에 도시된 바와 같이, 323.0mg 과 319.6mg으로 OVX군과 Sham군에 비하여 증가하였으며, 이는 대퇴골 건조무게와 비례하는 경향을 나타내었다. 도 5는 Sham군, OVX군, OVX-AnCa군과 OVX-AnCa-OM군에서 실험 쥐의 대퇴골 무게(A), 대퇴골의 회분(B), 대퇴골의 칼슘(C와 D)에서 ANCA와 ANCA-OM 공급의 효과를 나타내는 그래프로서, 모든 값은 평균은 SD이다.

대퇴골 회분 내의 칼슘함량 또한 유사한 경향을 보였는데, OVX군에서는 217.9mg을 보인 반면에 정상군인 Sham군에서는 141.8mg을, 실험군 2개 군에서도 144.2mg과 46.3mg으로 나타났다. 이는 대퇴골건조무게에 대한 회분속의 칼슘무게를 비율로 계산한 결과에서도 유사하게 나타나, 본 발명에서 사용한 시료 2가지가 대퇴골 무게와 칼슘 증가에 유효함을 입증하였다.

다음에 본 발명에 따른 멸치 칼슘제에 의한 골격대사능 관련 지표의 생화학적 분석을 실행하였다.

오스테오칼신(Osteocalcin)은 골아세포와 상아아세포에서만 생산되는 골격의 산성단백질로, 혈청 내의 오스테오칼신 농도는 골아세포의 활성을 반영하는 것으로 알려져있다(Jayachandran and Miller, 2002). 오스테오칼신은 뼈의 구조에서 칼슘과 단단하게 결합되어 있는데, 새로운 뼈를 형성할 경우에 뼈의 모세포의 활성을 간접적으로 반영하는 뼈의 형성지표로서의 역할 또한 한다. 난소적출을 실시하면 혈청 중의 함량이 다소 감소한다고 보고되고 있다(Duda et. al., 1998).

본 발명에서 SD-rat의 혈청 중의 오스테오칼신 함량은 The Rat Gla-Osteocalcin High Sensitive EIA Kit (Cat #MK126, Clontech Laboratories, Inc., CA, USA) 와 96-well plate, 그리고 자동생화학 분석기(BS-390 Automatic biochemistry analyzer, Medista, Korea)를 사용하여 면역혈청학적 방법에 의하여 측정하였다.

실험결과, OVX 군에서 1.23 ng/mL로 가장 낮았으며, Sham군은 1.57 ng/mL로 OVX군에 비하여 유의하게 높은 수치를 나타내었다. 시료를 투여한 실험군 OVX-AnCa과 OVX-AnCa-OM은 OVX에 비해서는 증가된 수치를 보였으나 Sham보다는 낮게 측정되었다. 이 결과는 멸치 분말 투여와 복합한약재추출물의 투여가 혈청 중의 오스테오칼신 농도를 증가시킬 수 있음을 나타낸다. 본 발명에 따른 시료 투여가 표 11 및 도 6에 도시된 바와 같이, 난소절제로 인해 유발된 골다공증의 뼈에서 모세포를 활성화시키고 뼈의 파괴세포의 활성도는 감소시켰을 것으로 추정된다. 도 6은 Sham군, OVX군, OVX-AnCa군과 OVX-AnCa-OM군에서 멸치 분말 투여와 복합한약재추출물의 투여에 따른 혈청 중의 오스테오칼신 농도를 나타내는 그래프이다.

오스테오칼신은 골과 상아질에 특이적으로 존재하는 단백질로 조골세포의 활동을 나타내는데 가장 민감하다고 알려졌으며, 골아세포에서 생성되어 일부는 골 기질에 축척되고, 일부는 혈액 속으로 방출된다(Price et. al., 1980). 골 형성시에는 골아세포의 활성이 증가되어 혈청 내 오스테오칼신의 농도가 높아져 골 생성의 지표로 이용된다. 또한, 오스테오칼신의 농도는 폐경 후에 증가되며, 폐경 후에 나타나는 골소실율의 예측에 이용된다(육태한 등, 2006). 즉, 혈청 오스테오칼신 농도 증가는 젊은 연령층에서는 골 형성의 증가를 의미하는 긍정적인 면으로 해석되지만, 폐경 후에는 골밀도와 음의 상관관계를 갖는 것으로 보고되어 골 교체율의 증가를 의미한다.

본 발명에 따른 실험의 결과는 멸치 분말 투여와 복합한약재추출물의 투여가 혈청 중의 오스테오칼신 농도를 증가시킬 수 있음을 나타낸다. 본 발명의 시료 투여가 난소절제로 인해 유발된 골다공증의 뼈에서 모세포를 활성화시키고 뼈의 파괴세포의 활성도는 감소시켰을 것으로 추정된다. 멸치 분말 투여군에서는 비록 정상군인 Sham군의 수준에는 미치지 않았으나 멸치 분말과 한약재추출물을 동시에 투여한 실험군에서는 정상수치와 유사하게 증가하였다. 이는 한약재추출물이 같이 투여되었을 때 시너지효과를 낼 수 있음을 나타낸다.

다음에 본 발명에 따른 한방추출물과 멸치 분말 혼합물의 생리활성을 평가하였다.

(1) 혈액 중 생체기능 지표의 분석

실험동물 혈액 중의 ALP(Alkaline phosphatase), calcium, GOT, GPT등의 지표를 분석하였다.

실험동물의 심장으로부터 채취한 혈액은 3,000 rpm, 4℃, 15분간 원심분리(Avanti centrifuge J-20XP, Beckman coulter, USA)하여 분리된 혈청을 -70℃에서 냉동 보관하여 실험에 사용하였다.

혈액으로부터 분리한 혈청에서 염기성 인산분해효소 ALP분석 Kit (Asan Co. Ltd., Korea)를 사용하였으며, spectrophotometer를 이용하여 500nm에서 정량하였다.

HDL-cholesterol, LDL-cholesterol, Triglyceride, GOT, GPT, Ca은 자동생화학 분석기(BS-390 Automatic biochemistry analyzer, Medista, Korea)를 사용하여 면역혈청학적 방법에 의하여 측정하고 분석하였다.

ALP는 임상에서 가장 흔히 이용되는 골형성 표지자이며, 골아세포가 골형성을 하는 동안 생성되어 그 중의 일부가 혈중에 분비되는 당단백질 효소이다. 난소를 절제한 후에는 ALP의 활동이 증가된다고 알려졌다(Morris, 1993). 혈청 중 ALP의 함량을 보면, 골다공증이 유발된 OVX군에서는 8주 처리 후에 Sham군에 비하여 증가하였다. 한편, 멸치 분말과 복합한약재추출물을 투여한 실험군에서는 표 12 및 도 7에 도시된 바와 같이, 각각 110.27 U/L과 108.81 U/L로 Sham군보다도 더 감소한 결과를 보였다. 도 7은 Sham군, OVX군, OVX-AnCa군과 OVX-AnCa-OM군의 실험 쥐의 혈청에서 APL 농도 상태를 나타내는 그래프이다.

혈청 중 칼슘 농도의 변화 또한 골흡수 지표 중의 하나이다. 뼈에 존재하는 칼슘은 혈청 중 칼슘 농도에 영향을 끼치게 되고, 혈청 중 칼슘농도의 변화는 골흡수율과 관련이 있다(James et. al., 1994). 혈청 중 칼슘 함량을 보면, OVX군에서는 Sham군에 비하여 유의성 있게 감소하였다. 시험물질 투여한 실험군에서는 OVX군과 Sham군에 비하여 그 값이 증가하였다. 이는 표 12 및 도 8에 도시된 바와 같이, 실험군에서 상대적으로 골재생 활동이 활발해지고 있다는 것을 의미한다. 도 8은 Sham군, OVX군, OVX-AnCa군과 OVX-AnCa-OM군의 실험 쥐의 혈청에서 칼슘 농도 상태를 나타내는 그래프이다.

GOT와 GPT는 간장이나 심장 등에 다량 존재하여 아미노산을 분해하는 효소로 간세포가 손상을 받는 경우에 혈중으로 방출되어 이 수치가 상승하게 되므로 간계질환의 지표가 된다(김한수 등, 2010). 본 발명의 실험에서는 실험시료인 복합한약재추출물을 장기간 섭취하였을 경우 나타날 수 있는 간장에 대한 영향을 알아보기 위해 혈청 중의 GOT와 GPT를 측정한 결과, 일반 대조군인 Sham군의 수치가 GOT는 120.61 U/L, GPT는 48.29 U/L로 분석되었으며, 난소적출로 골다공증이 유도된 OVX군의 수치는 각각 242.63 U/L과 59.63 U/L로 GOT는 2배가량, GPT 또한 20% 이상 증가하였음을 알 수 있다. 한편, 실험시료를 급여한 두 실험군인 OVX-AnCa와 OVX-AnCa-OM군은 GOT와 GPT의 수치가 모두 유의하게 감소하였다. 8주간의 투여로 정상군으로 볼 수 있는 Sham군의 수치까지 감소하지는 않았지만, 표 12 및 도 9에 도시된 바와 같이, OVX군에 비해 현저하게 저하된 수치를 볼 수 있었으며, 통계적으로도 유의하다고 분석되었다. 도 9는 Sham군, OVX군, OVX-AnCa군과 OVX-AnCa-OM군의 실험 쥐의 혈청에서 GOT와 GPT를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 이러한 결과는 실험시료가 농도에 따라 간장에 대한 영향이 있을 수는 있지만, 골다공증이 있는 동물의 간지수를 낮추어 줄 수 있는 결과로 해석된다.

다음에 실험동물 혈액 중의 지질성분 중에서 HDL-, LDL-cholesterol, triglyceride 등의 지표를 분석하였다.

멸치 분말과 복합한약재추출물을 급여한 골다공증 유발쥐의 혈액중의 지질성분의 특성을 표 13과 도 10에 나타내었다. 도 10은 Sham군, OVX군, OVX-AnCa군과 OVX-AnCa-OM군의 실험 쥐의 혈액에서 HDL(A), LDL(B) 및 트리글리 세라이드(C)를 나타내는 그래프이다.

골다공증이 유발된 OVX군은 정상군인 Sham군에 비하여 HDL-cholesterol 농도가 유의하게 증가하였으며, 멸치 분말과 복합한약재추출물을 투여한 실험군에서도 유의하게 증가하였다. LDL-cholesterol 농도는 실험시료를 급여한 두가지 실험군에서 상대적으로 감소하는 효과가 있었다. 이는 난소 적출 흰쥐를 대상으로 돈피 젤라틴 효소분해물 급여에 의한 혈청 HDL-cholesterol 농도의 상승을 유도했었다(박정은 등, 2012)는 결과와 일치하였다.

트리글리 세라이드(Triglyceride)의 경우에 Sham군에 비해 OVX군에서 상당히 증가된 수치(92.24 mg/dL)를 보였다. 실험군에서는 정상군의 수치만큼 떨어지지는 않았지만 유의적으로 감소되는 현상이 관찰되었으며, 한약재추출물을 투여한 실험군에서 그 저하폭이 크게 나타났다. 이는 난소 적출 군은 일반 정상군에 비하여 감소된 TG 수치를 나타낸다는 타 보고(박정은 등, 2012; 박찬수 등, 2008)와는 반대의 경향을 나타내었으나, 시험물질의 투여로 어느 정도 감소되는 경향을 나타내었다.

다음에 In vitro assay를 통한 복합한약재추출물의 항산화능을 분석하였다.

1) DPPH radical scavenging 활성 측정

DPPH는 화학적으로 안정성을 띠는 자유라디칼을 가지고 있다. 항산화 활성이 있는 물질과 만나면 전자를 내주면서 라디칼이 소멸되고 자주색에서 황색으로 색깔이 변한다. 복합한약제추출물 샘플의 항산화능을 DPPH 라디칼 소거능을 이용하여 측정하였다.

시료 0.2 mL에 에탄올에 용해시킨 0.4 mM DPPH 용액 0.8 mL을 첨가하여 vortex mixer로 5초간 진탕한 후, 암소에서 10분 동안 반응시켰다. 다음 microplate reader를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디칼 소거능은 시료용액 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소의 백분율로 나타내었다.

비타민 C의 일종으로 항산화활성의 표준물질인 ascorbic acid와 비교하였을 때 본 발명에서 사용한 복합한약재추출물 시료는 약 46~54% 정도의 항산화활성을 나타내었으며 농도 의존적으로 증가하는 경향을 나타내었다. 반면에 표 14에 나타낸 바와 같이, 멸치 분말은 약간의 활성을 나타내었다.

복합한약재추출물은 또한 기존의 멸치 분말과 단독으로 비교하였을 경우에도 2 mg/mL의 경우에 40% 이상의 강한 항산화활성을 나타내었고, 그 증가경향은 농도 의존적이었다.

본 연구에서 투여한 1:2의 비율로 항산화활성을 비교한 경우에도 멸치 분말 단독의 경우에 비교하여 약 30% 정도의 향상된 항산화활성을 나타내었다. 복합한방추출물 단독의 경우보다는 약 15% 정도 저하된 항산화활성을 나타내었지만 이는 1:2의 비율을 적용하기 위해 투여된 절대량이 적기 때문에 나타난 현상으로 분석되었다.

2) SOD-like 활성 측정

활성산소를 제거시키는 효소(Superoxide Dismutase)의 약자로서 몸 안에 필요 이상의 활성산소가 생겼을 때 이것을 중화하는 작용을 하는 물질이 있는지를 알아보는 실험이다.

각 농도별 시료 0.2 mL에 Tris-HCl buffer(50 mM tris containing 10 mM EDTA, pH 8.5, 3 mL)와 7.2 mM pyrogallol(0.2 mL)을 가하고 25에서 10분간 방치하였으며 1 N HCl(1 mL)로 반응을 정지시킨 후 420 nm에서 흡광도를 측정하여 백분율로 나타내었다.

DPPH radical scavenging에서와 마찬가지로 표 15에 나타낸 바와 같이, SOD 결과에서도 복합한약재 추출물 시료는 농도 의존적으로 항산화활성을 나타내었으며, ascorbic acid에 비교하여 약 5053% 정도의 상대활성을 나타내었다.

또한, 기존의 멸치 분말과 단독으로 비교하였을 경우에도 2 mg/mL의 경우에 30% 이상의 강한 항산화활성을 나타내었고, 그 증가경향은 농도의존적이었다. 멸치 분말 단독으로는 미미한 SOD 유사활성을 나타내었다.

본 발명에서 투여한 1:2의 비율로 항산화활성을 비교한 경우에도 멸치 분말 단독의 경우에 비교하여 약 20% 이상의 향상된 항산화활성을 나타내었다. 복합한방추출물 단독의 경우보다는 약 10% 정도 저하된 항산화활성을 나타내었지만 이는 1:2의 비율을 적용하기 위해 투여된 절대량이 적기 때문에 나타난 현상으로 분석되었다.

최근 의학계 보고와 한방여성과학에서는 골다공증은 노화현상과 함께 오는 질환이라는 관점으로 파악하고 있는 점을 고려할 때 항산화활성을 가지는 복합한약재추출물은 그 자체의 골다공증 극복 활성과 더불어 항노화 활성도 기대할 수 있을 것으로 사료된다. 또한, 흡수율이 높은 멸치 분말과 복합처방 될 경우에 골다공증 예방과 개선에 시너지 효과를 기대할 수 있을 것으로 사료된다.

다음에 본 발명에 따른 한방추출물과 멸치 분말 혼합물의 시제품 제작 및 품질 검사를 시행하였다.

(1) 시제품 제작 및 관능검사

상술한 결과를 토대로 하여 시제품을 제작하여 관능검사를 시행하였다. 기존의 멸치 칼슘제를 대조군으로 하여 한방소재를 첨가한 칼슘제로 나누어 관능성에 미치는 영향을 평가하기 위하여 동의대학교 재학생, 절골마을 주민, 주변의 지인 등을 선정하여 실시하였다. 이들에게 관능평가 실험의 목적과 상세 정보를 숙지토록 하고, 조직감(texture), 풍미(flavor), 색(color), 맛(taste), 이물감(feeling of irritation), 전체적 기호도(overall acceptance)를 평가하도록 하였다. 시식은 한 개의 시료를 검사한 후에는 물로 입안을 헹군 후 다른 시료를 시식하고 평가하도록 하였다. 검사 방법은 "매우 좋음(5점), 좋음(4점), 보통(3점), 나쁨(2점), 매우 나쁨(1점)으로 구분 채점하여 관능검사를 실시하여 가장 기호도가 높은 최적의 조건을 찾았다.

표 16에서와 같이 전 연령층에서 골고루 기존 칼슘제보다는 본 발명에 따른 한방추출물이 배합된 칼슘제에서 높은 평가를 받았다. 특히 고령 연령층으로 갈수록 높은 평가를 받았는데, 한방소재에 대한 편안한 인식과 친숙함의 결과로 판단되며, 웰빙의 이미지가 강한 것으로 나타났다.

이와 같이 전 연령층에 걸쳐 받은 평가를 토대로 연령층에 맞는 기능성 소재를 개발하고, 차별화된 제형, 차별화된 포장방법 및 디자인을 개발한다면 다양한 소비층으로부터 선택받을 수 있으리라 사료된다.

본 발명에 따른 한방소재에 대한 긍정적 평가를 기반으로 한방소재에 대한 다양한 부가가치의 창출이 기대되며, 식품에 대한 긍정적 이미지의 부합으로 기능성 소재의 개발이 기대된다.

이상 본 발명자에 의해서 이루어진 발명을 상기 실시 예에 따라 구체적으로 설명하였지만, 본 발명은 상기 실시 예에 한정되는 것은 아니고 그 요지를 이탈하지 않는 범위에서 여러 가지로 변경 가능한 것은 물론이다.

본 발명에 따른 한방소재를 이용한 고령친화적 고품질 멸치 칼슘제를 사용하는 것에 의해 우수한 고기능성 칼슘제를 제공할 수 있다.

Claims (3)

1. 한방소재를 이용한 고령친화적 고품질 멸치 칼슘제로서,
   숙지황, 당귀, 골쇄보, 구기자, 두충, 우슬, 육계, 속단, 감초 및 구척으로 이루어진 한약재 추출물과 멸치 분말을 포함하고,
   상기 한약재 추출물은 전체 중량 100%에 대해 숙지황 10~20중량%, 당귀 10~20중량%, 골쇄보 10~15중량%, 구기자 10~20중량%, 두충 10~15중량%, 우슬 3~7중량%, 육계 3~7중량%, 속단 3~7중량%, 감초 3~7중량% 및 구척 3~7중량%로 이루어지고,
   상기 멸치 분말은 멸치 잔사를 자숙, 수세 및 탈수공정을 거쳐 건조된 후, 500mesh로 분쇄된 것이고,
   상기 멸치 분말은 수분 3.3중량%, 조단백질 26.6중량%, 조지방 1.6중량%, 조회분 66.0중량% 및 탄수화물 2.5중량%로 이루어지고, 상기 한약재 추출물은 수분 18.1중량%, 조단백질 7.5중량%, 조지방 0.9중량%, 조회분 5.5중량% 및 탄수화물 68.0중량%로 이루어진 것을 특징으로 하는 멸치 칼슘제.
2. 제1항에서,
   상기 한약재 추출물은 수냉 냉각 순환식 추출기를 이용하여 상기 숙지황, 당귀, 골쇄보, 구기자, 두충, 우슬, 육계, 속단, 감초 및 구척의 혼합물 1kg과 물 4L 비율로 넣고 105±2℃에서 7시간 추출한 후 회전식 농축기에서 감압 농축한 것을 특징으로 하는 멸치 칼슘제.
3. 제2항에서,
   상기 한약재 추출물과 멸치 분말은 중량비로서 1 : 1로 혼합된 것을 특징으로 하는 멸치 칼슘제.

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