KR101728890B1 - Hox28 유전자를 이용하여 벼의 생산성을 증가시키는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 벼의 생산성을 증가시키는 방법에 관한 것으로서, 구체적으로 벼의 종자에 HOX28 유전자를 도입하는 단계를 포함하는 벼의 생산성을 증가시키는 방법, 상기 유전자가 도입된 형질전환 벼, 상기 방법에 이용되는 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 키트에 관한 것이다.
본 발명에 따른 벼의 생산성을 증가시키는 방법은 벼의 분얼수, 신장길이, 이삭길이 및 이삭수를 증가시킴으로써 수확량을 증가시켜 원활한 농산물 공급을 가능하게 하며, 나아가 생산성이 증가된 새로운 작물을 개발하는데 이용될 수 있을 것이다.

Description

HOX28 유전자를 이용하여 벼의 생산성을 증가시키는 방법{A method for improving productivity of Oryza sativa L. using HOX28 gene}

본 발명은 벼의 생산성을 증가시키는 방법에 관한 것으로서, 구체적으로 벼의 종자에 HOX28 유전자를 도입하는 단계를 포함하는 벼의 생산성을 증가시키는 방법, 상기 유전자가 도입된 형질전환 벼, 상기 방법에 이용되는 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 키트에 관한 것이다.

세계 4대 식량작물 중 하나인 벼는 우리나라를 포함한 아시아 지역 사람들이 주식으로 이용하는 작물이다. 그러나, 최근 가구 구조와 식생활 형태 변화로 인하여 밥쌀 소비는 지속적으로 감소하고 있으며, 가공용 쌀 소비는 꾸준히 증가하고 있는 추세이다. 이러한 수요 변화에 맞춰 쌀 가공제품도 기존 떡, 면류에서 빵,과자, 프리믹스 등으로 다양해지고 있으며, 이에 따라 한국 농림축산식품부는 국산 쌀을 중심으로 고부가가치를 창출할 쌀 가공산업을 활성화하는 방안을 마련하고 있다. 구체적으로, 쌀 전문 재배단지 규모를 늘리고, 쌀 가공 제품 개발에 대한 투자 및 쌀 가공식품 수출물류비 지원 등의 쌀 가공산업 활성화 방안을 마련하고 있으며, 이를 통해 2017년 쌀 가공산업은 매출액 약 5조원, 수출액은 약 1억달러 수준까지 성장하고, 쌀 소비량은 약 70만톤으로 증가할 것으로 예상하고 있다.

한편, 국산 쌀의 수요변화는 가공식품을 위한 것뿐만 아니라, 해외 수출에 따른 수요도 증가하고 있는 추세이다. 군산시는 2007년 전국에서 처음으로 해외에 쌀을 수출하기 시작해 현재까지 호주, 러시아, 영국 등 17개국에 약 2643톤을 수출해 오고 있다. 또한, 강원도는 중국 종합물류회사인 중티에성더그룹과 '강원도 쌀 수출을 위한 업무협약'을 맺어 강원도 쌀 수출의 통로를 마련하였으며, 강원도 내 전체 연간 쌀 생산량(17만 6574톤)의 17%수준인 약 3만톤을 수출할 계획이라고 밝힌바 있다.

쌀의 수요가 증가함에 따라, 벼의 생산성을 향상시키기 위한 연구가 활발히 진행되어, HOX5 유전자(미국 공개특허 2010-0251423) 또는 LOC_Os02g05840 유전자(한국 등록특허 10-1423834) 등을 형질전환 함으로써 수량성이 증진된 벼를 제조하는 방법이 발표된 바 있다. 그러나, 상기 방법들은 감소된 영양분의 이용성을 증가시키거나, 줄기 발달에 영향을 주는 등의 방법으로 수량성을 향상시킬 뿐, 벼과식물의 수량 관련 요소 중 가장 중요한 이삭의 수를 결정하는 분얼수에 관한 상기 유전자의 영향은 밝혀내지 못하였다. 이와 관련하여, HOX10 유전자(한국 등록특허 10-1322319)를 이용하여 벼의 분얼수에 대한 영향을 분석한 연구 결과가 발표된 바 있지만, 상기 방법 또한 분얼수를 제외한 벼의 생산성과 관련한 다른 성장 파라미터에 대한 영향은 밝혀 내지 못한 실정이다.

이러한 배경하에, 본 발명자들은 분얼수 및 다른 성장 파라미터들이 증가된 벼를 제조하는 방법을 고안하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, HOX28 유전자를 형질전환시킨 벼는 분얼수가 증가하며, 신장길이, 이삭길이 및 이삭수 또한 야생형에 비해 월등히 증가함에 따라 벼의 생산성 및 수확량이 증가한다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 벼의 종자에 HOX28 유전자를 도입하는 단계를 포함하는 벼의 생산성을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 유전자가 도입되어 생산성이 증가된 형질전환 벼를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에 이용되고, HOX28 유전자를 포함하는 벼의 생산성 증가용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 벼의 생산성 증가용 키트를 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 벼의 종자에 HOX28 유전자를 도입하는 단계를 포함하는 벼의 생산성을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 용어, "HOX28"이란, Homeodomain을 가진 HOX 유전자의 패밀리 그룹에 속하는 유전자로서, 상기 HOX 유전자는 몸의 근위부 및 원위부, 또는 등부 및 복부를 지정하는 등의 기본적인 발달 패턴을 조절하는 유전자로 알려져 있다. 상기 HOX28 단백질을 코딩하는 유전자의 구체적인 염기서열 및 단백질 정보는 NCBI에 공지되어 있다(GenBank: Accession AAS83421.1 등).

본 발명에서, 상기 HOX28 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 것일 수 있고, 구체적으로 상기 HOX28 유전자는 p35S 프로모터에 작동 가능하게 연결된 것일 수 있다.

본 발명의 목적상, 벼의 생산성을 증가시키는 방법은 상기 HOX28 유전자의 도입에 의하여, 벼가 형질전환되고, 형질전환된 벼에서 HOX28 유전자가 과발현되는 것일 수 있다.

본 발명에서, 상기 HOX28 유전자는 상시적으로 발현을 유도하는(constitutive) 프로모터인 p35S 프로모터에 연결되어 있는 것이므로, 상기 유전자는 발현 유도 등의 추가의 과정을 거치지 않더라도 유전자의 도입에 의하여 과발현될 수 있다.

본 발명의 용어, "프로모터(promoter)"란, 일반적으로 전사를 개시하는 지점을 포함하는 암호화 부위의 상류 쪽에 위치하는 유전자 부위로, 흔히 유전자 발현을 조절하는 TATA 박스, CAAT 박스 부위, 외부 자극에 반응하여 유전자 발현에 영향을 주는 부위 및 위치와 방향에 상관없이 거의 모든 유전자의 발현을 촉진하는 인핸서(enhancer) 등으로 이루어져 있다. 또한, 이러한 프로모터 중에는 모든 조직에서 상시적으로 발현을 유도하는 프로모터(constitutive promoter) 및 시간 또는 위치 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터(inducible promoter)가 있으며, 구체적으로 본 발명에 따른 프로모터는 p35S 프로모터일 수 있다.

상기 p35S 프로모터는 Cauliflower mosaic virus(CaMV)에서 유래한 프로모터로서, 전체 CaMV 유전체의 전사를 책임지는 상시적으로 발현을 유도하는 프로모터이며, 식물 형질전환에 주로 사용된다.

본 발명의 용어, "재조합 발현벡터"란, 본 발명의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 유전자 서열이 삽입 또는 도입될 수 있는 당분야에 공지된 플라스미드(plasmid), 바이러스 또는 기타 매개체를 의미한다. 구체적으로, HOX28을 발현시킬 수 있는 p35S 프로모터 및 상기 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있는 HOX28을 암호화하는 유전자 서열은 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 상기 작동 가능하게 연결된 유전자 서열과 발현 조절 서열은 선발마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 재조합 발현벡터 내에 포함될 수 있다. 상기에서 용어, "작동 가능하게 연결(operably linked)"된다는 것은 적절한 분자가 발현 조절 서열에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결되는 것을 의미한다. 또한, 상기 용어, "발현 조절 서열(expression control sequence)"이란, 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 재조합 발현벡터는, 단백질 발현에 사용되는 기존의 벡터를 기본 골격으로 하여 본 발명의 p35S의 프로모터를 삽입하고 상기 프로모터의 하류(downstream)쪽으로 HOX28를 암호화하는 염기서열을 삽입함으로써 제조할 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 벡터로 식물 바이러스 벡터 등이 있으며, 구체적 예로서 pCHF3, pPZP, pGA, pBTEX 및 pCAMBIA 계열과 같은 바이너리벡터를 사용할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 당업자라면, 본 발명의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 숙주 세포내로 도입할 수 있는 벡터라면 어떠한 벡터라도 모두 사용할 수 있다. 구체적으로, pCAMBIA3300PT 벡터 또는 pCR8/GW/TOPO 벡터를 사용할 수 있으며, 상기 벡터는 MCS 부분을 제거하고 새롭게 35S promoter와 제한효소 위치 및 OCS teminater(Octopine synthase terminator)를 삽입하여 제작될 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, pCAMBIA3300PT 벡터 및 pCR8/GW/TOPO 벡터를 이용한 바이너리 벡터 시스템을 이용하여, p35S 프로모터에 작동 가능하게 연결된 서열번호 1의 HOX28 유전자가 삽입된 재조합 발현벡터를 제조하였다(도 3).

본 발명의 용어, 유전자의 "과발현(overexpression)"이란, 정상의 세포에서 발현하는 수준보다 더 높은 수준으로 유전자가 발현하는 것을 의미하며, 상기 유전자가 과발현됨에 따라 단백질이 과발현되는 것을 의미한다. 상기 과발현은 자연적인 세포의 조절 기전에 의하여 일어날 수 있으며, 형질전환 등의 인위적인 조절 기전에 의하여도 일어날 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따른 HOX28 유전자의 과발현은 재조합 발현벡터를 이용한 형질전환에 의하여 일어날 수 있다.

본 발명의 용어, "벼(Oryza sativa L.)"는 외떡잎식물 벼목 화본과의 한해살이풀 식용작물로서, 열매를 찧은 것을 쌀이라고 하며, 전세계 인구의 40% 정도가 쌀을 주식량으로 한다. 벼속에 속하는 식물로는 20여 종(種) 이상이 알려져 있으나, 실제로 재배되고 있는 것은 벼(O. sativa L)가 대부분이다. 본 발명의 형질전환 대상으로서, 구체적으로 풍옥, 수성, 팔굉, 팔달, 진흥, 재건, 팔금, 농백, 낙동, 관악, 진주, 설악, 동진 등이 있으나, 벼목에 속하는 식물체라면 이에 제한되지 않으며, 더욱 구체적으로 동진벼일 수 있다.

구체적으로, 본 발명에서 벼의 생산성 증가는 벼의 분얼수, 신장길이, 이삭길이 및 이삭수의 증가에 의하여 달성되는 것일 수 있다.

본 발명의 용어, "생산성"이란, 수확량을 의미하며, 상기 "분얼수", "신장길이", "이삭길이" 및 "이삭수"는 벼의 성장 정도를 나타내는 파라미터(parmeter)로서, 상기 성장 파라미터가 증가함에 따라 낟알의 수가 증가하므로, 벼의 수확량 및 생산성이 증가한다.

상기의 목적을 달성하기 위한 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 p35S 프로모터 및 이에 작동 가능하게 연결된 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 HOX28 유전자가 도입되어 생산성이 증가된 형질전환 벼를 제공한다. 이때, 상기 HOX28 유전자 및 p35S 프로모터의 정의는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명의 용어, "형질전환"이란, 일반적으로 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미할 수 있다. 상기 형질전환은 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있으며, 구체적으로 식물 병원균 아그로박테리움을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 아그로박테리움은 그들의 Ti(종양 유도성, tumor-inducing) 또는 Ri(뿌리 유도성, root-inducing) 플라스미드 DNA 중 일부(T-DNA)를 감염된 식물 세포 내로 전이 이식시키는 능력을 지니고 있다. 따라서 목적 유전자를 T-DNA 내에 재조합한 후 이를 보유한 균과 식물체를 공동 배양하면 식물 세포의 형질전환이 가능해진다.

본 발명의 형질전환 벼는 HOX28 유전자가 발현된 또는 발현될 수 있는 상태로 세포 내에 존재하는 벼의 형질전환 세포일 수 있다. 또한, 본 발명의 형질전환 벼는 상기 유전자가 도입된 형질전환세포를 포함한 벼의 식물체 전체 또는 일부 기관 등을 모두 포함할 수 있으며, 상기 유전자가 도입된 식물체의 유성생식 또는 무성생식에 의해 얻어질 수 있는 종자, 식물체 및 이의 조직이나 기관의 일부도 포함될 수 있다.

구체적으로, 상기 형질전환 벼는 분얼수, 신장길이, 이삭길이 및 이삭수가 야생형 벼에 비해 증가됨으로써 생산성이 증가된 것일 수 있다. 이때, 상기 생산성의 정의는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, HOX28 유전자의 형질전환체는 대조군인 동진벼에 비하여 분얼수가 평균 4개 이상 많아졌음을 확인하였고, 신장길이 또한 길어진 것을 확인하였다. 아울러, HOX28 유전자 형질전환체의 이삭길이 및 이삭수 또한 대조군에 비하여 증가함을 확인하였다(도 5 내지 9). 이는, 형질전환 벼에서는 더 많은 수의 낟알이 열릴 수 있으므로, 벼의 생산성이 증가될 수 있음을 시사한다.

상기의 목적을 달성하기 위한 또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 방법에 이용되고, HOX28 유전자를 포함하는 벼의 생산성 증가용 조성물을 제공한다. 이때, 상기 HOX28 유전자 및 생산성의 정의는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명에 따른 조성물은 상기 HOX28 유전자를 벼에 도입하는데 필요한 물질을 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않지만, 구체적으로 형질전환에 필요한 HOX28 유전자, 프로모터, 상기 유전자 및 프로모터를 포함하는 발현벡터, 버퍼 등 상기 HOX28 유전자를 도입하여 HOX28 유전자를 과발현시키는데 적합한 물질을 포함할 수 있다.

상기 조성물에 따른 HOX28 유전자의 도입은, 벼의 생산성을 증가시킬 수 있으며, 상기 벼의 생산성 증가는 벼의 분얼수, 신장길이, 이삭길이 및 이삭수의 증가에 의하여 달성되는 것일 수 있다.

상기의 목적을 달성하기 위한 또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 벼의 생산성 증가용 키트를 제공한다.

본 발명에 따른 키트는 HOX28 유전자의 도입에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 포함할 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 키트는 HOX28 유전자를 도입하는데 사용될 수 있으며, 특별히 이에 제한되지 않으나, HOX28 유전자, HOX28 유전자를 과발현시키기 위한 프로모터, 상기 유전자 및 프로모터를 포함하는 발현벡터 뿐만 아니라 도입에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다. 일례로서, 본 발명의 HOX28 유전자를 도입하기 위한 키트는 형질전환을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다.

본 발명에 따른 벼의 생산성을 증가시키는 방법은 벼의 분얼수, 신장길이, 이삭길이 및 이삭수를 증가시킴으로써 수확량을 증가시켜 원활한 농산물 공급을 가능하게 하며, 나아가 생산성이 증가된 새로운 작물을 개발하는데 이용될 수 있을 것이다.

도 1은 HOX28 유전자의 도메인을 분석한 결과를 보여주는 개략도이다.
도 2는 HOX28 유전자의 발현 양상을 분석한 qPCR 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 HOX28 유전자의 벼 형질전환용 벡터의 설계를 보여주는 개략도이다.
도 4는 형질전환한 벼에서 HOX28 유전자의 삽입 여부를 분석한 결과를 보여주는 이미지이다.
도 5는 HOX28 유전자 형질전환 벼와 대조군(동진벼)의 분얼수에 대한 표현형을 비교한 이미지이다.
도 6은 HOX28 유전자 형질전환 벼와 대조군(동진벼)의 분얼수(tiller number)에 대한 표현형을 비교한 그래프이다.
도 7은 HOX28 유전자 형질전환 벼와 대조군(동진벼)의 신장(stem length)에 대한 표현형을 비교한 그래프이다.
도 8은 HOX28 유전자 형질전환 벼와 대조군(동진벼)의 이삭 길이(panicle length)에 대한 표현형을 비교한 그래프이다.
도 9는 HOX28 유전자 형질전환 벼와 대조군(동진벼)의 이삭수(panicle number)에 대한 표현형을 비교한 그래프이다.

이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. HOX28 유전자의 특성 분석

실시예 1-1. HOX28 유전자의 도메인 분석

생산성이 증가한 벼를 제조하는데 이용하고자, HOX28 유전자의 특성을 분석하였다.

구체적으로, HOX 유전자 패밀리 중, 그룹 II 에 속하는 HOX 유전자 패밀리를 대상으로 줄기, 뿌리, 잎 순으로 발현량이 증가되는 HOX28번 유전자를 선발하였다. 이후, HOX28 유전자의 기능을 확인하기 위해 도메인을 NCBI 도메인 분석 사이트에서 분석하였다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 유전자는 Homeodomain을 가진 전형적인 HOX 유전자의 패밀리 그룹에 속하는 유전자임을 확인하였고, 768 뉴클레오타이드의 염기서열로 256 아미노산 잔기를 가짐을 알 수 있었다.

실시예 1-2. HOX28 조직 부위별 발현량 분석

HOX28 유전자는 야생형 벼의 어느 부위에서 발현하는지 조사하고자, HOX28 유전자의 qPCR 분석을 수행하였다.

구체적으로, 먼저 야생형 벼의 잎, 줄기, 뿌리의 RNA를 분리하였다. 각각의 샘플들을 액체질소가 담긴 막자사발에 넣고 곱게 간 후, 2 ㎖ 튜브에 적당량 담고 트리졸(Trizol, Takara, Japan) 800 ㎕를 넣고 재빨리 볼텍스(vortex)하였다. 같은 튜브에 클로로포름(Chloroform) 400 ㎕를 넣고 간단히 볼텍스한 뒤, 4℃ 원심분리기를 이용하여 13,000 rpm으로 10분간 원심분리 하였다. 이 과정을 한 번 더 반복한 후 최종 획득한 상층액에 375 ㎕의 이소프로판올(isopropanol)을 넣고 잘 혼합한 후 4℃에서 13,000 rpm으로 10분간 원심분리 하였다. 상층액은 버리고 RNA 침전물을 1 ㎖의 70% 에탄올(ethanol)로 세척하였다. 4℃에서 13,000 rpm으로 원심분리한 후, 상층액을 완전히 제거한 뒤, RNA 침전물을 37℃에서 30분간 건조시켰다. ddH2O 또는 1x TE 버퍼 50 ㎕를 넣고 볼텍스하여 RNA를 완전히 녹이고, 60℃ 인큐베이터(incubator)에서 10분간 인큐베이션시켰다. 20℃에서 13,000 rpm으로 원심분리하고, 상층액을 새로운 1.5㎖ 튜브에 옮겨 RNA의 양을 분광측광기(Spectrophotometer)로 정량한 뒤, -70℃ 에서 보관하였다.

이후, cDNA 합성을 위하여 Sprint RT Complete-Oligo(dT)(Clontech kit)를 이용하여 첫 주형 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA에 물 80 ㎕를 넣어 5배 희석시킨 반응액을 SYBR Premix Ex Taq(Takara)와 혼합하여 real-time qPCR(Biorad)기기를 이용하여 qPCR을 수행하였다. HOX28 유전자의 sense primer(5'-CTCACTCCGAAGCAGAAGGT-3', 서열번호 3) 및 antisense primer(5'-GTGATCTCTGAATCCGCACA-3', 서열번호 4)를 qPCR 반응액에 넣은 후, 95℃에서 5분 동안 반응시킨 후, 95℃에서 10초, 58℃에서 30초, 72℃에서 35초의 반응을 40번 반복한 후, 다시 95℃에서 1분, 55℃에서 1분, 65℃에서 10초간 반응시켰고, 이후 분석 프로그램을 통해 정량분석 하였다.

그 결과, 도 2에서 볼 수 있듯이, HOX28 유전자는 벼의 줄기(stem), 뿌리(root) 및 잎(leaf) 조직에서 모두 발현하는 유전자임을 확인하였으며, 잎에서의 발현양은 줄기 및 뿌리에 비하여 현저히 낮음을 확인하였다.

실시예 2. 벼 형질전환용 벡터 제작

HOX28 유전자를 과발현하는 벼를 제조하기 위하여, pCAMBIA3300PT 벡터 및 pCR8/GW/TOPO 벡터를 이용한 바이너리(Binary) 벡터 시스템을 이용하여 HOX28 유전자가 삽입된 형질전환용 재조합벡터를 제조하였다. 아울러, HOX28 유전자 발현 조절을 위하여 p35S 프로모터를 사용하였다.

구체적으로, pCAMBIA3300PT 벡터에 HOX28 유전자를 삽입하기 위하여 RT-PCR에 의해 증폭된, 서열번호 1의 염기서열을 갖는 HOX28 유전자를 pCR8/GW/TOPO 벡터에 클로닝하였다. 이후, 벼 형질전환을 위한 바이너리(Binary) 벡터 제작을 위하여 게이트웨이(Gateway) 시스템에 따라 LR(Invitrogen 사) 목적벡터인 pCAMBIA3300PT 및 pCR8/GW/TOPO 벡터에 클로닝된 HOX28 유전자를 반응액에 혼합하여 반응시킨 후 형질전환하였다. 콜로니(Colony) PCR을 실시하여 HOX28 유전자의 pCAMBIA3300PT 벡터 삽입 여부를 확인함으로써, HOX28 유전자가 삽입된 바이너리 벡터를 완성하였다. 상기와 같이 제작된 HOX28 유전자의 형질전환용 벡터의 모식도는 도 3에 나타내었으며, 재조합벡터 제작에 사용된 상기 HOX28 유전자의 염기서열 및 이에 따라 번역되는 HOX28 유전자의 아미노산 서열은 하기 표 1에 정리하였다.

HOX28	서열
염기서열	ATGGAGAGGCAAGGCTTGGATCTTGGCCTGAGCCTCGGGCTAGGCTTGACGACGGCGGCGACATGGCCGGCTGCTGGGTTCTGTCTGAACTCCGGCATGGCGGAGCAGGAAGTGATCAGGCGTGATGATGTGGTTGCGGCGACGGCGGCGGAGGATGAGAGGTTCGCGTGCTCACCCGGCAGCCCGGTGTCGAGCGGCAGCGGGAAGCGAGGCAGCGGCAGCGGCAGCGGCGACGAGGTCGACGACGCCGGCTGCGACGTCGGCGGCGGCGGCGCGCGCAAGAAGCTGCGGTTGTCCAAGGACCAGGCCGCCGTCCTCGAGGAGTGCTTCAAGACGCACCACACCCTCACTCCGAAGCAGAAGGTGGCGCTGGCGAAGAGCTTGAACCTGCGGCCGCGGCAGGTGGAGGTGTGGTTCCAGAACCGCCGCGCGAGGACGAAGCTGAAGCAGACGGAGGTGGACTGCGAGCACCTCAAGCGGTGGTGCGACCAGCTCGCCGACGACAACCGCCGCCTCCACAAGGAGCTCGCCGAGCTCAGGGCGCTCAAGGCCACGCCCACACCGCCCGCCGCCGCGCCGCCATTGACCACCCTCACAATGTGCCTCTCCTGCAAGCGCGTCGCCAATGCCGGCGTGCCCTCGCCGGCGGCGGCGATATTCCCCGGCCACCCCCAGTTCTTGTGCGGATTCAGAGATCACGCCGGAGCAGCGTCGTCGTCGTACGGCGGCGCATCATCTGGACTCGCGAAGGCGGTCAGGGCGGCGAGGTAGATCGATCGATGCGCGCGCCGCCATGATCGACATGACCAAGCTAG (서열번호 1)
아미노산서열	MERQGLDLGLSLGLGLTTAATWPAAGFCLNSGMAEQEVIRRDDVVAATAAEDERFACSPGSPVSSGSGKRGSGSGSGDEVDDAGCDVGGGGARKKLRLSKDQAAVLEECFKTHHTLTPKQKVALAKSLNLRPRQVEVWFQNRRARTKLKQTEVDCEHLKRWCDQLADDNRRLHKELAELRALKATPTPPAAAPPLTTLTMCLSCKRVANAGVPSPAAAIFPGHPQFLCGFRDHAGAASSSYGGASSGLAKAVRAAR (서열번호 2)

또한, 완성된 바이너리 벡터를 아그로박테리움(Agrobacterium, LBA4404)에 형질전환하기 위하여 냉동과 해동을 2-3번 반복한 후, 37℃의 히트 쇼크(heat shock) 방법에 의해 형질전환하였고, YEP배지(Yeast 10g, NaCl 5g, 펩톤(peptone) 10g, 아가(Agar) 15g/1L) 에서 밤새 배양한 후 콜로니를 확인하였다. 콜로니 PCR에 의해 형질전환이 확인된 콜로니는 벼에 형질전환하기 위하여 AB 배지(AB buffer(K₂HPO₄ 60g, NaH₂PO₄ 20g/1L), AB Salts(NH₄Cl60g, MgSO₄ㆍ7H₂O 6g, KCl 3g, CaCl₂ㆍ2H₂O 0.265g, FeSO₄.7H₂O 50mg/1L) 및 Glucose 5g/1L)에서 배양하였다.

실시예 3. HOX28 유전자의 벼 형질전환

상기 실시예 1에 따라 제조한 형질전환용 벡터를 이용하여, HOX28 유전자를 과발현하는 벼를 제조하고자 하였다.

구체적으로, 상기 재조합벡터를 도입하기 위하여, 아그로박테리움 매개 동시 형질전환법(Agrobacterium-mediated co-transformation)을 사용하였다.

실시예 3-1. 체세포 배(embryo) 배양 방법

아그로박테리움에 의한 벼 형질전환을 위하여 종자를 락스에 세척한 후 적당히 건조시켜 2,4-D 호르몬을 첨가한 2N6 배지(Duchefa 사 CHU(N6) vitamin 포함 medium)에 치상하였다. 치상한 종자는 28℃에서 약 7일간 배양한 후 배반을 적출하여 HOX28 유전자가 들어 있는 아그로박테리움 감염에 사용하였다.

실시예 3-2. 아그로박테리움 감염 및 형질전환체 유도 방법

배발생(embryogenesis)화된 배와 아그로박테리움 형질전환된 유전자를 AB 액체배지에 배양하여 20분간 감염시킨 후, 아세토시리곤(Acetosyringone)이 첨가된 2N6 배지에서 7일간 배양하였다. 아그로박테리움 감염 후, 다시 세포탁심(cefotaxime)과 PPT(Phosphinotricine)가 첨가된 2N6 배지에서 2주간 암배양하였다. 슈팅(Shooting) 유도를 위해 암배양이 끝난 배는 MSR-세포탁심과 PPT가 첨가된 배지에 옮겨 2-3주간 양배양하여 슈팅한 후 발근이 되면 온실로 옮기기 이전에 순화처리를 실시하였다.

실시예 4. 형질전환 벼(T ₀ )의 선발

상기 실시예 3을 통해 형질전환 하고자 한 벼 중에서 HOX28 유전자가 실제로 형질전환된 벼를 선발하기 위하여, Bar 유전자 특이적 프라이머를 이용하여 HOX28 유전자 삽입 여부를 확인하였다. 명확하게 삽입된 HOX28 유전자만의 삽입여부를 확인하기 위해서는 벼가 가지고 있지 않은 Bar 유전자를 이용하여 삽입여부를 확인하는 것이 가장 정확하기 때문에, Bar 유전자를 이용하여 HOX28 유전자의 삽입을 확인하였다.

구체적으로, 아그로박테리움에 의해 얻어진 23 라인의 형질전환 벼에서 Genomic DNA(Qiagen kit)를 추출하였으며, HOX28 유전자의 삽입 여부를 확인하기 위하여 Bar 유전자 특이적 sense primer(5’-AAGCACGGTCAACTTCCGTA-3’, 서열번호 5)와 antisense primer(5’- GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC-3’, 서열번호 6)를 PCR(Takara kit) 반응액과 혼합하여 94℃에서 5분 동안 반응시킨 후, 94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 1분간 반응시키는 35 사이클을 반복한 후, 72℃에서 5분간 연장 반응 시킨 후, 1% Agarose 젤을 이용하여 전기영동을 수행하였다.

그 결과, 도 4에서 볼 수 있듯이, 23 라인 중, 19 라인에서 HOX28 유전자가 삽입된 것을 확인할 수 있었다.

실시예 5. 형질전환 벼(T ₂ )의 표현형 분석

상기 실시예 4에 따라 얻은 벼 형질전환 식물체의 표현형을 분석하였다.

구체적으로, GMO 포장에서 재배한 HOX28 유전자가 삽입된 벼 형질전환체를 재배하여 2개월 간격으로 2번에 걸쳐 표현형을 조사하였다.

그 결과, HOX28 유전자의 형질전환체는 대조군인 동진벼에 비하여 분얼수가 평균 4개 이상 많아졌음을 확인하였다(도 5 및 도 6). 또한, HOX28 유전자의 형질전환체는 대조군인 동진벼에 비하여 신장길이가 길어진 것을 확인할 수 있었는데(도 7), 이는 HOX28 유전자는 줄기에서 가장 많이 발현되기 때문으로 해석된다. 아울러, HOX28 유전자의 형질전환체의 이삭길이 및 이삭수 또한 증가함을 확인하였다(도 8 및 도 9).

상술한 바와 같은 형질전환 벼의 성장 파라미터 증가는, 상시발현 프로모터인 p35S에 의하여 HOX28 유전자가 계속 발현됨으로써 이루어진 것임을 알 수 있었고, 이에 따른 벼의 분얼수, 신장길이, 이삭길이 및 이삭수의 증가는 벼의 생산성 향상에 많은 영향을 미칠 것임을 시사한다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> A method for improving productivity of Oryza sativa L. using HOX28 gene <130> KPA150930-KR <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 815 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cDNA of HOX28 <400> 1 atggagaggc aaggcttgga tcttggcctg agcctcgggc taggcttgac gacggcggcg 60 acatggccgg ctgctgggtt ctgtctgaac tccggcatgg cggagcagga agtgatcagg 120 cgtgatgatg tggttgcggc gacggcggcg gaggatgaga ggttcgcgtg ctcacccggc 180 agcccggtgt cgagcggcag cgggaagcga ggcagcggca gcggcagcgg cgacgaggtc 240 gacgacgccg gctgcgacgt cggcggcggc ggcgcgcgca agaagctgcg gttgtccaag 300 gaccaggccg ccgtcctcga ggagtgcttc aagacgcacc acaccctcac tccgaagcag 360 aaggtggcgc tggcgaagag cttgaacctg cggccgcggc aggtggaggt gtggttccag 420 aaccgccgcg cgaggacgaa gctgaagcag acggaggtgg actgcgagca cctcaagcgg 480 tggtgcgacc agctcgccga cgacaaccgc cgcctccaca aggagctcgc cgagctcagg 540 gcgctcaagg ccacgcccac accgcccgcc gccgcgccgc cattgaccac cctcacaatg 600 tgcctctcct gcaagcgcgt cgccaatgcc ggcgtgccct cgccggcggc ggcgatattc 660 cccggccacc cccagttctt gtgcggattc agagatcacg ccggagcagc gtcgtcgtcg 720 tacggcggcg catcatctgg actcgcgaag gcggtcaggg cggcgaggta gatcgatcga 780 tgcgcgcgcc gccatgatcg acatgaccaa gctag 815 <210> 2 <211> 256 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant protein of HOX28 <400> 2 Met Glu Arg Gln Gly Leu Asp Leu Gly Leu Ser Leu Gly Leu Gly Leu 1 5 10 15 Thr Thr Ala Ala Thr Trp Pro Ala Ala Gly Phe Cys Leu Asn Ser Gly 20 25 30 Met Ala Glu Gln Glu Val Ile Arg Arg Asp Asp Val Val Ala Ala Thr 35 40 45 Ala Ala Glu Asp Glu Arg Phe Ala Cys Ser Pro Gly Ser Pro Val Ser 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Lys Arg Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asp Glu Val 65 70 75 80 Asp Asp Ala Gly Cys Asp Val Gly Gly Gly Gly Ala Arg Lys Lys Leu 85 90 95 Arg Leu Ser Lys Asp Gln Ala Ala Val Leu Glu Glu Cys Phe Lys Thr 100 105 110 His His Thr Leu Thr Pro Lys Gln Lys Val Ala Leu Ala Lys Ser Leu 115 120 125 Asn Leu Arg Pro Arg Gln Val Glu Val Trp Phe Gln Asn Arg Arg Ala 130 135 140 Arg Thr Lys Leu Lys Gln Thr Glu Val Asp Cys Glu His Leu Lys Arg 145 150 155 160 Trp Cys Asp Gln Leu Ala Asp Asp Asn Arg Arg Leu His Lys Glu Leu 165 170 175 Ala Glu Leu Arg Ala Leu Lys Ala Thr Pro Thr Pro Pro Ala Ala Ala 180 185 190 Pro Pro Leu Thr Thr Leu Thr Met Cys Leu Ser Cys Lys Arg Val Ala 195 200 205 Asn Ala Gly Val Pro Ser Pro Ala Ala Ala Ile Phe Pro Gly His Pro 210 215 220 Gln Phe Leu Cys Gly Phe Arg Asp His Ala Gly Ala Ala Ser Ser Ser 225 230 235 240 Tyr Gly Gly Ala Ser Ser Gly Leu Ala Lys Ala Val Arg Ala Ala Arg 245 250 255 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for HOX28 <400> 3 ctcactccga agcagaaggt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for HOX28 <400> 4 gtgatctctg aatccgcaca 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for Bar <400> 5 aagcacggtc aacttccgta 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for Bar <400> 6 gaagtccagc tgccagaaac 20

Claims (10)

1. 벼의 종자에 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 HOX28 유전자를 도입하는 단계를 포함하는 벼의 신장길이, 이삭길이 및 이삭수를 증가시키는 방법.
   
2. 삭제
3. 제1항에 있어서,
   상기 HOX28 유전자는 p35S 프로모터에 작동 가능하게 연결된 것인, 방법.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 HOX28 유전자의 도입에 의하여, 벼가 형질전환되고, 형질전환된 벼에서 HOX28 유전자가 과발현되는 것인, 방법.
   
5. 삭제
6. p35S 프로모터 및 이에 작동 가능하게 연결된 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 HOX28 유전자가 도입되어 신장길이, 이삭길이 및 이삭수가 증가된 형질전환 벼.
   
7. 삭제
8. 제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항의 방법에 이용되고, 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 HOX28 유전자를 포함하는 벼의 신장길이, 이삭길이 및 이삭수 증가용 조성물.
   
9. 삭제
10. 제8항의 조성물을 포함하는 벼의 신장길이, 이삭길이 및 이삭수 증가용 키트.

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