KR101722357B1

KR101722357B1 - 간섬유화 진단용 마커로서의 akap12의 용도

Info

Publication number: KR101722357B1
Application number: KR1020160116502A
Authority: KR
Inventors: 김규원; 이혜신; 정영화; 류수형; 이단비; 김정아; 서지혜; 박지현; 최진혁
Original assignee: 서울대학교산학협력단; 재단법인 아산사회복지재단; 울산대학교 산학협력단
Priority date: 2016-09-09
Filing date: 2016-09-09
Publication date: 2017-03-31
Also published as: WO2018048257A1

Abstract

본 발명은 간섬유화를 조기에 효과적으로 진단 및 예측할 수 있는 간섬유화 진단 마커용 조성물, 간섬유화 진단용 조성물 및/또는 키트, 상기 간섬유화 진단 마커용 조성물을 이용한 간섬유화 진단 방법 및 간섬유화의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 본 발명으로 간섬유화 및 간암의 진단이 가능할 것으로 기대되며, 본 발명의 마커인 AKAP12의 발현 및 활성을 조절하여 만성 간질환 치료제 개발에 유용하게 사용할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

간섬유화 진단용 마커로서의 AKAP12의 용도 {Use of AKAP12 as a Hepatic Fibrosis diagnostic marker}

본 발명은 간섬유화를 조기에 효과적으로 진단 및 예측할 수 있는 간섬유화 진단 마커용 조성물, 간섬유화 진단용 조성물, 상기 간섬유화 진단 마커용 조성물을 이용한 간섬유화 진단 방법 및 간섬유화의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

만성 간질환은 간의 질병이 6개월 이상 지속되는 경우로, 만성 간염, 간경변 및 간암 등이 대표적인 질병이다. 2013년 통계청 자료에 의하면 우리나라의 간질환에 의한 사망률은 인구 10만명 당 13.2 명으로 전체 사망원인 8위를 차지하고 암에 의한 사망의 22.6 %가 간암으로, 암 사망 원인 4위에 해당되며, 특히 한국 및 일본 등의 아시아에서 발생되는 가장 흔한 암이다(Parkin, et al., Int. J. Cancer, 80, 827-841, 1999, Luo et al., Basic Biology and Clinical Sciences 1st Ed., pp. 435-445, 1997, Chen et al., J. Gastroenterol. Hepatol. 12, S294-308, 1997).

만성 간질환을 유발하는 병인은 B, C형 간염 바이러스, 알콜 과다 섭취, 면역이상 등 다양하지만, 대부분의 만성 간질환은 간섬유화를 수반하는 특성을 보인다. 통계적으로 간암의 80 % 가량이 liver cirrhosis (간경변증)에서 발생하고, etiology에 따라 B형 간염에 의한 간경변 환자가 5년 이내에 간암이 발병할 확률은 15 %, 알콜성 간경변 환자의 경우 8 %에 이른다. 이렇게 간섬유화는 그 자체로도 생명을 위협하는 질병일 뿐 아니라 간암 발병률을 높이는 위험 요소이다. 그럼에도 불구하고 현재까지 FDA 승인된 간섬유화 치료제가 개발되지 않았고, 간섬유화에 의해 간암이 발병하는 구체적인 메커니즘에 대해서도 밝혀진 바가 없다.

AKAP12 단백질은 종양 억제 유전자로 여러 암종에서 발현이 감소되어 있다고 알려져 있으며, 간암에서도 AKAP12 유전자의 epigenetic regulation에 의한 발현 감소가 보고되어 있지만, 모두 암세포에 초점을 맞춘 연구로 AKAP12를 발현하는 세포 타입에 따른 연구는 되어있지 않으며, 또한 간섬유화 조직에서 AKAP12의 발현이나 기능에 대한 연구는 이루어지지 않고 있다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 정상 및 만성 간질환 조직을 분석하여 AKAP12를 발현하는 세포 타입을 결정하였으며, 상기 질병 상황에서 AKAP12 단백질의 발현 패턴의 변화를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명의 목적은 AKAP12 (A-kinase anchoring protein 12) 유전자 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 AKAP12 단백질을 포함하는 간섬유화 진단 마커용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 AKAP12 (A-kinase anchoring protein 12) 유전자의 수준 또는 AKAP12 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는 간섬유화 진단용 조성물 및/또는 키트를 포함한 관련 제품 및/또는 적용 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 생물학적 시료에 존재하는 AKAP12 (A-kinase anchoring protein 12) 유전자의 발현량 또는 단백질의 양을 측정하여 정상대조군 시료의 발현량과 비교하는 단계를 포함하는 간섬유화의 예측 및 진단 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 AKAP12 (A-kinase anchoring protein 12)를 유효성분으로 포함하는 간섬유화의 예방 또는 치료용 조성물 및 이를 이용한 간섬유화 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 AKAP12 (A-kinase anchoring protein 12) 유전자 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 AKAP12 단백질을 포함하는 간섬유화 진단 마커용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 AKAP12 유전자는 AKAP12 알파 형태 (alpha form) 또는 AKAP12 베타 형태 (beta form)일 수 있으며, 상기 AKAP12 알파 형태 및 AKAP12 베타 형태는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열을 가질 수 있다.

또한, 본 발명은 AKAP12 (A-kinase anchoring protein 12) 유전자의 수준 또는 AKAP12 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는 간섬유화 진단용 조성물 및/또는 키트를 포함한 관련 제품 및/또는 적용 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 AKAP12 유전자의 수준을 측정하는 물질은 AKAP12 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 AKAP12 단백질의 수준을 측정하는 물질은 AKAP12 단백질을 특이적으로 인식하는 항체일 수 있다.

또한, 본 발명은 생물학적 시료에 존재하는 AKAP12 (A-kinase anchoring protein 12) 유전자의 발현량 또는 단백질의 양을 측정하여 정상대조군 시료의 발현량과 비교하는 단계를 포함하는 간섬유화의 예측 및 진단 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨로 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 간 동모양 혈관 내피 세포 (Liver sinusoidal endothelial cell, LSEC) 또는 간문맥 섬유아세포 (Portal fibroblast, PF)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 유전자 발현 수준을 측정하는 방법은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNaseprotection assay), 노던 블롯팅(Northern blotting) 및 DNA 칩으로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 방법일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하기 위한 방법은 웨스턴 블롯, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직 면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS) 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 방법일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 생물학적 시료에서 존재하는 AKAP12 유전자의 발현량 또는 단백질의 양이 대조군에 비해 감소된 경우, 간섬유화가 진행된 것으로 판정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 간섬유화의 예측 및 진단 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 AKAP12 (A-kinase anchoring protein 12)를 유효성분으로 포함하는 간섬유화의 예방 또는 치료용 조성물 및 이를 이용한 간섬유화 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

도 1은 마우스의 정상 간조직에서 AKAP12의 발현을 나타내는 도이다.
도 2는 마우스의 정상 간조직과 DDC 식이로 유발한 섬유화 조직에서의 AKAP12의 발현을 나타내는 도이다.
도 3은 마우스의 정상 간조직과 Thioacetamide (TAA)-유래 소엽중심성 (centrilobular) 섬유화 조직에서의 AKAP12의 발현을 나타내는 도이다.
도 4는 HBV 유래 간섬유화 환자의 간조직에서 섬유화 단계에 따른 AKAP12의 발현을 나타내는 도이다.
도 5는 HCV 유래 간섬유화 환자의 간조직에서 섬유화 단계에 따른 AKAP12의 발현을 나타내는 도이다.
도 6은 non-HBV/non-HCV (NBNC) 유래 간섬유화 환자의 간조직에서 섬유화 단계에 따른 AKAP12의 발현을 나타내는 도이다.

본 발명자들은, 실시예에서 간 조직의 섬유화 영역에서 AKAP12 단백질 발현이 감소한다는 점에 기반하여 생쥐 (mouse)의 간섬유화 모델 및 간섬유화 환자 간 조직의 섬유화 영역에서 AKAP12 단백질 발현 등을 구체적으로 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 AKAP12 (A-kinase anchoring protein 12) 유전자 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 AKAP12 단백질을 포함하는 간섬유화 진단 마커용 조성물을 제공함에 특징이 있다.

본 발명자들은, AKAP12 (A-kinase anchoring protein 12) 유전자가 비-간암 조직에 비해 간암 조직에서 낮게 발현되는 것을 확인할 수 있었으며, 상기 AKAP12 유전자는 AKAP12 알파 형태 (alpha form) 또는 AKAP12 베타 형태 (beta form)인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, 상기 AKAP12 알파 형태 및 AKAP12 베타 형태의 염기서열을 각각 서열번호 1 및 서열번호 2에 나타내었고, AKAP12 알파 형태 및 AKAP12 베타 형태의 아미노산 서열을 서열번호 3 및 서열번호 4에 나타내었다.

본 발명의 일실시예에서는, 간 조직 내 간 동모양 혈관 내피 세포 (Liver sinusoidal endothelial cell, LSEC) 또는 간문맥 섬유아세포 (Portal fibroblast, PF)에서 특이적으로 AKAP12의 발현이 감소한다는 것을 확인하였는 바(실시예 2 참조), 본 발명에 따른 AKAP12 유전자를 이용하여 간섬유화 또는 간암의 진단이 요구되는 다양한 목적 및 용도로 사용될 수 있다.

이에, 본 발명은 AKAP12 (A-kinase anchoring protein 12) 유전자의 수준 또는 AKAP12 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는 간섬유화 진단용 조성물 및/또는 키트를 포함한 관련 제품 및/또는 적용 방법을 제공한다.

본 발명에서, "진단"이란 병리 상태를 확인하는 것을 의미하는 것으로서, 본 발명의 목적상 상기 진단은 간섬유화 진단 마커의 발현 유무를 확인하여 간섬유화의 진행 여부를 확인하는 것을 의미하며, 또한, 본 발명에서의 진단은 간섬유화 진단 마커의 발현 유무 및 발현 정도를 확인하여 간섬유화의 발병여부, 발전 및 경감 등을 판단하는 것도 포함한다.

또한, "진단 마커 (diagnosis marker)"란 간섬유화 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질을 의미하며, 정상 세포에 비하여 간섬유화 세포에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산 (예컨대, mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당 (단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명에서 제공하는 간섬유화 진단 마커용 조성물은 정상 세포에 비해 간섬유화 세포에서 발현량이 감소하는 AKAP12 유전자 또는 단백질일 수 있으며, 바람직하게 상기 AKAP12 유전자는 서열번호 1로 기재된 염기서열을 갖는 것일 수 있다.

본 발명에서 상기 AKAP12 유전자의 수준을 측정하는 물질은 AKAP12 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있고, 상기 AKAP12 단백질의 수준을 측정하는 물질은 AKAP12 단백질을 특이적으로 인식하는 항체일 수 있다.

본 발명에서 "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형 (template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응 (즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.

본 발명에서 "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 표지 (Labelling)되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오티드 프로브, 단쇄 DNA (single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA (double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명에서, "항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.

본 발명의 유전자는 핵산 서열이 유전자 은행에 등록되어 있으므로 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍 또는 프로브를 디자인할 수 있다.

본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브는 포스포르 아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체 (예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미 데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

본 발명에서 "생물학적 시료"는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨로 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 간 동모양 혈관 내피 세포 (Liver sinusoidal endothelial cell, LSEC) 또는 간문맥 섬유아세포 (Portal fibroblast, PF)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 생물학적 시료에서 존재하는 AKAP12 유전자의 발현량 또는 단백질의 양이 대조군에 비해 감소된 경우, 간섬유화가 진행된 것으로 판정할 수 있다.

본 발명에서 "유전자 발현량 측정"이란 간섬유화의 진행 여부를 확인하기 위하여 간 조직 세포에서 상기 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, mRNA의 양을 측정하여 이루어진다. 이를 위한 분석 방법으로는 예를 들어, 역전사 중합효소반응 (RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응 (Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응 (Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅 (Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 유전자의 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍 또는 프로브이다. 본 발명에서 "안티센스"는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적서열 내에서, 전형적으로 mRNA와 RNA:올리고머 헤테로이중체의 형성을 허용하는, 뉴클레오티드염기의 서열 및 서브 유닛간 백본을 갖는 올리고머를 지칭한다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다. 이 안티센스 올리고머는 mRNA의 번역을 차단 또는 저해하고 mRNA의 스플라이스 변이체를 생산하는 mRNA의 프로세싱 과정을 변화시킬 수 있다.

본 발명에서 "단백질 발현량 측정"이란 간섬유화의 진행 여부를 확인하기 위하여 간 조직 세포에서 본 발명의 유전자로부터 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 단백질의 양을 측정하여 이루어진다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석 (RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법 (radioimmunodiffusion), 오우크테로니 (Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 (rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법 (Complement Fixation Assay), 유세포분석 (Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩 (protein chip) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 단백질 발현 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 항체이다.

본 발명의 일실시예로서, 대상체 유래 생물학적 시료로부터 AKAP12 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하고, 이에 간섬유화 치료용 후보물질 투여시, AKAP12 유전자 또는 단백질의 발현 수준이 기존 대비 증가되는 경우 상기 후보물질은 간섬유화 치료제로 이용될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 시료의 준비

1-1. 마우스 (mouse) 간섬유화 모델

TAA (thioacetamide)-유래 소엽중심성 섬유화 (TAA-induced centrilobular fibrosis) 모델의 경우, TAA를 150 mg/kg의 농도로 주 3회, 총 8 주간 복강 투여하여 제작하였으며, DDC (3,5-diethoxycarbonyl-1,4-dihydrocollidine)-유래 간문맥 섬유화 (DDC-induced portal fibrosis) 모델의 경우, 0.1 %의 DDC를 함유한 사료를 제작하여 3 주간 공급하여 제작하였다.

1-2. 조직 샘플

28명의 환자들로부터 간 조직의 섬유화 영역 샘플을 얻었다. 본 실시예에서 사용된 상기 조직 샘플들은 서울아산병원 임상연구심의위원회의 승인을 받은 것이며, 헬싱키 선언의 요구에 부합되도록 사전에 참가자들로부터 동의를 받았다. 각 환자의 특성치는 하기 표 1에 나타내었다.

항목	특성치
연령 (년, 평균±SD)	51 ± 13.8
성별 (M:F)	14 : 14
질환정도 (정상 (normal)/간문맥 섬유화 (portal fibrosis)/간문맥주변 섬유화 (periportal fibrosis)/격막 섬유화 (septal fibrosis)/간경변 (cirrhosis))	4/6/6/6/6
원인 (HBV/HCV/NBNC)	8/8/8

* 간섬유화 환자 (총 28명) 특성치

1-3. 세포 배양 및 면역조직화학적 염색

파라핀 조직 슬라이드는 자일렌 용액에 5 분씩 2회 배양하여 파라핀을 제거한 후 100 % 에탄올, 95 % 에탄올, 90 % 에탄올, 80 % 에탄올, 50 % 에탄올, 증류수 용액에 순차적으로 3~5 분간 배양하여 재수화 하였다. 면역반응성을 증가시키기 위하여, 95 ℃로 가열된 Tris/EDTA (pH 9.0) 용액에서 40 분간 항원 회수 과정을 거쳤다. 5 % normal donkey serum/PBS 용액으로 블로킹 (blocking) 후 같은 용액에 anti-AKAP12 항체를 1:200의 비율로 희석하여 4 ℃ 에서 밤새 배양하였다. PBS/0.1 % tween-20 버퍼로 세척 후 Alexafluor 488 dye가 태그 된 항-토끼 2차 항체로 염색하였다. 이미지는 Zeiss 공초점 현미경으로 촬영하였다.

실시예 2. AKAP12 (A-kinase anchoring protein 12) 발현 확인

AKAP12의 발현을 확인하기 위하여, 실시예 1-1에서 제작된 마우스의 간섬유화 모델 및 실시예 1-2의 간섬유화 환자로부터 간 조직의 섬유화 영역을 채취하여 실시예 1-3과 같이 실험하였다.

2-1. 마우스에서 AKAP12 발현 확인

먼저, 상기 실시예 1-1에서 제작된 마우스의 간섬유화 모델에서 섬유화 정도를 확인하였다.

그 결과, 마우스 정상 간조직의 경우, 도 1에 나타낸 바와 같이, AKAP12의 발현이 간문맥 섬유아세포 (portal fibroblast) 마커인 thy-1 및 혈관내피세포 마커인 CD31과 일치하나, 간성상세포 (hepatic stellate cell) 마커인 Desmin과는 일치하지 않는 것을 확인하였다.

또한, DDC (3,5-diethoxycarbonyl-1,4-dihydrocollidine)-유래 간문맥 섬유화 (DDC-induced portal fibrosis) 모델의 경우, 도 2에 나타낸 바와 같이, 간문맥에서의 AKAP12 발현은 섬유화가 진행됨에 따라 감소하고, 3 주간의 DDC 식이 후 정상 식이를 공급하여 섬유화의 회복을 유도하였을 때, 다시 증가하는 양상을 보였다(이러한 패턴은 근섬유아세포 (myofibroblast) 마커인 aSMA의 발현과는 반대되는 양상이다.). 또한, 동양혈관 (Sinusoid)에서의 AKAP12 발현 또한 DDC 식이 2 주경부터 감소하기 시작하여 3 주경에 최대치로 감소하였다가, 정상 식이에 의해 다시 증가하는 양상을 보였다(이러한 패턴은 동양혈관 (sinusoid)의 모세혈관화 (capillarization) 마커인 laminin의 발현과 반대되는 양상이다.).

마지막으로, TAA (thioacetamide)-유래 소엽중심성 섬유화 (TAA-induced centrilobular fibrosis) 모델의 경우, 도 3에 나타낸 바와 같이, 근섬유아세포 마커인 aSMA 발현이 강한, 즉, 섬유화가 진행된 부분의 동양혈관 (Sinusoid)에서 AKAP12 발현이 감소하였으나, 섬유화가 진행되지 않은 부분에서는 유지되는 양상을 보였다(이러한 발현 패턴은 동양혈관의 모세혈관화 (capillarization) 마커인 laminin의 발현과 반대되는 양상이다.).

2-2. 인간에서 AKAP12 발현 확인

상기 실시예 1-2에서 28명의 환자들로부터 얻은 간 조직의 섬유화 영역을 aSMA에 대한 항체로 이중염색하였으며, 병리과 전문의에 의해 섬유화 단계 (grading)를 확인하였다.

그 결과, HBV 유래 간섬유화 환자의 경우, 도 4에서 나타낸 바와 같이, 정상 조직과 비교할 때, 초기 단계의 섬유화 조직에서부터 AKAP12의 발현이 급격히 감소함을 알 수 있었으며, HCV 유래 간섬유화 환자의 경우, 도 5에서 나타낸 바와 같이, HBV 유래 간섬유화 환자의 패턴과 유사하게, 초기 단계의 섬유화 조직에서부터 AKAP12의 발현이 급격히 감소함을 확인하였다. 마지막으로, NBNC 유래 간섬유화 환자의 경우, 도 6에 나타낸 바와 같이, HBV 또는 HCV 유래 간섬유화 조직과는 상이하게, 초기 섬유화 단계 동양혈관에서 AKAP12 단백질의 발현이 섬유화 영역에 한하여 감소하며, 후기 섬유화 단계 및 간경변 환자 조직에서는 HBV/HCV 성 섬유화와 유사하게 전반적으로 발현이 감소하는 양상을 확인하였다.

상기 내용을 종합한 결과, AKAP12는 마우스의 간섬유화 모델 및 간섬유화 환자 조직 모두의 섬유화 영역에서 발현이 감소하며, 그 병인에 따라 중심 정맥 (central vein)에서 시작하는 섬유화에 비해 간문맥 (portal track)에서 시작하는 섬유화에서 감소폭이 크게 나타남을 확인하였다. 또한, 간 조직 내 간 동모양 혈관 내피 세포 (Liver sinusoidal endothelial cell, LSEC) 또는 간문맥 섬유아세포 (Portal fibroblast, PF)에서 특이적으로 AKAP12 유전자의 발현이 감소되는 사실을 확인함에 따라, AKAP12를 간섬유화 진단을 위한 마커 및 간섬유화 예방 또는 치료 용도로 사용할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> SNU R&DB FOUNDATION THE ASAN FOUNDATION University of Ulsan Foundation For Industry Cooperation <120> Use of AKAP12 as a Hepatic Fibrosis diagnostic marker <130> MP16-334 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 8450 <212> DNA <213> Human AKAP12 transcription variant 1 (hAKAP12α) <400> 1 gggactcgga ctcgctcctg ggcgagctga aagtcggctg cagcagaagc tcctgccttg 60 ggagtttgcc gcgagcgcgt ctccttcatt cgcaggctgg gcgcgttcgc agtcggctgg 120 cggcgaagga aggcgctctc gggacctcgc gggcgcgcgt cttttggctc ttgcccctgt 180 ccctgcggct tggggaaggc gtaacccggc ggctaggcgc gggagaagtg cggaggagcc 240 atgggcgccg ggagctccac cgagcagcgc agcccggagc agccgcccga ggggagctcc 300 acgccggctg agcccgagcc cagcggcggc ggcccctcgg ccgaggcggc gccagacacc 360 accgcggacc ccgccatcgc tgcctcggac cccgccacca agctcctaca gaagaatggt 420 cagctgtcca ccatcaatgg cgtagctgag caagatgagc tcagcctcca ggagggtgac 480 ctaaatggcc agaaaggagc cctgaacggt caaggagccc taaacagcca ggaggaagaa 540 gaagtcattg tcacagaggt tggacagaga gactctgaag atgtgagcaa aagagactcc 600 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Leu Gln Ser His Ala Lys Ser Pro Pro 1220 1225 1230 Ser Pro Val Glu Arg Glu Met Val Val Gln Val Glu Arg Glu Lys Thr 1235 1240 1245 Glu Ala Glu Pro Thr His Val Asn Glu Glu Lys Leu Glu His Glu Thr 1250 1255 1260 Ala Val Thr Val Ser Glu Glu Val Ser Lys Gln Leu Leu Gln Thr Val 1265 1270 1275 1280 Asn Val Pro Ile Ile Asp Gly Ala Lys Glu Val Ser Ser Leu Glu Gly 1285 1290 1295 Ser Pro Pro Pro Cys Leu Gly Gln Glu Glu Ala Val Cys Thr Lys Ile 1300 1305 1310 Gln Val Gln Ser Ser Glu Ala Ser Phe Thr Leu Thr Ala Ala Ala Glu 1315 1320 1325 Glu Glu Lys Val Leu Gly Glu Thr Ala Asn Ile Leu Glu Thr Gly Glu 1330 1335 1340 Thr Leu Glu Pro Ala Gly Ala His Leu Val Leu Glu Glu Lys Ser Ser 1345 1350 1355 1360 Glu Lys Asn Glu Asp Phe Ala Ala His Pro Gly Glu Asp Ala Val Pro 1365 1370 1375 Thr Gly Pro Asp Cys Gln Ala Lys Ser Thr Pro Val Ile Val Ser Ala 1380 1385 1390 Thr Thr Lys Lys Gly Leu Ser Ser Asp Leu Glu Gly Glu Lys Thr Thr 1395 1400 1405 Ser Leu Lys Trp Lys Ser Asp Glu Val Asp Glu Gln Val Ala Cys Gln 1410 1415 1420 Glu Val Lys Val Ser Val Ala Ile Glu Asp Leu Glu Pro Glu Asn Gly 1425 1430 1435 1440 Ile Leu Glu Leu Glu Thr Lys Ser Ser Lys Leu Val Gln Asn Ile Ile 1445 1450 1455 Gln Thr Ala Val Asp Gln Phe Val Arg Thr Glu Glu Thr Ala Thr Glu 1460 1465 1470 Met Leu Thr Ser Glu Leu Gln Thr Gln Ala His Val Ile Lys Ala Asp 1475 1480 1485 Ser Gln Asp Ala Gly Gln Glu Thr Glu Lys Glu Gly Glu Glu Pro Gln 1490 1495 1500 Ala Ser Ala Gln Asp Glu Thr Pro Ile Thr Ser Ala Lys Glu Glu Ser 1505 1510 1515 1520 Glu Ser Thr Ala Val Gly Gln Ala His Ser Asp Ile Ser Lys Asp Met 1525 1530 1535 Ser Glu Ala Ser Glu Lys Thr Met Thr Val Glu Val Glu Gly Ser Thr 1540 1545 1550 Val Asn Asp Gln Gln Leu Glu Glu Val Val Leu Pro Ser Glu Glu Glu 1555 1560 1565 Gly Gly Gly Ala Gly Thr Lys Ser Val Pro Glu Asp Asp Gly His Ala 1570 1575 1580 Leu Leu Ala Glu Arg Ile Glu Lys Ser Leu Val Glu Pro Lys Glu Asp 1585 1590 1595 1600 Glu Lys Gly Asp Asp Val Asp Asp Pro Glu Asn Gln Asn Ser Ala Leu 1605 1610 1615 Ala Asp Thr Asp Ala Ser Gly Gly Leu Thr Lys Glu Ser Pro Asp Thr 1620 1625 1630 Asn Gly Pro Lys Gln Lys Glu Lys Glu Asp Ala Gln Glu Val Glu Leu 1635 1640 1645 Gln Glu Gly Lys Val His Ser Glu Ser Asp Lys Ala Ile Thr Pro Gln 1650 1655 1660 Ala Gln Glu Glu Leu Gln Lys Gln Glu Arg Glu Ser Ala Lys Ser Glu 1665 1670 1675 1680 Leu Thr Glu Ser

Claims

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AKAP12 (A-kinase anchoring protein 12) 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는, 간섬유화 진단용 조성물.
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제4항에 있어서,
상기 AKAP12 단백질의 수준을 측정하는 물질은 AKAP12 단백질을 특이적으로 인식하는 항체인 것을 특징으로 하는, 간섬유화 진단용 조성물.
AKAP12 (A-kinase anchoring protein 12) 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는, 간섬유화 진단용 키트.
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제7항에 있어서,
상기 AKAP12 단백질의 수준을 측정하는 물질은 AKAP12 단백질을 특이적으로 인식하는 항체인 것을 특징으로 하는, 간섬유화 진단용 키트.
a) 생물학적 시료에 존재하는 AKAP12 (A-kinase anchoring protein 12) 단백질의 양을 측정하는 단계; 및
b) 상기 a) 단계의 측정결과를 정상대조군 시료의 AKAP12 단백질의 양과 비교하는 단계를 포함하는, 간섬유화의 예측 또는 진단을 위한 정보제공방법.
제10항에 있어서,
상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제11항에 있어서,
상기 세포는 간 동모양 혈관 내피 세포 (Liver sinusoidal endothelial cell) 또는 간문맥 섬유아세포 (Portal fibroblast)인, 방법.
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제10항에 있어서,
상기 단백질의 발현 수준을 측정하기 위한 방법은 웨스턴 블롯, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직 면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS) 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 방법인 것을 특징으로 하는, 방법.
제10항에 있어서,
상기 방법은, 상기 생물학적 시료에 존재하는 AKAP12 단백질의 양이 대조군에 비해 감소된 경우 간섬유화가 진행된 것으로 판정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
AKAP12 (A-kinase anchoring protein 12)를 유효성분으로 포함하는 간섬유화의 예방 또는 치료용 조성물.
a) 대상체 유래 생물학적 시료에 존재하는 AKAP12 단백질의 발현 수준을 측정하고, 이에 간섬유화 치료용 후보물질을 투여하는 단계; 및
b) AKAP12 단백질의 발현 수준이 상기 a) 단계에 비해 증가되는 것을 확인하는 단계를 포함하는 간섬유화 치료제의 스크리닝 방법.