KR101721712B1

KR101721712B1 - 미생물 탐지 스마트 포장재

Info

Publication number: KR101721712B1
Application number: KR1020117029286A
Authority: KR
Inventors: 드 라 푸에르타 엠 씨 크리스티나 네린; 바르톨로메 로라 구티에르즈; 자라보 크리스티나 산체즈
Original assignee: 유니버시다드 드 사라고사
Priority date: 2009-05-07
Filing date: 2010-04-21
Publication date: 2017-03-30
Also published as: EA024907B1; US8741596B2; ES2354677B1; CA2765632A1; KR20120024724A; US20120135455A1; MX2011011711A; SG10201402029WA; CN102439166B; DK2428580T3; SG175942A1; AU2010244344B2; EA201101582A1; CO6470867A2; ES2534838T3; EP2428580B1; IL216168A; CN102439166A; AU2010244344A1; JP5804279B2

Abstract

본 발명은 다른 유형의 상품에서 미생물과의 직접 접촉 또는 미생물을 포함하는 배지와의 접촉이 없이도 미생물의 성장을 시각적으로 탐지할 수 있도록 바닐린 용액이 흡수된 부분적으로 극성이 되는 단단한 지지물을 포함하는 새로운 물질을 사용하는 것으로 고안된 새로운 스마트 포장재에 관련된 것이다.

Description

미생물 탐지 스마트 포장재{SMART PACKING FOR DETECTING MICROORGANISM}

본 발명은 식품, 화학조제 그리고 화장품 분야에 관한 발명이다. 특히 바닐린 용액이 흡수된 부분적 극성흡착성의 단단한 지지물의 새로운 물질구성을 말하며 음식, 화장품 또는 조제에 있어서 미생물의 생존을 보호하는 비색 센서로 사용된다.

매년 미생물의 존재로 인한 독성음식 감염으로 인해 병원방문이 끊임없이 발생한다.

따라서, 21세기 소비자들은 질 좋고 영양가 높은, 즉 일반적인 손상이 최소화된 음식을 요구한다. 덜 강한 절차 상태의 적용이 미생물의 위험을 증가시킨다는 것은 명백하고 따라서 미생물 행동의 변이성이 중요하게 되며, 그들의 유효 기간 또는 생산자가 쉽게 예측할 수 있는 미생물학적 위험성에 대해 정확한 결정을 하기 위해서 어떤 상품에서의 실제 생존가능성과 잔여 미생물의 변화는 알려져야 한다.

음식에서의 병원균의 발생과 만연에 관한 연구는 사실 식품안전에 있어서 EU의 선행 과제 중의 하나이다. 연구의 목적은 식품, 또한 미생물학적 기준과 여러 종류의 식품에 대한 식품안전 목적에 관련된 위험에 접근하는 것이다.

현재 포장된 상품에서 광범위한 미생물의 생존을 시각적으로 보호하는 천연합성물로 거래되는 물질은 없다. 따라서 소비자, 소매업자 또는 배급업자 어느 누구도 포장된 상품이 미생물에 의해 오염되었는지 여부에 대하여 정확한 판단을 할 수 있는 사람은 없다. 그들을 통제하기 위해서는 많은 인력과 물질의 소비를 발생시키는 현미경관찰과 미생물학적 분석과 선택적인 배양기에서의 배양에 의존하는 것이 필요하다. 게다가 이러한 방법들은 분석된 상품들은 더 이상 상업적으로 쓸모가 없어지게 되어 파괴적이며, 미생물이 풍부해지는데 필요한 시간과 관계없이 2일에서 7일 사이의 미생물들의 수를 셀 때까지 수행되는 배양 시간 때문에 상당한 시간소비를 한다. 상기 테스트들은 역시 상당한 실험 비용이 발생한다. 상기 테스트들은 모든 식품의 모든 구성에 대해 수행할 수 없고 몇 개의 대표샘플에 대하여 무작위적으로 수행되는 경우에 그것에 의하여 상품에서의 미생물 오염과 생산자 또는 최종 소비자에 의해 발견되지 않는 잠재적 위험이 항상 존재한다. 그것이 그 피해가 이미 발생 되었을 때 종종 돌이킬 수 없는 본래 성격상의 문제가 발견되기 때문에 조제분야에서 위험성은 더 크다.

최근 몇 년간 식품 포장 시스템은 유통기한, 고유한 성질들, 신선함, 외관 등의 보존에 관한 면에서 소비자의 요구에 반응하여 진화하여 왔다. 이에 반해 현대의 마케팅 방법들은 상품을 구매하는 소비자들과 소통할 수 있는 매력적인 포장을 요구한다. 둘째로, 포장들은 생활 패턴에서의 뿌리깊은 변화에 반응하여 수년간 진화해왔고 포장산업은 이러한 변화들에 대응해야만 했다.

포장들은 다음의 기능들 사이에서 수행해야 한다:

·식품의 고정

·물리적, 화학적 그리고 미생물학적 활동으로부터의 식품 보호

·음식의 질과 건강함 보존

·모방금지

·상품의 상업적 가치 유지

·상품의 전시 및 증명

·소비자들에게 상품의 특징 설명

·유효기간 연장, 등

최근 소비자요구에서의 새로운 필요들 때문에 액티브 팩킹과 인텔리전트 팩킹이라는 두 가지 포장 컨셉이 있다. 액티브 그리고 인텔리전트 포장들은 식품 포장에서의 다음 세대로 보여 질 수 있다. 식품과 접촉하고 있는 활동적인 물질과 물품들은 저장기간 연장 또는 포장식품의 상태를 유지 개선하기 위한 것이고 포장된 식품 또는 그들의 환경으로 물질을 옮기거나 또는 포장된 식품 또는 그들의 환경으로부터 물질을 흡수하는 구성품들을 신중하게 결합시키기 위해 디자인된 EUROPEAN DIRECTIVE 1935/2004에 따라 정의된다. 최근 몇 년간 액티브 팩킹 분야에서 수 많은 간행물들이 이 주제를 언급하고 있는 중요한 발전이 있었다.(Rodriguez, A., Battle, R., Nerin, C(2007) "The use of natural oils as antimicrobial solutions essential in paper packing. Part Ⅱ"

"progress in Organic Coatings 60(1): 33-38), Rodriguez, A.,Nerin, C, and Battle, R (2008). "New cinnaamon-based active paper packing against Rhizopusstolonifer food spoilage." Journal of Agricultural and Food Chemistry 56(15)), Lopes, p., Sanchez C, Battle, R and Nerin, C(2007b). :Development of flexible antimicrobial films using esssntial oils as active agents." Journal of Agricultural and Food Chemistry 55(21): 8814-8824) Gutierrez, L, Sanchez C, Batlle, R.; Nerin, C. (2009). "New antimicrobial active package for bakery products." Trends in Food Science & Technology 20 (2): 92-99.

인텔리전트 팩킹은 목적이 다르고 특별한 지정으로 분리를 정당화한다. 그들의 행동은 포장 그 자체로서 부패 또는 파괴와 부적절한 유지 운송 또는 배급에 대한 정보제공자로서 행동하는 그들의 공정이 포함되거나 나타나는 상품의 질로서 현대 세계의 소비자 요구에 있어서 꿈을 실현한다. DIRECTIVE 1935/2004에 따르면 인텔리전트 포장들은 포장된 식품 또는 그 주변환경의 상태를 제어하는 물질로서 정의된다.

"스마트 패키지"가 그들이 본질적으로 시간-온도 지시자들, 미생물학적 질의 지시자들, 산소 또는 탄소 이산화물지시자들에 해당되는 한 식품 또는 몇몇의 포장 재료의 특성 또는 구성품의 사용하는 사람들에 의해 상품의 질과 이력의 지시자로서 분류될 것이다.

따라서 인텔리전트 패킹은 운송되고 저장되는 동안 포장된 식품의 질에 관한 정보를 제공함으로써 포장된 식품의 상태를 감독하는 것 중의 하나로 정의된다. 식품의 상태는 다음을 말한다.

·생리학적 과정(과일 또는 신선한 채소의 호흡)

·화학적 과정(지질 산화)

·물리적 과정(빵의 표면 경화, 탈수)

·미생물학적 관점(미생물에 의한 손상)

·감염(곤충에 의한)

상기 포장들은 식품산업에 상당한 관심이 있으며 이는 현재 상기 타입의 포장에 관한 발전과 연구에서 대단한 노력이 행해지고 있다는 증거이다.

상기 그룹 안에서 포장된 상품의 질, 안전성 또는 취급에 관한 지시자로서 사용되는 라벨, 염료 또는 에나멜을 운반하는 포장들이 있다. 그것들은 물리학과 화학의, 효소반응 또는 다른 일반적으로 장치에서 색의 변화를 유도하는 것들에 기반을 두고 있어서 해로운지 여부 또는 식품에 일어나는 변화에 대해 알려준다.

따라서, 식품 부패 요인을 막거나 억제함으로써 식품과 포장 사이의 능동적인 상호작용을 이용하는 가능성은 활용되기 시작할 수 있다.

현존하는 많은 시간-온도 인디케이터, 포장 완전성, 미생물 성장, 포장의 확실한 출처 등과 같은 스마트 인디케이터들은 식료품 포장산업에서 매우 유용하다. 이들 각각은 단지 몇몇을 제외하고는 독점 시스템이며 특히 시간-온도 인디케이터가 가장 그렇다.

식품에서의 미생물의 존재를 쉽고 효과적으로 발견할 수 있도록 하는 스마트 패키지의 발전과 관련된 참고문헌들은 많지 않다. 미생물학적 관점에서 부패한 음식의 섭취는 건강이상의 가장 큰 요인 중의 하나이다. 이것은 섭취 전에 빨리 포장음식이 감염된 것을 발견하는 것이 중요하다. 그 결과 판매자는 그것들은 제시간에 제거할 수 있고 소비자는 건강에 위험이 없이 섭취할 수 있다.

상기 발전들은 이 스마트패키지 방식과 관련하여 EP1326653, WO03093784, WO2008026119, (Kimberly-Clark Worldwide, INC)와 같은 특허에서, 비색탐지기가 사용된 점에서 또는 WO0013009, (Johnson Matthey Public Limited Company), 반응 지지물로서 금속복합체가 사용된 점에서 미생물과 센서 사이의 직접적인 접촉에 대하여 발표했다. Desbordes, J: CONIVE, L Prevot.A. Annales Francaises Pharmaceutiques 1972, 30 (7-8), 507-518 문서에서 유황과 인산에서 바닐라로 착색된 반응이 박테리아 연구에서 지질의 존재를 규명하기 위해 사용되었고 결국 얇은층의 크로마토그래피와 가스 크로마토그래피에 의해 지방산이 확인되었다. 다시 상기 변화에서는, 반응을 유발하기 위해서 박테리아와 시약 사이의 직접적인 반응이 필요하다. 더 나아가서 상기 방식 센서의 제조 시스템은 하나의 산업 단계에서는 그것의 제조가 어려움을 격을 정도로 상당히 복잡하다. 게다가 가동 메커니즘은 복잡하고 미생물들과 접촉했을 때 사라져버리는 착색된 합성물 세대의 첫 번째를 요구한다. 더구나 색원체로 사용되는 합성물들은 산성화 또는 반응을 일으키기 위한 복잡한 화학적 합성과 같은 특별한 조건을 요구하며, 그것들 중 몇몇은 요즘 식품과의 접촉에 사용되지 않거나 그들의 농축에 중요한 제한이 있다. 아무튼, 훨씬 더 적은 식품 첨가물이 적용된 천연 합성물이 기술적이고 건강에 도움이 되는 이점을 수반하면서 중요한 색원체의 합성물로 사용된다.

기술된 바에 따라 패키지의 결점의 관점에서, 본 발명의 발명자는 상당한 연구 후에, 포장된 다른 성질의 상품들에서 미생물을 보호하는 바닐라 용액이 흡수된 부분적으로 이온화되는 흡착성의 단단한 지지물을 포함하는 새로운 물질을 개발했다.

유리하게, 식품첨가물로 승인된 바닐린(3-methoxy-4-hydroxybenzaldehyde)은 간단하고 쉽게 증명할 수 있는 색원체 반응을 통하여 미생물들의 성장을 발견할 수 있다. 상기 바닐린은 역시 식품 또는 포장된 상품과의 직접 접촉이 없이도 센서로서 행동하지만 반응이 있어나기 위해서는 기체 상태에서 수분의 작은 응축의 존재가 필요하다.

바닐린은 많은 채소 특히 바닐라 꼬투리에 있는 천연 합성물의 원료이다. 그것은 산업적으로 오이게놀로부터 얻어지며, 정향나무오일의 주요 성분이다. 또한 리글린의 산화로부터 얻어지며, 식물들의 나무 조직에서 복잡한 중합체의 기초가 된다.

바닐린은 식품 특히 빵과자에서 향신료로 넓게 사용되며, 또한 제약산업에서 위의 자극물과 향수류로서 사용된다.

최근의 바닐린의 사용에 대하여 다른 시약들의 선구자로서 언급하고 있는 몇몇의 참고문헌들이 있으나 긴 합성과정과 에탄올과 같은 용액과 농축된 염산, 피페리딘, 메틸 요오드화물과 같은 시약들을 혼합해야 하는 것이 필요하다. 예를 들어 WO2008026119 문서에서 바닐린은 발명의 주요 구성성분이 아니나, 색변화가 일어나는 반응에서 다른 합성물의 존재를 필요로 한다.

다른 방법들에서 바닐린을 탐지기로 사용하는 것은 염산으로 보존액을 강하게 산성화하는 것이 요구되는 단점을 수반하며 인돌은 생산하는 능력을 가진 미생물들의 존재에 대하여만 탐지할 수 있다. 따라서 Ferlin, H.J. and Karabiner (J.V. Euclides 1954, 14, 345-353) 문서에서 트립토판으로 부터 인돌을 생산하는 것에서의 차이에 근거해 혼합된 것들로부터 E. coli 와 P. vulgaris 를 분리하기 위한 원료로서 트립토판을 포함하는 보존액을 발표했다. 그것으로, 그들은 또한 인돌 테스트를 수행하기 위한 시약을 개발했다. 이런 조건하에서, 인돌과 액체상태에서 직접 접촉하여 보라색을 만들기 위해 농축된 염산에 0.25% 바닐린 용액을 부가하였다. 인돌이 생산한 미생물들이 그 용액의 그 원료가 되었던 인돌의 생산한 미생물들이 색 변화 반응을 끌어올리는 인돌을 생산하는 것이다.

이러한 단점들에 비추어 현 발명의 중요한 장점 중의 하나는 정확히 해롭지 않은 천연합성물, 바닐린과 같은 식품 첨가물의 사용, 그리고 미생물과 포장물질과의 직접적인 접촉이 없이 미생물의 존재를 탐지하는 능력이다.

본 발명의 적용은 음식, 화장품 그리고 의약품 또는 다른 포장된 상품에서의 병원성 미생물들의 존재와 같은 사회에 대한 큰 위험을 갖는 문제를 해결하는 것이 목적이다.

본 발명의 재료는 쉽게 인식할 수 있는 색 변화를 통해 소비자가 상품을 거절할 수 있고 음식물 섭취를 피하거나 건강에 해로운 미생물들로 감염되거나 오염된 상품의 사용을 피하기 위하여 식품의 포장재료 또는 미생물에 의해 감염되기 쉬운 다른 어떤 상품들에 통합되어 진다.

상기 재료는 오염된 묶음들을 적절한 시기에 제거하여 포장 상품들의 질을 통제하는데 도움이 되는데 그렇게 함으로써 그것들이 최종사용자에게 도달하는 것과 또한 잠재적으로 되돌아오게 되는 문제들과 비용들을 방지하게 된다. 상기의 새로운 장치의 발전과 완성에 관련된 분야는 제조업과 포장에 포함된 물질 또는 식품, 화장품 또는 제약산업을 시장에 내놓게 되는 원인이 되는 것으로 포장산업의 한 축이 된다. 상기 분야는 포장된 상품에 간섭하지 못하게 하거나 또는 산업적 포장 절차를 지연시키지 못하게 하여 최종 사용자가 쉽게 볼 수 있는 위치를 확보하기 위하여, 산업적 포장 절차를 고려해, 포장 안쪽의 물질의 위치에 대한 최적화에 대해 고민해야 한다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해소하려는 것으로, 유기체와의 직접 또는 그것을 포함하는 배지와의 접촉이 없이 미생물의 성장으로 시각적으로 탐지할 수 있도록 하려는데 목적이 있다.

상술한 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 의한 첫 번째 수단은, 바닐린을 포함하는 용액이 흡수된 부분적으로 극성이 되는 흡착성의 단단한 지지물을 포함하는 물질이다.

본 발명에 의한 다른 수단은, 미생물의 성장을 시각적으로 탐지하기 위한 비색센서로서 색의 변화를 위해 미생물과 직접 또는 그것을 포함하는 배지와의 접촉을 요하지 않는 상기에서 서술된 물질의 사용이다.

본 발명에 의한 마지막 수단은, 미생물의 성장을 시각적으로 탐지하기 위해 비색시약으로서 바닐린의 사용이다.

본 발명에서 소개된 것과 같은 센서를 사용한 것의 중요한 이점은 사람들이 음식을 먹으려할 때 또는 상품을 사용하려할 때 미생물이 존재하지 않는다는 것을 알 수 있게 하여 습득하거나 섭취하려 할 때 그것의 소비를 삼가거나 상품을 거절할 수 있는 가능성을 제공하는 것이다.

도 1. 폴리프로필렌필름에서 센서물질의 적용. 대장균 배양.
도 2. 미생물이 존재하지 않는 종이 필터에서의 센서 물질의 적용(여백) 배지가 있는 경우(왼쪽 열)와 배지가 없는 경우(오른쪽 열)
도 3. 스티커 종이 라벨에서 센서 물질의 적용
도 4. 미생물(대장균)이 존재하는 경우 또는 미생물이 존재하지 않는 경우(여백)에 종이 필터에 센서물질의 적용. 배지는 Muiier-Himton
도 5. 다른 미생물에 대한 다른 배양기(Muiier-Himton, TSA,; M.E.A.) 에서 색이 변하는데 필요한 시간의 그래프.
도 6. Muiier-Himton배지에서 미생물이 존재하지 않는 배양기에서 다른 pH값의 종이 필터에 센서물질의 적용.
도 7. a)미생물이 존재하지 않는 경우; b) Candida albicans; c)Staphyloco ccusaureus and d) Salmonella cholerasuis.에 시간에 따른 바닐린 농도의 변화 그래프.

본 발명은 다른 성질을 가지는 상품에서 유기체와의 직접 또는 그것을 포함하는 배지와의 접촉이 없이 미생물의 성장으로 시각적으로 탐지할 수 있도록 고안된 새로운 인텔리전트 팩킹에 대하여 고려한다.

따라서, 발명의 중요한 관점에서 바닐린이 포함된 용액이 흡수된 부분적으로 극성이 되는 흡착성의 단단한 지지물을 포함하는 상기에서 서술된 물질이 고려된다.

물질의 구성에서 바닐린의 존재는 단순하고 쉽게 인식할 수 있는 비색반응에 의해 미생물의 성장이 탐지될 수 있도록 한다. 실험 조건하에서의 색의 변화(무색에서 보라색)는 페트로 접시에서 수행된 순수배양과 집에서 만들었거나 방부제가 없는 마요네즈와 같은 음식, 약 또는 화장품에서 모두 미생물의 존재와 확실히 관련되어 있다.

바닐린은 미생물의 존재에 반응하는 천연합성물이다. 바닐린이 없는 경우 반응색 변화는 일어나지 않는다. 반응은 비가역적이며, 미생물의 성장이 계속 일어날 때 색의 변화는 더 활발하다.

특별한 경우에는 바닐린 용액이 에탄올을 포함한다. 색 반응을 시각적으로 확인할 수 있는 바닐린의 최소 농도는 10%이고 에탄올 약 10에서 50%가 선호된다.

그 반응이 비색탐지기로서 지속적이고 비가역적이기 위해서는 수분을 포함하는 배지 또는 적어도 눈에 보일 정도의 수분이 필요하다. 이런 이유로 단단한 지지물은 선호되는 종이와 판지처럼 기체상태에서 음식 자체에 의해 수분을 발산할 수 있는 능력을 보유할 수 있는 부분적으로 극성을 띠는 흡착물 이어야 한다.

바닐린이 소수성 중성용액으로 녹아든 경우 수분이 소수성 구조에 집중되고 반응이 있더라도 중력에 의해 이슬방울이 떨어지게 되므로 반응은 영속적이지 못하게 된다. 따라서 비가역적이고 안정적인 구조가 될 수 없다.

상기와 같이 소개된 발명물질의 특징은 미생물의 성장의 시각적 탐지에 적합하며, 따라서 새로운 물질을 사용하는 본 발명의 다른 중요한 관점은 미생물 존재의 시각적 탐지를 위한 센서로서 고려된다는 것이다.

상기 센서 반응은 기체상태에서 일어나며, 따라서 바닐린은 미생물과 직접 또는 그것을 포함하는 배지와 접촉을 할 필요가 없다. 따라서 센서와 미생물은 증기를 통해서만 접촉을 하게 되므로 서로 멀리 떨어져 있게 된다. 센서가 유기체와 직접 접촉을 필요로 하지 않는다는 것은 매우 유리한 것이며, 합성물이 그들의 신진대사과정에서 미생물들에 의해 배출되고 기체상태에 도달하면 그것을 통하여 비색반응이 일어나는 센서에 도달하는 방식의 면에서 최근에 발표된 센서와 중요한 차이가 있다. 상기 장점은 그 센서가 뚜껑에 위치하거나 또는 포장에 붙어있거나, 조금 떨어져 있지만 그것의 일부가 될 수 있게 한다. 이것 역시 상기 조건하에서 장점을 가진다. 즉, 기체상태에서 행동하는 것은 상품에서 그것들이 있어야 하는 부분 어디에도, 직접적인 접촉이 필요한 경우에도, 파편이나 부분에도 제한 없이 미생물의 존재에 대하여 반응할 수 있게 한다.

또한, 증기상태에서 미생물로부터 합성물의 전이 또는 확산 때문에 색 변화가 일어난다는 사실은 배지에서 미생물의 첫 번째 군락의 외관에 반응하는 높은 자극반응성을 이룰 수 있다.

미생물 농도가 미생물을 포함하는 음식의 미생물 양과 같거나 10 CFU/ml, CFU/mg)(colony forming units per ml or per mg )이상일 때 무색(또는 종이나 고체구조 때문에 흰색)에서 핑크-바이올렛으로 색이 변화한다. 색의 강도는 미생물의 농도에 좌우된다.

상기 센서는 곰팡이, 효모 및/또는 박테리아와 같이 광범위한 효과가 있는 미생물들의 성장을 시각적으로 탐지할 수 있게 한다.

신진대사 과정에서 인돌을 발생시키는 모든 미생물들은 바닐린과 반응한다. 또한, 신진대사 과정에서 인돌을 생산하지 않는 살모넬라와 슈도모나스 종과 같은 다른 유기체들도 역시 상기 반응이 인돌-바닐린으로 특정화되지 않는 점에서 바닐린과 반응을 확인하는 것은 긍정적이며, 더 포괄적으로 질소합성물-바닐린 반응으로 정의될 수 있다.

본 발명의 스마트 센서 또는 시스템에 의한 미생물의 탐지는 포장된 상품에서 수행될 수 있다. 선호되는 포장된 상품인 식품, 의약 또는 화장품은 성질 면에서 차이가 있다.

따라서 인텔리전트 시스템은 포장 안쪽에서 발생하는 공기에 노출되기 위하여 포장재료 자체로서 사용될 수 있는 센서로서의 물질 형태로 되거나, 셀프-스티커형태, 플라스틱 또는 다른 물질로 될 수 있는 포장의 안쪽에 위치한 것과 같은 종이라벨 형태로 적용된다. 상기 포장은 미생물이 존재할 경우 색 변화가 일어나는 것을 볼 수 있도록 투명하거나 무색의 재료로 만들어져야 한다.

마지막으로 본 발명의 다른 중요한 관점은 바닐린을 증기상태에서 미생물의 성장을 시각적으로 탐지할 수 있도록 하는 비색 시약으로서의 사용 즉, 바닐린과 미생물 사이의 직접 접촉이 없다는 점이다.

실시예

센서의 활동은 다른 구조물질과 다른 실험 조건에 의하여 연구되었다. 이것은 육안으로 보이는 수준에서 센서 작용의 명확한 시각화를 가능하게 했다.

도 1은 대장균의 배양에서 바닐린 용액이 흡수된 폴리르로필렌 필름의 적용을 보여준다. 사용된 공식은 상기 센서에 적절하게 고안된 것이었음에도 불구하고, 색 변화는 관찰되지 않았다. 반응(색변화)이 없었던 이유는 물질이 수분 또는 합성물을 흡수하지 않았거나 또는 폴리프로필렌에 흡수된 것이 무극성 배지여서 바닐린을 포함하지 않는 구조와의 반응이기 때문이었다. 사실 센서의 구조로서 약한 무극성 또는 흡착성 구조를 사용한 것이어서 채색된 후광이 PP를 덮었고 결국 응축되고 PP필름에서 떨어졌다.

도 2는 미생물이 없는 시험들이 바닐린 용액에 적신 몇몇의 종이 필터를 사용하여 배양기가 있는 상태(왼쪽 열) 그리고 배양기가 없는 상태(오른쪽 열)로 수행되었다. 상기 실험은 미생물이 없는 상태에서 배지의 존재는 반응이 일어나기에 충분하지 않다는 것을 보여준다.

도 3은 본 발명의 센서물질을 자동 스티커 라벨 시스템에 적용하여 대장균 배양에서 미생물의 존재를 탐지하기 위한 것으로서 센서의 색 변화가 관찰되었다.

도 4는 다른 대장균의 배양에서 종이 필터와 비어있는 즉, 미생물이 없는 배양기에서 종이 필터에 센서 물질을 적용한 것이다. 배지는 Muler - Hinton이었다. 그것은 대장균 배양에서는 색 반응이 나타났으나 비어있는 배양기에서는 색이 나타나지 않았다.

연구를 확장하기 위해, 센서가 적절히 반응하는데 필요한 최소한의 농도를 결정하기 위해 광범위한 미생물에 대한 발명 물질의 반응이 평가되었다.

시험들은 다음의 미생물들에서 센서의 효능에 대해 연구하기 위해 수행되었다.

MOLDS

·Aspergillus flavus (Spanish Type Culture Collection, CECT, 2687)

·Penicillium roqueforti (Culture Collection of Fungi, IBT, 21319)

·Eurotium repens (IBT 1800)

·Penicillium islandicum (CECT 2762)

·Penicillium ammune (IBT 21314)

·Penicillium expansum

·Penicillium nalgiovensis

YEASTS

·Candida albicans (American Type Culture Collection, ATCC, 64550)

·Debaryomyces hansenii (CECT 10353)

·Zygosaccharomyces rouxii (CECT 11928)

·Botrytis cinerea

BACTERIA

·Enterococcus faecalis (ATCC 29212)

·Listeria monocytogenes (ATCC 7644)

·Bacillus cereus (CECT 495)

·Staphylococcus aureus (ATCC 29213)

·Salmonella choleraesuis (CECT 4000)

·Yersinia enterocolitica (CECT 4315)

·Escherichia coli (ATCC 29252)

·Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853)

양성 반응은 모든 박테리아, 곰팡이 그리고 효모에서 발견되었다. 다음의 표에서는 양성반응을 주었던 미생물들의 미생물이 섞여진 농도와 센서에서 색이 변하는데 필요한 시간에 의존해서 농도치가 명확하게 표현될 수 있는 것을 보여준다.

Bacterium	Incubation days	MCC(cfu per mg/ml)	MDC(cfu per mg/ml)
P.aeruginosa	1 2 3	10 10 10	10 ⁷ 10 ² 10
E.coli	1 2 3	10 10 10	10 ⁷ 10 ² 10
E.faecalis	1 2 3 4	10 10 10 10	10 ⁶ 10 ² 10 ² 10
B.cereus	1 2 3 4	10 10 10 10	10 ⁶ 10 ⁴ 10 ² 10 ²
S. aereus	1 2 3 4	10 10 10 10	＞10 ⁷ 10 ⁵ 10 ⁴ 10 ⁴
Y. enterocolitica	1 2 3 4	10 10 10 10	＞10 ⁷ ＞10 ⁷ 10 ⁷ 10 ⁶

표1: 농도에 따른 색의 변화

MCC: Minimum inoculated concentration: MCD: Minimum detectable concentration

상기 연구는 센서를 포함하는 흡착구조의 색을 변화시키는 다른 배양기의 효과에 대한 연구를 함으로써 완성되었다. 자원의 많은 소비로 인하여 우리는 두 개의 미생물들을 각 그룹과 모든 미생물이 성장할 수 있는 그러나 다른 성질 때문에 단백질 출처의 구성은 달리하는 세 개의 배양기의 대표로서 선택했다. 선택된 배양기는 Muller-Hinton (M. H), Malt Extract Agar (M.E.A.) and T.S.A. (Tryptone Soya Agar)였다. 연구 시간은 1년으로 연장되었다. 다음의 표(2와3)은 선택된 미생물과 배양기를 요약하고 있다. 배양기의 구성에 있어서 차이점들은 다른 영양분 농도와 이렇게 각 각으로부터 미생물을 위한 영양분이 다를 것이라는 점에서 식품의 경우를 흉내 내고 있다는 것을 보여준다.

[표 2] 미생물들

[표 3] 사용된 다른 배양기의 혼합물

도 5의 그래프는 다른 배양기에서 다른 미생물에 대한 연구에서 실질상 검은색(자주색 또는 매우 강한 보라색)으로 되는 결과를 얻기 위하여 필터에 요구되는 날들을 보여준다. 색의 강화는 미생물의 농도에 의존하여 발견된다.

상기 연구에 따르면 미생물성장이 두드러지게 일어나는 배지가 색의 변화에 영향을 준다고 결론 지어진다. 상기 변화는 질소 화합물의 높은 구성을 가지는 Muller-Hinton 매개체에서 빨랐고 T.S.A. 와 M.E.A.의 변화는 다소 느렸다.

상기 배양기에서의 주요한 차이점은 질소 화합물의 구성이다. Muller-Hinton 의 경우 소고기와 카제인이 질소화합물, 비타민, 탄소, 황과 아미노산을 공급한다. T.S.A.에 있어서 대두 효소의 소화가 질소, 비타민 그리고 미네랄을 제공하는 반면 M.E.A.는 다당류에 많고 하나의 질소원으로서 펩톤을 가지고 다른 두 배양기에서 보여 진 것보다 적은 양이다. 이것은 바닐린과 함께 위치해 색이 변하는 반응의 강도에 영향을 미친다. 왜냐하면 미생물들이 많은 양의 양분을 발견하는 경우에 미생물들이 빨리 성장한다는 점에서 반응은 일찍 일어나고 센서의 색변화를 빠르게 하며, 다른 경우에 비해서 같은 시간에 보다 강렬한 반응을 유도한다.

만약 신진대사 과정에서 인돌을 발생시키는 미생물이 양성반응을 보인다면 인돌과 바닐린 사이의 화학반응 때문에 그것은 색이 변한 화합물일 거라는 추측을 하면서 반응 메카니즘에 대하여 조사했다. 그러나 살모넬라와 슈도모나스균과 같은 미생물들은 인돌을 생산하지 않았고 역시 바닐린과 양성 반응을 보였다.

추가적인 분석들은 미생물의 탐지에서 바닐린의 영향에 대해 증명하고 착색은 pH의 변화 또는 미생물의 신진대사로부터 나온 CO₂의 존재 때문이라는 것을 배제하기 위해서 수행되었다. 이러한 실험에서 다른 모든 경우보다 빠른 색변화를 발생시켰기 때문에 배지로서 Muller-Hinton 을 선택했다.

CO₂의 영향 :

미생물은 성장과 호흡에서 CO₂를 배출한다. 상기 합성물의 풍부함과 단기성 때문에 우리는 바닐린이 흡수된 라벨에 의해 색이 변하는 영향에 대해 연구했다.

상기 실험은 미생물은 존재하지 않는 배양기 접시와 연구를 위한 바닐린 용액이 흡수된 라벨의 준비와 함께 성취되었다. 혐기성 생물 단지 안에서 그리고 혐기성균과 미호기성균의 조건하에서 이러한 공기를 발생시키는 주머니를 이용하여 배양이 수행되었다. 상기 접시들은 CO₂가 통과할 수 있도록 단지의 안쪽이 봉인되지 않았다.

상기 테스트는 3차례로 반복되었고 50일 후에 37^oC에서 Muller-Hinton 접시와 바닐닌을 포함하는 필터에서 디스크 위의 색 변화는 없었다.

따라서 색변화는 CO₂의 존재에 의해 유발되는 것이 아니라는 결론에 달하게 되었다.

pH의 영향:

배지의 pH는 피상적으로 수정되었다. 아세트산이 세 개의 접시에 부가되고 NAOH가 다른 세 개에 부가되었고, 미생물이 존재하지 않는 상태에서 이러한 산성 화합물들 또는 염기성들의 영향이 관찰되었다. 그것은 3개월 후에 관찰되었는데, 색의 변화는 없었다. 필터들과 산성화 또는 염기성화된 시약 간의 직접적인 접촉은 없었다.

다음 분석에서는 바닐린이 미리 첨가된 필터에 그 산과 염기를 직접적으로 첨가했다. 준비된 나머지 접시들에는 모든 경우와 동일하게 미생물을 주입하지 않았다. 역시 색의 변화가 없었다.

이러한 분석들을 보완하기 위해 그 산과 염기를 에탄올 바닐린 혼합물에 직접 부가하였고 그리고 그 필터는 이전의 모든 시험에서처럼 접시에 위치한 혼합물이 스며들었다.

한 달 후에 어떤 필터에서도 색변화는 관찰되지 않았다. 따라서 센서의 색 변화는 pH의 변화에 의해 발생되는 것이 아니라는 결론을 내렸다. 3개월 후에도 여전히 색은 변하지 않았다.

그러나 배양 매개체의 pH가 5일 후에 본질적으로 변했을 때, 매개체의 pH가 12와 10에서 기체상태에 있던 샘플의 색이 변한 것이 관찰 되었다(도 6).

미생물의 성장 역시 매개체의 기초의 pH도가 10 근처가 되는 마지막 pH에서 변화가 발생했다.

색 변화의 원인이 되는 합성물의 분석

반응 후의 바닐린과 새로운 합성물의 발달은 색층 분석 기술에 의하여 분석되었다.

바닐린의 변화를 알아보기 위하여, SPME (solid phase microextraction)과 GC - MS (gas chromatography-mass spectrometry)분석들이 수행되었다.

도 7에서 알 수 있는 바와 같이 모든 경우에서 바닐린의 농도가 감소되었다. 이러한 감소는 보다 빠르고 강렬한 색 변화를 유발했던 미생물들인 S. aureus 와 S. cholerasuis 보다 더 큰 것이었다. 아마도 발생된 착색된 합성물이 활발하지 않았기 때문에, 이 기술로 새로운 합성물의 존재가 색 변화의 요인이라는 것을 탐지할 수 없었다. 아무리 바닐린의 농도가 감소해도 새로운 착색된 합성물의 출현을 야기하는 미생물의 성장에 의해 발생되는 합성물과의 반응이 발생 되는 것을 알려준다.

Claims

삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
식품, 의약품 또는 화장품을 포장하며 포장된 상기 식품, 의약품 또는 화장품과 접촉없이 박테리아, 곰팡이 및 효모의 성장을 탐지하기 위한 식품, 의약품 또는 화장품 포장재(packaging)에 있어서,
상기 포장재는, 투명하고 무색(colorless)인 재료로 제작되며,
미생물의 대사물질(metabolites)이 증기상태(vapor phase)에 함유되었을 때 미생물의 대사물질을 탐지하기 위한 바닐린을 함유한 표면층을 가지며, 습기를 흡수하는 부분적 극성흡착성의 단단한 지지물(a partially polar adsorbent solid support) 형태의 센서를 포함하고,
상기 센서는, 포장된 상기 식품, 의약품 또는 화장품에서 상기 식품, 의약품 또는 화장품에 있는 곰팡이(molds), 효모(yeasts) 또는 박테리아를 표시하기 위해 (indicating), 상기 포장재의 외부에서 보이도록(visible) 내측에 결합되고,
미생물의 농도(the concentration of microorganisms)가 음식의 10cfu/ml 또는 10cfu/mg 와 같거나 높을 때 색 변화를 일으켜서 외부에서 시각적으로 인식할 수 있는 것을 특징으로 하는 포장재.
제15항에 있어서,
상기 센서의 표면층은 에탄올과 최소 10 중량%의 바닐린의 흡수층(an impregnated layer)인 것을 특징으로 하는 포장재.
제15항에 있어서,
상기 센서의 표면층은 10중량% 에서 50중량% 농도인 바닐린을 갖는 에탄올의 흡수층인 것을 특징으로 하는 포장재.
제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 센서는 접착제가 있는 종이 또는 흡수재인 것을 특징으로 하는 포장재.