BRPI1011297B1 - Embalagem para alimentos, produtos farmacêuticos ou produtos cosméticos, uso do mesmo, e, uso de vanilina - Google Patents
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Abstract
embalagem para alimentos, produtos farmacêuticos ou produtos cosméticos, uso do mesmo, e, uso de vanilina a presente invenção refere-se a uma embalagem 5 inteligente nova, projetada a partir de um material novo que compreende um suporte sólido adsorvente parcialmente polar impregnado um uma solução de vanilina, que permite a detecção visual do crescimento dos microorganismos nos produtos de natureza diferente sem a necessidade de estar em contato direto com o microorganismo ou com o meio contendo o mesmo.
Description
“EMBALAGEM PARA ALIMENTOS, PRODUTOS FARMACÊUTICOS OU PRODUTOS COSMÉTICOS, USO DO MESMO, E, USO DE VANILINA”
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se aos campos de alimentação, de química farmacêutica, e de cosméticos. Especificamente, ela se refere a um material novo formado por um suporte sólido adsorvente parcialmente polar impregnado com uma solução da vanilina e ao seu uso como sensor colorimétrico para a detecção da presença de microorganismos em alimentos, em produtos cosméticos ou farmacêuticos.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Todos os anos existem no mundo inumeráveis casos de hospitalizações como conseqüência de toxi-infecções alimentícias, derivadas da presença de microorganismos.
Por um lado, o consumidor do século XXI exige alimentos de grande qualidade sensorial e alto valor nutritivo, isto é, minimamente processados em detrimento dos produtos convencionais. É óbvio que a aplicação de condições de processamento menos drásticas comporta um aumento do risco microbiológico e, portanto, a variabilidade do comportamento microbiano adquire uma importância crítica, desde que se deve conhecer a possibilidade real de sobrevivência e desenvolvimento da microbiota residual em qualquer produto, para determinar exatamente a sua vida útil ou os riscos microbiológicos que o produtor é disposto a assumir.
O estudo da incidência e da prevalência dos patógenos em alimentos é, de fato, um dos objetivos prioritários da União Européia em matéria de segurança alimentar. Sua finalidade é poder avaliar quais riscos envolvem de fato os alimentos, bem como a adoção de critérios microbiológicos e objetivos de segurança alimentar para alguns tipos de alimentos.
Atualmente não existe no mercado nenhum material com
Petição 870180151304, de 13/11/2018, pág. 18/60 compostos naturais capaz de detectar de forma visual a presença de uma faixa ampla de microorganismos em produtos embalados. Para essa razão, nem o consumidor nem o vendedor ou o distribuidor podem saber se os produtos embalados estão contaminados ou não por microorganismos. No caso de microorganismos patogênicos esta situação supõe um risco sério para a saúde. Para seu controle é necessário recorrer a exames microscópicos e às análises microbiológicas ou semeaduras em meios seletivos de cultura, o que implica um consumo grande de recursos de material e pessoal. Além disso, estes métodos são destrutivos, o que implica que o produto analisado não estará disponível na corrente comercial, e requer um consumo grande de tempo, porque desde o momento em que se realiza a semeadura, até que se realiza a contagem dos microorganismos, se passam entre 2 e 7 dias, sem considerar o tempo necessário para o pré-enriquecimento. Referidas análises implicam, além disso, um custo laboratorial elevado. Em qualquer caso, estas análises são feitas de forma aleatória para um número representativo das amostras, mas em nenhum caso podem ser feitas para todas as unidades de todas as partidas de alimentos, porque sempre existe um risco potencial de que ocorra uma contaminação microbiana em um produto ou que seja detectada pelo produtor ou o consumidor final. Em produtos farmacêuticos o risco é muito maior, desde que apenas se detecta que ocorreu um problema desta natureza quando o dano já foi causado, com freqüência irreparável.
Nos últimos anos, os sistemas de embalagem para alimentos têm evoluído como resposta às exigências dos consumidores quanto à validade, conservação de suas propriedades, frescor, aparência, etc. Por um lado, os métodos modernos de comercialização necessitam de uma embalagem atraente que comunique algo para o consumidor para que, desta forma, ele adquira o produto. Em seguindo lugar, as embalagens têm evoluído ao longo dos anos como a resposta às mudanças profundas na forma de vida, e a indústria de embalagem precisou responder a estas mudanças.
As embalagens precisam atender, entre outras, às seguintes funções:
- conter o alimento,
- proteger o alimento das ações físicas, químicas e microbiológicas,
- conservar a qualidade e a salubridade do alimento,
- evitar fraudes,
- acondicionar o produto para a manipulação comercial,
- apresentar-se e identificar o produto,
- informar ao consumidor as características do alimento,
- estender a sua vida útil.
Ultimamente, e devido às exigências novas na demanda dos consumidores, surgiram dois conceitos novos de embalagem. A embalagem ativa e a embalagem inteligente. As embalagens ativas e inteligentes podem ser vistas como a próxima geração na embalagem de alimentos.
Os materiais e os objetos ativos em contato com alimentos são definidos, de acordo com a Diretriz Européia 1935/2004, como aqueles destinadas a ampliar o tempo de conservação, ou para manter ou melhorar o estado dos alimentos embalados, e que estão projetadas para incorporar deliberadamente os componentes que transmitem substâncias aos alimentos embalados ou no ambiente dos mesmos ou que absorvem substâncias dos alimentos embalados ou seu ambiente. Nos últimos anos foi produzido um desenvolvimento importante no campo de embalagem ativa com um grande número de publicações fazendo a referência a este assunto (Rodríguez, A., Battle, R., Nerín, C (2007) The use of natural oils as antimicrobial solutions essential in paper packaging. Part II”. Progress in Organic Coatings 60 (1): 33-38), Rodríguez, A., Nerín, C, and Battle, R (2008). New cinnamon-based active paper packaging against Rhizopusstolonifer food spoilage. Journal of Agricultural and Food Chemistry 56 (15)), López, P., Sánchez C, Batlle, R, and Nerín, C. (2007b). Development of flexible antimicrobial films using essential oils as active agents. Journal of Agricultural and Food Chemistry 55 (21): 8814-8824) Gutiérrez, L, Sánchez C, Batlle, R; Nerín, C. (2009). New antimicrobial active package for bakery products. ” Trends in Food Science & Technology 20 (2): 92-99.
Com relação à embalagem inteligente, as finalidades são diferentes, e isto justifica sua separação com uma designação especial. Sua ação possibilita um sonho nas pretensões do consumidor do mundo moderno, sendo a própria embalagem que fala da qualidade do produto que ela contém ou os eventos que marcaram seu processamento, atuando como um informante do possível estado ruim ou degradação possível, assim como de sua manutenção, transporte ou distribuição inadequada. De acordo a Diretriz 1935/2004, as embalagens inteligentes são definidas como aqueles materiais que controlam o estado de alimentos embalados ou o ambiente dos mesmos.
Como “embalagens inteligentes” são classificadas aquelas que usam as propriedades ou os componentes do alimento ou algum material de embalagem como indicadores da qualidade e história do produto; assim elas são indicadores fundamentais de tempo-temperatura, indicadores da qualidade microbiológica, medidores de oxigênio ou dióxido de carbono.
A embalagem inteligente é definida assim como aquela que monitora as condições do alimento embalado dando informação sobre a qualidade do alimento embalado durante o transporte e o armazenamento, compreendendo-se pela condição do alimento:
- processos fisiológicos (respiração de frutas e verduras frescas),
- processos químicos (oxidação de lipídeos),
- processos físicos (endurecimento de pão, desidratação),
- aspectos microbiológicos (danificada por microorganismos) e
- infecção (por insetos).
Estas embalagens despertam um interesse grande na indústria alimentícia e a prova disto é o grande esforço que está sendo feito neste momento no desenvolvimento e pesquisa deste tipo de embalagem.
Dentro deste grupo estão as embalagens que carregam etiquetas, pinturas ou esmaltes, que são usados como indicadores da qualidade, segurança ou tratamento do produto embalado. Eles se fundamentam em reações físicoquímicas, enzimáticas ou outras, que dão lugar, geralmente, à mudança de cor do dispositivo, indicando, desta forma, o dano ou mudança que ocorreu no alimento.
Assim pode-se começar a operar a possibilidade de usar a interação entre o alimento e a embalagem como algo positivo, isto é, bloqueando ou inibindo as causas da decomposição dos alimentos.
Muitos dos indicadores inteligentes existentes são muito úteis para a indústria de embalagem dos alimentos, tais como indicadores do tempotemperatura, a integridade da embalagem, crescimento microbiano, a autenticidade da embalagem, etc. Diversos destes sistemas patenteados existem, mas apenas alguns são comerciais, entre os quais se destacam os indicadores de tempo-temperatura.
Não se encontram muitas referências quanto ao desenvolvimento das embalagens inteligentes que podem detectar de forma rápida e eficaz a presença de microorganismos no alimento no momento da aquisição ou do consumo. Dado que o consumo de alimentos em estado ruim deste ponto de vista microbiológico é uma das causas principais das afeições à saúde (intoxicações alimentares), é importante detectar em tempo, isto é, antes do consumo, os produtos embalados que estão infectados. Desta forma, o vendedor pode retirar a tempo o produto e o consumidor pode evitar seu consumo sem risco para a sua saúde.
Os desenvolvimentos descritos com relação a este tipo de embalagens inteligentes necessitam do contato direto entre o microorganismo e o sensor, que atua como embalagem inteligente, como nas patentes EP1326653; WO03093784, W02008026119, (Kimberly-Clark Wordlwide, INC.), em que é usado um detector cromogênico; ou W00013009, (Johnson Matthey Public Limited Company), em que complexos de metal são usados como suportes de reação. No documento Desbordes, J: CONIVE, L Prevot.A. Annales Francaises Pharmaceutiques 1972, 30 (7-8), 507-518 se utiliza a reação colorida da vanilina em meio sulfúrico e fosfórico para identificar a presença de lipídeos em estudos bacterianos e finalmente identificam-se os ácidos graxos pela cromatografia de camada fina ou por cromatografia gasosa. Outra vez neste desenvolvimento é necessário o contato direto entre a bactéria e o reagente de modo de modo que ocorra a reação. Além disso, o sistema da fabricação deste tipo de sensores é de grande complexidade, o que dificulta a possibilidade de fabricação em nível industrial. Por outra parte, o mecanismo de atuação é complexo e requer inicialmente a geração de um composto colorido, que desaparecerá antes do contato com microorganismos. Além disso, os compostos usados como os cromógenos, são compostos químicos que em alguns casos necessitam de condições especiais como a acidificação, ou complexos compostos químicos de modo que ocorra a reação, sendo que vários não podem ser usados hoje em dia em contato com alimentos ou então têm uma limitação importante em sua concentração. Em nenhum caso se usam compostos naturais como compostos principais cromogênicos, e muito menos compostos aceitos como aditivos alimentares, com as vantagens tecnológicas e de salubridade que isto implica.
Em vista das deficiências das embalagens descritas até agora, os autores da presente invenção, depois de um trabalho extensivo de pesquisa, desenvolveram um material novo que compreende um suporte sólido adsorvente parcialmente polar impregnado em uma solução da vanilina que pode ser usado como sensor colorimétrico para a detecção de microorganismos em produtos embalados de diferente natureza.
De modo vantajoso, a vanilina (3-metoxi-4-hidroxibenzaldeído), autorizada como aditivo alimentício, permite detectar o crescimento dos microorganismos por meio de uma reação cromogênica simples e facilmente identificável. Além disso, ela atua no sensor sem necessidade de estar em contato direto com o alimento ou o produto embalado, embora para ocorrer, é necessário que exista uma pequena concentração de umidade em fase vapor.
A vanilina é um composto natural que se encontra em muitos vegetais, principalmente na vagem da baunilha. Ela é obtida industrialmente do eugenol, o componente principal da essência de cravo. É obtida também pela oxidação da lignina, um polímero complexo que se encontra no tecido lignoso das plantas.
A vanilina é amplamente usada como agente aromatizante em alimentação, principalmente em massas de torta. Também é empregada na indústria farmacêutica como estimulante gástrico, e em perfumaria.
Existem algumas referências no estado técnico que mencionam também o uso da vanilina como precursor de outros reagentes, mas elas necessitam de um longo processo de síntese e a mistura com soluções como etanol e com reagentes como o ácido clorídrico concentrado, a piperidina, iodeto de metila ou outros. Por exemplo, no documento W02008026119, a vanilina não é o componente principal da invenção, porque é necessária a presença de outro composto na reação de modo que ocorra a mudança de cor.
Outros métodos, que utilizam a vanilina como detector da presença de microorganismos necessitam acidifícar fortemente o meio com HCI, com as desvantagens que isto implica, e além disso somente são capazes de detectar a presença dos microorganismos que são capazes de produzir indol. Assim, no documento Ferlin, H. J. e Karabinos, (J. V.Euclides 1954, 14, 345-353) descreve-se um meio que contêm triptofano como a fonte para isolar E. coli e P. vulgaris das misturas de acordo com as diferenças na produção do indol a partir de triptofano. Com isto, foi desenvolvido também um reagente para realizar o teste de indol. Nestas circunstâncias usou-se a adição de uma solução da vanilina a 0,25% no ácido clorídrico concentrado para produzir uma cor violeta com o indol, pelo contato direto e em fase líquida. Isto é, os microorganismos produtores do indol deviam encontrar-se na referida solução, produzindo o indol que causa a reação cromogênica.
Diante destes inconvenientes, uma das vantagens principais da presente invenção é precisamente a utilização de um composto natural, não nocivo, aditivo alimentício, como é a vanilina, e com uma capacidade de detectar a presença de microorganismo sem a necessidade de que exista contato direto entre o microorganismo e o material de embalagem.
Sua aplicação é dirigida para resolver um problema que supõe um risco grande para a sociedade, como é a presença de microorganismos patogênicos nos alimentos, nos produtos de cosmética e farmácia, ou em outros produtos embalados.
O material da invenção é incorporado no material de embalagem dos alimentos, ou de quaisquer outros produtos suscetíveis de sofrer contaminação por microorganismos, de forma que por meio de uma mudança de cor facilmente reconhecível, (de incolor a violeta), o consumidor é capaz de rejeitar o produto e evitar o consumo de alimentos ou o uso de produtos infectados e contaminados com os microorganismos perigosos para a saúde.
Por outro lado, é um sistema que muito contribui para o controle da qualidade do produto embalado podendo-se retirar em tempo partidas contaminadas, evitando dessa maneira que cheguem ao consumidor final, bem como todos os problemas e custos gerados de possíveis devoluções. Os setores envolvidos na elaboração e na aplicação deste dispositivo novo, poderíam ser, por um lado, o setor das embalagens, que seria encarregado de fabricar e colocar no mercado o material já incorporado na embalagem, e, por outro lado, a indústria de alimentos, cosméticos ou fármacos. Este setor precisa tratar da otimização da localização do material dentro da embalagem, considerando o processo industrial de embalagem, com o objetivo de obter uma localização facilmente visível para o consumidor final e que não interfira com o produto embalado nem dificulte o processo industrial de embalar.
A vantagem principal de usar um sensor como o apresentado como a invenção é a possibilidade de que ele oferece ao consumidor saber que o alimento que ele vai consumir ou o produto que vai usar está livre de microorganismos no momento da aquisição e consumo do mesmo e assim pode se abster de consumir e rejeitar o produto.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Figura 1. Aplicação do material sensor em um filme de polipropileno. Cultura de E. coli.
Figura 2. Aplicação do material sensor em filtros de papel na ausência dos microorganismos (branco), com meios da cultura (coluna esquerda) e sem meio de cultura (coluna direita).
Figura 3. Aplicação do material sensor em uma etiqueta de papel autoadesiva. Cultura de E. Coli.
Figura 4. Aplicação do material sensor nos filtros do papel na presença dos microorganismos (£. coli) ou na ausência dos microorganismos (branco). O meio de cultura é Müller-EKnton.
Figura 5. Gráfico de dias necessários para obter a coloração em diferentes meios (Müller-Hinton; T.S.A.;. M.E.A.) para microorganismos diferentes.
Figura 6. Aplicação do material sensor a um filtro de papel com diferentes pHs em uma cultura sem microorganismos; meio de Müller-Hinton.
Figura 7. Gráfico da evolução da concentração de vanilina no tempo com a) ausência de microorganismos (branco); b) Candica albicans; c) Staphylococcus aureus e d) Salmonella cholerasuis.
OBJETO DA INVENÇÃO
Em primeiro lugar, é objeto da invenção um material que compreende um suporte sólido adsorvente parcialmente polar impregnado em uma solução que compreende vanilina.
É também objeto da invenção o uso deste material como sensor colorimétrico para a detecção visual do crescimento dos microorganismos, onde o referido sensor não necessita contato direto com os microorganismos nem com o meio que os contêm para produzir a mudança de cor.
Finalmente, é também o objeto da invenção o uso de vanilina como reagente colorimétrico para a detecção visual do crescimento de microorganismos.
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
A presente invenção contempla uma nova embalagem inteligente, projetada a partir de um material novo, que permite a detecção visual do crescimento de microorganismos nos produtos da natureza diferente sem necessidade de estar em contato direto com o microorganismo nem com o meio contendo o mesmo.
Assim, em um aspecto principal da invenção, referido material é contemplado, que compreende um suporte sólido adsorvente parcialmente polar impregnado em uma solução que compreende vanilina.
A presença da vanilina na composição do material permite detectar o crescimento de microorganismos por meio de uma reação cromogênica simples e facilmente identificável. A mudança de cor (de incolor a violeta) nas condições do teste está claramente relacionada com a presença de microorganismos, tanto em culturas puras, feitas em placa Petri, como em alimentos, como, por exemplo, a maionese caseira, que não usa conservante, em fármacos ou em cosméticos.
A vanilina é um composto natural que reage na presença de microorganismos. Na ausência de vanilina a reação colorida não ocorre. A reação é de caráter irreversível e a cor gerada aumenta em intensidade quando continua a produção do crescimento microbiano.
Em uma forma de realização particular, a solução de vanilina compreende etanol. A concentração mínima de vanilina necessária para tomar a reação colorida visível é de 10% em etanol, preferivelmente de 10 a 50%.
A reação necessita de meio aquoso ou pelo menos de umidade para que seja visível, durável e irreversível e, portanto, sirva como detector colorimétrico. Por esta razão, o suporte sólido deve ser de um material adsorvente parcialmente polar, capaz de reter a umidade liberada pelo próprio alimento em fase de vapor, preferivelmente papel ou papelão é usado.
No evento em que a vanilina fosse incorporada em um suporte hidrofóbico, a reação não seria permanente, porque a umidade se condensaria sobre o suporte hidrofóbico e, apesar de ser do mesmo modo colorida, não permanecería porque a gota de orvalho cairia devido à gravidade. Assim, não constituiría um suporte irreversível e estável.
Como mencionado previamente, as características descritas do material da invenção o tomam adequado para a detecção visual do crescimento de microorganismos, pelo que, em outro aspecto principal da invenção, é contemplado o uso deste material novo como sensor colorimétrico para a detecção visual da presença dos microorganismos.
A reação no sensor ocorre em fase vapor, pelo que a vanilina não necessita estar em contato direto com o microorganismo nem com o meio que o contém. Desta maneira, o sensor e os microorganismos podem estar afastados um do outro, sendo unicamente o contato entre eles através de uma fase vapor.
O fato de que o sensor não necessita de contato direto com o microorganismo é muito vantajoso e uma diferença importante com respeito aos sensores descritos no estado técnico, dado que desta forma os compostos exalados pelos microorganismos em seu metabolismo, alcançam a fase vapor e através disto chegam ao sensor onde se realiza a reação cromogênica. Isto possibilita que o sensor seja colocado na tampa ou aderido à embalagem formando parte da mesma, porém afastado. Ele tem a vantagem também que, nestas circunstâncias, isto é, atuando em fase vapor, ele pode responder à presença dos microorganismos em qualquer ponto do produto onde eles podem estar, não estando limitado a uma fração ou parte do mesmo, como acontece quando se requer contato direto.
Além disso, o fato de ocorrer a mudança de cor provocada pela transferência ou difusão dos compostos procedentes dos microorganismos em fase vapor permite alcançar alta sensibilidade, o que significa que o sensor responde ao surgimento das primeiras colônias de microorganismos no meio.
Na presença de uma concentração de microorganismos igual ou superior a 10 unidades formadoras de colônias por ml ou por mg (CFU/ml, CFU/mg)) de alimento contendo o microorganismo, o sensor muda de cor de modo irreversível, de incolor (ou branco, devido ao papel ou suporte sólido) a um tom rosa-violeta. A intensidade da cor depende da concentração de microorganismos.
O sensor permite a detecção visual do crescimento de um amplo espectro de microorganismos tais como mofos, leveduras e/ou bactérias.
Todos os microorganismos gerando indol em seu metabolismo reagem com a vanilina. Além disso, outros microorganismos que não produzem indol em seu metabolismo, como Salmonella e Pseudomonas spp., são também positivos para a reação de identificação com vanilina, pelo que a reação não seria específica para “indol-vanilina”, mas seria definida como uma reação mais genérica, “compostos nitrogenados-vanilina”.
A detecção de microorganismos por meio do sensor ou sistema inteligente da invenção pode ser realizada em um produto embalado. O produto embalado pode ser de natureza diferente, de modo preferido é um alimento, um produto farmacêutico ou um produto cosmético.
Assim, em realizações particulares, o sistema inteligente formado pelo material sensor pode ser usado como material da embalagem propriamente dita ou ser aplicado em forma de uma etiqueta de base papel, preferivelmente no formato autoadesivo, colocada em uma face interna da embalagem, que pode ser de plástico ou de qualquer outro material, de modo que está exposta à atmosfera gerada no interior da embalagem. A embalagem deve ser nesta zona de um material transparente e incolor, a fim de permitir a visualizar da mudança de cor que ocorrerá na presença de microorganismos.
Finalmente, em outro aspecto principal da invenção comtempla-se o emprego da vanilina como reagente colorimétrico para a detecção visual do crescimento de microorganismos em fase de vapor, isto é, sem contato direto entre a vanilina e o microorganismo.
EXEMPLOS
A atividade do sensor com base em diferentes materiais de suporte e condições experimentais foi estudada. Isto permitiu visualizar claramente a operação do sensor em nível macroscópico.
Na figura 1, aplicou-se um filme de polipropileno (PP) impregnado em uma solução da vanilina em uma cultura de E. coli. Embora a formulação fosse a correta projetada para este sensor, não se observou mudança de cor. A razão da ausência da resposta (mudança de cor) se deve ao fato de que o material não absorveu a umidade nem os compostos, ou o que é o mesmo pensamento, reação com a formulação que contém a vanilina não foi retida no suporte, porque esta se encontrava em um meio não polar, embebida em polipropileno (PP). De fato, foi observado um halo colorido recobrindo o PP, mas que finalmente condensou e se desprendeu do filme de PP, dando como não válido este suporte não polar nem adsorvente para ser empregado como suporte para o sensor.
Na figura 2, foram realizados testes em branco (ausência de microorganismos), usando diversos filtros de suporte de papel impregnados na solução da vanilina, na presença de meios da cultura (coluna esquerda) e na ausência de cultura (coluna direita). Foi demonstrado que, na ausência de microorganismos, a presença de meio de cultura não é suficiente para que a reação ocorresse.
Na Figura 3, foi aplicado o material sensor da invenção a uma etiqueta autoadesiva para detectar a presença de microorganismos em uma cultura de E. Coli, podendo-se observar a mudança de cor do sensor.
Na Figura 4, foi aplicado o material sensor a diversos filtros de papel em culturas diferentes de E. coli e uma cultura em branco, isto é, sem microorganismo. Os meios da cultura eram Müller-Hinton. Foi possível observar que a coloração ocorreu em todas as culturas de E. coli, visto que na única cultura em branco não apareceu cor.
Para ampliar o estudo, foi avaliado o comportamento do material da invenção frente a uma série ampla de microorganismos para determinar a concentração mínima necessária para que o sensor funcionasse apropriadamente.
Testes foram realizados para estudar a eficácia do sensor nos seguintes microorganismos:
MOFOS • Aspergillus flavus (Colección Espanola de Cultivos Tipo, CECT,
2687) • Penicillium roqueforti (Culture Collection of Fungi, IBT, 21319) • Eurotium repens (IBT 1800) • Penicillium islandicum (CECT 2762) • Penicillium ammune (IBT 21314) • Penicillium expansum • Penicillium nalgiovensis
LEVEDURAS • Candida albicans (American Type Culture Collection, ATCC, 64550) • Debaryomyces hansenii (CECT 10353) • Zygosaccharomyces rouxii (CECT 11928) • Botrytis cinerea
BACTÉRIAS • Enterococcus faecalis (ATCC 29212) • Listeria monocytogenes (ATCC 7644) • Bacillus cereus (CECT 495) • Staphylococcus aureus (ATCC 29213) • Salmonella choleraesuis (CECT 4000) • Yersinia enterocolitica (CECT 4315) • Escherichia coli (ATCC 29252) • Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853)
As reações positivas entre as bactérias foram observadas tanto nos mofos como nas leveduras. Dentre os microorganismos experimentados que deram reação positiva na seguinte tabela (tabela 1) estão aqueles em que o valor da concentração de microorganismos pode se expressar de modo claro, em função da concentração de microorganismo inoculado e do tempo necessário para a mudança de cor no sensor.
Tabela í. Mudança de cor em função na concentração
| Bactérias | Dias de incubação | MCC (cfu por mg/ml) | MCD(cfiipor mg/ml) |
| P. aeruginosa | 1 | 10 | 107 |
| 2 | 10 | 102 | |
| 3 | 10 | 10 | |
| E. coli | 1 | 10 | 10z |
| 2 | 10 | 102 | |
| 3 | 10 | 10 | |
| E. faecalis | 1 | 10 | ÍÕ2 |
| 2 | 10 | 102 | |
| 3 | 10 | 102 | |
| 4 | 10 | 10 | |
| B. cereus | 1 | 10 | 1Õ5 |
| 2 | 10 | 104 | |
| 3 | 10 | 102 | |
| 4 | 10 | 102 | |
| S. aureus | 1 | 10 | |
| 2 | 10 | 105 | |
| 3 | 10 | 104 | |
| 4 | 10 | 104 | |
| Y. enterocolítíca | 1 | 10 | M07 |
| 2 | 10 | >107 | |
| 3 | 10 | 107 | |
| 4 | 10 | 106 |
MCC: Concentração mínima inoculada
MCD: Concentração mínima detectada
Os testes foram completados estudando o efeito dos meios diferentes de cultura na mudança da cor do suporte adsorvente que contem o sensor. Devido ao consumo elevado de recursos, foram escolhidos 2 microorganismos de representação de cada grupo e de três meios de cultura, genéricos que permitiram o crescimento de todos os microorganismos, mas com índice diferente em fonte de proteínas, como característica diferenciadora.
Os meios selecionados foram Müller-Hinton (Μ. H), agar de extrato de malte (M.E.A) e T.S.A (agar de triptona soja). O tempo do estudo se estendeu até um ano. Nas seguintes tabelas (2 e 3) resumem os microorganismos e os meios selecionados de cultura. As diferenças na composição de meios de cultura representam a concentração diferente de nutrientes e, portanto, simula a situação dos alimentos, em que os nutrientes para os microorganismos serão diferentes uns dos outros.
Tabela 2 — Microorganismos
Υ1
| GRUPO | MICROORGANISMOS | MEIO DE CULTURA |
| GRAM POSITIVOS GRAM NEGATIVOS LEVEDURAS MOFOS | B. cereus e E.faecalis P. aeruginosa e S. cholerasuis C. albicans A. flavus e P. roqueforti | Μ. H, M.E.A. e T.S.A. Μ. Η, M.E.A. e T.S.A. Μ. H, M.E.A. e T.S.A. Μ. H, M.E.A. e T.S.A. |
Tabela 3 - Composição dos diferentes meios de cultura usados
| MÜLLERHINTON | T.S.A. | DEXTROSE AGAR SABOURAUD | M.E.A. | |
| Amido l,5g | Cloreto de sódio 5g | D(+) glicose 40g | Extrato de malte 13g | |
| Infusão de came bovina 2g | Peptona de caseína 15g | Cloranfenicol 50 mg | Dextrina 2,5g | |
| Peptona de caseína hidrolisada | Peptona de soja 5g | Mistura de peptonas lOg | Gelatina Peptona 5g | |
| Agar 15g | Agar lg | Agar 15g | ||
| pH final | 7,2 | 7,3 +/- 0,2 | 5,5 +/- 0,2 |
Os gráficos da figura 5 mostram os dias que foram necessários para que o filtro adquirisse a tonalidade praticamente negra final (arroxeado ou violeta muito intenso) para os diferentes microorganismos nos meios diferentes estudados. Observa-se uma intensificação da cor em função da concentração de microorganismos.
• io Em consequência deste teste foi possível concluir que o meio de cultura em que ocorre o crescimento do microorganismo afeta de forma notável a mudança de cor. Esta mudança foi mais rápida em meio Müller-Hinton, com um índice maior de compostos nitrogenados, seguido de T.S.A. e em M.E.A a mudança foi muito mais lenta.
A diferença principal entre estes meios é o teor em compostos nitrogenados. No exemplo de Müller-Hinton, a came de gado e caseína fornecem compostos nitrogenados, vitaminas, carbono, enxofre e aminoácidos. Para T.S.A, a digestão enzimática da soja fornece nitrogênio, vitaminas e minerais. Apesar do M.E.A. ter um teor elevado de polissacarídeos como única fonte de nitrogênio tem peptona e em quantidades menores às presentes nos outros dois meios. Isto afeta a intensidade da reação que ocorre com a vanilina e portando a mudança de cor, desde que naqueles casos em que os microorganismos crescem rapidamente porque encontram uma quantidade grande de nutrientes, a reação se produz antes, causando uma mudança de cor no sensor antes no tempo e mais intensa e para o mesmo tempo que em outros casos.
Foi investigado o mecanismo de reação que ocorreu, verificando que microorganismos que geraram em seu metabolismo indol deram uma reação positiva, sugerindo que se tratava de um composto colorido devido à reação química produzida entre o indol e a vanilina. Não obstante, os microorganismos que não geram indol, como Salmonella e Pseudomonas spp, também deram uma reação positiva com a vanilina.
Testes adicionais foram feitos para demonstrar a eficácia da vanilina na detecção de microorganismos e descartar que a mudança de coloração se devia a uma mudança do pH ou devido à presença de CO2, procedente do metabolismo dos microorganismos. Nestes testes foi selecionado como meio de cultura Müller-Hinton, porque que este que gerava uma reação mais rápida da mudança de cor para todos os casos.
Efeito do CO2:
Os microorganismos em seu crescimento e respiração liberam CO2. Devido à abundância e à volatilidade deste composto, foi estudado o efeito que exercia sobre a cor desenvolvida pelas etiquetas impregnadas com vanilina.
Para isto, foi feita uma preparação de placas com meio de cultura e etiquetas impregnadas com a solução de vanilina a estudar, mas sem a presença de microorganismos. A incubação foi feita em frascos de anaerobiose e nas condições do anaerobiose e microaerofilia, por meio da utilização de restos geradores destas atmosferas. As placas não foram seladas no interior do frasco, de modo a deixar penetrar o CO2.
O teste foi repetido por triplicata e observou-se que os últimos 50 dias, a 37°C, nas placas com Müller-Hinton e o filtro contendo a vanilina, não se produziu mudança de coloração no disco.
Assim, conclui-se que a mudança de cor não é produzida pela presença de CO2.
Efeito de pH:
O pH do meio foi modificado superficialmente. Adicionou-se em três placas ácido acético e em outras três NaOH, e foi observado o efeito que estas compostos ou bases poderíam exercer no sensor, na ausência de microorganismos. Observou-se que, passados três meses, não havia nenhuma mudança de cor. Não existiu contato direto entre os filtros e os agentes acidificantes ou basificantes.
No seguinte teste, o ácido e a base foram adicionados diretamente sobre o filtro, ao qual tinha sido previamente adicionada a vanilina. O resto da preparação da placa foi em todos os casos idêntico, sem semeadura do microorganismo. Tampouco, não foi observada mudança da coloração.
Complementar a estes testes o ácido e a base foram adicionados diretamente à mistura de etanol-vanilina, e com esta mistura o filtro foi impregnado que foi colocado nas placas como em todos os testes realizados previamente.
Observou-se que não existia nenhuma mudança da coloração em nenhum dos filtros depois de passar um mês. Para tanto se concluiu que a mudança de cor do sensor não é produzida por uma mudança de pH. Três meses depois continua sem produzir nenhuma mudança de cor.
Não obstante, quando o pH de meio de cultura foi modificado intrinsecamente, passados 5 dias, observou-se que se produziu uma mudança de coloração nas amostras que estavam em fase vapor com o meio de pH 12 e de pH 10 (figura 6).
Ο crescimento dos microorganismos gerou também uma modificação no pH final do meio, sendo pH básico com um valor em tomo de 10.
Análises dos compostos responsáveis pela mudança de cor
Foram analisados por meio das técnicas cromatografia a evolução da vanilina e os compostos novos que apareceram após a reação.
A fim ver a evolução da vanilina, uma análise por SPME (microextração em fase sólida) foi feita e GC-MS (Cromatografia de gases10 espectrometria de massas)
Como é possível observar (Figura 7) ocorreu uma diminuição da concentração de vanilina em todos os casos. Esta diminuição foi maior para o caso de S. aureus e S. cholerasuis, que são, além disso, os microorganismos que causam uma mudança de uma cor mais rápida e intensa. Com esta técnica 15 não se pode detectar a presença dos novos compostos responsáveis pela mudança da coloração, desde que provavelmente o composto colorido gerado não é volátil. Não obstante diminuiu a concentração de vanilina, o que indica que ocorreu uma reação desta com um composto gerado pelo crescimento dos microorganismos, provocando o aparecimento do novo composto colorido.
Claims (9)
- REIVINDICAÇÕES1. Embalagem para alimentos, produtos farmacêuticos ou produtos cosméticos para detectar o crescimento de levedura, mofo e bactéria em alimentos, produtos farmacêuticos e produtos cosméticos, sem a necessidade de contato direto com referidos alimentos, produtos farmacêuticos ou produtos cosméticos contidos na atmosfera gasosa interna desta embalagem caracterizada em que esta embalagem é feita de material transparente e incolor e, ainda, por compreender um sensor em forma de um suporte sólido adsorvente parcialmente polar capaz de absorver umidade, com uma camada superficial contendo vanilina estando referido sensor fixo ao lado interno da referida embalagem e visível do exterior da embalagem para indicar micróbios nos alimentos embalados, produtos farmacêuticos ou produtos cosméticos por alterar a cor deste sensor visível.
- 2. Embalagem para alimentos, produtos farmacêuticos ou produtos cosméticos de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a camada superficial do sensor é uma camada impregnada de etanol e pelo menos 10% de vanilina.
- 3. Embalagem para alimentos, produtos farmacêuticos ou produtos cosméticos de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a camada superficial do sensor é uma camada impregnada de etanol com uma vanilina numa concentração de 10% a 50% sendo a Vanilina.
- 4. Embalagem para alimentos, produtos farmacêuticos ou produtos cosméticos de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que o sensor sólido adsorvente parcialmente polar é papel com um adesivo para fixação.
- 5. Uso de uma embalagem para alimentos, produtos farmacêuticos ou produtos cosméticos conforme definida em qualquer uma das reivindicações anteriores como sensor colorimétrico para detectar visualmente o crescimentoPetição 870190013464, de 08/02/2019, pág. 10/11 de micro-organismos em alimentos, produtos farmacêuticos ou produtos cosméticos na fase de vapor, isto é, sem contato direto entre o material e os micro-organismos no alimento, produtos farmacêuticos ou produtos cosméticos a serem detectados, caracterizado pelo fato de que a alteração de cor é visualmente notável a partir do exterior da embalagem quando a concentração de micro-organismos é igual ou superior a 10 ufc por ml ou mg de alimento.
- 6. Uso de uma embalagem para alimentos, produtos farmacêuticos ou produtos cosméticos de acordo com a reivindicação 5, caracterizado para a detecção de mofos, leveduras e/ou bactérias em alimentos, produtos farmacêuticos ou produtos cosméticos.
- 7. Uso de uma embalagem para alimentos, produtos farmacêuticos ou produtos cosméticos de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 6, caracterizado para a detecção de micro-organismos em alimentos, produtos farmacêuticos ou produtos cosméticos embalados.
- 8. Uso de uma embalagem para alimentos, produtos farmacêuticos ou produtos cosméticos de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, caracterizado pelo fato de que a embalagem do alimento, produto farmacêutico ou produto cosmético, na qual o crescimento de bactérias, mofos e leveduras deve ser detectado é formada por uma embalagem para alimentos, produtos farmacêuticos ou cosméticos conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.
- 9. Uso de vanilina caracterizado por ser como um reagente colorimétrico para detectar visualmente o crescimento de micro-organismos na fase de vapor.
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