KR101720472B1

KR101720472B1 - 식물체 유래의 유충호르몬 아고니스트 또는 안타고니스트를 포함하는 Met 수용체 조절을 통한 해충방제 조성물 및 방법

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Publication number: KR101720472B1
Application number: KR1020160152647A
Authority: KR
Inventors: 제연호; 최재영; 김우진; 박일권; 이석희; 박동환
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2016-11-16
Filing date: 2016-11-16
Publication date: 2017-03-27

Abstract

본원은 유충호르몬 Met(Methoprene-tolerant) 수용체를 조절할 수 있는 화합물을 포함하는 해충 방제용 조성물 및 그 용도를 개시한다. 본원에 따른 조성물은 식물 유래 곤충 성장 조절제로서 곤충에는 특이적으로 작용하여 살충효과를 가지면서도 식물체 자체에는 무해한 친환경 살충제인 동시에 곤충의 호르몬과 동일한 작용기작과 작용점을 가지므로 곤충이 이에 대한 저항성을 획득하기 어렵다는 장점을 가진다.

Description

식물체 유래의 유충호르몬 아고니스트 또는 안타고니스트를 포함하는 Met 수용체 조절을 통한 해충방제 조성물 및 방법 {Pesticidal composition and method for modulating Met receptor comprising plant derived agonists or antagonists of juvenile hormone}

본원은 해충 방제 기술 분야로 구체적으로 유충호르몬 아고니스트 또는 안타고니스트를 이용한 해충 방제 또는 살충제용 조성물 및 방제 방법에 관한 것이다.

해충은 농작물을 가해하여 경제적인 피해를 입힐 뿐만 아니라 사람에게 질병을 일으키는 다양한 병원체를 매개함으로써 인류에게 심각한 영향을 미치고 있다. 이러한 해충을 방제하기 위하여 가장 많이 사용된 화학 농약은 잔류 등을 통한 환경 오염과 인축에 대한 독성 및 저항성 해충 출현 등의 문제 때문에, 친환경 농약에 대한 수요가 날로 증가하고 있다.

곤충 성장 조절제(Insect growth regulator, IGR)는 대상 해충에 특이적으로 작용하고 환경에 대한 독성이 매우 적기 때문에 화학 농약의 대안으로 떠오르고 있다. 곤충 성장 조절제는 작용 기작에 따라 유충호르몬 유사체, 탈피호르몬 아고니스트 및 키틴합성 저해제의 세 가지로 구분된다. 이 중 유충호르몬은 곤충의 발달과 생식 및 그 밖의 다양한 생리작용을 조절하는 중요한 역할을 하기 때문에, 유충호르몬 아고니스트(agonist) 및 안타고니스트(antagonist)를 포함한 유충호르몬 기반의 곤충 성장 조절제는 곤충의 내분비계를 교란함으로써 유충 시기에 비정상적인 발달과 치사를 유도할 수 있어 곤충 방제에 효과적으로 사용될 수 있다.

그 예로는 발삼 전나무(Balsam fir) 유래의, Pyrrhocoris apterus의 정상적인 변태를 방해하는 물질인 쥬바비온(juvabione) (Slama, K. & Williams, C. M. The juvenile hormone. V. The sensitivity of the bug, Pyrrhocoris apterus, to a hormonally active factor in American paper-pulp. Biol . Bull. 130, 235-246, 1966), 그리고 유충호르몬 수용체인 Methoprene-tolerant(Met)과의 상호작용을 통하여 유충호르몬의 아고니스트 또는 안타고니스트로 작용할 수 있는 식물체 유래의 신규 곤충 성장 조절제(Lee, S.-H. et al. Identification of plant compounds that disrupt the insect juvenile hormone receptor complex. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 1733-1738, 2015)를 들 수 있다.

대한민국 특허출원 제10-2014-0100066호는 “유충호르몬의 안타고니스트 스크리닝 방법과 살충제용 조성물”에 관한 것으로, 상기 Met와 CYC 또는 SRC로 형질전환된 형질전환체를 이용한 안타고니스트 스크리닝 방법 및 이를 이용한 살충제용 조성물이 개시되어 있다.

미국 특허 출원번호 제12/507,498호는“아세테이트-함유 교신교란제 및 이를 이용한 교신교란 방법”에 관한 것으로, 아세테이트 및 알코올 또는 알코올을 함유하는 교신교란제가 개시되어 있다.

그러나 현재 상용화된 곤충 성장 조절제에 대한 저항성을 나타내는 해충이 출현하기 시작하면서, 보다 신규하고 효과적인 곤충 성장 조절제의 개발이 필요하다.

본원은 식물체 유래의 유충호르몬 아고니스트 또는 안타고니스트를 포함하는 살충제용 조성물 및 이를 이용한 해충 퇴치 또는 방제 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

한 양태에서 본원은 본원에 개시된 화학식 1 내지 8로 표시되는 화합물로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 정유를 포함하는, 해충 방제용 조성물 또는 살충제 조성물에 관한 것이다.

본원에 따른 조성물은 수용체에 결합하여 작용하는 유충호르몬 아고니스트 또는 안타고니스트로 작용하며, 특히 Met 수용체를 조절한다. 본원에서 화학식 1 내지 4의 화합물은 유충호르몬 아고니스트이고, 화학식 5 내지 8의 화합물은 유충호르몬의 안타아고니스트로 작용한다.

본원에 따른 조성물은 유충호르몬의 작용에 영향을 미쳐 살충작용이 가능한 기전이 작동하는 유충호르몬 수용체를 가진 다양한 해충, 특히 곤충에 적용될 수 있다. 또한 해충의 유충 또는 해충의 알, 또는 상기 해충 등의 방제가 필요한 식물 또는 서식지에 적용될 수 있다.

또 다른 양태에서 본원은 본원에 따른 조성물을 방제가 필요한, 해충, 해충의 유충 또는 해충의 알; 식물의 전부 또는 일부 또는 식물의 종자; 또는 해충 또는 식물의 서식지를 접촉시키는 단계를 포함하는, 해충 방제 방법을 제공한다.

또 다른 양태에서 본원은 본원에 따른 조성물을 해충, 해충의 유충 또는 해충의 알에 처리하는 단계를 포함하는, 상기 해충에서 유충호르몬 수용체인 Met(Methoprene-tolerant) 수용체를 조절하는 하는 방법을 제공한다.

본원은 Met와 CYC 또는 SRC 기반의 스크리닝을 방법을 통해 선별된 유충호르몬의 아고니스트 및 안타고니스트를 개시한다. 본원에 따른 화합물은 기존의 IGR 계열의 물질과는 다른 살충 메카니즘을 가지는 JHA (유충호르몬 아고니스트) 및 JHAN (유충호르몬 안타고니스트)을 이용함으로써 기존의 살충제에 저항성을 가지는 해충의 방제에 효과적으로 사용될 수 있다.

본원에 따른 조성물은 식물 유래 곤충 성장 조절제이므로, 곤충에는 특이적으로 작용하여 살충효과를 가지면서도 식물체 자체에는 전혀 무해한 친환경 살충제인 동시에 곤충의 호르몬과 동일한 작용기작과 작용점을 가지므로 곤충이 이에 대한 저항성을 획득하기 어렵다는 장점을 가진다.

도 1은 유충호르몬의 아고니스트를 탐색할 수 있는 방법의 모식도이다.
도 2는 유충호르몬의 안타고니스트를 탐색할 수 있는 방법의 모식도이다.
도 3은 쥬베노이드 및 안티 쥬베노이드 활성 평가 결과이다.
도 4는 본원에 따른 화합물의 모기 살충활성 평가 결과이다.
도 5는 본원에 따른 화합물의 농도별 쥬베노이드 활성 평가 결과이다.
도 6은 본원에 따른 화합물의 농도별 안티 쥬베노이드 활성 평가 결과이다.
도 7은 본원에 따른 화합물의 항이스트 활성 평가 결과이다.
도 8은 본원에 따른 화합물의 Hairy의 발현을 평가한 결과이다.
도 9는 본원에 따른 화합물의 난소 발달을 평가한 결과이다.

본 발명은 곤충의 유충호르몬의 아고니스트 또는 안타고니스트로 작용할 수 있는 식물체 유래의 곤충 성장 조절제 발견에 근거한 것이다.

식물은 오랜기간 곤충과 공진화를 하면서 곤충에 대한 방어수단으로 살충 또는 방충활성을 지니는 다양한 2차 대사산물을 생산한다. 이러한 식물유래 대사물질 중에서 곤충 성장을 조절하는 곤충 유충호르몬 아고니스트 및 안타고니스트 활성을 지닌 8개의 화합물을 선별하였다.

이에 한 양태에서 본원은 하기 화학식 1 내지 8의 화합물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 화합물을 포함하는, 살충제용 조성물에 관한 것이다.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]

[화학식 8]

본원에 따른 화합물은 본원 발명자에 의해 출원된 대한민국 공개특허 제2014-0100066호에 개시되어 있는 방법에 기반한 유충호르몬을 이용한 스크리닝 방법을 이용하여 선별된 것이다. 상기 방법은 도 1 및 도 2에 기재된 바와 같이 Met과 CYC로 형질전환된 형질전환체를 유충호르몬 유사체인 파이리프록시펜 존재 하에서 배양할 경우, 도 1과 같이 Met과 CYC가 결합하여 LacZ가 전사되면 유충호르몬의 아고니스트로, 도 2와 같이 Met과 CYC가 결합하지 않아 LacZ가 전사되지 않는 경우 유충호르몬의 안타고니스트로 탐색되는 원리이다.

본원의‘유충 호르몬(Juvenile Hormone, JH)’은 곤충의 발생과정 동안에 주기적으로 외골격을 벗는 변태과정을 조절하며, 성체의 경우 암컷이 정상적으로 알을 생산하는 데 관여하는 물질로, 수용체를 통해서 작용하며, 수용체는 곤충의 체내에 존재하면서 유충 호르몬(Juvenile Hormone)을 감지하고 인식하여 호르몬이 그 역할을 할 수 있도록 수행하는 단백질이다.

본원에 따른 일 구현예에서는 본원에 따른 화합물은 JH의 수용체로서 Met을 조절한다. Met은 유충호르몬의 수용체 (Jindra, M., Palli, S.R. & Riddiford, L. M. The juvenile hormone signaling pathway in insect development. Annu. Rev. Entolol 58, 181-204, 2013), 유충호르몬에 의존적인 방식으로 Ftz-F1-interacting steroid receptor coactivator(FISC) 또는 Cycle(CYC)과 이합체를 형성한다 (Li, M., Mead, E. A. & Zhu, J. Heterodimer of two bHLH-PAS proteins mediates juvenile hormone-induced gene expression. Proc . Natl . Acad . Sci . U. S. A. 108, 638-643, 2011).

본원에 따른 화합물은 본 이론으로 한정하는 것은 아니나, Met과 이의 파트너인 CYC와의 이합체 형성을 조절(아고니스트 또는 안타고니스트)함으로써 유충의 비정상적인 발달을 유도하거나 성충의 번식(reproduction)을 억제하여 해충을 방제할 수 있다.

본원에 따른 상기 화학식 1 내지 4의 화합물은 곤충 유충호르몬에 대해 아고니스트(agonist)로, 화학식 5 내지 8의 화합물은 곤충 유충호르몬에 대해 안타고니스트(antagonist)로 탐색되었다.

본원에 따른 화합물은 본 이론으로 한정하는 것은 아니지만, 아고니스트의 경우 유충의 정상적인 탈피를 억제하고, 안타고니스트의 경우 비성숙한 상태에서 조기 탈피를 유도하여 유충의 정상적인 발달을 저해함으로써 곤충에 대한 살충효과를 가질 수 있다. 또한 해충 알의 부화율에도 영향을 미치며, 알에 처리한 경우, 부화한 유충의 발달에도 영향을 미쳐, 방제에 효과적으로 사용될 수 있다.

본원에서 ‘아고니스트’는 유충호르몬 수용체에 결합해서 그 물질이 갖는 작용과 동일 또는 유사한 작용을 하는 물질, 혹은 수용체 부위의 활성을 높이는 분물질로 알로스테릭 효과를 포함하는 것이다. 본원에 따른 곤충의 유충호르몬 아고니스트는 유충의 정상적인 탈피를 억제하거나, 성충의 난소 발달을 저해하여 정상적인 산란을 방해함으로써 해충 방제를 위한 살충제로 이용될 수 있다.

본원의 ‘안타고니스트’는 유충호르몬 수용체에 결합해서 그 물질이 갖는 작용을 저해하는 물질로, 유충호르몬의 활성을 방해하여, 비정상적인 곤충의 변태를 유도하거나 정상적인 알의 분화를 막아 곤충의 생식을 방해하는 물질을 말한다.

본원에 따른 살충제는 방제가 필요한 해충자체, 그 유충 또는 알, 또는 방제가 필요한 지역, 서식지 또는 식물의 전부 또는 일부에 적용될 수 있다.

본원에 따른 살충제가 사용되는 해충(pest)은 기생(colonizing), 손상유발, 또는 감염 등을 통해 식물 또는 동물에 해를 입히는 무척추 동물 또는 미생물을 일컫는 것이다. 해충은 또한 숙주에 손상을 입히거나 질병을 퍼뜨리고, 숙주와 영양분을 두고 경쟁관계에 있는 개체이다. 본원에 따른 일 구현예에서는 특히 식물체와 연관된 해충으로 곰팡이, 박테리아, 곤충, 거미류, 선충, 민달팽이, 달팽이 등 및 이들 해충의 알 또는 유충을 또한 포함한다. 본원에 따른 다른 구현예에서는 농작물, 자연환경 및/또는 가정용 해충 및 이들의 알 및 유충을 또한 포함하는 것이다. 예를 들면 이집트 숲모기(Aedes aeypti), 흰줄숲모기(Aedes albopictus), 빨간집모기(Culex pipiens), 작은뿌리파리(Bradysia agrestis), 파밤나방(Spodoptera exigua), 배추좀나방(Plutella xylostella), 담배거세미나방(Spodoptera litura), 미국흰불나방(Hyphantria cunea), 왕담배나방(Helicoverpa armigera), 화랑곡나방(Plodia interpunctella), 이화명나방(Chilo suppressalis), 혹명나방(Cnaphalocrocis medinalis), 옥수수조명나방(Ostrinia furnacalis), 톱다리개미허리노린재(Riptortus clavatus), 벼물바구미(Lissorhoptrus oryzophilus), 벼멸구(Nilaparvata lugens), 애멸구(Laodelphax striatellus), 목화진딧물(Aphis gossypii), 복숭아혹진딧물(Myzus persicae), 오이총채벌레(Thrips palmi), 꽃노랑총채벌레(Frankliniella occidentalis), 또는 담배가루이(Bemisia tabaci) 등 유충호르몬이 존재하는 절지동물과, 또는 상기 해충의 알 또는 유충을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니며, 본원에 따른 화합물이 작용할 수 있는 유충호르몬 수용체와 조력체를 가진 모든 곤충에 적용될 수 있다.

본원에 따른 방제용 조성물 또는 살충제가 적용될 수 있는 식물은 식물 전체 또는 그 부분으로 예를 들면 뿌리, 줄기, 잎, 및 종자는 물론 식물체의 세포 또는 조직에 적용될 수 있다. 본원에 따른 살충제가 적용될 수 있는 작물은 곡물 (밀, 보리, 호밀, 귀리, 쌀, 사탕 수수 등), 비트 (사탕무 및 사료 사탕무), 목초 (과수원 잔디, 김의 털, 등), 과일류 (사과, 배, 자두, 복숭아, 아몬드, 체리, 딸기, 라스베리, 블랙 베리), 콩과 식물 (콩, 렌즈 콩, 완두콩, 콩), 오일 식물 (유채, 겨자, 양귀비, 올리브, 해바라기, 코코넛, 피마자 오일 플랜트, 코코아 콩, 땅콩 등), 오이 식물 (오이, 참외, 멜론 등), 섬유 식물 (면, 아마, 대마, 황마), 감귤류의 과일 (귤, 오렌지, 레몬, 자몽 등), 야채 (시금치, 상추, 아스파라거스, 양배추, 양파, 토마토, 감자, 파프리카 등), 녹나무과 (아보카도, 당근, 계피, 녹나무), 활엽수와 침엽수 (예를 들어, 린든 - 트리, 주목 나무, 떡갈 나무, 오리 나무, 포플러, 자작 나무, 전나무, 낙엽송, 소나무), 또는 옥수수, 담배, 견과류, 커피, 사탕 수수, 차, 덩굴, 홉, 바나나, 천연 고무와 같은 식물, 또는 관상용 식물을 포함한다. 또한 본원에 따른 조성물이 적용되는 식물 또는 작물은 식재된 또는 성장하는 작물 및 수확된 작물 둘 다를 포함하는 것이다.

본원에서 살충제에 의한 해충의 퇴치, 조절, 방제 또는 제어는 표적하는 병해충의 박멸 또는 병해충을 물리적으로 또는 이의 성장 또는 행동을 억제, 방해 하는 것을 포함한다. 따라서, 해충을 박멸하는 것은 물론, 생식력이 없는 곤충의 생성을 통한 정자 또는 난자의 생성을 방지, 또는 곤충의 유전자에 손상을 가하여 정자 또는 난자가 성체로 발달 될 수 없게 하는 것을 포함한다.

다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 화합물 또는 이를 포함하는 조성물을 해충 또는 해충의 유충에 처리하는 단계를 포함하는, 상기 해충 또는 해충의 유충의 Met(Methoprene-tolerant) 수용체를 조절하는 하는 방법에 관한 것이다.

Met은 유충호르몬의 수용체로 작용하는 것으로 알려졌으며 (Jindra, M., Palli, S.R. & Riddiford, L. M. The juvenile hormone signaling pathway in insect development. Annu . Rev. Entolol 58, 181-204, 2013), 유충호르몬에 의존적인 방식으로 Ftz-F1-interacting steroid receptor coactivator(FISC) 또는 Cycle(CYC)과 이합체를 형성하는 것으로 나타났다(Li, M., Mead, E. A. & Zhu, J. Heterodimer of two bHLH-PAS proteins mediates juvenile hormone-induced gene expression. Proc . Natl . Acad . Sci . U. S. A. 108, 638-643, 2011).

본 발명의 해충 방제용 또는 살충제용 조성물은 상기 화학식 1 내지 8를 유효성분으로 포함하지만, 그 외 통상의 살충제용 조성물에 포함되는 부형제, 첨가제를 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 가소제, 착색제, 증백제, 계면활성제, 분산제, 유화제, 유동화제 등을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 살충제용 조성물은 통상의 살충제, 또는 농약 제형으로 제제화될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 살충제용 조성물은 유제, 액제, 수화제, 수용제, 분제, 입제, 훈증제, 도포제 등으로 제형화 될 수 있다. 구체적으로, 화학식 1 내지 8의 화합물을 적정 방법으로 포함시켜 농약 제제로 제제화한다. 이들 조성물 제형은 문헌 ["Catalogue of pesticide formulation types and international coding system", Technical Monograph No. 2, 6th Ed. May 2008, CropLife International]에 정의되어 있다. 조성물은 문헌 [Mollet and Grubemann, Formulation technology, Wiley VCH, Weinheim, 2001; 또는 Knowles, New developments in crop protection product formulation, Agrow Reports DS243, T&F Informa, London, 2005]에 기재된 바와 같은 공지된 방식으로 제조된다.

구체적으로, 화학식 1 내지 8 중 하나 이상의 화합물에 계면활성제, 증량제, 붕해제, 영양제 등을 혼합하고 분쇄하여 수화제로 사용하거나 용해시켜 액제로 제제화할 수 있다. 계면활성제로는 폴리카르복실레이트(polycarboxylate), 소듐 리그노설포네이트(sodium lignosulfonate), 칼슘 리그노설포네이트 소듐 다이알킬 설포석시네이트(sodium dialkyl sulfosuccinate), 소듐 알킬 설포네이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 페닐 에테르, 소듐 트리폴리포스페이트(sodium tripolyphosphate), 소듐 알킬 아릴 설포네이트(sodium alkyl aryl sulfonate), 폴리옥시에틸렌 알킬 페닐 에테르(polyoxyethylene alkyl phenyl ether), 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 포스포릭 에스테르(polyoxyethylene aryl phosphoric ester), 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 에테르(polyoxyethylene alkyl aryl ether), 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 폴리머(polyoxyethylene alkyl aryl polymer), 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 폴리머 스페셜, 폴리옥시알킬온 알킬 페닐 에테르(polyoxyalkylone alkyl phenyl ether), 폴리옥시에틸렌 노닐 페닐 에테르(polyoxyethylene nonyl phenyl ether), 소듐 설포네이트 나프탈렌 포름알데히드(sodium sulfonate naphthalene formaldehyde), 트리톤 100 및 트윈 80으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용할 수 있다. 계면활성제의 예는 문헌 [McCutcheon's, Vol.1:Emulsifiers & Detergents, McCutcheon's Directories, Glen Rock, USA, 2008 (International Ed. or North American Ed.)]에 열거되어 있다. 붕해제로는 벤토나이트, 탈크, 카올린, 칼슘카보네이트 등을 사용할 수 있고, 증량제로는 황토, 규조토, 덱스트린, 포도당, 전분 중 하나 또는 둘 이상을 사용할 수 있다.

본 발명의 해충 방제용 또는 살충제용 조성물은 살충 유효량의 화합물을 포함할 수 있고, 예를 들어 농약 제제 당 사용량이 0.01 내지 100(mg/kg) 이 될 수 있다. 상기 용어 "유효량"은 재배 식물 상에서 유충을 방제하는데 충분하거나 물질의 보호에 충분하고, 처리된 식물에 실질적인 손상을 초래하지 않는 조성물 또는 화합물의 양을 의미한다. 이러한 양은 넓은 범위 내에서 달라질 수 있고, 다양한 인자, 예컨대 방제할 해충 종, 처리된 재배 식물 또는 물질, 기후 조건 및 사용되는 특정 화합물에 따라 좌우된다. 제제화할 경우 사용 시기는 해충 발생시 상시적으로 사용할 수 있다.

다른 양태에서 본원은 상기 화학식 1 내지 8의 화합물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 화합물을 포함하는 살충제용 조성물을 해충 또는 상기 해충의 토서식지, 또는 상기 해충의 방제가 필요한 식물 또는 토양 또는 물을 포함하는 식물의 서식지와 접촉시키는 것을 포함하는, 해충의 퇴치 또는 방제 방법에 관한 것이다.

본원 방법이 적용될 수 있는 해충 및 작물은 상기에 기재한 바와 같다.

본원의 해충의 퇴치 또는 방제는 해충을 없애거나 농작물을 해충으로부터 예방하거나 구제하여 해충을 몰아내어 없애버리는 것을 말한다.

본원의 방법은 해충 또는 그 유충 또는 그 알 자체, 또는 해충의 서식지; 또는 식물의 전부 또는 일부 또는 그 종자, 식물 또는 해충 또는 그 유충이 서식하는 서식지 예를 들면 토양 또는 물에, 당업계에 공지된 임의의 적용 방법에 의해 본 발명의 살충제용 조성물과 접촉시킬 수 있다. 이 경우에, "접촉"은 직접적 접촉 (화합물/조성물을 해충 또는 식물 - 전형적으로 식물의 잎, 줄기 또는 뿌리에 직접적으로 적용함) 및 간접적 접촉 (화합물/조성물을 해충 또는 식물의 생육지에 적용함) 둘 다를 포함한다.

본원의 방법은 또한 성장하는 식물 또는 작물을 살충 유효량의 조성물과 접촉시킴으로써 식물/작물을 해충에 의한 공격 또는 침입으로부터 보호하기 위해 사용될 수 있다. 본원에서 용어 식물 또는 작물은 성장하는 작물 및 수확된 작물 둘 다를 포함하는 것이다.

본원의 방법은 해충의 공격으로부터 보호하고자 하는 식물, 식물 번식 재료, 예컨대 종자, 토양, 표면, 물질 또는 공간을 살충 유효량의 본원 조성물로 처리함으로써 이용된다. 본원 방법은 해충에 의한 식물, 식물 번식 재료, 예컨대 종자, 토양, 표면, 물질 또는 공간의 감염 전 및 감염 후에 둘 다 수행될 수 있다.

본원 방법은 해충의 발생이 예상되는 장소에 예방적으로 적용될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실험 재료

본 발명에서 사용한 Met과 CYC로 형질전환된 Y187 세포(Saccharomyces cerevisiae strain Y187-Aa; 기탁 번호: KCTC12621BP)는 한국공개특허 제10-2014-0100066에 개시되어 있는 것을 사용하였다. 아래 표 1의 식물체 유래 정유 물질은 시그마알드리치에서 구매하여 실험에 사용하였다.

실시예 1. 유충호르몬 아고니스트 스크리닝

유충호르몬 아고니스트 활성을 갖는 화합물을 다음과 같이 스크리닝 하였다.

우선, 본 실시예에서 사용한 Met과 CYC로 형질전환된 Y187 세포(Saccharomyces cerevisiae strain Y187-Aa; 기탁 번호: KCTC12621BP)는 한국공개특허 제10-2014-0100066에 개시되어 있는 것을 사용하였다. 상기 형질전환체에 스크리닝 물질을 배합하여 배양하였을 때, 스크리닝 물질이 아고니스트인지 여부에 따라 Met과 CYC의 결합이 영향을 받을 수 있으며, 이를 이용하여 유충 호르몬의 아고니스트를 탐색할 수 있다 (도 1 참조).

본 실시예에서 사용한 유충호르몬 아고니스트 탐색 방법의 모식도인 도 1을 참조하면, Met과 CYC로 형질전환된 형질전환체를 유충호르몬 유사체인 파이리프록시펜 존재 하에 배양할 경우, 도 1의 I과 같이 Met과 CYC가 결합하여 LacZ가 전사됨을 확인할 수 있다. 또한, 스크리닝 물질의 존재 하에 형질전환체를 배양하였을 때, 도 1의 II와 같이 Met과 CYC가 결합하여 LacZ가 전사될 경우 스크리닝 물질은 아고니스트로 탐색될 수 있다.

아고니스트 스크리닝을 위해 상기 원리를 이용하여, 이집트 숲모기(Aedes aeypti)의 Met-CYC로 형질전환된 상기 이스트 Y187 세포를 OD₆₀₀이 0.3 ~ 0.4가 될 때까지 디디오(DDO, SD-Leu/-Trp) 배지를 이용하여 30℃에서 배양하였다. 이렇게 배양한 세포를 수거하여 2.0×10⁶ 세포/ml의 농도로 새로운 배지에 현탁하고, 이를 100㎕씩 96-웰 플레이트에 분배하였다. 96-웰 플레이트에 표 1의 정유 (Sigma Aldrich)을 각각 10ppm씩 처리하고 30℃에서 3시간 동안 추가로 배양한 후, 이스트 β-갈락토시다제 분석 키트(Thermo Scientific)을 제조자의 방법대로 사용하여 β-갈락토시다제 분석을 수행하였다. 아래 표 1은 스크리닝에 사용한 식물체 정유 유래 화합물 목록이다.

[표 1]

양성 대조군으로는 파이리프록시펜 0.033ppm을, 음성 대조군으로 용매 디메틸술폭사이드(DMSO) 10ppm을 처리하여 동일한 방법으로 β-갈락토시다제 분석을 수행하였다. 96-웰 플레이트에 들어있는 이들 β-갈락토시다제 분석 반응 혼합물을 30℃에서 5시간 동안 배양하고, 각각의 OD₄₂₀을 iMark^TM 마이크로플레이트 리더(BIO-RAD)를 이용하여 측정하였다. 이렇게 측정된 OD₄₂₀을 하기 식 1에 대입하여 각각의 식물체 정유 유래 화합물에 대한 유충호르몬 아고니스트(JHA) 활성을 평가하였으며, 그 결과를 도 3의 세로축에 나타내었다.

[식 1]

JHA 활성 = OD4₂₀ PEO/OD₄₂₀ control

상기 식 1에서, OD₄₂₀ control은 파이리프록시펜 0.033ppm을 처리한 경우의 OD₄₂₀이고, OD₄₂₀PEO는 식물체 정유 유래 화합물 10ppm을 처리한 경우의 OD₄₂₀이다.

상기 식 1은 파이리프록시펜 0.033ppm을 처리한 경우의 OD₄₂₀을 1로 보았을 때, 각 식물체 정유 유래 화합물의 OD₄₂₀을 평가한 것이다.

도 3에서와 같이, 본 발명의 식물체 정유 유래 화합물 중 하기의 화학식을 갖는 4개의 화합물이 상대적으로 높은 유충호르몬 아고니스트 활성을 가짐을 확인하였다.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

실시예 2. 유충호르몬 안타고니스트 스크리닝

본 실시예에서는 유충호르몬 또는 유충호르몬 유사체에 스크리닝 물질을 더 배합하여 상기 형질전환체를 배양하였을 때, 스크리닝 물질이 안타고니스트인지 여부에 따라 Met와 CYC 의 결합이 영향을 받을 수 있으며, 이를 통해 유충 호르몬의 안타고니스트를 스크리닝하였다.

본 실시예에서 유충호르몬의 안타고니스트 탐색 방법의 모식도인 도 2를 참조하면, Met와 CYC로 형질전환된 형질전환체를 유충호르몬 유사체인 파이리프록시펜 존재 하에 배양할 경우, 도 2의 I과 같이 Met과 CYC가 결합하여 LacZ 전사됨을 확인할 수 있다. 그런데, 파이리프록시펜과 스크리닝 물질의 존재 하에 형질전환체를 배양하였을 때, 도 2의 II와 같이 Met와 CYC가 결합하지 않아서 LacZ가 전사되지 않을 경우 스크리닝 물질은 안타고니스트로 탐색될 수 있다. 도 2는 유충호르몬 유사체로 파이리프록시펜을 적용한 경우를 도시하였으나, 유충호르몬 또는 파이리프록시펜 이외의 유충호르몬 유사체 또는 이들의 혼합물을 사용한 경우에도 동일하게 적용될 수 있다.

안타고니스트 스크리닝을 위해 상기 원리를 이용하여, 실시예 1의 이집트 숲모기의 Met-CYC가 형질전환된 이스트 Y187 세포를 OD₆₀₀이 0.3 ~ 0.4가 될 때까지 디디오(DDO, SD-Leu/-Trp) 배지를 이용하여 30℃에서 배양하였다. 이렇게 배양한 세포를 수거하여 2.0×10⁶ 세포/ml의 농도로 새로운 배지에 현탁하고, 이를 100㎕씩 96-웰 플레이트에 분배하였다. 96-웰 플레이트에 파이리프록시펜 0.033ppm과 표 1의 정유 각각을 10ppm씩을 처리하고 30℃에서 3시간 동안 추가로 배양한 후, 이스트 β-갈락토시다제 분석 키트(Thermo Scientific)을 제조자의 방법대로 사용하여 β-갈락토시다제 분석을 수행하였다. 양성 대조군으로는 파이리프록시펜 0.033ppm과 메토프렌산(Methoprene acid, MA) 10ppm을 처리하였고, 음성 대조군으로는 파이리프록시펜 0.033ppm과 용매 디메틸술폭사이드 10ppm을 처리하여 동일한 방법으로 β-갈락토시다제 분석을 수행하였다. 96-웰 플레이트에 들어있는 이들 β-갈락토시다제 분석 반응 혼합물을 30℃에서 5시간 동안 배양하고, 각각의 OD₄₂₀을 iMark^TM 마이크로플레이트 리더(BIO-RAD)를 이용하여 측정하였다. 이렇게 측정된 OD₄₂₀을 하기 식 2에 대입하여 각각의 식물체 정유 유래 화합물에 대한 유충호르몬 안타고니스트(JHAN) 활성을 평가하였으며, 그 결과를 도 3의 가로 축에 나타내었다.

[식 2]

JHAN 활성= (OD₄₂₀ control - OD₄₂₀ PEO)/OD₄₂₀ control

상기 식 2에서, OD₄₂₀ control은 파이리프록시펜 0.033ppm과 용매 디메틸술폭사이드 10ppm을 처리한 경우의 OD₄₂₀이고, OD₄₂₀ PEO는 파이리프록시펜 0.033ppm과 식물체 정유 유래 화합물 10ppm을 처리한 경우의 OD₄₂₀이다.

상기 식 2는 파이리프록시펜 0.033ppm과 용매 디메틸술폭사이드 10ppm을 처리한 경우의 OD₄₂₀을 0으로 보았을 때, 각 식물체 정유 유래 화합물의 OD₄₂₀을 평가한 것이다.

도 3에서와 같이, 본 발명의 식물체 정유 유래 화합물 중 하기의 화학식을 갖는 4개의 화합물이 상대적으로 높은 유충호르몬 안타고니스트 활성을 가짐을 확인하였다.

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]

[화학식 8]

실시예 3. 모기에 대한 살충 활성 검정

실시예 1과 2에서 선별한 화학식 1 ~ 8의 화합물에 대해 살충 활성을 평가하고, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 구체적으로 흰줄 숲모기(Aedes albopictus) 3령 유충 10마리씩을 한 처리구로 하여, 상기 선별된 각 화합물을 10ppm을 처리하고 24시간 이후 사충 수를 측정하였다. 모든 실험은 3회 반복 하였다. 그 결과, 본 발명의 화학식 1 ~ 8의 화합물은 실시예 1과 2에서와 같이 쥬베노이드 또는 안티 쥬베노이드 활성을 가질 뿐만 아니라, 모기 유충에 대한 살충 활성도 갖고 있음을 확인하였다.

실시예 4. 농도에 따른 유충호르몬 아고니스트 활성 검정

이집트 숲모기의 Met-CYC가 형질전환된 이스트 Y187 세포를 OD₆₀₀이 0.3 ~ 0.4가 될 때까지 디디오(DDO, SD-Leu/-Trp) 배지를 이용하여 30℃에서 배양하였다. 이렇게 배양한 세포를 수거하여 2.0×10⁶ 세포/ml의 농도로 새로운 배지에 현탁하고, 이를 100㎕씩 96-웰 플레이트에 분배하였다. 96-웰 플레이트에 화학식 3, 4, 7 및 8의 화합물을 각각 0ppm, 0.01ppm, 0.1ppm, 1ppm, 10ppm의 농도로 처리하고 30℃에서 3시간 동안 추가로 배양한 후, 실시예 1에서와 같이 OD₄₂₀에 의한 β-갈락토시다제 분석을 수행하였다.

도 5에서와 같이, 실시예 2에서 유충호르몬 안타고니스트 활성을 보인 화학식 7과 8의 화합물은 농도와 상관없이 유충호르몬 아고니스트 활성을 전혀 보이지 않았으나, 실시예 1에서 유충호르몬 아고니스트 활성을 보인 화학식 3과 4의 화합물은 유충호르몬 유사체인 파이리프록시펜과 마찬가지로 농도가 올라갈수록 높은 유충호르몬 아고니스트 활성을 보임을 확인하였다.

실시예 5. 농도에 따른 유충호르몬 안타고니스트 활성 검정

이집트 숲모기의 Met-CYC가 형질전환된 이스트 Y187 세포를 OD₆₀₀이 0.3 ~ 0.4가 될 때까지 디디오(DDO, SD-Leu/-Trp) 배지를 이용하여 30℃에서 배양하였다. 이렇게 배양한 세포를 수거하여 2.0×10⁶ 세포/ml의 농도로 새로운 배지에 현탁하고, 이를 100㎕씩 96-웰 플레이트에 분배하였다. 96-웰 플레이트에 파이리프록시펜 0.033ppm과 화학식 3, 4, 7 및 8의 화합물을 각각 0ppm, 0.01ppm, 0.1ppm, 1ppm, 10ppm의 농도로 처리하고 30℃에서 3시간 동안 추가로 배양한 후, 실시예 2에서와 같이 OD₄₂₀에 의한 β-갈락토시다제 분석을 수행하였다.

도 6에서와 같이, 실시예 1에서 유충호르몬 아고니스트 활성을 보인 화학식 3과 4의 화합물은 농도와 상관없이 유충호르몬 안타고니스트 활성을 전혀 보이지 않았으나, 실시예 2에서 유충호르몬 안타고니스트 활성을 보인 화학식 7과 8의 화합물은 농도가 올라갈수록 높은 유충호르몬 안타고니스트 활성을 보임을 확인하였다.

실시예 6. 항이스트 (anti-yeast) 활성 검정

탐색 대상 물질이 이스트에 대하여 독성을 가지고 있을 경우, 실시예 2의 방법으로 측정된 OD₄₂₀은 대상 물질의 유충호르몬 안타고니스트 활성에 기인한 것이 아니라 항이스트 활성에 기인한 것이다. 실시예 2와 5에서 높은 유충호르몬 안타고니스트 활성을 보인 화학식 7과 8의 화합물에 대하여 이스트 세포에 대한 생장 저해 효과를 조사함으로써 항이스트 활성 여부를 검정하였다.

이를 위하여 이집트 숲모기의 Met-CYC가 형질전환된 이스트 Y187 세포를 OD₆₀₀이 0.3 ~ 0.4가 될 때까지 디디오(DDO, SD-Leu/-Trp) 배지를 이용하여 30℃에서 배양하였다. 이렇게 배양한 세포를 수거하여 2.0×10⁶ 세포/ml의 농도로 새로운 배지에 현탁하고, 이를 200㎕씩 96-웰 플레이트에 분배하였다. 96-웰 플레이트에 파이리프록시펜 0.033ppm과 화학식 7과 8의 화합물 각각 10ppm을 처리하고 30℃에서 진탕 배양(shaking incubation)하면서 3시간 간격으로 하루 동안 세포의 성장율을 OD₆₀₀으로 측정하였다.

도 7에서와 같이, 화학식 7과 8의 화합물은 이스트 세포의 생장에 어떠한 영향도 주지 않음으로써 항이스트 활성이 전혀 없음을 확인하였다.

실시예 7. 모기에 대한 정량 살충 활성 검정

실시예 1과 2에서 분리한 화학식 3, 4, 7 및 8의 화합물에 대해 살충 활성을 정량적으로 평가하고, 그 결과를 표 2에 나타내었다. 흰줄 숲모기 2령 및 4령 유충 각각 30마리씩을 한 처리구로 하여, 2배 농도로 연쇄 희석한 각 화합물을 처리하고 24시간 간격으로 3일 동안 사충 수를 조사하였다. 모든 실험은 3회 반복 하였으며, IRMA QCal 프로그램을 이용한 직선 회귀를 통해 LD₅₀값을 측정하였다.

[표 2] 식물체 정유 유래 화합물의 모기 유충에 대한 정량적 살충 활성

그 결과, 본 발명의 화학식 3, 4, 7 및 8의 화합물은 2령 및 4령 모기 유충 모두에 대해 높은 수준의 살충 활성을 보였으며, 특히 2령 유충에 대해서는 유충호르몬 안타고니스트 활성을 가진 화학식 7과 8의 화합물이 유충호르몬 아고니스트 활성을 가지는 화학식 3과 4의 화합물에 비해 매우 우수한 살충 활성을 가지는 것을 확인하였다.

실시예 8. 모기 유전자 발현에 대한 영향 평가

이집트 숲모기 암컷 성충의 우화 후 발달과정에서 전사조절자인 Hairy 유전자는 유충호르몬에 의해 발현이 조절되며, 유충호르몬 아고니스트와 안타고니스트는 Met과의 상호작용을 통하여 Hairy 유전자의 발현에 영향을 미치고, 이로 인하여 난소의 정상적인 발달을 저해하는 것으로 알려져 있다.

우화 후 6시간 이내인 흰줄 숲모기 암컷 성충의 배면에 본 발명의 화학식 3, 4, 7 및 8의 화합물을 각각 0.5 μg씩 처리하고, 4시간 간격으로 Qiazol(QIAGEN) 용액을 이용하여 제조사의 방법을 따라 total RNA를 추출하였다. 이렇게 추출한 total RNA를 대상으로 QuantiTect Reverse Transcription 키트(QIAGEN)를 이용하여 제조사의 방법에 따라 cDNA를 합성하고, EvaGreen qPCR 키트(Applied Biological Materials)와 CFX96^TM Real-Time 시스템(BIO-RAD)을 이용하여 Hairy 유전자의 발현 양상을 qPCR 기법으로 조사하였다. qPCR은 a preheating step for enzyme activation at 95℃에서 10분 간 효소 활성화 단계와 95℃에서 15초, 58℃에서 15초 및 72℃에서 30초의 증폭 단계 40회로 수행하였으며, reference 유전자로는 기존에 알려진 RPS7 유전자를 사용하였다(Lee, S.-H. et al. Identification of plant compounds that disrupt the insect juvenile hormone receptor complex. Proc.Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 1733-1738, 2015). Hairy 유전자의 증폭을 위해서는 Hairy-Fw(5'-TGACCGTGAAACATTTGGAA-3')와 Hairy-Re(5'-CGGTCTCCAAGGTTTGTCAT-3') 프라이머 세트를 사용하였다.

결과로 도 8에서와 같이, 유충호르몬 아고니스트 활성을 가지는 화학식 3과 4의 화합물은 유충호르몬 유사체인 파이리프록시펜과 마찬가지로 Hairy 유전자의 조기 발현을 유도하였으며, 그 발현량 역시 증가시키는 것으로 나타났다. 이에 반해 유충호르몬 안타고니스트 활성을 가진 화학식 7과 8의 화합물은 Hairy 유전자의 발현을 억제하는 것으로 확인되었다.

실시예 9. 난소 발달에 대한 영향 평가

우화 후 2일째인 흰줄 숲모기 암컷 성충의 배면에 본 발명의 화학식 3, 4, 7 및 8의 화합물을 각각 0.5μg씩 처리하고, 10% 설탕물을 공급하면서 6시간 동안 실험용 흰쥐를 이용하여 흡혈시켰다. 흡혈 2일 후에 모기를 5 ~ 10분 동안 -20℃에 처리하여 기절 시킨 다음, 모기의 배를 생리식염수 용액 안에 위치시키고 해부현미경으로 관찰하면서 배 끝마디를 잡아당기는 방식으로 해부하여 난소를 관찰하였다.

도 9에서와 같이, 유충호르몬 유사체인 파이리프록시펜과 마찬가지로 화학식 3, 4, 7과 8의 화합물은 모두 암컷 성충 모기의 난소 발달을 저해하는 것을 확인하였다.

이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

Claims

하기 화학식 1 내지 8의 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 해충, 해충의 유충 또는 해충의 알; 식물의 전부 또는 일부, 또는 식물의 종자; 또는 해충 또는 식물의 서식지와 접촉시키는 단계를 포함하는, 상기 해충에서 유충호르몬 수용체인 Met(Methoprene-tolerant) 수용체를 조절하는 방법.
[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]

[화학식 8]
제 1 항에 있어서,
상기 화학식 1 내지 4의 화합물은 유충호르몬(juvenile hormone) 아고니스트(agonist)이고,
상기 화학식 5 내지 8의 화합물은 유충호르몬(juvenile hormone) 안타아고니스트(antagonist)인, 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 해충은 이집트 숲모기(Aedes aeypti), 흰줄숲모기(Aedes albopictus), 빨간집모기(Culex pipiens), 작은뿌리파리(Bradysia agrestis), 파밤나방(Spodoptera exigua), 배추좀나방(Plutella xylostella), 담배거세미나방(Spodoptera litura), 미국흰불나방(Hyphantria cunea), 왕담배나방(Helicoverpa armigera), 화랑곡나방(Plodia interpunctella), 이화명나방(Chilo suppressalis), 혹명나방(Cnaphalocrocis medinalis), 옥수수조명나방(Ostrinia furnacalis), 톱다리개미허리노린재(Riptortus clavatus), 벼물바구미(Lissorhoptrus oryzophilus), 벼멸구(Nilaparvata lugens), 애멸구(Laodelphax striatellus), 목화진딧물(Aphis gossypii), 복숭아혹진딧물(Myzus persicae), 오이총채벌레(Thrips palmi), 꽃노랑총채벌레(Frankliniella occidentalis), 또는 담배가루이(Bemisia tabaci)를 포함하는 곤충인, 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 Met 수용체의 조절은 상기 해충의 방제로 이어지는 것인, 방법.
삭제
하기 화학식 1 내지 8의 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함하는, 해충의 유충호르몬 수용체인 Met(Methoprene-tolerant) 수용체 조절용 조성물.
[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]

[화학식 8]