KR101730604B1

KR101730604B1 - 항균활성을 갖는 코어-쉘 나노복합체, 이의 제조방법 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101730604B1
Application number: KR1020160054003A
Authority: KR
Inventors: 김동환; 팡옌
Original assignee: 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2016-05-02
Filing date: 2016-05-02
Publication date: 2017-04-26

Abstract

본 발명은 항균활성을 갖는 코어-쉘 나노복합체에 관한 것으로, 보다 상세하게는 은 나노입자와 타닌산(tannic acid)을 이용하여 제조된 코어-쉘 나노복합체, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 생체에 독성이 없는 생체 적합성이 우수한 재료이면서도, 은 나노입자만을 단독으로 사용한 경우보다 항균성이 현저히 뛰어나다.

Description

항균활성을 갖는 코어-쉘 나노복합체, 이의 제조방법 및 이의 용도{core-shell nanocomposites showing antibacterial, method for manufacturing thereof and uses thereof}

본 발명은 항균활성을 갖는 코어-쉘 나노복합체에 관한 것으로, 보다 상세하게는 은 나노입자와 타닌산(tannic acid)을 이용하여 제조된 코어-쉘 나노복합체, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다.

최근 사람들은 다양한 종류의 세균 및 바이러스 등의 미생물과 접하면서 살아가고 있는데, 특히, 식품, 에어컨, 환기 시스템, 칫솔 등과 같은 매우 일상적인 생활 속에서 많은 접촉이 이루어진다.

다양한 미생물 중에는 신체에 악영향을 미치는 포도상구균, 살모넬라균 및 대장균과 같은 미생물도 다수 존재하고, 이러한 미생물과의 의도치 않은 접촉으로 인해 다양한 질병의 전염, 감염 등의 피해가 끊임없이 발생하고 있다.

이러한 피해들을 미연에 방지하기 위해, 지금까지 수많은 항균활성을 갖는 추출물, 금속계 항균 물질들이 발견되거나 개발되어 왔고, 상기 금속계 항균 물질로는 대표적으로 은(metallic Ag) 혹은 은(Ag)화합물이 이용되어져 왔다.

은은 인체에 해가 적고, 독성이 적으며, 미생물 체내의 신진대사 기능을 다방면으로 억제하여 수백 종류의 유해 세균을 죽이는 것으로 알려져 있으며, 신진대사 기능을 억제하는 것 외에도 금속 은이 방출하는 은 이온의 전기적 능력으로 인해 미생물의 생식기능에 영향을 주어 항균 및 살균 작용을 하는 것으로 알려져 있다.

특히나 은은 효소 등의 단백질을 구성하고 있는 아미노산 중 하나인 시스테인의 -SH기와 은 이온이 반응함으로써, S-Ag를 형성함으로써 미생물을 불활성화시키며, 미생물의 물질 대사 과정 중 활성 산소의 생성을 유도하며, 미생물의 세포질 막에 있는 K+ 이온을 방출시키거나, 미생물의 DNA에 존재하는 염기와 직접적으로 반응하여 미생물의 세포 분열을 방해하는 등의 메커니즘들에 의해 항균 및 살균 효과를 갖는다.

그러나 은 이온은 용액 상태에서만 존재할 수 있기 때문에, 실생활에서 다양한 제품들로 응용되기 위해서는 특정 물질에 이온 결합을 시켜야 이용할 수 있다는 한계점이 있다.

이러한 문제점을 해결하기 위하여 은 나노입자 형태로 제조하여 생활 용품 및 의료 용품과 같은 다양한 분야에 응용한 예가 보고되고 있으나, 이러한 은 나노입자는 은 나노입자 그 자체와 은 나노입자 합성시 사용된 화학물질에 의해 세포에 부정적인 영향을 끼치게 되는 또 다른 문제점이 발견되었다.

이에, 상기 은 나노입자의 세포 독성 문제를 해결하면서도 항균성은 우수한, 의료분야, 화학약품, 환경분야 등의 넓은 분야에 활용될 수 있는 은 나노입자를 적용한 복합재료의 개발이 요구되고 있는 실정이다.

특허문헌 1. 대한민국 공개특허 제10-2010-0122919호

본 발명은 상기와 같은 문제점을 감안하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 우수한 항균활성과 저독성 특성을 갖는 새로운 구조의 코어-쉘 나노복합체를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 상기 코어-쉘 나노복합체를 대량생산할 수 있는 단일 단계(one pot)의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, 은 나노입자로 이루어진 코어; 및 상기 코어의 외표면을 감싸도록 형성된 쉘;을 포함하는 구형의 코어-쉘 나노복합체로, 상기 쉘은 폴리타닌산(poly(tannic acid))으로 이루어진 것을 특징으로 하는 코어-쉘 나노복합체를 제공한다.

상기 코어의 평균 직경은 5 내지 30 ㎚일 수 있다.

상기 쉘의 두께는 1 내지 20 ㎚일 수 있다.

상기 코어-쉘 나노복합체는 음의 표면 전하를 갖는 것일 수 있다.

상기 코어-쉘 나노복합체의 제타 전위는 - 20 내지 - 10 mV인 것일 수 있다.

본 발명은 상기 다른 목적을 이루기 위하여, 염기성 조건 하에서, 은 전구체와 타닌산을 혼합하는 단계를 통해 간단한 방법으로 상기 코어-쉘 나노복합체를 제조하는 것을 특징으로 하는 코어-쉘 나노복합체의 제조방법을 제공한다.

상기 은 전구체는 AgNO₃, AgBF₄, AgPF₆, Ag₂O, CH₃COOAg, AgCF₃SO₃, AgClO₄, AgCl, Ag₂SO₄, 및 CH₃COCH-COCH₃Ag으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

상기 염기성 조건은 pH 7.1 내지 8.5일 수 있다.

상기 염기성 조건은 pH 7.5 내지 8.0일 수 있다.

상기 은 전구체와 타닌산의 혼합 중량비는 1 : 0.5-5일 수 있다.

상기 단계는 10 내지 30 ℃에서 수행되는 것일 수 있다.

상기 단계는 5 내지 60분 동안 수행되는 것일 수 있다.

본 발명은 상기 또 다른 목적을 이루기 위하여, 상기 코어-쉘 나노복합체를 포함하는 항균 조성물을 제공한다.

본 발명은 상기 또 다른 목적을 이루기 위하여, 상기 코어-쉘 나노복합체를 포함하는 도료를 제공한다.

본 발명은 은 나노입자와 폴리타닌산(poly(tannic acid))을 이용한 새로운 구조의 코어-쉘 나노복합체로, 이는 생체에 독성이 없는 생체 적합성이 우수한 재료이면서도, 은 나노입자만을 단독으로 사용한 경우보다 항균성이 현저히 뛰어나다.

또한, 물 속을 비롯한 다양한 환경 속에서도 안정성이 우수하기 때문에, 생체 의학 재료부터 소독제, 약품, 생활분야까지 폭넓게 활용이 가능하다.

본 발명에 따른 코어-쉘 나노복합체는 입자 간 크기가 균일하고, 분산성이 우수하다.

또한 본 발명의 코어-쉘 나노복합체는 특정 pH 조건에서 은 전구체와 타닌산(tannic acid)을 혼합해주는 것만으로 자기 조립, 자기 중합을 통해 제조되기 때문에, 별도의 정제공정, 가열단계, 환원공정 등이 요구되지 않아 은 나노입자만을 제조하는 공정보다 훨씬 단순하여, 제조 공정 면에서도 편리하며 비용을 현저히 절감할 수 있다.

본 발명에 따른 코어-쉘 나노복합체를 구성함으로써 은 나노입자가 표면활성도가 높아 쉽게 산화되어 은 산화체(Ag₂O)로 변하는 단점을 극복할 수 있는 방법을 제공한다.

이러한 코어-쉘 나노복합체는 출발물질이 저렴하고, 제조공정이 단순하며, 제조공정에 별다른 에너지가 요구되지 않으므로, 제조비용이 낮아 단가가 기존 합성법보다 현저히 더 낮다. 이에 대량생산이 가능할 뿐만 아니라, 다양한 제품 및 분야에 응용될 시 상업성이 매우 높아 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 코어-쉘 나노복합체의 제조과정을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 2는 pH 조건별 타닌산(tannic acid)의 자기 중합(self-polymerization) 정도를 용액 상에서의 색상 변화를 통해 확인한 결과이다.
도 3은 실시예 1로부터 제조된 코어-쉘 나노복합체의 SEM 이미지이고, 내삽된 이미지는 실시예 1로부터 제조된 코어-쉘 나노복합체가 포함된 용액의 광학 사진이다.
도 4는 비교예 1로부터 제조된 은 나노입자의 SEM이미지이다.
도 5는 실시예 1로부터 제조된 코어-쉘 나노복합체의 TEM 이미지이고, 내삽된 이미지는 비교예 1로부터 제조된 bare AgNPs의 TEM 이미지이다.
도 6은 실시예 1로부터 제조된 코어-쉘 나노복합체와 비교예 1로부터 제조된 은 나노입자의 UV-vis 분광 분석하여 흡광 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 7은 대장균 배양에 있어서, 실시예 1로부터 제조된 코어-쉘 나노복합체 또는 비교예 1로부터 제조된 은 나노입자가 첨가되었을 때 미치는 영향을 확인하기 위하여, 배양 시간에 따른 각각의 배양액에서의 흡광도를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 8은 대장균 배양에 있어서, PTA 용액이 미치는 영향을 확인하기 위하여, 배양 시간에 따른 각각의 배양액에서의 흡광도를 측정하여 나타낸 그래프이다.

이하에서, 본 발명의 여러 측면 및 다양한 구현 예에 대해 더욱 구체적으로 살펴보도록 한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 '항균(antibacterical)'은 미생물을 사멸시키는 것 이외에 미생물의 증식이나 성장을 억제하는 것까지 포함한다.

본 발명의 일 측면은 은 나노입자로 이루어진 코어; 및 상기 코어의 외표면을 감싸도록 형성된 쉘;을 포함하는 구형의 코어-쉘 나노복합체에 관한 것이다.

구체적으로 상기 코어는 은 나노입자로 이루어진 것으로, 상기 은 나노입자의 개수는 특별히 이에 한정되지 않는다.

상기 쉘은 폴리타닌산(poly(tannic acid))으로 이루어진 것인데, 폴리타닌산은 생체적합성(biocompatible)을 갖는 동시에 다수의 히드록시기를 포함하고 있는 폴리하이드릭(polyhydric) 고분자로, 용액 상에서 안정성이 뛰어나기 때문에, 물과 같은 용매 상에서 중합을 통해 쉽게 은 나노입자로 이루어진 코어의 표면을 감싸도록 형성될 수 있다.

즉, 상기 폴리타닌산으로 이루어진 상기 쉘은 상기 코어를 전체적으로 균일하게 감싸면서도, 상기 코어를 구성하는 은 나노입자의 안정성을 향상시키고, 은 나노입자의 독성을 완화 또는 제거하는 역할을 수행한다.

이러한, 상기 폴리타닌산은 하기 실시 예에서 후술하는 바와 같이 항균활성이 전혀 없음에도 불구하고(도 8 참조), 이를 이용한 본 발명의 코어-쉘 나노복합체는 은 나노입자를 단독으로 사용한 경우보다 더욱 우수한 항균성을 달성하고 있다.

게다가 본 발명에 따른 코어-쉘 나노복합체는 은 나노입자가 항균활성이 없는 폴리타닌산에 의해 감싸지게 된다는 점을 고려하면, 은 나노입자의 독성이 줄어듦과 동시에 은 나노입자로 인해 발휘되던 항균활성이 오히려 증대되고 있다.

이를 통해 본 발명에 따른 코어-쉘 나노복합체는 상기 폴리타닌산으로 이루어진 쉘과 상기 은 나노입자로 이루어진 코어 간의 상호결합 및 상호작용에 의해, 기대 이상의 항균활성의 증대 효과를 달성하고 있음을 확인하였다.

본 발명에서 '복합체(composite)'라는 용어는 두 종류 이상의 물질이 다양한 화학적, 물리적 결합에 의해 회합되어 있는 것을 말하는 것으로, 본 발명의 도 5에 따른 코어-쉘 나노복합체와 같이 은 나노입자로 이루어진 코어를 형성하고, 상기 폴리타닌산이 상기 코어를 감싸도록 쉘을 형성한 것이다.

본 발명에서 '나노 복합체'라는 용어는 복합체를 이루는 두 종류 이상의 물질 중 하나 이상이 나노 크기를 갖는 복합체로, 상기 코어를 구성하는 어느 하나의 은 나노입자의 크기가 1 내지 100 ㎚, 바람직하게는 1 내지 50 ㎚, 더욱 바람직하게는 가장 항균성이 우수한 1 내지 25 ㎚일 수 있다.

상기 코어의 평균 직경은 1 내지 100 ㎚이고, 바람직하게는 1 내지 50 ㎚이며, 더욱 바람직하게는 5 내지 20 ㎚일 수 있다.

상기 쉘의 두께는 1 내지 100 ㎚이고, 바람직하게는 1 내지 50 ㎚이며, 더욱 바람직하게는 1 내지 20 ㎚일 수 있는데, 만약 1 ㎚ 미만이면 상기 코어에 존재하는 은 나노입자의 독성을 충분히 차단할 수 없고, 20 ㎚를 초과하게 되면 항균활성이 저하되는 문제가 발생한다.

상기 코어-쉘 나노복합체는 음의 표면 전하를 갖기 때문에, 음전하성 단백질 등에 의하여 쉽게 파괴 및 분해되지 않으므로, 생체 내 약물전달체 혹은 다양한 제품으로 활용될 때 우수한 안정성을 장기간 유지할 수 있다.

구체적으로 상기 코어-쉘 나노복합체의 제타 전위는 - 20 내지 - 10 mV이며, 더욱 구체적으로 - 18 내지 - 16 mV로, 본 발명에 따른 코어-쉘 나노복합체는 생체 내에서 단일 은 나노입자(bare AgNPs, 비교예 1)보다 안정성이 우수하므로 다양한 의약 분야에서 활용될 수 있다.

또한, 상기 코어-쉘 나노복합체는 UV-vis 분광기로 UV-vis 흡광 스펙트럼 측정시, 420 내지 430 ㎚에서 최대 흡광 피크를 갖는 것일 수 있다.

다시 말해 본 발명에 따른 코어-쉘 나노복합체에서 폴리타닌산으로 이루어진 쉘은 은 나노입자로 이루어진 코어의 안정성을 향상시킴과 동시에 은 나노입자의 독성을 억제하는 역할을 수행한다. 또한, 상기 코어-쉘 나노복합체는 항균활성을 갖는 은 나노입자가 항균활성이 없는 폴리타닌산에 의해 감싸졌는데도 불구하고 미생물에 대한 항균활성이 현저히 증가한 것을 확인할 수 있는데, 이는 상기 폴리타닌산과 은 나노입자 간의 상호결합, 상호작용 및 코어-쉘 구조 등의 다양한 유기적 결합관계로 인해 나타나는 향상된 효과임을 알 수 있다.

이 중에서 상기 코어-쉘 구조는 단일 나노입자 형태보다 생체 세포에 대해 더 안정적이기 때문에, 본 발명에 따른 코어-쉘 나노복합체가 생체 세포에는 안정적이면서 미생물에 대해 우수한 항균 활성 효과를 발휘하는 데 있어 하나의 긍정적 요인으로 작용하게 된다.

또한 본 발명에 따른 코어-쉘 나노복합체는 미생물 중에서도 대장균에 대해 우수한 항균활성을 가지는 것을 특징으로 하며, 이를 통해 본 발명에 따른 코어-쉘 나노복합체는 선택적인 항균처리를 위한 항균제로 활용될 수 있다.

은 나노입자는 앞서 배경기술에서 기술한 바와 같이, 일반적인 무기 항균제로, E. coli , S. aureus , P. aeruginosa , B. subtilis and V. cholerae 등의 다양한 미생물에 대한 항균성이 보고되어 있고, 이러한 은 나노입자의 항균활성은 나노입자의 크기, 모양 및 안정성에 영향을 받는다.

은 나노입자의 안정성은, 은 나노입자를 제조하는 과정에 사용되는 다양한 안정화제(stabilizing agent)에 큰 영향을 받는다. 이들 중에서 대표적으로 시트레이트(citrate), 폴리-(N-비닐-2-피롤리돈)(PVP) 및 Daxad 19등이 존재한다.

이러한 은 나노입자를 제조하는 과정에 사용되는 안정화제가 시트레이트, PVP 및 Daxad 19일 경우, 생성된 은 나노입자는 항균성이 있지만, 제조방법이 90 ℃까지 가열되어야 하거나, 초음파 방사를 해줘야 하거나, 적어도 2 단계이상의 공정이 요구되는 등의 복잡한 제조공정이 요구되는 문제가 있다.

한편, SDS를 안정화제로 사용하는 경우에는 상기 문제점 외에 추가적으로, 생성된 은 나노입자가 무시할 수 있을 정도의 미미한 항균성을 갖게 된다는 문제가 있다.

본 발명에서는 상술한 제조공정상의 민감성과 복잡성에 의한 대량생산의 한계, 수율의 한계, 추가 비용 발생 및 시간 낭비와 같은 다양한 문제점을 해결하고자 노력한바, 완성할 수 있었다.

본 발명에 따른 폴리(타닌산)(poly(tannic acid))(이하, PTA라고도 한다.)을 기반으로 하는 코어-쉘 나노복합체를 제조함에 있어서, 상온하에서 한 단계(one-pot) 공정을 통해 합성할 수 있도록 하기 위해, 폴리타닌산의 단량체인 타닌산의 pH에 따른 산화 및 자기 중합 특성과 이로 인한 응집 현상을 이용하였다.

결국, 본 발명은 종래의 제조방법과 달리 가열, 초음파, 균일한 혼합, 정제 등의 모든 요구사항 없이, 단순히 염기성 조건 하에서 은 전구체와 타닌산을 혼합하는 하나의 단계만으로 균일한 코어-쉘 나노복합체를 높은 수율로 얻을 수 있는 본 발명의 코어-쉘 나노복합체의 제조방법을 완성하기에 이르렀다.

본 발명의 다른 측면은 염기성 조건 하에서, 은 전구체와 타닌산을 혼합하는 단계를 통해 상기 코어-쉘 나노복합체를 제조하는 것을 특징으로 하는 코어-쉘 나노복합체의 제조방법에 관한 것이다. 이러한 제조과정을 구체적으로 나타낸 도 1을 참고하여 아래에서 상세히 설명하기로 한다.

본 발명에 따른 코어-쉘 나노복합체의 제조방법은 단일 단계를 이용하는 간단하면서도 친환경적인 방법이라는 장점을 갖는다.

본 발명에 따른 코어-쉘 나노복합체의 제조방법은 타닌산의 특정 pH 조건에서만 대기중의 산소와 반응하여 산화됨으로써, 자기 중합(self-polymerization)되는 특성을 이용한 것으로, 공장단위로 스케일 업(scale up)하여 대량 생산이 가능하며, 대량 생산시에도 균일한 코어-쉘 나노복합체를 얻을 수 있다는 장점을 갖는다.

도 1에 나타난 바와 같이, 염기성 조건 하에서, 은 전구체와 타닌산을 혼합하는 단계를 통해 본 발명에 따른 코어-쉘 나노복합체를 제조하는데, 염기성 조건에서 타닌산이 대기중의 산소와 반응하여 산화되면서, 자기 중합화(self-polymerization) 하게 되고, 상기 산화과정으로 인해 상기 은 전구체는 은 나노입자로 환원하게 된다. 이로 인해 상기 폴리타닌산이 구형의 입자형태로 응집(aggregation)하게 될 때, 상기 산화과정에서 형성된 은 나노입자와 함께 응집하게 되면서 코어-쉘 나노복합체 구조로 제조되는 것이다.

상기 타닌산은 하기 화학식 1로 표시되는 것으로, 추후 산화와 자기 중합과정을 통해 폴리타닌산으로 제조되어지는 폴리타닌산의 단량체이다.

이때 사용가능한 상기 은 전구체는 당 업계에서 통상적으로 사용되는 은 전구체라면 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 AgNO₃, AgBF₄, AgPF₆, Ag₂O, CH₃COOAg, AgCF₃SO₃, AgClO₄, AgCl, Ag₂SO₄, 및 CH₃COCH-COCH₃Ag으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 수율과 경제성 측면을 따져보았을 때 가장 바람직한 것은 AgNO₃일 수 있다.

상기 염기성 조건은 타닌산이 산화 및 자기 중합되는 pH 범위인 pH 7.1 내지 8.5이면 바람직한데, 왜냐하면 pH 7.0 미만에서는 타닌산 단량체의 산화 반응이 억제되어 자기 중합이 이루어지지 않는다는 문제가 존재하고, pH 8.5를 초과하게 되면 타닌산 단량체의 산화 반응 및 자기 중합속도가 과도하게 빠르게 진행되어, 과도한 산화 반응에 의해 쉘의 형성과 동시에 분해되어 버리는 문제가 발생하게 된다.

상기 염기성 조건은 가장 바람직하게 pH 7.5 내지 8.0일 수 있는데, 만약 pH 7.5 미만일 경우 타닌산의 산화 및 자기 중합에 의한 응집현상으로 은 나노입자로 이루어진 코어는 제조되지만 충분한 두께의 쉘이 제조되지 못해, 코어-쉘 나노복합체 구조로 형성되지 못하므로, 은 나노입자의 독성 문제가 여전히 존재하게 되고, 항균활성도 낮아지는 문제가 있다.

상기 염기성 조건이 pH 8.0을 초과하게 되면 타닌산의 과도한 중합으로 인해 코어-쉘 나노복합체에서의 쉘의 두께만 증가하게 되어, 나노복합체의 평균 직경이 균일하게 형성되지 못하는 문제가 발생할 수 있다.

본 발명에 따른 코어-쉘 제조방법에서 상기 은 전구체와 타닌산의 혼합 중량비는 1 : 0.5-5일 수 있고, 바람직하게는 1 : 1-2일 수 있다.

상기 은 전구체와 타닌산의 혼합 중량비가 1 : 1 미만과 같이 은 전구체보다 타닌산의 함량이 더 작은 경우에는 코어-쉘 구조를 형성하지 못하며, 1 : 2를 초과할 경우에는 타닌산에 의해 형성되는 쉘의 두께가 과도하게 두꺼워져 활성이 저하되는 문제가 발생하게 된다.

본 발명에 따른 코어-쉘 제조방법은 상기 타닌산이 자기 중합될 수 있는 온도면 이에 특별히 제한되지 않는데, 바람직하게는 1 내지 50 ℃, 보다 바람직하게는 10 내지 30 ℃에서 수행될 수 있다. 여기에서 나타나있듯이 본 제조공정은 추가적인 가열과정이 요구되지 않으며, 온도에도 영향을 받지 않으므로, 일정 온도로도 유지할 필요가 없다는 제조공정상의 큰 장점을 갖는다.

본 발명에 따른 코어-쉘 제조방법은 5 내지 60 분 동안 수행되는 것이 바람직한데, 보다 바람직하게는 10 내지 20 분 동안 수행되는 것일 수 있다. 만약 상기 단계가 10 분 미만으로 수행될 경우 타닌산이 충분히 자기 중합하지 못하여 본 발명에 따른 코어-쉘 나노복합체를 형성하지 못하는 문제가 존재하고, 20 분을 초과하여 수행될 경우에는 타닌산의 자기 중합이 과도하게 이루어져, 상기 코어-쉘 나노복합체의 쉘 두께만 증가하게 되는 문제가 발생한다.

이때, 상기 코어-쉘 나노복합체에 쉘의 두께만 증가하게 될 경우(20 ㎚ 초과된 쉘 두께를 가질 경우), 은 나노입자의 독성은 확실하게 차단하겠지만, 항균활성이 은 나노입자를 단독으로 사용했을 때보다도 오히려 저하되는 문제가 발생한다.

다시 말해 본 발명에 따른 코어-쉘 나노복합체의 제조방법에서는 pH 조건과 반응시간 조건을 제외한 다른 온도, 가열, 환원제, 정제 등과 같은 단계를 일체 요구하지 않고, 단일 단계만으로 균일한 평균 직경의 코어-쉘 나노복합체를 제조할 수 있다는 장점을 갖는다. 따라서 대량생산을 하는 경우에 제조 단가를 줄이는데 결정적인 역할을 할 수 있을 것으로 기대된다.

본 발명의 또 다른 측면은 상기 코어-쉘 나노복합체의 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따른 코어-쉘 나노복합체가 다양한 미생물 특히 대장균에 대한 우수한 항균 활성을 나타내고 있음을 밝힘으로써, 이를 유효성분으로 포함하는 환경친화적인 항균 조성물을 제공한다.

상기 항균 조성물은 항미생물제를 총칭하는 의미인 항생제와 같은 의미일 수 있고, 항균제, 살균제, 방부제, 보존제 또는 제균제와 같은 의미일 수 있으며, 바람직하게는 그람 양성균 및 그람 음성균의 발육과 생활 기능을 저지 또는 억제할 수 있는 물질을 의미한다.

상기 코어-쉘 나노복합체는 상기 항균 조성물에 대해 20 내지 100 ㎍/㎖의 농도로 포함되는 것일 수 있는데, 만약 상기 코어-쉘 나노복합체의 농도가 20 ㎍/㎖ 미만으로 포함될 경우 후술하는 실험 예에서와 같이 미생물의 생장에 대해 6 시간까지는 항균활성을 나타내나, 그 이후에는 종래 은 나노입자와 동일한 항균활성을 나타내고 있는 것으로, 장기간 항균활성을 유지할 수 없음을 확인할 수 있다. 상기 코어-쉘 나노복합체는 생체적합한 물질이며, 독성을 갖는 은 나노입자가 복합체의 중심인 코어에 위치하고 있으므로, 과량 투여하여도 인체에 부작용이 적으므로, 본 발명의 조성물 내에 포함되는 상기 코어-쉘 나노복합체의 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택할 수 있다.

본 발명의 항균조성물은 상기 유효성분 이외에 사용되는 용도에 따라 특정 균에 대해 항균활성을 갖는 물질을 더 포함할 수 있다.

특히 본 발명에 따른 코어-쉘 나노복합체를 포함하는 항균 조성물은 대장균(E. coli)에 대하여 강한 항균활성을 나타낸다.

또한 본 발명에 따른 코어-쉘 나노복합체를 포함하는 항균 조성물은 항균활성이 은 나노입자를 단독으로 사용할 경우보다 더욱 강화되면서도 인체에 부작용을 나타내지 않는 생체적합성 물질이기 때문에, 식품 조성물, 화장료 조성물, 사료 조성물, 도료 조성물, 코팅 조성물 등에 함유되어 유용하게 이용될 수 있다.

특히, 본 발명에 따른 코어-쉘 나노복합체를 함유하여 식품 장기 보존을 위한 첨가제로 이용할 경우, 식품을 장기간 보존할 수 있다.

이하에서 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하며, 다만 이하에 실시예 등에 의해 본 발명의 범위와 내용이 축소되거나 제한되어 해석될 수 없다. 또한, 이하의 실시예를 포함한 본 발명의 개시 내용에 기초한다면, 구체적으로 실험 결과가 제시되지 않은 본 발명을 통상의 기술자가 용이하게 실시할 수 있음은 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연하다.

또한 이하에서 제시되는 실험 결과는 상기 실시예 및 비교예의 대표적인 실험 결과만을 기재한 것이며, 아래에서 명시적으로 제시하지 않은 본 발명의 여러 구현예의 각각의 효과는 해당 부분에서 구체적으로 기재하도록 한다.

시약

은 나이트레이트(Ag nitrate, AgNO₃), 트리소듐 시트레이트(trisodium citrate), 타닌산(tannic acid, TA), 소듐 보로하이드라이드(sodium borohydride, NaBH4), NaOH는 시그마-알드리치(america)로부터 구매한 것을 사용하였다.

본 발명의 코어-쉘 나노복합체의 합성에 있어서, 완충액으로 포스페이트 완충액(phosphate buffer, PB)(pH=7.8, 10mM)을 사용하였다.

증류수는 Milipore Milli-Q gradient system으로 이온화하고 18 ㏁·㎝으로 울트라 여과한 것을 사용하였다.

실시예 1. Ag@PTA 나노복합체 합성.

10 ㎖ AgNO₃(1 mM)(in 10 mM PB, pH=7.8)에 50 ㎕ TA(40 ㎎/㎖)를 상온에서 혼합하여 Ag-PTA(이하, Ag@PTA라고도 한다) 나노복합체를 제조하였다. 상기 혼탁액을 교반기(vortex mixer)로 20 분 동안 강하게 교반하여 준다. 상기 용액의 색상이 적갈색으로 바뀌고, 점차 균일하게 될 때까지 짙게 변하게 되면, 원심분리기(centrifugation)로 9000 rpm에서 15 분 동안 수행하여 Ag@PTA를 분리하고, 증류수로 두 차례 세척한다.

비교예 1. Bare AgNPs

bare 은 나노입자(이하, 'AgNPs 또는 AgNP'라고도 한다.)를 제조하기 위하여, 간략하게 설명하자면, 우선 NaBH₄를 제1 환원제로 첨가하고, 트리소듐 시트레이트(trisodium citrate)를 제2 환원제로 첨가하여 제조한다. 이때 제2 환원제는 안정제로서의 역할도 수행한다.

구체적인 과정은 다음과 같다. NaBH₄(1 mM)과 트리소듐 시트레이트(trisodium citrate)(3.6 mM)를 혼합하고, 어두운 환경(dark)에서 60 ℃로 가열하여 30분간 섞어 제1 혼합액을 제조하였다. 이후 AgNO₃(1 mM) 용액을 제1 혼합액에 서서히 첨가한 다음, 90 ℃로 가열하는데, 상기 온도가 90 ℃에 도달하면, 0.1 M NaOH 용액을 이용하여 상기 제1 혼합액의 pH를 10.5로 조절한 후, 상기 제1 혼합액의 색이 명확하게 바뀔 때까지 약 20 분 동안 방치하여 나노입자 현탁되어 있는 제2 혼합액을 제조한다.

상기 제2 혼합액을 상온으로 식힌 후, 미반응된 제1, 2 환원제를 완전히 제거하기 위하여 상기 제2 혼합액을 원심분리기(centrifuge)로 9000 rpm, 20 분 동안 원심분리하고, 상등액을 버리고, 증류수로 재현탁하고 다시 원심분리하는 단계를 3회 반복하여, 은 나노입자를 제조하였다.

상기 은 나노입자는 필요한 실험에 따라 적절한 용액에 재현탁시켜 사용할 수 있다.

실험예 1. PH에 따른 TA 의 색상 변화.

도 2는 pH 조건별 타닌산(tannic acid)의 자기 중합(self-polymerization) 정도를 용액상에서의 색상 변화를 통해 확인한 결과이다.

상기 TA 용액(40 ㎎/㎖)은 타닌산(tannic acid)을 각기 다른 phosphate buffer(pH 3.3, 6.0, 7.0, 7.8, 8.5)에 혼합한 것이고, 실험은 TA 용액을 제조한 후 4 시간 반응시킨 다음 관찰하였다.

도 2에 나타난 바와 같이, pH가 3.3에서 8.5로 증가함에 따라 TA 용액 색상이 노란색으로 변화되어 가는 것을 확인할 수 있는데, 이러한 TA 용액의 색상변화를 통해 TA가 알칼리 조건(pH 7.0-8.5)에서 대기 속 산소와 반응하여 산화(oxidation)됨으로써 자발적으로 중합되어 폴리타닌산(poly(tannic acid); PTA)을 형성한다는 것을 확인하였다.

실험예 2. 코어-쉘 나노복합체( 실시예 1), 은 나노입자( 비교예 1)의 물리화학적 특성 분석.

실시예 1로부터 제조된 코어-쉘 나노복합체 또는 비교예 1로부터 제조된 은 나노입자의 형태학적 특징 및 크기를 확인하였다.

2-1) 실시예 1의 코어-쉘 나노복합체, 비교예 1의 은 나노입자의 SEM 이미지

도 3은 실시예 1로부터 제조된 코어-쉘 나노복합체의 SEM 이미지이고, 내삽된 이미지는 실시예 1로부터 제조된 코어-쉘 나노복합체가 포함된 용액의 광학 사진이다.

도 3에 나타난 바와 같이, 실시예 1로부터 제조된 코어-쉘 나노복합체의 평균 직경은 약 20-30 ㎚(코어 평균 직경 20ㅁ3 ㎚, 쉘 두께 5ㅁ0.5 ㎚)의 구형 입자임을 확인하였고, 코어-쉘 나노복합체의 크기와 형태는 모두 균일한 것을 알 수 있다.

도 4는 비교예 1로부터 제조된 은 나노입자의 SEM이미지이다.

도 4에 나타난 바와 같이, 비교예 1로부터 제조된 은 나노입자는 실시예 1로부터 제조된 코어-쉘 나노복합체와 같이 균일한 크기 및 형태로 분산되어 있는 것을 확인하였다.

2-2) 실시예 1의 코어-쉘 나노복합체의 제타 포텐셜

이때, 실시예 1로부터 제조된 코어-쉘 나노복합체의 제타 포텐셜은 제타 포텐셜 분석기(Malvern Instruments Zetasizer)를 이용하여 측정하였고, 이때 용액은 증류수를 사용하였고, 그 결과 제타 포텐셜이 ??16.9 ㅁ 0.5 mV로 측정되었다(미도시).

이를 통해 본 발명에 따른 코어-쉘 나노복합체는 음 표면 전하를 갖는다는 것을 확인하였다.

2-3) 실시예 1의 코어-쉘 나노복합체의 DLS 측정.

실시예 1로부터 제조된 코어-쉘 나노복합체의 입도분포를 동적광산란법(DLS)로 측정하였고, 이로부터 얻은 수치를 나타내었다.

실시예 1로부터 제조된 코어-쉘 나노복합체의 물리적 평균 직경은 23.4 ± 0.6 ㎚이고, 쉘의 두께는 1.82 ± 0.5 ㎚, 유체역학적 직경은 54.4 ± 0.3 ㎚이였다.

나아가 실시예 1의 코어-쉘 나노복합체는 계산을 통해 얻은 유체역학적 직경이 실제 측정된 물리적 직경보다 훨씬 더 크다는 결과를 통해, 본 발명에 따른 코어-쉘 나노복합체가 형성될 때, 산화와 자기 중합과정을 통해 합성된 폴리타닌산이 은 나노입자와 함께 응집되어 코어-쉘 형태로 형성되었음을 알 수 있다.

2-4) 실시예 1의 코어-쉘 나노복합체와 비교예 1의 은 나노입자의 TEM 이미지

도 5는 실시예 1로부터 제조된 코어-쉘 나노복합체의 TEM 이미지이고, 내삽된 이미지는 비교예 1로부터 제조된 bare AgNPs의 TEM 이미지이다.

도 5에 나타난 바와 같이, 실시예 1로부터 제조된 코어-쉘 나노복합체와 비교예 1로부터 제조된 bare AgNPs는 평균 직경이 20 내지 30 ㎚의 구형입자인 것을 확인하였다.

실험예 2. 코어-쉘 나노복합체( 실시예 1), 은 나노입자( 비교예 1)의 광학 특성 분석.

도 6은 실시예 1로부터 제조된 코어-쉘 나노복합체과 비교예 1로부터 제조된 은 나노입자의 UV-vis 분광기로 분석하여 흡광 스펙트럼을 나타낸 것이다.

그래프 상에서 'Ag'는 비교예 1로부터 제조된 은 나노입자를 의미하고, 'Ag@PTA'는 실시예 1로부터 제조된 코어-쉘 나노복합체를 의미한다.

도 6에 나타난 바와 같이 실시예 1로부터 제조된 코어-쉘 나노복합체는 420 내지 430 ㎚에서 최대 흡광 피크가 관찰되었고, 구체적으로 428 ㎚에서 최대 흡광 피크가 관찰되었다.

이에 반해 비교예 1로부터 제조된 은 나노입자는 최대 흡광 피크가 410 내지 420 ㎚, 자세히는 418 ㎚로 관찰되었으며, 상기 실시예 1로부터 제조된 코어-쉘 나노복합체의 최대 흡광 피크가 비교예 1로부터 제조된 은 나노입자의 최대 흡광 피크보다 적색편이(red-shift)되어 있는 것을 확인하였다.

실시예 1의 코어-쉘 나노복합체와 비교예 1의 은 나노입자는 크기와 형태는 비슷하지만, 굴절률이 서로 상이하다는 것을 확인하였다.

이는 실시예 1의 코어-쉘 나노복합체가 표면에 균일한 PTA 쉘이 형성되어 있기 때문에, 상기 PTA 쉘로 인하여 비교예 1의 은 나노입자보다 실시예 1의 코어-쉘 나노복합체의 굴절률이 증가되었다고 할 수 있다.

즉, 상술한 최대 흡광 피크 범위의 차이로부터 실시예 1의 코어-쉘 나노복합체는 비교예 1로부터 제조된 은 나노입자와 달리 코어-쉘 구조를 가지고 있음을 다시 한번 확인하였다.

실험예 3. 항균 효과 측정

3-1) 대장균( E. coil ) 배양액 제조

엠피실린(ampicillin 저항 유전자)을 발현하는 플라스미드로 유전자 변형된 E. coli strain DH5α(zymo Research)는 100 ㎍/㎖의 ampicillin이 포함된 lysogeny broth(LB) 배지(15 ㎖)에서 12시간동안 전배양하고, 여기서 200 ㎕를 채취하여, 100 ㎍/㎖ ampicillin이 추가된 신선한 LB 배지(20 ㎖)에 넣어 밤새(약 12시간) 재배양한 것을 사용하였다.

3-2) 대장균 성장

상기 대장균 배양액 각각에 실시예 1의 코어-쉘 나노복합체와 비교예 1의 은 나노입자를 첨가하고, 2 시간 간격마다 시료(1 ㎖)를 채취하여 600 ㎚에서 흡광도(OD₆₀₀)를 측정하여 도 7에 나타내었다. 상기 대장균 배양액 총 중량을 기준으로 상기 실시예 1의 코어-쉘 나노복합체과 비교예 1의 은 나노입자 최종농도가 10 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖가 되도록 혼합하였다. 본 실험에서 배양은 200 RPM으로 37 ℃에서 수행하였다.

상기 채취된 시료의 흡광도가 1 이상으로 측정될 경우에는 LB 배지로 적정량의 배수로 희석하는데, 본 실험에서는 2배 희석하였다.

흡광도를 측정함에 있어서, LB배지에 존재하는 나노입자의 영향을 배제하기 위하여, Blank로 각기 다른 농도의 나노입자를 포함하는 LB 배지를 사용하였다.

이때, 0.1 OD₆₀₀는 1×10⁸ 세포수/㎖를 나타내는데, 이는 1×10⁸ CFU(colony forming unit)/㎖과 동일하다.

도 7은 대장균 배양에 있어서, 실시예 1로부터 제조된 코어-쉘 나노복합체 또는 비교예 1로부터 제조된 은 나노입자가 첨가되었을 때 미치는 영향을 확인하기 위하여, 배양 시간에 따른 각각의 배양액에서의 흡광도를 측정하여 나타낸 그래프이다.

대조군(control)으로는 아무것도 처리하지 않은 대장균 배양액의 흡광도를 측정하여 나타내었다.

그래프에서 'Ag10'은 대장균 배양액에 비교예 1의 은 나노입자 10 ㎍/㎖를 혼합한 것이고, 'Ag25'는 대장균 배양액에 비교예 1의 은 나노입자 25 ㎍/㎖를 혼합한 것이며, 'Ag50'는 대장균 배양액에 비교예 1의 은 나노입자 50 ㎍/㎖를 혼합한 것이며, 'Ag@PTA10'은 대장균 배양액에 실시예 1의 코어-쉘 나노복합체 10 ㎍/㎖를 혼합한 것이며, 'Ag@PTA25'는 대장균 배양액에 실시예 1의 코어-쉘 나노복합체 25 ㎍/㎖를 혼합한 것이며, 'Ag@PTA50'은 대장균 배양액에 실시예 1의 코어-쉘 나노복합체 50 ㎍/㎖를 혼합한 것이다.

도 7에 나타난 바와 같이, 다양한 농도의 비교예 1의 은 나노입자가 포함된 대장균 배양액의 경우. 대조군과 매우 유사한 성장 양상을 나타내고 있음을 확인하였다.

대조적으로 실시예 1로부터 제조된 코어-쉘 나노복합체가 10 ㎍/㎖ 포함된 배양액에서는 6 시간까지 대장균 성장을 현저히 억제시키고 있음을 알 수 있다.

또한 실시예 1로부터 제조된 코어-쉘 나노복합체가 25 ㎍/㎖ 또는 50 ㎍/㎖ 포함된 배양액에서는 대장균 12시간까지 전혀 관찰되지 않았으며, 이를 통해 본 발명에 따른 코어-쉘 나노복합체를 20 ㎍/㎖ 이상의 농도로 첨가할 경우 미생물 특히 대장균의 성장을 완벽에 가깝게 저해할 수 있음을 확인하였다.

구체적으로 본 발명에 따른 코어-쉘 나노복합체의 농도가 20 ㎍/㎖ 포함될 경우, 12 시간 이상 대장균 배양액을 600 ㎚ 흡광도로 측정하면 0.0 내지 0.1로 측정이 되는 항균 활성을 가질 수 있고, 이는 본 발명에 따른 코어-쉘 나노복합체가 미생물 성장을 완벽에 가깝게 억제하고 있음을 나타내는 것이다.

즉, 비교예 1과 같은 은 나노입자만을 사용한 배양액을 600 ㎚ 흡광도로 측정하면 최대 1.0까지 증가한 것에 비해, 본 발명에 따른 코어-쉘 나노복합체를 25 ㎍/㎖ 이상 처리한 배양액은 600 ㎚ 흡광도에서 0.0-0.1로 측정되고 있는 것으로, 미생물 성장을 현저히 억제하고 있는 것을 알 수 있다.

나아가 비교예 1의 은 나노입자의 평균 직경과 실시예 1의 코어-쉘 나노복합체 코어의 평균 직경이 동일함에도 불구하고, 실시예 1의 코어-쉘 나노복합체의 미생물 성장 억제 특성이 향상되었다는 것을 알 수 있다. 즉 동일양 동일크기일 때, 은 나노입자보다 본 발명에 따른 코어-쉘 나노복합체를 사용하는 것이 훨씬 항균성 면에서 유리하다는 것을 알 수 있다.

또한, 실시예 1의 코어-쉘 나노복합체의 항균활성은 농도 의존적이라는 것을 알 수 있다.

실험예 4. PTA의 항균활성

4-1) 대장균( E. coil ) 배양액 제조

4-2) PTA 용액

타닌산(tannic acid)을 pH 7.8의 phosphate buffer에 혼합하여 제조하고 4 시간 반응시킨 후 제조된 PTA 용액을 제조하였다. 이때 혼합되는 TA 농도는 40 ㎎/㎖이였다.

4-3) 대장균에 대한 활성 측정

상기 대장균 배양액에 PTA 용액을 20 ㎍/㎖ 첨가하고, 2 시간 간격마다 시료(1 ㎖)를 채취하여 600 ㎚에서 흡광도(OD₆₀₀)를 측정하여 도 8에 'PTA'로 표기하여 나타내었다. 본 실험에서 배양은 200 RPM으로 37 ℃에서 수행하였다.

흡광도를 측정함에 있어서, Blank로 각기 다른 농도의 나노입자를 포함하는 LB 배지를 사용하였다.

도 8은 대장균 배양에 있어서, PTA 용액이 미치는 영향을 확인하기 위하여, 배양 시간에 따른 각각의 배양액에서의 흡광도를 측정하여 나타낸 그래프이다.

도 8에 나타난 바와 같이 PTA로 처리한 대장균 배양액은 대조군과 별 차이가 없을 정도로 성장하고 있음을 확인하였다.

다시 말해 PTA는 전혀 항균활성을 가지고 있지 않음을 알 수 있다. 이를 통해 본 발명에 따른 코어-쉘 나노복합체는 코어와 쉘 각각의 역할에 의해 항균활성을 갖는 것이 아닌 PTA 쉘과 은 코어 간의 상호작용, 상호결합에 의해 은 나노입자 단독으로 사용했을 때보다 현저히 우수한 항균활성을 달성하고 있음을 알 수 있다.

Claims

은 나노입자로 이루어진 코어; 및
상기 코어의 외표면을 감싸도록 형성된 쉘;을 포함하는 구형의 코어-쉘 나노복합체로,
상기 쉘은 폴리타닌산(poly(tannic acid))으로 이루어진 것이고,
상기 코어의 평균 직경은 5 내지 30 ㎚, 상기 쉘의 두께는 1 내지 20 ㎚이며,
상기 코어-쉘 나노복합체의 제타 전위는 - 20 내지 - 10 mV이며,
상기 코어-쉘 나노복합체는 UV-vis 분광기로 UV-vis 흡광 스펙트럼 측정시, 428 ㎚에서 최대 흡광 피크를 갖는 것을 특징으로 하는 코어-쉘 나노복합체.
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pH 7.5 내지 8.0의 염기성 조건 하에서, 은 전구체와 타닌산을 혼합하는 단계를 통해 제1항에 따른 코어-쉘 나노복합체를 제조하되,
상기 단계에서 포스페이트 완충액을 사용하고,
상기 은 전구체와 타닌산의 혼합 중량비는 1 : 1-2이며,
상기 단계는 10 내지 20 분 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 코어-쉘 나노복합체의 제조방법.
제7항에 있어서,
상기 은 전구체는 AgNO₃, AgBF₄, AgPF₆, Ag₂O, CH₃COOAg, AgCF₃SO₃, AgClO₄, AgCl, Ag₂SO₄, 및 CH₃COCH-COCH₃Ag으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 코어-쉘 나노복합체의 제조방법.
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제7항에 있어서,
상기 단계는 10 내지 30 ℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 코어-쉘 나노복합체의 제조방법.
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제1항에 따른 코어-쉘 나노복합체를 포함하는 항균 조성물.
제1항에 따른 코어-쉘 나노복합체를 포함하는 도료.